JP2003503371A - ＰＩ３Ｋｐ８５発現のアンチセンス調節 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ＰＩ３Ｋ ｐ８５の発現を調節するためのアンチセンス化合物、組成物および方法を提供する。組成物は、ＰＩ３Ｋ ｐ８５をコードする核酸をターゲティングするアンチセンス化合物、特にアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。これらの化合物をＰＩ３Ｋ ｐ８５発現の調節およびＰＩ３Ｋ ｐ８５発現に関連する疾患の処置に使用する方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 発明の分野 本発明は、ＰＩ３Ｋ ｐ８５の発現を調節するための組成物および方法を提供
する。特に、本発明はヒトＰＩ３Ｋ ｐ８５をコードする核酸と特異的にハイブ
リダイズしうるアンチセンス化合物、殊にオリゴヌクレオチドに関する。そのよ
うなオリゴヌクレオチドはＰＩ３Ｋ ｐ８５の発現を調節することが示された。

【０００２】 発明の背景 多くの成長因子およびホルモン、たとえば神経成長因子（ＮＧＦ）、血小板由
来成長因子（ＰＤＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）およびインスリンは、細胞表
面チロシンキナーゼ受容体との相互作用によりそれらの信号を仲介する。リガン
ドの結合により膜を越える細胞外シグナルの伝達が開始され、これによって多重
シグナリング事象が伝搬され、最終的にはターゲットである細胞内生化学的経路
が制御される。

【０００３】 ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）は遍在性ヘテロ二量体
脂質キナーゼファミリーであり、ホルモンおよび成長因子の受容体の細胞質ドメ
インならびに癌遺伝子生成物と結合した状態でみられる。ＰＩ３Ｋはこれらの受
容体の下流エフェクターとして作用し、受容体が刺激されると賦活化され、イノ
シトールのリン酸化誘導体の生成により第２メッセンジャーシグナリング経路の
活性化を仲介する(Fry、Biochim. Biophys. Acta.、1994、1226、237-268)。

【０００４】 ＰＩ３Ｋは、成長因子仲介による細胞トランスフォーメーション、有糸分裂誘
発、タンパク質転送、細胞の生存および増殖、ＤＮＡ合成、アポトーシス、神経
突起伸展、ならびにインスリン刺激によるグルコース輸送を含めた、多数の細胞
活性に関与するとされている(Fry, Biochim. Biophys. Acta., 1994, 1226, 237
-268に概説)。

【０００５】 ＰＩ３Ｋキナーゼ酵素ヘテロ二量体は１１０ｋＤの触媒サブユニット（ｐ１１
０）が８５ｋＤの調節サブユニット（ｐ８５）と結合したものからなり、この酵
素はｐ８５サブユニットのＳＨ２ドメインを介して膜結合受容体と結合している
(Escobedo et al., Cell, 1991, 65, 75-82; Skolnik et al., Cell, 1991, 65,
83-90)。

【０００６】 ＰＩ３Ｋ ｐ８５（ＧＲＢ１およびＰＩＫ３Ｒ１としても知られる）は、最初
にウシ脳から単離され、αおよびβの２つの形で存在することが示された。これ
らの研究で、ｐ８５イソ形はチロシン−リン酸化受容体キナーゼおよびポリオー
マウイルスミドルＴ抗原複合体に結合してその基質として作用することが示され
た(Otsu et al., Cell, 1991, 65, 91-104)。それ以来、ｐ８５サブユニットは
さらに解明され、チロシンキナーゼ受容体、たとえばエリスロポエチン受容体、
ＰＤＧＲ−β受容体、およびＴｉｅ２、すなわち血管の発生および腫瘍血管形成
誘導に関与する内皮特異性受容体を含めた、多様なタンパク質群と相互作用する
ことが示された(Escobedo et al., Cell,1991, 65, 75-82; He et al., Blood,
1993, 82, 3530-3538; Kontos et al., Mol. Cell. Biol., 1998, 18, 4131-414
0)。それは、フォーカルアドヒージョンキナーゼ（ＦＡＫ）、すなわちインテグ
リンシグナリングに関与する細胞質チロシンキナーゼとも相互作用し、ＦＡＫの
基質およびエフェクターであると考えられる。ｐ８５サブユニットは、プロフィ
リン、すなわちアクチン重合を促進するアクチン結合性タンパク質とも相互作用
し(Bhargavi et al., Biochem. Mol. Biol. Int., 1998, 46, 241-248; Chen an
d Guan, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 1994, 91, 10148-10152)、ｐ８５
／プロフィリン複合体はアクチン重合を阻害する。

【０００７】 最近、トランケート形のＰＩ３Ｋ ｐ８５サブユニットが単離された(Jimenez
et al., Embo J., 1998, 17, 743-753)。この形は、ｅｐｈチロシンキナーゼ受
容体ファミリーにおいて保存されている領域に結合した野生型の最初の５７１個
のアミノ酸（Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｍ６１９０６のヌクレオチド４３〜１７５
５によりコードされる）を含む。このトランケーションはＰＩ３キナーゼの構成
性活性化を誘導し、哺乳動物線維芽細胞の細胞トランスフォーメーションに関与
することが示された。

【０００８】 現在、ＰＩ３キナーゼの合成を効果的に阻害する療法薬は知られておらず、阻
害物質の使用はＰＩ３キナーゼ機能を調べるための主な方法であった。 ＰＩ３キナーゼに対する幾つかの化学的に異なる阻害物質が文献に報告されて
いる。これらには下記のものが含まれる；真菌代謝産物であるワートマニン（wo
rtmannin）(Ui et al., Trends Biochem. Sci., 1995, 20, 303-307)；抗真菌薬
であるデメトキシビリジン（demethoxyviridin） (Woscholski et al., FEBS Le
tt., 1994, 342, 109-114)；ならびに２つの関連クロモンであるケルセチン（qu
ercetin）およびＬＹ２９４００２(Vlahos et al., J. Biol. Chem., 1994, 269
, 5241-5248)。しかしこれらの阻害物質は主にｐ１１０サブユニットをターゲテ
ィングし、療法プロトコルとしては試験されていない。したがって、ＰＩ３Ｋ
ｐ８５機能を効果的に阻害しうる他の薬剤が以前から求められている。

【０００９】 代わりに特異的遺伝子生成物の発現を低下させるのに有効な手段としてアンチ
センス法が出現し、したがってＰＩ３Ｋ ｐ８５発現調節のための多数の療法、
診断および研究などの用途においてきわめて有用となるであろう。

【００１０】 本発明は、トランケート形ＰＩ３Ｋ ｐ８５の調節を含めたＰＩ３Ｋ ｐ８５
発現調節のための組成物および方法を提供する。 発明の概要 本発明は、ＰＩ３Ｋ ｐ８５コード核酸をターゲティングし、ＰＩ３Ｋ ｐ８
５の発現を調節するアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドに関する。本
発明のアンチセンス化合物を含む医薬その他の組成物も提供される。さらに、細
胞または組織におけるＰＩ３Ｋ ｐ８５発現を調節する方法であって、細胞また
は組織を本発明の１以上のアンチセンス化合物または組成物と接触させることを
含む方法が提供される。さらに、治療または予防に有効な量の本発明の１以上の
アンチセンス化合物または組成物を投与することにより、ＰＩ３Ｋ ｐ８５発現
に関連する疾患または状態であるか、またはそれらの疾患または状態になりやす
い動物、特にヒトを処置する方法が提供される。

【００１１】 発明の詳細な記述 本発明は、ＰＩ３Ｋ ｐ８５をコードする核酸分子の機能を調節し、最終的に
はＰＩ３Ｋ ｐ８５産生量を調節するために、オリゴマー形アンチセンス化合物
、特にオリゴヌクレオチドを使用する。これは、１以上のＰＩ３Ｋ ｐ８５コー
ド核酸と特異的にハイブリダイズするアンチセンス化合物を提供することにより
達成される。本明細書中で用いる用語”ターゲット核酸”および”ＰＩ３Ｋ ｐ
８５をコードする核酸（ＰＩ３Ｋ ｐ８５コード核酸）”には、ＰＩ３Ｋ ｐ８
５をコードするＤＮＡ、そのようなＤＮＡから転写されたＲＮＡ（ｐｒｅ−ｍＲ
ＮＡおよびｍＲＮＡを含む）、およびそのようなＲＮＡから誘導されたｃＤＮＡ
が含まれる。オリゴマー化合物とそれのターゲット核酸の特異的ハイブリダイゼ
ーションにより、その核酸の正常な機能が妨害される。特異的にハイブリダイズ
する化合物によるこのターゲット核酸機能調節を、一般に”アンチセンス”と呼
ぶ。妨害されるＤＮＡ機能には、複製および転写が含まれる。妨害されるＲＮＡ
機能には、あらゆる生命機能、たとえばタンパク質翻訳部位へのＲＮＡの移動、
ＲＮＡからタンパク質への翻訳、ＲＮＡスプライシングによる１以上のｍＲＮＡ
種の生成、およびＲＮＡと連携した、またはＲＮＡにより促進される触媒活性が
含まれる。そのようなターゲット核酸機能妨害の全体的作用は、ＰＩ３Ｋ ｐ８
５発現の調節である。本発明に関して”調節（modulation）”は、遺伝子発現の
増大（刺激）または低下（阻害）を意味する。本発明に関しては、阻害が好まし
い形の遺伝子発現調節であり、ｍＲＮＡが好ましいターゲットである。

【００１２】 アンチセンスに特異的な核酸をターゲティングすることが好ましい。本発明に
関して、特定の核酸に対するアンチセンス化合物の”ターゲティング”は多工程
プロセスである。このプロセスは通常は、その機能を調節すべき核酸配列の同定
から始まる。これは、たとえばその発現が特定の障害もしくは疾病状態と関連す
る細胞遺伝子（またはその遺伝子から転写されたｍＲＮＡ）、または感染性物質
に由来する核酸分子であってよい。本発明において、ターゲットはＰＩ３Ｋ ｐ
８５をコードする核酸分子である。ターゲティングプロセスには、この遺伝子内
において目的効果（たとえばタンパク質発現の検出または調節）が得られるよう
なアンチセンス相互作用が起きる部位（１以上）の判定も含まれる。本発明にお
いて好ましい遺伝子内部位は、遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ
）の翻訳開始コドンまたは終止コドンを含む領域である。当技術分野で知られる
とおり、翻訳開始コドンは一般に５’−ＡＵＧ（転写されたｍＲＮＡ分子におい
て；対応するＤＮＡ分子においては５’−ＡＴＧ）であるので、翻訳開始コドン
は”ＡＵＧコドン”、”出発コドン”または”ＡＵＧ出発コドン”とも呼ばれる
。少数の遺伝子がＲＮＡ配列５’−ＧＵＧ、５’−ＵＵＧまたは５’−ＣＵＧの
翻訳開始コドンをもち、インビボでは５’−ＡＵＡ、５’−ＡＣＧおよび５’−
ＣＵＧが機能することが示された。用語”翻訳開始コドン”および”出発コドン
”は多数のコドン配列を包含することができるが、それぞれの場合、イニシエー
ターアミノ酸は一般にメチオニン（真核細胞において）またはホルミルメチオニ
ン（原核細胞において）である。真核細胞および原核細胞の遺伝子が２以上のオ
ータナティブ開始コドンをもち、それらのうちのいずれかが個々の細胞タイプも
しくは組織において、または個々の組合わせの条件下で優先的に用いられている
可能性があることも、当技術分野で知られている。本発明に関して、”出発コド
ン”および”翻訳開始コドン”は、そのようなコドンの配列（単数または複数種
類）に関係なく、インビボでＰＩ３Ｋ ｐ８５コード遺伝子から転写されたｍＲ
ＮＡ分子の翻訳を開始するのに用いられるコドン（１以上）を表す。

【００１３】 遺伝子の翻訳終止コドン（または”停止コドン”）が３つの配列、すなわち５
’−ＵＡＡ、５’−ＵＡＧおよび５’−ＵＧＡ（対応するＤＮＡ配列はそれぞれ
５’−ＴＡＡ、５’−ＴＡＧおよび５’−ＴＧＡ）のうちの１つをもつことも、
当技術分野で知られている。用語”出発コドン領域”および”翻訳開始コドン領
域”は、翻訳開始コドンからいずれかの方向（すなわち５’または３’）に約２
５〜約５０個の連続ヌクレオチドを含むｍＲＮＡまたは遺伝子の部分を表す。同
様に、用語”停止コドン領域”および”翻訳終止コドン領域”は、翻訳終止コド
ンからいずれかの方向（すなわち５’または３’）に約２５〜約５０個の連続ヌ
クレオチドを含むｍＲＮＡまたは遺伝子の部分を表す。

【００１４】 オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）または”コード領域”が翻訳開始コ
ドンと翻訳終止コドンの間の領域を表すことは当技術分野で知られており、これ
も効果的にターゲティングできる領域である。他のターゲット領域には下記のも
のが含まれる；５’側非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、すなわち翻訳開始コドンから
５’方向のｍＲＮＡ部分を表し、したがってｍＲＮＡの５’キャップ部位と翻訳
開始コドンの間のヌクレオチドまたは対応する遺伝子のヌクレオチドを含むこと
が当技術分野で知られている領域；３’側非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、すなわち
翻訳終止コドンから３’方向のｍＲＮＡ部分を表し、したがってｍＲＮＡの翻訳
終止コドンと３’末端の間のヌクレオチドまたは対応する遺伝子のヌクレオチド
を含むことが当技術分野で知られている領域。ｍＲＮＡの５’キャップは５’−
５’三リン酸結合を介してｍＲＮＡの最も５’側の残基に結合したＮ７−メチル
化グアノシン残基を含む。ｍＲＮＡの５’キャップ領域は、５’キャップ構造自
体およびキャップに隣接する最初の５０ヌクレオチドを含むとみなされる。５’
キャップ領域も好ましいターゲット領域でありうる。

【００１５】 ある真核細胞ｍＲＮＡ転写体は直接翻訳されるが、多くは”イントロン”とし
て知られる１以上の領域を含み、これらは翻訳前に転写体から切り落とされる。
残りの（したがって翻訳される）領域は”エキソン”として知られ、互いにスプ
ライシングされて連続ｍＲＮＡ配列を形成する。ｍＲＮＡスプライス部位、すな
わちイントロン−エキソン接合部も好ましいターゲット領域であり、異常スプラ
イシングが疾患に関与している状態、または特定のｍＲＮＡスプライス生成物の
過剰産生が疾患に関与している状態には、特に有用となりうる。再配列または欠
失による異常融合接合部も好ましいターゲットである。たとえばＤＮＡまたはｐ
ｒｅ−ｍＲＮＡをターゲティングするアンチセンス化合物には、イントロンも有
効な、したがって好ましいターゲット領域となりうることも見いだされた。

【００１６】 １以上のターゲット部位が同定されると、目的効果を得るのに十分なほどその
ターゲットに相補的である、すなわち十分に良好にかつ十分な特異性でハイブリ
ダイズするオリゴヌクレオチドを選択する。

【００１７】 本発明に関して、”ハイブリダイゼーション”は相補的ヌクレオシドまたはヌ
クレオチド塩基間の水素結合を意味し、これはワトソン−クリック型、フーグス
ティーン型または逆フーグスティーン型水素結合であってよい。たとえばアデニ
ンとチミンは相補的核酸塩基であり、水素結合の形成により対合する。本明細書
中で用いる”相補的”とは、２ヌクレオチド間の厳密な対合能を表す。たとえば
オリゴヌクレオチドの特定位置のヌクレオチドがＤＮＡまたはＲＮＡ分子の同一
位置のヌクレオチドと水素結合しうる場合、そのオリゴヌクレオチドとＤＮＡま
たはＲＮＡはその位置において互いに相補的であるとみなされる。各分子におい
て十分な数の対応する位置が互いに水素結合しうるヌクレオチドで占められてい
る場合、そのオリゴヌクレオチドとＤＮＡまたはＲＮＡは互いに相補的である。
このように”特異的にハイブリダイズしうる”および”相補的”は、そのオリゴ
ヌクレオチドとＤＮＡまたはＲＮＡターゲットとの間で安定かつ特異的な結合が
起きるのに十分な程度の相補性または厳密な対合を示すために用いられる用語で
ある。特異的にハイブリダイズするためにアンチセンス化合物の配列がそれのタ
ーゲット核酸に１００％相補的である必要はないことは、当技術分野で理解され
ている。ターゲットＤＮＡまたはＲＮＡ分子への化合物の結合によりターゲット
ＤＮＡまたはＲＮＡの正常な機能が妨害されて有用性が失われ、かつ特異的な結
合が望まれる条件下で（すなわちインビボアッセイまたは療法処置の場合は生理
的条件下で、インビトロアッセイの場合はアッセイを実施する条件下で）非ター
ゲット配列へのアンチセンス化合物の非特異的結合を避けるのに十分な程度の相
補性がある場合、そのアンチセンス化合物は特異的にハイブリダイズしうるもの
である。

【００１８】 アンチセンス化合物は一般に研究試薬および診断薬として使用される。たとえ
ば遺伝子発現をきわめて特異的に阻害しうるアンチオリゴヌクレオチドは、特定
の遺伝子の機能を解明するために当業者によりしばしば用いられる。アンチセン
ス化合物は、生物学的経路の種々のメンバーの機能を識別するためにも用いられ
る。したがって、アンチセンス調節は研究用として利用される。

【００１９】 アンチセンスの特異性および感受性は、当業者が療法にも利用している。アン
チセンスオリゴヌクレオチドは、療法分野で動物およびヒトの疾病状態の処置に
用いられる。アンチセンスオリゴヌクレオチドはヒトに投与して安全かつ有効で
あり、多数の臨床試験が現在行われている。したがって、オリゴヌクレオチドは
細胞、組織および動物、特にヒトの処置のための処置方式に有用となるように構
成できる有用な療法手段であることが確認された。

【００２０】 本発明に関して、用語”オリゴヌクレオチド”は、リボ核酸（ＲＮＡ）もしく
はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはその模倣体のオリゴマーまたはポリマーを
表す。この用語には、天然の核酸塩基、糖および共有ヌクレオシド間（主鎖）結
合からなるオリゴヌクレオチド、ならびに同様に機能する非天然生成部分をもつ
オリゴヌクレオチドが含まれる。望ましい特性、たとえば細胞取込みの増大、核
酸ターゲットに対する親和性の増大、およびヌクレアーゼの存在下での安定性の
増大のため、そのような修飾または置換オリゴヌクレオチドの方が天然形より好
ましい場合がしばしばある。

【００２１】 アンチセンスオリゴヌクレオチドが好ましい形のアンチセンス化合物であるが
、本発明は他のオリゴマー形アンチセンス化合物を包含する。これには後記のオ
リゴヌクレオチド模倣体が含まれるが、これらに限定されない。本発明によるア
ンチセンス化合物は、好ましくは約８〜約３０個の核酸塩基（すなわち約８〜約
３０個の連結ヌクレオシド）を含む。特に好ましいアンチセンス化合物はアンチ
センスオリゴヌクレオチド、さらに好ましくは約１２〜約２５個の核酸塩基を含
むものである。当技術分野で知られているとおり、ヌクレオシドは塩基−糖の組
合わせである。ヌクレオシドの塩基部分は普通は複素環式塩基である。２つの最
も一般的なクラスのそのような複素環式塩基は、プリン類およびピリミジン類で
ある。ヌクレオチドは、さらにヌクレオシドの糖部分に共有結合したリン酸基を
含むヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を含むヌクレオシドについては、
リン酸基は糖の２’、３’または５’−ヒドロキシル部分に結合できる。オリゴ
ヌクレオチドの形成に際しては、リン酸基が隣接ヌクレオシドを互いに共有結合
して線状ポリマー化合物を形成する。次いでこの線状ポリマー構造の各末端がさ
らに結合して環状構造を形成しうるが、一般に開放線状構造の方が好ましい。オ
リゴヌクレオチド構造内において、リン酸基は一般にオリゴヌクレオチドのヌク
レオシド間主鎖を形成すると言われる。ＲＮＡおよびＤＮＡの普通の結合または
主鎖は、３’−５’ホスホジエステル結合である。

