JP2006028188A - Survivin発現のアンチセンスモジュレーション - Google Patents
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Abstract
【課題】 Survivinの発現をモジュレートするためのアンチセンス化合物、組成物および方法を提供する。
【解決手段】Survivinをコードする核酸を標的とするアンチセンス化合物、特にアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物並びにSurvivin発現のモジュレーション及びSurvivinの発現と関連した疾病の治療のためにこれらの化合物を使用する方法。
【選択図】なし
【解決手段】Survivinをコードする核酸を標的とするアンチセンス化合物、特にアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物並びにSurvivin発現のモジュレーション及びSurvivinの発現と関連した疾病の治療のためにこれらの化合物を使用する方法。
【選択図】なし
Description
発明の属する分野
本発明はSurvivin発現をモジュレートするための組成物と方法を提供する。特に、本発明はヒトSurvivinをコードする核酸と特異的にハイブリダイズ可能なアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドに関する。そのようなオリゴヌクレオチドは、Survivinの発現をモジュレートすることが示された。
本発明はSurvivin発現をモジュレートするための組成物と方法を提供する。特に、本発明はヒトSurvivinをコードする核酸と特異的にハイブリダイズ可能なアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドに関する。そのようなオリゴヌクレオチドは、Survivinの発現をモジュレートすることが示された。
発明の背景
癌性の細胞の特徴的な特質は、調節不能な増殖である。すなわち、腫瘍細胞と正常細胞との間で発見された相違の中で、アポトーシスとしても知られるプログラム細胞死のプロセスに対する耐性のことである(Ambrosini et al., Nat. Med., 1997, 3, 917-921)。アポトーシスは、多細胞生物のプロセスであり、調節不能な細胞増殖を防止するため、そして病気となるような、有害となるような、あるいはもはや必要とはされなくなったような、そのような細胞を排除するため、進化してきた。アポトーシスのプロセスには、多段階のカスケードが関与しており、それぞれのカスケードにおいて、細胞はタンパク質分解酵素およびDNAエンドヌクレアーゼの調和的な作用を通じて分解され、その結果として、アポトーシス小体を形成し、それがその後、清掃細胞(scavenger cells)により取り除かれる。これまでの研究により、細胞内分解の多くが、アスパラギン酸残基に隣接する場所で切断するタンパク質分解酵素ファミリーである、カスパーゼの働きを介して行われていることが示された。(Cohen, Biochemistry Journal, 1997, 326, 1-16)。
癌性の細胞の特徴的な特質は、調節不能な増殖である。すなわち、腫瘍細胞と正常細胞との間で発見された相違の中で、アポトーシスとしても知られるプログラム細胞死のプロセスに対する耐性のことである(Ambrosini et al., Nat. Med., 1997, 3, 917-921)。アポトーシスは、多細胞生物のプロセスであり、調節不能な細胞増殖を防止するため、そして病気となるような、有害となるような、あるいはもはや必要とはされなくなったような、そのような細胞を排除するため、進化してきた。アポトーシスのプロセスには、多段階のカスケードが関与しており、それぞれのカスケードにおいて、細胞はタンパク質分解酵素およびDNAエンドヌクレアーゼの調和的な作用を通じて分解され、その結果として、アポトーシス小体を形成し、それがその後、清掃細胞(scavenger cells)により取り除かれる。これまでの研究により、細胞内分解の多くが、アスパラギン酸残基に隣接する場所で切断するタンパク質分解酵素ファミリーである、カスパーゼの働きを介して行われていることが示された。(Cohen, Biochemistry Journal, 1997, 326, 1-16)。
ほとんどの腫瘍細胞がアポトーシスプロセスに対して抵抗性である、という知見から、腫瘍細胞のアポトーシスに対する抵抗性を減弱させることを目的とした治療ストラテジーが腫瘍性細胞の広がりを食い止める新規な手段を提示することができる、という観点が導き出された(Ambrosini et al., Nat. Med., 1997, 3, 917-921)。腫瘍細胞がアポトーシスに対する抵抗性を獲得すると考えられるメカニズムの一つは、IAP(アポトーシス阻害剤)カスパーゼ阻害剤ファミリーの構成分子として最近記載された、Survivin(サバイビン)の過剰な発現によるものである。現在まで、Survivinの過剰発現は、肺腫瘍、結腸腫瘍、膵臓腫瘍、前立腺腫瘍、乳腺腫瘍、胃の腫瘍、非-ホジキン氏リンパ腫および神経芽細胞腫において検出された(Adida et al., Lancet, 1998, 351, 882-883; Ambrosini et al., Nat. Med., 1997, 3, 917-921; Lu et al., Cancer Res., 1998, 58, 1808-1812)。より詳細な解析が、神経芽細胞腫において行われ、そこでSurvivinの過剰発現が、予後とはほとんど関連しないことが知られている腫瘍組織学とは分離されていることが、見出された(Adida et al., Lancet, 1998, 351, 882-883)。最終的には、Ambrosiniらは、HeLa細胞をSurvivinのコード鎖(Ambrosini et al., J. Bio. Chem., 1998, 273, 11177-11182)と広範囲にわたって相補的であり、そしてSurvivinアンチセンスRNAとして機能する可能性がある、コード配列である、エフェクター細胞プロテアーゼ受容体1(EPR-1)をコードするヒトcDNAの708 nt断片を含有する発現ベクターにより、トランスフェクションすることを記載している。この構築物は、細胞生存率の低下を引き起こした。アポトーシスをモジュレートする方法およびSurvivinの量または活性をモジュレートする剤を使用して、Survivinにより媒介される病理学的状態の重症度を減少させる方法は、WO 98/22589中に開示されており、この文献はまた、Ambrosiniら(上述)により記載されたEPR-1コード鎖/Survivinアンチセンス構築物もまた、開示している。
Survivinは、細胞周期制御において働いていることが最近見出された。それは、細胞周期のG2/M期において、周期-制御的様式で発現していることが見いだされ、そして紡錘体の微小管と相互作用する。この相互作用の破壊により、結果としてSurvivinの抗-アポトーシス機能が失われおよび有糸分裂の間のカスパーゼ-3活性が増大する。カスパーゼ-3は、アポトーシス性細胞死と関連している。したがって、Survivinは、G2/M期におけるアポトーシスのデフォルト誘導に対抗しうるものであると考えられる。癌におけるSurvivinの過剰発現は、このアポトーシス性チェックポイントを克服することができ、その結果癌性細胞の望まれない生存および分裂を可能にする、と考えられている。上述したAmbrosiniにより記載されたSurvivinアンチセンス構築物は、HeLa細胞における内在性のSurvivinを下方制御し、そしてG2/M期の細胞におけるカスパーゼ-3-依存性アポトーシスを増大させること、が見出された(Li et al., Nature, 1998, 396, 580-584)。
アポトーシスを理解する際の、そしてSurvivin発現がさまざまな腫瘍細胞型に対して、増殖のアドバンテージに寄与する王に働くと考えられている役割を理解する際のこれらの前進があった結果、Survivinの発現をモジュレートすることができる物質の組成物を提供することが大きな要求がある。動物において、Survivinをコードする核酸を診断しそして検出する方法を提供することが、非常に望まれている。Survivin発現から生じる症状を診断しそして治療する方法を提供することもまた、望まれる。さらに、Survivinをコードする核酸を検出しそして研究するための研究用キットおよび試薬の改良もまた、望まれる。
現在、Survivinの合成を効果的に阻害する既知の治療剤は存在しない。したがって、腫瘍におけるSurvivinの発現を効果的に阻害することができる剤を求める長い間感じられていた必要せいが存在する。Survivinに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、したがって、多くの治療用途、診断用途、そして研究用途において唯一有用であることが証明される可能性がある。
発明の概要
本発明は、Survivinをコードする核酸を標的とし、そしてSurvivinの発現をモジュレートする、アンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドに関する。本発明のアンチセンス化合物を含む医薬組成物およびその他の組成物もまた、提供する。さらに、細胞または組織中でSurvivinの発現をモジュレートする方法であって、前記細胞または組織を、1またはそれ以上の本発明のアンチセンス化合物または組成物と接触させることを含む、前記方法を提供する。さらに、治療的または予防的有効量の1またはそれ以上の本発明のアンチセンス化合物または組成物を投与することにより、Survivinの発現と関連する疾患または症状を有するか、またはかかっている可能性があると疑われる動物、特にヒトを治療する方法を提供する。
本発明は、Survivinをコードする核酸を標的とし、そしてSurvivinの発現をモジュレートする、アンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドに関する。本発明のアンチセンス化合物を含む医薬組成物およびその他の組成物もまた、提供する。さらに、細胞または組織中でSurvivinの発現をモジュレートする方法であって、前記細胞または組織を、1またはそれ以上の本発明のアンチセンス化合物または組成物と接触させることを含む、前記方法を提供する。さらに、治療的または予防的有効量の1またはそれ以上の本発明のアンチセンス化合物または組成物を投与することにより、Survivinの発現と関連する疾患または症状を有するか、またはかかっている可能性があると疑われる動物、特にヒトを治療する方法を提供する。
発明の詳細な説明
本発明は、Survivinをコードする核酸分子の機能をモジュレートする際に使用するための、究極的には産生されるSurvivinの量をモジュレートする際に使用するための、オリゴマーアンチセンス化合物、とくにオリゴヌクレオチドを利用する。これは、Survivinをコードする1またはそれ以上の核酸と特異的にハイブリダイズするアンチセンス化合物を提供することにより達成される。本明細書中で使用する場合、用語“標的核酸”および“Survivinをコードする核酸”は、SurvivinをコードするDNA、このようなDNAから転写されるRNA(プレ-mRNAおよびmRNAを含む)、およびこのようなRNAに由来するcDNAも含む。オリゴマー化合物のその標的核酸との特異的ハイブリダイゼーションは、核酸の正常な機能を妨害する。標的核酸の機能のそれに特異的にハイブリダイズする化合物によるこのモジュレーションは、一般的に“アンチセンス”といわれる。妨害すべきDNAの機能には、複製および転写が含まれる。妨害されるべきRNAの機能には、すべての生存に必要な機能、たとえばRNAのタンパク質翻訳部位への転移(translocation)、RNAからタンパク質への翻訳、1またはそれ以上のmRNA種を得るためのRNAのスプライシング、およびRNAに含まれる触媒活性またはRNAにより促進される触媒活性、が含まれる。標的核酸機能によるこのような妨害の全体的な効果は、Survivinの発現のモジュレーションである。本発明の文脈において、“モジュレーション”とは、遺伝子の発現における増加(刺激)または減少(阻害)のいずれかを意味する。本発明の文脈において、阻害は遺伝子発現のモジュレーションの好ましい形態であり、そしてmRNAは好ましい標的である。
本発明は、Survivinをコードする核酸分子の機能をモジュレートする際に使用するための、究極的には産生されるSurvivinの量をモジュレートする際に使用するための、オリゴマーアンチセンス化合物、とくにオリゴヌクレオチドを利用する。これは、Survivinをコードする1またはそれ以上の核酸と特異的にハイブリダイズするアンチセンス化合物を提供することにより達成される。本明細書中で使用する場合、用語“標的核酸”および“Survivinをコードする核酸”は、SurvivinをコードするDNA、このようなDNAから転写されるRNA(プレ-mRNAおよびmRNAを含む)、およびこのようなRNAに由来するcDNAも含む。オリゴマー化合物のその標的核酸との特異的ハイブリダイゼーションは、核酸の正常な機能を妨害する。標的核酸の機能のそれに特異的にハイブリダイズする化合物によるこのモジュレーションは、一般的に“アンチセンス”といわれる。妨害すべきDNAの機能には、複製および転写が含まれる。妨害されるべきRNAの機能には、すべての生存に必要な機能、たとえばRNAのタンパク質翻訳部位への転移(translocation)、RNAからタンパク質への翻訳、1またはそれ以上のmRNA種を得るためのRNAのスプライシング、およびRNAに含まれる触媒活性またはRNAにより促進される触媒活性、が含まれる。標的核酸機能によるこのような妨害の全体的な効果は、Survivinの発現のモジュレーションである。本発明の文脈において、“モジュレーション”とは、遺伝子の発現における増加(刺激)または減少(阻害)のいずれかを意味する。本発明の文脈において、阻害は遺伝子発現のモジュレーションの好ましい形態であり、そしてmRNAは好ましい標的である。
アンチセンスに対する特異的核酸を標的とすることが好ましい。特定の核酸に対してアンチセンス化合物を“標的化する”とは、本発明の文脈において、複数工程のプロセスである。プロセスは通常、その機能をモジュレートすべき核酸配列の同定からはじめる。たとえば、このことは、その発現が特定の症状または疾患状態と関連する細胞の遺伝子(あるいはその遺伝子から転写されるmRNA)、または感染性病原体に由来する核酸分子でありうる。本発明において、標的はSurvivinをコードする核酸分子である。標的化のプロセスにはまた、アンチセンス相互作用のためにこの遺伝子内部に1または複数の部位を決定し、所望の効果、たとえばタンパク質の発現の検出またはモジュレーション、を結果として生じるようにすることを含む。本発明の文脈において、好ましい遺伝子内部部位は、遺伝子のオープンリーディングフレーム(ORF)の翻訳開始コドンあるいは終止コドンを含む領域である。当該技術分野において既知であるように、翻訳開始コドンは、典型的には5’-AUG(転写されたmRNA分子において;対応するDNA分子においては5’-ATG)であるので、翻訳開始コドンはまた、“AUGコドン”、“スタートコドン”または“AUGスタートコドン”とも呼ばれる。少数の遺伝子は、RNA配列5’-GUG、5’-UUGまたは5’-CUGを有する翻訳開始コドンを有し、そして5’-AUA、5’-ACGおよび5’-CUGが、in vivoで機能することが示された。このように、それぞれの事例における開始アミノ酸は典型的にはメチオニン(真核細胞において)またはホルミルメチオニン(原核細胞において)であるにもかかわらず、用語“翻訳開始コドン”および“スタートコドン”は、多くのコドン配列を含むことができる。真核細胞の遺伝子および原核細胞の遺伝子は、2またはそれ以上の代わりのスタートコドンを有する場合があり、そのいずれもが好ましくは特定の細胞型または組織においてまたは特定の条件のセットのもとにおいて、翻訳開始のために利用することができる、ということも、当該技術分野において既知である。本発明の文脈において、“スタートコドン”および“翻訳開始コドン”は、そのようなコドンの1またはそれ以上の配列にかかわらず、in vivoで使用して、Survivinをコードする遺伝子から転写されるmRNA分子の翻訳を開始する、1またはそれ以上のコドンのことをいう。
遺伝子の翻訳終止コドン(または“停止コドン”)は、3つの配列、すなわち、5’-UAA、5’-UAGおよび5’-UGA(対応するDNA配列は、それぞれ、5’-TAA、5’-TAGおよび5’-TGA)のうちの一つを有しうることも、当該技術分野において既知である。用語“スタートコドン領域”および“翻訳開始コドン領域”は、翻訳開始コドンからいずれかの方向(すなわち、5’または3’)に約25から約50の連続するヌクレオチドを含む、mRNAあるいは遺伝子の部分のことを言う。同様に、用語“停止コドン領域”および“翻訳終止コドン領域”は、翻訳終止コドンからいずれかの方向(すなわち、5’または3’)に約25から約50の連続するヌクレオチドを含む、mRNAまたは遺伝子の部分のことを言う。
翻訳開始コドンと翻訳終止コドンとのあいだの領域のことを言うと当該技術分野において知られているオープンリーディングフレーム(ORF)または“コード領域”はまた、効果的に標的化されうる領域でもある。その他の標的領域には、翻訳開始コドンから5’方向におけるmRNAの部分、そしてしたがってmRNAの5’キャップ部位と翻訳開始コドンとのあいだのヌクレオチドまたは遺伝子上の対応するヌクレオチドを含むもの、のことをいうと当該技術分野において知られている5’非翻訳領域(5’UTR)、そして翻訳終止コドンから3’方向におけるmRNAの部分、そしてしたがってmRNAの翻訳終止コドンと3’末端とのあいだのヌクレオチドまたは遺伝子上の対応するヌクレオチドを含むもの、のことをいうと当該技術分野において知られている3’非翻訳領域(3’UTR)、が含まれる。mRNAの5’キャップには5’-5’三リン酸結合を介して、mRNAの最も5’側の残基と結合するN7-メチル化グアノシン残基を含む。mRNAの5’キャップ領域は、5’キャップ構造それ自体だけでなく、キャップに隣接する最初の50ヌクレオチドも含むと考えられている。5’キャップ領域もまた、好ましい標的領域でありうる。
いくつかの真核細胞mRNA転写物は直接的に翻訳されるが、多くは1またはそれ以上の“イントロン”として知られる領域を含有し、それらは翻訳される前に転写物から切り出される。残りの(そしてしたがって翻訳される)領域は、 “エクソン”として知られ、そして一緒にスプライシングされて連続的なmRNA配列を形成する。mRNAスプライス部位、すなわち、イントロン-エクソン結合もまた、好ましい標的領域である場合があり、そして特に異常なスプライシングが疾患に関与しているか、あるいは特定のmRNAスプライス産物の過剰産生が疾患に関与している状況において、特に有用である。再構成または欠損による異常な融合結合もまた、好ましい標的である。イントロンも有効である場合があり、そしてしたがって、たとえばDNAまたはプレ-mRNAを標的とするアンチセンス化合物のための標的領域が好ましい場合があることもまた、見出した。
いったん1またはそれ以上の標的部位を同定したら、標的に対して十分に相補的な、すなわち、十分によくそして十分に特異的にハイブリダイズする、オリゴヌクレオチドを選択し、所望の効果を得る。
本発明の文脈において、“ハイブリダイゼーション”とは、相補的ヌクレオシドまたはヌクレオチド塩基間のワトソン-クリック水素結合、フーグスティーン水素結合または逆フーグスティーン水素結合でありうる、水素結合を意味する。たとえば、アデニンおよびチミンは相補的な核塩基であり、水素結合を形成することを通じて対合する。本明細書中で使用する場合、“相補的”とは、2つのヌクレオチド間で正確に対合するための能力のことをいう。たとえば、オリゴヌクレオチドの特定の位置のヌクレオチドがDNAまたはRNA分子の同一の位置でヌクレオチドと水素結合することができる場合、オリゴヌクレオチドおよびDNAまたはRNAは、その位置において互いに相補的であると考えられる。オリゴヌクレオチドおよびDNAまたはRNA は、それぞれの分子中での十分な数の対応する位置が、互いに水素結合することができるヌクレオチドにより占められている場合、互いに相補的である。したがって、“特異的にハイブリダイズ可能”および“相補的”は、安定でそして特異的な結合がオリゴヌクレオチドとDNAまたはRNA標的とのあいだで生じるような、十分な程度の相補性または正確な対合を示すために使用される用語である。アンチセンス化合物の配列は、特異的にハイブリダイズ可能であるために、その標的核酸の配列と100%の相同性がある必要はないことは、当該技術分野において理解されている。アンチセンス化合物は、標的DNAまたはRNA分子に対する化合物の結合が標的DNAまたはRNAの正常な機能を妨害して利用できないようにし、そして特異的な結合が所望される条件下、すなわち、in vivoアッセイまたは治療の場合には生理学的条件下、そしてin vitroアッセイの場合には、アッセイを行う条件下にて、非-標的配列に対するアンチセンス化合物の非-特異的結合を妨害するための十分な程度の相補性が存在する場合、特異的にハイブリダイズ可能である。
アンチセンス化合物は、一般的に、研究用試薬および診断薬として使用される。たとえば、当業者はしばしば、正確な特異性により遺伝子発現を阻害することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用して、特定遺伝子の機能を解明する。たとえば、アンチセンス化合物を使用して、生物学的経路の様々なメンバーの機能どうしを区別することもある。アンチセンスモジュレーションは、したがって、研究用途として使用された。
アンチセンスの特異性および感受性も、治療用途として当業者に利用される。アンチセンスオリゴヌクレオチドを、動物およびヒトにおける疾患状態を治療する際の治療部分として使用した。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトに対して安全にそして効果的に投与され、そして多くの臨床試験が現在進行中である。したがって、オリゴヌクレオチドは、細胞、組織および動物、特にヒトの治療のための治療計画において有用なものとして形成することができる、有用な治療様式でありうることが確立される。本発明の文脈において、用語“オリゴヌクレオチド”とは、リボ核酸(RNA)またはデオキシリボ核酸(DNA)のオリゴマーまたはポリマー、またはそれらの模倣体のことをいう。この用語には、天然に存在する核塩基、糖および共有ヌクレオシド間(バックボーン)結合、および同様に機能する非-天然に存在する部分を有するオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドが含まれる。このような修飾されたまたは置換されたオリゴヌクレオチドは、たとえば、細胞取り込みの亢進、核酸標的に対する親和性の亢進、そしてヌクレアーゼの存在下における安定性の増加などの望ましい特性のため、しばしば天然の型より好ましい。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、アンチセンス化合物の好ましい形態である一方、本発明は、以下に記載するようなオリゴヌクレオチド模倣体(しかし、これらのものには限定されない)を含む、その他のオリゴマーアンチセンス化合物を包含する。本発明に従うアンチセンス化合物は、好ましくは、約8〜約30核塩基を含む。約8〜約30核塩基(すなわち、約8〜約30の連結したヌクレオシド)を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドが、特に好ましい。好ましい態様には、Survivinの発現を阻害するアンチセンス化合物の配列の少なくとも8-核塩基部分が含まれる。当該技術分野において知られているように、ヌクレオシドは塩基-糖の組み合わせである。ヌクレオシドの塩基部分は、通常はヘテロ環式塩基である。このようなヘテロ環式塩基の2つの最も一般的なクラスは、プリンとピリミジンである。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合したリン酸基をさらに含む、ヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を含むそれらのヌクレオシドに対して、リン酸基は、糖の2’、3’または5’ヒドロキシル部分のいずれかに結合することができる。オリゴヌクレオチドを形成する際に、リン酸基が隣接するヌクレオシドと互いに共有結合し、直鎖ポリマー化合物を形成する。引き続いて、この直鎖ポリマー化合物のそれぞれの末端がさらに一緒になって、環状構造を形成することができるが、しかしながら、開環直鎖構造が一般的には好ましい。オリゴヌクレオチド構造中において、リン酸基とは、一般的には、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間バックボーンを形成するものと言われる。RNAおよびDNAの正常な結合またはバックボーンは、3’から5’のホスホジエステル結合である。
