JP4054192B2 - Ｐｔｐ１ｂ発現のアンチセンス阻害 - Google Patents

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Description

【０００１】
（技術分野）
発明の分野
本発明は、PTP1Bの発現をモジュレートするための組成物および方法を提供する。特に本発明はアンチセンス化合物、特にPTP1Bをコードする核酸と特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドに関する。そのようなオリゴヌクレオチドはPTP1Bの発現をモジュレートすることが示された。
発明の背景
キナーゼと呼ばれる酵素の作用を通して生物分子へのリン酸部分の付加として定義されるリン酸化のプロセスは、細胞内シグナルが広がって最終的に細胞性応答をもたらす過程を表す。細胞内で、タンパク質はセリン、トレオニンまたはチロシン残基上でリン酸化されることができ、そしてリン酸化の程度はリン酸部分を除去するホスファターゼの反対作用により調節される。細胞中のタンパク質リン酸化の大部分はセリンおよびトレオニン残基上であるが、チロシンのリン酸化は発ガン性の形質転換および増殖因子の刺激中に最大にモジュレートされる（Zhang,Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol.1998,33,1-52）。
【０００２】
リン酸化は細胞内でそのように偏在するプロセスであるので、しかも細胞の表現型はこれらの経路の活性により大きく影響を受けるので、現在は多くの疾患状態および／または障害が、キナーゼおよびホスファターゼの異常な活性化または機能的突然変異の結果のいずれかであると考えられている。この結果、現在ではかなりの注目がチロシンキナーゼおよびチロシンホスファターゼのキャラクタライゼーションに費やされている。
【０００３】
PTP1B（タンパク質ホスファターゼ1BおよびPTPN1としても知られている）は、元々ヒト胎盤の主要タンパク質チロシンホスファターゼとして単離された小胞体(ER)に付随する酵素である（Tonks et al.,J.Biol.Chem.,1988,263,6731-6737;Tonks et al.,J.Biol.Chem.,1988,263,6722-6730）。
【０００４】
インスリン受容体により媒介されるシグナル発信における本質的な調節の役割がPTP1Bに関して確立された。PTP1Bはインビトロおよび完全な細胞中の両方で活性化されたインスリン受容体と相互作用し、しかも脱リン酸化し、シグナル経路のダウンレギュレーション（downregulation）をもたらす（Goldstein et al.,Mol.Cell.Biochem.,1998,182,91-99；Seely et al.,Diabetes,1996,45,1379-1385）。さらにPTP1Bはインスリンの分裂促進作用をモジュレートする（Goldstein et al.,Mol.Cell.Biochem.,1998,182,91-99）。PTP1Bを過剰発現しているラットの脂肪細胞では、GLUT4グルコース輸送体のトランスロケーションが阻害され、グルコース輸送体の負の調節物質としてもPTP1Bを意味している（Chen et al.,J.Biol.Chem.,1997,272,8026-8031)。
【０００５】
PTP1B遺伝子を欠くマウスノックアウトモデルも、PTP1Bによりインスリンシグナル発信が負の調節に向かうことを指摘する。破壊されたPTP1B遺伝子を有するマウスはインスリン感受性の上昇、インスリン受容体のリン酸化の上昇を示し、そして高脂肪食に置いた時、PTP1B-/-マウスは体重増加に抵抗があり、そしてインスリン感受性のままであった（Elchebly et al.,Science,1999,283,1544-1548）。これらの研究は、糖尿病および肥満の処置における治療的標的としてPTP1Bを明らかに確立する。
【０００６】
細胞サイクル中に様々に調節されるPTP1B（Schievella et al.,Cell.Growth Differ.,1993,4,239-246)は、mRNA前駆体の選択的スプライシングから生じる２種類の異なるアイソフォームとして、インスリン感受性組織中に発現される（Shifrin and Neel,J.Biol.Chem.,1993,268,25376-25384）。最近、選択的にスプライシングされた生成物の比率はインスリンのような増殖因子により影響を受け、そして調査した種々の組織中で多様であることが証明された（Sell and Reese,Mol.Genet.Metab.,1999,66,189-192)。これらの研究では、変異体のレベルは血漿インスリン濃度および体脂肪に相関し、したがって慢性の高インスリン血症または２型糖尿病の患者に関するバイオマーカーとして使用することができる。
【０００７】