【００２２】 本発明に有用な好ましいアンチセンス化合物の具体例には、修飾された主鎖ま
たは非天然ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドが含まれる。本明細書
に定義するように、修飾された主鎖を含むオリゴヌクレオチドには、主鎖中にリ
ン原子を保有するものと主鎖中にリン原子をもたないものが含まれる。本明細書
の目的については、また当技術分野で時に言及されるように、ヌクレオシド間主
鎖中にリン原子をもたない修飾オリゴヌクレオチドはオリゴヌクレオシドとみな
すこともできる。

【００２３】 好ましい修飾オリゴヌクレオチド主鎖には、たとえば下記のものが含まれる：
ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホス
ホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、ホスホン酸メチルおよび
他のアルキル（ホスホン酸３’−アルキレンおよびキラルホスホナートを含む）
、ホスフィナート、ホスホロアミデート（３’−アミノホスホルアミデートおよ
びアミノアルキルホスホルアミデートを含む）、チオノホスホルアミデート、チ
オノアルキルホスホナート、チオノアルキルホスホトリエステル、およびボラノ
ホスフェートであって、普通の３’−５’結合をもつもの、これらの２’−５’
結合類似体、ならびに隣接ヌクレオシド単位対が３’−５’から５’−３’へ、
または２’−５’から５’−２’へ結合している反転極性をもつもの。種々な塩
、混合塩及び遊離酸形も含まれる。

【００２４】 上記のリン含有結合の製造について教示した代表的な米国特許には下記のもの
が含まれるが、これらに限定されない： U.S.P.: 3,687,808; 4,469,863; 4,476,301; 5,023,243; 5,177,196; 5,188,897; 5,264,423; 5,276,019; 5,278,302; 5,286,717; 5,321,131; 5,399,676; 5,405,939; 5,453,496; 5,455,233; 5,466,677; 5,476,925; 5,519,126; 5,536,821; 5,541,306; 5,550,111; 5,563,253; 5,571,799; 5,587,361および5,625,050； これらのうちの幾つかは本出願人が共有する；これらをそれぞれ本明細書に参考
として援用する。

【００２５】 リン原子を含まない好ましい修飾オリゴヌクレオチド主鎖は、下記により形成
される主鎖をもつ：短鎖のアルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、
異種原子とアルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合との混合、あるい
は１以上の短鎖の異種原子型または複素環型ヌクレオシド間結合。これらには、
モルホリノ結合をもつもの（一部がヌクレオシドの糖部分から形成）；シロキサ
ン主鎖；スルフィド、スルホキシドおよびスルホン主鎖；ホルムアセチルおよび
チオホルムアセチル主鎖；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル主
鎖；アルケン含有主鎖；スルファメート主鎖；メチレンイミノおよびメチレンヒ
ドラジノ主鎖；スルホナートおよびスルホンアミド主鎖；アミド主鎖；ならびに
混合Ｎ、Ｏ、ＳおよびＣＨ₂成分部分をもつ他のものが含まれる。

【００２６】 上記オリゴヌクレオシドの製造について教示した代表的な米国特許には下記の
ものが含まれるが、これらに限定されない： U.S.P.: 5,034,506; 5,166,315; 5,185,444; 5,214,134; 5,216,141; 5,235,033; 5,264,562; 5,264,564; 5,405,938; 5,434,257; 5,466,677; 5,470,967; 5,489,677; 5,541,307; 5,561,225; 5,596,086; 5,602,240; 5,610,289; 5,602,240; 5,608,046; 5,610,289; 5,618,704; 5,623,070; 5,663,312; 5,633,360; 5,677,437および5,677,439； これらのうちのあるものは本出願人が共有する；これらをそれぞれ本明細書に参
考として援用する。

【００２７】 他の好ましいオリゴヌクレオチド模倣体においては、ヌクレオチド単位の糖と
ヌクレオシド間結合（すなわち主鎖）の両方が新たな基で交換されている。塩基
単位は適切な核酸ターゲット化合物とのハイブリダイゼーションのために保持さ
れている。そのようなオリゴマー化合物の１つであって、卓越したハイブリダイ
ゼーション特性をもつことが示されたオリゴヌクレオチド模倣体は、ペプチド核
酸（ＰＮＡ）と呼ばれるものである。ＰＮＡ化合物においては、オリゴヌクレオ
チドの糖−主鎖がアミド含有主鎖、特にアミノエチルグリシン主鎖で交換されて
いる。核酸塩基は保持されて、主鎖のアミド部分のアザ窒素原子に直接的または
間接的に結合している。ＰＮＡ化合物の製造について教示した代表的な米国特許
にはU.S.P.: 5,539,082; 5,714,331および5,719,262が含まれるが、これらに限
定されない。これらをそれぞれ本明細書に参考として援用する。ＰＮＡ化合物に
ついての教示はさらにNielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500中にみ
られる。

【００２８】 本発明の最も好ましい態様は、ホスホロチオエート主鎖をもつオリゴヌクレオ
チド、異種原子主鎖をもつオリゴヌクレオシド、特に前記U.S.P. 5,489,677に記
載の-CH₂-NH-O-CH₂-, -CH₂-N(CH₃)-O-CH₂- [メチレン（メチルイミノ）またはMM
I主鎖として知られる]、-CH₂-O-N(CH₃)-CH₂-,-CH₂-N(CH₃)-N(CH₃)-CH₂-および-O
-N(CH₃)-CH₂-CH₂- [これらにおいて、天然ホスホジエステル主鎖は-O-P-O-CH₂-
として表される]、ならびに前記U.S.P. 5,602,240に記載のアミド主鎖である。
前記U.S.P. 5,034,506に記載のモルホリノ主鎖構造をもつオリゴヌクレオチドも
好ましい。

【００２９】 修飾オリゴヌクレオチドは１以上の置換糖部分をも含むことができる。好まし
いオリゴヌクレオチドは、２’位に下記のうちの１つを含む：OH; F; O-, S-,も
しくはN-アルキル; O-, S-,もしくはN-アルケニル; O-, S-もしくはN-アルキニ
ル;またはO-アルキル-O-アルキル；これらにおいてアルキル、アルケニルおよび
アルキニルは、置換もしくは非置換Ｃ₁−Ｃ₁₀アルキル、またはＣ₂−Ｃ₁₀アルケ
ニルおよびアルキニルであってよい。特に好ましいものは、O[(CH₂)_nO]_mCH₃, O(
CH₂)_nOCH₃, O(CH₂)_nNH₂, O(CH₂)_nCH₃, O(CH₂)_nONH₂,およびO(CH₂)_nON[(CH₂)_nCH₃ )]₂であり、これらにおいてｎおよびｍは１〜約１０である。他の好ましいオリ
ゴヌクレオチドは、２’位に下記のうちの１つを含む：Ｃ₁−Ｃ₁₀低級アルキル
、置換低級アルキル、アルカリール、アラルキル、O-アルカリールまたはO-アラ
ルキル、SH, SCH₃, OCN, Cl, Br, CN, CF₃, OCF₃, SOCH₃, SO₂CH₃, ONO₂, NO₂,
N₃, NH₂,ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルア
ミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ開裂基、レポーター基、インタ
ーカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善する基、またはオリゴ
ヌクレオチドの薬力学的特性を改善する基、ならびに類似の特性をもつ他の置換
基。好ましい修飾には、２’−メトキシエトキシ(2'-O-CH₂CH₂OCH₃、2'-O-(2-メ
トキシエチル)または2'-MOEとしても知られる) (Martin et al., Helv. Chim. A
cta, 1995, 78, 486-504)、すなわちアルコキシアルコキシ基が含まれる。さら
に好ましい修飾には、後記実施例に記載の２’−ジメチルアミノオキシエトキシ
、すなわちO(CH₂) ₂ON(CH₃) ₂基（２’−ＤＭＡＯＥとしても知られる）、およ
び同様に後記実施例に記載の２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（当技術分
野で２’−Ｏ−ジメチルアミノエトキシエチルまたは２’−ＤＭＡＥＯＥとして
も知られる）、すなわち2'-O-CH₂-O-CH₂-N(CH₂) ₂が含まれる。

【００３０】 他の好ましい修飾には、２’−メトキシ(2'-O-CH₃)、２’−アミノプロポキシ
(2'-OCH₂CH₂CH₂NH₂)および２’−フルオロ(2'-F)が含まれる。オリゴヌクレオチ
ドの他の位置、特に３’末端ヌクレオチド上または２’−５’結合オリゴヌクレ
オチド中の糖の３’位、ならびに５’末端ヌクレオチドの５’位において、同様
な修飾を行うこともできる。オリゴヌクレオチドがペントフラノシル糖の代わり
にシクロブチル部分のような糖模倣体をもつこともできる。そのような修飾糖構
造体の製造について教示した代表的な米国特許には下記のものが含まれるが、こ
れらに限定されない： U.S.P.:4,981,957; 5,118,800; 5,319,080; 5,359,044; 5,393,878; 5,446,137; 5,466,786; 5,514,785; 5,519,134; 5,567,811; 5,576,427; 5,591,722; 5,597,909; 5,610,300; 5,627,053; 5,639,873; 5,646,265; 5,658,873; 5,670,633および5,700,920； これらのうちのあるものは本出願人が共有する；これらそれぞれの全体を本明細
書に参考として援用する。

【００３１】 オリゴヌクレオチドは核酸塩基（当技術分野でしばしば単に”塩基”と呼ばれ
る）の修飾または置換を含むこともできる。本明細書中で用いる”修飾されてい
ない”または”天然の”核酸塩基には、プリン塩基のアデニン（Ａ）およびグア
ニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基のチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウ
ラシル（Ｕ）が含まれる。修飾された核酸塩基には、他の合成および天然の核酸
塩基、たとえば下記のものが含まれる：５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、
５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデ
ニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルその他のアルキル誘導体、アデニン
およびグアニンの２−プロピルその他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２
−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよび−シトシン、５
−プロピニルウラシルおよび−シトシン、６−アザウラシル、−シトシンおよび
−チミン、５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、
８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルその他の８−
置換アデニンおよび−グアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロ
メチルその他の５−置換ウラシルおよび−シトシン、７−メチルグアニンおよび
７−メチルアデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグ
アニンおよび７−デアザアデニン、ならびに３−デアザグアニンおよび３−デア
ザアデニン。他の核酸塩基には、U. S. P. 3,687,808に示されるもの、The Conc
ise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, p. 858-859, Kroschw
itz, J.I., ed. John Wiley & Sons, 1990に示されるもの、Englisch et al., A
ngewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613に示されるもの、Sa
nghvi, Y.S., Chapter 15, Antisense Research and Applications, p. 289-302
, Crooke, S.T. and Lebleu, B. , ed., CRC Press, 1993に開示されるものが含
まれる。特定のこれらの核酸塩基は、本発明のオリゴマー化合物の結合親和性を
高めるのに特に有用である。これらには、５−置換ピリミジン、６−アザピリミ
ジン、ならびにＮ−２、Ｎ−６およびＯ−６置換プリン、たとえば２−アミノプ
ロピルアデニン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシンが含ま
れる。５−メチルシトシン置換は核酸二重らせんの安定性を０．６〜１．２℃高
めることが示され(Sanghvi, Y.S., Crooke, S.T. and Lebleu, B., eds., Antis
ense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278
)、現在好ましい塩基置換であり、２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わ
せた場合、よりいっそう好ましい。

【００３２】 上記の特定の修飾核酸塩基および他の修飾核酸塩基の製造について教示した代
表的な米国特許には下記のものが含まれるが、これらに限定されない： 前記U.S.P. 3,687,808、ならびに U.S.P.: 4,845,205; 5,130,302; 5,134,066; 5,175,273; 5,367,066; 5,432,272; 5,457,187; 5,459,255; 5,484,908; 5,502,177; 5,525,711; 5,552,540; 5,587,469; 5,594,121, 5,596,091; 5,614,617;および5,681,941； これらのうちのあるものは本出願人が共有し、上記のそれぞれを本明細書に参考
として援用する；ならびにU.S.P. 5,750,692：これは本出願人が共有し、これを
同様に本明細書に参考として援用する。

【００３３】 本発明オリゴヌクレオチドの他の修飾は、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分
布または細胞取込みを高める１以上の部分または結合体をオリゴヌクレオチドに
化学的に結合させるものである。そのような部分には下記のものが含まれるが、
これらに限定されない：脂質部分、たとえばコレステロール部分(Letsinger et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553-6556)、コール酸(Manohara
n et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1994, 4, 1053-1060)、チオエーテル、た
とえばヘキシル−Ｓ−トリチルチオール(Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. S
ci., 1992, 660, 306-309; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993
, 3, 2765-2770)、チオコレステロール(Oberhauser et al., Nucl. Acids Res.,
1992, 20, 533-538)、脂肪族鎖、たとえばドデカンジオールもしくはウンデシ
ル残基(Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10, 1111-1118; Kabanov et
al., FEBS Lett., 1990, 259, 327-330; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993
, 75, 49-54)、リン脂質、たとえばジ−ヘキサデシル-rac-グリセロールもしく
は1,2-ジ-O-ヘキサデシル-rac-グリセロ-3-H-ホスホン酸トリエチルアンモニウ
ム(Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654; Shea et al.
, Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777-3783)、ポリアミンもしくはポリエチレン
グリコール鎖(Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969-
973)、またはアダマンタン酢酸(Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995,
36, 3651-3654)、パルミチル部分(Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 19
95, 1264, 229-237)、またはオクダデシルアミンもしくはヘキシルアミノカルボ
ニル−オキシコレステロール部分(Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther.,
1996, 277, 923-937）。

【００３４】 そのようなオリゴヌクレオチド結合体（conjugate:コンジュゲート）の製造に
ついて教示した代表的な米国特許には下記のものが含まれるが、これらに限定さ
れない： U.S.P.: 4,828,979; 4,948,882; 5,218,105; 5,525,465; 5,541,313; 5,545,730; 5,552,538; 5,578,717, 5,580,731; 5,580,731; 5,591,584; 5,109,124; 5,118,802; 5,138,045; 5,414,077; 5,486,603; 5,512,439; 5,578,718; 5,608,046; 4,587,044; 4,605,735; 4,667,025; 4,762,779; 4,789,737; 4,824,941; 4,835,263; 4,876,335; 4,904,582; 4,958,013; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,245,022; 5,254,469; 5,258,506; 5,262,536; 5,272,250; 5,292,873; 5,317,098; 5,371,241, 5,391,723; 5,416,203, 5,451,463; 5,510,475; 5,512,667; 5,514,785; 5,565,552; 5,567,810; 5,574,142; 5,585,481; 5,587,371; 5,595,726; 5,597,696; 5,599,923; 5,599,928および 5,688,941； これらのうちのあるものは本出願人が共有する；これらをそれぞれ本明細書に参
考として援用する。

【００３５】 所定の化合物のすべての位置を均一に修飾する必要はなく、事実、１より多い
前記修飾を単一化合物に、しかもオリゴヌクレオチド内の単一ヌクレオシドに取
り込ませてもよい。本発明は、キメラ化合物であるアンチセンス化合物をも含む
。本発明に関して”キメラ”アンチセンス化合物または”キメラ”は、２以上の
化学的に異なる領域を含み、それぞれが少なくとも１つのモノマー単位（すなわ
ちオリゴヌクレオチド化合物の場合はヌクレオチド）を構成しているアンチセン
ス化合物、特にオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは一般
に、ヌクレアーゼ分解に対する抵抗性の増大、細胞取込みの増大および／または
ターゲット核酸に対する結合親和性の増大をオリゴヌクレオチドに与えるように
オリゴヌクレオチドが修飾された領域を少なくとも１つ含む。オリゴヌクレオチ
ドの他の領域は、ＲＮＡ：ＤＮＡまたはＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを開裂しう
る酵素の基質として作用するものであってもよい。たとえばＲＮａｓｅ ＨはＲ
ＮＡ：ＤＮＡ二重らせんのＲＮＡ鎖を開裂する細胞性エンドヌクレアーゼである
。したがってＲＮａｓｅ Ｈを活性化するとＲＮＡターゲットが開裂し、これに
よりオリゴヌクレオチドによる遺伝子発現阻害の効率が大幅に高まる。その結果
、キメラオリゴヌクレオチドを用いると、同一ターゲット領域にハイブリダイズ
するホスホロチオエートデオキシオリゴヌクレオチドと比較して短いオリゴヌク
レオチドで匹敵する結果が得られることがしばしばある。ＲＮＡターゲットの開
裂は、ゲル電気泳動、および必要ならば当技術分野で既知の関連核酸ハイブリダ
イゼーション法によりルーティンに検出できる。

【００３６】 本発明のキメラアンチセンス化合物は、２以上の前記のオリゴヌクレオチド、
修飾オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシドおよび／またはオリゴヌクレオチ
ド模倣体の複合構造体として形成されてもよい。それらの化合物は当技術分野で
ハイブリッドまたはギャップマー（gapmer）とも呼ばれる。そのようなハイブリ
ッド構造体の製造について教示した代表的な米国特許には下記のものが含まれる
が、これらに限定されない： U.S.P.: 5,013,830; 5,149,797; 5,220,007; 5,256,775; 5,366,878; 5,403,711; 5,491,133; 5,565,350; 5,623,065; 5,652,355; 5,652,356および5,700,922； これらのうちのあるものは本出願人が共有する；これらそれぞれの全体を本明細
書に参考として援用する。

【００３７】 本発明により使用するアンチセンス化合物は、周知の固相合成法によって簡便
かつルーティンに製造できる。そのような合成のための装置は、たとえばApplie
d Biosystems（カリフォルニア州フォスターシティー）を含めた数社により市販
されている。さらに、または代わりに、そのような合成のための当技術分野で知
られている任意の手段を採用できる。ホスホロチオエートおよびアルキル化誘導
体などのオリゴヌクレオチドを製造するために同様な方法を用いることは周知で
ある。

【００３８】 本発明のアンチセンス化合物はインビトロで合成され、生物由来のアンチセン
ス組成物、またはアンチセンス分子のインビボ合成を指令するように設計した遺
伝子ベクター構築体を含まない。

【００３９】 本発明化合物は、取込み、分布および／または吸収を助成するために、混合、
封入、結合その他の形で、他の分子、分子構造体または化合物混合物、たとえば
リポソーム、受容体をターゲットとする分子、経口用、直腸用、局所用その他の
製剤と一緒にすることもできる。そのような取込み、分布および／または吸収助
成のための製剤の調製について教示した代表的な米国特許には下記のものが含ま
れるが、これらに限定されない： U.S.P.: 5,108,921; 5,354,844; 5,416,016; 5,459,127; 5,521,291; 5,543,158; 5,547,932; 5,583,020; 5,591,721; 4,426,330; 4,534,899; 5,013,556; 5,108,921; 5,213,804; 5,227,170; 5,264,221; 5,356,633; 5,395,619; 5,416,016; 5,417,978; 5,462,854; 5,469,854; 5,512,295; 5,527,528; 5,534,259; 5,543,152; 5,556,948; 5,580,575および5,595,756； これらをそれぞれ本明細書に参考として援用する。

【００４０】 本発明のアンチセンス化合物には、ヒトを含めた動物に投与した際に生物学的
活性代謝産物またはその残基を供給しうる（直接的または間接的に）医薬的に許
容できる塩類、エステル、もしくはそのようなエステルの塩類、または他の任意
の化合物がいずれも含まれる。したがって、たとえば本発明化合物のプロドラッ
グおよび医薬的に許容できる塩類、そのようなプロドラッグの医薬的に許容でき
る塩類、および他の生物学的均等物も開示内容に含まれる。

【００４１】 用語”プロドラッグ”は、不活性な形で製造され、体内またはその細胞内で内
因性酵素もしくは他の化学物質および／または状態の作用により活性形（すなわ
ち薬物）に変換される療法薬を示す。特に、プロドラッグ形の本発明のオリゴヌ
クレオチドはWO 93/24510（Gosselinら，1993年12月9日公開）またはWO 94/2676
4（Imbachら）に開示された方法に従ってＳＡＴＥ［リン酸（Ｓ−アセチル−２
−チオエチル）］誘導体として製造される。

【００４２】 用語”医薬的に許容できる塩類”は、本発明化合物の生理学的および医薬的に
許容できる塩類、すなわち親化合物の目的とする生物学的活性を保持し、かつ望
ましくない毒性をそれに与えない塩類を表す。