本発明において有用な好ましいアンチセンス化合物の具体的な例には、修飾バックボーンまたは非-天然ヌクレオシド間結合を含有するオリゴヌクレオチドが含まれる。本明細書中で定義する場合、修飾バックボーンを有するオリゴヌクレオチドには、バックボーン中にリン原子を保持するものや、バックボーン中にリン原子を有さないものが含まれる。本明細書の目的のため、そして当該技術分野において時々参照される場合、そのヌクレオシド間バックボーン中にリン原子を有さない修飾オリゴヌクレオチドもまた、オリゴヌクレオシドであると考えることができる。
好ましい修飾オリゴヌクレオチドバックボーンには、たとえば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、3’-アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含むメチルおよびその他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、3’-アミノホスホールアミデートおよびアミノアルキルホスホールアミデートを含むホスホールアミデート、チオノホスホールアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、および正常な3’-5’結合を有するボラノホスホネート、2’-5’結合したこれらの類似体、そしてヌクレオシドユニットの隣接する塩基対が、5’-3’に対して3’-5’または5’-2’に対して2’-5’に結合する、逆向きの極性を有するもの、が含まれる。様々な塩、混合塩、そして遊離酸型も含まれる。
上述したリン-含有結合の調製を教示する代表的な米国特許には、U.S.特許: 3,687,808;4,469,863;4,476,301;5,023,243;5,177,196;5,188,897;5,264,423;5,276,019;5,278,302;5,286,717;5,321,131;5,399,676;5,405,939;5,453,496;5,455,233;5,466,677;5,476,925;5,519,126;5,536,821;5,541,306;5,550,111;5,563,253;5,571,799;5,587,361;および5,625,050が含まれるが、これらには限定されず、参考文献としてそのそれぞれを本明細書中に援用する。
リン原子を含まない好ましい修飾オリゴヌクレオチドバックボーンは、短鎖アルキルあるいはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合へテロ原子そしてアルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または1またはそれ以上の短鎖へテロ原子またはヘテロ環式ヌクレオシド間結合により形成される、バックボーンを有する。これらには、モルホリノ結合(部分的にヌクレオシドの糖部分から形成される);シロキサンバックボーン;スルフィド、スルホキシドおよびスルホンバックボーン;ホルムアセチルおよびチオホルムアセチルバックボーン;メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチルバックボーン;アルケン含有バックボーン;スルファメートバックボーン;メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノバックボーン;スルホネートおよびスルホンアミドバックボーン;アミドバックボーン;および混合N、O、SおよびCH2構成要素部分を有するその他のもの、を有するものが含まれる。
上記のオリゴヌクレオシドの調製を教示する代表的な米国特許には、U.S.特許: 5,034,506;5,166,315;5,185,444;5,214,134;5,216,141;5,235,033;5,264,562;5,264,564;5,405,938;5,434,257;5,466,677;5,470,967;5,489,677;5,541,307;5,561,225;5,596,086;5,602,240;5,610,289;5,602,240;5,608,046;5,610,289;5,618,704;5,623,070;5,663,312;5,633,360;5,677,437;および5,677,439が含まれるが、これらには限定されず、参考文献としてそのそれぞれを本明細書中に援用する。
その他の好ましいオリゴヌクレオチド模倣体において、ヌクレオチドユニットの糖およびヌクレオシド間結合の両方、すなわち、バックボーンを、新規の基により置換する。塩基ユニットは、適した核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのための維持される。優れたハイブリダイゼーション特性を有すると示されたそのようなオリゴマー化合物の一つであるオリゴヌクレオチド模倣体は、ペプチド核酸(PNA)とも呼ばれている。PNA化合物において、オリゴヌクレオチドの糖-バックボーンは、アミド含有バックボーン、特にアミノエチルグリシンバックボーンにより置換される。核塩基を保持し、そしてバックボーンのアミド部分のアザ窒素原子に直接的または間接的に結合する。PNA化合物の調製を教示する代表的な米国特許には、U.S.特許: 5,539,082;5,714,331;および5,719,262が含まれるが、これらだけには限定されず、そのそれぞれを本明細書中に参考文献として援用する。PNA化合物のさらなる教示は、Nielsenら(Science, 1991, 254, 1497-1500)中に見出すことができる。
本発明の最も好ましい態様は、ホスホロチオエートバックボーンを有するオリゴヌクレオチドおよびヘテロ原子バックボーンを有するオリゴヌクレオシドであり、特に上述の米国特許5,489,677の-CH2-NH-O-CH2-、-CH2-N(CH3)-O-CH2-〔メチレン(メチルイミノ)またはMMIバックボーン〕、-CH2-O-N(CH3)-CH2-、-CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2-および-O-N(CH3)-CH2-CH2-〔ここで、天然のホスホジエステルバックボーンは-O-P-O-CH2-として示される〕そして上述の米国特許5,602,240のアミドバックボーンである。上述した米国特許5,034,506のモルホリノバックボーン構造を有するオリゴヌクレオチドもまた好ましい。
修飾オリゴヌクレオチドは、1またはそれ以上の置換糖部分も含有する。好ましいオリゴヌクレオチドは、2’位で以下のものの一つを含む:OH;F;O-、S-、またはN-アルキル;O-、S-、またはN-アルケニル;O-、S-またはN-アルキニル;またはO-アルキル-O-アルキル、ここでアルキル、アルケニルおよびアルキニルは、置換または非置換のC1〜C10アルキルまたはC2〜C10アルケニルおよびアルキニルでありうる。O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2)nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2、およびO(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2、ここでnおよびmは1から約10である、が特に好ましい。その他の好ましいオリゴヌクレオチドは、2’位に以下のものの一つを含む:C1〜C10の低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリール、アラルキル、O-アルカリールまたはO-アラルキル、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、RNA切断基、リポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を向上するための基、またはオリゴヌクレオチドの薬理特性を向上するための基、そして同様の特性を有するその他の置換基を含む。好ましい修飾には、2’-メトキシエトキシ(2’-O-CH2CH2OCH3、2’-O-(2-メトキシエチル)または2’-MOEとしても知られる)(Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504)、すなわち、アルコキシアルコキシ基が含まれる。さらに好ましい修飾には、2’-ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、本出願により一般に所有されるものであり、そして参考文献としてその内容を本明細書中に援用する、1998年1月30日に出願した米国特許出願シリアル番号09/016,520に記載する場合、2’-DMAOEとしても知られるO(CH2)2ON(CH3)2基、が含まれる。
その他の好ましい修飾には、2’-メトキシ(2’-O-CH3)、2’-アミノプロポキシ(2’-OCH2CH2CH2NH2)および2’-フルオロ(2’-F)が含まれる。同様の修飾もまた、オリゴヌクレオチドのその他の位、特に3’末端ヌクレオチドまたは2’-5’結合オリゴヌクレオチド中の糖の3’位および5’末端ヌクレオチドの5’位において作製することもできる。オリゴヌクレオチドは、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分などの糖模倣体を有する場合もある。このような修飾糖構造の調製を教示する代表的な米国特許には、U.S.特許: 4,981,957;5,118,800;5,319,080;5,359,044;5,393,878;5,446,137;5,466,786;5,514,785;5,519,134;5,567,811;5,576,427;5,591,722;5,597,909;5,610,300;5,627,053;5,639,873;5,646,265;5,658,873;5,670,633;および5,700,920が含まれるが、これらには限定されず、そのそれぞれはその全体を参考文献として本明細書中に援用する。
オリゴヌクレオチドには、核塩基(しばしば当該技術分野において単に“塩基”としても呼ばれる)修飾または置換も含まれうる。本明細書中に使用される場合、“非修飾”または“天然”核塩基には、プリン塩基、アデニン(A)およびグアニン(G)、そしてピリミジン塩基、チミン(T)、シトシン(C)およびウラシル(U)が含まれる。修飾核塩基には、その他の合成および天然核塩基、たとえば5-メチルシトシン(5-me-C)、5-ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、2-アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの6-メチルおよびその他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの2-プロピルおよびその他のアルキル誘導体、2-チオウラシル、2-チオチミンおよび2-チオシトシン、5-ハロウラシルおよびシトシン、5-プロピニルウラシルおよびシトシン、6-アゾのウラシル、シトシンおよびチミン、5-ウラシル(シュードウラシル)、4-チオウラシル、8-ハロ、8-アミノ、8-チオール、8-チオアルキル、8-ヒドロキシルおよびその他の8-置換アデニンおよびグアニン、5-ハロ、特に5-ブロモ、5-トリフルオロメチルおよびその他の5-置換ウラシルおよびシトシン、7-メチルグアニンおよび7-メチルアデニン、8-アザグアニンおよび8-アザアデニン、7-デアザグアニンおよび7-デアザアデニンおよび3-デアザグアニンおよび3-デアザアデニンが含まれる。さらなる核塩基には、米国特許3,687,808に開示されたもの、Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858-859、Kroschwitz, J.I., ed. John Wiley & Sons, 1990に開示されたもの、Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613に開示されたもの、そしてSanghvi, Y.S., Chapter 15, Antisense Research and Applications, pages 289-302, Crooke, S.T. and Lebleu, B. , ed., CRC Press, 1993により開示されたもの、が含まれる。これらの核塩基の特定のものは、本発明のオリゴマー化合物の結合親和性を増加させるために特に有用である。これらには、2-アミノプロピルアデニン、5-プロピニルウラシルおよび5-プロピニルシトシンを含む、5-置換ピリミジン、6-アザピリミジンおよびN-2、N-6およびO-6置換プリンが含まれる。5-メチルシトシン置換は、核酸二重鎖安定性を0.6〜1.2℃増加させることが示され(Sanghvi, Y.S., Crooke, S.T. and Lebleu, B., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278)、そして現在は好ましい塩基置換であり、2’-O-メトキシエチル糖修飾と組み合わせた場合にさらにより特に好ましい。
上述した修飾核塩基の特定のものおよびその他の修飾核塩基の調製を教示する代表的な米国特許には、上述したU.S.特許 3,687,808、およびU.S.特許: 4,845,205;5,130,302;5,134,066;5,175,273;5,367,066;5,432,272;5,457,187;5,459,255;5,484,908;5,502,177;5,525,711;5,552,540;5,587,469;5,594,121;5,596,091;5,614,617;5,681,941;および5,750,692が含まれるが、これらには限定されず、そのそれぞれは参考文献として本明細書中に援用する。
本発明のオリゴヌクレオチドのその他の修飾には、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、または細胞取り込みを向上する、化学的にオリゴヌクレオチドに結合する1またはそれ以上の部分または複合体が含まれる。そのような部分には、脂質部分、たとえばコレステロール部分(Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553-6556)、コール酸(Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1994, 4, 1053-1060)、チオエーテル、たとえば、ヘキシル-S-トリチルチオール(Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660, 306-309;Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765-2770)、チオコレステロール(Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533-538)、脂肪族鎖、たとえば、ドデカンジオールまたはウンデシル残基(Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10, 1111-1118;Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259, 327-330;Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75, 49-54)、リン脂質、たとえば、ジ-ヘキサデシル-rac-グリセロールまたはトリエチルアンモニウム1,2-ジ-O-ヘキサデシル-rac-グリセロ-3-H-ホスホネート(Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654;Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777-3783)、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖(Manoharan et al., Nucleosides & Nucleoside, 1995, 14, 969-973)、またはアダマンタン酢酸(Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654)、パルミチル部分(Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229-237)、またはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ-カルボニル-オキシコレステロール部分(Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277, 923-937)が含まれるが、これらには限定されない。
この様なオリゴヌクレオチド複合体の調製を教示する代表的な米国特許には、U.S.特許: 4,828,979;4,948,882;5,218,105;5,525,465;5,541,313;5,545,730;5,552,538;5,578,717, 5,580,731;5,580,731;5,591,584;5,109,124;5,118,802;5,138,045;5,414,077;5,486,603;5,512,439;5,578,718;5,608,046;4,587,044;4,605,735;4,667,025;4,762,779;4,789,737;4,824,941;4,835,263;4,876,335;4,904,582;4,958,013;5,082,830;5,112,963;5,214,136;5,082,830;5,112,963;5,214,136;5,245,022;5,254,469;5,258,506;5,262,536;5,272,250;5,292,873;5,317,098;5,371,241, 5,391,723;5,416,203, 5,451,463;5,510,475;5,512,667;5,514,785;5,565,552;5,567,810;5,574,142;5,585,481;5,587,371;5,595,726;5,597,696;5,599,923;5,599,928および5,688,941が含まれるが、これらには限定されず、そのそれぞれは参考文献として本明細書中に援用される。
所定の化合物中のすべての位置を均一に修飾されることが必要とはされず、そして実際に、一つ以上の上述した修飾を、単一の化合物中あるいはオリゴヌクレオチド中の単一のヌクレオシドにおいても組み込むことができる。本発明には、キメラ化合物であるアンチセンス化合物も含まれる。本発明の文脈において、“キメラ”アンチセンス化合物または“キメラ”は、2つまたはそれ以上の化学的に特徴的な領域を含有するアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドであり、それぞれが少なくとも一つのモノマーユニット、すなわち、オリゴヌクレオチド化合物の場合にヌクレオチドから形成される。これらのオリゴヌクレオチドは、典型的には少なくとも一つの領域を含有し、ここでオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドに対して、増加したヌクレアーゼ分解耐性、増加した細胞取り込みおよび/または標的核酸に対する増加した結合親和性を付与するように、修飾される。オリゴヌクレオチドの追加の領域は、RNA:DNAまたはRNA:RNAハイブリッドを切断することができる酵素に対する基質として働くことができる。例を挙げると、RNase Hは、RNA:DNA二重鎖のRNA鎖を切断する、細胞性のエンドヌクレアーゼである。RNase Hの活性化により、したがって、結果としてRNA標的の切断を引き起こし、それにより遺伝子発現のオリゴヌクレオチド阻害の効率を非常に向上させる。結果として、キメラオリゴヌクレオチドを使用する場合に、同一の標的領域に対してハイブリダイズするホスホロチオエートデオキシオリゴヌクレオチドの場合と比較して、しばしばより短いオリゴヌクレオチドにより匹敵する結果を得ることができる。RNA標的の切断は、ゲル電気泳動により、そして必要な場合には当該技術分野において既知の関連する核酸ハイブリダイゼーション技術により、日常的に検出することができる。
本発明のキメラアンチセンス化合物は、2つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシドおよび/または上述したオリゴヌクレオチド模倣体の混成の構造として形成することができる。このような化合物は、 当該技術分野においてハイブリッドまたはギャップマーとも呼ばれている。このようなハイブリッド構造の調製を教示する代表的な米国特許には、U.S.特許: 5,013,830;5,149,797;5,220,007;5,256,775;5,366,878;5,403,711;5,491,133;5,565,350;5,623,065;5,652,355;5,652,356;および5,700,922が含まれるが、これらには限定されず、そのそれぞれは全体として参考文献として本明細書中に援用される。
本発明に従って使用されるアンチセンス化合物は、周知の固相合成技術を介して、容易にそして日常的に作製することができる。このような合成のための装置は、たとえばApplied Biosystems(Foster City, CA)を含むいくつかの供給者により販売されている。このような合成のための当該技術分野において既知のいずれかその他の手段を、追加的にまたは代替的に使用することができる。同様な技術を使用してホスホロチオエートおよびアルキル化誘導体などのオリゴヌクレオチドを調製することは周知である。
本発明のアンチセンス化合物は、in vitroで合成され、そして生物学的起源のアンチセンス組成物またはアンチセンス分子のin vivo合成を指向するように設計された遺伝子ベクター構築物を含まない。
本発明の化合物を、取り込み、分布および/または吸収を助けるために、たとえば、リポソーム、受容体標的化分子、経口、直腸、局所またはその他の製剤として、混合し、カプセル化し、複合体化することができ、またはそうでなければ、その他の分子、分子構造、または化合物の混合物と結合させてもよい。そのような取り込み、分布および/または吸収を助ける製剤の調製を教示する代表的な米国特許には、U.S.特許: 5,108,921;5,354,844;5,416,016;5,459,127;5,521,291;5,543,158;5,547,932;5,583,020;5,591,721;4,426,330;4,534,899;5,013,556;5,108,921;5,213,804;5,227,170;5,264,221;5,356,633;5,395,619;5,416,016;5,417,978;5,462,854;5,469,854;5,512,295;5,527,528;5,534,259;5,543,152;5,556,948;5,580,575;および5,595,756が含まれるが、それらには限定されず、そのそれぞれを参考文献として本明細書中に援用する。