LiuおよびChernoffは、PTP1Bが上皮増殖因子受容体（EGFR）に結合し、そしてその基質として役立つことを示した（Liu and Chernoff,Biochem.J.,1997,327,139-145）。さらにA431ヒト上皮ガン腫細胞中で、PTP1BはEGFの添加により生成したH2O2の存在により不活性化されることが分かった。これらの研究では、PTP1Bは細胞の酸化状態により負に調節することができ、これはしばしば腫瘍形成中に脱調節（deregulated）されることを示す（Lee et al.,J.Biol.Chem.,1998,273,15366-15372)。
【０００８】
PTP1Bの過剰発現は悪性の卵巣ガン中で示され、そしてこの相関は関係する増殖因子受容体の発現における同時上昇により達成された（Wiener et al.,Am.J.Obstet.Gynecol.,1994,170,1177-1183）。
【０００９】
PTP1Bは、neuガン遺伝子により誘導されるNIH3T3細胞中（Brown-Shimer et al.,Cancer Res.,1992,52,478-482）、ならびにv-srk、v-srcおよびv-rasにより誘導されるラット3Y1繊維芽細胞中（Liu et al.,Mol.Cell.Biol.,1998,18,250-259）、およびbcr-ab1により誘導されるラット-1繊維芽細胞（LaMontagne et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1998,95,14094-14099）での形質転換を抑制することが示された。またPTP1BはK562細胞、慢性骨髄性白血病細胞系の分化を、bcr-ab1ガンタンパク質のインヒビターが行う様式と同様に促進することも示された。これらの研究は、慢性骨髄性白血病の病原の制御におけるPTP1Bの役割の可能性を説明している（LaMontagne et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1998,95,14094-14099）。
【００１０】
PTP1Bは１以上の接着−依存的シグナル伝達成分と相互作用し、そしてインテグリンが媒介するMAPキナーゼ活性化を抑制することにより、インテグリンのシグナル伝達を負に調節する（Liu et al.,Curr.Biol.,1998,8,173-176)。PTP1Bの触媒的に不活性形を使用したインテグリンのシグナル伝達を研究するために計画された他の研究では、PTP1Bがカドヘリンが媒介する細胞接着（Balsamo et al.,J.Cell.Biol.,1998,143,523-532）、ならびに細胞の広がり、フォーカルアドヒージョンおよびストレスファイバー形成およびチロシンリン酸化（Arregui et al.,J.Cell.Biol.,1998,143,861-873）を調節することが示された。
【００１１】
現在、PTP1Bの合成または作用を阻害するように設計された治療剤には低分子（Ham et al.,Bioorg.Med.Chem.Lett.,1999,9,185-186；Skorey et al.,J.Biol.Chem.,1997,272,22472-22480；Taing et al.,Biochemistry,1999,38,3793-3803；Taylor et al.,Bioorg.Med.Chem.,1998,6,1457-1468；Wang et al.,Bioorg.Med.Chem.Lett.,1998,8,345-350；Wang et al.,Biochem.Pharmacol.,1997,54,703-711；Yao et al.,Bioorg.Med.Chem.,1998,6,1799-1810)、およびペプチド（Chen et al.,Biochemistry,1999,38,384-389；Desmarais et al.,Arch.Biochem.Biophys.,1998,354,225-231;Roller et al.,Bioorg.Med.Chem.Lett.,1998,8,2149-2150）を含む。さらに国際公開第97/32595号明細書には、インスリン抵抗性に関連する障害を処置するために、PTP1Bと活性化したインスリン受容体との結合を阻害するホスホペプチドおよび抗体が開示されている。PTP1Bに対するアンチセンスヌクレオチドも一般的に開示されている（Olefsky,1997）。
【００１２】
PTP1B機能を効果的に阻害することができるさらなる薬剤の長い間の必要性は未だに存在し、そしてアンチセンス法が特異的な遺伝子産物の発現を減少させるための効果的手段として出現して来ている。したがってこの技法はPTP1B発現のモジュレーションに関して多くの治療的、診断的および研究的応用に独特な有用性があると示すことができる。
【００１３】