【００４３】 医薬的に許容できる塩基付加塩は、金属またはアミン、たとえばアルカリ金属
およびアルカリ土類金属または有機アミンにより形成される。カチオンとして用
いる金属の例は、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどである
。適切なアミンの例は、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカ
イン、コリン、ジエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、エチレンジアミ
ン、Ｎ−メチルグルカミンおよびプロカインである(たとえばBerge et al., "医
薬塩類" J. of Pharma Sci., 1977, 66, 1-19参照)。これら酸性化合物の塩基付
加塩類は、常法により遊離酸形と十分な量の目的塩基とを接触させて塩を形成す
ることにより製造される。常法により塩形と酸を接触させ、遊離酸を単離するこ
とにより、遊離酸形を再生できる。遊離酸形とそれらの各塩形は極性溶剤中での
溶解度など特定の物理的特性において若干異なるが、他の点では塩類は本発明の
目的に関してそれらの各遊離酸と同等である。本明細書中で用いる”医薬付加塩
”には、本発明組成物の成分のいずれかの酸形の医薬的に許容できる塩が含まれ
る。これらにはアミンの有機酸塩または無機酸塩が含まれる。好ましい酸塩は塩
酸塩、酢酸塩、サリチル酸塩、硝酸塩およびリン酸塩である。医薬的に許容でき
る他の適切な塩類は当業者に周知であり、たとえば下記の多様な無機酸および有
機酸との塩基塩がこれに含まれる：無機酸、たとえば塩酸、臭化水素酸、硫酸ま
たはリン酸；有機カルボン酸、スルホン酸、スルホ酸もしくはホスホ酸、または
Ｎ−置換スルファミン酸、たとえば酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、コハク
酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、メチルマレイン酸、フマル酸、リンゴ
酸、酒石酸、乳酸、シュウ酸、グルコン酸、グルカル酸、グルクロン酸、クエン
酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、サリチル酸、４−アミノサリチル酸、２
−フェノキシ安息香酸、２−アセトキシ安息香酸、エンボン酸（embonic acid）
、ニコチン酸またはイソニコチン酸；およびアミノ酸、たとえば自然界でタンパ
ク質の合成に関与している２０種類のα−アミノ酸（たとえばグルタミン酸また
はアスパラギン酸）、ならびにフェニル酢酸、メタンスルホン酸、エタンスルホ
ン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、エタン−１，２−ジスルホン酸、ベン
ゼンスルホン酸、４−メチルベンゼンスルホン酸、ナフタレン−２−スルホン酸
、ナフタレン−１，５−ジスルホン酸、２−または３−ホスホグリセレート、グ
ルコース−６−ホスフェート、Ｎ−シクロヘキシルスルファミン酸（シクラメー
トを形成）、あるいは他の酸性有機化合物、たとえばアスコルビン酸。化合物の
医薬的に許容できる塩類は、医薬的に許容できるカチオンにより調製することも
できる。医薬的に許容できる適切なカチオンは当業者に周知であり、アルカリ、
アルカリ土類、アンモニウムおよび第四級アンモニウムなどのカチオンがこれに
含まれる。炭酸塩または炭酸水素塩も可能である。

【００４４】 オリゴヌクレオチドについて医薬的に許容できる好ましい塩類の例には下記の
ものが含まれるが、これらに限定されない：（ａ）カチオン、たとえばナトリウ
ム、カリウム、アンモニウム、マグネシウム、カルシウム、ポリアミン、たとえ
ばスペルミンおよびスペルミジンなどにより形成される塩類；（ｂ）無機酸、た
とえば塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸などにより形成される酸付加塩；
（ｃ）有機酸、たとえば酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、フマ
ル酸、グルコン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン
酸、パルミチン酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンスルホン酸、メ
タンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、ポリガラ
クツロン酸などにより形成される塩類；および（ｄ）アニオン元素、たとえば塩
素、臭素およびヨウ素により形成される塩類。

【００４５】 本発明のアンチセンス化合物は、診断、治療、予防に、ならびに研究用試薬お
よびキットとして使用できる。治療用としては、本発明によるアンチセンス化合
物を投与することにより、ＰＩ３Ｋ ｐ８５の発現調節により治療できる疾患ま
たは障害をもつ疑いのある動物、好ましくはヒトを治療する。本発明化合物は、
有効量のアンチセンス化合物を医薬的に許容できる適切な希釈剤またはキャリヤ
ーに添加することにより、医薬組成物として使用できる。本発明のアンチセンス
化合物および方法の使用は、予防として、たとえば感染、炎症または腫瘍形成を
阻止もしくは遅延させるためにも有用でありうる。

【００４６】 本発明のアンチセンス化合物は、ＰＩ３Ｋ ｐ８５コード核酸にハイブリダイ
ズし、この事実を利用してサンドイッチアッセイ法その他のアッセイ方法を容易
に構築できるので、研究および診断に有用である。本発明のアンチセンスオリゴ
ヌクレオチドとＰＩ３Ｋ ｐ８５コード核酸のハイブリダイゼーションは、当技
術分野で既知の手段で検出できる。そのような手段には、オリゴヌクレオチドへ
の酵素の結合、オリゴヌクレオチドの放射性標識、または他の任意の適切な検出
手段が含まれうる。試料中のＰＩ３Ｋ ｐ８５のレベルを検出するためにそのよ
うな検出手段を用いるキットも作製できる。

【００４７】 本発明には、本発明のアンチセンス化合物を含有する医薬組成物および製剤も
含まれる。本発明の医薬組成物は、局所または全身のいずれの処置を望むかに応
じて、また処置すべき領域に応じて多様な方法で投与できる。投与は、局所（眼
投与、ならびに膣および直腸への送達を含めた粘膜投与、肺投与、たとえば散剤
またはエアゾル剤の吸入または吹入れによる投与（ネブライザーによる投与を含
む）；気管内、鼻腔内、上皮および経皮投与を含む）、経口または非経口投与で
あってよい。非経口投与には、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内または筋肉内への
注射または注入；頭蓋内、たとえばくも膜下または脳室内投与が含まれる。少な
くとも１つの２’−Ｏ−メトキシエチル修飾をもつオリゴヌクレオチドは、経口
投与に特に有用であると考えられる。

【００４８】 局所投与用の医薬組成物および製剤には、経皮パッチ、軟膏剤、ローション剤
、クリーム剤、ゲル剤、点滴剤、坐剤、噴霧剤、液剤および散剤が含まれる。一
般的な医薬用キャリヤー、水性、粉末または油性の基剤、増粘剤などが必要であ
るか、あるいは望ましい。コーティングしたコンドーム、手袋なども有用であろ
う。

【００４９】 経口投与用の医薬組成物および製剤には、散剤もしくは顆粒剤、水もしくは非
水性媒質中の懸濁液剤もしくは液剤、カプセル剤、分包剤または錠剤が含まれる
。増粘剤、フレーバー剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤または結合剤が望ましい。

【００５０】 非経口、くも膜下または脳室内投与用の医薬組成物および製剤には、無菌水性
液剤が含まれ、これは緩衝剤、希釈剤、および他の適切な添加剤、たとえば透過
促進剤、キャリヤー化合物その他の医薬的に許容できるキャリヤーまたは賦形剤
（これらに限定されない）を含有してもよい。

【００５１】 本発明の医薬組成物には、液剤、エマルジョン、およびリポソーム含有製剤が
含まれるが、これらに限定されない。これらの組成物は多様な成分から調製でき
、これには予め調製した液体、自己乳化性固体、および自己乳化性半固体が含ま
れるが、これらに限定されない。

【００５２】 本発明の医薬製剤は単位剤形として提供するのが好都合であり、医薬工業にお
いて周知の常法により製造できる。そのような方法には、有効成分を医薬用キャ
リヤー（単数または複数種類）または賦形剤（単数または複数種類）と混和する
工程が含まれる。一般に製剤は、有効成分を液体キャリヤーもしくは微細に分割
した固体キャリヤーまたは両者と均一かつ密に混和し、次いで必要ならば生成物
を造形することにより製造される。

【００５３】 本発明組成物は、多数の可能な剤形のいずれか、たとえば錠剤、カプセル剤、
液体シロップ剤、軟質ゲル剤、坐剤および浣腸剤（これらに限定されない）へ製
剤化できる。本発明組成物は、水性、非水性または混合媒質中の懸濁液剤として
製剤化することもできる。水性懸濁液剤はさらに、懸濁液剤の粘度を高める物質
、たとえばカルボキシメチルセルロース、ソルビトールおよび／またはデキスト
ランを含有してもよい。懸濁液剤は安定剤を含有してもよい。

【００５４】 本発明の１態様においては、医薬組成物をフォーム（foam）として製剤化およ
び使用することができる。医薬フォームには、エマルジョン、マイクロエマルジ
ョン、クリーム剤、ゼリー剤およびリポソームが含まれるが、これらに限定され
ない。これらの製剤は基本的性質においては類似するが、最終製品の成分および
コンシステンシーが異なる。そのような組成物および製剤の製造は医薬および製
剤の当業者に一般に知られており、それらを本発明組成物の製剤化に適用できる
。

【００５５】 本発明組成物はエマルジョンとして調製および製剤化できる。エマルジョンは
、一般に１つの液体が通常は直径０．１μｍを超える液滴の形で他の液体に分散
した不均一系である(Idson, Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger
and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc.,ニューヨーク州ニューヨーク
, volume 1, p. 199; Rosoff, Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieg
er and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc.,ニューヨーク州ニューヨー
ク, Volume 1, p. 245; Block, Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rie
ger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc.,ニューヨーク州ニューヨ
ーク, volume 2, p. 335; Higuchi et al., Remington's Pharmaceutical Scien
ces, Mack Publishing Co.,ペンシルベニア州イーストン, 1985, p. 301)。エマ
ルジョンは２つの非混和性液相が密に混合し、互いに分散したものからなる二相
系であることが多い。一般にエマルジョンは油中水型（ｗ／ｏ）または水中油型
（ｏ／ｗ）でありうる。水相が微細に分割されてバルク油相に微小液滴として分
散した場合、生じた組成物を油中水型（ｗ／ｏ）エマルジョンと呼ぶ。あるいは
、油相が微細に分割されてバルク水相に微小液滴として分散した場合、生じた組
成物を水中油型（ｏ／ｗ）エマルジョンと呼ぶ。エマルジョンは分散相および有
効薬物（水相、油相中の溶液として、またはそれ自体が別個の相として存在しう
る）のほかに追加成分を含有してもよい。医薬賦形剤、たとえば乳化剤、安定剤
、染料および酸化防止剤も、必要に応じてエマルジョン中に存在してもよい。医
薬エマルジョンは、油中水中油型（ｏ／ｗ／ｏ）および水中油中水型（ｗ／ｏ／
ｗ）エマルジョンの場合のように、２より多い相からなる多相エマルジョンであ
ってもよい。このような複雑な製剤は、単純な二相エマルジョンでは得られない
ある利点を与える場合がしばしばある。ｏ／ｗエマルジョンの個々の油滴が水の
小滴を内包した多相エマルジョンはｗ／ｏ／ｗエマルジョンを構成する。同様に
、連続油相中に安定化された水球に内包される油滴の系はｏ／ｗ／ｏエマルジョ
ンを形成する。

【００５６】 エマルジョンは、熱力学的安定性がほとんど、またはまったくないことを特徴
とする。しばしば、乳化剤または製剤粘度によりエマルジョンの分散相または不
連続相を外部相または連続相中に良好に分散させ、この形態を維持する。エマル
ジョン型軟膏基剤およびクリーム剤の場合のように、エマルジョンのいずれかの
相が半固体または固体であってよい。エマルジョンを安定化するための他の手段
は、エマルジョンのいずれかの相に取込まれうる乳化剤の使用を伴う。乳化剤は
おおまかに４つのカテゴリーに分類できる：合成界面活性剤、天然乳化剤、吸収
基剤、および微小分散固体(Idson, Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman,
Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc.,ニューヨーク州ニュー
ヨーク, volume 1, p. 199)。

【００５７】 合成界面活性剤はエマルジョン形成に広く用いられ、文献に概説されている(R
ieger, Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.),
1988, Marcel Dekker, Inc.,ニューヨーク州ニューヨーク, volume 1, p. 285;
Idson, Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.)
, Marcel Dekker, Inc.,ニューヨーク州ニューヨーク, 1988, volume 1, p. 199
)。界面活性剤は一般に両親媒性であり、親水性部分と疎水性部分を含む。界面
活性剤の親水性と疎水性の比率は親水性／疎水性バランス（ＨＬＢ）と呼ばれ、
界面活性剤を分類し、製剤の調製に際して選択する際に価値ある手段できる。界
面活性剤は親水基の性質に基づいて異なるクラスに分類できる：非イオン性、ア
ニオン性、カチオン性および両性(Rieger, Pharmaceutical Dosage Forms, Lieb
erman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc.,ニューヨーク
州ニューヨーク, volume 1, p. 285)。

【００５８】 エマルジョンの調製に用いられる天然乳化剤には、ラノリン、密ろう、ホスフ
ァチド、レシチンおよびアラビアゴムが含まれる。無水ラノリンおよび親水ワセ
リンのような吸収基剤は親水性をもつので、水を吸収してｗ／ｏエマルジョンを
形成し、なおかつ半固体コンシステンシーを保持することができる。微細に分割
した固体も、特に界面活性剤と組み合わせて粘稠な製剤中に、良好な乳化剤とし
て用いられている。これらには、極性無機固体、たとえば重金属水酸化物、非膨
潤性クレー、たとえばベントナイト、アタパルジャイト、ヘクトライト、カオリ
ン、モンモリロナイト、コロイドケイ酸アルミニウムおよびコロイドケイ酸アル
ミニウムマグネシウム、顔料、ならびに非極性固体、たとえばカーボンまたはト
リステアリン酸グリセリルが含まれる。

【００５９】 エマルジョン製剤中には多様な非乳化性物質も含有され、エマルジョンの特性
に寄与している。これらには、脂肪、油、ろう、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪
エステル、湿潤剤、親水コロイド、保存剤および酸化防止剤が含まれる(Block,
Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988,
Marcel Dekker, Inc.,ニューヨーク州ニューヨーク, volume 1, p. 335; Idson,
Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988,
Marcel Dekker, Inc.,ニューヨーク州ニューヨーク, volume 1, p. 199)。

【００６０】 親水コロイド（Hydrophilic colloidまたはhydrocolloid）には、天然ゴムお
よび合成ポリマー、たとえば多糖類（たとえばアラビアゴム、寒天、アルギン酸
、カラゲナン、グアルゴム、インドゴムおよびトラガカント）、セルロース誘導
体（たとえばカルボキシメチルセルロースおよびカルボキシプロピルセルロース
）、および合成ポリマー（たとえばカルボマー（carbomer）、セルロースエーテ
ルおよびカルボキシビニルポリマー）が含まれる。これらは水中で分散または膨
潤してコロイド溶液を形成し、これが分散相液滴の周りに強靭な界面フィルムを
形成することにより、また外部相の粘度を高めることにより、エマルジョンを安
定化する。

【００６１】 エマルジョンは微生物の増殖を支持しやすい多数の成分、たとえば炭水化物、
タンパク質、ステロールおよびホスファチドを含有することがしばしばあるので
、これらの製剤にはしばしば保存剤を添加する。エマルジョン製剤に含有させる
慣用の保存剤には、メチルパラベン、プロピルパラベン、第四級アンモニウム塩
、塩化ベンザルコニウム、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステルおよびホウ酸が含ま
れる。酸化防止剤も製剤の劣化を防ぐためにエマルジョン製剤に一般に添加され
る。使用される酸化防止剤は、フリーラジカルスカベンジャー、たとえばトコフ
ェロール、没食子酸アルキル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロ
キシトルエン、または還元剤、たとえばアスコルビン酸およびメタ亜硫酸水素ナ
トリウム、ならびに酸化防止剤相乗剤、たとえばクエン酸、酒石酸およびレシチ
ンであってよい。

【００６２】 皮膚、経口および非経口経路でのエマルジョン製剤の適用ならびにそれらの調
製方法は、文献に概説されている(Idson, Pharmaceutical Dosage Forms, Liebe
rman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc.,ニューヨーク州
ニューヨーク, volume 1, p. 199)。経口送達用エマルジョン製剤は、製剤化し
やすく、吸収および生物学的利用能からみて効率的であるという理由で、きわめ
て広く用いられている(Rosoff, Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rie
ger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc.,ニューヨーク州ニューヨ
ーク, volume 1, p. 245; Idson, Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, R
ieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc.,ニューヨーク州ニュー
ヨーク, volume 1, p. 199)。鉱油ベースの緩下剤、油溶性ビタミン剤、および
高脂肪栄養剤は、一般にｏ／ｗエマルジョンとして経口投与されている物質のひ
とつである。

【００６３】 本発明の１態様においては、オリゴヌクレオチドおよび核酸の組成物をマイク
ロエマルジョンとして製剤化する。マイクロエマルジョンは、単一で光学的に等
方性の、熱力学的に安定な液体溶液である、水、油および両親媒性物質の系と定
義できる(Rosoff, Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Bank
er (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc.,ニューヨーク州ニューヨーク, volume
1, p. 245)。一般にマイクロエマルジョンは、まず油を界面活性剤水溶液に分散
させ、次いで透明な系を形成するのに十分な量の第４成分（中鎖長アルコール）
を添加することにより調製される系である。したがってマイクロエマルジョンは
、２つの非混和性液体が界面活性分子の界面膜により安定化された、熱力学的に
安定な等方性の透明な分散液とも記載されている(Leung and Shah, Controlled
Release of Drugs: Polymers and Aggregate Systems, Rosoff, M., Ed., 1989,
VCH Publishers, ニューヨーク, p. 185-215)。マイクロエマルジョンは一般に
、油、水、界面活性剤、補助界面活性剤および電解質を含む３〜５成分の組合わ
せにより調製される。マイクロエマルジョンが油中水型（ｗ／ｏ）または水中油
型（ｏ／ｗ）のいずれであるかは、使用する油および界面活性剤の性質、ならび
に界面活性剤分子の極性ヘッドおよび炭化水素テイルの構造および幾何学的充填
に依存する(Schott, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing
Co.,ペンシルベニア州イーストン, 1985, p. 271)。

【００６４】 状態図を利用した現象学的方法が広く研究され、当業者にマイクロエマルジョ
ン製剤化方法の包括的知見をもたらした(Rosoff, Pharmaceutical Dosage Forms
, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc.,ニュー
ヨーク州ニューヨーク, volume 1, p. 245; Block, Pharmaceutical Dosage For
ms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc.,ニュ
ーヨーク州ニューヨーク, volume 1, p. 335)。マイクロエマルジョンは通常の
エマルションと比較して、自然に形成される熱力学的に安定な液滴の製剤中に水
不溶性薬物が可溶化されるという利点をもつ。

【００６５】 マイクロエマルジョンの調製に用いられる界面活性剤には、イオン性界面活性
剤、非イオン性界面活性剤、Brij 96、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、
ポリグリセロール脂肪酸エステル、モノラウリン酸テトラグリセロール(ML310)
、モノオレイン酸テトラグリセロール(MO310)、モノオレイン酸ヘキサグリセロ
ール(PO310)、ペンタオレイン酸ヘキサグリセロール(PO500)、モノカプリン酸デ
カグリセロール(MCA750)、モノオレイン酸デカグリセロール(MO750)、セスキオ
レイン酸デカグリセロール(SO750)、デカオレイン酸デカグリセロール(DAO750)
の単独、または補助界面活性剤と組み合わせたものが含まれる。補助界面活性剤
は通常は短鎖アルコール、たとえばエタノール、１−プロパノールおよび１−ブ
タノールであり、界面活性剤フィルムに浸透して界面活性剤分子間に生成した空
隙のため無秩序フィルムを形成することにより、界面流動性を高める作用をもつ
。ただしマイクロエマルジョンは補助界面活性剤を用いなくても調製でき、無ア
ルコールの自己乳化性マイクロエマルジョン系が当技術分野で知られている。水
相は一般に水、薬物水溶液、グリセロール、PEG300、PEG400、ポリグリセロール
、プロピレングリコール、およびエチレングリコール誘導体であってよいが、こ
れらに限定されない。油相には一般に、Captex 300、Captex 355、Capmul MCM、
脂肪酸エステル、中鎖(C8-C12)モノ、ジおよびトリ−グリセリド、ポリオキシエ
チル化グリセリル脂肪酸エステル、脂肪アルコール、ポリグリコール化グリセリ
ド、飽和ポリグリコール化Ｃ８〜Ｃ１０グリセリド、植物油、ならびにシリコー
ン油などの物質が含まれるが、これらに限定されない。