本発明のアンチセンス化合物は、いずれかの医薬的に許容可能な塩、エステル、またはそのようなエステルの塩、またはヒトを含む動物に投与する際にその生物学的に活性な代謝物または残留物を(直接的にまたは間接的に)提供することができるいずれか他の化合物を包含する。したがって、たとえば、開示から、プロドラッグおよび医薬的に許容可能な本発明の化合物の塩、そのプロドラッグの医薬的に許容可能な塩、およびその他の生物学的等価物も導き出される。
用語“プロドラッグ”は、内在性の酵素またはその他の化学物質および/または条件の作用により、その体内または細胞内で活性化型(すなわち、薬物)に変換される、不活性型で調製される治療剤のことを示す。特に、本発明のオリゴヌクレオチドのプロドラッグ版は、GosselinらのWO 93/24510(1993年12月9日に発行)またはImbachらのWO 94/26764に開示された方法に従うSATE[(S-アセチル-2-チオエチル)ホスフェート]誘導体として調製される。
用語“医薬的に許容可能な塩”とは、生理学的または医薬的に許容可能な本発明の化合物の塩:すなわち、親化合物の所望の生物学的活性を保持し、そしてそれについての所望しない毒性効果を与えない塩のことをいう。
医薬的に許容可能な塩基付加塩は、金属またはアミン、たとえばアルカリおよびアルカリ土類金属または有機アミンなどにより形成される。カチオンとして使用される金属の例は、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどである。適したアミンの例は、N,N’-ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、エチレンジアミン、N-メチルグルカミン、およびプロカイン(たとえば、Berge et al., “Pharmaceutical Salts,” J. of Pharma Sci., 1977, 66, 1-19を参照)である。前記酸性化合物の塩基付加塩は、遊離酸型を十分な量の所望の塩基と接触させて、共有結合様式で塩を生成することにより、調製する。遊離酸型は、塩型を酸と接触させることにより、そして遊離酸を従来の様式で単離することにより、再生することができる。遊離酸型は、そのそれぞれの塩型とは、極性溶媒中への溶解性などの特定の生理学的特性においていくらか異なっているが、しかしそれ以外は、本発明の目的のためには、塩はそれらそれぞれの遊離酸と等価である。本明細書中で使用される場合、“医薬的な付加塩”には、本発明の組成物の構成要素の一つの酸型の医薬的に許容可能な塩が含まれる。これらには、アミンの有機酸塩または無機酸塩が含まれる。好ましい酸塩は、塩酸塩、酢酸塩、サリチル酸塩、硝酸塩およびリン酸塩である。その他の適した医薬的に許容可能な塩は、当業者に周知であり、そして様々な無機酸および有機酸の塩基性塩が含まれ、たとえば、無機酸を有するものとしては、たとえば塩酸、臭化水素酸、硫酸またはリン酸など;有機酸を有するものとしてはカルボン酸、スルホン酸、スルホ酸またはリン酸またはN-置換スルファミン酸、たとえば酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、コハク酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、メチルマレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、乳酸、シュウ酸、グルコン酸、グルカル酸、グルクロン酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、サリチル酸、4-アミノサリチル酸、2-フェノキシ安息香酸、2-アセトキシ安息香酸、エンボン酸(embonic acid)、ニコチン酸またはイソニコチン酸;そしてアミノ酸を有するものとしては、本来はタンパク質の合成に関連する20個のα-アミノ酸、たとえばグルタミン酸、またはアスパラギン酸など、そしてまた、フェニル酢酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、2-ヒドロキシエタンスルホン酸、エタン-1,2-ジスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、4-メチルベンゼンスルホン酸、ナフタレン-2-スルホン酸、ナフタレン-1,5-ジスルホン酸、2-または3-ホスホグリセリン酸、グルコース-6-ホスフェート、N-シクロヘキシルスルファミン酸(シクラメートの形成を伴う)を有するもの、またはその他の酸有機化合物、たとえば、アスコルビン酸などを有するものが含まれる。化合物の医薬的に許容可能な塩もまた、医薬的に許容可能なカチオンにより調製することができる。適した医薬的に許容可能なカチオンは、当業者に周知であり、そしてアルカリ、アルカリ土類、アンモニウムおよび第四アンモニウムカチオンが含まれる。炭酸塩または炭酸水素塩もまた可能である。
オリゴヌクレオチドについて、医薬的に許容可能な塩の好ましい例には、(a)ナトリウム、カリウム、アンモニウム、マグネシウム、カルシウム、スペルミンおよびスペルミジンなどのポリアミンなどのカチオンにより形成される塩;(b)無機酸、たとえば塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸などにより形成される酸付加塩;(c)有機酸、たとえば酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、パルミチン酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンスルホン酸、メタンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、ポリガラクツロン酸などにより形成される塩;そして(d)塩素、臭素、およびヨウ素などの元素アニオンから形成される塩;が含まれるが、これらには限定されない。
本発明のアンチセンス化合物は、診断薬、治療薬、予防薬、そして研究用試薬およびキットとして使用することができる。治療薬として、Survivinの発現をモジュレートすることにより治療することができる疾患または症状を有することが疑われる動物、好ましくはヒトを、本発明に従うアンチセンス化合物を投与することにより治療する。本発明の化合物を、有効量のアンチセンス化合物を適した医薬的に許容可能な希釈剤または担体に添加することにより、医薬組成物中で利用することができる。本発明のアンチセンス化合物および方法の使用はまた、予防的、たとえば、感染、炎症または腫瘍形成を予防しまたは遅延させるためにも有用である場合がある。
これらの化合物がSurvivinをコードする核酸に対してハイブリダイズし、この事実を探求するためにサンドイッチアッセイおよびその他のアッセイを容易に構築することができるため、本発明のアンチセンス化合物は、研究用としてそして診断薬として有用である。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドのSurvivinをコードする核酸とのハイブリダイゼーションは、当該技術分野において既知の手段により検出することができる。このような手段には、オリゴヌクレオチドに対する酵素の複合化、オリゴヌクレオチドの放射標識またはいずれかその他の適した検出手段を含むことができる。サンプル中のSurvivinのレベルを検出するためのこの様な検出手段を使用するキットもまた、調製することができる。
本発明はまた、本発明のアンチセンス化合物を含む医薬組成物および製剤も含む。本発明の医薬組成物は、局所治療または全身治療のいずれが好ましいか、および治療すべき領域、に依存して、多数の方法で投与することができる。投与は、局所(眼および膣送達および直腸送達を含む粘膜を含む)、ネブライザーによるものを含む、たとえば粉末またはエアロゾルの吸入または吹き入れによる、肺;気管内、鼻内、表皮、皮内および経皮、経口または非経口、であってもよい。非経口投与には、静脈内注射、動脈内注射、皮下注射、腹腔内注射、または筋肉内注射、点滴または輸液;または頭蓋内、たとえばクモ膜下投与または脳室内投与が含まれる。少なくとも一つの2’-O-メトキシエチル修飾を有するオリゴヌクレオチドは、経口投与に特に有用であると考えられている。
医薬組成物および製剤には、経皮パッチ剤、軟膏剤、ローション剤、クリーム剤、ゲル剤、滴剤、坐剤、スプレー剤、液剤および粉末剤が含まれる可能性がある。従来からの医薬的なキャリア、液体、粉末または油状基剤、増粘剤などが、必須であるかまたは所望される場合がある。コートされたコンドーム、グローブなどもまた、有用である場合がある。
経口投与用の組成物および製剤には、粉末剤または顆粒剤、水中または非-水性媒体中の懸濁剤または溶液剤、カプセル剤、サシェ剤、または錠剤が含まれる。増粘剤、着香剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤または結合剤が望まれる場合がある。
非経口投与用、クモ膜下投与用、または脳室内投与用の組成物および製剤は、バッファー剤、希釈剤およびたとえば浸透亢進剤、キャリア化合物、および医薬的に許容可能なキャリアまたは賦形剤などの、しかしこれらには限定されない、その他の適した添加剤、もまた含有する場合がある、滅菌水溶液を含んでもよい。
本発明のオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物および/または製剤は、オリゴヌクレオチドの食餌性送達を亢進するため、浸透亢進剤を含んでいてもよい。浸透亢進剤は、5種の幅広いカテゴリー、すなわち、脂肪酸、胆汁酸、キレート剤、サーファクタント、および非-サーファクタント、のうちの一つに属するものとして分類することができる。(Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, 8, 91-192; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7:1, 1-33)。1またはそれ以上のこれらの広いカテゴリーに由来する1またはそれ以上の浸透亢進剤が、含まれる場合がある。
浸透亢進剤として機能する、様々な脂肪酸およびその誘導体には、たとえば、オレイン酸、ラウリン酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、レシンレアート、モノオレイン(a.k.a. 1-モノオレイル-rac-グリセロール)、ジラウリン、カプリル酸、アラキドン酸、グリセリル1-モノカプレート、1-ドデシルアザシクロヘプタン-2-オン、アシルカルニチン、アシルコリン、モノ-およびジ-グリセリドおよび生理学的に許容可能なそれらの塩(すなわち、オレエート、ラウレート、カプレート、ミリステート、パルミテート、ステアレート、リノレエートなど)が含まれる(Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, 8:2, 91-192;Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7:1, 1-33;El-Hariri et al., J. Pharm. Pharmacol., 1992, 44, 651-654)。いくつかの現在好ましい脂肪酸の例は、0.5〜5%の濃度で単独であるいは組み合わせて使用する、カプリン酸ナトリウムおよびラウリン酸ナトリウムである。
胆汁の生理学的役割には、脂質吸収および脂肪-可溶性ビタミンの吸収の促進が含まれる(Brunton, Chapter 38 In: Goodman & Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9th Ed., Hardman et al., eds., McGraw-Hill, New York, NY, 1996, pages 934-935)。様々な天然の胆汁酸塩、およびそれらの合成誘導体は、浸透亢進剤として機能する。したがって、“胆汁酸塩”という語には、胆汁の天然に存在する構成要素、およびそれらの合成誘導体が含まれる。現在好ましい胆汁酸塩の例としては、ケノデオキシコール酸(CDCA)および/またはウルソデオキシコール酸(UDCA)があり、一般的には0.5〜2%の濃度で使用される。
1またはそれ以上の浸透亢進剤を含む複合製剤を使用することができる。たとえば、胆汁酸塩を脂肪酸とともに使用して、複合製剤を製造することができる。好ましい組み合わせには、カプリン酸ナトリウムまたはラウリン酸ナトリウム(一般的には0.5〜5%)と組み合わせたCDCAが含まれる。
キレート剤には、エチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)2ナトリウム、クエン酸、サリチル酸(たとえば、サリチル酸ナトリウム、5-メトキシサリチル酸およびホモバニレート), コラーゲンのN-アシル誘導体、ラウレス-9およびベータ-ジケトンのN-アミノアシル誘導体(エナミン)が含まれるが、これらのものには限定されない(Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, 8:2, 92-192; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7:1, 1-33; Buur et al., J. Control Rel., 1990, 14, 43-51)。キレート剤は、DNase阻害剤としても機能する追加の利点を有する。
サーファクタントには、たとえば、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン-9-ラウリルエーテルおよびポリオキシエチレン-20-セチルエーテル(Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, 8:2, 92-191);およびたとえばFC-43などのパーフルオロ化学物質エマルジョン(Takahashi et al., J. Pharm. Pharmacol., 1988, 40, 252-257)が含まれる。
非-サーファクタントには、たとえば、不飽和環状ウレア、1-アルキル-および1-アルケニルアザシクロ-アルカノン誘導体(Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, 8:2, 92-191);およびジクロフェナクナトリウム、インドメタシンおよびフェニルブタゾンなどの非-ステロイド性抗-炎症剤(Yamashita et al., J. Pharm. Pharmacol., 1987, 39, 621-626)が含まれる。
本明細書中で使用する場合、“キャリア化合物”は、不活性な(すなわち、それ自体生物学的アッセイを有さない)、しかしたとえば、生物学的に活性な核酸を分解しまたはその循環からの除去を促進することにより、生物学的活性を有する核酸の生物学的利用性を減少するin vivoプロセスにより核酸として認識される、核酸、またはその類似体のことをいう。核酸とキャリア化合物(典型的にはキャリア化合物を過剰量)の共投与により、おそらくは担体化合物と核酸との一般的な受容体に対する競合により、結果として、肝臓、腎臓、またはその他の循環外レゼルボア中で回収される核酸の量の実質的な減少が引き起こされる。たとえば、ポリイノシン酸、硫酸デキストラン、ポリシチジン酸あるいは4-アセトアミド-4’イソチオシアノ-スチルベン-2,2’-ジスルホン酸とともに共投与する場合、肝臓組織中での部分的ホスホロチオエート化オリゴヌクレオチドの回収を減少することができる(Miyao et al., Antisense Res. Dev., 1995, 5, 115-121; Takakura et al., Antisense & Nucl. Acid Drug Dev., 1996, 6, 177-183).
キャリア化合物とは対照的に、“医薬的に許容可能なキャリア”(賦形剤)は、医薬的に許容可能な溶媒、懸濁剤、または1またはそれ以上の核酸を動物に送達するためのその他の医薬的に不活性なビヒクルのいずれかである。医薬的に許容可能なキャリアは、液体であってもあるいは固体であってもよく、そして、想定した計画された様式の投与により、核酸および所定の医薬組成物のその他の構成要素と組み合わせた場合、所望のバルク、粘度などを提供するように選択される。典型的な医薬的に許容可能な担体には、結合剤(たとえば、α化コーンスターチ、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースなど);充填剤(たとえば、ラクトースおよびその他の糖、微結晶セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリル酸またはリン酸水素カルシウムなど);潤滑剤(たとえば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド状シリコンジオキシド、ステアリン酸、金属性ステアリン酸、硬化植物油、コーンスターチ、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなど);崩壊剤(たとえば、スターチ、スターチグリコール酸ナトリウムなど);および湿潤剤(たとえば、ラウリル硫酸ナトリウムなど)が含まれるが、これらには限定されない。経口投与用剤形のための徐放性経口送達システムおよび/または腸溶性コーティングは、U.S.特許4,704,295;4,556,552;4,309,406;および4,309,404に開示されている。
キャリア化合物とは対照的に、“医薬的に許容可能なキャリア”(賦形剤)は、医薬的に許容可能な溶媒、懸濁剤、または1またはそれ以上の核酸を動物に送達するためのその他の医薬的に不活性なビヒクルのいずれかである。医薬的に許容可能なキャリアは、液体であってもあるいは固体であってもよく、そして、想定した計画された様式の投与により、核酸および所定の医薬組成物のその他の構成要素と組み合わせた場合、所望のバルク、粘度などを提供するように選択される。典型的な医薬的に許容可能な担体には、結合剤(たとえば、α化コーンスターチ、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースなど);充填剤(たとえば、ラクトースおよびその他の糖、微結晶セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリル酸またはリン酸水素カルシウムなど);潤滑剤(たとえば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド状シリコンジオキシド、ステアリン酸、金属性ステアリン酸、硬化植物油、コーンスターチ、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなど);崩壊剤(たとえば、スターチ、スターチグリコール酸ナトリウムなど);および湿潤剤(たとえば、ラウリル硫酸ナトリウムなど)が含まれるが、これらには限定されない。経口投与用剤形のための徐放性経口送達システムおよび/または腸溶性コーティングは、U.S.特許4,704,295;4,556,552;4,309,406;および4,309,404に開示されている。
本発明の組成物にはさらに、医薬組成物中に従来見出されたその他の補助剤構成要素を、それらの技術において確立された使用レベルで含有することができる。このように、たとえば、組成物には、たとえば、鎮痒薬、収斂剤、局所麻酔薬または抗炎症剤などの追加的で適合性な医薬的に活性な物質を含有することができ、または本発明の組成物の様々な用量剤形を物理的に製剤化する際に有用な追加の物質、たとえば色素、着香剤、保存剤、抗酸化剤、乳白剤、増粘剤および安定化剤など、を含有することができる。しかしながら、このような物質は、添加される場合、本発明の組成物の構成要素の生物学的活性を過度に妨害すべきではない。
本発明のアンチセンス化合物を患者体内に導入する方法にかかわらず、コロイド分散システムを送達ビヒクルとして使用して、化合物のin vivo安定性を亢進し、および/または特定の器官、組織または細胞型に対して化合物を標的化することができる。コロイド分散システムには、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフィア、ビーズ、および水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、リポソーム、および不特定構造の脂質:オリゴヌクレオチド複合体を含む脂質ベースのシステムが含まれるが、これらのものには限定されない。好ましいコロイド分散システムは、多数のリポソームである。リポソームは、二重層構造中に配置された1またはそれ以上の脂質から形成された外層により囲まれた水性コアを有する、非常に小さな球体である(一般的には、Chonn et al., Current Op. Biotech., 1995, 6, 698-708を参照)。
本発明の特定の態様は、(a)1またはそれ以上のアンチセンス化合物および(b)非-アンチセンス化合物メカニズムで機能する、1またはそれ以上のその他の化学療法剤を含有する、リポソームおよびその他の組成物を提供する。このような化学療法剤の例には、ダウノルビシン、ダウノマイシン、ダクチノマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン(epirubicin)、イダルビシン(idarubicin)、エソルビシン(esorubicin)、ブレオマイシ、マフォスファミド(mafosfamide)、イフォスファミド(ifosfamide)、シトシンアラビノシド、ビス-クロロエチルニトロソウレア、ブスルファン、マイトマイシンC、アクチノマイシンD、ミトラマイシン、プレドニゾン、ヒドロキシプロゲステロン、テストステロン、タモキシフェン、ダカルバジン、プロカルバジン、ヘキサメチルメラミン、ペンタメチルメラミン、マイトキサントロン、アムサクリン、クロラムブシル、メチルシクロヘキシルニトロソウレア、ナイトロジェンマスタード、メルファラン、シクロホスファミド、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、シタラビン、5-アザシチジン、ヒドロキシウレア、デオキシコフォルマイシン、4-ヒドロキシペルオキシシクロホスホールアミド、5-フルオロウラシル(5-FU)、5-フルオロデオキシウリジン(5-FUdR)、メトトレキセート(MTX)、コルヒチン、タキソール、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド(VP-16)、トリメトレキセート、イリノテカン(irinotecan)、トポテカン(topotecan)、ゲムシタビン(gemcitabine)、テニポシド、シスプラチンおよびジエチルスチルベストロール(DES)が含まれれるが、これらのものには限定されない。一般的には、The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 15th Ed. 1987, pp. 1206-1228, Berkow et al., eds., Rahway, N.J.を参照。本発明の化合物とともに使用する場合、このような化学療法剤を個別に(たとえば、5-FUおよびオリゴヌクレオチド)、連続的に(たとえば、ある期間5-FUおよびオリゴヌクレオチド、その後MTXおよびオリゴヌクレオチド)、または1またはそれ以上のその他のこのような化学療法剤と組み合わせて(たとえば、5-FU、MTXおよびオリゴヌクレオチド、または5-FU、放射線療法およびオリゴヌクレオチド)、使用することができる。
非ステロイド性抗-炎症剤およびコルチコステロイドを含むが、これらのものには限定されない、抗-炎症剤、およびリビビリン(ribivirin)、ビダラビン、アシクロビル、およびガンシクロビルを含むが、これらのものには限定されない、抗ウィルス剤を、本発明の組成物中に組み合わせてもよい(一般的には、それぞれThe Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 15th Ed., Berkow et al., eds., 1987, Rahway, N.J., pages 2499-2506および46-49を参照)。その他の非-アンチセンス化学療法剤もまた、本発明の範囲内にある。2またはそれ以上の組み合わせ化合物を、一緒にまたは連続的に使用することができる。
