JP2002531469A

JP2002531469A - アポトーシス−１の細胞性阻害物質の発現のアンチセンスモジュレーション

Info

Publication number: JP2002531469A
Application number: JP2000585447A
Authority: JP
Inventors: ベネット，シー・フランク; アッカーマン，エリザベス・エイ; カウサート，レックス・エム
Original assignee: Isis Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Ionis Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1998-12-03
Filing date: 1999-06-16
Publication date: 2002-09-24
Also published as: CA2353090A1; EP1163373A1; AU753245C; WO2000032816A1; AU753245B2; AU4572799A; EP1163373A4; US5958772A

Abstract

(57)【要約】アポトーシス−１の細胞性阻害物質の発現をモジュレートするアンチセンス化合物、組成物及び方法が提供される。この組成物は、アンチセンス化合物、特にアポトーシス−１の細胞性阻害物質をコードする核酸を標的にしたアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。アポトーシス−１の細胞性阻害物質の発現のモジュレーションとアポトーシス−１の細胞性阻害物質の発現に関連した疾患の治療にこれらの化合物を用いる方法が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の分野】

本発明は、アポトーシス−１の細胞性阻害物質の発現をモジュレートする組成
物及び方法を提供する。特に、本発明は、ヒトのアポトーシス−１の細胞性阻害
物質をコードする核酸と特異的にハイブリダイズするアンチセンス化合物、特に
オリゴヌクレオチドに関する。そのようなオリゴヌクレオチドは、アポトーシス
−１の細胞性阻害物質の発現をモジュレートすることが分かっている。

【０００２】

【発明の背景】

アポトーシス、又はプログラム化された細胞死は、制御不能な細胞増殖を防ぐ
ために進化の間に強く保存されてきた。この形式の細胞死は、余剰であるか又は
望ましくない細胞を一掃することによって多細胞生物体の発達及び維持において
きわめて重要な役割を担っている。しかしながら、このプロセスが破綻すると、
過剰なアポトーシスは細胞の損失及び変性障害をもたらし、不十分なアポトーシ
スは癌、自己免疫疾患及びウイルス感染症の発現につながる（Thompon, Science
, 1995, 267, 1465-1462）。いくつかの刺激がアポトーシスを誘導し得るが、多くの種間に保存されている
共通の細胞死経路へアポトーシスの、阻害を含む中間シグナル伝達事象について
は、ほとんどわかっていない。最近、ウイルスにより産生されるものと相同なア
ポトーシス阻害タンパク質のヒトにおけるファミリーが同定された。

【０００３】アポトーシス−１の細胞性阻害物質（ｃ−ＩＡＰ−１、アポトーシス阻害物質
１、ＡＰＩ−１、ｈＩＡＰ−２及びＭＩＨＢとしても知られる）は、細胞内デス
シグナルの伝達に干渉する抗アポトーシスタンパク質のアポトーシス阻害物質（
ＩＡＰ）ファミリーのメンバーである。それは最初ＴＮＦＲ２−ＴＲＡＦシグナ
ル伝達経路の成分としてクローン化されて特徴づけられ（Rothe et al., Cell,
1994, 78, 681-692)、ＴＲＡＦ２−ＴＲＡＦ１へテロ複合体とともにＴＮＦＲ２
の細胞質ドメインへ補充されることが示された（Rothe et al., Cell, 1995, 83
, 1243-1252 ）。後に、それは、哺乳動物におけるアポトーシスに必要とされる
プロテアーゼである、インターロイキン−１β変換酵素（ＩＣＥ）又はカスパー
ゼ−１の過剰発現に起因するアポトーシスを阻害し得る因子として同定された（
Uren et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 1996, 93, 4974-4978）。引き続
き、アポトーシス−１の細胞性阻害物質は、他の細胞死プロテアーゼ、即ちカス
パーゼ−３、カスパーゼ−７及びカスパーゼ−８を阻害することが示された（De
veraux et al., Embo. J., 1998, 17, 2215-2223; Roy et al., Embo J., 1997,
16, 6914-6925; Wang et al., Science, 1998, 281, 1680-1683）。さらに、ア
ポトーシス−１の細胞性阻害物質は、以前に同定されたＴＮＦＲ２経路から独立
しているＴＮＦＲ１シグナル伝達経路においてある役割を担うことが示された（
Shu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 1996, 93, 13973-13978 ）。

【０００４】アポトーシス−１ｍＲＮＡ発現の細胞性阻害物質は、胸腺、精巣及び卵巣で最
も多く（Rothe et al., Cell, 1995, 83, 1243-1252 ）、ラット顆粒膜及び筴膜
細胞の卵胞発生期に調節されることが示されていて、ステージ特異的な卵胞閉鎖
の制御におけるアポトーシス−１の細胞性阻害物質の役割を示唆する（Li et al
., Endocrinology, 1998, 139, 1321-1328）。現時点では、アポトーシス−１の細胞性阻害物質の合成を有効に阻害する既知
の治療薬は存在しない。

【０００５】今日まで、アポトーシス−１の細胞性阻害物質の機能を阻害することを狙った
戦略は、ＴＲＡＦ２−ＴＲＡＦ１ヘテロ複合体やＴＮＦシグナル伝達カスケード
の成分を含む上流の因子群を妨害する諸分子の使用に関するものであった。しかしながら、これらの戦略は、治療用プロトコールとして検証されていない
し、ＴＮＦシグナル伝達からは多くの枝分かれした経路が生じるので、アポトー
シス−１の細胞性阻害物質に対して非特異的でもある。従って、アポトーシス−
１の細胞性阻害物質の機能を有効に阻害し得る追加の薬剤への痛切なニーズがあ
る。それ故に、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、アポトーシス−１の細胞性
阻害物質の発現を有効かつ特異的にモジュレートするための有望な新薬ツールを
提供すると考えられている。

【０００６】

【発明の要旨】

本発明は、アポトーシス−１の細胞性阻害物質をコードする核酸を標的にして
、アポトーシス−１の細胞性阻害物質の発現をモジュレートするアンチセンス化
合物、特にオリゴヌクレオチドに関する。本発明のアンチセンス化合物を含んで
なる医薬及び他の組成物もまた提供される。さらに提供されるのは、本発明の１
種又はそれ以上のアンチセンス化合物又は組成物に細胞又は組織を接触させるこ
とを含んでなる、前記細胞又は組織におけるアポトーシス−１の細胞性阻害物質
の発現をモジュレートする方法である。さらに提供されるのは、治療上又は予防
有効量の本発明の１種又はそれ以上のアンチセンス化合物又は組成物を投与する
ことによって、アポトーシス−１の細胞性阻害物質の発現に関連する疾患又は病
態を有しているか又はそれに罹患しやすい疑いのある動物、特にヒトを治療する
方法である。

【０００７】

【発明の具体的な説明】

本発明は、アポトーシス−１の細胞性阻害物質をコードする核酸分子の機能を
モジュレートして、産生されるアポトーシス−１の細胞性阻害物質の量を最終的
にモジュレートする使用について、オリゴマーのアンチセンス化合物、特にオリ
ゴヌクレオチドを利用する。このことは、アポトーシス−１の細胞性阻害物質を
コードする１つ又はそれ以上の核酸と特異的にハイブリダイズするアンチセンス
化合物を提供することによって達成される。本明細書で使用されるように、「標
的核酸」及び「アポトーシス−１の細胞性阻害物質をコードする核酸」という用
語は、アポトーシス−１の細胞性阻害物質をコードするＤＮＡ、そのようなＤＮ
Ａから転写されるＲＮＡ（プレｍＲＮＡとｍＲＮＡを含む）、及びそのようなＲ
ＮＡに由来するｃＤＮＡも含む。オリゴマー化合物がその標的核酸と特異的にハ
イブリダイズすると、その核酸の正常な機能が干渉される。このように標的核酸
と特異的にハイブリダイズする化合物によってその機能をモジュレートすること
は、一般に「アンチセンス」と言われる。干渉されるＤＮＡの機能には複製及び
転写が含まれる。干渉されるＲＮＡの機能には、例えばタンパク質翻訳部位への
ＲＮＡの転座、ＲＮＡからタンパク質の翻訳、１種又はそれ以上のｍＲＮＡ種を
産生するＲＮＡのスプライシング、及びＲＮＡが関与しているか又はそれによっ
て促進され得る触媒活性といった、きわめて重要な機能がすべて含まれる。標的
核酸の機能に対するそのような干渉の全体的な効果がアポトーシス−１の細胞性
阻害物質の発現のモジュレーションになる。本発明の文脈では、「モジュレーシ
ョン」は遺伝子発現の増加（刺激）又は減少（阻害）のいずれかを意味する。本
発明の文脈では、遺伝子発現のモジュレーションの好ましい形態は阻害であり、
好ましい標的はｍＲＮＡである。

【０００８】特定の核酸をアンチセンスの標的にすることが好ましい。アンチセンス化合物
をある特定の核酸への「標的にする」ことは、本発明の文脈では、多工程の方法
である。この方法は、通常、その機能をモジュレートすべき核酸配列を同定する
ことから始まる。これは、例えば、その発現が特定の障害又は病態に関連づけら
れる細胞の遺伝子（又はその遺伝子から転写されるｍＲＮＡ）、又は感染病原体
由来の核酸分子であり得る。本発明では、標的は、アポトーシス−１の細胞性阻
害物質をコードする核酸分子である。標的にする方法には、所望の効果、例えば
このタンパク質の発現の検出又はモジュレーションが生じるようにアンチセンス
相互作用が起こる、この遺伝子内の部位を決定することも含まれる。本発明の文
脈では、好ましい遺伝子内部位は、この遺伝子のオープンリーディングフレーム
（ＯＲＦ）の翻訳開始又は終止コドンを含む領域である。当技術分野で知られて
いるように、翻訳開始コドンは通常５' −ＡＵＧ（転写されたｍＲＮＡ分子では
、対応するＤＮＡ分子内の５' −ＡＴＧ）であるので、翻訳開始コドンはまた「
ＡＵＧコドン」、「開始コドン」又は「ＡＵＧ開始コドン」とも言われる。遺伝
子のごく一部は、５' −ＧＵＧ、５' −ＵＵＧ又は５' −ＣＵＧのＲＮＡ配列を
有する翻訳開始コドンを有し、５' −ＡＵＡ、５' −ＡＣＧ及び５' −ＣＵＧは
in vivoで機能することが示されている。従って、「翻訳開始コドン」及び「開
始コドン」という用語は、それぞれの場合で開始のアミノ酸が通常メチオニン（
真核生物）又はホルミルメチオニン（原核生物）であっても、多くのコドン配列
を含み得る。当技術分野では、真核生物と原核生物の遺伝子が２種又はそれ以上
の代替可能な開始コドンを有し、特定の細胞型又は組織、又は特定の条件セット
のもとでそのうちの１つが翻訳開始に選択的に利用され得ることも知られている
。本発明の文脈では、「開始コドン」及び「翻訳開始コドン」は、そのようなコ
ドンの配列に拘らず、アポトーシス−１の細胞性阻害物質をコードする遺伝子か
ら転写されるｍＲＮＡ分子の翻訳を in vivoで開始させるのに使用されるコドン
を意味する。

【０００９】当技術分野では、遺伝子の翻訳終止コドン（又は「停止コドン」）が、３種の
配列、即ち５' −ＵＡＡ、５' −ＵＡＧ及び５' −ＴＧＡ（対応するＤＮＡ配列
は、それぞれ５' −ＴＡＡ、５' −ＴＡＧ及び５' −ＴＧＡである）のうち１つ
を有し得ることも知られている。「開始コドン領域」及び「翻訳開始コドン領域
」という用語は、翻訳開始コドンから両方向（即ち、５' 又は３' ）にある約２
５〜約５０個の連続したヌクレオチドを含むようなｍＲＮＡ又は遺伝子の部分を
意味する。同様に、「停止コドン領域」及び「翻訳終止コドン領域」という用語
は、翻訳終止コドンから両方向（即ち、５' 又は３' ）にある約２５〜約５０個
の連続したヌクレオチドを含むようなｍＲＮＡ又は遺伝子の部分を意味する。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）又は「コーディング領域」は、当技
術分野では翻訳開始コドンと翻訳終止コドンの間に存在する領域を意味すること
が知られているが、有効に標的にし得る領域でもある。他の標的領域には、５'
非翻訳領域（５' −ＵＴＲ）［当技術分野では、翻訳開始コドンから５' 方向に
あるｍＲＮＡの部分であり、従って、５' キャップ部位とｍＲＮＡ翻訳開始コド
ンとの間にあるヌクレオチド、又は遺伝子上の対応するヌクレオチドを包含する
部分を意味する］、及び３' 非翻訳領域（３' −ＵＴＲ）［当技術分野では、翻
訳終止コドンから３' 方向にあるｍＲＮＡの部分であり、従って、ｍＲＮＡの翻
訳終止コドンと３' 末端との間にあるヌクレオチド、又は遺伝子上の対応するヌ
クレオチドを包含する部分を意味する］が含まれる。ｍＲＮＡの５' キャップ領
域は、ｍＲＮＡの５' 末端残基に５' −５' 三リン酸結合を介して結合したＮ７
メチル化グアノシン残基を含む。ｍＲＮＡの５' キャップ領域は、この５' キャ
ップ構造そのものだけでなく、このキャップに隣接した最初の５０個のヌクレオ
チドも包含すると考えられている。５' キャップ領域も好ましい標的領域になり
得る。

【００１０】真核生物のｍＲＮＡ転写物のなかには直接翻訳されるものもあるが、多くは、
翻訳される前に転写物から切出される、「イントロン」として知られる１つ又は
それ以上の領域を含有する。残りの（従って、翻訳される）領域は「エクソン」
として知られ、一緒にスプライスされて連続したｍＲＮＡ配列を形成する。ｍＲ
ＮＡのスプライス部位、すなわちイントロン−エクソン連結部も好ましい標的領
域となり得るので、異常なスプライシングが疾患に関連している可能性があった
り、特定のｍＲＮＡスプライス産物の過剰産生が疾患に関連している可能性があ
る状況では、特に有用である。種々の再配置や欠損によって生じる異常な融合連
結部もまた好ましい標的である。イントロンもまた、例えばＤＮＡ又はプレｍＲ
ＮＡを標的にしたアンチセンス化合物にとって有効であり、従って好ましい場合
があることも見出されている。

【００１１】１つ又はそれ以上の標的部位が同定されたなら、この標的に対して十分相補的
である、すなわち十分強くて十分な特異性をもってハイブリダイズして所望の効
果をもたらす、オリゴヌクレオチドが選択される。本発明の文脈では、「ハイブリダイゼーション」は、ワトソン−クリック、フ
ーグスティーン又は逆フーグスティーン型の水素結合であり得る、相補的なヌク
レオシド又はヌクレオチド塩基間の水素結合を意味する。例えば、アデニンとチ
ミンは、水素結合の形成を介して対合する相補的な核酸塩基である。本明細書で
使用されるように、「相補的」は、２つのヌクレオチド間の正確な対合能力を意
味する。例えば、オリゴヌクレオチドのある位置にあるヌクレオチドがＤＮＡ又
はＲＮＡ分子の同じ位置にあるヌクレオチドと水素結合し得る場合、このオリゴ
ヌクレオチドとＤＮＡ又はＲＮＡはその位置で互いに相補的であると考えられる
。オリゴヌクレオチドとＤＮＡ又はＲＮＡが互いに相補的であるのは、各分子内
の対応する位置の十分な数が互いに水素結合し得るヌクレオチドによって占めら
れているときである。従って、「特異的にハイブリダイズし得る」及び「相補的
」とは、オリゴヌクレオチドとＤＮＡ又はＲＮＡ標的との間に安定で特異的な結
合が起こるほど十分な程度の相補性又は正確な対合を明示するために使用される
用語である。当技術分野では、アンチセンス化合物の配列が特異的にハイブリダ
イズし得るのに、その標的核酸の配列に対して１００％相補的である必要はない
と理解されている。アンチセンス化合物が特異的にハイブリダイズし得るのは、
標的ＤＮＡ又はＲＮＡ分子に対するこの化合物の結合が標的ＤＮＡ又はＲＮＡの
正常機能に干渉して有用性の損失を引き起こすとき、及び特異的な結合が所望さ
れる条件、即ち in vivoアッセイ又は治療処置の場合や in vitro アッセイの場
合の生理学的条件、つまりそのようなアッセイが実施される条件下で、非標的配
列に対するアンチセンス化合物の非特異的な結合が回避されるのに十分な程度の
相補性があるときである。

【００１２】アンチセンス化合物は、研究試薬及び診断薬として通常使用される。例えば、
ごく強い特異性をもって遺伝子発現を阻害することができるアンチセンスオリゴ
ヌクレオチドは、特定遺伝子の機能を解明するために、当業者によってしばしば
使用される。アンチセンス化合物はまた、例えばある生物学的経路の様々な因子
の機能を区別するためにも使用される。従って、アンチセンスモジュレーション
は研究上の使用のために利用されている。アンチセンスの特異性及び感度はまた、当業者によって治療上の使用のために
利用されている。アンチセンスオリゴヌクレオチドは動物及びヒトの病態の治療
に治療用成分として利用されている。アンチセンスオリゴヌクレオチドはヒトに
対して安全かつ有効に投与され、数多くの臨床試験が現在進行している。従って
、オリゴヌクレオチドは、細胞、組織及び動物、特にヒトの治療の治療様式に有
用であるように組立て得る有用な治療モダリティーであり得ることが確立されて
いる。

【００１３】本発明の文脈では、「オリゴヌクレオチド」という用語は、リボ核酸（ＲＮＡ
）又はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はそれらの模擬体のオリゴマー又はポリマ
ーを意味する。この用語には、天然に存在する核酸塩基、糖及びヌクレオシド間
（骨格）の共有結合からなるオリゴヌクレオチド、並びに同様に機能する天然に
存在しない部分を有するオリゴヌクレオチドも含まれる。そのような修飾された
か又は置換されたオリゴヌクレオチドがネーティブな形態よりしばしば好ましい
のは、例えば、強められた細胞取込み、核酸標的に対する強められた親和性、及
びヌクレアーゼ存在下での高められた安定性のような、所望される特性のためで
ある。

【００１４】アンチセンスオリゴヌクレオチドがアンチセンス化合物の好ましい形態である
が、本発明には、以下に示すようなオリゴヌクレオチド模擬体を限定しないが包
含する、他のオリゴマーアンチセンス化合物も含まれる。本発明によるアンチセ
ンス化合物は、好ましくは約８〜約３０の核酸塩基を含む。特に好ましいのは、
約８〜約３０の核酸塩基（即ち、約８〜約３０の連結したヌクレオシド）を含ん
でなるアンチセンスオリゴヌクレオチドである。当技術分野で知られているよう
に、ヌクレオシドは塩基−糖結合物である。ヌクレオシドの塩基部分は、普通へ
テロ環式塩基である。そのようなへテロ環式塩基の最も一般的な２つのクラスは
プリンとピリミジンである。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合
したリン酸基をさらに包含するヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を包含
するヌクレオシドでは、糖の２' 、３' 又は５' ヒドロキシル部分のいずれかに
リン酸基が連結し得る。オリゴヌクレオチドを形成するときは、隣接するヌクレ
オシドがリン酸基を介して互いに連結し、直線状のポリマー化合物を形成する。
さらに、この直線状ポリマー構造の両端は結合して環状の構造体を形成し得るが
、一般には開いた直線状の構造体が好ましい。オリゴヌクレオチド構造の内部で
は、リン酸基がオリゴヌクレオチドのヌクレオシド間骨格を形成すると言われる
。ＲＮＡとＤＮＡの正常な連結又は骨格は、３' から５' へのホスホジエステル
連結である。

【００１５】本発明に有用な好ましいアンチセンス化合物の特定の例には、修飾された骨格
又は非天然のヌクレオシド間連結を含有するオリゴヌクレオチドが含まれる。本
明細書で規定されるように、修飾された骨格を有するオリゴヌクレオチドには、
骨格にリン原子を保持するもの、及び骨格にリン原子を有さないものが含まれる
。本明細書の目的からすれば、当技術分野で時々参照されるように、そのヌクレ
オシド間骨格にリン原子を有さない修飾されたオリゴヌクレオチドもオリゴヌク
レオシドであると考えられる。

【００１６】好ましい修飾されたオリゴヌクレオチド骨格には、例えば、通常の３' −５'
連結を有するホスホロチオエート、キラルなホスホロチオエート、ホスホロジチ
オエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３' −ア
ルキレンホスホネート及びキラルなホスホネートを包含するメチル及び他のアル
キルホスホネート、ホスフィネート、３' −アミノホスホロアミデート及びアミ
ノアルキルホスホロアミデートを包含するホスホロアミデート、チオノホスホロ
アミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル
及びボラノホスフェート、２' −５' 連結した上記の類似体、及びヌクレオシド
単位の隣接対が３' −５' から５' −３' か又は２' −５' から５' −２' へ結
合している逆の極性を有する類似体が含まれる。様々な塩、混合塩、及び遊離酸
の形態も包含される。