【００６６】 マイクロエマルジョンは、薬物の可溶化および薬物の吸収増大の観点から特に
重要である。ペプチドを含めた薬物の経口による生物学的利用能を高めるために
、脂質ベースのマイクロエマルジョン（ｏ／ｗとｗ／ｏの両方）が提唱された(C
onstantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385-1390; Rits
chel, Meth. Find. Exp. Clin. Pharmacol., 1993, 13, 205)。マイクロエマル
ジョンは、薬物の可溶化の向上、酵素加水分解からの薬物の保護、界面活性剤誘
発による膜の流動性および透過性の変化に起因する薬物吸収亢進の可能性、調製
しやすさ、固体剤形と比較した経口投与しやすさ、臨床効力の改善、ならびに毒
性低下という利点をもつ(Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1
994, 11, 1385; Ho et al., J. Pharm. Sci., 1996, 85, 138-143)。マイクロエ
マルジョンはそれらの成分を周囲温度で混和すると自然に形成されることがしば
しばある。これは、熱不安定性の薬物、ペプチドまたはオリゴヌクレオチドを製
剤化する場合に、特に有利である。マイクロエマルジョンは、化粧品および医薬
品のいずれにおいても、有効成分の経皮送達に有効であった。本発明のマイクロ
エマルジョン組成物および製剤は、消化管からのオリゴヌクレオチドおよび核酸
の全身吸収増大を促進し、かつ消化管、膣、口腔その他の投与領域内でのオリゴ
ヌクレオチドおよび核酸の局所細胞取込みを改善するであろう。

【００６７】 本発明のマイクロエマルジョンは、製剤の特性を改善し、かつ本発明のオリゴ
ヌクレオチドおよび核酸の吸収を高めるために、追加の成分および添加剤、たと
えばモノステアリン酸ソルビタン(Grill 3)、Labrasol、ならびに浸透促進剤を
含有してもよい。本発明のマイクロエマルジョンに用いられる浸透促進剤は、５
つの広義のカテゴリーのうちのいずれかに属するものとして分類できる−界面活
性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート化剤、および非キレート化−非界面活性剤(L
ee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p
. 92)。これらの各クラスについては前記に述べた。

【００６８】 リポソーム マイクロエマルジョンのほかに、薬物の製剤化のために研究および使用されて
いる組織化された界面活性剤構造体は多数ある。これらには、単分子層、ミセル
、二分子層およびベシクルが含まれる。ベシクル、たとえばリポソームは、それ
らが示す作用の特異性および持続時間のため、薬物送達の観点から強い関心がも
たれている。本発明において用いる用語”リポソーム”は、球状の二分子層（１
以上）状に配置された両親媒性脂質からなるベシクルを意味する。

【００６９】 リポソームは親油性物質から形成された膜および水性内部環境をもつ単膜また
は多重膜ベシクルである。水性部分には送達すべき組成物が含有される。カチオ
ンリポソームは細胞壁に融合しうるという利点をもつ。非カチオンリポソームは
細胞壁とそれほど効率的には融合できないが、インビボでマクロファージにより
取り込まれる。

【００７０】 哺乳動物の皮膚と交差相互作用するためには、脂質ベシクルはそれぞれ５０ｎ
ｍ未満の直径をもつ一連の細孔を適切な経皮勾配の影響下で通過しなければなら
ない。したがって、変形性が高く、それらの細孔を通過しうるリポソームを使用
することが望ましい。

【００７１】 リポソームがもつ他の利点には下記のものが含まれる：天然リン脂質から得た
リポソームは生体適合性かつ生物分解性である；リポソームは広範な水溶性およ
び脂溶性薬物を取り込むことができる；リポソームはその内部コンパートメント
に封入した薬物を代謝および分解から保護することができる(Rosoff, Pharmaceu
tical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel De
kker, Inc.,ニューヨーク州ニューヨーク, volume 1, p. 245)。リポソーム製剤
の調製に際して考慮すべき重要なことは、リポソームの脂質表面電荷、ベシクル
サイズおよび水性体積である。

【００７２】 リポソームは有効成分を作用部位へ輸送および送達するために有用である。リ
ポソーム膜の構造は生体膜に類似するので、リポソームが組織に適用されるとリ
ポソームは細胞膜と合体し始める。リポソームと細胞の合体が進行するのに伴っ
て、リポソーム内容物が細胞内へ移され、ここで有効薬剤が作用することができ
る。

【００７３】 リポソーム製剤は多くの薬物の送達様式として広範な研究において注目されて
いる。局所投与用としてリポソームは他の製剤に優る幾つかの利点をもつことが
証明されつつある。そのような利点には、投与薬物の多量全身吸収に関連する副
作用が少なくなり、目的ターゲットにおける投与薬物の蓄積が増加し、親水性お
よび疎水性の両方の多様な薬物を皮膚内へ投与することができる点が含まれる。

【００７４】 リポソームが高分子量ＤＮＡを含めた薬剤を皮膚内へ送達する能力について、
幾つかの報文に詳述されている。鎮痛薬、抗体、ホルモンおよび高分子量ＤＮＡ
を含めた化合物が皮膚に投与された。大部分の適用は上皮（upper epidermis）
をターゲティングするものであった。

【００７５】 リポソームは２つの広義のクラスに属する。カチオンリポソームは正に荷電し
たリポソームであり、負に荷電したＤＮＡ分子と相互作用して安定な複合体を形
成する。正に荷電したこのＤＮＡ／リポソーム複合体は負に荷電した細胞表面に
結合し、エンドソームに取り込まれる。エンドソーム内は酸性ｐＨであるので、
リポソームは破裂し、その内容物を細胞質内へ放出する(Wang et al., Biochem.
Biophys. Res. Commun., 1987, 147, 980-985)。

【００７６】 ｐＨ感受性または負に荷電したリポソームはＤＮＡと複合体形成するのではな
く、それを捕獲する。ＤＮＡと脂質が両方とも同様に荷電しているので、複合体
形成ではなく反発が起きる。それにもかかわらず、あるＤＮＡはこれらのリポソ
ームの水性内部環境内に捕獲される。チミジンキナーゼ遺伝子をコードするＤＮ
Ａを培養細胞単層へ送達するために、ｐＨ感受性リポソームが用いられた。この
外来遺伝子の発現がターゲット細胞において検出された(Zhou et al., Journal
of Controlled Release, 1992, 19, 269-274)。

【００７７】 ある主要なタイプのリポソーム組成物は、天然ホスファチジルコリン以外のリ
ン脂質を含有する。天然リポソーム組成物は、たとえばジミリストイルホスファ
チジルコリン（ＤＭＰＣ）またはジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰ
Ｃ）から形成できる。アニオンリポソーム組成物は一般にジミリストイルホスフ
ァチジルグリセロールから形成され、一方、融合誘導性アニオンリポソームは主
にジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）から形成される。
他のタイプのリポソーム組成物は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、たとえば大
豆ＰＣおよび卵ＰＣから形成される。他のタイプは、リン脂質および／またはホ
スファチジルコリンおよび／またはコレステロールの混合物から形成される。

【００７８】 幾つかの研究で、皮膚へのリポソーム薬物製剤の局所送達について評価された
。インターフェロンを含有するリポソームをモルモットの皮膚に適用すると皮膚
ヘルペス性潰瘍が軽減し、これに対し他の手段（たとえば液剤またはエマルジョ
ンとして）によるインターフェロン送達は無効であった(Weiner et al., Journa
l of Drug Targeting, 1992, 2, 405-410)。さらに、他の研究で水性系を用いた
インターフェロン投与に対し、リポソーム製剤の一部として投与したインターフ
ェロンの有効性が試験され、リポソーム製剤は水性投与に優ると結論された(du
Plessis et al., Antiviral Research, 1992, 18, 259-265)。

【００７９】 非イオンリポソーム系、特に非イオン界面活性剤およびコレステロールを含む
系も試験され、薬物送達におけるそれらの有用性が判定された。サイクロスポリ
ンＡをマウス皮膚の真皮内へ送達するために、Novasome（商標）I（ジラウリン
酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテ
ル）およびNovasome（商標）II（ジステアリン酸グリセリル／コレステロール／
ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル）を含む非イオンリポソーム製
剤が用いられた。結果は、そのような非イオンリポソーム系が皮膚の種々の層内
へのサイクロスポリンＡの沈着促進に有効であることを示した(Hu et al. S.T.P
.Pharma. Sci., 1994, 4, 6, 466)。

【００８０】 リポソームには”立体的に安定化された”リポソームも含まれる。本明細書に
おいて用いるこの用語は、リポソームに取り込まれるとそのような特殊な脂質を
含まないリポソームと比較して循環寿命を延長する特殊な１以上の脂質を含むリ
ポソームを表す。立体的に安定化されたリポソームの例は、リポソームのベシク
ル形成脂質部分の１部が（Ａ）１以上の糖脂質、たとえばモノシアロガングリオ
シド（monosialoganglioside）Ｇ_M1を含むもの、または（Ｂ）１以上の親水性ポ
リマー、たとえばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分で誘導体化されている
ものである。いずれか特定の理論により拘束されたくはないが、少なくとも、ガ
ングリオシド、スフィンゴミエリンまたはＰＥＧ誘導体化脂質を含有する立体的
に安定化されたリポソームについては、これらの立体的に安定化されたリポソー
ムの循環半減期延長は細網内皮系（ＲＥＳ）の細胞への取込みが低下することに
由来すると当技術分野では考えられている(Allen et al., FEBS Letters, 1987,
223, 42; Wu et al., Cancer Research, 1993, 53, 3765)。１以上の糖脂質を
含む種々のリポソームが当技術分野で知られている。Papahadjopoulos et al. (
Ann. N.Y. Acad. Sci., 1987, 507, 64)は、モノシアロガングリオシドＧ_M1、
硫酸ガラクトセレブロシドおよびホスファチジルイノシトールがリポソームの血
中半減期を改善する能力について報告した。これらの所見はGabizon et al. (Pr
oc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1988, 85, 6949)により解説されている。U.S.P.
4,837,028およびWO 88/04924（両方ともAllenら）には、（１）スフィンゴミエ
リンおよび（２）ガングリオシドＧ_M1またはガラクトセレブロシド硫酸エステル
を含むリポソームが開示されている。U.S.P. 5,543,152 (Webbら)には、スフィ
ンゴミエリンを含むリポソームが開示されている。WO 97/13499 (Limら)には、
１，２−ｓｎ−ジミリストイルホスファチジルコリンを含むリポソームが開示さ
れている。

【００８１】 １以上の親水性ポリマーで誘導体化された脂質を含む多数のリポソーム、およ
びその製造方法が当技術分野で知られている。Sunamoto et al. (Bull. Chem. S
oc. Jpn., 1980, 53, 2778)は、ＰＥＧ部分を含有する非イオン界面活性剤2C₁₂1
5Gを含むリポソームを開示している。Illum et al. (FEBS Lett., 1984, 167, 7
9)は、ポリスチレン粒子を高分子グリコールで親水性コーティングすると血中半
減期が有意に延長されると報告した。ポリアルキレングリコール（たとえばＰＥ
Ｇ）のカルボキシル基を結合させることにより修飾された合成リン脂質がSears
(U.S.P. 4,426,330および4,534,899)により記載されている。Klibanov et al. (
FEBS Lett., 1990, 268, 235)は、ＰＥＧまたはステアリン酸ＰＥＧで誘導体化
したホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）を含むリポソームの血中循環半減
期が有意に延長されたことを証明する実験を記載している。Blume et al. (Bioc
himica et Biophysica Acta, 1990, 1029, 91)は、他のＰＥＧ誘導体化リン脂質
、たとえばジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）とＰＥ
Ｇの組合わせから形成したＤＳＰＥ−ＰＥＧにまでこのような所見を広げた。外
面に共有結合ＰＥＧ部分をもつリポソームがEP 0 445 131 B1およびWO 90/04384
（Fisher）に記載されている。ＰＥＧで誘導体化したＰＥを１〜２０モル％含有
するリポソーム組成物、およびその使用方法が、Woodleら(U.S.P. 5,013,556お
よび5,356,633)およびMartinら(U.S.P. 5,213,804およびEP 0 496 813 B1)によ
り記載されている。他の多数の脂質−ポリマー結合体を含むリポソームがWO 91/
05545およびU.S.P. 5,225,212 (両方ともMartinら)ならびにWO 94/20073 (Zalip
skyら)に開示されている。ＰＥＧ修飾セラミド脂質を含むリポソームがWO 96/10
391 (Choiら)に記載されている。U.S.P. 5,540,935 (Miyazakiら)および5,556,9
48 (Tagawaら)にはＰＥＧ含有リポソームが記載され、これらは官能基でそれら
の表面をさらに誘導体化することができる。

【００８２】 核酸を含むリポソームが少数ではあるが当技術分野で知られている。WO 96/40
062（Thierryら）には、高分子量核酸をリポソームに封入する方法が開示されて
いる。U.S.P. 5,264,221（Tagawaら）には、タンパク質結合リポソームが開示さ
れ、そのようなリポソームの内容物がアンチセンスＲＮＡを含有しうると断言さ
れている。U.S.P. 5,665,710（Rahmanら）には、オリゴデオキシヌクレオチドを
リポソームに封入する特定の方法が記載されている。WO 97/04787（Loveら）に
は、ｒａｆ遺伝子をターゲティングするアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む
リポソームが開示されている。

【００８３】 トランスファーソーム（Transfersome）はさらに他のタイプのリポソームであ
り、魅力的な薬物送達ビヒクル候補の高変形性脂質凝集体である。トランスファ
ーソームは、その脂質滴より小さな細孔に容易に浸透しうるほど高変形性の脂質
滴であると述べることができる。トランスファーソームは使用環境に適合性であ
り、たとえば自己最適化性（皮膚の細孔の形状に適合性である）、自己修復性で
あり、分断されずにそれらのターゲットに到達する場合が多く、かつしばしば自
己装填性である。トランスファーソームを調製するために、標準的リポソーム組
成物に表面エッジ活性化剤（surface edge-activator）、通常は界面活性剤を添
加することができる。トランスファーソームは血清アルブミンを皮膚に送達する
ために用いられる。トランスファーソーム仲介による血清アルブミン送達は、血
清アルブミン含有溶液の皮下注射と同程度に有効であることが示された。

【００８４】 界面活性剤はエマルジョン（マイクロエマルジョンを含む）およびリポソーム
などの製剤に広く利用される。多様なタイプの界面活性剤（天然および合成とも
に）の特性を分類および等級付けするための最も一般的な方法は、親水性／親油
性バランス（ＨＬＢ）を用いるものである。親油基（”ヘッド”としても知られ
る）の性質は製剤に用いる種々の界面活性剤を分類するために最も有用な手段を
提供する(Rieger, Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New Y
ork, NY, 1988, p. 285)。

【００８５】 界面活性剤分子がイオン化していない場合、それは非イオン界面活性剤として
分類される。非イオン界面活性剤は医薬品および化粧品に広く用いられ、広範な
ｐＨ値にわたって使用できる。一般にそれらのＨＬＢ値はそれらの構造に応じて
２〜約１８である。非イオン界面活性剤には、非イオンエステル、たとえばエチ
レングリコールエステル、プロピレングリコールエステル、グリセリルエステル
、ポリグリセリルエステル、ソルビタンエステル、スクロースエステルおよびエ
トキシル化エステルが含まれる。非イオンアルカノールアミドおよびエーテル類
、たとえば脂肪アルコールエトキシラート、プロポキシル化アルコール、および
エトキシル化／プロポキシル化ブロックポリマーもこのクラスに含まれる。ポリ
オキシエチレン系界面活性剤は、非イオン界面活性剤クラスの最も一般的なメン
バーである。

【００８６】 界面活性剤分子が水に溶解または分散した際に負の電荷をもつ場合、その界面
活性剤はアニオン系に分類される。アニオン界面活性剤には、カルボキシレート
、たとえばセッケン、アシルラクチレート（acyl lactylate）、アミノ酸のアシ
ルアミド、硫酸エステル、たとえばアルキルスルフェートおよびエトキシル化ア
ルキルスルフェート、スルホネート、たとえばアルキルベンゼンスルホネート、
アシルイセチオネート、アシルタウレートおよびスルホスクシネート、ならびに
ホスフェートが含まれる。アニオン界面活性剤の最も重要なメンバーは、アルキ
ルスルフェートおよびセッケンである。

【００８７】 界面活性剤分子が水に溶解または分散した際に正の電荷をもつ場合、その界面
活性剤はカチオン系に分類される。カチオン界面活性剤には、第四級アンモニウ
ム塩およびエトキシル化アミンが含まれる。第四級アンモニウム塩はこのクラス
のうち最も多く用いられるメンバーである。

【００８８】 界面活性剤分子が正または負のいずれの電荷も保有する能力をもつ場合、それ
は両性として分類される。両性界面活性剤には、アクリル酸誘導体、置換アルキ
ルアミド、Ｎ−アルキルベタインおよびホスファチドが含まれる。

【００８９】 医薬、製剤およびエマルジョン中における界面活性剤の使用について概説され
ている(Rieger, Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc.,ニューヨ
ーク州ニューヨーク, 1988, p. 285)。

【００９０】 浸透促進剤 １態様において本発明は、核酸、特にオリゴヌクレオチドを動物の皮膚に効率
的に送達するために種々の浸透促進剤を使用する。大部分の薬物はイオン化した
形とイオン化していない形の両方で溶液中に存在する。しかし通常は、細胞膜を
容易に越えるのは脂溶性または親油性の薬物のみである。通過すべき膜を浸透促
進剤で処理すると、非親油性薬物ですら細胞膜を越えうることが見いだされた。
浸透促進剤は、細胞膜を越えた非親油性薬物の拡散を補助するほか、親油性薬物
の透過性をも促進する。

【００９１】 浸透促進剤は５つのカテゴリーのうちのいずれかに属するものとして分類でき
る：界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸、キレート化剤、および非キレート化−非界面
活性剤(Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,
1991, p. 92)。これら各クラスの浸透促進剤について以下に詳述する。

【００９２】 界面活性剤：本発明に関して界面活性剤（または表面活性剤）は、水溶液中
に溶解した場合にその溶液の表面張力または水溶液と他の液体との界面張力を低
下させ、その結果、粘膜からのオリゴヌクレオチドの吸収を促進する化学物質で
ある。胆汁酸塩および脂肪酸のほか、これらの浸透促進剤には、たとえばラウリ
ル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテルおよびポリオキ
シエチレン−２０−セチルエーテル(Lee et al., Critical Reviews in Therape
utic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92)；ならびにペルフルオロ化合物エマ
ルション、たとえばＦＣ−４３（Takahashi et al., J. Pharm. Pharmacol., 19
88, 40, 252)が含まれる。

【００９３】 脂肪酸：浸透促進剤として作用する種々の脂肪酸およびそれらの誘導体には
、たとえば下記のものが含まれる：オレイン酸、ラウリン酸、カプリン酸（ｎ−
デカン酸）、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレ
ン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン（１−モノオレイル−ｒａ
ｃ−グリセロール）、ジラウリン、カプリル酸、アラキドン酸、グリセロール１
−モノカプレート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニ
チン類、アシルコリン類、そのＣ_1-10アルキル（たとえばメチル、イソプロピル
およびｔ−ブチル）エステル、ならびにそのモノ−およびジ−グリセリド（すな
わちオレエート、ラウレート、カプレート、ミリステート、パルミテート、ステ
アレート、リノレエートなど）(Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic
Drug Carrier Systems, 1991, p.92; Muranishi, Critical Reviews in Therap
eutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; El Hariri et al., J. Pharm. P
harmacol., 1992, 44, 651-654)。