別の関連する態様において、本発明の組成物は、第一の核酸を標的とする1またはそれ以上のアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチド、および第二の核酸標的を標的とする1またはそれ以上の追加のアンチセンス化合物を含有することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドの例には、本出願人により共通して所有され、本明細書中に参照文献として援用される、示されたU.S.特許または係属中のU.S.出願、もしくは示された国際公開されたPCT出願の中に記載されるような以下の標的に対するものを含むが、これらのものには限定されない:raf(WO 96/39415、WO 95/32987およびU.S.特許5,563,255および5,656,612)、p120仁(nucleolar)抗原(WO 93/17125およびU.S.特許5,656,743)、タンパク質キナーゼC(WO 95/02069、WO 95/03833およびWO 93/19203)、多剤耐性-関連タンパク質(WO 95/10938およびU.S.特許5,510,239)、転写因子AP-1のサブユニット(1997年4月14日に出願の係属中出願U.S.シリアルNo. 08/837,201)、Junキナーゼ(1997年8月13日に出願の係属中出願U.S.シリアルNo. 08/910,629)、MDR-1(多剤耐性糖タンパク質;1997年9月30日に出願の係属中出願U.S.シリアルNo. 08/731,199)、HIV(U.S.特許5,166,195および5,591,600)、ヘルペスウィルス(U.S.特許5,248,670および5,514,577)、サイトメガロウィルス(U.S.特許5,442,049および5,591,720)、パピローマウィルス(U.S.特許5,457,189)、細胞間接着分子-1(ICAM-1)(U.S.特許5,514,788)、5-リポキシゲナーゼ(U.S.特許5,530,114)およびインフルエンザウィルス(U.S.特許5,580,767)。2またはそれ以上の組み合わせ化合物を、一緒にまたは連続して使用することができる。
治療用組成物の製剤化およびそれに引き続く投与は、当該技術分野の技術の範囲内のものであると考えられる。用量は、治療すべき疾患状態の重症度および反応性に依存し、数日間から数ヶ月間持続する治療経過、あるいは治癒が得られるかまたは疾患の減退が得られるまでの治療経過を伴う。最適な用量スケジュールは、患者体内での薬物の蓄積を測定することから算出することができる。当業者であれば、最適用量、投与方法、および反復頻度を容易に決定することができる。最適な用量は、個々のオリゴヌクレオチドの比効力に依存して変更することができ、そして一般的には、in vitroおよびin vivo動物モデルにおいて効果的であることが見いだされるEC50に基づいて見積もることができる。一般的には、用量は、0.01μg〜100 g/kg体重であり、そして1日、1週間、1ヶ月、あるいは1年に一度またはそれ以上与えることができ、あるいは2〜20年ごとに1度であってもよい。当業者は、体液あるいは組織における薬物の測定された滞留時間および濃度に基づいて、投与のための反復頻度を容易に見積もることができる。継続的な治療により、患者に維持療法を受けさせて、疾患状態の再発を防止することが好ましく、ここでオリゴヌクレオチドは、1日に1回またはそれ以上〜20年間ごとに1回で、0.01μg〜100 g/kg体重の範囲で、維持用量で投与する。
本発明特定のその好ましい態様にしたがって、具体的に記載されるが、以下の実施例は、本発明の説明のためにのみ提供し、そして本発明を限定することを意図するものではない。
実施例1
オリゴヌクレオチド合成のためのヌクレオシドホスホールアミダイト
デオキシ及び2’-アルコキシアミダイト
2’-デオキシ及び2’-メトキシβ-シアノエチルジイソプロピルホスホールアミダイトを販売元(例えば、Chemgenes, Needham MA またはGlen Research, Inc. Sterling VA)より購入した。他の2’-O-アルコキシ置換ヌクレオシドアミダイトは、本明細書中で参考文献として援用される、アメリカ合衆国特許5,506,351に記載の通り調製する。2’-アルコキシアミダイトを用いてオリゴヌクレオチドを合成するために、テトラゾール及び塩基のパルスデリバリー後の待機段階を360秒に増加した以外は、非修飾オリゴヌクレオチドのための標準サイクルを使用した。
オリゴヌクレオチド合成のためのヌクレオシドホスホールアミダイト
デオキシ及び2’-アルコキシアミダイト
2’-デオキシ及び2’-メトキシβ-シアノエチルジイソプロピルホスホールアミダイトを販売元(例えば、Chemgenes, Needham MA またはGlen Research, Inc. Sterling VA)より購入した。他の2’-O-アルコキシ置換ヌクレオシドアミダイトは、本明細書中で参考文献として援用される、アメリカ合衆国特許5,506,351に記載の通り調製する。2’-アルコキシアミダイトを用いてオリゴヌクレオチドを合成するために、テトラゾール及び塩基のパルスデリバリー後の待機段階を360秒に増加した以外は、非修飾オリゴヌクレオチドのための標準サイクルを使用した。
5-メチル-2’-デオキシシチジン(5-Me-C)ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドは、市販のホスホールアミダイト(Glen Research, Sterling VAまたはChemGenes, Needham MA)を用いて公表された方法〔Sanghvi ら、Nucleic Acids Research, 1993, 21, 3197-3203〕に従って合成した。
2’-フルオロアミダイト
2’-フルオロデオキシアデノシンアミダイト
2’-フルオロオリゴヌクレオチドは、本明細書中で参考文献として援用される以前に記載の通り〔Kawasakiら、 J. Med. Chem., 1993, 36, 831-841〕、及び、アメリカ合衆国特許5,670,633に記載の通り合成した。簡潔には、保護されたヌクレオシドであるN6-ベンゾイル-2’-デオキシ-2’-フルオロアデノシンは、市販の9-β-D-アラビノフラノシルアデニンを出発物質として使用し、そして文献手法を修正して、2’-α-フルオロ原子を2’-β-トリチル基のSN2-置換により導入することより、合成した。このようにN6-ベンゾイル-9-β-D-アラビノフラノシルアデニンは中程度の収量で3’,5’-ジテトラヒドロピラニル(THP)中間体として選択的に保護した。THP及びN6-ベンゾイル基の脱保護は標準的な手法論を用いて成され、そして標準手法を用いて5’-ジメトキシトリチル-(DMT)及び5’-DMT-3’-ホスホールアミダイト中間体を得た。
2’-フルオロデオキシアデノシンアミダイト
2’-フルオロオリゴヌクレオチドは、本明細書中で参考文献として援用される以前に記載の通り〔Kawasakiら、 J. Med. Chem., 1993, 36, 831-841〕、及び、アメリカ合衆国特許5,670,633に記載の通り合成した。簡潔には、保護されたヌクレオシドであるN6-ベンゾイル-2’-デオキシ-2’-フルオロアデノシンは、市販の9-β-D-アラビノフラノシルアデニンを出発物質として使用し、そして文献手法を修正して、2’-α-フルオロ原子を2’-β-トリチル基のSN2-置換により導入することより、合成した。このようにN6-ベンゾイル-9-β-D-アラビノフラノシルアデニンは中程度の収量で3’,5’-ジテトラヒドロピラニル(THP)中間体として選択的に保護した。THP及びN6-ベンゾイル基の脱保護は標準的な手法論を用いて成され、そして標準手法を用いて5’-ジメトキシトリチル-(DMT)及び5’-DMT-3’-ホスホールアミダイト中間体を得た。
2’-フルオロデオキシグアノシン
2’-デオキシ-2’-フルオログアノシンの合成はテトライソプロピルジシロキサニル(TPDS)で保護した9-β-D-アラビノフラノシルグアニンを出発物質として用い、そして、中間体であるジイソブチリルアラビノフラノシルグアノシンへの変換により成された。TPDS基の脱保護に続いて水酸基のTHPによる保護によりジイソブチリルジ-THP保護アラビノフラノシルグアニンを得た。選択的なO-脱アシル化及びトリフラート化に続き、フルオリドによる粗生成物の処理をし、その後THP基の脱保護をした。標準的な方法論を使用し、5’-DMT-及び5’-DMT-3’-ホスホールアミダイトを得た。
2’-デオキシ-2’-フルオログアノシンの合成はテトライソプロピルジシロキサニル(TPDS)で保護した9-β-D-アラビノフラノシルグアニンを出発物質として用い、そして、中間体であるジイソブチリルアラビノフラノシルグアノシンへの変換により成された。TPDS基の脱保護に続いて水酸基のTHPによる保護によりジイソブチリルジ-THP保護アラビノフラノシルグアニンを得た。選択的なO-脱アシル化及びトリフラート化に続き、フルオリドによる粗生成物の処理をし、その後THP基の脱保護をした。標準的な方法論を使用し、5’-DMT-及び5’-DMT-3’-ホスホールアミダイトを得た。
2’-フルオロウリジン
2’-デオキシ-2’-フルオロウリジンの合成は、2,2’-アンヒドロ-1-β-D-アラビノフラノシルウラシルを70%フッ化水素-ピリジン(hydrogen fluoride-pyridine)で処理する、文献手法の修正により成された。標準的な手法を用いて5’-DMT及び5’-DMT-3’ホスホールアミダイトを得た。
2’-デオキシ-2’-フルオロウリジンの合成は、2,2’-アンヒドロ-1-β-D-アラビノフラノシルウラシルを70%フッ化水素-ピリジン(hydrogen fluoride-pyridine)で処理する、文献手法の修正により成された。標準的な手法を用いて5’-DMT及び5’-DMT-3’ホスホールアミダイトを得た。
2’-フルオロデオキシシチジン
2’-デオキシ-2’-フルオロシチジンは2’-デオキシ-2’-フルオロウリジンのアミノ化を介して合成され、次に選択的な保護によりN4-ベンゾイル-2’-デオキシ-2’-フルオロシチジンを得た。標準的な手法を用いて、5’-DMT及び5’-DMT-3’ホスホールアミダイトを得た。
2’-デオキシ-2’-フルオロシチジンは2’-デオキシ-2’-フルオロウリジンのアミノ化を介して合成され、次に選択的な保護によりN4-ベンゾイル-2’-デオキシ-2’-フルオロシチジンを得た。標準的な手法を用いて、5’-DMT及び5’-DMT-3’ホスホールアミダイトを得た。
2’-O-(2-メトキシエチル)修飾アミダイト
2’-O-メトキシエチル-置換ヌクレオシドアミダイトは、次の通り、あるいは、Martin, P.(Helvetica Chimica Acta, 1995, 78, 486-504)の方法に従って調製した。
2’-O-メトキシエチル-置換ヌクレオシドアミダイトは、次の通り、あるいは、Martin, P.(Helvetica Chimica Acta, 1995, 78, 486-504)の方法に従って調製した。
2,2’-アンヒドロ〔1-(β-D-アラビノフラノシル)-5-メチルウリジン〕
5-メチルウリジン(Yamasa, Choshi, Japanにより市販され入手可能な、リボシルチミン)(72.0 g、0.279 M)、ジフェニルカーボネート(90.0 g、0.420 M)及び炭酸水素ナトリウム(2.0 g、0.024 M)をDMF(300 mL)に加えた。混合物を熱して攪拌しながら還流し、発生する二酸化炭素ガスを制御された方法で放出させた。1時間後、わずかに黒ずんだ溶液を、低圧下、濃縮した。得られたシロップを攪拌しながらジエチルエーテル(2.5 L)中に注いだ。産物はガム状物を形成した。エーテルをデカントし、そして、残渣を最小量のメタノール(約400 mL)に溶解した。溶液をフレッシュなエーテル(2.5 L)に注ぎ入れ、硬いガム状物を得た。エーテルをデカントし、ガム状物を減圧オーブンで乾燥させ(60℃、1 mm Hgで24時間)、得られた固体を砕いて淡い黄褐色の粉末にした(57 g、85%粗収率)。NMRスペクトルは、そのナトリウム塩としてフェノールが混じった(約5%)構造と一致した。その物質はさらに続く反応に用いられた(あるいはに酢酸エチル中のメタノールの勾配(10-25%)を利用したカラムクロマトグラフィーにより、さらに精製して融点222-4℃の白色の固体を得ることができる)。
5-メチルウリジン(Yamasa, Choshi, Japanにより市販され入手可能な、リボシルチミン)(72.0 g、0.279 M)、ジフェニルカーボネート(90.0 g、0.420 M)及び炭酸水素ナトリウム(2.0 g、0.024 M)をDMF(300 mL)に加えた。混合物を熱して攪拌しながら還流し、発生する二酸化炭素ガスを制御された方法で放出させた。1時間後、わずかに黒ずんだ溶液を、低圧下、濃縮した。得られたシロップを攪拌しながらジエチルエーテル(2.5 L)中に注いだ。産物はガム状物を形成した。エーテルをデカントし、そして、残渣を最小量のメタノール(約400 mL)に溶解した。溶液をフレッシュなエーテル(2.5 L)に注ぎ入れ、硬いガム状物を得た。エーテルをデカントし、ガム状物を減圧オーブンで乾燥させ(60℃、1 mm Hgで24時間)、得られた固体を砕いて淡い黄褐色の粉末にした(57 g、85%粗収率)。NMRスペクトルは、そのナトリウム塩としてフェノールが混じった(約5%)構造と一致した。その物質はさらに続く反応に用いられた(あるいはに酢酸エチル中のメタノールの勾配(10-25%)を利用したカラムクロマトグラフィーにより、さらに精製して融点222-4℃の白色の固体を得ることができる)。
2’-O-メトキシエチル-5-メチルウリジン
2,2’-アンヒドロ-5-メチルウリジン(195 g、0.81 M)、トリス(2-メトキシエチル)ホウ酸(231 g、0.98 M)及び2-メトキシエタノール(1.2 L)を、2 Lステンレススチール圧力容器に加え、160℃に予熱した油浴中に設置した。155-160℃で48時間熱した後、容器を開き、そして、溶液を蒸発させて乾燥させ、次にメタノール(200 mL)中で磨砕した。残渣を熱したアセトン(1 L)中に懸濁した。不溶の塩を濾過し、アセトン(150 mL)で洗浄し、そして、濾過物を蒸発させた。残渣を(280 g)をCH3CN(600 mL)に溶解させ、次に、蒸発させた。シリカゲルカラム(3 kg)を0.5%Et3NHを含むCH2Cl2/アセトン/MeOH(20:5:3)中に充填した。残渣をCH2Cl2(250 mL)中に溶解し、そして、シリカ(150 g)に吸着させた後、カラムにロードした。生成物は充填溶媒とともに溶出され、160 g(63%)の産物を得た。不純な分画をやり直すことにより、追加の物質を得た。
2,2’-アンヒドロ-5-メチルウリジン(195 g、0.81 M)、トリス(2-メトキシエチル)ホウ酸(231 g、0.98 M)及び2-メトキシエタノール(1.2 L)を、2 Lステンレススチール圧力容器に加え、160℃に予熱した油浴中に設置した。155-160℃で48時間熱した後、容器を開き、そして、溶液を蒸発させて乾燥させ、次にメタノール(200 mL)中で磨砕した。残渣を熱したアセトン(1 L)中に懸濁した。不溶の塩を濾過し、アセトン(150 mL)で洗浄し、そして、濾過物を蒸発させた。残渣を(280 g)をCH3CN(600 mL)に溶解させ、次に、蒸発させた。シリカゲルカラム(3 kg)を0.5%Et3NHを含むCH2Cl2/アセトン/MeOH(20:5:3)中に充填した。残渣をCH2Cl2(250 mL)中に溶解し、そして、シリカ(150 g)に吸着させた後、カラムにロードした。生成物は充填溶媒とともに溶出され、160 g(63%)の産物を得た。不純な分画をやり直すことにより、追加の物質を得た。
2’-O-メトキシエチル-5’-O-ジメトキシトリチル-5-メチルウリジン
2’-O-メトキシエチル-5-メチルウリジン(160 g、0.506 M)をピリジン(250 mL)と共に蒸発させ、次に、乾燥させた残渣をピリジン(1.3 L)に溶解した。ジメトキシトリチルクロリドの一番目のアリコート(94.3 g、0.278 M)を加え、そして、混合液を室温で1時間攪拌した。ジメトキシトリチルクロリドの二番目のアリコート(94.3 g、0.278 M)を加え、そして、反応液をさらに1時間攪拌した。メタノール(170 mL)を次に加え、反応を停止した。HPLCにより、約70%の産物の存在が示された。溶媒を蒸発させ、そして、CH3CN(200 mL)中で磨砕した。残渣をCHCl3(1.5 L)に溶解し、次に、2×500 mLの飽和NaHCO3及び2×500 mLの飽和NaClにより抽出した。有機層をNa2SO4上で乾燥させ、濾過し、そして、蒸発させた。275 gの残渣が得られた。残渣を3.5 kgシリカゲルカラムで精製し、充填し、そして、0.5%Et3NHを含むEtOAc/ヘキサン/アセトン(5:5:1)で溶出した。純粋な分画を蒸発させ、164 gの生成物を得た。さらに約20 gが不純な分画より得られ、全収量183 g(57%)を得た。
2’-O-メトキシエチル-5-メチルウリジン(160 g、0.506 M)をピリジン(250 mL)と共に蒸発させ、次に、乾燥させた残渣をピリジン(1.3 L)に溶解した。ジメトキシトリチルクロリドの一番目のアリコート(94.3 g、0.278 M)を加え、そして、混合液を室温で1時間攪拌した。ジメトキシトリチルクロリドの二番目のアリコート(94.3 g、0.278 M)を加え、そして、反応液をさらに1時間攪拌した。メタノール(170 mL)を次に加え、反応を停止した。HPLCにより、約70%の産物の存在が示された。溶媒を蒸発させ、そして、CH3CN(200 mL)中で磨砕した。残渣をCHCl3(1.5 L)に溶解し、次に、2×500 mLの飽和NaHCO3及び2×500 mLの飽和NaClにより抽出した。有機層をNa2SO4上で乾燥させ、濾過し、そして、蒸発させた。275 gの残渣が得られた。残渣を3.5 kgシリカゲルカラムで精製し、充填し、そして、0.5%Et3NHを含むEtOAc/ヘキサン/アセトン(5:5:1)で溶出した。純粋な分画を蒸発させ、164 gの生成物を得た。さらに約20 gが不純な分画より得られ、全収量183 g(57%)を得た。
3’-O-アセチル-2’-O-メトキシエチル-5’-O-ジメトキシトリチル-5-メチルウリジン
2’-O-メトキシエチル-5’-O-ジメトキシトリチル-5-メチルウリジン(106 g、0.167 M)、DMF/ピリジン(562 mLのDMFと188 mLのピリジンから調製された3:1の混合液750 mL)、及び、無水酢酸(24.38 mL、0.258 M)を混合し、そして、室温で24時間攪拌した。反応は、TLC試料にMeOHを添加し初めに急冷すること(quenching)によりTLCによりモニターした。TLCにより判断した反応の終了時に、MeOH(50 mL)を加え、混合物を35℃で蒸発させた。残渣をCHCl3(800 mL)に溶解し、次に、2×200 mLの飽和炭酸水素ナトリウム及び2×200 mLの飽和NaClにより抽出した。水層を200 mLのCHCl3で逆抽出した。合わせた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、そして、蒸発させ、122 g(約90%生成物)の残渣を得た。残渣を3.5 kgシリカゲルカラムで精製し、そして、EtOAc/ヘキサン(4:1)で溶出した。純粋な生成物分画を蒸発させ、96 g(84%)を得た。後の分画より追加の1.5 gを回収した。
2’-O-メトキシエチル-5’-O-ジメトキシトリチル-5-メチルウリジン(106 g、0.167 M)、DMF/ピリジン(562 mLのDMFと188 mLのピリジンから調製された3:1の混合液750 mL)、及び、無水酢酸(24.38 mL、0.258 M)を混合し、そして、室温で24時間攪拌した。反応は、TLC試料にMeOHを添加し初めに急冷すること(quenching)によりTLCによりモニターした。TLCにより判断した反応の終了時に、MeOH(50 mL)を加え、混合物を35℃で蒸発させた。残渣をCHCl3(800 mL)に溶解し、次に、2×200 mLの飽和炭酸水素ナトリウム及び2×200 mLの飽和NaClにより抽出した。水層を200 mLのCHCl3で逆抽出した。合わせた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、そして、蒸発させ、122 g(約90%生成物)の残渣を得た。残渣を3.5 kgシリカゲルカラムで精製し、そして、EtOAc/ヘキサン(4:1)で溶出した。純粋な生成物分画を蒸発させ、96 g(84%)を得た。後の分画より追加の1.5 gを回収した。
3’-O-アセチル-2’-O-メトキシエチル-5’-O-ジメトキシトリチル-5-メチル-4-トリアゾールウリジン
はじめの溶液は、3’-O-アセチル-2’-O-メトキシエチル-5’-O-ジメトキシトリチル-5-メチルウリジン(96 g、0.144 M)をCH3CN(700 mL)に溶かすことにより調製し、そして、とり置いた。トリエチルアミン(189 mL、1.44 M)をCH3CN(1 L)中トリアゾール(90 g、1.3 M)溶液に加えて、-5℃に冷却し、そして、オーバーヘッドスターラーを使用して0.5時間攪拌した。0-10℃に維持した攪拌溶液に、30分間、POCl3を滴下して加え、そして得られた混合液をさらに2時間攪拌した。はじめの溶液を後者の溶液に、45分間をかけて滴下して加えた。得られた反応混合物をコールドルームに一晩保存した。反応混合物から塩を濾過し、そして、溶液を蒸発させた。残渣をEtOAc(1 L)に溶解し、次に、不溶の固体を濾過により除去した。濾過物を1×300 mLのNaHCO3及び2×300 mLの飽和NaClで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、そして、蒸発させた。残渣をEtOAc中で磨砕し、表題の化合物を得た。
はじめの溶液は、3’-O-アセチル-2’-O-メトキシエチル-5’-O-ジメトキシトリチル-5-メチルウリジン(96 g、0.144 M)をCH3CN(700 mL)に溶かすことにより調製し、そして、とり置いた。トリエチルアミン(189 mL、1.44 M)をCH3CN(1 L)中トリアゾール(90 g、1.3 M)溶液に加えて、-5℃に冷却し、そして、オーバーヘッドスターラーを使用して0.5時間攪拌した。0-10℃に維持した攪拌溶液に、30分間、POCl3を滴下して加え、そして得られた混合液をさらに2時間攪拌した。はじめの溶液を後者の溶液に、45分間をかけて滴下して加えた。得られた反応混合物をコールドルームに一晩保存した。反応混合物から塩を濾過し、そして、溶液を蒸発させた。残渣をEtOAc(1 L)に溶解し、次に、不溶の固体を濾過により除去した。濾過物を1×300 mLのNaHCO3及び2×300 mLの飽和NaClで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、そして、蒸発させた。残渣をEtOAc中で磨砕し、表題の化合物を得た。
2’-O-メトキシエチル-5’-O-ジメトキシトリチル-5-メチルシチジン
ジオキサン(500 mL)及びNH4OH(30 mL)中3’-O-アセチル-2’-O-メトキシエチル-5’-O-ジメトキシトリチル-5-メチル-4-トリアゾールウリジン(103 g、0.141 M)溶液を、室温で2時間攪拌した。ジオキサン溶液を蒸発させ、残渣をMeOH(2×200 mL)と共沸させた。残渣をMeOH(300 mL)に溶解し、2リットルステンレススチール圧力容器に移した。NH3ガスで飽和させたMeOH(400 mL)を加え、その容器を100℃、2時間熱した(完全な変換がTLCにより示された)。容器の内容物を蒸発させて乾燥し、そして、残渣をEtOAc(500 mL)に溶解し、次に、飽和NaCl(200 mL)で1回洗浄した。有機物を硫酸ナトリウムで乾燥させ、そして、溶媒を蒸発させて85 g(95%)の表題の化合物を得た。