【００１７】上記のリン含有連結の製造を教示する代表的な米国特許には、限定しないが、
米国特許第３，６８７，８０８号；第４，４６９，８６３号；第４，４７６，３
０１号；第５，０２３，２４３号；第５，１７７，１９６号；第５，１８８，８
９７号；第５，２６４，４２３号；第５，２７６，０１９号；第５，２７８，３
０２号；第５，２８６，７１７号；第５，３２１，１３１号；第５，３９９，６
７６号；第５，４０５，９３９号；第５，４５３，４９６号；第５，４５５，２
３３号；第５，４６６，６７７号；第５，４７６，９２５号；第５，５１９，１
２６号；第５，５３６，８２１号；第５，５４１，３０６号；第５，５５０，１
１１号；第５，５６３，２５３号；第５，５７１，７９９号；第５，５８７，３
６１号及び第５，６２５，０５０号が含まれ、このうちあるものは本出願ととも
に所有され、これらはいずれも参照により本明細書に組込まれている。

【００１８】リン原子を包含しない好ましい修飾されたオリゴヌクレオチド骨格は、短鎖ア
ルキル又はシクロアルキルのヌクレオシド間連結、ヘテロ原子とアルキル又はシ
クロアルキルの混合したヌクレオシド間連結、又は１つ又はそれ以上の短鎖ヘテ
ロ原子又はヘテロ環式ヌクレオシド間連結により形成される骨格を有する。これ
らには、モルホリノ連結（ヌクレオシドの糖部分から一部形成される）を有する
もの；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシド及びスルホンの骨格；ホルム
アセチル及びチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチル及びチオホルム
アセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；メチレンイミノ及びメ
チレンヒドラジノ骨格；スルホネート及びスルホンアミド骨格；アミド骨格；及
びＮ、Ｏ、Ｓ及びＣＨ₂成分の混合部分を有する他の骨格が含まれる。

【００１９】上記オリゴヌクレオチドの製造を教示する代表的な米国特許には、限定しない
が、米国特許第５，０３４，５０６号；第５，１６６，３１５号；第５，１８５
，４４４号；第５，２１４，１３４号；第５，２１６，１４１号；第５，２３５
，０３３号；第５，２６４，５６２号；第５，２６４，５６４号；第５，４０５
，９３８号；第５，４３４，２５７号；第５，４６６，６７７号；第５，４７０
，９６７号；第５，４８９，６７７号；第５，５４１，３０７号；第５，５６１
，２２５号；第５，５９６，０８６号；第５，６０２，２４０号；第５，６１０
，２８９号；第５，６０２，２４０号；第５，６０８，０４６号；第５，６１０
，２８９号；第５，６１８，７０４号；第５，６２３，０７０号；第５，６６３
，３１２号；第５，６３３，３６０号；第５，６７７，４３７号及び第５，６７
７，４３９号が含まれ、このうちあるものは本出願とともに所有され、これらは
いずれも参照により本明細書に組込まれている。

【００２０】他の好ましいオリゴヌクレオチド模擬体では、糖とヌクレオシド間連結の両方
、即ちヌクレオシド単位の骨格が新規な基で置換されている。この塩基単位は、
適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持されている。そ
のようなオリゴマー化合物の１つは、優れたハイブリダイゼーション特性を有す
ることが示されているオリゴヌクレオチド模擬体であり、ペプチド核酸（ＰＮＡ
）と言われる。ＰＮＡ化合物では、オリゴヌクレオチドの糖骨格がアミド含有骨
格、特にアミノエチルグリシン骨格に置換されている。核酸塩基は保持され、骨
格のアミド部分のアザ窒素原子に直接的又は間接的に結合している。ＰＮＡ化合
物の製造を教示する代表的な米国特許には、限定しないが米国特許第５，５３９
，０８２号；第５，７１４，３３１号；及び第５，７１９，２６２号が含まれ、
これらはいずれも参照により本明細書に組込まれている。ＰＮＡ化合物に関する
別の教示は、Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497に見出し得る。

【００２１】本発明の最も好ましい態様は、ホスホロチオエート骨格を有するオリゴヌクレ
オチド、及びヘテロ原子骨格を有するヌクレオシドであり、特に、上記に参照し
た米国特許第５，４８９，６７７号の−ＣＨ₂−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ₂−、−ＣＨ₂ −Ｎ（ＣＨ₃)−Ｏ−ＣＨ₂−［メチレン（メチルイミノ）又はＭＭＩ骨格として
知られる］、−ＣＨ₂−Ｏ−Ｎ（ＣＨ₃)−ＣＨ₂−、−ＣＨ₂−Ｎ（ＣＨ₃)−Ｎ
（ＣＨ₃)−ＣＨ₂−及び−Ｏ−Ｎ（ＣＨ₃)−ＣＨ₂−ＣＨ₂−［ここでネーティ
ブなホスホジエステル骨格は、−Ｏ−Ｐ−Ｏ−ＣＨ₂−として表される］、及び
上記に参照した米国特許第５，６０２，２４０号のアミド骨格を有するものであ
る。また好ましいのは、上記参照の米国特許第５，０３４，５０６号のモルホリ
ノ骨格構造を有するオリゴヌクレオチドである。

【００２２】修飾されたオリゴヌクレオチドは、１つ又はそれ以上の置換された糖部分を含
有する場合もある。好ましいオリゴヌクレオチドは、２' 位に以下の１つを含む
：ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−又はＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−又はＮ−アルケニル；Ｏ
−、Ｓ−又はＮ−アルキニル；又はＯ−アルキル−Ｏ−アルキル（ここで、アル
キル、アルケニル及びアルキニルは、置換されているか又は置換されていないＣ ₁ 〜Ｃ₁₀アルキル、Ｃ₂〜Ｃ₁₀アルケニル及びアルキニルであり得る）。特に好
ましいのは、Ｏ［（ＣＨ₂)_nＯ］_mＣＨ₃、Ｏ（ＣＨ₂)_nＯＣＨ₃、Ｏ（ＣＨ₂) _n ＮＨ₂、Ｏ（ＣＨ₂)_nＣＨ₃、Ｏ（ＣＨ₂)_nＯＮＨ₂及びＯ（ＣＨ₂)_nＯＮ［
（ＣＨ₂)_nＣＨ₃］₂である（ここでｎ及びｍは１〜約１０である）。他の好ま
しいオリゴヌクレオチドは、以下の１つを２' 位に含む：Ｃ₁〜Ｃ₁₀低級アルキ
ル、置換された低級アルキル、アルカリール、アラルキル、Ｏ−アルカリール又
はＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ₃、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ₃、ＯＣ
Ｆ₃、ＳＯＣＨ₃、ＳＯ₂ＣＨ₃、ＯＮＯ₂、ＮＯ₂、Ｎ₃、ＮＨ₂、ヘテロシ
クロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキ
ルアミノ、置換されたシリル、ＲＮＡ開裂基、レポーター基、インターカレータ
ー、オリゴヌクレオチドの薬力学特性を改善する基、オリゴヌクレオチドの薬物
動態特性を改善する基、及び同様の特性を有する他の置換基。好ましい修飾には
、２' −メトキシエトキシ（２' −Ｏ−ＣＨ₂ＣＨ₂ＯＣＨ₃、２' −Ｏ−（２
−メトキシエチル）又は２' −ＭＯＥとしても知られる）（Martin et al., Hel
v. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504）、即ちアルコキシアルコキシ基が含まれる
。さらに好ましい修飾には、以下の実施例で説明されるような２' −ジメチルア
ミノオキシエトキシ、即ち２' −ＤＭＡＯＥとしても知られるＯ（ＣＨ₂)₂ＯＮ
（ＣＨ₃)₂基が含まれる。

【００２３】他の好ましい修飾には、２' −メトキシ（２' −Ｏ−ＣＨ₃)、２' −アミノプ
ロポキシ（２' −ＯＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂ＮＨ₂) 及び２' −フルオロ（２' −Ｆ
）が含まれる。同様の修飾は、オリゴヌクレオチドの他の部位、特に３' 末端ヌ
クレオチド上又は２' −５' 連結オリゴヌクレオチド内の糖の３' 位、及び５'
末端ヌクレオチドの５' 位でなし得る。オリゴヌクレオチドはまた、ペントフラ
ノシル糖の代わりにシクロブチル部分のような糖模擬体を有し得る。そのような
修飾された糖構造の製造を教示する代表的な米国特許には、限定しないが、米国
特許第４，９８１，９５７号；第５，１１８，８００号；第５，３１９，０８０
号；第５，３５９，０４４号；第５，３９３，８７８号；第５，４４６，１３７
号；第５，４６６，７８６号；第５，５１４，７８５号；第５，５１９，１３４
号；第５，５６７，８１１号；第５，５７６，４２７号；第５，５９１，７２２
号；第５，５９７，９０９号；第５，６１０，３００号；第５，６２７，０５３
号；第５，６３９，８７３号；第５，６４６，２６５号；第５，６５８，８７３
号；第５，６７０，６３３号及び第５，７００，９２０号が含まれ、このうちあ
るものは本出願とともに所有され、これらはいずれもそのまま参照により本明細
書に組込まれている。

【００２４】オリゴヌクレオチドはまた、核酸塩基（当技術分野では単に「塩基」と言われ
ることが多い）の修飾物又は置換物を包含し得る。本明細書で使用されるように
、「未修飾の」又は「天然の」核酸塩基には、プリン塩基のアデニン（Ａ）及び
グアニン（Ｇ）とピリミジン塩基のチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル
（Ｕ）が含まれる。修飾された核酸塩基には、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−
Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミ
ノアデニン、アデニンとグアニンの６−メチル及び他のアルキル誘導体、アデニ
ンとグアニンの２−プロピル及び他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−
チオチミン及び２−チオシトシン、５−ハロウラシル及びシトシン、５−プロピ
ルウラシル及びシトシン、６−アゾウラシル、シトシン及びチミン、５−ウラシ
ル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオ
ール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル及び他の８位置換されたアデニン及
びグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチル及び他の５位
置換されたウラシル及びシトシン、７−メチルグアニン及び７−メチルアデニン
、８−アザグアニン及び８−アザアデニン、７−デアザグアニン及び７−デアザ
アデニン、及び３−デアザグアニン及び３−デアザアデニンのような他の合成及
び天然の核酸塩基が含まれる。さらなる核酸塩基には、米国特許第３，６８７，
８０８号に開示されるもの、The Concise Encyclopedia Of Polymer Science An
d Engineering, pages 858-859, Kroschwitz, J. I., ed. John Wiley & Sons,
1990に開示されるもの、Englisch et al., Angewandte Chemie, International
Edition, 1991, 30, 613に開示されるもの、及び Sanghvi, Y. S., Chapter 15,
Antisense Research and Applications, pages 289-302, Crooke, S. T. and L
ebleu, B., ed., CRC Press, 1993 に開示されるものが含まれる。これら核酸塩
基のあるものは本発明のオリゴマー化合物の結合親和性を増加させるのに特に有
用である。これらには、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル
及び５−プロピニルシトシンを包含する、５位置換ピリミジン、６−アザピリミ
ジン、及びＮ−２、Ｎ−６、Ｏ−６位置換プリンが含まれる。５−メチルシトシ
ンの置換は核酸二重鎖の安定性を０．６〜１．２℃高めることが示され（Sanghv
i, Y. S., Crooke, S. T., and Lebleu, B. eds., Antisense Research and App
lications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278 ）、特に２' −Ｏ−メ
トキシエチル糖修飾と結びつくと、目下のところでは好ましい塩基置換である。

【００２５】上記の注目すべき修飾された核酸塩基、並びに他の修飾された核酸塩基のいく
つかの製造を教示する代表的な米国特許には、限定しないが、上記に注目した米
国特許第３，６８７，８０８号、並びに米国特許第４，８４５，２０５号；第５
，１３０，３０２号；第５，１３４，０６６号；第５，１７５，２７３号；第５
，３６７，０６６号；第５，４３２，２７２号；第５，４５７，１８７号；第５
，４５９，２５５号；第５，４８４，９０８号；第５，５０２，１７７号；第５
，５２５，７１１号；第５，５５２，５４０号；第５，５８７，４６９号；第５
，５９４，１２１号；第５，５９６，０９１号；第５，６１４，６１７号；及び
第５，６８１，９４１号（このうちあるものは本出願とともに所有され、これら
はいずれも参照により本明細書に組込まれている）、及び米国特許第５，７５０
，６９２号（これは本出願とともに所有され、やはり参照により本明細書に組込
まれている）が含まれる。

【００２６】本発明のオリゴヌクレオチドの他の修飾には、オリゴヌクレオチドの活性、細
胞内分布又は細胞内取込みを増強する１つ又はそれ以上の部分又はコンジュゲー
トをオリゴヌクレオチドへ化学的に連結することが含まれる。そのような部分に
は、限定しないが、コレステロール部分（Letsinger et al., Proc. Natl. Acad
. Sci., USA, 1989, 86, 6553-6556）のような脂質部分、コール酸（Manoharan
et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1994, 4, 1053-1060）、チオエーテル、例
えばヘキシル−Ｓ−トリチルチオール（Manoharan et al., Ann. N. Y. Acad. S
ci., 1992, 660, 306-309 ； Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 19
93, 3, 2765-2770）、チオコレステロール（Oberhauser et al., Nucl. Acids R
es., 1992, 20, 533-538）、脂肪族の鎖、例えばドデカンジオール又はウンデシ
ル残基（Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10, 1111-1118 ；Kabanov
et al., FEBS Lett., 1990, 259, 327-330; Svinarchuk et al., Biochimie, 19
93, 75, 49-54 ）、リン脂質、例えばジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロール
又は１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホン酸ト
リエチルアンモニウム（Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 365
1-3654；Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777-3783）、ポリアミン
又はポリエチレングリコール鎖（Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotide
s, 1995, 14, 969-973）、又はアダマンタン酢酸（Manoharan et al., Tetrahed
ron Lett., 1995, 36, 3651-3654）、パルミチル部分（Mishra et al., Biochim
. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229-237）、又はオクタデシルアミン又はヘキシ
ルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分（Crooke et al., J. Pharma
col. Exp. Ther., 1996, 277, 923-937 ）が含まれる。

【００２７】上記のオリゴヌクレオチドコンジュゲートの製造を教示する代表的な米国特許
には、限定しないが、米国特許第４，８２８，９７９号；第４，９４８，８８２
号；第５，２１８，１０５号；第５，５２５，４６５号；第５，５４１，３１３
号；第５，５４５，７３０号；第５，５５２，５３８号；第５，５７８，７１７
号；第５，５８０，７３１号；第５，５９１，５８４号；第５，１０９，１２４
号；第５，１１８，８０２号；第５，１３８，０４５号；第５，４１４，０７７
号；第５，４８６，６０３号；第５，５１２，４３９号；第５，５７８，７１８
号；第５，６０８，０４６号；第４，５８７，０４４号；第４，６０５，７３５
号；第４，６６７，０２５号；第４，７６２，７７９号；第４，７８９，７３７
号；第４，８２４，９４１号；第４，８３５，２６３号；第４，８７６，３３５
号；第４，９０４，５８２号；第４，９５８，０１３号；第５，０８２，８３０
号；第５，１１２，９６３号；第５，２１４，１３６号；第５，０８２，８３０
号；第５，１１２，９６３号；第５，２１４，１３６号；第５，２４５，０２２
号；第５，２５４，４６９号；第５，２５８，５０６号；第５，２６２，５３６
号；第５，２７２，２５０号；第５，２９２，８７３号；第５，３１７，０９８
号；第５，３７１，２４１号；第５，３９１，７２３号；第５，４１６，２０３
号；第５，４５１，４６３号；第５，５１０，４７５号；第５，５１２，６６７
号；第５，５１４，７８５号；第５，５６５，５５２号；第５，５６７，８１０
号；第５，５７４，１４２号；第５，５８５，４８１号；第５，５８７，３７１
号；第５，５９５，７２６号；第５，５９７，６９６号；第５，５９９，９２３
号；第５，５９９，９２８号及び第５，６８８，９４１号が含まれ、このうちあ
るものは本出願とともに所有され、これらはいずれも参照により本明細書に組込
まれている。

【００２８】ある特定化合物のすべての位置が一様に修飾される必要はなく、実のところ、
ある単一化合物又はあるオリゴヌクレオチド内の単一ヌクレオシドににさえ１つ
又はそれ以上の上記修飾物がとりこまれ得る。本発明には、キメラ化合物である
アンチセンス化合物も含まれる。「キメラ」アンチセンス化合物又は「キメラ」
は、本発明の文脈において、それぞれ少なくとも１つのモノマー単位、即ちヌク
レオチド（オリゴヌクレオチド化合物の場合）からなる、２種又はそれ以上の化
学的に異なる領域を含有するアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドであ
る。典型的には、これらオリゴヌクレオチドは、増加したヌクレアーゼ分解抵抗
性、増加した細胞内取込み、及び／又は標的核酸に対する増加した結合親和性を
オリゴヌクレオチドに与えるようにオリゴヌクレオチドが修飾されている少なく
とも１つの領域を含有する。オリゴヌクレオチドの追加の領域は、ＲＮＡ：ＤＮ
Ａ又はＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを開裂し得る酵素の基質として役立ち得る。
例を挙げると、ＲＮアーゼＨはＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ鎖を開裂する細胞
エンドヌクレアーゼであり、従ってＲＮアーゼＨの活性化はＲＮＡ標的の開裂を
もたらし、それにより遺伝子発現のオリゴヌクレオチド阻害の効率を多いに高め
る。それ故、キメラオリゴヌクレオチドを使用するときにより短いオリゴヌクレ
オチドを用いれば、ホスホロチオエート・デオキシオリゴヌクレオチドが同一の
標的領域にハイブリダイズするときと同等な結果がしばしば得られる。ＲＮＡ標
的の開裂はゲル電気泳動によって、必要ならば、当技術分野で知られている関連
した核酸ハイブリダイゼーション技術と組合せて、型通りに検出し得る。

【００２９】本発明のキメラアンチセンス化合物は、２種又はそれ以上のオリゴヌクレオチ
ド、修飾されたオリゴヌクレオチド、上記のようなオリゴヌクレオシド及び／又
はオリゴヌクレオチド模擬体の複合した構造体として形成され得る。そのような
化合物はまた当技術分野ではハイブリッド又はギャップマーと言われている。そ
のようなハイブリッド構造体の製造を教示する代表的な米国特許には、限定しな
いが、米国特許第５，０１３，８３０号；第５，１４９，７９７号；第５，２２
０，００７号；第５，２５６，７７５号；第５，３６６，８７８号；第５，４０
３，７１１号；第５，４９１，１３３号；第５，５６５，３５０号；第５，６２
３，０６５号；第５，６５２，３５５号；第５，６５２，３５６号及び第５，７
００，９２２号が含まれ、このうちあるものは本出願とともに所有され、これら
はいずれもそのまま参照により本明細書に組込まれている。

【００３０】本発明により使用されるアンチセンス化合物は、固相合成の既知技術を介して
簡便かつ型通りに製造され得る。そのような合成のための装置は、例えばＡｐｐ
ｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（フォスターシティ、ＣＡ）を含む、ベンダー
数社により販売されている。当技術分野で知られているそのような合成に代わる
他の手段も、追加的に又は代替的に利用し得る。ホスホロチオエート及びアルキ
ル化誘導体のようなオリゴヌクレオチドを製造する同様の技術を使用することも
知られている。

【００３１】本発明のアンチセンス化合物は in vitro で合成され、生物学的起源のアンチ
センス組成物、又はアンチセンス分子の in vivo合成を指令するように設計され
た遺伝子ベクター構築体も包含しない。本発明の化合物はまた、取込み、分布及び／又は吸収を促進するために、例え
ばリポソーム、受容体標的分子、経口、直腸、局所又は他の投与製剤といった他
の分子、分子構造体又は化合物の混合物と混合、被包、コンジュゲートさせるか
、他のやり方で結合させてよい。そのような取込み、分布及び／又は吸収を促進
する製剤の製造を教示する代表的な米国特許には、限定しないが、米国特許第５
，１０８，９２１号；第５，３５４，８４４号；第５，４１６，０１６号；第５
，４５９，１２７号；第５，５２１，２９１号；第５，５４３，１５８号；第５
，５４７，９３２号；第５，５８３，０２０号；第５，５９１，７２１号；第４
，４２６，３３０号；第４，５３４，８９９号；第５，０１３，５５６号；第５
，１０８，９２１号；第５，２１３，８０４号；第５，２２７，１７０号；第５
，２６４，２２１号；第５，３５６，６３３号；第５，３９５，６１９号；第５
，４１６，０１６号；第５，４１７，９７８号；第５，４６２，８５４号；第５
，４６９，８５４号；第５，５１２，２９５号；第５，５２７，５２８号；第５
，５３４，２５９号；第５，５４３，１５２号；第５，５５６，９４８号；第５
，５８０，５７５号及び第５，５９５，７５６号が含まれ、これらはいずれも参
照により本明細書に組込まれている。