【００９４】 胆汁酸塩：胆汁の生理学的役割には、脂質および脂溶性ビタミンの分散およ
び吸収の促進が含まれる(Brunton, Chapter 38 in: Goodman & Gilman's The Ph
armacological Basis of Therapeutics, 9th Ed., Hardman et al. Eds., McGra
w-Hill,ニューヨーク, 1996, pp. 934-935)。種々の天然胆汁酸塩およびそれら
の合成誘導体が浸透促進剤として作用する。したがって用語”胆汁酸塩”には、
天然の胆汁成分およびそれらの合成誘導体がいずれも含まれる。本発明の胆汁酸
塩には、たとえば下記のものが含まれる：コール酸（またはその医薬的に許容で
きるナトリウム塩であるコール酸ナトリウム）、デヒドロコール酸（デヒドロコ
ール酸ナトリウム）、デオキシコール酸（デオキシコール酸ナトリウム）、グル
コール酸（グルコール酸ナトリウム）、グリコール酸（グリコール酸ナトリウム
）、グリコデオキシコール酸（グリコデオキシコール酸ナトリウム）、タウロコ
ール酸（タウロコール酸ナトリウム）、タウロデオキシコール酸（タウロデオキ
シコール酸ナトリウム）、ケノデオキシコール酸（ケノデオキシコール酸ナトリ
ウム）、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、タウロ−２４，２５−ジヒドロ
フシジン酸ナトリウム（ＳＴＤＨＦ）、グリコジヒドロフシジン酸ナトリウムお
よびポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ＰＯＥ）(Lee et al., Criti
cal Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92; Swinyard,
Chapter 39 In: Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Gennaro, e
d., Mack Publishing Co.,ペンシルベニア州イーストン, 1990, p. 782-783; Mu
ranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7,
1-33; Yamamoto et al., J. Pharm. Exp. Ther., 1992, 263, 25; Yamashita et
al., J. Pharm. Sci., 1990, 79, 579-583)。

【００９５】 キレート化剤：本発明に関して使用されるキレート化剤は、溶液から金属イ
オンをそれとの錯体形状により除去し、その結果、粘膜からのオリゴヌクレオチ
ドの吸収を促進する化合物と定義できる。本発明における浸透促進剤としての使
用に関して、キレート化剤はさらにＤＮａｓｅ阻害剤としても作用するという利
点をもつ。最もよく解明されているＤＮＡヌクレアーゼは触媒作用のために二価
金属イオンを必要とし、したがってキレート化剤により阻害されるからである(J
arrett, J. Chromatogr., 1993, 618, 315-339)。本発明のキレート化剤には下
記のものが含まれるが、これらに限定されない：エチレンジアミン四酢酸二ナト
リウム（ＥＤＴＡ）、クエン酸、サリチレート（たとえばサリチル酸ナトリウム
、５−メトキシサリチレートおよびホモバニレート）、コラーゲンのＮ−アシル
誘導体、ｌａｕｒｅｔｈ−９、およびβ−ジケトンのＮ−アミノアシル誘導体（
エナミン）(Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Syst
ems, 1991, page 92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carr
ier Systems, 1990, 7, 1-33; Buur et al., J. Control Rel., 1990, 14, 43-5
1)。

【００９６】 非キレート化−非界面活性剤：本明細書中で用いる非キレート化−非界面活
性剤系の浸透促進化合物は、キレート化剤または界面活性剤としては有意の活性
を示さないが、それにもかかわらず消化器粘膜からのオリゴヌクレオチドの吸収
を促進する化合物と定義できる(Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic
Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33)。このクラスの浸透促進剤には、たとえ
ば不飽和環状尿素、１−アルキル−および１−アルケニルアザシクロアルカノン
誘導体(Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,
1991, p. 92)；および非ステロイド系抗炎症薬、たとえばジクロフェナク（dic
lofenac）ナトリウム、インドメタシンおよびフェニルブタゾン(Yamashita et a
l., J. Pharm. Pharmacol., 1987, 39, 621-626)が含まれる。

【００９７】 細胞レベルでのオリゴヌクレオチドの取込みを促進する物質を、本発明の医薬
その他の組成物に添加することもできる。たとえばカチオン脂質、たとえばリポ
フェクチン(Junichiら, U.S.P. 5,705,188)、カチオングリセロール誘導体、お
よびポリカチオン分子、たとえばポリリシン(Lolloら，WO 97/30731)も、オリゴ
ヌクレオチドの細胞取込みを促進することが知られている。

【００９８】 投与した核酸の浸透を促進するために他の物質も使用でき、これにはグリコー
ル類、たとえばエチレングリコールおよびプロピレングリコール、ピロール類、
たとえば２−ピロール、アゾン（ａｚｏｎｅ）類、ならびにテルペン類、たとえ
ばリモネンおよびメントンが含まれる。

【００９９】 キャリヤー 本発明のある種の組成物は製剤中にキャリヤー化合物をも含有する。本明細書
中で用いる”キャリヤー化合物”または”キャリヤー”は、核酸またはその類似
体であって、不活性である（すなわちそれ自体は生物学的活性をもたない）が、
インビボプロセスではたとえば生物活性核酸を分解し、または循環からその除去
を促進することにより、生物学的活性をもつ核酸の生物学的利用能を低下させる
核酸と認識されるものを表すことができる。核酸とキャリヤー化合物（一般に後
者の物質は過剰）を同時投与すると、肝、腎その他の循環外リザバーにおいて回
収される核酸の量を実質的に減らすことができる。これは、キャリヤー化合物と
本発明の核酸とが共通の受容体に対して競合するためであろう。たとえば肝組織
における部分ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの回収は、それをポリイノ
シン酸、硫酸デキストラン、ポリシチジン酸または４−アセトアミド−４’−イ
ソチオシアノ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸と共に投与すると減らすこ
とができる(Miyao et al., Antisense Res. Dev., 1995, 5, 115-121; Takakura
et al., Antisense & Nucl. Acid Drug Dev., 1996, 6, 177-183)。

【０１００】 賦形剤 キャリヤー化合物と異なり、”医薬用キャリヤー”または”賦形剤”は、１以
上の核酸を動物に送達するための医薬的に許容できる溶剤、懸濁化剤または他の
いずれかの薬理学的不活性ビヒクルである。賦形剤は液体または固体であってよ
く、所定の医薬組成物の核酸または他の成分と組み合わせた場合に目的の嵩、コ
ンシステンシーなどが得られるように、意図した投与様式に従って選択される。
代表的な医薬キャリヤーには下記のものが含まれるが、これらに限定されない：
結合剤（たとえばプレゼラチン化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン
またはヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）；充填剤（たとえば乳糖その
他の糖、微結晶セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセル
ロース、ポリアクリラートまたはリン酸水素カルシウムなど）；滑沢剤（たとえ
ばステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド状二酸化ケイ素、ステ
アリン酸、ステアリン酸金属塩、水素添加植物油、コーンスターチ、ポリエチレ
ングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなど）；崩壊剤（たとえば
デンプン、グリコール酸デンプンナトリウムなど）；および湿潤剤（たとえばラ
ウリル硫酸ナトリウムなど）。

【０１０１】 核酸と有害な反応をしない、非経口投与に適した、医薬的に許容できる有機ま
たは無機賦形剤を用いて、本発明の組成物を製剤化することもできる。医薬的に
許容できる適切なキャリヤーには、水、塩類溶液、アルコール類、ポリエチレン
グリコール類、ゼラチン、乳糖、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タル
ク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリ
ドンなどが含まれるが、これらに限定されない。

【０１０２】 核酸の局所投与用製剤には、無菌および非無菌水溶液、一般的溶剤（たとえば
アルコール類）中の非水溶液、または液体もしくは固体油性基剤中の核酸溶液が
含まれる。これらの溶液は緩衝剤、希釈剤および他の適切な添加剤を含有しても
よい。核酸と有害な反応をしない、非経口投与に適した、医薬的に許容できる有
機または無機賦形剤を使用できる。

【０１０３】 医薬的に許容できる適切な賦形剤には、水、塩類溶液、アルコール類、ポリエ
チレングリコール類、ゼラチン、乳糖、アミロース、ステアリン酸マグネシウム
、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニル
ピロリドンなどが含まれるが、これらに限定されない。

【０１０４】 他の成分 本発明組成物はさらに、医薬組成物中に一般的にみられる他の補助成分を、当
技術分野で確立されているレベルで含有してもよい。たとえば本発明組成物は追
加の適合性薬効物質、たとえばかゆみ止め、収斂薬、局所麻酔薬または抗炎症薬
を含有してもよく、本発明組成物の種々の剤形を物理的に形成する際に有用な他
の物質、たとえば染料、フレーバー剤、保存剤、酸化防止剤、乳白剤、増粘剤お
よび安定剤を含有してもよい。ただし、そのような物質を添加する際には、本発
明組成物の成分の生物学的活性を不都合に妨害してはならない。製剤を殺菌し、
そして所望により、製剤の核酸（単数または複数種類）と有害な相互作用をしな
い助剤、たとえば滑沢剤、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与
える塩類、緩衝剤、着色剤、フレーバー剤および／または芳香剤などと混合する
ことができる。

【０１０５】 水性懸濁液剤は、懸濁液の粘度を高める物質、たとえばカルボキシメチルセル
ロースナトリウム、ソルビトールおよび／またはデキストランを含有してもよい
。懸濁液剤は安定剤を含有することもできる。

【０１０６】 本発明のある態様は、（ａ）１以上のアンチセンス化合物および（ｂ）１以上
の、非アンチセンス機序で機能する他の化学療法薬を含有する医薬組成物を提供
する。そのような化学療法薬の例には下記のものが含まれるが、これらに限定さ
れない：抗癌薬、たとえばダウノルビシン（daunorubicin）、ダクチノマイシン
（dactinomycin）、ドキソルビシン（doxorubicin）、ブレオマイシン、マイト
マイシン、ナイトロジェンマスタード、クロラムブシル（chlorambucil）、メル
ファラン（melphalan）、シクロホスファミド、６−メルカプトプリン、６−チ
オグアニン、シタラビン（cytarabine）（ＣＡ）、５−フルオロウラシル（５−
ＦＵ）、フロクスウリジン（floxuridine）（５−ＦＵｄＲ）、メトトレキセー
ト（ＭＴＸ）、コルヒチン、ビンクリスチン（vincristine）、ビンブラスチン
（vinblastine）、エトポシド（etoposide）、テニポシド（teniposide）、シス
プラチンおよびジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）。一般にThe Merck Manu
al of Diagnosis and Therapy, 15th Ed., Berkow et al., eds., 1987,ニュー
ジャージー州ローウェイ, p. 1206-1228を参照されたい。抗炎症薬、たとえば非
ステロイド系抗炎症薬およびコルチコステロイド（これらに限定されない）、な
らびに抗ウイルス薬、たとえばルビビリン（ribivirin）、ビダラビン（vidarab
ine）、アシクロビル（acyclovir）およびガンシクロビル（ganciclovir）（こ
れらに限定されない）を本発明組成物中に組み合わせることもできる。一般にTh
e Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 15th Ed., Berkow et al., eds.,
1987,ニュージャージー州ローウェイ,それぞれp. 2499-2506および46-49を参照
されたい。他の非アンチセンス化学療法薬も本発明の範囲に含まれる。２以上の
組合わせ化合物を一緒に、または順次使用してもよい。

【０１０７】 他の関連態様において本発明組成物は、第１核酸をターゲティングする１以上
のアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチド、および第２核酸ターゲットを
ターゲティングする１以上の他のアンチセンス化合物を含有することができる。
多数のアンチセンス化合物の例が当技術分野で知られている。２以上の組合わせ
化合物を一緒に、または順次使用してもよい。

【０１０８】 療法用組成物の製剤化およびそれらのその後の投与は当業者が容易になしうる
と考えられる。投与量は処置すべき疾病状態の重症度および反応性に依存し、処
置は数日から数カ月まで、あるいは疾病状態が治癒するか、または軽減が得られ
るまで続けられる。最適投与計画は、患者の体内の薬剤蓄積を測定することによ
り計算できる。当業者は最適投与量、投与方法および反復速度を容易に判定でき
る。最適投与量は個々のオリゴヌクレオチドの相対力価に応じて異なり、一般に
インビトロおよびインビボ動物モデルにおいて有効であると認められたＥＣ₅₀に
基づいて推定できる。一般に投与量は０．０１μｇ〜１００ｇ／体重ｋｇであり
、１日、週、月もしくは年に１回以上、または２〜２０年毎に１回投与すること
ができる。当業者は、体液または組織中で測定された薬物の滞留時間および濃度
に基づいて投与反復速度を容易に推定できる。処置が成功した後、疾病状態の再
発を防ぐために患者は維持療法を受けることが望ましい。その場合、オリゴヌク
レオチド０．０１μｇ〜１００ｇ／体重ｋｇの維持用量を、１日１回以上ないし
２０年毎に１回投与する。

【０１０９】 本発明を特にその好ましい態様に従って記載した。以下の実施例は本発明を説
明するためのものにすぎず、本発明を限定するためのものではない。 実施例 実施例１ オリゴヌクレオチド合成のためのヌクレオシドホスホロアミダイト デオキシ及び２’−アルコキシアミダイト 2'-デオキシ及び2'-メトキシβ−シアノエチルジイソプロピルホスホロアミダ
イトは商業的な入手源（例えば、Chemgenes, Needham MA 又は Glen Research,
Inc. Sterling VA)から購入した。他の 2'-O-アルコキシ置換ヌクレオシドアミ
ダイトは、本明細書に援用される米国特許5,506,351に記載されているように製
造した。 2'-アルコキシアミダイトを用いて合成されるオリゴヌクレオチドに関
しては、非修飾オリゴヌクレオチドのための標準サイクルを用いた、但し、テト
ラゾールと塩基とのパルスデリバリー後の待機工程は３６０秒間に延長した。

【０１１０】 5-メチル-2'-デオキシシチジン(5-Me-C)ヌクレオチドを含有するオリゴヌクレ
オチドは、公開された方法[Sanghvi等, Nucleic Acids Research, 1993, 21, 31
97-3203]に従って、商業的に入手可能なホスホロアミダイト (Glen Research, S
terling VA 又は ChemGenes,Needham MA)を用いて合成した。

【０１１１】 2'-フルオロアミダイト 2'-フルオロデオキシアデノシンアミダイト 2'-フルオロオリゴヌクレオチドを既述されたように［[Kawasaki等, J. Med.
Chem.,1993, 36, 831-841]及び、本明細書に援用される米国特許5,670,633と同
様に合成した。簡単に説明すると、保護されたヌクレオシドN6-ベンゾイル-2'-
デオキシ-2'-フルオロアデノシンを商業的に入手可能な9-β-D-アラビノフラノ
シルアデニンを出発物質として用いて、2'-α-フルオロ原子を2'-β-トリチル基
のS_N2-置換によって導入する文献方法を改変することによって、合成した。 したがって、N6-ベンゾイル-9-β-D-アラビノフラノシルアデニンが3',5'-ジテ
トラヒドロピラニル(THP)中間体として中程度の収率で選択的に保護された。THP
とN6-ベンゾイル基との脱保護は標準方法論を用いて達成され、標準方法を用い
て、5'-ジメトキシトリチル-(DMT)と5'-DMT-3'-ホスホロアミダイト中間体とを
得た。

【０１１２】 2'-フルオロデオキシグアノシン 2'-デオキシ-2'-フルオログアノシンの合成は、出発物質としてのテトライソ
プロピルジシロキサニル(TPDS)保護9-β-D-アラビノフラノシルグアニンと、中
間体ジイソブチリルアラビノフラノシルグアノシンへの転化とを用いて達成され
た。TPDS基の脱保護に続いて、ヒドロキシル基をTHPで保護して、ジイソブチリ
ルジ-THP保護アラビノフラノシルグアニンを得た。選択的なＯ−脱アシル化及び
トリフラート化(triflation)に続いて、粗生成物をフッ化物によって処理し、次
に、THP基を脱保護した。標準方法論を用いて、5'-DMT-及び5'-DMT-3'-ホスホロ
アミダイトを得た。

【０１１３】 2'-フルオロウリジン 2'-デオキシ-2'-フルオロウリジンの合成は、2,2'-アンヒドロ-1-β-D-アラビ
ノフラノシルウラシルを70%フッ化水素-ピリジンによって処理する文献方法の改
変によって達成された。標準方法を用いて、5'-DMT-及び 5'-DMT-3'ホスホロア
ミダイトを得た。

【０１１４】 2'-フルオロデオキシシチジン 2'-デオキシ-2'-フルオロシチジンを2'-デオキシ-2'-フルオロウリジンのアミ
ノ化を介して合成し、続いて選択的保護を行なって、N4-ベンゾイル-2'-デオキ
シ-2'-フルオロシチジンを得た。標準方法を用いて、5'-DMT及び 5'-DMT-3'ホス
ホロアミダイトを得た。

【０１１５】 2'-O-(2-メトキシエチル) 修飾アミダイト 2'-O-メトキシエチル-置換ヌクレオシドアミダイトを次のように、或いはMart
in, P., Helvetica Chimica Acta, 1995, 78, 486-504の方法によって調製する
。

【０１１６】 2,2'-アンヒドロ[1-(β-D-アラビノフラノシル)-5-メチルウリジン] 5-メチルウリジン(リボシルチミン,Yamasa, Choshi, Japanから商業的に入手
可能）(72.0 g, 0.279 M)と、ジフェニルカーボネート(90.0 g, 0.420 M) と、
炭酸水素ナトリウム(2.0 g, 0.024 M)とをDMF (300 mL)に加えた。この混合物を
撹拌しながら、加熱還流させ、発生した二酸化炭素ガスを制御した方法で放出さ
せた。１時間後に、やや暗色化した溶液を減圧下で濃縮した。得られたシロップ
をジエチルエーテル(2.5 L)中に撹拌しながら注入した。生成物はガムを形成し
た。エーテルをデカントし、残渣を最少量のメタノール(約400 mL)中に溶解した
。この溶液を新鮮なエーテル(2.5 L)中に注入して、堅いガムを得た。エーテル
をデカントして、ガムを真空オーブン(60℃，1 mm Hg，24時間)内で乾燥させて
、固体を得て、これを粉砕して、明黄褐色粉末(57 g,85% 粗収率)を得た。NMRス
ペクトルは、そのナトリウム塩としてのフェノール(約5%)によって汚染された構
造に一致した。この物質をさらなる反応のためにそのまま用いた（又は、酢酸エ
チル中メタノールの勾配(10-25%)を用いてカラムクロマトグラフィーによってさ
らに精製して、白色固体、mp 222-4℃を得ることができる）。

【０１１７】 2'-O-メトキシエチル-5-メチルウリジン 2,2'-アンヒドロ-5-メチルウリジン(195g,0.81M)と、トリス(2-メトキシエチ
ル)ボレート(231 g,0.98 M)と、2-メトキシエタノール(1.2 L)とを2 L ステンレ
ス鋼圧力容器に加えて、160℃の予熱した油浴に入れた。155-160℃において48時
間加熱した後に、容器を開けて、溶液を蒸発乾燥させて、MeOH(200 mL)と共に磨
砕した。残渣を熱アセトン(1 L)中に懸濁させた。不溶な塩を濾過し、アセトン(
150mL)によって洗浄し、濾液を蒸発させた。残渣(280 g)をCH₃CN(600 mL)中に溶
解して、蒸発させた。シリカゲルカラム(3 kg)を0.5% Et₃NHを含有するCH₂Cl₂/
アセトン/MeOH (20:5:3)中にパックした。残渣をCH₂Cl₂(250 mL)中に溶解し、シ
リカ(150 g)に吸着させてから、カラムに負荷した。生成物をパッキング溶媒に
よって溶出して、160 g (63%)の生成物を得た。不純なフラクションを再処理す
ることによって、追加の物質を得た。

【０１１８】 2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルウリジン 2'-O-メトキシエチル-5-メチルウリジン(160 g, 0.506 M)をピリジン(250 mL)
と共に共沸蒸発させ、乾燥残渣をピリジン(1.3 L)中に溶解した。ジメトキシト
リチルクロリドの第１アリコート(94.3 g, 0.278 M)を加え、混合物を室温にお
いて１時間撹拌した。ジメトキシトリチルクロリドの第２アリコート(94.3 g, 0
.278 M)を加えて、反応をさらに１時間撹拌した。次に、メタノール(170 mL)を
加えて、反応を停止させた。 HPLCは、約70%の生成物の存在を示した。溶媒を蒸
発させ、CH₃CN (200 mL)と共に磨砕した。残渣をCHCl₃ (1.5 L)中に溶解し、2x5
00 mLの飽和NaHCO₃と2x500 mLの飽和NaClによって抽出した。有機相をNa₂SO₄上
で乾燥させ、濾過し、蒸発させた。275 gの残渣が得られた。この残渣を、0.5%
Et₃NHを含有するEtOAc/ヘキサン/アセトン (5:5:1)でパックされ、溶出される3.
5 kgのシリカゲルカラム上で精製した。純粋なフラクションを蒸発させて、164
gの生成物を得た。不純なフラクションから約20 gの追加の生成物が得られ、総
収量183 g (57%)となった。