ジオキサン(500 mL)及びNH4OH(30 mL)中3’-O-アセチル-2’-O-メトキシエチル-5’-O-ジメトキシトリチル-5-メチル-4-トリアゾールウリジン(103 g、0.141 M)溶液を、室温で2時間攪拌した。ジオキサン溶液を蒸発させ、残渣をMeOH(2×200 mL)と共沸させた。残渣をMeOH(300 mL)に溶解し、2リットルステンレススチール圧力容器に移した。NH3ガスで飽和させたMeOH(400 mL)を加え、その容器を100℃、2時間熱した(完全な変換がTLCにより示された)。容器の内容物を蒸発させて乾燥し、そして、残渣をEtOAc(500 mL)に溶解し、次に、飽和NaCl(200 mL)で1回洗浄した。有機物を硫酸ナトリウムで乾燥させ、そして、溶媒を蒸発させて85 g(95%)の表題の化合物を得た。
N4-ベンゾイル-2’-O-メトキシエチル-5’-O-ジメトキシトリチル-5-メチルシチジン
2’-O-メトキシエチル-5’-O-ジメトキシトリチル-5-メチル-シチジン(85 g、0.134 M)をDMF(800 mL)に溶解し、次に、無水安息香酸(37.2 g、0.165 M)を攪拌しながら加えた。3時間攪拌後、反応が約95%終了したことをTLCが示した。溶媒を蒸発させ、そして、残渣をMeOH(200 mL)と共沸させた。残渣をCHCl3(700 mL)に溶解し、飽和NaHCO3(2×300 mL)及び飽和NaCl(2×300 mL)で抽出し、MgSO4で乾燥させ、次に、蒸発させて残渣(96 g)を得た。残渣を、溶出溶媒として0.5%Et3NHを含むEtOAc/ヘキサン(1:1)を使用して、1.5 kgシリカカラムでクロマトグラフィーにより分離した。純粋な生成物画分を蒸発させて、90 g(90%)の表題化合物を得た。
2’-O-メトキシエチル-5’-O-ジメトキシトリチル-5-メチル-シチジン(85 g、0.134 M)をDMF(800 mL)に溶解し、次に、無水安息香酸(37.2 g、0.165 M)を攪拌しながら加えた。3時間攪拌後、反応が約95%終了したことをTLCが示した。溶媒を蒸発させ、そして、残渣をMeOH(200 mL)と共沸させた。残渣をCHCl3(700 mL)に溶解し、飽和NaHCO3(2×300 mL)及び飽和NaCl(2×300 mL)で抽出し、MgSO4で乾燥させ、次に、蒸発させて残渣(96 g)を得た。残渣を、溶出溶媒として0.5%Et3NHを含むEtOAc/ヘキサン(1:1)を使用して、1.5 kgシリカカラムでクロマトグラフィーにより分離した。純粋な生成物画分を蒸発させて、90 g(90%)の表題化合物を得た。
N4-ベンゾイル-2’-O-メトキシエチル-5’-O-ジメトキシトリチル-5-メチルシチジン-3’-アミダイト
N4-ベンゾイル-2’-O-メトキシエチル-5’-O-ジメトキシトリチル-5-メチルシチジン(74 g、0.10 M)をCH2Cl2(1 L)に溶解した。テトラゾールジイソプロピルアミン(7.1 g)及び2-シアノエトキシ-テトラ-(イソプロピル)亜リン酸塩(40.5 mL、0.123 M)を窒素気体条件下、攪拌しながら加えた。得られた混合物は室温で20時間攪拌した(反応が95%終了したことをTLCが示した)。反応混合物を飽和NaHCO3(1×300 mL)及び飽和NaCl(3×300 mL)で抽出した。水層洗浄液をCH2Cl2(300 mL)で逆抽出し、次に抽出物を合わせ、MgSO4で乾燥させそして濃縮した。得られた残渣は、溶出溶媒としてEtOAc/ヘキサン(3:1)を使用して、1.5 kgシリカカラムでクロマトグラフィーにより分離した。純粋な分画を合わせて、90.6 g(87%)の表題化合物を得た。
N4-ベンゾイル-2’-O-メトキシエチル-5’-O-ジメトキシトリチル-5-メチルシチジン(74 g、0.10 M)をCH2Cl2(1 L)に溶解した。テトラゾールジイソプロピルアミン(7.1 g)及び2-シアノエトキシ-テトラ-(イソプロピル)亜リン酸塩(40.5 mL、0.123 M)を窒素気体条件下、攪拌しながら加えた。得られた混合物は室温で20時間攪拌した(反応が95%終了したことをTLCが示した)。反応混合物を飽和NaHCO3(1×300 mL)及び飽和NaCl(3×300 mL)で抽出した。水層洗浄液をCH2Cl2(300 mL)で逆抽出し、次に抽出物を合わせ、MgSO4で乾燥させそして濃縮した。得られた残渣は、溶出溶媒としてEtOAc/ヘキサン(3:1)を使用して、1.5 kgシリカカラムでクロマトグラフィーにより分離した。純粋な分画を合わせて、90.6 g(87%)の表題化合物を得た。
2’-(アミノオキシエチル)ヌクレオシドアミダイト及び2’-(ジメチルアミノオキシエチル)ヌクレオシドアミダイト
アミノオキシエチルおよびジメチルアミノオキシエチルアミダイトを、そのそれぞれは本出願により一般に所有されるものであり、そして参考文献としてその内容を本明細書中に援用する、1998年2月14日に出願の米国特許出願シリアル番号10/037,143の方法、および1998年1月30日に出願のシリアル番号09/016,520の方法により調製する。
アミノオキシエチルおよびジメチルアミノオキシエチルアミダイトを、そのそれぞれは本出願により一般に所有されるものであり、そして参考文献としてその内容を本明細書中に援用する、1998年2月14日に出願の米国特許出願シリアル番号10/037,143の方法、および1998年1月30日に出願のシリアル番号09/016,520の方法により調製する。
実施例2
オリゴヌクレオチド合成
未置換及び置換ホスホジエステル(P=O)オリゴヌクレオチドを、自動DNAシンセサイザー(Applied Biosystems model 380B)で、ヨウ素による酸化を用いる標準的なホスホールアミダイト化学を使用して、合成する。
オリゴヌクレオチド合成
未置換及び置換ホスホジエステル(P=O)オリゴヌクレオチドを、自動DNAシンセサイザー(Applied Biosystems model 380B)で、ヨウ素による酸化を用いる標準的なホスホールアミダイト化学を使用して、合成する。
亜リン酸塩結合の段階的チア化のため、標準的な酸化瓶を、アセトニトリル中0.2 M 3H-1,2-ベンゾジチオール-3-オン1,1-ジオキシド溶液に置き換えた以外は、ホスホロチオエート(P=S)は、ホスホジエステルオリゴヌクレオチドのためと同様に合成される。チア化待機段階を68秒に増加し、そして、引き続いてキャッピング段階を行った。CPGカラムからの分離、及び、55℃で(18時間)濃縮された水酸化アンモニウム中の脱ブロック化した後、2.5倍量のエタノールで2回沈殿することにより、オリゴヌクレオチドを0.5 M NaCl溶液から精製した。ホスフィネートオリゴヌクレオチドを、本明細書中で参考文献として援用される、アメリカ合衆国特許5,508,270に記載の通り、調製する。
アルキルホスホネートオリゴヌクレオチドは、本明細書中で参考文献として援用される、アメリカ合衆国特許4,469,863に記載の通り、調製する。
3’-デオキシ-3’-メチレンホスホネートオリゴヌクレオチドは、本明細書中で参考文献として援用される、アメリカ合衆国特許5,610,289あるいは5,625,050に記載の通り、調製する。
3’-デオキシ-3’-メチレンホスホネートオリゴヌクレオチドは、本明細書中で参考文献として援用される、アメリカ合衆国特許5,610,289あるいは5,625,050に記載の通り、調製する。
ホスホールアミダイトオリゴヌクレオチドは、本明細書中で参考文献として援用される、アメリカ合衆国特許5,256,775あるいはアメリカ合衆国特許5,366,878に記載の通り、調製する。
アルキルホスホノチオエートオリゴヌクレオチドは、本明細書中で参考文献として援用される、公開されたPCT出願PCT/US94/00902及びPCT/US93/06976(それぞれWO 94/17093及びWO 94/02499として公開)に記載の通り、調製する。
3’-デオキシ-3’-アミノホスホールアミデートオリゴヌクレオチドは、本明細書中で参考文献として援用される、アメリカ合衆国特許5,023,243に記載の通り、調製する。
ホスホトリエステルオリゴヌクレオチドは、本明細書中に参考文献として援用されるアメリカ合衆国特許5,023,234に記載の通り、調製する。
ホスホトリエステルオリゴヌクレオチドは、本明細書中に参考文献として援用されるアメリカ合衆国特許5,023,234に記載の通り、調製する。
ボランリン酸オリゴヌクレオチドは、共に本明細書中で参考文献として援用される、アメリカ合衆国特許5,130,302及び5,177,198に記載の通り、調製する。
実施例3
オリゴヌクレオシド合成
MMI結合オリゴヌクレオシドとも同一であるメチレンメチルイミノ結合オリゴヌクレオシド、MDH結合オリゴヌクレオシドとも同一であるメチレンジメチルヒドラゾ結合オリゴヌクレオシド、及び、アミド-3結合オリゴヌクレオシドとも同一であるメチレンカルボニルアミノ結合オリゴヌクレオシド、及び、アミド-4結合オリゴヌクレオシドとも同一であるメチレンアミノカルボニル結合オリゴヌクレオシド、そして、例えば、MMIとP=OあるいはP=S結合とを換えたものを有する混合バックボーン化合物は、そのすべてが本明細書中で参考文献として援用される、アメリカ合衆国特許5,378,825、5,386,023、5,489,677、5,602,240及び5,610,289,に記載の通り、調製する。
実施例3
オリゴヌクレオシド合成
MMI結合オリゴヌクレオシドとも同一であるメチレンメチルイミノ結合オリゴヌクレオシド、MDH結合オリゴヌクレオシドとも同一であるメチレンジメチルヒドラゾ結合オリゴヌクレオシド、及び、アミド-3結合オリゴヌクレオシドとも同一であるメチレンカルボニルアミノ結合オリゴヌクレオシド、及び、アミド-4結合オリゴヌクレオシドとも同一であるメチレンアミノカルボニル結合オリゴヌクレオシド、そして、例えば、MMIとP=OあるいはP=S結合とを換えたものを有する混合バックボーン化合物は、そのすべてが本明細書中で参考文献として援用される、アメリカ合衆国特許5,378,825、5,386,023、5,489,677、5,602,240及び5,610,289,に記載の通り、調製する。
ホルムアセタール及びチオホルムアセタール結合オリゴヌクレオシドは、本明細書中で参考文献として援用される、アメリカ合衆国特許5,264,562及び5,264,564に記載の通り、調製する。
エチレンオキシド結合オリゴヌクレオシドは、本明細書中で参考文献として援用される、アメリカ合衆国特許5,223,618に記載の通り、調製する。
実施例4
PNA合成
ペプチド核酸(PNAs)は、ペプチド核酸(PNA)に関する様々な方法:Synthesis, Properties and Potential Applications, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 1996, 4, 5-23のいずれかに従って、調製される。それらはまた、本明細書中で参考文献として援用される、アメリカ合衆国特許5,539,082、5,700,922,、及び、5,719,262に従ってもまた、調製され得る。
実施例4
PNA合成
ペプチド核酸(PNAs)は、ペプチド核酸(PNA)に関する様々な方法:Synthesis, Properties and Potential Applications, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 1996, 4, 5-23のいずれかに従って、調製される。それらはまた、本明細書中で参考文献として援用される、アメリカ合衆国特許5,539,082、5,700,922,、及び、5,719,262に従ってもまた、調製され得る。
実施例5
キメラオリゴヌクレオチドの合成
本発明のキメラオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、または、混合オリゴヌクレオチド/オリゴヌクレオシドは、いくつかの異なる型でありうる。これらは、結合ヌクレオシドの“ギャップ”セグメントが結合ヌクレオシドの5’あるいは3’“ウィング”セグメントの間に位置する第一の型、及び、“ギャップ”セグメントがオリゴマー化合物の3’あるいは5’端のどちらかに位置する、第二の“オープンエンド”型を含む。第一の型のオリゴヌクレオチドは、当該技術分野において、“ギャップマー”あるいはギャップ化オリゴヌクレオチドとしても知られる。第二の型のオリゴヌクレオチドは、当該技術分野において、“ヘミマー”あるいは“ウィングマー”としても知られる。
キメラオリゴヌクレオチドの合成
本発明のキメラオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、または、混合オリゴヌクレオチド/オリゴヌクレオシドは、いくつかの異なる型でありうる。これらは、結合ヌクレオシドの“ギャップ”セグメントが結合ヌクレオシドの5’あるいは3’“ウィング”セグメントの間に位置する第一の型、及び、“ギャップ”セグメントがオリゴマー化合物の3’あるいは5’端のどちらかに位置する、第二の“オープンエンド”型を含む。第一の型のオリゴヌクレオチドは、当該技術分野において、“ギャップマー”あるいはギャップ化オリゴヌクレオチドとしても知られる。第二の型のオリゴヌクレオチドは、当該技術分野において、“ヘミマー”あるいは“ウィングマー”としても知られる。
〔2’-O-Me〕-〔2’-デオキシ〕-〔2’-O-Me〕キメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチド
2’-O-アルキルホスホロチオエートを有するキメラオリゴヌクレオチド及び2’-デオキシホスホロチオエートオリゴヌクレオチドセグメントを、上記の通り、Applied Biosystems自動DNAシンセサイザーModel 380Bを使用して合成する。オリゴヌクレオチドは、自動シンセサイザーを用い、及び、DNA部分には2’-デオキシ-5’-ジメトキシトリチル-3’-O-ホスホールアミダイトを、そして、5’及び3’ウィングには5’-ジメトキシトリチル-2’-O-メチル-3’-O-ホスホールアミダイトを使用して、合成する。標準的な合成サイクルを、テトラゾール及び塩基のデリバリー後の待機段階を600秒に増加することにより修正し、RNAについては4回、2’-O-メチルについては2回繰り返した。完全に保護されたオリゴヌクレオチドを支持体から解離し、そして、室温で一晩、3:1アンモニア/エタノール中で、リン酸基を脱保護し、その後、凍結乾燥により乾燥させる。その後、室温で24時間、メタノールアンモニア中で処理することによりすべての塩基を脱保護し、そして、試料を再び凍結乾燥により乾燥させる。ペレットをTHF中1 M TBAFに、室温で24時間懸濁し、2’位を脱保護する。次に、反応を1 M TEAAで停止し、そして次に試料をrotovacにより1/2量に減少させ、G25サイズ排除カラムにより脱塩する。回収したオリゴは次に、キャピラリー電気泳動により、また、質量分析により、収量について、また、純度について、分光光度的に分析される。
2’-O-アルキルホスホロチオエートを有するキメラオリゴヌクレオチド及び2’-デオキシホスホロチオエートオリゴヌクレオチドセグメントを、上記の通り、Applied Biosystems自動DNAシンセサイザーModel 380Bを使用して合成する。オリゴヌクレオチドは、自動シンセサイザーを用い、及び、DNA部分には2’-デオキシ-5’-ジメトキシトリチル-3’-O-ホスホールアミダイトを、そして、5’及び3’ウィングには5’-ジメトキシトリチル-2’-O-メチル-3’-O-ホスホールアミダイトを使用して、合成する。標準的な合成サイクルを、テトラゾール及び塩基のデリバリー後の待機段階を600秒に増加することにより修正し、RNAについては4回、2’-O-メチルについては2回繰り返した。完全に保護されたオリゴヌクレオチドを支持体から解離し、そして、室温で一晩、3:1アンモニア/エタノール中で、リン酸基を脱保護し、その後、凍結乾燥により乾燥させる。その後、室温で24時間、メタノールアンモニア中で処理することによりすべての塩基を脱保護し、そして、試料を再び凍結乾燥により乾燥させる。ペレットをTHF中1 M TBAFに、室温で24時間懸濁し、2’位を脱保護する。次に、反応を1 M TEAAで停止し、そして次に試料をrotovacにより1/2量に減少させ、G25サイズ排除カラムにより脱塩する。回収したオリゴは次に、キャピラリー電気泳動により、また、質量分析により、収量について、また、純度について、分光光度的に分析される。
〔2’-O-(2-メトキシエチル)〕-〔2’-デオキシ〕-〔2’-O-(メトキシエチル)〕キメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチド
〔2’-O-(2-メトキシエチル)〕-〔2’-デオキシ〕-〔2’-O-(メトキシエチル)〕キメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、2’-O-(メトキシエチル)アミダイトを2’-O-メチルアミダイトに置き換えた2’-O-メチルキメラオリゴヌクレオチドのための上記の方法に従って、調製した。
〔2’-O-(2-メトキシエチル)〕-〔2’-デオキシ〕-〔2’-O-(メトキシエチル)〕キメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、2’-O-(メトキシエチル)アミダイトを2’-O-メチルアミダイトに置き換えた2’-O-メチルキメラオリゴヌクレオチドのための上記の方法に従って、調製した。
〔2’-O-(2-メトキシエチル)ホスホジエステル〕-〔2’-デオキシホスホロチオエート〕-〔2’-O-(2-メトキシエチル)ホスホジエステル〕キメラオリゴヌクレオチド
〔2’-O-(2-メトキシエチル)ホスホジエステル〕-〔2’-デオキシホスホロチオエート〕-〔2’-O-(2-メトキシエチル)ホスホジエステル〕キメラオリゴヌクレオチドは、2’-O-(メトキシエチル)アミダイトを2’-O-メチルアミダイトに置き換えた、2’-O-メチルキメラオリゴヌクレオチドについての上記の方法、キメラ構造のウィング部分中のホスホジエステルヌクレオチド間結合を作るためのヨウ素を用いる酸化、中央ギャップのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を作るための3,H-1,2ベンゾジチオール-3-オン1,1ジオキシド(Beaucage Reagent)を使用する硫化に従って、調製する。
〔2’-O-(2-メトキシエチル)ホスホジエステル〕-〔2’-デオキシホスホロチオエート〕-〔2’-O-(2-メトキシエチル)ホスホジエステル〕キメラオリゴヌクレオチドは、2’-O-(メトキシエチル)アミダイトを2’-O-メチルアミダイトに置き換えた、2’-O-メチルキメラオリゴヌクレオチドについての上記の方法、キメラ構造のウィング部分中のホスホジエステルヌクレオチド間結合を作るためのヨウ素を用いる酸化、中央ギャップのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を作るための3,H-1,2ベンゾジチオール-3-オン1,1ジオキシド(Beaucage Reagent)を使用する硫化に従って、調製する。
他のキメラオリゴヌクレオチド、キメラオリゴヌクレオシド及び混合キメラオリゴヌクレオチド/オリゴヌクレオシドは、本明細書中で参考文献として援用される、アメリカ合衆国特許5,623,065に従って合成される。
実施例6
オリゴヌクレオチドの単離
制御孔ガラスカラム(Applied Biosystems)から分離し、そして、濃縮された水酸化アンモニウム中、55℃、18時間、脱ブロック化した後、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオシドは、0.5 M NaClから2.5倍量のエタノールを用いた2回の沈殿により精製する。合成されたオリゴヌクレオチドは、変性ゲル上でのポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析され、そして、少なくとも85%の全長物質であると判断された。合成により得られたホスホロチオエート及びホスホジエステル結合の相対的な量は、定期的に31P核磁気共鳴分光器により検査され、そして、いくつかの研究のため、オリゴヌクレオチドをChiangら(J. Biol. Chem. 1991, 266, 18162-18171)により記載の通り、HPLCで精製した。HPLC精製産物を用いて得られた結果は、非HPLC精製産物から得られたものと同様だった。
オリゴヌクレオチドの単離
制御孔ガラスカラム(Applied Biosystems)から分離し、そして、濃縮された水酸化アンモニウム中、55℃、18時間、脱ブロック化した後、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオシドは、0.5 M NaClから2.5倍量のエタノールを用いた2回の沈殿により精製する。合成されたオリゴヌクレオチドは、変性ゲル上でのポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析され、そして、少なくとも85%の全長物質であると判断された。合成により得られたホスホロチオエート及びホスホジエステル結合の相対的な量は、定期的に31P核磁気共鳴分光器により検査され、そして、いくつかの研究のため、オリゴヌクレオチドをChiangら(J. Biol. Chem. 1991, 266, 18162-18171)により記載の通り、HPLCで精製した。HPLC精製産物を用いて得られた結果は、非HPLC精製産物から得られたものと同様だった。
実施例7
オリゴヌクレオチド合成−96ウェルプレート型
オリゴヌクレオチドを、固相P(III)ホスホールアミダイト化学により、標準的な96ウェル型に同時に96配列を構築することができる自動シンセサイザーで合成した。ホスホロジエステルヌクレオチド間結合はヨウ素水溶液を用いる酸化によって得られた。ホスホロチオエートヌクレオチド間結合は、無水アセトニトリル中3,H-1,2ベンゾジチオール-3-オン1,1ジオキシド(Beaucage Reagent)を使用した硫化により、生成した。標準的な塩基保護β-シアノエチルジイソプロピルホスホールアミダイトは、商業販売者(例えば、PE-Applied Biosystems, Foster City, CAまたはPharmacia, Piscataway, NJ)から購入した。非標準ヌクレオシドは、既知の文献、あるいは、特許の方法の通り、合成する。それらは、塩基保護β-シアノエチルジイソプロピルホスホールアミダイトとして使用される。
オリゴヌクレオチド合成−96ウェルプレート型
オリゴヌクレオチドを、固相P(III)ホスホールアミダイト化学により、標準的な96ウェル型に同時に96配列を構築することができる自動シンセサイザーで合成した。ホスホロジエステルヌクレオチド間結合はヨウ素水溶液を用いる酸化によって得られた。ホスホロチオエートヌクレオチド間結合は、無水アセトニトリル中3,H-1,2ベンゾジチオール-3-オン1,1ジオキシド(Beaucage Reagent)を使用した硫化により、生成した。標準的な塩基保護β-シアノエチルジイソプロピルホスホールアミダイトは、商業販売者(例えば、PE-Applied Biosystems, Foster City, CAまたはPharmacia, Piscataway, NJ)から購入した。非標準ヌクレオシドは、既知の文献、あるいは、特許の方法の通り、合成する。それらは、塩基保護β-シアノエチルジイソプロピルホスホールアミダイトとして使用される。
オリゴヌクレオチドを支持体から解離し、そして、高温度(55-60℃)にて、12−16時間、濃縮NH4OHにより脱保護し、そして放出された生成物を次に減圧下で乾燥した。乾燥した生成物を次に滅菌水に再懸濁して、マスタープレートを得て、そこからすべての分析及び試験プレート試料をロボットピペッターを使用して希釈する。
実施例8
オリゴヌクレオチド分析−96ウェルプレート型