【００３２】本発明のアンチセンス化合物には、ヒトを包含する動物への投与時に、生物学
的に活性な代謝物又はその残基を（直接的又は間接的に）提供し得る、製剤的に
許容される塩、エステル又はそのようなエステルの塩、又は他の化合物が含まれ
る。従って、例えば、本発明の開示は、本発明の化合物のプロドラッグ及び製剤
的に許容される塩、そのようなプロドラッグの製剤的に許容される塩、及び他の
生物学的同等物へも引用される。「プロドラッグ」という用語は、生体又はその細胞の内部で、内因性の酵素や
他の化学品及び／又は条件の作用により活性型（つまり、薬物）へ変換される不
活性型で製造される治療薬を示す。特に、本発明のオリゴヌクレオチドのプロド
ラッグバージョンは、Gosselin et al．へのＷＯ９３／２４５１０号（１９９３
年１２月９日公開）又は Imbach et al ．へのＷＯ９４／２６７６４号に開示さ
れた方法により、ＳＡＴＥ［（Ｓ−アセチル−２−チオエチル）リン酸塩］誘導
体として製造される。「製剤的に許容される塩」という用語は、本発明の化合物の生理学的及び製剤
的に許容される塩、即ち、親化合物の所望される生物学的活性を保持し、所望さ
れない毒性効果をそれへ与えない塩を意味する。

【００３３】製剤的に許容される塩基付加塩は、アルカリ及びアルカリ土類金属又は有機ア
ミンのような金属又はアミンとともに形成される。カチオンとして使用される金
属の例は、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム等である。好適な
アミンの例は、Ｎ，Ｎ' −ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コ
リン、ジエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、エチレンジアミン、Ｎ−
メチルグルカミン及びプロカインである（例えば、Berge et al., "Pharmaceuti
cal Salts," J. of Pharma Sci. 1977, 66: 1-19を参照のこと）。前記酸性化合
物の塩基付加塩は、従来のやり方で塩を産生するために、十分量の所望される塩
基にフリーの酸型を接触させることによって製造される。フリーの酸型は、従来
のやり方でこの塩型を酸に接触させ、フリーの酸を単離することによって再生し
得る。フリーの酸型は、極性溶媒における溶解度といったある種の物理的性質に
おいてそれぞれの塩型とやや異なるが、他の点では、本発明の目的にとって、そ
の塩はそれぞれのフリー酸と同等である。本明細書で使用されるように、「医薬
付加塩」には、本発明の組成物を構成する成分の酸型の製剤的に許容される塩が
含まれる。これには上記アミンの有機又は無機の酸塩が含まれる。好ましい酸塩
は、塩酸塩、酢酸塩、サリチル酸塩、硝酸塩及びリン酸塩である。他の好適な製
剤的に許容される塩は当業者によく知られていて、例えば塩酸、臭酸、硫酸又は
リン酸といった無機酸；例えば酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、コハク酸、
マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、メチルマレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、
酒石酸、乳酸、シュウ酸、グルコン酸、グルカル酸、グルクロン酸、クエン酸、
安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、サリチル酸、４−アミノサリチル酸、２−フ
ェノキシ安息香酸、２−アセトキシ安息香酸、エムボン酸、ニコチン酸又はイソ
ニコチン酸といった有機カルボン酸、スルホン酸、スルホ又はホスホ酸又はＮ−
置換スルファミン酸；及び、例えばグルタミン酸又はアスパラギン酸といった天
然のタンパク質合成に関わる２０種のα−アミノ酸のようなアミノ酸；さらに、
フェニル酢酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、２−ヒドロキシエタンス
ルホン酸、エタン−１，２−ジスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、４−メチルベ
ンゼンスルホン酸、ナフタレン−２−スルホン酸、ナフタレン−１，５−ジスル
ホン酸、２−又は３−ホスホグリセリン酸塩、グルコース−６−リン酸塩、Ｎ−
シクロヘキシルスルファミン酸（シクラメートの形成とともに）；又はアスコル
ビン酸のような他の酸有機化合物といった、多種多様な無機酸及び有機酸の塩基
性塩を包含する。製剤的に許容される化合物の塩はまた、製剤的に許容されるカ
チオンとともに形成され得る。製剤的に許容される好適なカチオンは当業者によ
く知られていて、アルカリ、アルカリ土類、アンモニウム及び４級アンモニウム
のカチオンを包含する。炭酸塩又は炭酸水素塩も可能である。

【００３４】オリゴヌクレオチドについて製剤的に許容される好ましい塩の例には、限定し
ないが、（ａ）ナトリウム、カリウム、アンモニウム、マグネシウム、カルシウ
ム、スペルミンやスペルミジンのようなポリアミン等のようなカチオンとともに
形成される塩；（ｂ）無機酸、例えば塩酸、臭酸、硫酸、リン酸、硝酸等ととも
に形成される酸付加塩；（ｃ）例えば酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、マレ
イン酸、フマル酸、グルコン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香
酸、タンニン酸、パルミチン酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンス
ルホン酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ナフタレンジスルホン
酸、ポリガラクツロン酸等のような有機酸とともに形成される塩；及び（ｄ）塩
素、臭素及びヨウ素のような元素アニオンから形成される塩が含まれる。

【００３５】本発明のアンチセンス化合物は、診断薬、治療薬、予防法、及び研究試薬やキ
ットとして利用し得る。治療薬について言えば、アポトーシス−１の細胞性阻害
物質の発現をモジュレートすることにより治療し得る疾患又は障害を有する疑い
のある動物、好ましくはヒトが、本発明によりアンチセンス化合物を投与するこ
とによって治療される。本発明の化合物は、有効量のアンチセンス化合物を好適
な製剤的に許容される希釈剤又は担体へ加えることによって医薬組成物の形で利
用し得る。本発明のアンチセンス化合物の使用及び方法は、例えば感染、炎症又
は腫瘍形成を予防するか又は遅延するといったように、予防的にも有用であり得
る。

【００３６】本発明のアンチセンス化合物が研究や診断に有用であるのは、これら化合物が
アポトーシス−１の細胞性阻害物質をコードする核酸にハイブリダイズすること
を利用して、サンドイッチ法や他のアッセイを容易に構築することを可能にする
からである。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドとアポトーシス−１の細
胞性阻害物質をコードする核酸とのハイブリダイゼーションは当技術分野で知ら
れている手段により検出し得る。そのような手段には、酵素のオリゴヌクレオチ
ドへのコンジュゲーション、オリゴヌクレオチドの放射標識化、又は他の好適な
検出手段が含まれる場合がある。そのような検出手段を用いてサンプル中のアポ
トーシス−１の細胞性阻害物質のレベルを検出するキットも製造し得る。

【００３７】本発明には、本発明のアンチセンス化合物を包含する医薬組成物及び製剤も含
まれる。本発明の医薬組成物は、局所又は全身治療のどちらが所望されるのかと
いうことや処置される部位に依存して、数多くの方法で投与され得る。投与は、
局所投与（眼への投与、膣及び直腸デリバリーを含む粘膜への投与）、肺への投
与（ネブライザーによることを含む、粉末又はエアゾールの吸入又は通気による
）、気管内、鼻腔内、表皮内及び経皮、経口又は腸管外であり得る。腸管外投与
には、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内又は筋肉内注射又は注入、又は頭蓋内、例
えば鞘内又は脳室内投与が含まれる。少なくとも１つの２' −Ｏ−メトキシエチ
ル修飾を有するオリゴヌクレオチドは経口投与に特に有用であると考えられてい
る。

【００３８】局所投与用の医薬組成物及び製剤には、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリ
ーム、ゲル、ドロップ、坐剤、スプレー、液剤及び粉末が含まれ得る。従来の製
剤用担体、水性の粉末又は油状の基剤、濃化剤等が必要であるか又は所望され得
る。被覆されたコンドーム、グラブなどもまた有用であり得る。経口投与用の組成物及び製剤には、粉末又は顆粒剤、水又は非水性媒体に溶け
た懸濁液又は溶液、カプセル剤、小袋又は錠剤が含まれる。濃化剤、芳香剤、希
釈剤、乳化剤、分散補助剤又は結合剤が所望される場合もある。腸管外、鞘内又は脳室内投与用の組成物及び製剤には、緩衝剤、希釈剤、及び
限定しないが、浸透エンハンサー、担体化合物及び他の製剤的に許容される担体
又は賦形剤といった他の好適な添加物も含有し得る無菌の水溶液が含まれ得る。

【００３９】本発明の医薬組成物には、限定しないが、溶液、乳剤、及びリポソーム含有製
剤が含まれる。これら組成物は、限定しないが、前形成した液体、自己乳化性の
固体、及び自己乳化性の半固体を包含する多種多様な成分から産生され得る。本発明の医薬製剤は、簡便にも単位剤形で提示され得るが、製薬業界でよく知
られた従来技術により製造し得る。そのような技術には、医薬用の担体又は賦形
剤と有効成分を複合する工程が含まれる。一般に、この製剤は、液状担体か又は
微細化した固形担体、又はその両方と均一かつ緊密に有効成分を複合すること、
及び、必要ならばその生成物を成型することによって製造される。

【００４０】本発明の組成物は、限定しないが、錠剤、カプセル、液状シロップ、軟性ゲル
、坐剤及び浣腸剤のような多くの可能な剤形のいずれにも製剤化し得る。本発明
の組成物はまた、水性、非水性又は混合媒体の懸濁液としても製剤化し得る。水
性懸濁液は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール及
び／又はデキストランを包含する、懸濁液の粘度を高める物質をさらに含有し得
る。懸濁液はまた安定化剤を含有してよい。本発明の１つの態様では、医薬組成物はフォーム（泡沫）として製剤化され、
使用し得る。医薬フォームには、限定しないが、乳剤、ミクロ乳剤、クリーム、
ゼリー及びリポソームのような製剤が含まれる。上記の諸製剤は性質において基
本的に似通っているが、最終産物の成分及びコンシステンシーにおいて異なる。
そのような組成物及び製剤の製造については製薬及び製剤技術分野の当業者に概
ね知られていて、本発明の組成物の製剤化に適用し得る。

【００４１】乳剤本発明の組成物は乳剤として製造及び製剤化し得る。乳剤は、典型的には、１
つの液体がもう１つの液体に、直径０．１μｍを通常越える液滴の形態で分散し
ている異種成分系である（Idson, Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, R
ieger and Banker (Eds.),1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N. Y., volu
me 1, p. 199; Rosoff, Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and
Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N. Y., volume 1, p.
245; Block, Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (
Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N. Y., volume 2, p. 335; Hig
uchi et al., Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., E
aston, PA, 1985, p. 301 ）。乳剤は、緊密に混合して互いに分散している２種
の混合し得ない液相からなる二相系であることが多い。一般に、乳剤は油中水型
（ｗ／ｏ）又は水中油型（ｏ／ｗ）のいずれかであり得る。水相が細分されて多
量の油相の中へ微小の液滴として分散している場合、生成した組成物は油中水型
（ｗ／ｏ）乳剤と呼ばれる。他に、油相が細分されて多量の水相の中へ微小の液
滴として分散している場合、生成した組成物は水中油型（ｗ／ｏ）乳剤と呼ばれ
る。乳剤は、分散相及び有効成分に加えて追加の成分を含有し得るが、これは水
相、油相のいずれかに溶けているか、又はそれ自身が分離した相として存在し得
る。乳化剤、安定化剤、色素、及び抗酸化剤のような医薬用賦形剤も、必要に応
じ、乳剤中に存在し得る。医薬乳剤はまた、例えば、油中水中油型（ｏ／ｗ／ｏ
）及び水中油中水型（ｗ／ｏ／ｗ）乳剤の場合のように、２つ以上の相からなる
多相乳剤である場合がある。そのような複合製剤は、単純な二相乳剤が提供しな
いある種の利点をしばしば提供する。ｏ／ｗ乳剤の各油滴が小さい水滴を包む多
相乳剤がｗ／ｏ／ｗ乳剤を構成する。同様に、油性の連続層の中で安定化した水
球に油滴が包まれている系がｏ／ｗ／ｏ乳剤を提供する。

【００４２】乳剤は熱力学的安定性によりほとんど、又はまったく特徴づけられない。よく
あるように、乳剤の分散相又は不連続相は外部相又は連続相へ十分分散し、乳化
剤の手段又は製剤の粘度によりこの形態で維持される。乳剤の諸相のいずれかは
、乳剤形式の軟膏基材及びクリームの場合のように、半固体又は固体であり得る
。乳剤を安定化させる他の手段には、乳剤のいずれかの相へ取込まれ得る乳化剤
の使用が含まれる。乳化剤は４種のカテゴリーへ概ね分類し得る：合成界面活性
剤、天然に存在する乳化剤、吸収基剤、及び微分散固形物である（Idson, Pharm
aceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marce
l Dekker, Inc., New York, N. Y., volume 1, p. 199 ）。

【００４３】表面活性剤としても知られる合成界面活性剤は、乳剤の製剤化に広汎に応用さ
れていて、文献に解説されている（Rieger, Pharmaceutical Dosage Forms, Lie
berman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N
. Y., volume 1, p. 285; Idson, Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, R
ieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N. Y., vol
ume 1, p. 199 ）。界面活性剤は普通両親媒性であり、親水性と疎水性の部分を
含む。界面活性剤の疎水性に対する親水性の比率は親水性／親油性バランス（Ｈ
ＬＢ）と呼ばれ、種々の製剤を製造する場合に界面活性剤を分類して選択すると
きの貴重な手段となる。界面活性剤は、非イオン性、アニオン性、カチオン性及
び両性といった、親水基の性質に基づいて種々のクラスへ分類し得る（Rieger,
Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988,
Marcel Dekker, Inc., New York, N. Y., volume 1, p. 285）。

【００４４】乳剤製剤に使用される天然に存在する乳化剤には、ラノリン、ミツロウ、ホス
ファチド、レシチン及びアカシアが含まれる。吸収基剤は、無水ラノリン及び親
水ワセリンのように、水に浸るとｗ／ｏ乳剤を形成するが、その半固体コンシス
テンシーを保持するような親水性の特質を保有する。微分散固形物も、特に界面
活性剤との組み合わせや粘稠な調製物において、良好な乳化剤として使用されて
いる。これには、重金属水酸化物のような極性の無機固形物、ベントナイト、ア
ッタプルガイト（attapulgite ）、ヘクトライト、カオリン、モントモリロナイ
ト（montmorillonite ）、ケイ酸アルミニウムコロイド及びケイ酸マグネシウム
アルミニウムコロイドのような非膨潤性の粘土、色素、及び炭素又はトリステア
リン酸グリセリルのような非極性固形物が含まれる。

【００４５】乳剤製剤には多種多様な非乳化物質も含まれ、乳剤の諸特性に貢献する。これ
には、脂肪、オイル、ロウ、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪エステル、湿潤剤、
親水性コロイド、保存剤及び抗酸化剤が含まれる（Block, Pharmaceutical Dosa
ge Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc.
, New York, N. Y., volume 1, p. 335; Idson, Pharmaceutical Dosage Forms,
Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New Yor
k, N. Y., volume 1, p. 199）。

【００４６】親水性コロイド又はヒドロコロイドには、多糖類のような天然に存在するゴム
や合成ポリマー（例えば、アカシア、寒天、アルギン酸、カラゲナン、グアーゴ
ム、カラヤゴム及びトラガカント）、セルロース誘導体（例えば、カルボキシメ
チルセルロース及びカルボキシプロピルセルロース）、及び合成ポリマー（例え
ば、カルボマー、セルロースエーテル、及びカルボキシビニルポリマー）が含ま
れる。これらは水に分散するか又は膨潤してコロイド溶液を形成し、分散相の液
滴の周囲に強い界面膜を形成し、外相の粘度を増加させることによって乳剤を安
定化させる。

【００４７】乳剤はしばしば炭水化物、タンパク質、ステロール及びホスファチドといった
、微生物の増殖をすぐに助長し得る多くの成分を含有するので、上記製剤には保
存剤が取込まれることが多い。乳剤製剤に含まれる通常使用される保存剤には、
メチルパラベン、プロピルパラベン、４級アンモニウム塩、塩化ベンザルコニウ
ム、ｐ−ヒドロ安息香酸のエステル、及びホウ酸が含まれる。抗酸化剤もまた製
剤の劣化を防ぐためによく乳剤製剤へ加えられる。使用される抗酸化剤は、トコ
フェロール、没食子酸アルキル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒド
ロキシトルエンのような遊離基捕捉剤、又はアスコルビン酸及びメタ重亜硫酸ナ
トリウムのような還元剤、及びクエン酸、酒石酸及びレシチンのような抗酸化協
力剤であり得る。

【００４８】皮膚、経口及び非腸管の経路を介した乳剤製剤の適用、及びそれらの製造法に
ついては文献に解説されている（Idson, Pharmaceutical Dosage Forms, Lieber
man, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N. Y
., volume 1, p. 199 ）。経口デリバリー用の乳剤製剤は、製剤化の容易さ、吸
収からの効力及びバイオアベイラビリティの観点という理由のために非常に広く
使用されている（Rosoff, Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger a
nd Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N. Y., volume 1,
p. 245; Idson, Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker
(Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N. Y., volume 1, p. 199 ）
。鉱油ベースの緩下剤、脂溶性ビタミン製剤、及び高脂肪栄養調剤は、ｏ／ｗ乳
剤として普通に経口投与されている材料の１つである。

【００４９】本発明の１つの態様では、オリゴヌクレオチド及び核酸の組成物がミクロ乳剤
として製剤化される。ミクロ乳剤は、水、油及び両親媒性化合物からなる系とし
て定義し得るが、光学的に単等方性で熱力学的に安定な液状溶液である（Rosoff
, Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988
, Marcel Dekker, Inc., New York, N. Y., volume 1, p. 245）。典型的には、
ミクロ乳剤は、先ず界面活性剤の水溶液に油を分散させて、次いで十分量の第四
成分、一般的には中鎖長のアルコールを加えて透明な系を形成させることによっ
て製造される系である。従って、ミクロ乳剤は、界面活性分子の界面膜により安
定化されている、２種の混和しない液体の熱力学的に安定で、等方的に澄明な分
散液としても説明されている（Leung and Shah, Controlled Release of Drugs:
Polymers and Aggregate Systems, Rosoff, M., Ed., 1989, VCH Publishers,
New York, pages 185-215 ）。通常、ミクロ乳剤は、水、界面活性剤、界面活性
助剤（cosurfactant）及び電解質を包含する３〜５種の成分の組み合わせにより
製造される。ミクロ乳剤が油中水型（ｗ／ｏ）であるか又は水中油型（ｏ／ｗ）
のいずれであるかは、使用する油及び界面活性剤の性質と、界面活性分子の極性
ヘッド及び炭化水素テールの構造及び幾何学的パッキングに依存している（Scho
tt, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA
, 1985, p. 271）。

【００５０】相図を利用する現象的アプローチは深く研究され、ミクロ乳剤を製剤化する方
法に関する包括的な知識を当業者へもたらしてきた（Rosoff, Pharmaceutical D
osage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, I
nc., New York, N. Y., volume 1, p. 245; Block, Pharmaceutical Dosage For
ms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New
York, N. Y., volume 1, p. 335 ）。従来の乳剤と比べると、ミクロ乳剤は、自
発的に形成される熱力学的に安定な液滴の製剤のなかに水に不溶性の薬物を可溶
化するという利点を提供する。

【００５１】ミクロ乳剤の製造に使用される界面活性剤には、限定しないが、イオン性界面
活性剤、非イオン性界面活性剤、Ｂｒｉｊ９６、ポリオキシエチレンオレイル
エーテル、ポリグリセロール脂肪酸エステル、モノラウリン酸テトラグリセロー
ル（ＭＬ３１０）、モノオレイン酸テトラグリセロール（ＭＯ３１０）、モノオ
レイン酸ヘキサグリセロール（ＰＯ３１０）、ペンタオレイン酸ヘキサグリセロ
ール（ＰＯ５００）、モノカプリン酸デカグリセロール（ＭＣＡ７５０）、モノ
オレイン酸デカグリセロール（ＭＯ７５０）、セスキオレイン酸デカグリセロー
ル（ＳＯ７５０）、デカオレイン酸デカグリセロール（ＤＡＯ７５０）の単独又
は界面活性助剤との組合せが含まれる。通常はエタノール、１−プロパノール及
び１−ブタノールのような短鎖アルコールである界面活性助剤は、界面膜に浸透
し、界面活性分子のなかに生じた隙間のために無秩序な膜を創出することによっ
て界面の流動性を高めることに役立つ。しかしながら、ミクロ乳剤は界面活性助
剤を使用せずとも製造し得るし、アルコールフリーの自己乳化性ミクロ乳剤が当
技術分野で知られている。水相は、典型的には、水、薬物の水溶液、グリセロー
ル、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ポリグリセロール、プロピレングリコール、
及びエチレングリコールの誘導体であり得るが、それらに限定されない。油相に
は、限定しないが、Ｃａｐｔｅｘ３００、Ｃａｐｔｅｘ３５５、Ｃａｐｍｕ
ｌＭＣＭ、脂肪酸エステル、中鎖（Ｃ８−Ｃ１２）モノ、ジ、トリ−グリセリ
ド、ポリオキシエチル化グリセリル脂肪酸エステル、脂肪アルコール、ポリグリ
コール化グリセリド、飽和ポリグリコール化Ｃ８−Ｃ１０グリセリド、植物油及
びシリコーン油のような材料が含まれ得る。