したがって本発明は、選択的にスプライシングされるPTP1B形のモジュレーションを含めPTP1B発現をモジュレートする組成物および方法を提供する。
発明の要約
本発明は、PTP1Bをコードする核酸を標的とし、そしてPTP1Bの発現をモジュレートするアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドを対象とする。本発明のアンチセンス化合物を含んで成る製薬学的および他の組成物も提供する。さらに細胞または組織中のPTP1B発現をモジュレートする方法を提供し、この方法は該細胞または組織を１以上の本発明のアンチセンス化合物または組成物と接触させることを含んで成る。さらにPTP1Bの発現に関係する疾患または症状を有するか、またはそのようになる傾向がある動物、特にヒトを、治療または予防に効果的な量の本発明の１以上のアンチセンス化合物または組成物を投与することより処置する方法を提供する。
発明の詳細な説明
本発明は、PTP1Bをコードする核酸分子の機能のモジュレーション、最終的には生産されるPTP1Bの量のモジュレーションに使用するために、オリゴマーのアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドを使用する。これはPTP1Bをコードする１以上の核酸と特異的にハイブリダイズするアンチセンス化合物を提供することにより達成される。本明細書で使用する用語「標的核酸」および「PTP1Bをコードする核酸」は、PTP1BをコードするDNA、そのようなDNAから転写されたRNA（mRNA前駆体およびmRNAを含む）、およびまたそのようなRNAに由来するcDNAを包含する。オリゴマー化合物とその標的核酸との特異的ハイブリダイゼーションは、核酸の正常な機能を妨害する。標的核酸に特異的にハイブリダイズする化合物による核酸のこの機能のモジュレーションを、一般に「アンチセンス」と称する。妨害されるDNAの機能には複製および転写を含む。妨害されるRNAの機能には、例えばRNAのタンパク質翻訳の部位への転位、RNAからタンパク質の翻訳、RNAをスプライシングして１以上のmRNA種の生成、およびRNAにより関係または促進され得る触媒活性のようなすべての生命機能を含む。標的核酸機能のそのような妨害の全効果が、PTP1Bの発現のモジュレーションである。本発明の内容において、「モジュレーション」とは遺伝子発現の上昇（刺激）または減少（阻害）のいずれかを意味する。本発明の内容において、阻害は遺伝子発現のモジュレーションの好適な形態であり、そしてmRNAが好適な標的である。
【００１４】
アンチセンスに特異的な核酸を標的とすることが好ましい。本発明の内容では、アンチセンス化合物を特定の核酸に「標的」することは多段階プロセスである。このプロセスは通常、モジュレートされる機能を持つ核酸配列の同定から始まる。これは例えば、発現が特定の障害または疾患状態に関連する細胞性遺伝子（またはその遺伝子から転写されたmRNA）、または感染源に由来する核酸分子であり得る。本発明では、標的はPTP1Bをコードする核酸分子である。標的プロセスには、所望する効果（例えばタンパク質の発現の検出またはモジュレーション）が生じるように、アンチセンス相互作用が起こるための遺伝子内の部位（１つまたは複数）の決定も含む。本発明の内容において好適な遺伝子内部位は、遺伝子のオープンリーディングフレイム（ORF）の翻訳開始また終結コドンを包含する領域である。当該技術分野では既知であるように、翻訳開始コドンは典型的には5'-AUG（転写されたmRNA分子で；対応するDNA分子では5'-ATG）であるので、翻訳開始コドンは「AUGコドン」、「出発(start)コドン」または「AUG出発コドン」とも呼ばれる。遺伝子の少数はRNA配列5'-GUG、5'-UUGまたは5'-CUGを持つ翻訳開始コドンを有し、そして5'-AUA、5'-ACGおよび5'-CUGはインビボで機能することが示された。このように用語「翻訳開始コドン」および「出発コドン」は、たとえ各々の場合でイニシエーターのアミノ酸が典型的にはメチオニン（真核生物）またはホルミルメチオニン（原核生物）であっても多くのコドン配列を包含することができる。当該技術分野では、真核生物および原核生物遺伝子は２以上の代替的（alternative）出発コドンを有してもよく、その任意の１つが特定の細胞型または組織中でまたは特定の条件の組み合わせの下で、翻訳開始に優先的に使用される。本発明の内容では、「出発コドン」および「翻訳開始コドン」は、そのようなコドンの配列（１つまたは複数）にかかわらず、PTP1Bをコードする遺伝子から転写されたmRNA分子の翻訳を開始するためにインビボで使用されるコドン（１つまたは複数）を称する。
【００１５】