各ウェルのオリゴヌクレオチドの濃度を、試料の希釈及びUV吸収分光器により調査した。個々の生成物の全長の完全性を、キャピラリー電気泳動(CE)により、96ウェル型(Beckman P/ACETMMDQ)で、あるいは、個々に調製した試料については、市販のCE器具(例えば、Beckman P/ACETM 5000, ABI 270)で、評価した。塩基及びバックボーン構成は、エレクトロスプレー質量分光計を使用する化合物の質量分析により、確かめられた。すべてのアッセイ検査プレートは、マスタープレートから、シングルあるいはマルチチャネルのロボットピペッターを使用して希釈した。プレートは、プレート上の化合物の少なくとも85%が、少なくとも全長の85%であれば、許容可能であると判断した。
オリゴヌクレオチド分析−96ウェルプレート型
各ウェルのオリゴヌクレオチドの濃度を、試料の希釈及びUV吸収分光器により調査した。個々の生成物の全長の完全性を、キャピラリー電気泳動(CE)により、96ウェル型(Beckman P/ACETMMDQ)で、あるいは、個々に調製した試料については、市販のCE器具(例えば、Beckman P/ACETM 5000, ABI 270)で、評価した。塩基及びバックボーン構成は、エレクトロスプレー質量分光計を使用する化合物の質量分析により、確かめられた。すべてのアッセイ検査プレートは、マスタープレートから、シングルあるいはマルチチャネルのロボットピペッターを使用して希釈した。プレートは、プレート上の化合物の少なくとも85%が、少なくとも全長の85%であれば、許容可能であると判断した。
実施例9
細胞培養及びオリゴヌクレオチド処理
標的核酸発現に対するアンチセンス化合物の効果は、測定可能なレベルで標的核酸が存在する場合、様々な細胞タイプのいずれにおいても、試験することができる。これは、例えば、PCRあるいはノザンブロット分析を使って日常的に決定され得る。以下の4つの細胞タイプは説明するために提供されるが、他の細胞タイプを日常的に使用することができる。
細胞培養及びオリゴヌクレオチド処理
標的核酸発現に対するアンチセンス化合物の効果は、測定可能なレベルで標的核酸が存在する場合、様々な細胞タイプのいずれにおいても、試験することができる。これは、例えば、PCRあるいはノザンブロット分析を使って日常的に決定され得る。以下の4つの細胞タイプは説明するために提供されるが、他の細胞タイプを日常的に使用することができる。
T-24細胞:
移行上皮細胞(transitional cell)膀胱癌細胞株T-24細胞はAmerican Type Culture Collection(ATCC)(Manassas, VA)より入手した。T-24細胞は、日常的に、10%ウシ胎児血清(Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD)、100 u/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン(Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD)を加えた、完全McCoy’s 5A基本培地(Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD)で、培養した。細胞は、日常的に、それが90%コンフルエンスに達したら、トリプシン処理及び希釈により継代した。RT-PCR分析において使用するため、細胞を96ウェルプレート(Falcon-Primaria#3872)に7000細胞/ウェルの濃度でまいた。
移行上皮細胞(transitional cell)膀胱癌細胞株T-24細胞はAmerican Type Culture Collection(ATCC)(Manassas, VA)より入手した。T-24細胞は、日常的に、10%ウシ胎児血清(Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD)、100 u/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン(Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD)を加えた、完全McCoy’s 5A基本培地(Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD)で、培養した。細胞は、日常的に、それが90%コンフルエンスに達したら、トリプシン処理及び希釈により継代した。RT-PCR分析において使用するため、細胞を96ウェルプレート(Falcon-Primaria#3872)に7000細胞/ウェルの濃度でまいた。
ノザンブロットあるいは他の分析のため、細胞を100 mmあるいは他の標準的な組織培養プレートにまき、そして、適切な量の培地及びオリゴヌクレオチドを使用して、同様の処理をすることができる。
A549細胞:
ヒト肺癌細胞株A549は、American Type Culture Collection(ATCC)(Manassas, VA)より入手した。A549は、日常的に、10%ウシ胎児血清(Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD)、100 u/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン(Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD)を加えた、DMEM基本培地(Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD)で培養した。細胞は、日常的に、それが90%コンフルエンスに達したら、トリプシン処理及び希釈により継代した。
ヒト肺癌細胞株A549は、American Type Culture Collection(ATCC)(Manassas, VA)より入手した。A549は、日常的に、10%ウシ胎児血清(Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD)、100 u/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン(Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD)を加えた、DMEM基本培地(Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD)で培養した。細胞は、日常的に、それが90%コンフルエンスに達したら、トリプシン処理及び希釈により継代した。
NHDF細胞:
ヒト新生児皮膚線維芽細胞(NHDF)は、Clonetics Corporation(Walkersville MD)より入手した。NHDFは日常的に、提供者により推奨される通り添加した線維芽細胞成長培地(Clonetics Corporation, Walkersville MD)で維持した。細胞は提供者により推奨される通り、10継代まで維持した。
ヒト新生児皮膚線維芽細胞(NHDF)は、Clonetics Corporation(Walkersville MD)より入手した。NHDFは日常的に、提供者により推奨される通り添加した線維芽細胞成長培地(Clonetics Corporation, Walkersville MD)で維持した。細胞は提供者により推奨される通り、10継代まで維持した。
HEK細胞:
ヒト胎児ケラチノサイト(HEK)はClonetics Corporation(Walkersville MD)より入手した。HEK細胞は、日常的に、提供者により推奨される通り製剤化されたケラチノサイト成長培地(Clonetics Corporation, Walkersville MD)で維持した。細胞は、日常的に、提供者により推奨される通り、10継代まで維持した。
ヒト胎児ケラチノサイト(HEK)はClonetics Corporation(Walkersville MD)より入手した。HEK細胞は、日常的に、提供者により推奨される通り製剤化されたケラチノサイト成長培地(Clonetics Corporation, Walkersville MD)で維持した。細胞は、日常的に、提供者により推奨される通り、10継代まで維持した。
3T3-L1細胞:
マウス胚脂肪細胞-様細胞株3T3-L1を、American Type Culure Collection(Manassas, VA)から入手した。3T3-L1細胞は、10%ウシ胎児血清(Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD)を添加したDMEM、高グルコース(Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD)中で、日常的に培養した。細胞が80%コンフルエントに達したときに、細胞を、トリプシン処理および希釈により、日常的に継代した。細胞を、RT-PCR解析において使用するため、96-ウェルプレート(Falcon-Primaria#3872)中に、4000細胞/ウェルの濃度でまいた。
マウス胚脂肪細胞-様細胞株3T3-L1を、American Type Culure Collection(Manassas, VA)から入手した。3T3-L1細胞は、10%ウシ胎児血清(Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD)を添加したDMEM、高グルコース(Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD)中で、日常的に培養した。細胞が80%コンフルエントに達したときに、細胞を、トリプシン処理および希釈により、日常的に継代した。細胞を、RT-PCR解析において使用するため、96-ウェルプレート(Falcon-Primaria#3872)中に、4000細胞/ウェルの濃度でまいた。
ノザンブロットまたは他の解析のため、細胞を100 mm組織培養プレートまたはその他の標準的な組織培養プレートにまき、適切な容量の培地およびオリゴヌクレオチドを使用して、同様に処理することができる。
アンチセンス化合物の処理:
細胞が80%コンフルエンスに達したとき、オリゴヌクレオチドにより処理した。96ウェルプレートで生育した細胞について、ウェルを200μLのOPTI-MEMTM-1減少血清培地(Gibco BRL)で一度洗浄し、次に3.75μg/mL LIPOFECTINTM(Gibco BRL)及び最終濃度150 nMで所望のオリゴヌクレオチドを含む、130μLのOPTI-MEMTM-1で処理した。4時間処理後、培地をフレッシュな培地に交換した。オリゴヌクレオチド処理後16時間後に細胞を回収した。
細胞が80%コンフルエンスに達したとき、オリゴヌクレオチドにより処理した。96ウェルプレートで生育した細胞について、ウェルを200μLのOPTI-MEMTM-1減少血清培地(Gibco BRL)で一度洗浄し、次に3.75μg/mL LIPOFECTINTM(Gibco BRL)及び最終濃度150 nMで所望のオリゴヌクレオチドを含む、130μLのOPTI-MEMTM-1で処理した。4時間処理後、培地をフレッシュな培地に交換した。オリゴヌクレオチド処理後16時間後に細胞を回収した。
使用したオリゴヌクレオチドの濃度は、細胞株ごとに変化させる。特定の細胞株に対する最適オリゴヌクレオチド濃度を決定するため、細胞をある濃度範囲の陽性対照オリゴヌクレオチドにより処理する。ヒト細胞については、陽性対照オリゴヌクレオチドは、ヒトH-rasを標的とし、ホスホロチオエートバックボーンを有する2’-O-メトキシエチルギャップマー(2’-O-メトキシエチルは太字で示した)である、ISIS 13920、
である。マウスまたはラット細胞については、陽性対照オリゴヌクレオチドは、マウスc-rafおよびラットc-rafの両方を標的とし、ホスホロチオエートバックボーンを有する2’-O-メトキシエチルギャップマー(2’-O-メトキシエチルは太字で示した)である、ISIS 15770、
である。H-ras(ISIS 13920)mRNAまたはc-raf(ISIS 15770)mRNAの80%の阻害を引き起こす陽性対照オリゴヌクレオチドの濃度を、その細胞株について引き続いて実験する際に利用する。80%の阻害が達成されない場合、H-rasまたはc-raf mRNAの60%の阻害を引き起こす陽性対照オリゴヌクレオチドの最低濃度を、その細胞株について引き続いて実験する際に、オリゴヌクレオチドスクリーニング濃度として利用する。60%の阻害が達成されない場合、その特定の細胞株はオリゴヌクレオチドトランスフェクション実験については適していないものと判断する。
実施例10
Survivin発現のオリゴヌクレオチド阻害の分析
Survivin発現のアンチセンスモジュレーションは、当該技術分野において知られる様々な方法でアッセイすることができる。例えば、Survivin mRNAレベルは、例えばノザンブロット分析、競合的ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、あるいは、リアルタイムPCR(RT-PCR)により、定量され得る。リアルタイム定量PCRが現在のところ好ましい。RNA分析は、全細胞内RNA、あるいは、ポリ(A)+ mRNAについて行うことができる。RNA単離の方法は、例えば、Ausubel, F.M. ら(Current Protocols in Molecular Biology, Volume 1, pp. 4.1.1-4.2.9 及び4.5.1-4.5.3, John Wiley & Sons, Inc., 1993)に教示される。ノザンブロット分析は、当該技術分野においては、日常的な方法であり、また、例えば、Ausubel, F.M.ら(Current Protocols in Molecular Biology, Volume 1, pp. 4.2.1-4.2.9, John Wiley & Sons, Inc., 1996)に教示される。リアルタイム定量(PCR)は、PE-Applied Biosystems(Foster City, CA)から入手可能な、市販のABI PRISMTM 7700 Sequence Detection Systemを使用することにより、都合よく成し遂げられ、そして、製造者の指示に従って使用される。PCRの他の手法もまた、当該技術分野において、既知である。
Survivin発現のオリゴヌクレオチド阻害の分析
Survivin発現のアンチセンスモジュレーションは、当該技術分野において知られる様々な方法でアッセイすることができる。例えば、Survivin mRNAレベルは、例えばノザンブロット分析、競合的ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、あるいは、リアルタイムPCR(RT-PCR)により、定量され得る。リアルタイム定量PCRが現在のところ好ましい。RNA分析は、全細胞内RNA、あるいは、ポリ(A)+ mRNAについて行うことができる。RNA単離の方法は、例えば、Ausubel, F.M. ら(Current Protocols in Molecular Biology, Volume 1, pp. 4.1.1-4.2.9 及び4.5.1-4.5.3, John Wiley & Sons, Inc., 1993)に教示される。ノザンブロット分析は、当該技術分野においては、日常的な方法であり、また、例えば、Ausubel, F.M.ら(Current Protocols in Molecular Biology, Volume 1, pp. 4.2.1-4.2.9, John Wiley & Sons, Inc., 1996)に教示される。リアルタイム定量(PCR)は、PE-Applied Biosystems(Foster City, CA)から入手可能な、市販のABI PRISMTM 7700 Sequence Detection Systemを使用することにより、都合よく成し遂げられ、そして、製造者の指示に従って使用される。PCRの他の手法もまた、当該技術分野において、既知である。
Survivinタンパク質レベルは、免疫沈降、ウエスタンブロット分析(イムノブロット)、ELISA、あるいは、蛍光活性化細胞分取器(FACS)といった、当該技術分野において既知である様々な手法により定量され得る。Survivinに対する抗体は同定され、そして、MSRSの抗体カタログ(Aerie Corporation, Birmingham, MI)といった、様々な供給者から入手することが可能であり、または、従来からの抗体作成方法により調製し得る。ポリクローナル抗血清の調製方法は、例えば、Ausubel, F.M.ら(Current Protocols in Molecular Biology, Volume 2, pp. 11.12.1-11.12.9, John Wiley & Sons, Inc., 1997)に教示される。モノクローナル抗血清の調製方法は、例えば、Ausubel, F.M.ら(Current Protocols in Molecular Biology, Volume 2, pp. 11.4.1-11.11.5, John Wiley & Sons, Inc., 1997)に教示される。
免疫沈降方法は、当該技術分野において標準的であり、また、例えば、Ausubel, F.M. ら(Current Protocols in Molecular Biology, Volume 2, pp. 10.16.1-10.16.11, John Wiley & Sons, Inc., 1998)において見いだすことができる。ウェスタンブロット(イムノブロット)分析は、当該技術分野において標準的であり、例えば、Ausubel, F.M.ら(Current Protocols in Molecular Biology, Volume 2, pp. 10.8.1-10.8.21, John Wiley & Sons, Inc., 1998)において見いだすことができる。酵素免疫吸着測定法(ELISA)は、当該技術分野において標準的であり、また、例えば、Ausubel, F.M. ら(Current Protocols in Molecular Biology, Volume 2, pp. 11.2.1-11.2.22, John Wiley & Sons, Inc., 1991)において見つけることができる。
実施例11
ポリ(A)+ mRNA単離
ポリ(A)+ mRNAは、Miuraら(Clin. Chem., 1996, 42, 1758-1764)に従って、単離された。ポリ(A)+ mRNA単離のための他の方法は、例えば、Ausubel, F.M.ら(Current Protocols in Molecular Biology, Volume 1, pp. 4.5.1-4.5.3, John Wiley & Sons, Inc., 1993)に教示される。簡潔には、96ウェルプレート上で培養した細胞において、細胞から増殖培地を除き、そして、各ウェルを200μL冷PBSで洗浄した。60μL溶解バッファー(10 mM Tris-HCl、pH 7.6、1 mM EDTA、0.5 M NaCl、0.5%NP-40、20 mMバナジル-リボヌクレオシド複合体)を各ウェルに加え、プレートをゆっくり揺り動かし、そして次に、室温で5分間インキュベートした。溶解物55μLをオリゴd(T)をコートした96ウェルプレート(AGCT Inc., Irvine CA)に移した。プレートを、60分、室温でインキュベートし、洗浄バッファー(10 mM Tris-HCl pH 7.6、1 mM EDTA、0.3 M NaCl)200μLで3回洗浄した。最後の洗浄の後、プレートをペーパータオルに当てて、余分な洗浄バッファーを取り除き、そしてその後、5分間風乾した。70℃に前もって熱した、溶出バッファー(5 mM Tris-HCl pH 7.6)60μLを、各ウェルに加え、プレートを90℃ホットプレートで5分間インキュベートし、そして、次に溶出物を新しい96ウェルプレートに移した。
ポリ(A)+ mRNA単離
ポリ(A)+ mRNAは、Miuraら(Clin. Chem., 1996, 42, 1758-1764)に従って、単離された。ポリ(A)+ mRNA単離のための他の方法は、例えば、Ausubel, F.M.ら(Current Protocols in Molecular Biology, Volume 1, pp. 4.5.1-4.5.3, John Wiley & Sons, Inc., 1993)に教示される。簡潔には、96ウェルプレート上で培養した細胞において、細胞から増殖培地を除き、そして、各ウェルを200μL冷PBSで洗浄した。60μL溶解バッファー(10 mM Tris-HCl、pH 7.6、1 mM EDTA、0.5 M NaCl、0.5%NP-40、20 mMバナジル-リボヌクレオシド複合体)を各ウェルに加え、プレートをゆっくり揺り動かし、そして次に、室温で5分間インキュベートした。溶解物55μLをオリゴd(T)をコートした96ウェルプレート(AGCT Inc., Irvine CA)に移した。プレートを、60分、室温でインキュベートし、洗浄バッファー(10 mM Tris-HCl pH 7.6、1 mM EDTA、0.3 M NaCl)200μLで3回洗浄した。最後の洗浄の後、プレートをペーパータオルに当てて、余分な洗浄バッファーを取り除き、そしてその後、5分間風乾した。70℃に前もって熱した、溶出バッファー(5 mM Tris-HCl pH 7.6)60μLを、各ウェルに加え、プレートを90℃ホットプレートで5分間インキュベートし、そして、次に溶出物を新しい96ウェルプレートに移した。
100 mmあるいは他の標準的なプレートに培養した細胞は、適する容量のすべての溶液を用いて、同様に処理し得る。
実施例12
全RNA単離
全mRNAは、Qiagen Inc.(Valencia CA)より購入したRNEASY 96TMキット及びバッファーを用い、製造者の推薦する方法に従って単離した。簡潔には、96ウェルプレート上で培養した細胞において、増殖培地を細胞から除き、そして、各ウェルを200μL冷PBSで洗浄した。100μLのバッファーRLTを各ウェルに加え、そして、プレートを20秒間激しく揺り動かした。70%エタノール100μLを次に各ウェルに加え、内容物を3回上下にピペッティングして混ぜた。次に試料を排水回収トレイに合わせたQIAVACTMマニホルドに取り付け、そして減圧装置に取り付けた、RNEASY 96TMウェルプレートに移した。減圧は15秒間行われた。1 mLのバッファーRW1をRNEASY 96TMプレートの各ウェルに加え、そして、再び減圧を15秒間行った。その後、1 mLのバッファーRPEをRNEASY 96TMプレートの各ウェルの添加し、そして減圧を15秒間行った。バッファーRPE洗浄を次に繰り返し、さらに10分間減圧を行った。プレートをQIAVACTMマニホルドから取り外し、そしてペーパータオルにあてて乾燥させた。プレートを次に、1.2 mL回収チューブを含む、回収チューブラックに合わせたQIAVACTMマニホルドにもう一度取り付けた。RNAを次に各ウェル中の60μLの水をピペッティングすることにより溶出し、1分間インキュベートし、そして次に、30秒間減圧を行った。さらに60μLの水を用いて、溶出段階を繰り返した。
実施例12
全RNA単離
全mRNAは、Qiagen Inc.(Valencia CA)より購入したRNEASY 96TMキット及びバッファーを用い、製造者の推薦する方法に従って単離した。簡潔には、96ウェルプレート上で培養した細胞において、増殖培地を細胞から除き、そして、各ウェルを200μL冷PBSで洗浄した。100μLのバッファーRLTを各ウェルに加え、そして、プレートを20秒間激しく揺り動かした。70%エタノール100μLを次に各ウェルに加え、内容物を3回上下にピペッティングして混ぜた。次に試料を排水回収トレイに合わせたQIAVACTMマニホルドに取り付け、そして減圧装置に取り付けた、RNEASY 96TMウェルプレートに移した。減圧は15秒間行われた。1 mLのバッファーRW1をRNEASY 96TMプレートの各ウェルに加え、そして、再び減圧を15秒間行った。その後、1 mLのバッファーRPEをRNEASY 96TMプレートの各ウェルの添加し、そして減圧を15秒間行った。バッファーRPE洗浄を次に繰り返し、さらに10分間減圧を行った。プレートをQIAVACTMマニホルドから取り外し、そしてペーパータオルにあてて乾燥させた。プレートを次に、1.2 mL回収チューブを含む、回収チューブラックに合わせたQIAVACTMマニホルドにもう一度取り付けた。RNAを次に各ウェル中の60μLの水をピペッティングすることにより溶出し、1分間インキュベートし、そして次に、30秒間減圧を行った。さらに60μLの水を用いて、溶出段階を繰り返した。