【００５２】ミクロ乳剤は、薬物の可溶化と薬物吸収の増加という観点から特に興味深い。
脂質ベースのミクロ乳剤（ｏ／ｗとｗ／ｏの両方）は、ペプチドを含む薬物の経
口バイオアベイラビリティを増強すると提唱されている（Constantinides et al
., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385-1390; Ritschel, Meth. Find. E
xp. Clin. Pharmacol., 1993, 13, 205 ）。ミクロ乳剤は、薬物の可溶化を改善
すること、酵素的加水分解から薬物を保護すること、膜の流動性及び透過性にお
ける界面活性剤誘導性の変化により薬物の吸収性を高め得ること、調製の容易さ
、固形剤形より経口投与がしやすいこと、臨床効果が高まること、及び毒性が減
少することといった種々の利点を提供する（Constantinides et al., Pharmaceu
tical Research, 1994, 11, 1385; Ho et al., J. Pharm. Sci., 1996, 85, 138
-143）。しばしば、ミクロ乳剤は、その諸成分が周囲温度で一緒にされると自発
的に形成され得る。これは、熱に弱い薬物、ペプチド又はオリゴヌクレオチドを
製剤化するときに特に有利であり得る。ミクロ乳剤はまた、化粧品と医薬品の応
用のいずれにおいても、有効成分を経皮デリバリーするのに効果的である。本発
明のミクロ乳剤の組成物及び製剤は、オリゴヌクレオチド及び核酸の胃腸管から
の全身吸収を高めることを促進するばかりでなく、胃腸管、膣、頬腔及び他の吸
収部位内におけるオリゴヌクレオチド及び核酸の局所的な細胞内取込みを高める
だろう。

【００５３】本発明のミクロ乳剤は、製剤の特性を改善し、本発明のオリゴヌクレオチド及
び核酸の吸収を増強するために、モノステアリン酸ソルビタン（Ｇｒｉｌｌ３
）、Ｌａｂｒａｓｏｌ、及び浸透エンハンサーのような追加成分及び添加物も含
有し得る。本発明のミクロ乳剤に使用される浸透エンハンサーは５つの広いカテ
ゴリー、即ち、界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート剤、及び非キレート非
界面活性剤の１つに属するものとして分類され得る（Lee et al., Critical Rev
iews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92 ）。上記クラスのそ
れぞれについては以下に論じる。

【００５４】リポソームこれまで研究されてきて薬物の製剤化に使用されている、ミクロ乳剤以外の多
くの組織化された界面活性構造がある。これには、単層、ミセル、二層及び小胞
が含まれる。リポソームのような小胞が多大な関心を惹いてきたのは、薬物デリ
バリーの観点からそれらが提供するその特異性と作用時間のためである。本明細
書で使用される「リポソーム」という用語は、球状の二層（群）に配置された両
親媒性の脂質からなる小胞を意味する。リポソームは、親油性物質と水性内部から形成される膜を有する単層又は多層
の小胞である。デリバリーされる組成物は水性部分に含有される。カチオン性リ
ポソームは細胞壁に融合し得る利点を有する。非カチオン性リポソームは、細胞
壁と効率的には融合し得ないが、in vivo でマクロファージにより取込まれる。

【００５５】哺乳動物のインタクトな皮膚を通過するためには、脂質小胞は、適切な経皮勾
配の影響下で、それぞれ直径５０ｎｍ未満の連続した微細な空孔を通過しなけれ
ばならない。従って、ごく変形しやすくて、そのような微細空孔を通過すること
ができるリポソームを使用することが望ましい。リポソームのさらなる利点は以下に含まれる：天然のリン脂質から得られるリ
ポソームは生体適合性であり、生物分解性であること；リポソームは広範囲の水
溶性及び脂溶性薬物を取込むことができること；リポソームはその内部コンパー
トメントにある被包された薬物を代謝及び分解から保護し得ること（Rosoff, Ph
armaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Ma
rcel Dekker, Inc., New York, N. Y., volume 1, p. 245）。リポソーム製剤の
製造における重要な考察事項は、脂質表面の電荷、小胞のサイズ、及びリポソー
ムの水分量である。

【００５６】リポソームは、有効成分の作用部位への輸送及びデリバリーに有用である。リ
ポソーム膜は生体膜と構造的に似ているので、リポソームをある組織へ適用する
と、リポソームは細胞膜に溶け込み始める。リポソームの細胞への溶け込みが進
行するにつれて、リポソームの内容物は細胞のなかへ入り、そこで有効薬剤が作
用し得る。リポソーム製剤は、多くの薬物のデリバリー形式として詳細な研究の焦点とな
ってきた。局所投与についてはリポソームが他の製剤に優るいくつかの利点を示
すという証拠が増えつつある。そのような利点には、投与薬物の全身吸収に関連
した副作用の軽減、所望される標的における投与薬物の蓄積増加、及び親水性と
疎水性、両方の多様な薬物を皮膚へ投与し得る能力が含まれる。いくつかの報告論文は、高分子量ＤＮＡを包含する種々の薬剤を皮膚へデリバ
リーするリポソームの能力を詳しく述べている。鎮痛薬、抗体、ホルモン、及び
高分子量ＤＮＡを包含する化合物群が皮膚へ投与された。この適用の大部分は上
部表皮の標的化をもたらした。

【００５７】リポソームは２つのクラスに大別される。カチオン性リポソームは陽電荷のリ
ポソームであり、陰電荷のＤＮＡ分子と相互作用して安定な複合体を形成する。
陽電荷のＤＮＡ／リポソーム複合体は陰電荷の細胞表面に結合し、エンドソーム
のなかに内部化される。リポソームは、エンドソーム内の酸性ｐＨにより破壊さ
れ、細胞の細胞質へその内容物を放出する（Wang et al., Biochem. Biophys. R
es. Commun., 1987, 147, 980-985 ）。

【００５８】ｐＨ感受性であるか又は陰電荷であるリポソームは、ＤＮＡと複合するという
よりそれを取込む。ＤＮＡと脂質はいずれも似たように荷電しているので、複合
体の形成ではなく反発が起こるものである。それでも、あるＤＮＡはこれらリポ
ソームの水性内部に取込まれる。ｐＨ感受性リポソームはチミジンキナーゼ遺伝
子をコードするＤＮＡを培養細胞の単層へデリバリーするために使用されている
。この外来遺伝子の発現は標的細胞で検出された（Zhou et al., Journal of Co
ntrolled Release, 1992, 19, 269-274 ）。

【００５９】リポソーム組成物の１つの主要タイプには天然に由来するホスファチジルコリ
ン以外のリン脂質が含まれる。例えば、中性のリポソーム組成物は、ジミリスト
イルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）又はジパルミトイルホスファチジルコリ
ン（ＤＰＰＣ）から形成され得る。アニオン性リポソーム組成物が一般にジミリ
ストイルホスファチジルグリセロールから形成されるのに対し、アニオン性の融
合産生（fusogenic ）リポソームは主にジオレイルホスファチジルエタノールア
ミン（ＤＯＰＥ）から形成される。もう１つのタイプのリポソーム組成物は、例
えば、大豆のＰＣ及び卵のＰＣのようなホスファチジルコリン（ＰＣ）から形成
される。もう１つのタイプはリン脂質及び／又はホスファチジルコリン及び／又
はコレステロールの混合物から形成される。

【００６０】いくつかの研究でリポソーム性薬物製剤の皮膚への局所デリバリーが評価され
ている。インターフェロン含有リポソームをモルモットの皮膚へ適用すると皮膚
のヘルペス潰瘍の減少を生じたが、他の手段（例えば、溶液又は乳剤）を介した
デリバリーでは無効であった（Weiner et al., Journal of Drug Targeting, 19
92, 2, 405-410）。さらに、別の研究では、水性の系を使用するインターフェロ
ンの投与に対してリポソーム製剤の一部として投与されたインターフェロンの効
力が試験され、リポソーム製剤が水性系の投与に優ると結論された（du Plessis
et al., Antiviral Research, 1992, 18, 259-265）。

【００６１】非イオン性のリポソーム系（特に非イオン性界面活性剤及びコレステロールを
含んでなる系）も薬物の皮膚へのデリバリーにおけるその有用性を判定するため
に試験されている。マウス皮膚の真皮へシクロスポリン−Ａをデリバリーするた
めに、Ｎｏｖａｓｏｍｅ^TM Ｉ（ジラウリン酸グリセリル／コレステロール／ポ
リオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル）及びＮｏｖａｓｏｍｅ^TM ＩＩ
（ジステアリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０−ス
テアリルエーテル）を含んでなる非イオン性リポソーム製剤が使用された。結果
は、そのような非イオン性リポソーム系が皮膚の種々の層へのシクロスポリン−
Ａ沈着を促進するのに有効であることを示した（Hu et al., S. T. P. Pharma.
Sci., 1994, 4, 6, 466 ）。

【００６２】リポソームにはまた、「立体的に安定した」リポソームが含まれるが、この用
語は、本明細書で使用されるように、１種又はそれ以上の特殊な脂質を含んでな
るリポソームを意味し、これがリポソームに取込まれると、そのような特殊な脂
質を欠いているリポソームに比べて循環寿命が増加する。立体的に安定したリポ
ソームの例は、リポソームの小胞を形成する脂質部分の一部が（Ａ）モノシアロ
ガングリオシドＧ_M1のような１種又はそれ以上の糖脂質を含むか、又は（Ｂ）ポ
リエチレングリコール（ＰＥＧ）部分のような１つ又はそれ以上の親水性ポリマ
ーで誘導化されているものである。特定の理論に縛られることを望まないが、当
技術分野では、少なくともガングリオシド、スフィンゴミエリン、又はＰＥＧ−
誘導化脂質を含有する立体的に安定したリポソームについて言えば、これらの立
体的に安定したリポソームの増加された循環半減期は細網内皮系（ＲＥＳ）細胞
への取込みの減少に由来する（Allen et al., FEBS Letters, 1987, 223, 42; W
u et al., CancerResearch, 1993, 53, 3765）。１種又はそれ以上の糖脂質を含
んでなる様々なリポソームが当技術分野で知られている。Papahadjopoulos et a
l.（Ann. N. Y. Acad. Sci., 1987,507, 64 ）は、モノシアロガングリオシドＧ _M1 、硫酸ガラクトセレブロシド及びホスファチジルイノシトールがリポソームの
血中半減期を改善させる能力について報告した。上記の知見は、Gabizon et al.
（Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 1988, 85, 6949 ）により詳しく解釈され
た。米国特許第４，８３７，０２８号及びＷＯ８８／０４９２４（いずれも All
en et al.,へ）には、（１）スフィンゴミエリン及び（２）ガングリオシドＧ_M1 又は硫酸ガラクトセレブロシドエステルを含んでなるリポソームを開示する。米
国特許第５，５４３，１５２号（Webb et al. ）は、スフィンゴミエリンを含ん
でなるリポソームが開示されている。１，２−ｓｎ−ジミリストイルホスファチ
ジルコリンを含んでなるリポソームがＷＯ９７／１３４９９号（Lim et al.）に
開示されている。

【００６３】１種又はそれ以上の親水性ポリマーで誘導化した脂質を含んでなる多くのリポ
ソーム、及びその製造方法が当技術分野で知られている。Sunamoto et al. （Bu
ll. Chem. Soc. Jpn., 1980, 53, 2778 ）は、ＰＥＧ部分を含有する非イオン性
洗剤である２Ｃ₁₂１５Ｇを含んでなるリポソームに付いて述べた。Illum et al.
（FEBS Lett., 1984, 167, 79 ）は、高分子グリコールでポリスチレン粒子を親
水コーティングすると血中半減期が有意に増加されることに注目した。ポリアル
キレングリコール（例えば、ＰＥＧ）のカルボキシル基を付けることにより修飾
した合成リン脂質が Sears（米国特許第４，４２６，３３０号及び４，５３４，
８９９号）に述べられている。Klibanov et al. （FEBS Lett., 1990, 268, 235
）は、ＰＥＧ又はステアリン酸ＰＥＧで誘導化したホスファチジルエタノールア
ミン（ＰＥ）を含んでなるリポソームが血液循環半減期の有意な増加をもたらす
ことを示す実験について述べた。Blume et al.（Biochimica et Biophysica Act
a, 1990, 1029, 91 ）は、そのような観察事実を、ジステアロイルホスファチジ
ルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）及びＰＥＧの組み合わせから形成される、他の
ＰＥＧ誘導化リン脂質（例、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ）へ拡張した。共有結合したＰＥ
Ｇ部分をその外部表面に有するリポソームがヨーロッパ特許第ＥＰ０４４５１３
１Ｂ１号とＦｉｓｈｅｒへのＷＯ９０／０４３８４号に記載されている。ＰＥＧ
で誘導化したＰＥを１〜２０モル％含有するリポソーム組成物、及びその使用方
法が Woodle et al.（米国特許第５，０１３，５５６号及び５，３５６，６３３
号）と Martin et al.（米国特許第５，２１３，８０４号及びヨーロッパ特許第
ＥＰ０４９６８１３Ｂ１号）により述べられている。数多くの他の脂質−ポリマ
ーコンジュゲートを含んでなるリポソームがＷＯ９１／０５５４５号及び米国特
許第５，２２５，２１２号（いずれも Martin et al.へのもの）、及びＷＯ９４
／２００７３号（Zalipsky et al. ）に開示されている。ＰＥＧ修飾されたセラ
ミド脂質を含んでなるリポソームがＷＯ９６／１０３９１号（Choi et al. ）に
記載されている。米国特許第５，５４０，９３５号（Miyazaki et al. ）及び５
，５５６，９４８号（Tagawa et al. ）は、その表面上の機能性部分でさらに誘
導化され得るＰＥＧ含有リポソームについて記載している。

【００６４】核酸を含んでなる、限られた数のリポソームが当技術分野で知られている。Th
ierry etal. へのＷＯ９６／４００６２号は、高分子量の核酸をリポソームに被
包化する方法を開示する。Tagawa et al. への米国特許第５，２６４，２２１号
はタンパク質に結合したリポソームを開示し、そのようなリポソームの内容物に
アンチセンスＲＮＡが含まれる可能性があると主張する。Rahman et al. への米
国特許第５，６６５，７１０号は、オリゴデオキシヌクレオチドをリポソームに
被包化するある種の方法を記載する。Love et al. へのＷＯ９７／０４７８７号
は、ｒａｆ遺伝子を標的にしたアンチセンスオリゴヌクレオチドを含んでなるリ
ポソームを開示する。

【００６５】トランスファーソーム（transfersome）はもう１つのタイプのリポソームであ
り、きわめて変形しやすい脂質の集塊であって、薬物デリバリー運搬体の魅力的
な候補である。トランスファーソームは脂質の液滴として記載される場合があり
、きわめて変形しやすくてその液滴より小さい空孔を容易に貫通し得るものであ
る。トランスファーソームはそれが使用される環境に適合している、例えば、そ
れらは自己最適化し（皮膚の空孔の形状に適合する）、自己修復し、断片化せず
にその標的に達するものであり、しばしば自己ローディングである。トランスフ
ァーソームを製造するには、界面エッジ活性化剤、通常界面活性剤を標準的なリ
ポソーム組成物へ加えることが可能である。トランスファーソームは血清アルブ
ミンを皮膚へデリバリーするために使用された。トランスファーソーム介在性の
血清アルブミンデリバリーは、血清アルブミンを含有する溶液の皮下注射と同じ
くらい有効であることが示された。

【００６６】界面活性剤は乳剤（ミクロ乳剤を含む）やリポソームのような製剤に広く応用
されている。天然と合成、両方の多種多様なタイプの界面活性剤の性質を分類し
て順位づける最も一般的な方法は、親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）の使用に
よるものである。親水基（「ヘッド」としても知られる）の性質は、製剤に使用
される様々な界面活性剤を分類するための最も有用な手段を提供する（Rieger,
Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, N. Y., 1988,
p. 285 ）。

【００６７】界面活性分子がイオン化されていない場合、それは非イオン性界面活性剤とし
て分類される。非イオン性界面活性剤は医薬品及び化粧品に広く応用され、広範
囲のｐＨ値にわたり使用し得る。一般に、そのＨＬＢ値は、その構造に依存して
、２〜約１８の範囲をとる。非イオン性界面活性剤には、エチレングリコールエ
ステル、プロピレングリコールエステル、グリセリルエステル、ポリグリセリル
エステル、ソルビタンエステル、スクロースエステル、及びエトキシル化エステ
ルのような非イオン性エステルが含まれる。非イオン性アルカノールアミドや脂
肪アルコールエトキシレート、プロポキシル化アルコール、及びエトキシル化／
プロポキシル化ブロックポリマーのようなエーテルもこのクラスに含まれる。ポ
リオキシエチレン界面活性剤は非イオン性界面活性剤クラスの最も一般的なメン
バーである。

【００６８】界面活性分子が水に溶けるか又は分散するときに陰電荷を有する場合、この界
面活性剤はアニオン性として分類される。アニオン性界面活性剤には、石けんの
ようなカルボキシレート、アシルラクチレート、アミノ酸のアシルアミド、硫酸
アルキル及びエトキシル化硫酸アルキルのような硫酸エステル、ベンゼンスルホ
ン酸アルキル、イセチオン酸アシル、タウリン酸アシル及びスルホスクシネート
のようなスルホン酸エステル、及びリン酸エステルが含まれる。アニオン性界面
活性剤クラスの最も重要なメンバーは硫酸アルキルと石けんである。界面活性分子が水に溶けるか又は分散するときに陽電荷を有する場合、この界
面活性剤はカチオン性として分類される。カチオン性界面活性剤には、４級アン
モニウム塩とエトキシル化アミンが含まれる。４級アンモニウム塩がこのクラス
の最も重要なメンバーである。

【００６９】界面活性分子が陽電荷か陰電荷のいずれか一方を担う能力を有する場合、この
界面活性剤は両親媒性として分類される。両親媒性界面活性剤には、アクリル酸
誘導体、置換されたアルキルアミド、Ｎ−アルキルベタイン及びホスファチドが
含まれる。医薬品、製剤、及び乳剤における界面活性剤の使用が解説されている（Rieger
, Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, N. Y., 198
8, p. 285 ）。

【００７０】浸透エンハンサー１つの態様では、本発明は、核酸、特にオリゴヌクレオチドの動物の皮膚への
効率的なデリバリーを有効にする様々な浸透エンハンサーを利用する。ほとんど
の薬物はイオン化と非イオン化のいずれの形態でも溶液に存在する。しかしなが
ら、通常細胞膜を容易に通過するのは脂溶性又は親油性の薬物だけである。しか
しながら、非親油性の薬物でも、通過される膜が浸透エンハンサーで処理されれ
ば細胞膜を通過し得ることが発見された。非親油性薬物の細胞膜への拡散を助け
ることだけでなく、浸透エンハンサーは親油性薬物の透過性を増加させる。浸透
エンハンサーは５つの広いカテゴリー、即ち、界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、
キレート剤、及び非キレート非界面活性剤、の１つに属するものとして分類され
得る（Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,
1991, p. 92 ）。上記浸透エンハンサー群のそれぞれにつき、以下により詳しく
述べる。

【００７１】界面活性剤：本発明に関連すると、界面活性剤（又は「界面活性薬剤」）は、
水溶液に溶けると、溶液の表面張力、又は水溶液と他の液体間の界面張力を減少
させ、その結果粘膜を介したオリゴヌクレオチドの吸収が増強される。胆汁酸塩
及び脂肪酸に加え、この浸透エンハンサーには、例えば、ラウリル硫酸ナトリウ
ム、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル及びポリオキシエチレン−２０
−セチルエーテル（Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carri
er Systems, 1991, page 92 ）；及びＦＣ−４３のようなペルフルオロケミカル
乳剤（Takahashi et al., J. Pharm. Pharmacol., 1988, 40:252）が含まれる。

【００７２】脂肪酸：浸透エンハンサーとして作用する様々な脂肪酸及びその誘導体には、
例えばオレイン酸、ラウリン酸、カプリン酸（ｎ−デカン酸）、ミリスチン酸、
パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカ
プレート、モノオレイン（１−モノオレオイル−ｒａｃ−グリセロール）、ジラ
ウリン、カプリル酸、アラキドン酸、グリセロール−１−モノカプレート、１−
ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、そ
れらのＣ_1-10アルキル（例えば、メチル、イソプロピル及びｔ−ブチル）エステ
ル、及びそれらのモノ及びジグリセリド（即ち、オレエート、ラウレート、カプ
レート、ミリステート、パルミテート、ステアレート、リノレエート等）が含ま
れる（Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,
1991, p. 92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Sys
tems, 1990, 7:1-33; El-Hariri et al., J. Pharm. Pharmacol., 1992, 44, 65
1-654 ）。