【０１１９】 3'-O-アセチル-2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルウリ
ジン 2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルウリジン(106 g, 0.
167 M)と、DMF/ピリジン(562 mLのDMFと188 mLのピリジンとから調製された3:1
混合物，750 mL）と、無水酢酸(24.38 mL, 0.258 M)とを一緒にして、室温にお
いて２４時間撹拌した。この反応をTLC によって、TLCサンプルをMeOHの添加に
よって最初にクエンチすることによってモニターした。TLCによって判定した反
応の完了時に、MeOH (50 mL)を加えて、混合物を35℃において蒸発させた。残渣
をCHCl₃ (800mL)中に溶解し、2x200 mLの飽和炭酸水素ナトリウムと2x200 mL の
飽和NaClによって抽出した。水層を200 mLのCHCl₃によって逆抽出した。一緒に
した有機層(organics)を硫酸ナトリウムによって乾燥させ、蒸発させて、122 g
の残渣(約90% 生成物)を得た。残渣を3.5 kg シリカゲルカラム上で精製し、EtO
Ac/ヘキサン(4:1)を用いて溶出した。純粋な生成物フラクションを蒸発させて、
96 g (84%)を得た。後のフラクションから追加の1.5 gを回収した。

【０１２０】 3'-O-アセチル-2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチル-4-
トリアゾールウリジン 3'-O-アセチル-2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルウリ
ジン(96 g, 0.144 M)をCH₃CN (700 mL)中に溶解することによって、第１溶液を
調製して、わきに置いた。トリエチルアミン(189 mL, 1.44 M)をCH₃CN (1 L)中
のトリアゾール(90 g, 1.3 M)の溶液に加え、-5℃に冷却して、オーバーヘッド
スターラーを用いて0.5時間撹拌した。0-10℃に維持した撹拌溶液に３０分間に
わたってPOCl₃を滴加し、得られた混合物をさらに２時間撹拌した。第１溶液を
後者の溶液に45分間にわたって滴加した。得られた反応混合物を低温室に一晩保
存した。塩を反応混合物から濾別し、溶液を蒸発させた。残渣をEtOAc (1 L)中
に溶解し、不要な固体を濾過によって除去した。濾液を1x300 mLのNaHCO₃ と2x3
00 mLの飽和NaClによって洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、蒸発させた。
残渣をEtOAcと共に磨砕して、標題化合物を得た。

【０１２１】 2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルシチジン ジオキサン(500 mL)とNH₄OH (30 mL)中の3'-O-アセチル-2'-O-メトキシエチル
-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチル-4-トリアゾールウリジン(103 g, 0.141 M)
の溶液を室温において2時間撹拌した。ジオキサン溶液を蒸発させ、残渣をMeOH
(2x200 mL)と共に共沸蒸留した。残渣をMeOH (300 mL)中に溶解し、2Ｌステンレ
ス鋼圧力容器に移した。 NH₃ガスによって飽和したMeOH (400 mL)を加え、容器
を100℃に2 時間加熱した(TLCは完全な転化を示した)。容器の中身を蒸発乾燥さ
せ、残渣をEtOAc (500 mL)中に溶解し、飽和NaCl (200 mL)によって１回洗浄し
た。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、溶媒を蒸発させて、85 g (95%)の標
題化合物を得た。

【０１２２】 N4-ベンゾイル-2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルシチ
ジン 2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチル-シチジン(85 g, 0.
134 M)をDMF (800 mL)中に溶解し、無水安息香酸(37.2 g, 0.165 M)を撹拌しな
がら加えた。3時間撹拌した後に、TLC は反応が約９５％完成したことを示した
。溶媒を蒸発させ、残渣をMeOH (200 mL)と共に共沸蒸留した。残渣をCHCl₃ (70
0 mL)中に溶解し、飽和NaHCO₃ (2x300 mL)と飽和NaCl (2x300 mL)によって抽出
し、MgSO₄上で乾燥させ、蒸発させて残渣(96g)を得た。この残渣を1.5 kg シリ
カカラム上で溶離溶媒として0.5% Et₃NH含有EtOAc/ヘキサン(1:1)を用いてクロ
マトグラフィーした。純粋な生成物フラクションを蒸発させて、90 g (90%)の標
題化合物を得た。

【０１２３】 N4-ベンゾイル-2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルシチ
ジン-3'-アミダイト N4-ベンゾイル-2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルシチ
ジン(74 g, 0.10 M)をCH₂Cl₂ (1 L)中に溶解した。テトラゾールジイソプロピル
アミン(7.1 g)と2-シアノエトキシ-テトラ-(イソプロピル)ホスフィット(40.5 m
L, 0.123 M)を窒素雰囲気下で撹拌しながら加えた。得られた混合物を室温にお
いて20時間撹拌した(TLCは、反応が 95%完成したことを示した)。反応混合物を
飽和NaHCO₃ (1x300 mL)と飽和NaCl (3x300 mL)によって抽出した。水性洗液 (aq
ueous washes)をCH₂Cl₂ (300 mL)によって逆抽出し、抽出物を一緒にして、MgSO ₄ 上で乾燥させ、濃縮した。得られた残渣を1.5 kgシリカカラム上で溶離溶媒と
してEtOAc/ヘキサン(3:1)を用いてクロマトグラフィーした。純粋なフラクショ
ンを一緒にして、90.6 g (87%)の標題化合物を得た。

【０１２４】 2'-O-(アミノオキシエチル)ヌクレオシドアミダイトと2'-O-(ジメチルアミノ
オキシエチル) ヌクレオシドアミダイト 2'-(ジメチルアミノオキシエトキシ) ヌクレオシドアミダイト 2'-(ジメチルアミノオキシエトキシ)ヌクレオシドアミダイト[当該技術分野で
は、2'-O-(ジメチルアミノオキシエチル)ヌクレオシドアミダイトとしても知ら
れる]を以下のパラグラフで述べるように調製する。アデノシン、シチジン及び
グアノシン・ヌクレオシドアミダイトを、チミジン(5-メチルウリジン)と同様に
調製する、但し、環外アミン(exocyclic amines)をアデノシンとシチジンの場合
にはベンゾイル部分によって、グアノシンの場合にはイソブチリルによって保護
する。

【０１２５】 5'-O-tert-ブチルジフェニルシリル-O²-2'-アンヒドロ-5-メチルウリジン O²-2'-アンヒドロ-5-メチルウリジン(Pro. Bio. Sint., Varese, Italy, 100.
0g, 0.416 mmol)と、ジメチルアミノピリジン(0.66g,0.013eq, 0.0054mmol)とを
乾燥ピリジン(500ml)中にアルゴン雰囲気下、周囲温度において、機械的に撹拌
しながら溶解した。tert-ブチルジフェニルクロロシラン(125.8g, 119.0mL, 1.1
eq, 0.458mmol)を一度に加えた。反応を周囲温度において１６時間撹拌した。TL
C (Rf 0.22,酢酸エチル)は完成した反応を実証した。溶液を減圧下で濃縮して、
濃厚な油状物を得た。これをジクロロメタン(1 L)と飽和炭酸水素ナトリウム(2x
1 L)とブライン(1 L)とに分配した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、減
圧下で濃縮して、濃厚な油状物を得た。この油状物を酢酸エチルとエチルエーテ
ルとの1:1混合物(600mL)中に溶解し、溶液を-10℃に冷却した。得られた結晶質
生成物を濾過によって回収し、エチルエーテル(3x200 mL)によって洗浄し、乾燥
させて(40℃, 1mm Hg, 24時間)、149g (74.8%)の白色固体を得た。TLCと NMRは
、純粋な生成物と一致した。

【０１２６】 5'-O-tert-ブチルジフェニルシリル-2'-O-(2-ヒドロキシエチル)-5-メチルウ
リジン 2 L ステンレス鋼非撹拌式圧力反応器に、テトラヒドロフラン中ボラン(1.0 M
, 2.0 eq, 622mL)を加えた。ヒュームフードにおいて、手動で撹拌しながら、エ
チレングリコール(350 mL, 過剰)を最初に、水素発生が停止するまで、慎重に加
えた。5'-O-tert-ブチルジフェニルシリル-O²-2'-アンヒドロ-5-メチルウリジン
(149 g,0.311 mol)と炭酸水素ナトリウム(0.074 g, 0.003 eq)を手動で撹拌しな
がら加えた。反応器を密封して、160℃の内部温度に達するまで、油浴中で加熱
し、次に16時間(圧力< 100 psig)維持した。反応器を周囲温度に冷却して、開け
た。TLC (所望の生成物ではRf 0.67、ara-T 副生成物ではRf 0.82、酢酸エチル
）は、生成物への約70%転化を実証した。さらなる副生成物形成を避けるために
、反応を停止し、温水浴(40-100℃)中、減圧(10−1mm Hg)下で濃縮し、より極端
な条件を用いて、エチレングリコールを除去した。［或いは、低沸点溶媒が一度
留去されたならば、残留溶液を酢酸エチルと水とに分配することができる。生成
物は有機相中に含まれることになる。］ 残渣をカラムクロマトグラフィー(2kg
シリカゲル、酢酸エチル−ヘキサン勾配1:1−4:1)によって精製した。適当なフ
ラクションを一緒にして、ストリップし、乾燥させて、白色のパリパリした泡状
物(84g, 50%)としての生成物、汚染された出発物質(17.4g)、純粋な再使用可能
な出発物質20gを得た。出発物質、より純粋でない回収出発物質に基づく収率は5
8%であった。 TLC とNMRは99%純度生成物と一致した。

【０１２７】 2'-O-([2-フタルイミドキシ)エチル]-5'-t-ブチリルジフェニルシリル-5-メチ
ルウリジン 5'-O-tert-ブチルジフェニルシリル-2'-O-(2-ヒドロキシエチル)-5-メチルウ
リジン(20g, 36.98mmol)をトリフェニルホスフィン(11.63g, 44.36mmol)及び N-
ヒドロキシフタルイミド(7.24g, 44.36mmol)と混合した。次に、これを高真空下
、40℃においてP₂O₅上で２日間乾燥させた。この反応混合物をアルゴンによって
フラッシュし、乾燥THF(369.8mL, Aldrich, 確実に密封したボトル)を加えて、
透明な溶液を得た。ジエチル−アゾジカルボキシレート(6.98mL,44.36mmol)を反
応混合物に滴加した。生じた深赤色が丁度消失してから、次の滴加を行なうよう
に、添加速度を維持する。添加が完了した後に、反応を４時間撹拌した。この時
点までに、TLCは反応の完成を示した(酢酸エチル:ヘキサン, 60:40)。溶媒を真
空下で蒸発させた。得られた残渣をフラッシュカラムに載せ、酢酸エチル：ヘキ
サン(60:40)によって溶出して、2'-O-([2-フタルイミドキシ)エチル]-5'-t-ブチ
ルジフェニルシリル-5-メチルウリジンを白色泡状物(21.819 g,86%)として得た
。

【０１２８】 5'-O-tert-ブチルジフェニルシリル-2'-O-[(2-ホルムアドキシイミノオキシ)
エチル]-5-メチルウリジン 2'-O-([2-フタルイミドキシ)エチル]-5'-t-ブチルジフェニルシリル-5-メチル
ウリジン(3.1g, 4.5mmol)を乾燥CH₂Cl₂(4.5mL)中に溶解し、メチルヒドラジン(3
00mL, 4.64mmol)を-10℃〜0℃において加えた。1 時間後に、混合物を濾過し、
濾液を氷冷CH₂Cl₂によって洗浄し、一緒にした有機相を水、ブラインによって洗
浄して、無水Na₂SO₄上で乾燥させた。溶液を濃縮して、2'-O-(アミノオキシエチ
ル)チミジンを得て、これを次にMeOH (67.5mL)中に溶解した。これに、ホルムア
ミド(20%水溶液、w/w, 1.1 eq.)を加え、得られた混合物を1 時間撹拌した。溶
媒を真空下で除去し、残渣をクロマトグラフィーして、5'-O-tert-ブチルジフェ
ニルシリル-2'-O-[(2-ホルムアドキシイミノオキシ(formadoximinooxy)）エチル
]-5-メチルウリジンを白色泡状物(1.95 g, 78%)として得た。

【０１２９】 5'-O-tert-ブチルジフェニルシリル-2'-O-[N,N-ジメチルアミノオキシエチル]
-5-メチルウリジン 5'-O-tert-ブチルジフェニルシリル-2'-O-[(2-ホルムアドキシイミノオキシ)
エチル]-5-メチルウリジン (1.77g, 3.12mmol)を乾燥MeOH (30.6mL)中の1M ピリ
ジニウムp-トルエンスルホネート(PPTS)の溶液中に溶解した。シアノホウ水素化
ナトリウム(0.39g, 6.13mmol)をこの溶液に不活性雰囲気下、10℃において加え
た。 この反応混合物を10℃において10 分間撹拌した。この後に、反応器を氷
浴から取り出して、室温において 2 時間撹拌し、反応をTLC( CH₂Cl₂中5% MeOH
)によってモニターした。NaHCO₃水溶液(5%, 10mL)を加えて、酢酸エチル(2x20mL
)によって抽出した。酢酸エチル相を無水Na₂SO₄上で乾燥させ、蒸発乾燥させた
。残渣をMeOH (30.6mL)中1M PPTS の溶液中に溶解した。ホルムアルデヒド(20%
w/w, 30mL, 3.37mmol)を加えて、反応混合物を室温において10分間撹拌した。反
応混合物を氷浴中で10℃に冷却し、シアノホウ水素化ナトリウム(0.39g, 6.13mm
ol)を加えて、反応混合物を10℃において10分間撹拌した。１０分間後に、反応
混合物を氷浴から取り出し、室温において2時間撹拌した。この反応混合物に、5
% NaHCO₃(25mL)溶液を加えて、酢酸エチル(2x25mL)によって抽出した。酢酸エチ
ル層を無水Na₂SO₄上で乾燥させ、蒸発乾燥させた。得られた残渣をフラッシュ・
カラムクロマトグラフィーによって精製して、CH₂Cl₂中の5%MeOHによって溶出し
て、5'-O-tert-ブチルジフェニルシリル-2'-O-[N,N-ジメチルアミノオキシエチ
ル]-5-メチルウリジンを白色泡状物(14.6g, 80%)として得た。

【０１３０】 2'-O-(ジメチルアミノオキシエチル)-5-メチルウリジン トリエチルアミントリヒドロフルオリド(3.91mL, 24.0mmol)を乾燥THFとトリ
エチルアミン(1.67mL, 12mmol,乾燥,KOH上に維持)中に溶解した。次に、トリエ
チルアミン-2HFのこの混合物を5'-O-tert-ブチルジフェニルシリル-2'-O-[N,N-
ジメチルアミノオキシエチル]-5-メチルウリジン(1.40g, 2.4mmol)に加えて、室
温において２４時間撹拌した。反応をTLC (CH₂Cl₂中5% MeOH)によってモニター
した。溶媒を真空下で除去して、残渣をフラッシュカラム上に載せ、CH₂Cl₂中10
% MeOHによって溶出して、2'-O-(ジメチルアミノオキシエチル)-5-メチルウリジ
ン (766mg, 92.5%)を得た。

【０１３１】 5'-O-DMT-2'-O-(ジメチルアミノオキシエチル)-5-メチルウリジン 2'-O-(ジメチルアミノオキシエチル)-5-メチルウリジン(750mg, 2.17mmol)をP ₂ O₅上で 高真空下、40℃において一晩乾燥させた。次に、これを無水ピリジン(2
0mL)と共に共沸蒸発させた。得られた残渣をピリジン(11mL)中にアルゴン雰囲気
下で溶解した。4-ジメチルアミノピリジン(26.5mg, 2.60mmol)と、4,4'-ジメト
キシトリチルクロリド(880mg,2.60mmol)を混合物に加え、反応混合物を室温にお
いて、出発物質の全てが消失するまで撹拌した。ピリジンを真空下で除去し、残
渣をクロマトグラフィーして、CH₂Cl₂（数滴のピリジンを含有）中10% MeOH で
溶出して、5'-O-DMT-2'-O-(ジメチルアミノ−オキシエチル)-5-メチルウリジン
(1.13g, 80%)を得た。

【０１３２】 5'-O-DMT-2'-O-(2-N,N-ジメチルアミノオキシエチル)-5-メチルウリジン-3'-[
(2-シアノエチル)-N,N-ジイソプロピルホスホロアミダイト] 5'-O-DMT-2'-O-(ジメチルアミノオキシエチル)-5-メチルウリジン(1.08g, 1.6
7mmol)をトルエン(20mL)と共に共沸蒸発させた。残渣に、N,N-ジイソプロピルア
ミンテトラゾニド(0.29g,1.67mmol)を加えて、P₂O₅上で 高真空下、４０℃にお
いて一晩乾燥させた。次に、この反応混合物を無水アセトニトリル(8.4mL)中に
溶解して、2-シアノエチル-N,N,N¹,N¹-テトライソプロピルホスホロアミダイト(
2.12mL, 6.08mmol)を加えた。反応混合物を不活性雰囲気下、周囲温度において
４時間撹拌した。反応の進行をTLC (ヘキサン:酢酸エチル 1:1)によってモニタ
ーした。溶媒を蒸発させてから、残渣を酢酸エチル(70mL)中に溶解して、5%NaHC
O₃水溶液(40mL)によって洗浄した。酢酸エチル層を無水Na₂SO₄上で乾燥させ、濃
縮した。得られた残渣をクロマトグラフィーして（溶離剤として酢酸エチル）、
5'-O-DMT-2'-O-(2-N,N-ジメチルアミノオキシエチル)-5-メチルウリジン-3'-[(
2-シアノエチル)-N,N-ジイソプロピルホスホロアミダイト]を泡状物 (1.04g, 74
.9%)として得た。

【０１３３】 2'-(アミノオキシエトキシ)ヌクレオシドアミダイト 2'-(アミノオキシエトキシ)ヌクレオシドアミダイト[当該技術分野では 2'-O-
(アミノオキシエチル)ヌクレオシドアミダイトとしても知られる]を以下のパラ
グラフで述べるように調製する。アデノシン、シチジン及びチミジン・ヌクレオ
シドアミダイトは同様に調製される。

【０１３４】 N2-イソブチリル-6-O-ジフェニルカルバモイル-2'-O-(2-エチルアセチル)-5'-
O-(4,4'-ジメトキシトリチル)グアノシン-3'-[(2-シアノエチル)-N,N-ジイソプ
ロピルホスホロアミダイト] 2'-O-アミノオキシエチルグアノシン類似体をジアミノプリンリボシドの選択
的2'-O-アルキル化によって得ることができる。マルチグラム量(Multigram quan
tities)のジアミノプリンリボシドをSchering AG (Berlin)から購入して、 2'-O
-(2-エチルアセチル)ジアミノプリンリボシドを少量の3'-O-異性体と共に生成す
ることができる。 2'-O-(2-エチルアセチル)ジアミノプリンリボシドを分割して
、アデノシンデアミナーゼによる処理によって、2'-O-(2-エチルアセチル)グア
ノシンに転化させることができる(McGee, D. P. C., Cook, P. D., Guinosso, C
. J.,WO 94/02501 A1 940203.)。標準保護方法によって、2'-O-(2-エチルアセ
チル)-5'-O-(4,4'-ジメトキシトリチル)グアノシンと 2-N-イソブチリル-6-O-ジ
フェニルカルバモイル-2'-O-(2-エチルアセチル)-5'-O-(4,4'-ジメトキシトリチ
ル)グアノシンが得られる筈であり、これを還元して、2-N-イソブチリル-6-O-ジ
フェニルカルバモイル-2'-O-(2-エチルアセチル)-5'-O-(4,4'-ジメトキシトリチ
ル)グアノシンを生成することができる。前記と同様に、ヒドロキシル基をMitsu
nobu反応によってN-ヒドロキシフタルイミドによって置換して、保護されたヌク
レオシドを通常のようにホスフィチル化して、 2-N-イソブチリル-6-O-ジフェニ
ルカルバモイル-2'-O-(2-エチルアセチル)-5'-O-(4,4'-ジメトキシトリチル)グ
アノシン-3'-[(2-シアノエチル)-N,N-ジイソプロピルホスホロアミダイト]を得
ることができる。