実施例13
Survivin mRNAレベルのリアルタイム定量PCR分析
Survivin mRNAレベルの定量は、ABI PRISM 7700 Sequence Detection System(PE-Applied Biosystems, Foster City, CA)を製造者の指示に従って使用して、リアルタイム定量PCRにより決定された。これは、閉じられたチューブで、ゲルに基づいてなく、リアルタイムにポリメラーゼ連鎖反応(PCR)産物のハイスループット定量ができる蛍光検出システムである。PCRが終了した後に、増幅産物が定量される標準的なPCRとは対照的に、リアルタイム定量PCR産物はそれが蓄積するに従って定量される。これは、PCR反応にフォワード及びリバースPCRプライマーの間に特異的にアニールし、そして2つの蛍光色素を含むオリゴヌクレオチドを含むことにより達せられる。レポーター色素(例えば、Operon Technologies Inc., Alameda, CA またはPE-Applied Biosystems, Foster City, CAのどちらかから入手可能なJOEあるいはFAM)は、プローブの5’端に結合し、そして、クエンチャー色素(例えば、Operon Technologies Inc., Alameda, CAまたはPE-Applied Biosystems, Foster City, CAのどちらかから入手可能なTAMRA)は、プローブの3’端に結合する。プローブ及び色素が完全なとき、レポーター色素の発光は3’クエンチャー色素の近接により消失される。増幅の間、プローブの標的配列へのアニーリングはTaqポリメラーゼの5’-エキソヌクレアーゼ活性により切断されうる基質を作り出す。PCR増幅サイクルの伸長相の間、Taqポリメラーゼによるプローブの切断はプローブの残りから(そしてつまりクエンチャー部分から)レポーター色素を放出し、そして、配列特異的な蛍光シグナルが生み出される。各サイクルで、さらなるレポーター色素分子はその対応するプローブから解離され、そして、蛍光強度は、ABI PRISMTM 7700 Sequence Detection Systemに組み込まれるレーザー光により、一定(6秒間)のインターバルでモニターされる。各アッセイにおいて、未処理の対照試料由来mRNAの希釈系列を含む、並行した一連の反応は、試験試料の、アンチセンスオリゴヌクレオチド処理後の阻害パーセントを定量するのに用いられる、標準曲線を生み出す。
Survivin mRNAレベルのリアルタイム定量PCR分析
Survivin mRNAレベルの定量は、ABI PRISM 7700 Sequence Detection System(PE-Applied Biosystems, Foster City, CA)を製造者の指示に従って使用して、リアルタイム定量PCRにより決定された。これは、閉じられたチューブで、ゲルに基づいてなく、リアルタイムにポリメラーゼ連鎖反応(PCR)産物のハイスループット定量ができる蛍光検出システムである。PCRが終了した後に、増幅産物が定量される標準的なPCRとは対照的に、リアルタイム定量PCR産物はそれが蓄積するに従って定量される。これは、PCR反応にフォワード及びリバースPCRプライマーの間に特異的にアニールし、そして2つの蛍光色素を含むオリゴヌクレオチドを含むことにより達せられる。レポーター色素(例えば、Operon Technologies Inc., Alameda, CA またはPE-Applied Biosystems, Foster City, CAのどちらかから入手可能なJOEあるいはFAM)は、プローブの5’端に結合し、そして、クエンチャー色素(例えば、Operon Technologies Inc., Alameda, CAまたはPE-Applied Biosystems, Foster City, CAのどちらかから入手可能なTAMRA)は、プローブの3’端に結合する。プローブ及び色素が完全なとき、レポーター色素の発光は3’クエンチャー色素の近接により消失される。増幅の間、プローブの標的配列へのアニーリングはTaqポリメラーゼの5’-エキソヌクレアーゼ活性により切断されうる基質を作り出す。PCR増幅サイクルの伸長相の間、Taqポリメラーゼによるプローブの切断はプローブの残りから(そしてつまりクエンチャー部分から)レポーター色素を放出し、そして、配列特異的な蛍光シグナルが生み出される。各サイクルで、さらなるレポーター色素分子はその対応するプローブから解離され、そして、蛍光強度は、ABI PRISMTM 7700 Sequence Detection Systemに組み込まれるレーザー光により、一定(6秒間)のインターバルでモニターされる。各アッセイにおいて、未処理の対照試料由来mRNAの希釈系列を含む、並行した一連の反応は、試験試料の、アンチセンスオリゴヌクレオチド処理後の阻害パーセントを定量するのに用いられる、標準曲線を生み出す。
PCR試薬はPE-Applied Biosystems(Foster City, CA)より入手した。RT-PCR反応は、25μLポリ(A)mRNA溶液を含む96ウェルプレートに、25μL PCRカクテル(1×TAQMANTM バッファーA、5.5 mM MgCl2、各300μMのdATP、dCTP及びdGTPを、600μMのdUTP、フォワードプライマー、リバースプライマー、及び、プローブを各100 nM、20 U RNAseインヒビター、1.25 U AMPLITAQ GOLDTM及び12.5 U MuLV逆転写酵素)を加えることにより実行した。RT反応は48℃で30分のインキュベーションにより実行された。AMPLITAQ GOLDTMを活性化するために95℃にて10分間のインキュベーションした後、40サイクルの2段階PCRプロトコールを実行した:95℃15秒間(変性)続いて60℃1.5分間(アニーリング/伸長)。
刊行物に記載された配列情報(本明細書中でSEQ ID NO:3として援用されるGenBankアクセッション番号U75285)を使用して、ヒトSurvivinに対するプローブおよびプライマーを、ヒトSurvivin配列にハイブリダイズするように設計した。
ヒトSurvivinについて、PCRプライマーは:
フォワードプライマー:AAGGACCACCGCATCTCTACA(SEQ ID NO: 4)、
リバースプライマー:CCAAGTCTGGCTCGTTCTCAGT(SEQ ID NO: 5)、および
PCRプローブ:FAM-CGAGGCTGGCTTCATCCACTGCC-TAMRA(SEQ ID NO: 6)、
であり、ここでFAM(PE-Applied Biosystems, Foster City, CA)は蛍光レポーター色素であり、そして、TAMRA(PE-Applied Biosystems, Foster City, CA)はクエンチャー色素である。
フォワードプライマー:AAGGACCACCGCATCTCTACA(SEQ ID NO: 4)、
リバースプライマー:CCAAGTCTGGCTCGTTCTCAGT(SEQ ID NO: 5)、および
PCRプローブ:FAM-CGAGGCTGGCTTCATCCACTGCC-TAMRA(SEQ ID NO: 6)、
であり、ここでFAM(PE-Applied Biosystems, Foster City, CA)は蛍光レポーター色素であり、そして、TAMRA(PE-Applied Biosystems, Foster City, CA)はクエンチャー色素である。
ヒトGAPDH用のPCRプライマーは:
フォワードプライマー:GAAGGTGAAGGTCGGAGTC(SEQ ID NO: 7)
リバースプライマー:GAAGATGGTGATGGGATTTC(SEQ ID NO: 8)であり、及び
PCRプローブは:5’ JOE-CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC- TAMRA 3’(SEQ ID NO: 9)であり、JOE(PE-Applied Biosystems, Foster City, CA)は蛍光レポーター色素であり、そして、TAMRA(PE-Applied Biosystems, Foster City, CA)はクエンチャー色素である。
フォワードプライマー:GAAGGTGAAGGTCGGAGTC(SEQ ID NO: 7)
リバースプライマー:GAAGATGGTGATGGGATTTC(SEQ ID NO: 8)であり、及び
PCRプローブは:5’ JOE-CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC- TAMRA 3’(SEQ ID NO: 9)であり、JOE(PE-Applied Biosystems, Foster City, CA)は蛍光レポーター色素であり、そして、TAMRA(PE-Applied Biosystems, Foster City, CA)はクエンチャー色素である。
刊行物に記載された配列情報(本明細書中でSEQ ID NO:10として援用されるGenBankアクセッション番号AB013819)を使用して、マウスSurvivinに対するプローブおよびプライマーを、マウスSurvivin配列にハイブリダイズするように設計した。マウスSurvivinについて、PCRプライマーは:
フォワードプライマー:CCGAGAACGAGCCTGATTTG(SEQ ID NO:11)、
リバースプライマー:GGGAGTGCTTTCTATGCTCCTCTA(SEQ ID NO: 12)、および
PCRプローブ:FAM-TAAGGAATTGGAAGGCTGGGAACCCG-TAMRA(SEQ ID NO: 13)、
であり、ここでFAM(PE-Applied Biosystems, Foster City, CA)は蛍光レポーター色素であり、そして、TAMRA(PE-Applied Biosystems, Foster City, CA)はクエンチャー色素である。マウスGAPDHについてPCRプライマーは:
フォワードプライマー:GGCAAATTCAACGGCACAGT(SEQ ID NO: 14)
リバースプライマー:GGGTCTCGCTCCTGGAAGCT(SEQ ID NO: 15)であり、及び
PCRプローブは:5’ JOE-AAGGCCGAGAATGGGAAGCTTGTCATC- TAMRA 3’(SEQ ID NO: 16)であり、JOE(PE-Applied Biosystems, Foster City, CA)は蛍光レポーター色素であり、そして、TAMRA(PE-Applied Biosystems, Foster City, CA)はクエンチャー色素である。
フォワードプライマー:CCGAGAACGAGCCTGATTTG(SEQ ID NO:11)、
リバースプライマー:GGGAGTGCTTTCTATGCTCCTCTA(SEQ ID NO: 12)、および
PCRプローブ:FAM-TAAGGAATTGGAAGGCTGGGAACCCG-TAMRA(SEQ ID NO: 13)、
であり、ここでFAM(PE-Applied Biosystems, Foster City, CA)は蛍光レポーター色素であり、そして、TAMRA(PE-Applied Biosystems, Foster City, CA)はクエンチャー色素である。マウスGAPDHについてPCRプライマーは:
フォワードプライマー:GGCAAATTCAACGGCACAGT(SEQ ID NO: 14)
リバースプライマー:GGGTCTCGCTCCTGGAAGCT(SEQ ID NO: 15)であり、及び
PCRプローブは:5’ JOE-AAGGCCGAGAATGGGAAGCTTGTCATC- TAMRA 3’(SEQ ID NO: 16)であり、JOE(PE-Applied Biosystems, Foster City, CA)は蛍光レポーター色素であり、そして、TAMRA(PE-Applied Biosystems, Foster City, CA)はクエンチャー色素である。
実施例14
Survivin mRNAレベルのノザンブロット分析
アンチセンス処理の18時間後、単層の細胞を冷PBSで2回洗浄し、そして、1 mL RNAZOLTM(TEL-TEST “B” Inc., Friendswood, TX)に溶解した。全RNAは製造者が推薦するプロトコルに従って調製した。MOPSバッファーシステム(AMRESCO, Inc. Solon, OH)を用い、1.1%ホルムアルデヒドを含む1.2%アガロースゲルによる電気泳動により、20マイクログラムの全RNAを分離した。Northern/Southern Transferバッファーシステム(TEL-TEST “B” Inc., Friendswood, TX)を使用して、一晩キャピラリートランスファーすることによって、RNAをゲルからHYBONDTM-N+ ナイロンメンブレン(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)に移した。RNAのトランスファーは、UV可視化により確認した。メンブレンをSTRATALINKERTMUV Crosslinker 2400(Stratagene, Inc, La Jolla, CA)を使用して、UV架橋により固定し、次いでQUICKHYBTMハイブリダイゼーション溶液(Stratagene, La Jolla, CA)を使用し、ストリンジェントな条件についての製造者の推奨を用いて、プローブ化した。
Survivin mRNAレベルのノザンブロット分析
アンチセンス処理の18時間後、単層の細胞を冷PBSで2回洗浄し、そして、1 mL RNAZOLTM(TEL-TEST “B” Inc., Friendswood, TX)に溶解した。全RNAは製造者が推薦するプロトコルに従って調製した。MOPSバッファーシステム(AMRESCO, Inc. Solon, OH)を用い、1.1%ホルムアルデヒドを含む1.2%アガロースゲルによる電気泳動により、20マイクログラムの全RNAを分離した。Northern/Southern Transferバッファーシステム(TEL-TEST “B” Inc., Friendswood, TX)を使用して、一晩キャピラリートランスファーすることによって、RNAをゲルからHYBONDTM-N+ ナイロンメンブレン(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)に移した。RNAのトランスファーは、UV可視化により確認した。メンブレンをSTRATALINKERTMUV Crosslinker 2400(Stratagene, Inc, La Jolla, CA)を使用して、UV架橋により固定し、次いでQUICKHYBTMハイブリダイゼーション溶液(Stratagene, La Jolla, CA)を使用し、ストリンジェントな条件についての製造者の推奨を用いて、プローブ化した。
ヒトSurvivinを検出するため、ヒトSurvivin特異的プローブを、フォワードプライマーAAGGACCACCGCATCTCTACA(SEQ ID NO: 4)およびリバースプライマーCCAAGTCTGGCTCGTTCTCAGT(SEQ ID NO: 5)を使用したPCRにより調製した。ロード効率及びトランスファー効率における多様性を標準化するため、メンブレンをストリップ化し、そして、ヒトグリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ(GAPDH)RNA(Clontech, Palo Alto, CA)についてプローブ化した。
マウスSurvivinを検出するため、マウスSurvivin特異的プローブを、フォワードプライマーCCGAGAACGAGCCTGATTTG(SEQ ID NO:11)およびリバースプライマーGGGAGTGCTTTCTATGCTCCTCTA(SEQ ID NO: 12)を使用したPCRにより調製した。ロード効率及びトランスファー効率における多様性を標準化するため、メンブレンをストリップ化し、そして、マウスグリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ(GAPDH)RNA(Clontech, Palo Alto, CA)についてプローブ化した。
実施例15
Survivin発現のアンチセンス阻害- ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド
本発明にしたがって、一連のオリゴヌクレオチドを、刊行物に記載された配列(本明細書中にSEQ ID NO: 3として援用される、GenBankアクセッション番号U75285)を使用して、ヒトSurvivin RNAの異なる領域を標的とするように設計した。オリゴヌクレオチドは、表1中に示す。標的部位は、オリゴヌクレオチドが結合する配列供給源の参照(Genbankアクセッション番号U75285)中にあるようにヌクレオチド番号により示す。表1中の全ての化合物は、全体にわたりホスホロチオエートバックボーン(ヌクレオシド間結合)を有するオリゴデオキシヌクレオチドである。全てのシチジンは、5-メチルシチジンである。化合物を、Survivin mRNAレベルに対する効果について、本明細書中の他の実施例において記載されるように、定量的リアルタイムPCRを用いて、解析した。データは、3回の実験からの平均である。存在する場合、“N.D.”は、“データなし”を示す。
Survivin発現のアンチセンス阻害- ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド
本発明にしたがって、一連のオリゴヌクレオチドを、刊行物に記載された配列(本明細書中にSEQ ID NO: 3として援用される、GenBankアクセッション番号U75285)を使用して、ヒトSurvivin RNAの異なる領域を標的とするように設計した。オリゴヌクレオチドは、表1中に示す。標的部位は、オリゴヌクレオチドが結合する配列供給源の参照(Genbankアクセッション番号U75285)中にあるようにヌクレオチド番号により示す。表1中の全ての化合物は、全体にわたりホスホロチオエートバックボーン(ヌクレオシド間結合)を有するオリゴデオキシヌクレオチドである。全てのシチジンは、5-メチルシチジンである。化合物を、Survivin mRNAレベルに対する効果について、本明細書中の他の実施例において記載されるように、定量的リアルタイムPCRを用いて、解析した。データは、3回の実験からの平均である。存在する場合、“N.D.”は、“データなし”を示す。
表1中に示すように、SEQ ID NOs 19、21、23、24、25、27、29、30、32、37、40、41、43、48、49、50、51、52および56は、このアッセイにおいて、Survivin発現の少なくとも30%の阻害を示し、そしてしたがって、好ましい。
実施例16
Survivin発現のアンチセンス阻害- ホスホロチオエート2'-MOEギャップマーオリゴヌクレオチド
本発明にしたがって、ヒトSurvivinを標的とする第二の一連のオリゴヌクレオチドを合成した。オリゴヌクレオチド配列は、表2中に示す。標的部位は、オリゴヌクレオチドが結合する配列供給源の参照(Genbankアクセッション番号U75285)中にあるように、ヌクレオチド番号により示す。
Survivin発現のアンチセンス阻害- ホスホロチオエート2'-MOEギャップマーオリゴヌクレオチド
本発明にしたがって、ヒトSurvivinを標的とする第二の一連のオリゴヌクレオチドを合成した。オリゴヌクレオチド配列は、表2中に示す。標的部位は、オリゴヌクレオチドが結合する配列供給源の参照(Genbankアクセッション番号U75285)中にあるように、ヌクレオチド番号により示す。
表2中の全ての化合物は、長さ18ヌクレオチドのキメラオリゴヌクレオチド(“ギャップマー”)であり、4-ヌクレオチドの“ウィング”がその両端(5'および3'方向)に位置する、10個の2'-デオキシヌクレオチドからなる中央部“ギャップ”領域からなる。ウィングは、2'-メトキシエチル(2'-MOE)ヌクレオチドからなる。ヌクレオシド間(バックボーン)結合は、オリゴヌクレオチド全体にわたって、ホスホロチオエート(P=S)である。全てのシチジン残基は、5-メチルシチジンである。
データは、本明細書中の他の実施例中に記載されるように、リアルタイム定量的PCRにより得、そして3回の実験から平均化する。存在する場合、“N.D.”は、“データなし”を示す。
表2中に示すように、SEQ ID NOs 60、65、68、70、72、76、80、83、87、88、91および92は、この実験において、Survivin発現の少なくとも30%の阻害を示し、そしてしたがって、好ましい。
実施例17
Survivin発現のアンチセンス阻害- ホスホロチオエート2'-MOEギャップマーオリゴヌクレオチド
本発明にしたがって、ヒトSurvivin mRNAを標的とする第三の一連のオリゴヌクレオチドを合成した。オリゴヌクレオチド配列は、表3中に示される。標的部位は、オリゴヌクレオチドが結合するヌクレオチド番号により示される。ヒトSurvivin mRNAは、Genbankアクセッション番号U75285からヌクレオチド 2811-2921、3174-3283、5158-5275および11955-12044をスプライシングし、そして本明細書中にSEQ ID NO: 97として援用される完全なヒトmRNA配列を作成することにより、生成した。
Survivin発現のアンチセンス阻害- ホスホロチオエート2'-MOEギャップマーオリゴヌクレオチド
本発明にしたがって、ヒトSurvivin mRNAを標的とする第三の一連のオリゴヌクレオチドを合成した。オリゴヌクレオチド配列は、表3中に示される。標的部位は、オリゴヌクレオチドが結合するヌクレオチド番号により示される。ヒトSurvivin mRNAは、Genbankアクセッション番号U75285からヌクレオチド 2811-2921、3174-3283、5158-5275および11955-12044をスプライシングし、そして本明細書中にSEQ ID NO: 97として援用される完全なヒトmRNA配列を作成することにより、生成した。
表3中の全ての化合物は、長さ18ヌクレオチドのキメラオリゴヌクレオチド(“ギャップマー”)であり、4-ヌクレオチドの“ウィング”がその両端(5'および3'方向)に位置する、10個の2'-デオキシヌクレオチドからなる中央部“ギャップ”領域からなる。ウィングは、2'-メトキシエチル(2'-MOE)ヌクレオチドからなる。ヌクレオシド間(バックボーン)結合は、オリゴヌクレオチド全体にわたって、ホスホロチオエート(P=S)である。全てのシチジン残基は、5-メチルシチジンである。
データは、本明細書中の他の実施例において記載するように、リアルタイム定量的PCRにより得、そして3回の実験から平均化する。存在する場合、“N.D.”は“データなし”を示す。
表3中に示すように、SEQ ID No 101、106、107、113、138、141、152および156は、このアッセイにおいて、ヒトSurvivin発現の少なくとも30%の阻害を示し、そしてしたがって、好ましい。
実施例18
2'-MOEウィングおよびデオキシギャップを有するキメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドによる、マウスSurvivin発現のアンチセンス阻害
本発明にしたがって、刊行物に記載された配列(本明細書中にSEQ ID NO: 10として援用される、GenBankアクセッション番号AB013819)を使用して、一連のオリゴヌクレオチドを、マウスSurvivin RNAの異なる領域を標的とするように設計した。オリゴヌクレオチドは、表4中に示す。“標的部位”は、オリゴヌクレオチドが結合する特定の標的配列上の、最初の(最も5'-末端の)ヌクレオチド番号を示す。表4中の全ての化合物は、長さ20ヌクレオチドのキメラオリゴヌクレオチド(“ギャップマー”)であり、5-ヌクレオチドの“ウィング”がその両端(5'および3'方向)に位置する、10個の2'-デオキシヌクレオチドからなる中央部“ギャップ”領域からなる。ウィングは、2'-メトキシエチル(2'-MOE)ヌクレオチドからなる。ヌクレオシド間(バックボーン)結合は、オリゴヌクレオチド全体にわたって、ホスホロチオエート(P=S)である。全てのシチジン残基は、5-メチルシチジンである。化合物を、マウスSurvivin mRNAレベルに対するそれらの効果について、本明細書中の他の実施例において記載されるように、定量的リアルタイムPCRにより解析した。データは、2回の実験から平均化する。存在する場合、“N.D.”は、“データなし”を示す。