【００７３】胆汁酸塩：胆汁の生理学的役割には、脂質及び脂溶性ビタミンの分散及び吸収
の促進が含まれる（Brunton, Chapter 38, Goodman & Gilman's The Pharmacolo
gical Basis of Therapeutics, 9th Ed., Hardman et al., Eds., McGraw-Hill,
New York ，NY,1996, pp. 934-935）。様々な天然の胆汁酸塩、及びその合成誘
導体が浸透エンハンサーとして作用する。従って、「胆汁酸塩」という用語には
、天然に存在する胆汁の成分並びにその合成誘導体が含まれる。本発明の胆汁酸
塩には、例えば、コール酸（又はその製剤的に許容されるナトリウム塩、コール
酸ナトリウム）、デヒドロコール酸（デヒドロコール酸ナトリウム）、デオキシ
コール酸（デオキシコール酸ナトリウム）、グルコール酸（グルコール酸ナトリ
ウム）、グリコール酸（グリコール酸ナトリウム）、グリコデオキシコール酸（
グリコデオキシコール酸ナトリウム）、タウロコール酸（タウロコール酸ナトリ
ウム）、タウロデオキシコール酸（タウロデオキシコール酸ナトリウム）、ケノ
デオキシコール酸（ケノデオキシコール酸ナトリウム）、ウルソデオキシコール
酸（ＵＤＣＡ）、タウロ−２４，２５−ジヒドロ−フシジン酸ナトリウム（ＳＴ
ＤＨＦ）、グリコジヒドロフシジン酸ナトリウム及びポリオキシエチレン−９−
ラウリルエーテル（ＰＯＥ）が含まれる（Lee et al., Critical Reviews in Th
erapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92; Swinyard, Chapter 39 :Rem
ington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Gennaro, ed., Mack Publishin
g Co., Easton, PA, 1990, pages 782-783; Muranishi, Critical Reviews in T
herapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Yamamoto et al., J. Phar
m. Exp. Ther., 1992, 263, 25; Yamashita et al., J. Pharm. Sci., 1990, 79
, 579-583 ）。

【００７４】キレート剤：キレート剤は、本発明に関連して使用されるように、複合体を形
成することによって溶液から金属イオンを除去し、その結果粘膜を介したオリゴ
ヌクレオチドの吸収を増強させる化合物として定義し得る。本発明における浸透
エンハンサーとしての使用に関して言えば、キレート剤は、ＤＮアーゼ阻害物質
としても役立つという追加の利点を有する。これは、ほとんどの特徴づけられた
ＤＮＡヌクレアーゼが触媒作用のために２価金属イオンを必要とするので、キレ
ート剤により阻害されるためである（Jarrett, J. Chromatogr., 1993, 618, 31
5-339 ）。本発明のキレート剤には、限定しないが、エチレンジアミン四酢酸二
ナトリウム（ＥＤＴＡ）、クエン酸、サリチル酸塩（例えば、サリチル酸ナトリ
ウム、５−メトキシサリチル酸塩及びホモバニレート）、コラーゲンのＮ−アシ
ル誘導体、ラウレス−９とβ−ジケトンのＮ−アミノアシル誘導体（エナミン）
が含まれる（Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Sys
tems, 1991, page 92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Car
rier Systems, 1990, 7, 1-33; Buur et al., J. Control Rel., 1990, 14, 43-
51）。

【００７５】非キレート非界面活性剤：本明細書に使用されるように、非キレート非界面活
性剤の浸透増強化合物は、キレート剤又は界面活性剤としてはさしたる活性を示
さないが、それでも消化管粘膜を介したオリゴヌクレオチドの吸収を増強する化
合物として定義される（Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Ca
rrier Systems, 1990, 7, 1-33）。このクラスの浸透エンハンサーには、例えば
、不飽和サイクリック尿素、1 −アルキル及び１−アルケニルアザシクロ−アル
カノン誘導体（Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier S
ystems, 1991, page 92 ）；及びジクロフェナクナトリウム、インドメタシン及
びフェニルブタゾンのような非ステロイド性抗炎症薬（Yamashita et al., J. P
harm. Pharmacol., 1987, 39, 621-626 ）が含まれる。

【００７６】細胞レベルでオリゴヌクレオチドの取込みを強化する薬剤も本発明の医薬及び
他の組成物へ加えられる場合がある。例えば、リポフェクチン（Junichi et al.
, 米国特許第５，７０５，１８８号）のようなカチオン性脂質、カチオン性グリ
セロール誘導体、及びポリリシン（Lollo et al., ＰＣＴ出願ＷＯ９７／３０７
３１号）のようなポリカチオン性分子もオリゴヌクレオチドの細胞取込みを増強
することが知られている。エチレングリコールやプロピレングリコールのようなグリコール、２−ピロー
ルのようなピロール、アゾン、及びリモネンやメントンのようなテルペンを包含
する他の薬剤も、投与される核酸の浸透を増強するために利用し得る。

【００７７】担体本発明のある組成物はまた製剤中に担体化合物も取込む。本明細書で使用され
る「担体化合物」又は「担体」は、不活性である（即ち、それ自身は生物学的活
性を保有しない）が、例えば生物学的に活性のある核酸を分解するか又はその循
環からの除去を促進することによって、生物学的活性を有する核酸のバイオアベ
イラビリティを減少させる in vivoプロセスにより核酸として認知される核酸又
はその類似体を意味し得る。核酸及び担体化合物の同時投与は、典型的には後者
の物質が過剰であるが、肝臓、腎臓又は他の循環外レザバーにおいて回収される
核酸の量を実質的に減少させるが、これは恐らく共通の受容体に対する担体化合
物と核酸の競合によるものであろう。例えば、部分的にホスホロチオエート化さ
れたオリゴヌクレオチドの肝臓組織における回収は、それがポリイノシン酸、硫
酸デキストラン、ポリシチジン酸又は４−アセトアミド−４' −イソチオシアノ
−スチルベン−２，２' −ジスルホン酸と同時投与されるとき、減少する場合が
ある（Miyao et al., Antisense Res. Dev., 1995, 5, 115-121; Takakura et a
l., Antisense & Nucl. Acid Drug Dev., 1996, 6, 177-183）。

【００７８】賦形剤担体化合物とは対照的に、「医薬担体」又は「賦形剤」は、製剤的に許容され
る溶媒、懸濁剤、又は１種又はそれ以上の核酸を動物へデリバリーするための他
の薬理学的に不活性な担体である。賦形剤は液体又は固体であり得て、計画され
た投与方法に基づいて、所定の医薬組成物の核酸及び他の成分とともに組み合わ
せたときに、所望される大きさ、コンシステンシー等をもたらすように選択され
る。典型的な医薬担体には、限定しないが、結合剤（例、ゼラチン化トウモロコ
シデンプン、ポリビニルピロリドン又はヒドロキシプロピルメチルセルロース等
）；充填剤（例、ラクトース及び他の糖、微結晶性セルロース、ペクチン、ゼラ
チン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレート又はリン酸水素カ
ルシウム等）；潤滑剤（例、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロ
イダル二酸化シリコン、ステアリン酸、金属ステアリン酸塩、水素添加植物油、
コーンスターチ、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウ
ム等）；崩壊剤（例、デンプン、スターチグリコール酸ナトリウム等）；又は湿
潤剤（ラウリル硫酸ナトリウム等）が含まれる。

【００７９】非腸管外投与に好適で、核酸とは有害に反応しない、製剤的に許容される有機
又は無機の賦形剤も本発明の組成物を製剤化するために使用し得る。製剤的に許
容され得る好適な担体には、限定しないが、水、塩溶液、アルコール、ポリエチ
レングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウ
ム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニ
ルピロリドン等が含まれる。

【００８０】核酸の局所投与に適した製剤には、滅菌及び非滅菌の水性溶液、アルコールの
ような一般溶媒に溶けた非水性溶液、又は液体又は固体のオイルをベースとした
核酸溶液が含まれ得る。これら溶液は、緩衝液、希釈剤、及び他の好適な添加物
を含有し得る。非腸管外投与に適した、核酸とは有害に反応しない製剤的に許容
される有機又は無機の賦形剤も使用し得る。製剤的に許容される好適な賦形剤には、限定しないが、水、塩溶液、アルコー
ル、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン
酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロー
ス、ポリビニルピロリドン等が含まれる。

【００８１】他の成分本発明の組成物は、医薬組成物に従来的に見出される他の付加成分を、その現
行技術で確立された使用レベルで、追加的に含有し得る。従って、例えば本発明
の組成物は、例えば止痒剤、収斂薬、局所麻酔剤又は抗炎症剤のような適合性の
ある追加の医薬活性物質を含有し得るか又は、着色剤、芳香剤、保存剤，抗酸化
剤、混濁剤、濃化剤及び安定化剤のような、本発明の組成物の様々な剤形を物理
的に製剤化するのに有用である追加の物質を含有し得る。しかしながら、そのよ
うな物質は、追加されたときに、本発明の組成物の成分の生物学的活性に不当に
干渉してはならない。製剤は滅菌され、所望されるならば、製剤の核酸とは有害
に反応しない助剤、例えば潤滑剤、保存剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧
に影響を与える塩、緩衝液、着色剤、矯味剤及び／又は芳香性物質、等と混合し
得る。

【００８２】水性懸濁液は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトー
ル及び／又はデキストランを包含する、懸濁液の粘度を高める物質を含有し得る
。懸濁液は安定化剤も含有し得る。本発明のある態様は、（ａ）１種又はそれ以上のアンチセンス化合物、及び（
ｂ）非アンチセンス機序によって機能する１種又はそれ以上の他の化学療法剤を
含有する医薬組成物を提供する。そのような化学療法剤の例には、限定しないが
、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、マイ
トマイシン、ナイトロジェンマスタード、クロラムブシル、メルファラン、シク
ロホスファミド、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン（ＣＡ
）、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、フロキシウリジン（５−ＦＵｄＲ）、
メトトレキセート（ＭＴＸ）、コルヒチン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、
エトポシド、テニポシド、シスプラチン及びジエチルスチルベストロール（ＤＥ
Ｓ）のような抗癌剤が含まれる。一般論としては、The Merck Manual of Diagno
sis and Therapy, 15th Ed., Berkow et al., eds., 1987 Rahway, N. J., page
s 1206-1228 を参考のこと。非ステロイド抗炎症剤及びコルチコステロイドを限
定しないが包含する抗炎症剤、及びリビビリン、ビダラビン、アシクロビル及び
ガンシクロビルを限定しないが包含する抗ウイルス剤も本発明の組成物とともに
使用され得る。一般論としては、The Merck Manual of Diagnosis and Therapy,
15th Ed., Berkow et al., eds., 1987 Rahway, N. J., pages 2499-2506 及び
46-49をそれぞれ参考のこと。他の非アンチセンス化学療法剤も本発明の特許請
求の範囲内にある。２種又はそれ以上の複合化合物は一緒に、又は連続的に使用
される場合がある。

【００８３】もう１つの関連した態様では、本発明の組成物は、１種又はそれ以上のアンチ
センス化合物、特にオリゴヌクレオチドを含有し得るが、これは第一の核酸を標
的とし、１つ又はそれ以上の追加のアンチセンス化合物が第二の核酸を標的にす
る。アンチセンス化合物の数多の例が当技術分野で知られている。２種又はそれ
以上の複合化合物は一緒に、又は連続的に使用される場合がある。治療用組成物の製剤化及び後続の投与は、当業者の技術の範囲内にあると考え
られる。投与は治療される病態の重症度と反応性に依存し、治療期間は数日から
数ヶ月、又は治療が効果を示すか又は病態の減衰が達成されるまで続く。最適な
投与スケジュールは、患者体内における薬物蓄積の測定値から算出され得る。当
業者は、最適投与量、投与方法及び反復率を容易に決定し得る。最適投与量は個
々のオリゴヌクレオチドの相対効力に応じて変化し得るが、一般には in vitro
及び in vivoの動物モデルにおいて有効とされたＥＣ₅₀に基づいて推定され得る
。一般に、投与量は体重ｋｇあたり０．０１μｇ〜１００ｇであり、１日、１週
、１月又は１年につき１回又はそれ以上、又は２〜２０年に１回でさえ与え得る
。当業者は、体液又は組織内の薬物滞留時間及び濃度に基づいて投与反復率を容
易に推定し得る。治療がうまくいけば、患者に維持療法を施し、病態の再発を予
防することが所望され得る。ここでオリゴヌクレオチドは、体重ｋｇあたり０．
０１μｇ〜１００ｇの範囲で、１日１回又は数回〜２０年に１回まで、維持用量
で投与される。本発明をその好ましい態様のあるものに準じて特別に記載してきたが、以下の
実施例も本発明を説明するためのものであって、それを制限するものではない。

【００８４】

【実施例】

実施例１オリゴヌクレオチド合成用ヌクレオシドホスホロアミダイトデオキシ及び２' −アルコキシアミダイト２' −デオキシ及び２' −メトキシ−β−シアノエチルジイソプロピルホスホ
ロアミダイトは市販品を購入した（例えば、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ，ニーダム、Ｍ
Ａ、又はグレン・リサーチ社、スターリング、ＶＡ）。他の２' −Ｏ−アルコキ
シ置換ヌクレオシドアミダイトは、参照により本明細書に組込まれている米国特
許第５，５０６，３５１号に記載のように製造する。２' −アルコキシアミダイ
トを用いて合成するオリゴヌクレオチドについては、未修飾のオリゴデオキシヌ
クレオチドの標準サイクルを利用したが、テトラゾール及び塩基のパルスデリバ
リー後の待ち工程は３６０秒に高めた。５−メチル−２' −デオキシシチジン（５−Ｍｅ−Ｃ）ヌクレオチドを含有す
るオリゴヌクレオチドは、市販のホスホロアミダイト（グレン・リサーチ社、ス
ターリング、ＶＡ、又はＣｈｅｍＧｅｎｅｓ，ニーダム、ＭＡ）を用いる公知の
方法により合成した［Sanghvi, et. al., Nucleic Acids Research, 1993, 21,
3197-3203 ］。

【００８５】２' −フルオロアミダイト２' −フルオロデオキシアデノシンアミダイト２' −フルオロ−オリゴヌクレオチドは、参照により本明細書に組込まれてい
る既知の方法［Kawasaki et al., J. Med. Chem., 1993, 36, 831-841 ］と米国
特許第５，６７０，６３３号に記載のように合成した。簡略に言うと、市販の９
−β−Ｄ−アラビノフラノシルアデニンを出発材料として利用し、２' −β−ト
リチル基のＳ_N２置換により２' −α−フルオロ原子を導入して文献の方法を変
更することによって、保護化したヌクレオシド、Ｎ６−ベンゾイル−２' −デオ
キシ−２' −フルオロアデノシンを合成した。このようにして、Ｎ６−ベンゾイ
ル−９−β−Ｄ−アラビノフラノシルアデニンを、３' ，５' −ジテトラヒドロ
ピラニル（ＴＨＰ）中間体として中等度の収量で選択的に保護化した。ＴＨＰと
Ｎ６−ベンゾイル基の脱保護化を標準的な方法を用いて実行し、標準法を用いて
５' −ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）−及び５' −ＤＭＴ−３' −ホスホロアミ
ダイト中間体を得た。

【００８６】２' −フルオロデオキシグアノシン２' −デオキシ−２' −フルオログアノシンの合成は、テトライソプロピルジ
シロキサニル（ＴＰＤＳ）保護化９−β−Ｄ−アラビノフラノシルグアニンを出
発材料として使用して実施し、中間体のジイソブチリルアラビノフラノシルグア
ノシンへ変換した。ＴＰＤＳ基を脱保護化した後、ＴＨＰでヒドロキシル基を保
護化して、ジイソブチリルジ−ＴＨＰ保護化アラビノフラノシルグアニンを得た
。選択的なＯ−脱アシル化及びトリフレーション（triflation）に次いで粗生成
物をフッ化物で処理し、次いでＴＨＰ基を脱保護化した。標準法を用いて５' −
ＤＭＴ−及び５' −ＤＭＴ−３' −ホスホロアミダイトを得た。

【００８７】２' −フルオロウリジン２' −デオキシ−２' −フルオロウリジンの合成は、２，２' −アンヒドロ−
１−β−Ｄ−アラビノフラノシルウラシルを７０％フッ化水素／ピリジンで処理
する、文献の方法の変更により達成した。標準法を用いて５' −ＤＭＴ及び５'
−ＤＭＴ−３' ホスホロアミダイトを得た。

【００８８】２' −フルオロデオキシシチジン２' −デオキシ−２' −フルオロウリジンのアミノ化により２' −デオキシ−
２' −フルオロシチジンを合成した後、選択的な保護化によってＮ４−ベンゾイ
ル−２' −デオキシ−２' −フルオロシチジンを得た。標準法を用いて５' −Ｄ
ＭＴ及び５' −ＤＭＴ−３' ホスホロアミダイトを得た。

【００８９】２' −Ｏ−（２−メトキシエチル）修飾アミダイト２' −Ｏ−メトキシエチル置換ヌクレオシドアミダイトは、Martin, P., Helv
etica Chimica ．Acta, 1995, 78，486-504 の方法にそのまま準ずるか、一部変
更して製造する。

【００９０】２，２' −アンヒドロ［１−（β−D −アラビノフラノシル）−５−メチルウ
リジン］５−メチルウリジン（リボシルチミン、ヤマサ、銚子、日本の市販品）（７２
．０ｇ，０．２７９Ｍ）、ジフェニルカーボネート（９０．０ｇ，０．４２０Ｍ
）及び重炭酸ナトリウム（２．０ｇ，０．０２４Ｍ）をＤＭＦ（３００ｍＬ）に
加えた。この混合液を撹拌しながら還流加熱し、発生する二酸化炭素ガスを制御
されたやり方で放出させた。１時間後、やや黒ずんだ溶液を減圧濃縮した。得ら
れたシロップを、撹拌しながら、ジエチルエーテル（２．５Ｌ）へ注いだ。生成
物はゴムを形成した。エーテルをデカントし、残渣を最少量のメタノール（約４
００ｍＬ）に溶かした。この溶液を新鮮なエーテル（２．５Ｌ）に注ぐと、堅い
ゴムを生じた。エーテルをデカントし、このゴムを真空オーブンにて乾燥させ（
６０℃，１ｍｍＨｇ，２４時間）、得られた固形物を粉砕して明褐色の粉末にし
た（５７ｇ，粗収率８５％) 。ＮＭＲスペクトルは構造に一致し、フェノールが
ナトリウム塩として混在していた（約５％）。この物質をそのまま以後の反応に
使用した（又は、メタノールの酢酸エチル（１０〜２５％）勾配液を用いたカラ
ムクロマトグラフィーによってさらに精製し、融点２２２−４℃の白色固体を得
ることもできる）。

【００９１】２' −Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウリジン２，２' −アンヒドロ−５−メチルウリジン（１９５ｇ，０．８１Ｍ）、トリ
ス（２−メトキシエチル）ホウ酸エステル（２３１ｇ，０．９８Ｍ）及び２−メ
トキシエタノール（１．２Ｌ）を２Ｌのステンレス鋼圧力容器へ加え、前もって
１６０℃に加熱した油浴中に置いた。１５５−１６０℃で４８時間加熱した後、
この容器を開き、この溶液を蒸発乾固し、ＭｅＯＨ（２００ｍＬ）を加えて粉砕
した。残渣を温アセトン（１Ｌ）に懸濁した。不溶性の塩を濾過し、アセトン（
１５０ｍＬ）で洗浄し、濾液を蒸発させた。残渣（２８０ｇ）をＣＨ₃ＣＮ（６
００ｍＬ）に溶かし、蒸発させた。０．５％Ｅｔ₃ＮＨを含有するＣＨ₂Ｃｌ ₂ ／アセトン／ＭｅＯＨ（２０：５：３）にシリカゲルカラム（３ｋｇ）を充填
した。残渣をＣＨ₂Ｃｌ₂（２５０ｍＬ）に溶かし、シリカ（１５０ｇ）に吸着
させてからカラムにロードした。充填溶媒で生成物を溶出させ、生成物１６０ｇ
（６３％）を得た。低純度分画を再処理してさらに生成物質を得た。

【００９２】２' −Ｏ−メトキシエチル−５' −Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルウリ
ジン２' −Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウリジン（１６０ｇ，０．５０６Ｍ）
をピリジン（２５０ｍＬ）と共沸させ、乾燥した残渣をピリジン（１．３Ｌ）に
溶かした。塩化ジメトキシトリチルの第一アリコート（９４．３ｇ，０．２７８
Ｍ）を加え、この混合物を室温で１時間撹拌した。塩化ジメトキシトリチルの第
二アリコート（９４．３ｇ，０．２７８Ｍ）を加え、この反応物をさらに１時間
撹拌した。次いでメタノール（１７０ｍＬ）を加えて反応を止めた。ＨＰＬＣに
より約７０％の生成物の存在が示された。溶媒を蒸発させ、ＣＨ₃ＣＮ（２００
ｍＬ）で粉砕した。残渣をＣＨＣｌ₃（１．５Ｌ）に溶かし、２ｘ５００ｍＬの
飽和ＮａＨＣＯ₃と２ｘ５００ｍＬの飽和ＮａＣｌで抽出した。有機相をＮａ₂ ＳＯ₄で乾燥し、濾過して、蒸発させた。残渣２７５ｇを得た。０．５％Ｅｔ ₃ ＮＨを含有するＥｔＯＡｃ／ヘキサン／アセトン（５：５：１）で充填して溶
出させる３．５ｋｇのシリカゲルカラムでこの残渣を精製した。純粋な分画を蒸
発させて生成物１６４ｇを得た。低純度分画からさらに約２０ｇを得て、全体収
量１８３ｇ（５７％）を得た。