【０１３５】 2'-ジメチルアミノエトキシエトキシ(2'-DMAEOE)ヌクレオシドアミダイト 2'-ジメチルアミノエトキシエトキシヌクレオシドアミダイト(当該技術分野で
は、2'-O-ジメチルアミノエトキシエチル、即ち、2'-O-CH₂-O-CH₂-N(CH₂)₂又は
2'-DMAEOE ヌクレオシドアミダイトとしても知られる)を次のように調製する。
他のヌクレオシドアミダイトも同様に調製される。

【０１３６】 2'-O-[2(2-N,N-ジメチルアミノエトキシ)エチル]-5-メチルウリジン 2[2-(ジメチルアミノ)エトキシ］エタノール(Aldrich, 6.66 g, 50mmol)を、1
00 mLボンベ中でテトラヒドロフラン中ボランの溶液(1 M, 10 mL, 10 mmol)に撹
拌しながら徐々に加える。固体が溶解するにつれて、水素ガスが発生する。O²-,
2'-アンヒドロ-5-メチルウリジン(1.2 g, 5 mmol)と、炭酸水素ナトリウム(2.5
mg)とを加えて、ボンベを密封して、油浴中に入れ、155℃に26時間加熱する。こ
のボンベを室温に冷却して、開ける。粗溶液を濃縮して、残渣を水(200 mL)とヘ
キサン(200 mL)とに分配する。過剰なフェノールはヘキサン層中に抽出される。
水層を酢酸エチル(3x200 mL)によって抽出し、一緒にした有機層を水によって１
回洗浄して、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濃縮する。残渣をシリカゲル上
で溶離剤としてメタノール／塩化メチレン1:20(2%トリエチルアミンを有する)を
用いてカラム処理する。カラム・フラクションを濃縮すると、無色固体が形成さ
れ、これを回収して、標題化合物を白色固体として得る。

【０１３７】 5'-O-ジメトキシトリチル-2'-O-[2(2-N,N-ジメチルアミノエトキシ)エチル)]-
5-メチルウリジン 無水ピリジン(8 mL)中の0.5 g (1.3 mmol)の2'-O-[2(2-N,N-ジメチルアミノエ
トキシ)エチル)]-5-メチルウリジンに、トリエチルアミン(0.36 mL)とジメトキ
シトリチルクロリド(DMT-Cl, 0.87 g, 2 eq.)とを加えて、１時間撹拌する。こ
の反応混合物を水(200 mL)中に注入し、CH₂Cl₂ (2x200 mL)によって抽出する。
一緒にしたCH₂Cl₂ 層を飽和NaHCO₃溶液によって、続いて飽和NaCl 溶液によって
洗浄して、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させる。溶媒を蒸発させ、続いてMeOH:C
H₂Cl₂:Et₃N (20:1, v/v,1%トリエチルアミン含有)を用いてシリカゲルクロマト
グラフィーして、標題化合物を得る。

【０１３８】 5'-O-ジメトキシトリチル-2'-O-[2(2-N,N-ジメチルアミノエトキシ)エチル)]-
5-メチルウリジン-3'-O-(シアノエチル-N,N-ジイソプロピル)ホスホロアミダイ
ト CH₂Cl₂ (20 mL)中に溶解した5'-O-ジメトキシトリチル-2'-O-[2(2-N,N-ジメ
チルアミノエトキシ)エチル)]-5-メチルウリジン (2.17 g, 3mmol)の溶液に、ア
ルゴン雰囲気下でジイソプロピルアミノテトラゾリド(0.6 g)と2-シアノエトキ
シ-N,N-ジイソプロピル・ホスホロアミダイト(1.1 mL, 2 eq.)とを加える。この
反応混合物を一晩撹拌し、溶媒を蒸発させる。得られた残渣を、溶離剤として酢
酸エチルを用いるシリカゲル・フラッシュカラムクロマトグラフィーによって精
製して、標題化合物を得る。

【０１３９】 実施例２ オリゴヌクレオチド合成 自動ＤＮＡ合成装置(Applied Biosystems model 380B)においてヨウ素による
酸化と共に標準ホスホロアミダイト化学を用いて非置換及び置換ホスホジエステ
ル(P=O)オリゴヌクレオチドを合成する。

【０１４０】 ホスホジエステル・オリゴヌクレオチドの合成と同様に、但し、標準酸化ボト
ルの代わりにホスフィット結合の段階的チオ化のためにアセトニトリル中の3H-1
,2-ベンゾジチオール-3-オン 1,1-ジオキシドの0.2 M 溶液を用いて、ホスホロ
チオエート(P=S)を合成する。チオ化待機工程を６８秒間に延長し、次にキャッ
ピング工程を行なった。CPG カラムから切断し、55℃における濃水酸化アンモニ
ウム中で脱ブロックした(18時間）後に、オリゴヌクレオチドを0.5 M NaCl溶液
からの2.5倍量のエタノールによる２回の沈殿によって精製した。 ホスフィネー
ト・オリゴヌクレオチドを、本明細書に援用される米国特許 5,508,270に述べら
れているように調製する。

【０１４１】 アルキルホスホネート・オリゴヌクレオチドを、本明細書に援用される米国特
許4,469,863に述べられているように調製する。 3'-デオキシ-3'-メチレンホスホネート・オリゴヌクレオチドを、本明細書に
援用される米国特許5,610,289又は5,625,050に述べられているように調製する。

【０１４２】 ホスホロアミダイト・オリゴヌクレオチドを、本明細書に援用される米国特許
5,256,775又は米国特許5,366,878に述べられているように調製する。 アルキルホスホノチオエート・オリゴヌクレオチドを、本明細書に援用される
公開PCT出願PCT/US94/00902とPCT/US93/06976 (それぞれ、WO 94/17093とWO 94/
02499として公開）に述べられているように調製する。

【０１４３】 3'-デオキシ-3'-アミノホスホロアミダイト・オリゴヌクレオチドを、本明細
書に援用される米国特許5,476,925に述べられているように調製する。 ホスホトリエステル・オリゴヌクレオチドを、本明細書に援用される米国特許
5,023,243に述べられているように調製する。 ボラノホスフェート・オリゴヌクレオチドを、両方とも本明細書に援用される
米国特許5,130,302と5,177,198に述べられているように調製する。

【０１４４】 実施例３ オリゴヌクレオシド合成 MMI連結オリゴヌクレオシドとしても同定される、メチレンメチルイミノ連結
オリゴヌクレオシド、MDH 連結オリゴヌクレオシドとしても同定されるメチレン
ジメチルヒドラゾ連結オリゴヌクレオシド、並びにアミド-3 連結オリゴヌクレ
オシドとしても同定されるメチレンカルボニルアミノ連結オリゴヌクレオシド及
び アミド-4 連結オリゴヌクレオシドとしても同定されるメチレンアミノカルボ
ニル連結オリゴヌクレオシド、並びに例えば交互にMMI と P=O 又は P=S 結合を
有する混合バックボーン（主鎖）化合物を米国特許5,378,825、5,386,023、5,48
9,677、5,602,240及び5,610,289（これらの全てが本明細書に援用される）に述
べられているように調製する。

【０１４５】 ホルムアセタール及びチオホルムアセタール連結オリゴヌクレオシドを、本明
細書に援用される米国特許5,264,562と5,264,564に述べられているように調製す
る。 エチレンオキシド連結オリゴヌクレオシドを、本明細書に援用される米国特許
5,223,618に述べられているように調製する。

【０１４６】 実施例４ PNA 合成 ペプチド核酸(PNAs)を“ Peptide Nucleic Acids (PNA): Synthesis, Propert
ies and Potential Applications, Bioorganic & Medicinal Chemistry”1996,
4, 5-23に記載されている種々な方法のいずれかに従って調製する。これらは、
本明細書に援用される米国特許5,539,082, 5,700,922及び 5,719,262に従っても
製造される。

【０１４７】 実施例５ キメラオリゴヌクレオチドの合成 本発明のキメラオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド又は混合オリゴヌク
レオチド／オリゴヌクレオシドは幾つかの異なる種類でありうる。これらは、連
結ヌクレオシドの“ギャップ”セグメントが連結ヌクレオシドの５’“ウィング
”セグメントと３’“ウィング”セグメントとの間に配置された第１種類と、“
ギャップ”セグメントがオリゴマー化合物の３’末端又は５’末端のいずれかに
配置される第２“オープン末端(open end)”種類とを包含する。第１種類のオリ
ゴヌクレオチドは当該技術分野では“ギャップマー”又はギャップト(gapped)オ
リゴヌクレオチドとしても知られている。第２種類のオリゴヌクレオチドは当該
技術分野では“ヘミマー(hemimers)”又は“ウィングマー(wingmers)”としても
知られている。

【０１４８】 [2'-O-Me]--[2'-デオキシ]--[2'-O-Me]キメラホスホロチオエート・オリゴヌ
クレオチド 2'-O-アルキルホスホロチオエート及び2'-デオキシホスホロチオエート・オ
リゴヌクレオチド・セグメントを有するキメラオリゴヌクレオチドを上記のよう
に Applied Biosystems 自動DNA 合成装置モデル 380Bを用いて合成する。自動
合成装置と、DNA 部分としての2'-デオキシ-5'-ジメトキシトリチル-3'-O-ホス
ホロアミダイトと、 5'及び 3' ウィングとしての5'-ジメトキシトリチル-2'-O-
メチル-3'-O-ホスホロアミダイトとを用いて、オリゴヌクレオチドを合成する。
テトラゾールと塩基とのデリバリー後の待機工程を600 秒間に延長することによ
って、標準合成サイクルを改変して、ＲＮＡに関しては４回、 2'-O-メチルに関
しては２回繰り返す。完全保護オリゴヌクレオチドをサポートから切断し、リン
酸基(phosphate group)を3:1のアンモニア／エタノール中で室温において一晩脱
保護して、次に凍結乾燥する。次に、室温において２４時間メタノール性アンモ
ニア中で処理して、全ての塩基を脱保護し、再び、サンプルを凍結乾燥する。ペ
レットをTHF中1M TBAF中で室温において２４時間再懸濁させて、 2'位置を脱保
護する。次に、1M TEAAによって反応をクエンチしてから、サンプルをロトバク(
rotovac)によって１／２量に減少させた後に、G25サイズ排除カラム上で脱塩す
る。回収されたオリゴを次に収量に関しては分光測光法によって、純度に関して
は毛管電気泳動及び質量分析法によって分析する。

【０１４９】 [2'-O-(2-メトキシエチル)]--[2'-デオキシ]--[2'-O-(メトキシエチル)] キメ
ラホスホロチオエート・オリゴヌクレオチド [2'-O-(2-メトキシエチル)]--[2'-デオキシ]--[-2'-O-(メトキシエチル)] キ
メラホスホロチオエート・オリゴヌクレオチドを、 2'-O-メチルキメラオリゴヌ
クレオチドに関する上記方法によって、2'-O-メチルアミダイトの代わりに2'-O-
(メトキシエチル)アミダイトを用いて調製した。

【０１５０】 [2'-O-(2-メトキシエチル)ホスホジエステル]--[2'-デオキシホスホロチオエ
ート]--[2'-O-(2-メトキシエチル)ホスホジエステル]キメラオリゴヌクレオチド [2'-O-(2-メトキシエチルホスホジエステル]--[2'-デオキシホスホロチオエー
ト]--[2'-O-(メトキシエチル)ホスホジエステル]キメラオリゴヌクレオチドを、
2'-O-メチルキメラオリゴヌクレオチドに関する上記方法に従って、2'-O-メチル
アミダイトの代わりに2'-O-(メトキシエチル)アミダイトの使用と、キメラ構造
のウィング部分内にホスホジエステルヌクレオチド間結合を形成するためのヨウ
素による酸化、及び中央ギャップのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を形
成するための3,H-1,2 ベンゾジチオール-3-オン 1,1 ジオキシド (Beaucage試薬
)を用いた硫化によって調製する。

【０１５１】 他のキメラオリゴヌクレオチド、キメラオリゴヌクレオシド及び混合キメラオ
リゴヌクレオチド／オリゴヌクレオシドは、本明細書に援用される米国特許 5
,623,065によって合成される。

【０１５２】 実施例６ オリゴヌクレオチド単離 制御多孔質ガラスカラム(Applied Biosystems)から切断し、55℃における濃水
酸化アンモニウム中で18 時間脱ブロックした後に、オリゴヌクレオチド又はオ
リゴヌクレオシドを2.5倍量のエタノールによる0.5 M NaCl からの2回の沈殿に
よって精製する。合成されたオリゴヌクレオチドを変性ゲル(denaturing gels)
上でのポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析し、少なくとも８５％全長
物質であると判定した。合成において得られたホスホロチオエート結合とホスホ
ジエステル結合との相対的量を³¹Ｐ核磁気共鳴分光法によって定期的にチェック
し、幾つかの研究のために、Chiang等, J. Biol. Chem. 1991, 266,18162-18171
によって述べられているように、オリゴヌクレオチドをHPLCによって精製した。 HPLC-精製物質によって得られた結果は、非 HPLC-精製物質によって得られた
結果と同様であった。

【０１５３】 実施例７ オリゴヌクレオチド合成- 96 穴プレート・フォーマット 標準96 穴フォーマットで同時に96 配列をアセンブルすることができる自動合
成装置上で固相P(III) ホスホロアミダイト化学によってオリゴヌクレオチドを
合成した。ホスホジエステルヌクレオチド間結合は、水性ヨウ素による酸化によ
って得られた。ホスホロチオエートヌクレオチド間結合は、水性アセトニトリル
中で3,H-1,2 ベンゾジチオール-3-オン 1,1 ジオキシド (Beaucage試薬)を用い
る硫化によって形成された。標準塩基-保護β-シアノエチルジイソプロピルホス
ホロアミダイトは商業的売人(例えば、PE-Applied Biosystems, Foster City, C
A又はPharmacia, Piscataway, NJ)から購入した。非標準ヌクレオシドは既知文
献方法又は特許方法によって製造される。これらは塩基保護β−シアノエチルジ
イソプロピルホスホロアミダイトとして用いられる。

【０１５４】 オリゴヌクレオチドをサポートから切断し、高温(55-60℃) において濃NH₄OH
によって12-16 時間脱保護して、次に放出された生成物を真空下で乾燥させた。
乾燥した生成物を次に無菌水中に再懸濁させ、マスタープレートを得た、これか
ら全ての分析及び試験プレートサンプルを無人操縦ピペッター(robotic pipetto
rs)を用いて希釈する。

【０１５５】 実施例８ オリゴヌクレオチド分析- 96 穴プレートフォーマット 各穴中のオリゴヌクレオチドの濃度をサンプルの希釈とＵＶ吸収分光法とによ
って評価した。個々の生成物の全長完全性(full-length integrity)を、96 穴フ
ォーマット (Beckman P/ACE^TM MDQ)における毛管電気泳動(CE)によって、又は
個別に調製されたサンプルに関して、商業的 CE装置 (例えば、 Beckman P/ACE^{T M} 5000, ABI 270)上での毛管電気泳動(CE)によって評価した。塩基及びバック
ボーン組成は、エレクトロスプレイ−質量分光法を用いた化合物の質量分析によ
って確認した。全てのアッセイ試験プレートをマスタープレートから、単一及び
マルチチャンネル無人操縦ピペッターを用いて希釈した。プレート上の化合物の
少なくとも８５％が少なくとも８５％全長であるならば、プレートは許容できる
と判定した。

【０１５６】 実施例９ 細胞培養とオリゴヌクレオチド処理 ターゲット核酸発現に対するアンチセンス化合物の効果は、ターゲット核酸が
測定可能なレベルで存在するならば、多様な細胞種類のいずれかで試験すること
ができる。これは、例えば、ＰＣＲ又はノーザンブロット分析を用いてルーチン
に測定することができる。例示のために、次の４細胞種類を挙げるが、他の細胞
種類もルーチンに使用可能である。

【０１５７】 T-24 細胞: 移行上皮性膀胱癌(transitional cell bladder carcinoma)細胞系 T-24 は、
American Type Culture Collection(ATCC) (Manassas, VA)から得た。T-24細胞
を10%ウシ胎児血清(Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD)と、ペニシリ
ン100 単位／mLと、ストレプトマイシン100μｇ／mL (Gibco/Life Technologies
, Gaithersburg, MD)とを補充した完全 McCoy's 5A 基本培地 (Gibco/Life Tech
nologies, Gaithersburg, MD)中でルーチンに培養した。細胞が９０％集密度に
達したときに、細胞をトリプシン化と希釈とによってルーチンに継代した。RT-P
CR 分析に用いるために、細胞を96-穴プレート(Falcon-Primaria #3872)に 7000
細胞/穴の密度で接種した。

【０１５８】 ノーザンブロッティング又は他の分析のために、細胞を100 mm 又は他の標準
組織培養プレート上に接種して、適当な量の培地とオリゴヌクレオチドとを用い
て同様に処理することができる。

【０１５９】 A549 細胞: ヒト肺癌細胞系A549を American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas
,VA)から入手した。A549 細胞を10%ウシ胎児血清(Gibco/Life Technologies, Ga
ithersburg, MD)と、ペニシリン100 単位／mLと、ストレプトマイシン100μｇ／
mL (Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD)とを補充した DMEM 基本培地
(Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD) 中でルーチンに培養した。細胞
が９０％集密度に達したときに、細胞をトリプシン化と希釈とによってルーチン
に継代した。

【０１６０】 NHDF 細胞: ヒト新生児皮膚線維芽細胞(NHDF)をClonetics Corporation (Walkersville MD
)から入手した。NHDFsを供給者が勧めるように補充したFibroblast Growth Medi
um(Clonetics Corporation, Walkersville MD)中でルーチンに維持した。細胞を
供給者が勧めるように１０継代まで維持した。

【０１６１】 HEK 細胞: ヒト胚性ケラチノサイト(Human embryonic keratinocytes) (HEK)を Clonetic
s Corporation (Walkersville MD)から入手した。HEKsを供給者が勧めるように
処方したKeratinocyte Growth Medium(Clonetics Corporation, Walkersville M
D) 中にルーチンに維持した。細胞を供給者が勧めるように１０継代までルーチ
ンに維持した。 アンチセンス化合物による処理: 細胞が80% 集密度に達したときに、細胞をオリゴヌクレオチドによって処理し
た。96-穴プレートにおいて増殖した細胞に関しては、穴を200 μｌ OPTI-MEM^TM -1 還元血清培地(reduced-serum medium) (Gibco BRL)によって１回洗浄し、次
に3.75 μｇ/mL LIPOFECTIN^TM(Gibco BRL)を含有する130 μｌの OPTI-MEM^TM -1
と150 nMの最終濃度の所望のオリゴヌクレオチドとによって処理した。処理の４
時間後に、培地を新鮮な培地と交換した。オリゴヌクレオチド処理後１６時間に
細胞を回収した。

【０１６２】 実施例１０ PI3K p85発現のオリゴヌクレオチド阻害の分析 PI3K p85 発現のアンチセンスモジュレーションは当該技術分野において知ら
れた多様な方法で分析することができる。例えば、PI3K p85 mRNA レベルを例え
ばノーザンブロット分析、競合ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)又はリアル−タイム
PCR (RT-PCR)によって定量することができる。リアル−タイム 定量的PCRが現在
好ましい。RNA分析は総細胞RNA又はポリ(A)+ mRNAに関して行なうことができる
。RNA 単離方法は例えばAusubel, F.M. 等, Current Protocols in Molecular
Biology, 1巻,4.1.1-4.2.9頁と4.5.1-4.5.3頁,John Wiley & Sons, Inc.,1993に
教示されている。ノーザンブロット分析は当該技術分野においてルーチンであり
、例えば、Ausubel,F.M.等，Current Protocols in Molecular Biology, 1巻,4.
2.1-4.2.9頁,John Wiley & Sons, Inc.,1996に教示されている。リアル−タイム
定量的(PCR)は、PE-Applied Biosystems, Foster City, CA から入手可能で、製
造者の指示に従って用いられる、商業的に入手可能なABI PRISM^TM7700 Sequence
Detection Systemを用いて便利に達成することができる。他のPCR方法も当該技
術分野において知られている。