2'-MOEウィングおよびデオキシギャップを有するキメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドによる、マウスSurvivin発現のアンチセンス阻害
本発明にしたがって、刊行物に記載された配列(本明細書中にSEQ ID NO: 10として援用される、GenBankアクセッション番号AB013819)を使用して、一連のオリゴヌクレオチドを、マウスSurvivin RNAの異なる領域を標的とするように設計した。オリゴヌクレオチドは、表4中に示す。“標的部位”は、オリゴヌクレオチドが結合する特定の標的配列上の、最初の(最も5'-末端の)ヌクレオチド番号を示す。表4中の全ての化合物は、長さ20ヌクレオチドのキメラオリゴヌクレオチド(“ギャップマー”)であり、5-ヌクレオチドの“ウィング”がその両端(5'および3'方向)に位置する、10個の2'-デオキシヌクレオチドからなる中央部“ギャップ”領域からなる。ウィングは、2'-メトキシエチル(2'-MOE)ヌクレオチドからなる。ヌクレオシド間(バックボーン)結合は、オリゴヌクレオチド全体にわたって、ホスホロチオエート(P=S)である。全てのシチジン残基は、5-メチルシチジンである。化合物を、マウスSurvivin mRNAレベルに対するそれらの効果について、本明細書中の他の実施例において記載されるように、定量的リアルタイムPCRにより解析した。データは、2回の実験から平均化する。存在する場合、“N.D.”は、“データなし”を示す。
表4中に示すように、SEQ ID NOs 187、188、192、193、196、197、198、199、202、205、207、208、211、212、213、214、218、219、225、226、228および229は、この実験においてマウスSurvivin発現の少なくとも30%の阻害を示し、そしてしたがって、好ましい。
本発明にしたがって、刊行物に記載された配列(本明細書中にSEQ ID NO: 231として援用される、GenBankアクセッション番号AA717921)を使用して、第二の一連のオリゴヌクレオチドを、マウスSurvivin RNAの異なる領域を標的とするように設計した。オリゴヌクレオチドは、表5中に示される。“標的部位”は、オリゴヌクレオチドが結合する特定の標的配列上の最初の(最も5'-末端の)ヌクレオチド番号を示す。表5中の全ての化合物は、長さ20ヌクレオチドのキメラオリゴヌクレオチド(“ギャップマー”)であり、5-ヌクレオチドの“ウィング”がその両端(5'および3'方向)に位置する、10個の2'-デオキシヌクレオチドからなる中央部“ギャップ”領域からなる。ウィングは、2'-メトキシエチル(2'-MOE)ヌクレオチドからなる。ヌクレオシド間(バックボーン)結合は、オリゴヌクレオチド全体にわたって、ホスホロチオエート(P=S)である。全てのシチジン残基は、5-メチルシチジンである。化合物を、マウスSurvivin mRNAレベルに対するそれらの効果について、本明細書中の他の実施例において記載されるように、定量的リアルタイムPCRにより解析した。データは、2会の実験から平均化する。存在する場合、“N.D.”は、“データなし”を示す。
表5中に示すように、SEQ ID NOs 237および247は、この実験においてマウスSurvivin発現の少なくとも30%の阻害を示し、そしてしたがって、好ましい。
実施例19
Survivinタンパク質レベルのウェスタンブロット解析
ウェスタンブロット解析(イムノブロット解析)を、標準的な方法を使用して行う。細胞を、オリゴヌクレオチド処理の後16-20時間後に回収し、PBSにより1回洗浄し、レムリ(Laemmli)バッファー中に懸濁し(100μl/well)、5分間煮沸した後、16%SDS-PAGEゲル上にロードした。ゲルを、150 Vにて1.5時間流し、そしてウェスタンブロット用のメンブレンにトランスファーした。Survivinに対する適切な一次抗体を、放射標識したまたは蛍光標識した、一次抗体種に対する二次抗体とともに使用する。PHOSPHORIMAGERTM(Molecular Dynamics, Sunnyvale CA)を使用して、バンドを可視化する。
実施例19
Survivinタンパク質レベルのウェスタンブロット解析
ウェスタンブロット解析(イムノブロット解析)を、標準的な方法を使用して行う。細胞を、オリゴヌクレオチド処理の後16-20時間後に回収し、PBSにより1回洗浄し、レムリ(Laemmli)バッファー中に懸濁し(100μl/well)、5分間煮沸した後、16%SDS-PAGEゲル上にロードした。ゲルを、150 Vにて1.5時間流し、そしてウェスタンブロット用のメンブレンにトランスファーした。Survivinに対する適切な一次抗体を、放射標識したまたは蛍光標識した、一次抗体種に対する二次抗体とともに使用する。PHOSPHORIMAGERTM(Molecular Dynamics, Sunnyvale CA)を使用して、バンドを可視化する。
実施例20
Survivinのアンチセンス阻害の、アポトーシスに対する効果
ISIS 23722およびミスマッチ対照、ISIS 28598(TAAGCTGTTCTATGTGTT; SEQ ID NO: 248)を、HeLa細胞におけるアポトーシスに対する、それらの効果についてアッセイした。カスパーゼ阻害剤z-VAD.fmkを、Calbiochem(La Jolla CA)から購入し、製造者の推奨にしたがって使用した。オリゴヌクレオチドを伴わないHeLa細胞中で、およそ4%の細胞が低2倍体(hypodiploid)である(これは、アポトーシスの指標であるDNA断片化を示している)。ミスマッチオリゴヌクレオチドを添加した場合にはおよそ11%であるのと対照的に、ISIS 23722を添加した場合、およそ22%の細胞が低2倍体である。カスパーゼ阻害剤z-VAD.fmk(42.8 mM)の存在下において、低2倍体(アポトーシス性)細胞のパーセントは、オリゴヌクレオチドなしの場合3%に、ISIS 23722を添加した場合に6%に、そしてミスマッチ対照を添加した場合に4%に、低下する。このことから、Survivinのアンチセンス阻害によりアポトーシスが増加し、そしてこの効果はカスパーゼ-媒介性であることが示される。
Survivinのアンチセンス阻害の、アポトーシスに対する効果
ISIS 23722およびミスマッチ対照、ISIS 28598(TAAGCTGTTCTATGTGTT; SEQ ID NO: 248)を、HeLa細胞におけるアポトーシスに対する、それらの効果についてアッセイした。カスパーゼ阻害剤z-VAD.fmkを、Calbiochem(La Jolla CA)から購入し、製造者の推奨にしたがって使用した。オリゴヌクレオチドを伴わないHeLa細胞中で、およそ4%の細胞が低2倍体(hypodiploid)である(これは、アポトーシスの指標であるDNA断片化を示している)。ミスマッチオリゴヌクレオチドを添加した場合にはおよそ11%であるのと対照的に、ISIS 23722を添加した場合、およそ22%の細胞が低2倍体である。カスパーゼ阻害剤z-VAD.fmk(42.8 mM)の存在下において、低2倍体(アポトーシス性)細胞のパーセントは、オリゴヌクレオチドなしの場合3%に、ISIS 23722を添加した場合に6%に、そしてミスマッチ対照を添加した場合に4%に、低下する。このことから、Survivinのアンチセンス阻害によりアポトーシスが増加し、そしてこの効果はカスパーゼ-媒介性であることが示される。
実施例21
Survivinのアンチセンス阻害の、細胞分裂に対する効果
Survivinを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド(ISIS 23722)により処理したHeLa細胞では、異常な細胞分裂の結果、大型で、多核の細胞が形成されることを、観察することができる。ミスマッチ対照オリゴヌクレオチドは、この効果を有しておらず、そして細胞は見たところ正常であった(非処理対照とにている)。この効果は、フローサイトメトリーにより定量化することができる。
Survivinのアンチセンス阻害の、細胞分裂に対する効果
Survivinを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド(ISIS 23722)により処理したHeLa細胞では、異常な細胞分裂の結果、大型で、多核の細胞が形成されることを、観察することができる。ミスマッチ対照オリゴヌクレオチドは、この効果を有しておらず、そして細胞は見たところ正常であった(非処理対照とにている)。この効果は、フローサイトメトリーにより定量化することができる。
非処理細胞または対照オリゴヌクレオチドで処理した細胞は、細胞分裂のG1期およびG2/M期においてそれぞれ、細胞の集団を示す、二つの顕著なピークを示す。G1細胞は、1コピーのそれらのDNA(1×)を有し、そしてG2/M細胞は、2コピー(2×)を有する。24時間から72時間までにわたって、これらの1×および2×のピークは、対照オリゴヌクレオチドにより処理した細胞またはオリゴヌクレオチド処理していない細胞において、ほとんど実質的に変化しないままである。しかしながら、Survivinを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドにより処理した細胞において、オリゴ処理の24時間後までに、多くの細胞が2コピーのDNAを有している。このことから、細胞分裂が捕捉されることが示される。このオリゴヌクレオチドによる処理後48時間まで、4×のピークが、1×および2×のピークとほぼ同等のサイズであり、このことから、1コピー、2コピー、および4コピーのDNAを有する細胞の数は、大まかには同等であることが示される。72時間まで、最大のピークは、16×であり、このことから、細胞が16コピーのそれらのDNAを有しており、そしてしたがって、細胞質の分裂が、複数の世代にわたって起こっていないことが示される。したがって、Survivinの阻害は、細胞分裂を妨害することが示される。
実施例22
Survivinのアンチセンス阻害の、細胞増殖に対する効果
ヒトHT1080線維肉腫細胞(American Type Culture Collection, CCL-121)を、10%ウシ胎児血清(Gibco BRL)を添加した、1%非-必須アミノ酸を含む最小必須培地90%中で増殖させた。単一パルスを伴う225ボルト、6ミリ秒間、および1〜30μMのオリゴヌクレオチド濃度の設定で、オリゴヌクレオチドを使用して細胞をエレクトロポレーションした(Electro Square Porator, Model T820, Biotechnologies and Experimental Research, BTX)。ISIS 23722(SEQ ID NO: 87)およびミスマッチ対照ISIS 28598(SEQ ID NO: 248)を使用した。エレクトロポレーションの後すぐに1500細胞/wellで細胞をまき、そして生存細胞を、MTTアッセイにより、エレクトロポレーションの後、24、48、72、96および120時間後に測定した。増殖速度(ΔOD/時間)を、オリゴヌクレオチド濃度に対してプロットした。1μMのオリゴヌクレオチド濃度の場合、増殖速度は、ISIS 23722および対照であるISIS 28598についてほぼ同一であった(それぞれ、0.01726および0.01683)。5μMのオリゴヌクレオチドの場合、ISIS 23722-処理細胞の増殖速度は、対照処理細胞の増殖速度よりも16.7%低かった(それぞれ、0.01433 vs. 0.01728 ΔOD/時間)。10μMの場合、ISIS 23722-処理細胞の増殖速度は、対照処理細胞の増殖速度よりも45%低かった(それぞれ、0.009677 vs. 0.01762 ΔOD/時間)。20μMの場合、ISIS 23722-処理細胞の増殖速度は、対照処理細胞の増殖速度よりも52%低かった。(それぞれ、0.007716 vs. 0.01620 ΔOD/時間)。30μMの場合、ISIS 23722-処理細胞の増殖速度は、対照処理細胞よりも54%低かった(それぞれ、0.006562 vs. 0.01417 ΔOD/時間)。このように、Survivinを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた処理は、腫瘍細胞の増殖速度を、50%以上減少させることが示された。
Survivinのアンチセンス阻害の、細胞増殖に対する効果
ヒトHT1080線維肉腫細胞(American Type Culture Collection, CCL-121)を、10%ウシ胎児血清(Gibco BRL)を添加した、1%非-必須アミノ酸を含む最小必須培地90%中で増殖させた。単一パルスを伴う225ボルト、6ミリ秒間、および1〜30μMのオリゴヌクレオチド濃度の設定で、オリゴヌクレオチドを使用して細胞をエレクトロポレーションした(Electro Square Porator, Model T820, Biotechnologies and Experimental Research, BTX)。ISIS 23722(SEQ ID NO: 87)およびミスマッチ対照ISIS 28598(SEQ ID NO: 248)を使用した。エレクトロポレーションの後すぐに1500細胞/wellで細胞をまき、そして生存細胞を、MTTアッセイにより、エレクトロポレーションの後、24、48、72、96および120時間後に測定した。増殖速度(ΔOD/時間)を、オリゴヌクレオチド濃度に対してプロットした。1μMのオリゴヌクレオチド濃度の場合、増殖速度は、ISIS 23722および対照であるISIS 28598についてほぼ同一であった(それぞれ、0.01726および0.01683)。5μMのオリゴヌクレオチドの場合、ISIS 23722-処理細胞の増殖速度は、対照処理細胞の増殖速度よりも16.7%低かった(それぞれ、0.01433 vs. 0.01728 ΔOD/時間)。10μMの場合、ISIS 23722-処理細胞の増殖速度は、対照処理細胞の増殖速度よりも45%低かった(それぞれ、0.009677 vs. 0.01762 ΔOD/時間)。20μMの場合、ISIS 23722-処理細胞の増殖速度は、対照処理細胞の増殖速度よりも52%低かった。(それぞれ、0.007716 vs. 0.01620 ΔOD/時間)。30μMの場合、ISIS 23722-処理細胞の増殖速度は、対照処理細胞よりも54%低かった(それぞれ、0.006562 vs. 0.01417 ΔOD/時間)。このように、Survivinを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた処理は、腫瘍細胞の増殖速度を、50%以上減少させることが示された。
別の対照オリゴヌクレオチド、20merのランダムオリゴヌクレオチド(ISIS 29848、SEQ ID NO: 249;NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN、ここでそれぞれのNは、A、C、GおよびTの混合物である)を使用する同様の実験において、同様の結果が得られた。オリゴヌクレオチドを、0.5〜20μMの濃度で試験し、そして細胞生存を再びMTTアッセイにより測定し、そして増殖速度(ΔOD/時間)を測定した。0.5μMのオリゴヌクレオチド濃度の場合、増殖速度は、ISIS 23722および対照の処理細胞について同様であった(それぞれ、0.01441および0.01342)。10μMの場合、ISIS 23722-処理細胞の増殖速度は、対照処理細胞の増殖速度よりも57%低かった(それぞれ、0.005568 vs. 0.01298 ΔOD/時間)。20μMの場合には、ISIS 23722-処理細胞の増殖速度は、対照処理細胞の増殖速度よりも77%低かった(それぞれ、0.002433 vs. 0.01073 ΔOD/時間)。このように、Survivinを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた処理は、腫瘍細胞の増殖増殖速度を、対照と比較して75%以上減少させることが示された。
同様の実験を、ヒトMCF-7乳ガン癌腫細胞において行い、ISIS 23722およびランダム対照ISIS 29848を、0.5〜20μMの濃度で試験した。単一パルスを伴う175ボルト、6ミリ秒間の設定で、オリゴヌクレオチドにより細胞をエレクトロポレーションし(Biotechnologies and Experimental Research, BTXにより製造されたElectro Square Porator, Model T820)、そして増殖速度を上述したように測定した。0.5μMのオリゴヌクレオチド濃度の場合、ISIS 23722および対照の処理細胞について、増殖速度は同様であった(それぞれ、0.005959および0.005720)。1μMのオリゴヌクレオチドの場合、増殖速度は、ISIS 23722および対照の処理細胞について、それでも比較的同様であった(それぞれ、0.005938および0.005479)。5μMのオリゴヌクレオチドの場合、増殖速度は、ISIS 23722処理細胞および対照処理細胞について、それぞれ、0.002574および0.005676であった。10μMの場合、ISIS 23722-処理細胞の増殖速度は、対照処理細胞の増殖速度よりも69%低かった(それぞれ、0.001828 vs. 0.005901 ΔOD/時間)。20μMの場合、ISIS 23722-処理細胞の増殖速度は、対照処理細胞の増殖速度よりも64%低かった(それぞれ、0.001523 vs. 0.004223 ΔOD/時間)。このように、Survivinを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた処理は、いくつかの腫瘍細胞タイプにおいて、腫瘍細胞の増殖速度を有意に減少させることが示された。
実施例23
ISIS 23722による、細胞の化学療法剤刺激に対する感作
ISIS 23722(SEQ ID NO: 87)および対照オリゴヌクレオチドであるISIS 29848、20merのランダムオリゴヌクレオチド(ISIS 29848、SEQ ID NO: 249;NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN、ここで、それぞれのNは、A、C、GおよびTの混合物である)を、化学療法剤、タキソールおよびシスプラチンの効果に対して細胞を感作するその能力について、アッセイした。
ISIS 23722による、細胞の化学療法剤刺激に対する感作
ISIS 23722(SEQ ID NO: 87)および対照オリゴヌクレオチドであるISIS 29848、20merのランダムオリゴヌクレオチド(ISIS 29848、SEQ ID NO: 249;NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN、ここで、それぞれのNは、A、C、GおよびTの混合物である)を、化学療法剤、タキソールおよびシスプラチンの効果に対して細胞を感作するその能力について、アッセイした。
ヒトHT1080線維肉腫細胞(American Type Culture Collection, CCL-121)を、10%ウシ胎児血清(Gibco BRL)を添加した、1%非-必須アミノ酸を含む最小必須培地90%中で増殖させた。細胞を、10〜100 nMの濃度のオリゴヌクレオチド単独で、あるいはタキソール(0.25 nMまたは1 nMの濃度)またはシスプラチン(5μMまたは25μMの濃度)と組み合わせて、処理した。タキソールまたはシスプラチンを使用する処理の後、1〜2 hrのオリゴヌクレオチド処理を行った。処理後すぐに1500細胞/wellで細胞をまき、そして生存細胞を、処理後12、24、36、48、および60時間後に、MTTアッセイにより測定した。増殖速度(ΔOD/時間)を、オリゴヌクレオチド濃度および/または化学療法剤濃度に対してプロットする。
同様の実験を、ヒトMCF-7乳腺癌腫細胞(American Type Culture Collection)中で行い、ISIS 23722およびランダム対照ISIS 29848を、10〜100 nMの濃度で、単独で、あるいはタキソール(0.5 nMまたは2 nMの濃度)またはシスプラチン(2.5μMまたは15μM濃度)と組み合わせて、試験した。細胞を、10%ウシ胎児血清(Gibco BRL)を添加した、ダルベッコ改変イーグル培地(低グルコース)90%中で増殖させた。タキソールまたはシスプラチンを用いて処理した後、1〜2 hrのオリゴヌクレオチド処理した。細胞を、トランスフェクション後すぐに2500細胞/wellでまき、そして生存細胞を、処理後12、24、36、48、および60時間後に、MTTアッセイにより測定した。増殖速度(ΔOD/時間)を、オリゴヌクレオチド濃度および/または化学療法剤濃度に対してプロットした。
実施例24
活性オリゴヌクレオチドISIS 23722の混合バックボーン型
ISIS 23722(SEQ ID NO:87)と同一の配列を有するオリゴヌクレオチドを、今回は、2'MOE“ウィング”中にホスホジエステルバックボーン結合を、そして2'デオキシ“ギャップ”中にホスホロチオエート結合を有する2'MOEギャップマーとして、合成した。両方のシトシンは、5-メチルシトシンである。
活性オリゴヌクレオチドISIS 23722の混合バックボーン型
ISIS 23722(SEQ ID NO:87)と同一の配列を有するオリゴヌクレオチドを、今回は、2'MOE“ウィング”中にホスホジエステルバックボーン結合を、そして2'デオキシ“ギャップ”中にホスホロチオエート結合を有する2'MOEギャップマーとして、合成した。両方のシトシンは、5-メチルシトシンである。
本明細書中の前の実施例に記載したように、この化合物を、細胞増殖、細胞分裂、および化学療法剤に対する感作に対する、その効果について試験した。
Claims (5)
- 医薬的に許容可能な担体または希釈剤、およびSEQ ID NO: 1のヌクレオチド1099-1116の少なくとも8ヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその医薬的に許容可能な塩を含む、医薬組成物であって、ヒトSurvivinの発現を阻害する、前記医薬組成物。
- 医薬的に許容可能な担体または希釈剤およびSEQ ID NO: 87を含む長さ18〜30ヌクレオチドのアンチセンス化合物、またはその医薬的に許容可能な塩を含む医薬組成物であって、前記アンチセンス化合物がヒトSurvivinの発現を阻害する、前記医薬組成物。
- 医薬的に許容可能な担体または希釈剤およびSEQ ID NO: 87を含むアンチセンス化合物を含む医薬組成物であって、すべてのヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合であり、5'末端の4塩基が2'-O-メトキシエチル修飾を含み、3'末端の4塩基が2'-O-メトキシエチル修飾を含み、そしてすべてのシチジン残基が5-メチル修飾を含む、前記医薬組成物。
- 医薬的に許容可能な担体または希釈剤およびSEQ ID NO: 87を含むアンチセンス化合物の医薬的に許容可能な塩を含む医薬組成物であって、すべてのヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合であり、5'末端の4塩基が2'-O-メトキシエチル修飾を含み、3'末端の4塩基が2'-O-メトキシエチル修飾を含み、そしてすべてのシチジン残基が5-メチル修飾を含む、前記医薬組成物。
- 前記アンチセンス化合物がナトリウム塩である、請求項4に記載の医薬組成物。
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