【００９３】３' −Ｏ−アセチル−２' −Ｏ−メトキシエチル−５' −Ｏ−ジメトキシトリ
チル−５−メチルウリジン２' −Ｏ−メトキシエチル−５' −Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルウリ
ジン（１０６ｇ，０．１６７Ｍ）、ＤＭＦ／ピリジン（ＤＭＦ５６２ｍＬとピ
リジン１８８ｍＬから調製した３：１の混合液７５０ｍＬ）及び無水酢酸（２４
．３８ｍＬ，０．２５８Ｍ）を合わせて室温で２４時間撹拌した。最初にＴＬＣ
サンプルをＭｅＯＨ添加で急冷し、ＴＬＣにより反応をモニターした。ＴＬＣに
より判定されるように、反応の終了時にＭｅＯＨ（５０ｍＬ）を加え、この混合
液を３５℃で蒸発させた。残渣をＣＨＣｌ₃（８００ｍＬ）に溶かし、２ｘ２０
０ｍＬの飽和重炭酸ナトリウムと２ｘ２００ｍＬの飽和ＮａＣｌで抽出した。水
層をＣＨＣｌ₃ ２００ｍＬで戻し抽出した。一緒にした有機層を硫酸ナトリウ
ムで乾燥し、蒸発させ、残渣１２２ｇを得た（約９０％の生成物）。この残渣を
３．５ｋｇシリカゲルカラムで精製し、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（４：１）を使用
して溶出した。純粋な生成物の分画を蒸発させて９６ｇ（８４％）を得た。後の
分画からさらに１．５ｇを回収した。

【００９４】３' −Ｏ−アセチル−２' −Ｏ−メトキシエチル−５' −Ｏ−ジメトキシトリ
チル−５−メチル−４−トリアゾールウリジン３' −Ｏ−アセチル−２' −Ｏ−メトキシエチル−５' −Ｏ−ジメトキシトリ
チル−５−メチルウリジン（９６ｇ，０．１４４Ｍ）をＣＨ₃ＣＮ（７００ｍＬ
）に溶かして第一の溶液を調製し、取って置いた。トリアゾール（９０ｇ，１．
３Ｍ）のＣＨ₃ＣＮ（１Ｌ）溶液へトリエチルアミン（１８９ｍＬ，１．４４Ｍ
）を加え、−５℃に冷却し、オーバーヘッド撹拌子を使用して０．５時間撹拌し
た。この溶液を０〜１０℃に保って撹拌しながら、ＰＯＣｌ₃を１滴ずつ３０分
かけて加え、得られた混合液をさらに２時間撹拌した。この混合液へ、第一の溶
液を１滴ずつ４５分間かけて加えた。得られた反応混合液を一晩冷室に保管した
。反応混合液から塩を濾過し、溶液を蒸発させた。残渣をＥｔＯＡｃ（１Ｌ）に
溶かし、不溶性の固形物を濾過により除去した。濾液を１ｘ３００ｍＬのＮａＨ
ＣＯ₃と２ｘ３００ｍＬの飽和ＮａＣｌで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸
発させた。残渣をＥｔＯＡｃで粉砕し、表題化合物を得た。

【００９５】２' −Ｏ−メトキシエチル−５' −Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチ
ジン３' −Ｏ−アセチル−２' −Ｏ−メトキシエチル−５' −Ｏ−ジメトキシトリ
チル−５−メチル−４−トリアゾールウリジン（１０３ｇ，０．１４１Ｍ）のジ
オキサン（５００ｍＬ）／ＮＨ₄ＯＨ（３０ｍＬ）溶液を室温で２時間撹拌した
。このジオキサン溶液を蒸発させ、残渣をＭｅＯＨ（２ｘ２００ｍＬ）と共沸さ
せた。ＭｅＯＨ（３００ｍＬ）に残渣を溶かし、２リットルのステンレス鋼加圧
容器へ移した。ＮＨ₃ガスで飽和したメタノール（４００ｍＬ）を加え、容器を
２時間で１００℃まで加熱した（ＴＬＣにより完全な変換が示された）。容器の
内容物を蒸発乾固させ、残渣をＥｔＯＡｃ（５００ｍＬ）に溶かし、飽和ＮａＣ
ｌ（２００ｍＬ）で一度洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を蒸
発させ、表題化合物８５ｇ（９５％）を得た。

【００９６】Ｎ４−ベンゾイル−２' −Ｏ−メトキシエチル−５' −Ｏ−ジメトキシトリチ
ル−５−メチルシチジン２' −Ｏ−メトキシエチル−５' −Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチ
ジン（８５ｇ，０．１３４Ｍ）をＤＭＦ（８００ｍＬ）に溶かし、無水安息香酸
（３７．２ｇ，０．１６５Ｍ）を撹拌しながら加えた。３時間撹拌した後、ＴＬ
Ｃは反応が約９５％完了したことを示した。溶媒を蒸発させ、残渣をＭｅＯＨ（
２００ｍＬ）と共沸させた。ＣＨＣｌ₃（７００ｍＬ）に残渣を溶かし、飽和Ｎ
ａＨＣＯ₃（２ｘ３００ｍＬ）と飽和ＮａＣｌ（２ｘ３００ｍＬ）で抽出し、Ｍ
ｇＳＯ₄で乾燥し、蒸発させて残渣（９６ｇ）を得た。この残渣を、０．５％
Ｅｔ₃ＮＨを含有するＥｔＯＡｃ／ヘキサン（１：１）を溶出溶媒として使用す
る１．５ｋｇシリカゲルカラムでクロマトグラフ処理した。生成物の純粋な分画
を蒸発させて表題化合物９０ｇ（９０％）を得た。

【００９７】Ｎ４−ベンゾイル−２' −Ｏ−メトキシエチル−５' −Ｏ−ジメトキシトリチ
ル−５−メチルシチジン−３' −アミダイトＮ４−ベンゾイル−２' −Ｏ−メトキシエチル−５' −Ｏ−ジメトキシトリチ
ル−５−メチルシチジン（７４ｇ，０．１０Ｍ）をＣＨ₂Ｃｌ₂（１Ｌ）に溶か
した。テトラゾールジイソプロピルアミン（７．１ｇ）と２−シアノエトキシ−
テトラ（イソプロピル）亜リン酸塩（４０．５ｍＬ，０．１２３Ｍ）を撹拌しな
がら窒素環境下で加えた。得られた混合液を室温で２０時間撹拌した（ＴＬＣは
反応が約９５％完了したことを示した）。反応混合液を飽和ＮａＨＣＯ₃（１ｘ
３００ｍＬ）と飽和ＮａＣｌ（３ｘ３００ｍＬ）で抽出した。水性の洗浄液をＣ
Ｈ₂Ｃｌ₂（３００ｍＬ）で戻し抽出し、抽出物を合わせ、ＭｇＳＯ₄で乾燥し
、濃縮した。得られた残渣を、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（３：１）を溶出溶媒とし
て使用する１．５ｋｇのシリカゲルカラムでクロマトグラフ処理した。純粋な分
画を合わせて表題化合物９０．６ｇ（８７％）を得た。

【００９８】２' −Ｏ−（アミノオキシエチル）ヌクレオシドアミダイト及び２' −Ｏ−（ジ
メチルアミノオキシエチル）ヌクレオシドアミダイト２' −（ジメチルアミノオキシエトキシ）ヌクレオシドアミダイト２' −（ジメチルアミノオキシエトキシ）ヌクレオシドアミダイト［当技術分
野では２' −Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）ヌクレオシドアミダイトとし
ても知られる］は、以下のパラグラフに記載されるように製造する。アデノシン
、シチジン及びグアノシンヌクレオシドアミダイトはチミジン（５−メチルウリ
ジン）と同様に製造するが、ただし、環外アミンは、アデノシン及びシチジンの
場合はベンゾイル部分で、グアノシンの場合はイソブチリルで保護する。

【００９９】５' −Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−Ｏ²−２' −アンヒドロ−５
−メチルウリジンＯ²−２' −アンヒドロ−５−メチルウリジン（Ｐｒｏ．Ｂｉｏ．Ｓｉｎｔ．
，Ｖａｒｅｓｅ，イタリア、１００．０ｇ，０．４１６ミリモル）、ジメチルア
ミノピリジン（０．６６ｇ，０．０１３当量、０．００５４ミリモル）をアルゴ
ン環境下で機械的に撹拌させながら周囲温度で乾燥ピリジン（５００ｍｌ）に溶
かした。ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルクロロシラン（１２５．８ｇ，１１９．０
ｍＬ，１．１当量、０．４５８ミリモル）を一時に加えた。この反応液を周囲温
度で１６時間撹拌した。ＴＬＣ（Ｒｆ０．２２、酢酸エチル）は完全な反応を
示した。この溶液を減圧濃縮して濃い油状物とした。これをジクロロメタン（１
Ｌ）と飽和重炭酸ナトリウム（２ｘ１Ｌ）及び鹹水（１Ｌ）の間に分画した。有
機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧濃縮して濃い油状物とした。この油状物を
酢酸エチル及びエチルエーテルの１：１混合液（６００ｍＬ）に溶かし、この溶
液を−１０℃に冷やした。生じた結晶性の生成物を濾過により回収し、エチルエ
ーテル（３ｘ２００ｍＬ）で洗浄し、乾燥（４０℃，１ｍｍＨｇ，２４時間）さ
せて白色の固形物１４９ｇ（７４．８％）とした。ＴＬＣとＮＭＲは純粋な生成
物に一致していた。

【０１００】５' −Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２' −Ｏ−（２−ヒドロキシ
エチル）−５−メチルウリジン２Ｌのステンレス鋼製、固定式加圧反応器にボランのテトラヒドロフラン溶液
（１．０Ｍ，２．０当量、６２２ｍＬ）を加えた。ガス排出フード下に手動で撹
拌させながらエチレングリコール（３５０ｍＬ，過剰）を、初めは慎重に、水素
ガスの発生が止むまで加えた。５' −Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−
Ｏ²−２' −アンヒドロ−５−メチルウリジン（１４９ｇ，０．３１１モル）及
び重炭酸ナトリウム（０．０７４ｇ，０．００３当量）を手動で撹拌しながら加
えた。この反応器を密封し、内部温度が１６０℃に達するまで油浴で加熱し、次
いで１６時間維持した（圧力＜１００ｐｓｉｇ）。この反応器を周囲温度まで冷
やしてから開放した。ＴＬＣ（Ｒｆ０．６７：所望の生成物、Ｒｆ０．８２
：ａｒａ−Ｔの副生成物、酢酸エチル）は、生成物へ約７０％変換したことを示
した。さらなる副生成物の形成を避けるために、この反応を停止させ、減圧（１
０〜１ｍｍＨｇ）下、温水浴（４０〜１００℃）のより極端な条件を使用して濃
縮し、エチレングリコールを除去した。［他のやり方では、低沸点溶媒を除去し
たら、残った溶液を酢酸エチルと水との間に分画し得る。生成物は有機相にある
］カラムクロマトグラフィー（シリカゲル２ｋｇ、１：１〜４：１の酢酸エチル
−ヘキサン勾配液）により残渣を精製した。適切な分画を集め、軽質分を除去し
、乾燥させて白色のカリカリとした泡状物として、出発材料（１７．４ｇ）が混
在した生成物（８４ｇ，５０％）と、純粋な再使用し得る出発材料２０ｇを得た
。出発材料（回収されたより不純な出発材料）に基づいた収率は５８％であった
。ＴＬＣ及びＮＭＲは９９％の純生成物に一致していた。

【０１０１】２' −Ｏ−［（２−フタルイミドキシ）エチル］−５' −ｔ−ブチルジフェニ
ルシリル−５−メチルウリジン５' −Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２' −Ｏ−（２−ヒドロキシ
エチル）−５−メチルウリジン（２０ｇ，３６．６８ミリモル）をトリフェニル
ホスフィン（１１．６３ｇ，４４．３６ミリモル）及びＮ−ヒドロキシフタルイ
ミド（７．２４ｇ，４４．３６ミリモル）と混合した。次いで、４０℃で２日間
、高真空下、Ｐ₂Ｏ₅上で乾燥した。この反応混合液にアルゴンを通し、乾燥Ｔ
ＨＦ（３６９．８ｍＬ，アルドリッチ、密封ボトル）を加えて澄明な溶液を得た
。この反応混合液へジエチルアゾジカルボキシレート（６．９８ｍＬ，４４．３
６ミリモル）を１滴づつ加えた。滴加の速度は、生成する深赤の発色が丁度消え
てから次の一滴を加えるように維持する。この滴加が完了してから、この反応液
を４時間撹拌した。そのときまでに、ＴＬＣ（酢酸エチル：ヘキサン、６０：４
０）は、反応の完了を示した。真空で溶媒を蒸発させた。得られた残渣をフラッ
シュカラムにかけ、酢酸エチル：ヘキサン（６０：４０）で溶出させ、２' −Ｏ
−［（２−フタルイミドキシ）エチル］−５' −ｔ−ブチルジフェニルシリル−
５−メチルウリジン（２１．８１９ｇ，８６％）を白色の泡状物として得た。

【０１０２】５' −Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２' −Ｏ−［（２−ホルムア
ルドキシミノオキシ）エチル］−５−メチルウリジン２' −Ｏ−［（２−フタルイミドキシ）エチル］−５' −ｔ−ブチルジフェニ
ルシリル−５−メチルウリジン（３．１ｇ，４．５ミリモル）を乾燥ＣＨ₂Ｃｌ ₂ （４．５ｍＬ）に溶かし、メチルヒドラジン（３００ｍＬ，４．６４ミリモル
）を−１０℃〜０℃で滴加した。１時間後、この混合液を濾過し、濾液を氷冷Ｃ
Ｈ₂Ｃｌ₂で洗浄し、合わせた有機相を水、鹹水で洗浄し、無水Ｎａ₂ＳＯ₄で
乾燥させた。この溶液を濃縮して、２' −Ｏ−（アミノオキシエチル）チミジン
を得て、次いでこれをＭｅＯＨ（６７．５ｍＬ）に溶かした。これにホルムアル
デヒド（２０ｗ／ｗ％水溶液、１．１当量）を加え、得られた混合液を１時間撹
拌した。溶媒を真空下で除去し、残渣をクロマトグラフ処理して５' −Ｏ−ｔｅ
ｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２' −Ｏ−［（２−ホルムアルドキシミノオキ
シ）エチル］−５−メチルウリジン（１．９５ｇ，７８％）を白色の泡状物とし
て得た。

【０１０３】５' −Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２' −Ｏ−［Ｎ，Ｎ−ジメチ
ルアミノオキシエチル］−５−メチルウリジン５' −Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２' −Ｏ−［（２−ホルムア
ルドキシミノオキシ）エチル］−５−メチルウリジン（１．７７ｇ，３．１２ミ
リモル）を、ｐ−トルエンスルホン酸ピリジニウム（ＰＰＴＳ）の１Ｍ乾燥Ｍｅ
ＯＨ溶液（３０．６ｍＬ）に溶かした。この溶液へ、不活性気体下、１０℃でシ
アノホウ酸水素ナトリウム（０．３９ｇ，６．１３ミリモル）を加えた。この反
応混合液を１０℃で１０分間撹拌した。その後、氷浴からこの反応容器を取り出
し、ＴＬＣ（５％ＭｅＯＨ／ＣＨ₂Ｃｌ₂)により反応をモニターしながら、室
温で２時間撹拌した。ＮａＨＣＯ₃水溶液（５％，１０ｍＬ）を加え、酢酸エチ
ル（２ｘ２０ｍＬ）で抽出した。酢酸エチル相を無水Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥させ、
蒸発乾固させた。１ＭＰＰＴＳ／ＭｅＯＨ溶液（３０．６ｍＬ）に残渣を溶か
した。ホルムアルデヒド（２０ｗ／ｗ％，３０ｍＬ，３．３７ミリモル）を加え
、この反応混合液を室温で１０分間撹拌した。反応混合液を氷浴で１０℃へ冷却
し、シアノホウ酸水素ナトリウム（０．３９ｇ，６．１３ミリモル）を加え、反
応混合液を１０℃で１０分間撹拌した。１０分後、反応混合液を氷浴から取り出
し、室温で２時間撹拌した。この反応混合液へ５％ＮａＨＣＯ₃溶液（２５ｍ
Ｌ）を加え、酢酸エチル（２ｘ２５ｍＬ）で抽出した。酢酸エチル層を無水Ｎａ ₂ ＳＯ₄で乾燥させ、蒸発乾固させた。得られた残渣をフラッシュカラムクロマ
トグラフィーで精製し、５％ＭｅＯＨ／ＣＨ₂Ｃｌ₂で溶出させ、５' −Ｏ−
ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２' −Ｏ−［Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノオキ
シエチル］−５−メチルウリジン（１４．６ｇ，８０％）を白色の泡状物として
得た。

【０１０４】２' −Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジントリエチルアミントリヒドロフルオリド（３．９１ｍＬ，２４．０ミリモル）
を乾燥ＴＨＦ及びトリエチルアミン（１．６７ｍＬ，１２ミリモル、乾燥品、Ｋ
ＯＨ上に保管）に溶かした。次いで、このトリエチルアミン−２ＨＦの混合液を
５' −Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２' −Ｏ−［Ｎ，Ｎ−ジメチル
アミノオキシエチル］−５−メチルウリジン（１．４０ｇ，２．４ミリモル）へ
加え、室温で２４時間撹拌した。反応はＴＬＣ（５％ＭｅＯＨ／ＣＨ₂Ｃｌ₂)
によりモニターした。溶媒を真空除去し、残渣をフラッシュカラムにかけ、１０
％ＭｅＯＨ／ＣＨ₂Ｃｌ₂で溶出させて、２' −Ｏ−（ジメチルアミノオキシ
エチル）−５−メチルウリジン（７６６ｍｇ，９２．５％）を得た。

【０１０５】５' −Ｏ−ＤＭＴ−２' −Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチル
ウリジン２' −Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン（７５０ｍ
ｇ，２．１７ミリモル）を、４０℃で一晩、高真空下、Ｐ₂Ｏ₅上で乾燥させた
。次いで、無水ピリジン（２０ｍＬ）と共沸させた。得られた残渣をアルゴン気
体下でピリジン（１１ｍＬ）に溶かした。この混合液へ、４−ジメチルアミノピ
リジン（２６．５ｍｇ，２．６０ミリモル）、４，４' −ジメトキシトリチルク
ロリド（８８０ｍｇ，２．６０ミリモル）を加え、この反応混合液を出発物質が
すべて消失するまで室温で撹拌した。ピリジンを真空除去し、残渣をクロマトグ
ラフ処理し、１０％ＭｅＯＨ／ＣＨ₂Ｃｌ₂（ピリジン数滴を含有する）で溶
出させて、５' −Ｏ−ＤＭＴ−２' −Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）−５
−メチルウリジン（１．１３ｇ，８０％）を得た。

【０１０６】５' −Ｏ−ＤＭＴ−２' −Ｏ−（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノオキシエチル）
−５−メチルウリジン−３' −［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピ
ルホスホロアミダイト］５' −Ｏ−ＤＭＴ−２' −Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチル
ウリジン（１．０８ｇ，１．６７ミリモル）をトルエン（２０ｍＬ）と共沸させ
た。この残渣へＮ，Ｎ−ジイソプロピルアミンテトラゾリド（０．２９ｇ，１．
６７ミリモル）を加え、４０℃で一晩、高真空下、Ｐ₂Ｏ₅上で乾燥させた。次
いで、この反応混合液を無水アセトニトリル（８．４ｍＬ）に溶かし、２−シア
ノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ¹，Ｎ¹−テトライソプロピルホスホロアミダイト（２．
１２ｍＬ，６．０８ミリモル）を加えた。この反応混合液を、不活性気体の下、
周囲温度で４時間撹拌した。反応の進行はＴＬＣ（へキサン：酢酸エチル、１：
１）によりモニターした。溶媒を蒸発させ、残渣を酢酸エチル（７０ｍＬ）に溶
かし、５％ＮａＨＣＯ₃水溶液（４０ｍＬ）で洗浄した。酢酸エチル層を無水
Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥させて、濃縮した。得られた残渣をクロマトグラフ処理し（
溶出液：酢酸エチル）、５' −Ｏ−ＤＭＴ−２' −Ｏ−（２−Ｎ，Ｎ−ジメチル
アミノオキシエチル）−５−メチルウリジン−３' −［（２−シアノエチル）−
Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト］（１．０４ｇ，７４．９％）を泡
状物として得た。

【０１０７】２' −（アミノオキシエトキシ）ヌクレオシドアミダイト２' −（アミノオキシエトキシ）ヌクレオシドアミダイト［当技術分野では２
' −Ｏ−（アミノオキシエチル）ヌクレオシドアミダイトとしても知られる］は
、以下のパラグラフに記載されるように製造する。アデノシン、シチジン及びチ
ミジンのヌクレオシドアミダイトも同様に製造する。