当該技術分野では、遺伝子の翻訳終止コドン（又は「終結(stop)コドン」）は３つの配列、すなわち5'-UAA、5'-UAGおよび5'-UGA（対応するDNA配列はそれぞれ、5'-TAA、5'-TAGおよび5'-TGA）の１つを有することができることも知られている。用語「出発コドン領域」および「翻訳開始コドン領域」とは、は翻訳開始コドンからいずれかの方向（すなわち5'または3'）に約25から約50の連続するヌクレオチドを包含するそのようなmRNAまた遺伝子の部分を称する。同様に、用語「終結コドン領域」および「翻訳終止コドン領域」は、翻訳終止コドンからいずれかの方向（すなわち5'または3'）に約25から約50の連続するヌクレオチドを包含するそのようなmRNAまたは遺伝子の部分を称する。
【００１６】
翻訳開始コドンと翻訳終止コドンとの間の位置を称すると当該技術分野で知られているオープンリーディングフレイム（ORF）または「コード領域」も、効果的に標的とされ得る領域である。他の標的領域には、当該技術分野では翻訳開始コドンから5'方向のmRNAの部分を称することが知られている5'非翻訳領域（5'UTR）を含み（すなわち5'キャップ部位とmRNAの翻訳開始コドンの間のヌクレオチド、または遺伝子の対応するヌクレオチドを含む）、ならびに当該技術分野では翻訳終止コドンから3'方向のmRNAの部分を称することが知られている3'非翻訳領域（3'UTR）を含む（すなわち翻訳終結コドンとmRNAの3'末端の間のヌクレオチドまたは遺伝子の対応するヌクレオチドを含む）。mRNAの5'キャップは、5'-5'トリホスフェート結合を介して、mRNAの最も5'側の残基に連結したN7-メチル化グアノシン残基を含んで成る。mRNAの5'キャップ領域は、5'キャップ構造自体ならびにキャップに隣接する最初の50ヌクレオチドを含むと考えられる。
【００１７】
5'キャップ領域も好適な標的領域となり得る。
【００１８】
真核生物のmRNA転写産物の中には直接翻訳されるものもあるが、多くが「イントロン」として知られている１以上の領域を含み、これは翻訳される前に転写産物から切り出される。残る（したがって翻訳された）領域は「エキソン」として知られ、そして一緒にスプライシングされて連続するmRNA配列を形成する。mRNAスプライス部位、すなわちイントロン−エキソン連結部位も好適な標的部位であり、そして疾患において異常なスプライシングが関与する状況、あるいは疾患において特定のmRNAスプライス産物の過剰生産が関与する状況において特に有用である。再編成または欠失による異常な融合連結も好適な標的である。イントロンも効果的となり、したがって例えばDNAまたはmRNA前駆体を標的とするアンチセンス化合物の好適な標的領域であることが分かった。
【００１９】
いったん１以上の標的部位が同定されれば、標的に十分に相補的に、すなわち十分によく、しかも十分な特異性でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを選択して所望の効果を得る。
【００２０】
本発明の内容において「ハイブリダイゼーション」とは、相補的なヌクレオシドまたはヌクレオチド塩基対間のワトソン−クリック、フーグスティーンまたは逆フーグスティーン水素結合でよい水素結合を意味する。例えばアデニンおよびチミンは、水素結合の形成を通して対をなす相補的核酸塩基である。本明細書で使用する「相補的」とは、２つのヌクレオチド間を正確に対合することができる能力を称する。例えばオリゴヌクレオチドの特定位置でのヌクレオチドがDNAまたはRNA分子の同じ位置でヌクレオチドと水素結合することができれば、オリゴヌクレオチドとDNAまたはRNAはその位置で互いに相補的であると考えられる。オリゴヌクレオチドおよびDNAまたはRNAは、各分子中で十分数の相当する位置が、互いに水素結合することができるヌクレオチドにより占有される時、互いに相補的である。このように「特異的にハイブリダイズ可能な」および「相補的な」とは、オリゴヌクレオチドおよびDNAまたはRNA標的間で、安定かつ特異的な結合が起こるような、十分な程度の相補的な、または正確な対合を示すために使用する用語である。アンチセンス化合物の配列は、特異的にハイブリダイズすることが可能なその標的核酸に100％相補的である必要はないと当該技術分野では理解されている。アンチセンス化合物は、化合物の標的DNAまたはRNA分子との結合が、標的DNAまたはRNAの正常な機能を妨害して利用性の損失を生じる時、および特異的結合が望まれる条件下、すなわちインビボアッセイまたは治療的処置の場合における生理学的条件下、およびインビトロアッセイの場合、アッセイが行われる条件下で、アンチセンス化合物の非標的配列への非特異的結合を回避するために十分な程度の相補性がある時に特異的にハイブリダイズすることが可能である。
【００２１】
アンチセンス化合物は、研究試薬および診断薬として一般に使用されている。例えば正確な特異性で遺伝子発現を阻害することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、しはしば特定の遺伝子の機能を解明するために当業者により使用されている。またアンチセンス化合物は、例えば生物学的経路の種々の員の機能間を識別するためにも使用される。したがってアンチセンスモジュレーションは、研究的使用のために利用されてきた。