【０１６３】 PI3K p85 タンパク質レベルは、例えば免疫沈降、ウェスタンブロット分析（
イムノブロッティング）、ＥＬＩＳＡ又は蛍光活性化細胞ソーティング(fluores
cence-activated cell sorting)(FACS)のような、当該技術分野において周知の
多様な方法で定量することができる。 PI3K p85に向けられる抗体を同定して、
例えばMSRS 抗体カタログ(Aerie Corporation, Birmingham, MI)のような多様な
供給源から入手することができる、又は慣用的な抗体形成方法によって製造する
ことができる。ポリクローナル抗血清の製造方法は例えば Ausubel,F.M. 等.,Cu
rrent Protocols in Molecular Biology,2巻, 11.12.1-11.12.9頁,John Wiley &
Sons,Inc.,1997に教示されている。モノクローナル抗体の製造は、例えばAusub
el,F.M.等,Current Protocols in Molecular Biology,2巻,11.4.1-11.11.5頁,Jo
hn Wiley & Sons,Inc.,1997に教示されている。

【０１６４】 免疫沈降方法は当該技術分野において標準方法であり、例えばAusubel, F.M.
等,Current Protocols in Molecular Biology,2巻, 10.16.1-10.16.11頁,John W
iley & Sons,Inc.,1998に見出すことができる。ウェスタンブロット（イムノブ
ロット）分析は当該技術分野において標準方法であり、例えばAusubel, F.M.等,
Current Protocols in Molecular Biology,2巻, 10.8.1-10.8.21頁,John Wiley
& Sons,Inc.,1997に見出すことができる。酵素結合イムノソルベント・アッセイ
(Enzyme-linked immunosorbent assays)(ELISA)は当該技術分野において標準
方法であり、例えばAusubel, F.M.等,Current Protocols in Molecular Biology
,2巻, 11.2.1-10.2.22頁,John Wiley & Sons,Inc.,1991に見出すことができる。

【０１６５】 実施例１１ Poly(A)+ mRNA 単離 Poly(A)+ mRNAを Miura等,Clin.Chem.,1996, 42, 1758-1764に従って単離した
。poly(A)+ mRNAを単離するための他の方法は例えばAusubel, F.M.等, Current
Protocols in Molecular Biology, 1巻, 4.5.1-4.5.3頁,John Wiley & Sons,In
c.,1993に教示されている。簡単には、96-穴プレートで増殖した細胞に関しては
、増殖培地を細胞から除去し、各穴を200 μｌ冷PBSによって洗浄した。60μｌ
細胞溶解緩衝液( lysis buffer)(10 mM Tris-HCl, pH 7.6, 1 mM EDTA, 0.5 M N
aCl, 0.5% NP-40, 20 mMバナジル−リボヌクレオシド複合体）を各穴に加え、プ
レートを穏やかに撹拌してから、室温において５分間インキュベートした。55μ
ｌの溶解液(lysate)をOligo d(T)被覆96-穴プレート(AGCT Inc.,Irvine CA)に移
した。プレートを室温において60 分間インキュベートし、200 μｌの洗浄緩衝
液(10mM Tris-HCl pH 7.6, 1 mM EDTA, 0.3 M NaCl)によって３回洗浄した。最
終洗浄後に、プレートをペーパータオル上でブロットして、過剰な洗浄緩衝液を
除去してから、5 分間風乾させた。70℃に予熱した60 μｌの溶離緩衝液( eluti
on buffer)(5 mM Tris-HCl pH 7.6)を各穴に加えて、プレートを90℃ホットプレ
ート上で5 分間インキュベートして、次に溶出液(eluate)を新しい96-穴プレー
トに移した。 100 mm又は他の標準プレート上で増殖した細胞を適当量の全ての溶液を用いて
同様に処理することができる。

【０１６６】 実施例１２ 総RNA単離 製造者の勧める方法に従ってRNEASY 96^TM kit及びの緩衝液（Qiagen Inc. (Va
lencia CA)から購入）を用いて、総mRNAを単離した。簡単には、96-穴プレート
で増殖した細胞に関しては、増殖培地を細胞から除去し、各穴を200 μｌ冷PBS
によって洗浄した。100 μｌBuffer RLT を各穴に加えて、プレートを２０秒間
激しく撹拌した。100 μｌの70%エタノールを次に各穴に加えて、中身を上下に
３回ピペッティングして混合した。次に、サンプルを、廃棄物回収トレーを装備
したQIAVAC^TM マニホルドに取り付け、真空源に取り付けたRNEASY 96^TM 穴プレ
ートに移した。真空を１５秒間施した。1 mLのBuffer RW1 をRNEASY 96^TM 穴プ
レートの各穴に加えて、真空を再び１５秒間施した。次に、1 mL のBuffer RPE
をRNEASY 96^TM 穴プレートの各穴に加えて、真空を1５秒間施した。次に、Buffe
r RPE 洗浄を繰り返し、真空をさらに10分間施した。次に、プレートを QIAVAC^{T M} マニホルドから取り出し、ペーパータオル上で乾燥ブロットした。次に、1.2m
L回収管を含有する回収管ラックを装備したQIAVAC^TM マニホルドに、プレートを
再び取り付けた。次に、各穴に60 μｌの水をピペッティングし、１分間インキ
ュベートしてから、真空を３０秒間施すことによって、RNAを溶出した。この溶
出工程をさらなる60μｌの水によって繰り返した。

【０１６７】 この反復ピペッティングと溶出工程は、QIAGEN Bio-Robot 9604 (Qiagen, Inc
.,Valencia CA)を用いて、自動化することができる。培養プレート上で細胞を実
際に溶解した後に、プレートをロボットデッキ(robot deck)に移して、そこでピ
ペッティング、ＤＮアーゼ処理及び溶出工程を実施する。

【０１６８】 実施例１３ PI3K p85 mRNAレベルのリアル−タイム定量的PCR 分析 ABI PRISM^TM 7700配列検出系(PE-Applied Biosystems, Foster City, CA)を用
いるリアル−タイム定量的PCRによって、製造者の指示に従って、PI3K p85 mRNA
レベルの定量を行なった。これは閉鎖管式非ゲル性蛍光検出系(closed-tube, n
on-gel-based,fluorescence detection system)であり、リアル−タイムでのポ
リメラーゼ連鎖反応(PCR)生成物の高スループット定量を可能にする。PCRが完了
した後に増幅生成物を定量する標準 PCRとは対照的に、リアル−タイム定量的PC
Rでは、生成物が蓄積するにつれて、生成物を定量する。これは、前進プライマ
ー(forward primer)と逆PCRプライマーとの間に特異的にアニールし、２蛍光染
料を含有するオリゴヌクレオチドプローブをPCR反応に含めることによって、達
成される。リポーター染料（例えば、Operon Technologies Inc., Alameda, CA
又はPE-Applied Biosystems, Foster City,CAのいずれかから得られるJOE 又は
FAM）をプローブの5' 末端に取り付け、クエンチャー染料(quencher dye)(例え
ば、Operon Technologies Inc., Alameda, CA又は PE-Applied Biosystems, Fos
ter City, CAのいずれかから得られる TAMRA）をプローブの3' 末端に取り付け
る。プローブと染料とが完全なものであるときに、リポーター染料発光は 3' ク
エンチャー染料の接近によってクエンチされる。増幅中に、ターゲット配列への
プローブのアニーリングが、Taqポリメラーゼの5'-エキソヌクレアーゼ活性によ
って切断されうる基質を生成する。PCR増幅サイクルの伸長期中に、Taqポリメラ
ーゼによるプローブの切断がリポーター染料をプローブの残部から（それ故、ク
エンチャー部分から）放出して、配列特異的蛍光シグナルが発生される。各サイ
クルによって、付加的なリポーター染料分子がそれらの各プローブから切断され
、蛍光強度がABI PRISM^TM7700 配列検出系に組み込まれたレーザーオプティス(l
aser optics)によって規則的な間隔でモニターされる。各アッセイにおいて、非
処理対照サンプルからのmRNAの連続希釈を含有する一連の並行反応によって標準
曲線を形成して、これを用いて、試験サンプルのアンチセンス・オリゴヌクレオ
チド処理後の阻害％を定量する。

【０１６９】 PCR試薬はPE-Applied Biosystems, Foster City, CAから入手した。25 μｌ p
oly(A) mRNA 溶液を含有する96穴プレートに25μｌ PCR カクテル (1x TAQMAN^TM 緩衝液 A、5.5 mM MgCl₂、各300μｌの dATP, dCTP及び dGTP, 600 μＭの dUT
P、各100 nM の前進プライマー、逆プライマー及びプローブ、20 単位のRNAse
阻害剤, 1.25 単位 AMPLITAQ GOLD^TM 並びに12.5 単位MuLV 逆転写酵素)を加え
ることによって、RT-PCR 反応を実施した。RT 反応は、48℃において30分間イン
キュベートすることによって実施した。AMPLITAQ GOLD^TM を活性化するために、
95℃において10分間インキュベートした後に、40サイクルの２工程PCRプロトコ
ールを95℃において15秒間（変性）、続いて60℃において1.5分間（アニーリン
グ／伸長）行なった。PI3K p85 プローブとプライマーとはヒトPI3K p85配列に
ハイブリダイズするように、公開された配列情報(GenBank受け入れ番号 M61906,
本明細書に配列番号：１として包含される）を用いて設計した。

【０１７０】 PI3K p85に関して、PCR プライマーは、 前進プライマー: AGCAACCTGGCAGAATTACGA (配列番号: 2) 逆プライマー: CAAAACGTGCACATCGATCAT (配列番号: 3)であり、PCRプローブは
FAM-TTCTTGATTGTGATACACCCTCCGTGGACT-TAMRA(配列番号: 4)であった、この場合
、 FAM (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA)は蛍光リポーター染料であ
り、TAMRA (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) はクエンチャー染料で
ある。

【０１７１】 GAPDH に関して、PCR プライマーは、 前進プライマー: GAAGGTGAAGGTCGGAGTC (配列番号: 5)、 逆プライマー: GAAGATGGTGATGGGATTTC (配列番号: 6)であり、PCR プローブは
5' JOE-CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC- TAMRA 3'(配列番号: 7) であった、この場合、
JOE (PE-Applied Biosystems, Foster City,CA) は 蛍光リポーター染料であり
、TAMRA (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) はクエンチャー染料であ
った。

【０１７２】 実施例１４ PI3K p85 mRNA レベルのノーザンブロット分析 アンチセンス処理後１８時間に、細胞単層を冷PBSによって２回 洗浄し、1 mL
RNAZOL^TM(TEL-TEST "B" Inc., Friendswood, TX)中に溶解した。総RNAを製造者
の勧めるプロトコールに従って調製した。20μｇの総RNAを、1.1% ホルムアルデ
ヒドを含有する1.2%アガロースゲルを通しての電気泳動によってMOPS緩衝液系(A
MRESCO,Inc. Solon, OH)を用いて分画した。RNA をゲルからHYBOND^TM-N+ナイロ
ン膜(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway,NJ)に一晩毛管転移(overnight
capillary transfer)によってNorthern/Southern転移緩衝液系 (TEL-TEST "B" I
nc.,Friendswood,TX)を用いて移した。RNA転移をUV可視化によって確認した。膜
を STRATALINKER^TM UV Crosslinker 2400 (Stratagene, Inc, La Jolla, CA)を
用いるUV 架橋によって固定した。

【０１７３】 膜を QUICKHYB^TM ハイブリダイゼーション溶液(Stratagene, La Jolla, CA)を
用いて、前進プライマー AGCAACCTGGCAGAATTACGA (配列番号: 2)と逆プライマー
CAAAACGTGCACATCGATCAT (配列番号: 3)を用いる PCRによって調製されたPI3K p
85特異性プローブによって厳しい条件に関する製造者の勧告に従って検査した。
負荷及び転移効率の変動に関して標準化するために、膜をストリップして、グリ
セルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH) RNA (Clontech, Palo Al
to, CA)に関して検査した。ハイブリダイズした膜を可視化し、PHOSPHORIMAGER^{T M} と IMAGEQUANT^TM Software V3.3 (Molecular Dynamics,Sunnyvale,CA)を用い
て定量した。データを非処理対照中のGAPDHレベルに標準化した。

【０１７４】 実施例１５ PI3K p85 発現のアンチセンス阻害−ホスホロチオエート・オリゴデオキシヌク
レオチド 本発明によると、公開された配列 (GenBank 受け入れ番号M61906, 本明細書に
配列番号：１として援用)を用いて、ヒトPI3K p85 RNAの種々な領域をターゲッ
トするように、一連のオリゴヌクレオチドを設計した。これらのオリゴヌクレオ
チドを表１に示す。ターゲット部位は、配列ソース・リファレンス(sequence so
urce reference)(Genbank 受け入れ番号.M61906)に記載されるような、オリゴヌ
クレオチドが結合するヌクレオチド番号によって指示する。表１における全ての
化合物は、全体を通してホスホロチオエート・バックボーン（ヌクレオシド間結
合）を有するオリゴデオキシヌクレオチドである。これらの化合物を、本明細書
の他の実施例に述べるような定量的リアル−タイムPCRによってPI3K p85 mRNA
レベルに対する効果に関して分析した。データは２回の実験からの平均である。
存在する場合の"N.D." は"データなし"を意味する。

【０１７５】

【表１】

【０１７６】 表１に示すように、配列番号：21, 22, 27, 28, 30, 33, 40 及び41は、この
アッセイにおけるPI3K p85 発現の少なくとも30% 阻害を実証したので、好まし
い。

【０１７７】 実施例１６ PI3K p85 発現のアンチセンス阻害-ホスホロチオエート2'-MOE ギャップマーオ
リゴヌクレオチド 本発明によると、ヒトPI3K p85 をターゲットする第２系列のオリゴヌクレオ
チドを合成した。これらのオリゴヌクレオチド配列を表２に示す。ターゲット部
位は、配列ソース・リファレンス(Genbank 受け入れ番号.M61906)に記載される
ような、オリゴヌクレオチドが結合するヌクレオチド番号によって指示する。

【０１７８】 表２における全ての化合物はキメラオリゴヌクレオチド("ギャップマー")であ
り、これは長さにおいて１８ヌクレオチドであり、両側（５’方向と３’方向）
で４ヌクレオチド"ウィング"によって隣接される、10個の2'-デオキシヌクレオ
チドから成る中央"ギャップ"領域から構成される。ウィングは2'-メトキシエチ
ル(2'-MOE)ヌクレオチドから構成される。ヌクレオシド間（バックボーン）結合
は、オリゴヌクレオチドを通してホスホロチオエート(P=S)である。2'-MOE ウィ
ング中のシチジン残基は5-メチルシチジンである。

【０１７９】 データは本明細書の他の実施例に述べるような定量的リアル−タイムPCRによ
って得られたものであり、２回の実験からの平均である。存在する場合の"N.D."
は"データなし"を意味する。

【０１８０】

【表２】

【０１８１】 表２に示すように、配列番号：8, 9, 12, 13, 14, 15, 17, 18, 20, 21, 23,
24, 27, 30, 32, 37, 41, 42 及び43は、この実験における PI3K p85 発現の少
なくとも30% 阻害を実証したので、好ましい。

【０１８２】 実施例１７ PI3K p85タンパク質レベルのウェスタンブロット分析 ウェスタンブロット分析（イムノブロット分析）は標準方法を用いて実施する
。オリゴヌクレオチド処理後16-20時間に、細胞を回収して、 PBSによって１回
洗浄し、Laemmli緩衝液 (100 ul/穴)中に懸濁させ、５分間沸騰させ、16% SDS-P
AGE ゲル上に負荷する。ゲルを150 Vにおいて1.5時間処理して、ウェスタンブロ
ッティングのために膜に移す。 PI3K p85に向けられる適当な一次抗体(primary
antibody)を、該一次抗体種に向けられる放射能標識した又は蛍光標識した二次
抗体と共に用いる。バンド(band)をPHOSPHORIMAGER^TM(Molecular Dynamics, Sun
nyvale CA)を用いて可視化する。

【配列表】

【手続補正書】

【提出日】平成１４年１月２１日（２００２．１．２１）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） // Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ， ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ， ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，Ｋ Ｒ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ， ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，Ｓ Ｉ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 カウサート，レックス・エム アメリカ合衆国カリフォルニア州92008， カールズバッド，ニューシャイア・ストリ ート 3008 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 CA01 HA17 4C084 AA13 BA35 DC32 MA52 MA55 NA14 ZB261 ZC351 4C086 AA01 AA02 EA16 MA04 MA52 MA55 NA14 ZB26 ZC35

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒトＰＩ３Ｋ ｐ８５をコードする核酸分子をターゲティング
   する長さ８〜３０核酸塩基のアンチセンス化合物であって、ヒトＰＩ３Ｋ ｐ８
   ５に特異的にハイブリダイズしてその発現を阻害するアンチセンス化合物。
2. 【請求項２】 アンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１に記載のア
   ンチセンス化合物。
3. 【請求項３】 アンチセンスオリゴヌクレオチドが配列番号：21、22、27、28
   、30、33、40、41、8、9、12、13、14、15、17、18、20、23、24、32、37、42ま
   たは43を含む配列を有する、請求項２に記載のアンチセンス化合物。
4. 【請求項４】 アンチセンスオリゴヌクレオチドが配列番号：21、27、30また
   は41を含む配列を有する、請求項２に記載のアンチセンス化合物。
5. 【請求項５】 アンチセンスオリゴヌクレオチドが少なくとも１つの修飾され
   たヌクレオシド間結合を含む、請求項２に記載のアンチセンス化合物。
6. 【請求項６】 修飾されたヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合であ
   る、請求項５に記載のアンチセンス化合物。
7. 【請求項７】 アンチセンスオリゴヌクレオチドが少なくとも１つの修飾され
   た糖部分を含む、請求項２に記載のアンチセンス化合物。
8. 【請求項８】 修飾された糖部分が２’−Ｏ−メトキシエチル糖部分である、
   請求項７に記載のアンチセンス化合物。
9. 【請求項９】 アンチセンスオリゴヌクレオチドが少なくとも１つの修飾され
   た核酸塩基を含む、請求項２に記載のアンチセンス化合物。
10. 【請求項１０】 修飾された核酸塩基が５−メチルシトシンである、請求項９
    に記載のアンチセンス化合物。
11. 【請求項１１】 アンチセンスオリゴヌクレオチドがキメラオリゴヌクレオチ
    ドである、請求項２に記載のアンチセンス化合物。
12. 【請求項１２】 請求項１に記載のアンチセンス化合物および医薬的に許容で
    きるキャリヤーまたは希釈剤を含む組成物。
13. 【請求項１３】 さらにコロイド分散系を含む、請求項１２に記載の組成物。
14. 【請求項１４】 アンチセンス化合物がアンチセンスオリゴヌクレオチドであ
    る、請求項１２に記載の組成物。
15. 【請求項１５】 ヒトの細胞または組織においてＰＩ３Ｋ ｐ８５の発現を阻
    害する方法であって、細胞または組織を請求項１に記載のアンチセンス化合物と
    接触させ、これによりＰＩ３Ｋ ｐ８５の発現を阻害することを含む方法。
16. 【請求項１６】 ＰＩ３Ｋ ｐ８５関連の疾患または状態を有するヒトを処置
    する方法であって、治療または予防に有効な量の請求項１に記載のアンチセンス
    化合物をその動物に投与し、これによりＰＩ３Ｋ ｐ８５の発現を阻害すること
    を含む方法。
17. 【請求項１７】 疾患または状態が過増殖性障害である、請求項１６に記載の
    方法。
18. 【請求項１８】 過増殖性障害が癌である、請求項１７に記載の方法。
19. 【請求項１９】 疾患または状態が糖尿病である、請求項１６に記載の方法。
20. 【請求項２０】 トランケート形のヒトＰＩ３Ｋ ｐ８５をコードする核酸分
    子をターゲティングする、請求項１に記載のアンチセンス化合物。