【０１０８】Ｎ２−イソブチリル−６−Ｏ−ジフェニルカルバモイル−２' −Ｏ−（２−エ
チルアセチル）−５' −Ｏ−（４，４' −ジメトキシトリチル）グアノシン−３
' −［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト］２' −Ｏ−アミノオキシエチルグアノシン類似体は、ジアミノプリンリボシド
の選択的２' −Ｏ−アルキル化により得ることが可能である。数グラム量のジア
ミノプリンリボシドは、微量の３' −Ｏ−異性体を含む２' −Ｏ−（２−エチル
アセチル）ジアミノプリンリボシドを提供するシェーリングＡＧ（ベルリン）か
ら購入し得る。２' −Ｏ−（２−エチルアセチル）ジアミノプリンリボシドは、
アデノシンデアミナーゼを用いた処理により分解して２' −Ｏ−（２−エチルア
セチル）グアノシンへ変換し得る（McGee, D. P. C., Cook, P. D., Guinosso,
C. J.,ＷＯ９４／０２５０１Ａ１９４０２０３）。標準的な保護法により、
２' −Ｏ−（２−エチルアセチル）−５' −Ｏ−（４，４' −ジメトキシトリチ
ル）グアノシン及び２−Ｎ−イソブチリル−６−Ｏ−ジフェニルカルバモイル−
２' −Ｏ−（２−エチルアセチル）−５' −Ｏ−（４，４' −ジメトキシトリチ
ル）グアノシンが提供され、後者を還元すると２−Ｎ−イソブチリル−６−Ｏ−
ジフェニルカルバモイル−２' −Ｏ−（２−エチルアセチル）−５' −Ｏ−（４
，４' −ジメトキシトリチル）グアノシンになる。従来のように、ヒドロキシル
基は Mitsunobu反応を介してＮ−ヒドロキシフタルイミドにより置換され、保護
化されたヌクレオシドは通常のようにホスフィチル化されて、２−Ｎ−イソブチ
リル−６−Ｏ−ジフェニルカルバモイル−２' −Ｏ−（２−エチルアセチル）−
５' −Ｏ−（４，４' −ジメトキシトリチル）グアノシン−３' −［（２−シア
ノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト］を産生し得る。

【０１０９】実施例２オリゴヌクレオチド合成未置換及び置換ホスホジエステル（Ｐ＝Ｏ）オリゴヌクレオチドは、ヨウ素酸
化による標準的なホスホロアミダイト化学を使用する自動ＤＮＡ合成機（Ａｐｐ
ｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，モデル３８０Ｂ）で合成する。ホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）はホスホジエステルオリゴヌクレオチドと同様
に合成するが、標準酸化ボトルを、亜リン酸連結の段階的チオエート化（thiati
on）に用いる３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン−１，１−ジオキシド
の０．２Ｍアセトニトリル溶液に置き換えた。チオエート化の待ち工程を６８秒
まで高め、キャッピング工程を続けた。ＣＰＧカラムから分離し、濃水酸化アン
モニウムにて５５℃（１８時間）で脱保護化した後、０．５ＭＮａＣｌ溶液か
ら２．５倍量のエタノールで２度沈殿させることによって、オリゴヌクレオチド
を精製した。オリゴヌクレオチドのホスフィン酸塩は、参照により本明細書に組
込まれている米国特許第５，５０８，２７０号に記載のように製造する。ホスホン酸アルキルオリゴヌクレオチドは、参照により本明細書に組込まれて
いる米国特許第４，４６９，８６３号に記載のように製造する。３' −デオキシ−３' −メチレンホスホン酸オリゴヌクレオチドは、参照によ
り本明細書に組込まれている米国特許第５，６１０，２８９号又は第５，６２５
，０５０号に記載のように製造する。

【０１１０】ホスホロアミダイト・オリゴヌクレオチドは、参照により本明細書に組込まれ
ている米国特許第５，２５６，７７５号又は第５，３６６，８７８号に記載のよ
うに製造する。アルキルホスホノチオエート・オリゴヌクレオチドは、参照により本明細書に
組込まれている、公知のＰＣＴ出願、ＰＣＴ／ＵＳ９４／００９０２号及びＰＣ
Ｔ／ＵＳ９３／０６９７６号（それぞれ、ＷＯ９４／１７０９３号及びＷＯ９４
／０２４９９号として公開）に記載のように製造する。３' −デオキシ−３' −アミノホスホロアミダイト・オリゴヌクレオチドは、
参照により本明細書に組込まれている米国特許第５，４７６，９２５号に記載の
ように製造する。ホスホトリエステルオリゴヌクレオチドは、参照により本明細書に組込まれて
いる米国特許第５，０２３，２４３号に記載のように製造する。ボラノリン酸オリゴヌクレオチドは、いずれも参照により本明細書に組込まれ
ている米国特許第５，１３０，３０２号及び第５，１７７，１９６号に記載のよ
うに製造する。

【０１１１】実施例３オリゴヌクレオシド合成メチレンメチルイミノ連結オリゴヌクレオシド（ＭＭＩ連結オリゴヌクレオシ
ド）、メチレンジメチルヒドラゾ連結オリゴヌクレオシド（ＭＤＨ連結オリゴヌ
クレオシド）及びメチレンカルボニルアミノ連結オリゴヌクレオシド（アミド−
３連結オリゴヌクレオシド）、及びメチレンアミノカルボニル連結オリゴヌクレ
オシド（アミド−４連結オリゴヌクレオシド）、並びに、例えばＭＭＩとＰ＝Ｏ
又はＰ＝Ｓ連結を交替的に有する混在した骨格の化合物は、いずれも参照により
本明細書に組込まれている米国特許第５，３７８，８２５号、第５，３８６，０
２３号、第５，４８９，６７７号、５，６０２，２４０号及び第５，６１０，２
８９号に記載のように製造する。ホルムアセタール及びチオホルムアセタール連結オリゴヌクレオシドは、参照
により本明細書に組込まれている米国特許第５，２６４，５６２号及び５，２６
４，５６４号に記載のように製造する。酸化エチレン連結オリゴヌクレオシドは、参照により本明細書に組込まれてい
る米国特許第５，２２３，６１８号に記載のように製造する。

【０１１２】実施例４ＰＮＡ合成ペプチド核酸（ＰＮＡ）は、Peptide Nucleic Acids (PNA) : Synthesis, Pro
perties and Potential Applications, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 19
96, 4, 5-23 に参照される様々な方法により製造される。それはまた、参照によ
り本明細書に組込まれている米国特許第５，５３９，０８２号、５，７００，９
２２号、及び第５，７１９，２６２号によっても製造し得る。

【０１１３】実施例５キメラオリゴヌクレオチドの合成本発明のキメラオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド又はオリゴヌクレオ
チド／オリゴヌクレオシドの混合物は、いくつかの異なるタイプであり得る。こ
れには、連結ヌクレオシドの「ギャップ」セグメントが連結ヌクレオシドの５'
及び３' 「ウィング」セグメントの間に位置する第一のタイプ、及び「ギャップ
」セグメントがオリゴマー化合物の３' 末端か５' 末端のいずれかに位置する第
二の「オープンエンド」タイプがある。第一のタイプのオリゴヌクレオチドは、
当技術分野では「ギャップマー」又はギャップのあるオリゴヌクレオチドとして
も知られている。第二のタイプのオリゴヌクレオチドは、当技術分野では「ヘミ
マー」又は「ウィングマー」としても知られている。

【０１１４】［２' −Ｏ−Ｍｅ］−−［２' −デオキシ］−−［２' −Ｏ−Ｍｅ］キメラホ
スホロチオエートオリゴヌクレオチド２' −Ｏ−アルキルホスホロチオエート及び２' −デオキシホスホロチオエー
トオリゴヌクレオチドのセグメントを有するキメラオリゴヌクレオチドは、上記
のようにＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓの自動ＤＮＡ合成機、Ｍｏｄｅ
ｌ３８０Ｂを用いて合成される。ＤＮＡ部分は２' −デオキシ−５' −ジメト
キシトリチル−３' −Ｏ−ホスホロアミダイト、５' 及び３' ウィングは５' −
ジメトキシトリチル−２' −Ｏ−メチル−３' −Ｏ−ホスホロアミダイトとし、
自動合成機を用いてオリゴヌクレオチドを合成する。標準合成サイクルを変更し
てテトラゾール及び塩基のデリバリー後の待ち工程を６００秒に高め、ＲＮＡに
ついては４回、２' −Ｏ−メチルについては２回繰り返す。完全に保護化したオ
リゴヌクレオチドを支持体から分離し、室温で一晩、３：１アンモニア水／エタ
ノールにおいてリン酸基を脱保護化し、次いで凍結乾燥して乾固させる。室温で
２４時間、メタノール性アンモニア水において処理し、すべての塩基を脱保護化
した後、サンプルを再び凍結乾燥して乾固させる。室温で２４時間、１ＭＴＢ
ＡＦ／ＴＨＦにてペレットを再懸濁し、２' 位を脱保護化する。次いでこの反応
液を１ＭＴＥＡＡで急冷し、次いで半分の容積までサンプルを減圧濃縮した後
、Ｇ２５サイズ排除カラムで脱塩する。回収したオリゴヌクレオチドの収量と純
度を、毛管電気泳動と質量分析によって分光学的に分析する。

【０１１５】［２' −Ｏ−（２−メトキシエチル）］−−［２' −デオキシ］−−［２' −
Ｏ−（メトキシエチル）］キメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチド［２' −Ｏ−（２−メトキシエチル）］−−［２' −デオキシ］−−［２' −
Ｏ−（メトキシエチル）］キメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、２
' −Ｏ−メチルキメラオリゴヌクレオチドの上記方法と同じようにして製造した
が、２' −Ｏ−メチルアミダイトを２' −Ｏ−（メトキシエチル）アミダイトに
置き換えた。

【０１１６】［２' −Ｏ−（２−メトキシエチル）ホスホジエステル］−−［２' −デオキ
シホスホロチオエート］−−［２' −Ｏ−（２−メトキシエチル）ホスホジエス
テル］キメラオリゴヌクレオチド［２' −Ｏ−（２−メトキシエチル）ホスホジエステル］−−［２' −デオキ
シホスホロチオエート］−−［２' −Ｏ−（２−メトキシエチル）ホスホジエス
テル］キメラオリゴヌクレオチドは、２' −Ｏ−メチルキメラオリゴヌクレオチ
ドの上記方法と同じようにして製造するが、２' −Ｏ−（メトキシエチル）アミ
ダイトを２' −Ｏ−メチルアミダイトに置き換える。ヨウ素酸化によりキメラ構
造のウィング部分内にホスホジエステルのヌクレオチド間連結が生じ、３Ｈ−１
，２−ベンゾジチオール−３−オン−１，１−ジオキシド（Ｂｅａｕｃａｇｅ試
薬）を利用するスルフリル化により中央ギャップにホスホロチオエートのヌクレ
オチド間連結が生じる。他のキメラオリゴヌクレオチド、キメラオリゴヌクレオシド、及びキメラオリ
ゴヌクレオチド／オリゴヌクレオシドの混合物は、参照により本明細書に組込ま
れている米国特許第５，６２３，０６５号により合成する。

【０１１７】実施例６オリゴヌクレオチドの単離制御孔ガラスカラム（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）から分離し、
５５℃で１８時間、濃水酸化アンモニウムにて脱保護化した後、オリゴヌクレオ
チド又はオリゴヌクレオシドを、２．５倍量のエタノールで０．５ＭＮａＣｌ
から２度沈殿させて精製する。合成されたオリゴヌクレオチドを変性ゲル上のポ
リアクリルアミドゲル電気泳動により分析し、少なくとも８５％は完全な長さの
物質であると判定された。合成で得られるホスホロチオエートとホスホジエステ
ル連結の相対量を³¹Ｐ核磁気共鳴分光法によって一定時間ごとに検査し、試験に
よっては、Chiang et al．，J ．Biol．Chem. 1991, 266, 18162-18171に記載の
ように、ＨＰＬＣにより精製した。ＨＰＬＣで精製した物質について得られた結
果は、ＨＰＬＣで精製しなかった物質について得られたものと同様であった。

【０１１８】実施例７オリゴヌクレオチド合成−９６穴プレートフォーマットオリゴヌクレオチドは、標準９６穴フォーマットで９６種の配列を同時に組立
て得る自動合成機にて固相Ｐ（ＩＩＩ）ホスホロアミダイト化学を介して合成し
た。ホスホジエステルのヌクレオチド間連結は、水性ヨウ素を用いた酸化によっ
て供された。ホスホロチオエートのヌクレオチド間連結は、３Ｈ−１，２−ベン
ゾジチオール−３−オン−１，１−ジオキシド（Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬）の無水
アセトニトリル溶液を利用するスルフリル化により産生した。塩基が保護された
β−シアノエチルジイソプロピルホスホロアミダイトの標準品は市販ベンダー（
例えば、ＰＥ−ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、フォスターシティ、Ｃ
Ａ又はファルマシア、ピスカタウェイ、ＮＪ）より購入した。非標準ヌクレオシ
ドは、既知の文献又は特許の方法により合成する。それらは塩基保護化β−シア
ノエチルジイソプロピルホスホロアミダイトとして利用される。オリゴヌクレオチドを支持体から分離し、１２〜１６時間、高温（５５〜６０
℃）で濃ＮＨ₄ＯＨを用いて脱保護化し、次いで遊離した生成物を真空乾燥した
。乾燥させた生成物を滅菌水に再懸濁し、マスタープレートに入れる。ロボット
ピペッターを利用してこれを希釈し、分析及び試験用のプレートサンプルとする
。

【０１１９】実施例８オリゴヌクレオチド分析−９６穴プレートフォーマット各穴のオリゴヌクレオチド濃度を、サンプル希釈とＵＶ吸収の分光分析により
評価した。各生成物について、完全長の程度を９６穴フォーマット（ベックマン
Ｐ／ＡＣＥ^TM ＭＤＱ）で、又は個別に製造したサンプルについては、市販の
ＣＥ装置（例、ベックマンＰ／ＡＣＥ^TM ５０００，ＡＢＩ２７０）のいず
れかで、毛管電気泳動（ＣＥ）により評価した。塩基と骨格の組成はエレクトロ
スプレー質量分析法を利用する化合物の質量分析によって確認した。すべてのア
ッセイ試験プレートは、単数／複数チャンネルロボットピペッターを用いてマス
タープレートから希釈した。プレート上の化合物の少なくとも８５％が少なくと
も８５％完全な長さであれば、そのプレートは許容されると判定した。

【０１２０】実施例９細胞培養とオリゴヌクレオチド処理標的核酸の発現に対するアンチセンス化合物の効果は、標的核酸が測定可能レ
ベルで存在していれば、多種多様な細胞型で試験し得る。これは、例えばＰＣＲ
又はノーザンブロット分析を用いて型通りに定量し得る。以下の４種の細胞型は
説明用に供するのであって、他の細胞型も型通りに使用し得る。

【０１２１】Ｔ−２４細胞：移行細胞である膀胱ガン細胞系、Ｔ−２４は、アメリカン・タイプ・カルチャ
ー・コレクション（ＡＴＣＣ）（マナッサス、ＶＡ）から入手した。Ｔ−２４細
胞は、１０％ウシ胎仔血清（ギブコ／ライフテクノロジーズ、ゲイサースバーグ
、ＭＤ）、ペニシリン１００ユニット／ｍＬ及びストレプトマイシン１００マイ
クログラム／ｍＬ（ギブコ／ライフテクノロジーズ、ゲイサースバーグ、ＭＤ）
を補充した完全マッコイ５Ａ基底培地（ギブコ／ライフテクノロジーズ、ゲイサ
ースバーグ、ＭＤ）において型通りに培養した。細胞は、９０％の集密度に達し
たとき、トリプシン処理と希釈により型通りに継代した。ＲＴ−ＰＣＲ分析にお
ける使用では、７０００細胞／穴の密度で細胞を９６穴プレート（Ｆａｌｃｏｎ
−Ｐｒｉｍａｒｉａ＃３８７２）にまいた。ノーザンブロットや他の分析では、１００ｍｍ又は他の標準組織培養プレート
上に細胞をまいて、適量の培地とオリゴヌクレオチドを使用して、同様に処理し
得る。

【０１２２】Ａ５４９細胞：ヒト肺癌細胞系、Ａ５４９は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクショ
ン（ＡＴＣＣ）（マナッサス、ＶＡ）から入手した。Ａ５４９細胞は、１０％ウ
シ胎仔血清（ギブコ／ライフテクノロジーズ、ゲイサースバーグ、ＭＤ）、ペニ
シリン１００ユニット／ｍＬ、及びストレプトマイシン１００μｇ／ｍＬ（ギブ
コ／ライフテクノロジーズ、ゲイサースバーグ、ＭＤ）を補充したＤＭＥＭ基底
培地（ギブコ／ライフテクノロジーズ、ゲイサースバーグ、ＭＤ）において型通
りに培養した。細胞は、９０％の集密度に達したとき、トリプシン処理と希釈に
よって型通りに継代した。

【０１２３】ＮＨＤＦ細胞：ヒト新生児皮膚繊維芽細胞（ＮＨＤＦ）は、クローンティクスコーポレーショ
ン（ウォーカーズビル、ＭＤ）から入手した。ＮＨＤＦは、サプライヤーの推奨
通り、繊維芽細胞増殖培地（クローンティクスコーポレーション、ウォーカーズ
ビル、ＭＤ）において型通りに維持した。サプライヤーの推奨通り、細胞の継代
培養は１０回までとした。

【０１２４】ＨＥＫ細胞：ヒト胚ケラチノサイト（ＨＥＫ）は、クローンティクスコーポレーション（ウ
ォーカーズビル、ＭＤ）から入手した。ＨＥＫは、サプライヤーの推奨通りに調
製したケラチノサイト増殖培地（クローンティクスコーポレーション、ウォーカ
ーズビル、ＭＤ）において型通りに維持した。サプライヤーの推奨通り、細胞の
定常的な継代培養は１０回までとした。アンチセンス化合物を用いた処理：細胞が８０％の集密度に達してから、オリゴヌクレオチドにより処理した。９
６穴プレートで増殖した細胞については、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ^TM−１減血清培地（
ギブコＢＲＬ）２００μＬで穴を一度洗浄した後、次いでＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ ^TM （ギブコＢＲＬ）３．７５μｇ／ｍＬ含有Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ^TM−１の１３０μ
ｌ、及び最終濃度１５０ｎＭの所望されるオリゴヌクレオチドで処理した。４時
間の処理の後、もとの培地を新鮮な培地に代えた。オリゴヌクレオチド処理から
１６時間後に細胞を回収した。

【０１２５】実施例１０アポトーシス−１の細胞性阻害物質の発現のオリゴヌクレオチドによる阻害の分
析アポトーシス−１の細胞性阻害物質の発現のアンチセンスモジュレーションは
当技術分野で知られている様々な方法でアッセイし得る。例えば、ノーザンブロ
ット分析、競合的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、又はリアルタイムＰＣＲ（
ＲＴ−ＰＣＲ）によって、アポトーシス−１の細胞性阻害物質のｍＲＮＡレベル
を定量し得る。現時点で好ましいのはリアルタイム定量的ＰＣＲである。ＲＮＡ
分析は、細胞の全ＲＮＡか又はポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡに基づいて実施し得る。Ｒ
ＮＡの単離法は、例えば、Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Mole
cular Biology, Volume 1, pp. 4. 1. 1-4. 2. 9とpp. 4. 5. 1-4. 5. 3, John
Wiley & Sons, Inc., 1993に教示されている。ノーザンブロット分析は当技術分
野のルーチン作業であり、例えば、Ausubel, F. M. et al., Current Protocols
in Molecular Biology, Volume 1, pp. 4. 2. 1-4. 2. 9, John Wiley & Sons,
Inc., 1996 に教示されている。リアルタイム定量的（ＰＣＲ）は、市販のＡＢ
ＩＰＲＩＳＭ^TM ７７００配列検出システム（ＰＥ−ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏ
ｓｙｓｔｅｍｓ，フォスターシティ、ＣＡより入手可能）を製造業者の指示書に
よって使用して、簡便に達成し得る。他のＰＣＲ法もまた当技術分野で知られて
いる。

【０１２６】アポトーシス−１の細胞性阻害物質タンパク質のレベルは、免疫沈降法、ウェ
スタンブロット分析（イムノブロッティング）、ＥＬＩＳＡ又は蛍光活性化細胞
ソーティング（ＦＡＣＳ）のような当技術分野でよく知られている様々な方法で
定量し得る。アポトーシス−１の細胞性阻害物質に対する抗体は、ＭＳＲＳの抗
体カタログ（ＡｅｒｉｅＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，バーミンガム、ＭＩ）のよ
うな様々な供給元から確認して入手し得るか、又は従来の抗体産生法により製造
し得る。ポリクローナル抗血清の調製法は、例えば、Ausubel,F. M. et al., Cu
rrent Protocols in Molecular Biology, Volume 2, pp. 11. 12. 1-11. 12. 9,
John Wiley & Sons, Inc., 1997に教示されている。モノクローナル抗体の調製
は、例えば、Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biolog
y, Volume 2, pp. 11. 4. 1-11. 11. 5, John Wiley & Sons, Inc., 1997に教示
されている。