【００２２】
アンチセンスの特異性および感受性も、治療的使用のために当業者により利用されている。アンチセンスオリゴヌクレオチドは動物および人間の疾患状態の処置に治療的部分として採用されたて来た。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトに安全かつ効果的に投与され、そして多数の臨床試験が現在行われている。このようにオリゴヌクレオチドは、細胞、組織および動物、特にヒトの処置のための治療的投薬に有用となるように形成することができる有用な治療的モダリティーとなり得る。
【００２３】
本発明の内容では、用語「オリゴヌクレオチド」はリボ核酸（RNA）またはデオキシリボ核酸（DNA）またはそれらの模造物(mimetics)のオリゴマーまたはポリマーを称する。この用語には、自然に生じる核酸塩基、糖および共有ヌクレオシド間（骨格）結合ならびに同様に機能する自然には存在しない部分を有するオリゴヌクレオチドを含む。そのような修飾または置換オリゴヌクレオチドは、例えば強化された細胞の取り込み、強化された核酸標的に対する親和性、およびヌクレアーゼの存在下での安定性の上昇のような望ましい特性により、自然な形態よりも好ましいことが多い。
【００２４】
アンチセンスオリゴヌクレオチドはアンチセンス化合物の好適な形態であるが、本発明は限定するわけではないが以下に記載するようなオリゴヌクレオチド模造物を含む他のオリゴマーのアンチセンス化合物を包含する。本発明によるアンチセンス化合物は、好ましくは約８〜約30個の核酸塩基（すなわち約８〜約30個の連結ヌクレオシド）を含んで成る。特に好適なアンチセンス化合物はアンチセンスオリゴヌクレオチド、さらに一層好ましくは約12〜約25個の核酸塩基を含んで成るものである。当該技術分野では知られているように、ヌクレオチドは塩基−糖の組み合わせである。ヌクレオシドの塩基部分は通常、複素環式塩基である。そのような複素環式塩基のうちの２つの最も多くの種類は、プリンおよびピリミジンである。ヌクレオチドはヌクレオシドの糖部分に共有的に連結したリン酸基をさらに含むヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を含むこれらヌクレオシドについては、リン酸基を糖の2'、3'または5'ヒドロキシル部分のいずれかに連結することができる。オリゴヌクレオチドの形成では、リン酸基は隣接するヌクレオシドに互いに共有的に結合して線状のポリマー化合物を形成する。次にこの線状のポリマー構造の各末端がさらに連結して環状構造を形成することができるが、開放の線状構造が一般には好適である。オリゴヌクレオチド構造内で、リン酸基は通常、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間骨格を形成すると言われている。RNAおよびDNAの正常な結合は、3’から5'へのホスホジエステル結合である。
【００２５】
本発明に有用な好適なアンチセンス化合物の具体例には、修飾された(modified)骨格または自然ではないヌクレオシド結合を含有するオリゴヌクレオチドを含む。本明細書で定義するように、修飾された骨格を有するオリゴヌクレオチドには、リン原子を骨格に保持するもの、およびリン原子を骨格に保持しないものを含む。本明細書の目的、そして当該技術分野でよく言われるように、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間骨格中にリン原子をもたない修飾オリゴヌクレオチドも、オリゴヌクレオシドであると考えることができる。
【００２６】
好適な修飾オリゴヌクレオチド骨格には、例えばホスホロチオエート、キラルなホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロトリエステル、アミノアルキルホスホロトリエステル、メチルおよび他のアルキルホスホネート（3'-アルキレンホスホネートおよびキラルなホスホネートを含む）、ホスフィネート、ホスホロアミデート（3'-アミノホスホロアミデートおよびアミノアルキルホスホロアミデートを含む）、チオノホスホロアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、および正常3'-5'結合、これらの2'-5'結合同族体を有するボラノホスフェート、および逆転した極性を有するもの、ここでヌクレオシド単位の隣接対は、3'-5'から5'-3'または2'-5'から5'-2'で連結される。種々の塩、混合塩および遊離酸形態も含む。
【００２７】