【０１２７】免疫沈降法は当技術分野の標準法であり、例えば、Ausubel, F. M. et al., C
urrent Protocols in Molecular Biology, Volume 2, pp. 10. 16. 1-10. 16. 1
1, John Wiley & Sons, Inc., 1998に見出し得る。ウェスタンブロット（イムノ
ブロット）分析は当技術分野の標準法であり、例えば、Ausubel, F. M. et al.,
Current Protocols in Molecular Biology, Volume 2, pp. 10. 8. 1-10. 8. 2
1, John Wiley & Sons, Inc., 1997に見出し得る。酵素結合性免疫吸着剤検定（
ＥＬＩＳＡ）は当技術分野の標準法であり、例えば、Ausubel, F. M. et al., C
urrent Protocols in Molecular Biology, Volume 2, pp. 11. 2. 1-11. 2. 22,
John Wiley & Sons, Inc., 1991に見出し得る。

【０１２８】実施例１１ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡの単離ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡは、Miura et al., Clin. Chem., 1996, 42, 1758-1764
により単離した。ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡを単離する他の方法は、例えば、Ausube
l, F. M. et al.,Current Protocols in Molecular Biology, Volume 1, pp. 4.
5. 1-4. 5. 3, John Wiley & Sons, Inc., 1993に教示されている。簡略に言う
と、９６穴プレートで増殖した細胞について、細胞から増殖培地を除去し、冷Ｐ
ＢＳ２００μｌで各穴を洗浄した。溶解緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ，
ｐＨ７．６、１ｍＭＥＤＴＡ、０．５ＭＮａＣｌ、０．５％ＮＰ−４０、
２０ｍＭバナジル−リボヌクレオシド複合体）６０μＬを各穴に加え、プレー
トを穏やかに揺り動かし、次いで室温で５分間インキュベートした。Ｏｌｉｇｏ
ｄ（Ｔ）でコートした９６穴プレート（ＡＧＣＴ社、アーヴィン、ＣＡ）へ溶
解液５５μｌを移した。プレートを室温で６０分間インキュベートし、洗浄緩衝
液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．６、１ｍＭＥＤＴＡ、０．３ＭＮ
ａＣｌ）２００μｌで３回洗浄した。最終洗浄後、プレートをペーパータオルに
吸い取らせて過剰な洗浄緩衝液を除去し、次いで５分間空気乾燥した。前もって
７０℃に加熱した溶出緩衝液（５ｍＭトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．６）６０μｌ
を各穴に加え、５分間、９０℃のホットプレート上でプレートをインキュベート
し、次いでこの溶出液を新鮮な９６穴プレートへ移した。１００ｍｍ又は他の標準プレート上で増殖した細胞も、すべての溶液を適量使
用して、同様に処理し得る。

【０１２９】実施例１２全ＲＮＡの単離ＱｉａｇｅｎＩｎｃ．（バレンシア、ＣＡ）から購入したＲＮＥＡＳＹ９
６^TMのキット及び緩衝液を使用し、製造業者の推奨法に従って、全ｍＲＮＡを単
離した。簡略に言うと、９６穴プレートで増殖した細胞について、細胞から増殖
培地を除去し、冷ＰＢＳ２００μＬで各穴を洗浄した。ＢｕｆｆｅｒＲＬＴ
１００μＬを各穴へ加え、プレートを２０秒間激しく揺り動かした。次いで、
７０％エタノール１００μＬを加え、この内容物を吸ったり出したりのピペッテ
ィング操作を３回することによって混合した。排液回収トレイが付いて真空源と
つながっているＱＩＡＶＡＣ^TMマニホルドに付いたＲＮＥＡＳＹ９６^TM穴プレ
ートへサンプルを移した。真空を１５秒かけた。ＲＮＥＡＳＹ９６^TM穴プレー
トの各穴へＢｕｆｆｅｒＲＷ１１ｍＬを加え、再び真空を１５秒かけた。次
いで、ＲＮＥＡＳＹ９６^TM穴プレートの各穴へＢｕｆｆｅｒＲＰＥ１ｍＬ
を加え、真空を１５秒かけた。次いでＢｕｆｆｅｒＲＰＥの洗浄を繰り返し、
真空をさらに１０分かけた。次いでＱＩＡＶＡＣ^TMマニホルドからプレートを除
去し、ペーパータオルで吸い取って乾燥させた。１．２ｍＬ回収管の入った回収
管ラックが付いたＱＩＡＶＡＣ^TMマニホルドにプレートを再び付けた。水６０μ
Ｌを各穴へピペッティングし、１分インキュベートし、次いで真空を３０秒かけ
ることによってＲＮＡを溶出させた。さらに水６０μＬを用いて溶出工程を繰り
返した。

【０１３０】実施例１３アポトーシス−１の細胞性阻害物質・ｍＲＮＡレベルのリアルタイム定量的ＰＣ
Ｒ分析ＡＢＩＰＲＩＳＭ^TM ７７００配列検出システム（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、フォスターシティ、ＣＡ）を用いるリアルタイム定量的
ＰＣＲにより、製造業者の指示書に従ってアポトーシス−１の細胞性阻害物質の
ｍＲＮＡレベルを定量した。これは封管の、ゲルをベースとしない蛍光検出シス
テムであり、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）生成物をリアルタイムでハイスル
ープット定量することを可能にする。ＰＣＲ完了後に増幅生成物を定量する標準
ＰＣＲとは異なり、リアルタイム定量的ＰＣＲの生成物は、蓄積すると同時に定
量される。このことは、前方及び後方ＰＣＲプライマーとの間で特異的にアニー
ルし、２種の蛍光色素を含有するオリゴヌクレオチドプローブをＰＣＲ反応に包
含することによって達成される。プローブの５' 末端にレポーター色素（例、Ｊ
ＯＥ又はＦＡＭ，ＯｐｅｒｏｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＩｎｃ．，アラメ
ダ、ＣＡ又はＰＥ−ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，フォスターシティ
、ＣＡのいずれかより入手）を付け、プローブの３' 末端にはクエンチャー（ｑ
ｕｅｎｃｈｅｒ）色素（例、ＴＡＭＲＡ，ＯｐｅｒｏｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉ
ｅｓＩｎｃ．，アラメダ、ＣＡ又はＰＥ−ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅ
ｍｓ，フォスターシティ、ＣＡのいずれかより入手）を付ける。プローブと色素
がインタクトであれば、３' クエンチャー色素が近傍にあるためにレポーター色
素の放出が抑制される。増幅の間、プローブの標的配列へのアニーリングにより
、Ｔａｑポリメラーゼの５' −エクソヌクレアーゼ活性により開裂し得る基質が
生成する。ＰＣＲ増幅サイクルの伸張期では、Ｔａｑポリメラーゼによるプロー
ブの開裂で、プローブの残り部分から（同時にクエンチャー部分からも）レポー
ター色素が放出され、配列特有の蛍光シグナルが産生される。各サイクルごとに
、それぞれのプローブから追加のレポーター色素分子が開裂し、ＡＢＩＰＲＩ
ＳＭ^TM ７７００配列検出システムに組込まれたレーザー光により一定（６秒）
間隔で蛍光強度がモニターされる。それぞれのアッセイで、未処理対照サンプル
に由来するｍＲＮＡの連続希釈系列を含有する一連の並行反応から標準曲線を作
成し、これを用いて、試験サンプルのアンチセンスオリゴヌクレオチド処理後の
阻害率を定量する。

【０１３１】ＰＣＲ試薬は、ＰＥ−ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，フォスターシ
ティ、ＣＡより入手した。ＲＴ−ＰＣＲ反応は、ポリ（Ａ）ｍＲＮＡ溶液２５μ
ｌを含有する９６穴プレートへ、ＰＣＲカクテル（１ｘＴａｑｍａｎ^TM緩衝液Ａ
、５．５ｍＭＭｇＣｌ₂、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＧＴＰ、各３００μＭ、
６００μＭｄＵＴＰ、前方プライマー、後方プライマー及びプローブ、各１０
０ｎＭ、ＲＮＡアーゼ阻害物質２０ユニット、ＡｍｐｌｉＴａｑＧｏｌｄ^TM１
．２５ユニット、及びＭｕＬＶ逆転写酵素１２．５ユニット）２５μｌを加える
ことにより実行した。ＲＴ反応は、４８℃で３０分間インキュベーションして実
行した。９５℃で１０分間インキュベーションしてＡｍｐｌｉＴａｑＧｏｌｄ ^TM を活性化した後、４０サイクルの２工程ＰＣＲプロトコールを以下のように実
行した：９５℃、１５秒間（変性化）、６０℃、１．５分間（アニーリング／伸
張）。アポトーシス−１の細胞性阻害物質のプローブ及びプライマーは、公知の
配列情報（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ３７５４７，配列番号：１として本明細
書に組込まれている）を使用して、アポトーシス−１のヒト細胞性阻害物質の配
列にハイブリダイズするように設計した。

【０１３２】アポトーシス−１の細胞性阻害物質のＰＣＲプライマーは、以下の通りであっ
た：前方プライマー：ＴＧＣＣＴＧＴＧＧＴＧＧＧＡＡＧＣＴ（配列番号：２）後方プライマー：ＧＧＡＡＡＡＴＧＣＣＴＣＣＧＧＴＧＴＴ（配列番号：３）及
びＰＣＲプローブは：ＦＡＭ−ＴＡＡＣＴＧＧＧＡＡＣＣＡＡＡＧＧＡＴＧＡＴ
ＧＣＴＡＴＧＴＣＡ−ＴＡＭＲＡ（配列番号：４）である。ここで、ＦＡＭ（Ｐ
Ｅ−ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，フォスターシティ、ＣＡ）は蛍光
レポーター色素であり、ＴＡＭＲＡ（ＰＥ−ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅ
ｍｓ，フォスターシティ、ＣＡ）はクエンチャー色素である。

【０１３３】ＧＡＰＤＨのＰＣＲプライマーは以下の通りであった：前方プライマー：ＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣ（配列番号：５）後方プライマー：ＧＡＡＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＧＡＴＴＴＣ（配列番号：６）
及びＰＣＲプローブは：５' ＪＯＥ−ＣＡＡＧＣＴＴＣＣＣＧＴＴＣＴＣＡＧＣ
Ｃ−ＴＡＭＲＡ３' （配列番号：７）である。ここで、ＪＯＥ（ＰＥ−Ａｐｐｌ
ｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，フォスターシティ、ＣＡ）は蛍光レポーター色
素であり、ＴＡＭＲＡ（ＰＥ−ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，フォス
ターシティ、ＣＡ）はクエンチャー色素である。

【０１３４】実施例１４アポトーシス−１の細胞性阻害物質・ｍＲＮＡレベルのノーザンブロット分析アンチセンス処理から１８時間後に細胞の単層を冷ＰＢＳで二度洗浄し、ＲＮ
ＡＺＯＬ^TM（ＴＥＬ−ＴＥＳＴ“Ｂ" Ｉｎｃ．，フレンズウッド、ＴＸ）１ｍＬ
に溶解した。製造業者の推奨プロトコールに従って、全ＲＮＡを調製した。ＭＯ
ＰＳ緩衝液システム（ＡＭＲＥＳＣＯ，Ｉｎｃ．，ソロン、ＯＨ）を用いる１．
１％ホルムアルデヒド含有１．２％アガロースゲルを介した電気泳動により、２
０μｇの全ＲＮＡを分画した。ノーザン／サザントランスファー緩衝液システム
（ＴＥＬ−ＴＥＳＴ“Ｂ" Ｉｎｃ．，フレンズウッド、ＴＸ）を用いる毛管トラ
ンスファーを一晩実施して、ゲルからＨＹＢＯＮＤ^TM−Ｎ＋ナイロン膜（アマシ
ャム・ファルマシアバイオテク、ピスカタウェイ、ＮＪ）へＲＮＡを移した。Ｒ
ＮＡの移動はＵＶにより視覚化して確かめた。ＳＴＲＡＴＡＬＩＮＫＥＲ^TM Ｕ
ＶＣｒｏｓｓｌｉｎｋｅｒ２４００（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．，ラ
ジョラ、ＣＡ）を用いるＵＶ架橋により膜を固定した。前方プライマーのＴＧＣＣＴＧＴＧＧＴＧＧＧＡＡＧＣＴ（配列番号：２）と
後方プライマーのＧＧＡＡＡＡＴＧＣＣＴＣＣＧＧＴＧＴＴ（配列番号：３）を
用いるＰＣＲによって製造したアポトーシス−１の細胞性阻害物質特異的プロー
ブを用いた製造業者推奨のストリンジェント条件を使用して、ＱＵＩＣＫＨＹＢ ^TM ハイブリダイゼーション溶液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．，ラジョラ、
ＣＡ）を用いて膜をプローブした。ローディングとトランスファー効率の変動を
正規化するために、膜を切出し、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナ
ーゼ（ＧＡＰＤＨ）ＲＮＡ（クローンテク、パロアルト、ＣＡ）についてプロー
ブした。ＰＨＯＳＰＨＯＲＩＭＡＧＥＲ^TMとＩＭＡＧＥＱＵＡＮＴ^TM Ｓｏｆｔ
ｗａｒｅＶ３．３（モレキュラーダイナミクス、サニヴェール、ＣＡ）を使用
して、ハイブリダイズした膜を視覚化して定量化した。未処理対照のＧＡＰＤＨ
レベルにデータを正規化した。

【０１３５】実施例１５アポトーシス−１の細胞性阻害物質発現のアンチセンス阻害−ホスホロチオエー
ト・オリゴデオキシヌクレオチド本発明により、公知の配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ３７５４７、配列番
号：１として本明細書に組込む）を使用して、アポトーシス−１のヒト細胞性阻
害物質のＲＮＡの様々な領域を標的にする一連のオリゴヌクレオチドを設計した
。このオリゴヌクレオチドを表１に示す。標的部位は、オリゴヌクレオチドが結
合する参照配列（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｕ３７５４７）において与えられる
ヌクレオチド番号により示される。表１の化合物はいずれもホスホロチオエート
骨格（ヌクレオシド間連結）だけを有するオリゴデオキシヌクレオチドである。
アポトーシス−１の細胞性阻害物質のｍＲＮＡレベルに対するこれら化合物の効
果について、本明細書の他の実施例に記載した定量的リアルタイムＰＣＲにより
分析した。データは３回の実験の平均値である。「Ｎ．Ｄ．」とあれば、「デー
タなし」を示す。

【０１３６】

【表１】

【０１３７】表１に示すように、配列番号：９、１８、２９、３４、３６及び４６はこのア
ッセイにおいてアポトーシス−１の細胞性阻害物質の発現を少なくとも２０％阻
害することを示し、従って好ましい。

【０１３８】実施例１６アポトーシス−１の細胞性阻害物質の発現のアンチセンス阻害−ホスホロチオエ
ート・２' −ＭＯＥギャップマーオリゴヌクレオチド本発明により、アポトーシス−１のヒト細胞性阻害物質を標的にする第二系列
のオリゴヌクレオチドを合成した。このオリゴヌクレオチド配列を表２に示す。
標的部位は、オリゴヌクレオチドが結合する参照配列（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号
Ｕ３７５４７）において与えられるヌクレオチド番号により示される。表２の化合物はいずれも長さ１８ヌクレオチドのキメラオリゴヌクレオチド（
「ギャップマー」）であり、１０個の２' −デオキシヌクレオチドからなる中央
の「ギャップ」領域と、その両側（５' 及び３' 方向）に隣接する４個のヌクレ
オチド「ウィング」とから構成される。ウィングは２' −メトキシエチル（２'
−ＭＯＥ）ヌクレオチドからなる。ヌクレオシド間（骨格）連結はオリゴヌクレ
オチド全体でホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）である。２' −ＭＯＥウィングのシ
チジン残基は５−メチルシチジンである。本明細書の他の実施例に記載したリアルタイム定量的ＰＣＲによってデータを
得て、３回の実験で平均化する。「Ｎ．Ｄ．」とあれば、「データなし」を示す
。

【０１３９】

【表２】

【０１４０】表２に示すように、配列番号：１０、１５、１７、２１、２２、２３、２５、
２６、２８、２９、３３、３４、３５、３７、３８、４１、４４、４５及び４６
はこのアッセイにおいてアポトーシス−１の細胞性阻害物質の発現を少なくとも
２５％阻害することを示し、従って好ましい。

【０１４１】実施例１７アポトーシス−１の細胞性阻害物質のタンパク質レベルのウェスタンブロット分
析ウェスタンブロット分析（イムノブロット分析）は標準法を用いて実行する。
オリゴヌクレオチド処理から１６〜２０時間後に細胞を採取し、ＰＢＳで１回洗
浄し、Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液（１００μｌ／穴）に懸濁し、５分間煮沸して、１
６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにロードする。１５０Ｖで１．５時間ゲルを泳動し
、ウェスタンブロッティング用の膜へ移す。アポトーシス−１の細胞性阻害物質
に対する適切な一次抗体、並びにこの一次抗体種に対する放射標識又は蛍光標識
二次抗体を使用する。ＰＨＯＳＰＨＯＲＩＭＡＧＥＲ^TM（モレキュラーダイナミ
クス、サニヴェール、ＣＡ）を用いてバンドを視覚化する。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 31/00 Ａ６１Ｐ 31/00 35/00 35/00 37/02 37/02 43/00 １０５ 43/00 １０５Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者アッカーマン，エリザベス・エイアメリカ合衆国カリフォルニア州92075，ソラナ・ビーチ，サンタ・ビクトリア 519 (72)発明者カウサート，レックス・エムアメリカ合衆国カリフォルニア州92008，カールズバッド，ニューシャイア・ストリート 3008 Ｆターム(参考） 4B024 AA00 AA01 CA01 DA03 GA18 HA17 4C084 AA13 NA14 ZB072 ZB112 ZB212 ZB262 ZB322 4C086 AA01 AA02 AA03 EA16 MA01 MA04 NA14 ZB07 ZB11 ZB21 ZB26 ZB32

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】アポトーシス−１のヒト細胞性阻害物質をコードする核酸分
子を標的にした長さ８〜３０ヌクレオチドのアンチセンス化合物であって、アポ
トーシス−１のヒト細胞性阻害物質の発現を阻害するアンチセンス化合物。
【請求項２】アンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１に記載の
アンチセンス化合物。
【請求項３】アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号：９、１０、
１５、１７、１８、２１、２２、２３、２５、２６、２８、２９、３３、３４、
３５、３６、３７、３８、４１、４４、４５又は４６を含んでなる配列を有する
、請求項２に記載のアンチセンス化合物。
【請求項４】アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号：２９、３４
又は４６を含んでなる配列を有する、請求項２に記載のアンチセンス化合物。
【請求項５】アンチセンスオリゴヌクレオチドが少なくとも１つの修飾さ
れたヌクレオシド間連結を含む、請求項２に記載のアンチセンス化合物。
【請求項６】修飾されたヌクレオシド間連結がホスホロチオエート連結で
ある、請求項５に記載のアンチセンス化合物。
【請求項７】アンチセンスオリゴヌクレオチドが少なくとも１つの修飾さ
れた糖部分を含む、請求項２に記載のアンチセンス化合物。
【請求項８】修飾された糖部分が２' −Ｏ−メトキシエチル糖部分である
、請求項７に記載のアンチセンス化合物。
【請求項９】アンチセンスオリゴヌクレオチドが少なくとも１つの修飾さ
れた核酸塩基を含む、請求項２に記載のアンチセンス化合物。
【請求項１０】修飾された核酸塩基が５−メチルシトシンである、請求項
９に記載のアンチセンス化合物。
【請求項１１】アンチセンスオリゴヌクレオチドがキメラオリゴヌクレオ
チドである、請求項１に記載のアンチセンス化合物。
【請求項１２】請求項１に記載のアンチセンス化合物と製剤的に許容され
る担体又は希釈剤を含んでなる医薬組成物。
【請求項１３】コロイド分散系をさらに含んでなる、請求項１２に記載の
医薬組成物。
【請求項１４】アンチセンス化合物がアンチセンスオリゴヌクレオチドで
ある、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１５】アポトーシス−１の細胞性阻害物質の発現をヒトの細胞又
は組織において阻害する方法であって、前記細胞又は組織を請求項１に記載のア
ンチセンス化合物と接触させて、アポトーシス−１の細胞性阻害物質の発現を阻
害することを含んでなる方法。
【請求項１６】アポトーシス−１の細胞性阻害物質に関連した疾患又は病
態を有するヒトを治療する方法であって、前記ヒトに治療又は予防有効量の請求
項１に記載のアンチセンス化合物を投与することを含んでなる方法。
【請求項１７】疾患又は病態が過剰増殖性の病態であるか又は自己免疫疾
患である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】過剰増殖性の病態が癌である、請求項１７に記載の方法。