上記のリン含有結合の調製を教示する代表的な米国特許には、限定するわけではないが：米国特許第3,687,808号;同第4,469,863号;同第4,476,301号;同第5,023,243号;同第5,177,196号;同第5,188,897号;同第5,264,423号;同第5,276,019号;同第5,278,302号;同第5,286,717号;同第5,321,131号;同第5,399,676号;同第5,405,939号;同第5,453,496号;同第5,455,233号;同第5,466,677号;同第5,476,925号;同第5,519,126号;同第5,536,821号;同第5,541,306号;同第5,550,111号;同第5,563,253号;同第5,571,799号;同第5,587,361号;および同第5,625,050号明細書を含み、その中の特定の特許は本出願と共有され、そして各々は引用により本明細書に編入される。
【００２８】
それらの中にリン原子を含まない好適な修飾オリゴヌクレオチド骨格は、短鎖アルキルまたはシクロルキルのヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子およびアルキルまたはシクロアルキルのヌクレオシド間結合、または１以上の短鎖ヘテロ原子もしくは複素環式ヌクレオシド間結合により形成される骨格を有する。これらにはモルホリノ結合（一部はヌクレオシドの糖部分から形成される）；シロキサン骨格；スルフィド；スルホキシドおよびスルホン骨格；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格；スルホネートおよびスルホンアミド骨格；アミド骨格；および混合Ｎ、Ｏ、ＳおよびCH2成分部分を有するその他の骨格を含む。
【００２９】
上記オリゴヌクレオシドの調製を教示する代表的な米国特許には、限定するわけではないが：米国特許第5,034,506号;同第5,166,315号;同第5,185,444号;同第5,214,134号;同第5,216,141号;同第5,235,033号;同第5,264,562号;同第5,264,564号;同第5,405,938号;同第5,434,257号;同第5,466,677号;同第5,470,967号;同第5,489,677号;同第5,541,307号;同第5,561,225号;同第5,596,086号;同第5,602,240号;同第5,610,289号;同第5,602,240号;同第5,608,046号;同第5,610,289号;同第5,618,704号;同第5,623,070号;同第5,663,312号;同第5,633,360号;同第5,677,437号;および同第5,677,439号明細書を含み、その中の特定の特許は本出願と共有され、そして各々は引用により本明細書に編入される。
【００３０】
他の好適なオリゴヌクレオチド模造物では、ヌクレオチド単位の糖およびヌクレオシド間結合の両方、すなわち骨格が新しい基で置き換えられている。塩基単位は適切な核酸標的化合物とハイブリダイズするために維持されている。１つのそのようなオリゴマー化合物である優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されたオリゴヌクレオチド模造物を、ペプチド核酸（PNA）と称する。PNA化合物では、オリゴヌクレオチドの糖−骨格がアミド含有骨格、特にアミノエチルグリシン骨格に置き換えられている。この核酸塩基は保持され、そして骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接または間接的に結合する。PNA化合物の調製を教示する代表的な米国特許には、限定するわけではないが：米国特許第5,539,082号;同第5,714,331号;および同第5,719,262号明細書を含み、その各々は引用により本明細書に編入する。さらにPNA化合物の教示は、Nielsen et al.,Science,1991,254,1497-1500に見いだすことができる。
【００３１】
本発明の最も好適な態様は、ホスホロチオエート骨格を有するオリゴヌクレオチドおよびヘテロ原子骨格を有するオリゴヌクレオシド、そして特に上記に引用した米国特許第5,489,677号明細書の-CH2-NH-O-CH2-、-CH2-N(CH3)-O-CH2-［メチレン（メチレンイミノ）またはMMI骨格として知られている］、-CH2-O-N(CH3)-CH2-、-CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2-および-O-N(CH3)-CH2-CH2-［ここで自然なホスホジエステル骨格は、-O-P-O-CH2-で表される］、および上記に引用した米国特許第5,602,240号明細書のアミド結合である。また上記に引用した米国特許第5,034,506号明細書のモルホリノ骨格構造を有するオリゴヌクレオチドも好適である。
【００３２】
修飾したオリゴヌクレオチドは、１以上の置換された糖部分を有することもできる。好適なオリゴヌクレオチドは、2'位に１以上の以下の基を含んで成る：OH；Ｆ；Ｏ-、Ｓ-またはN-アルキル；Ｏ-、Ｓ-またはN-アルケニル；Ｏ-、Ｓ-またはN-アルキニル；またはO-アルキル-O-アルキルであり、ここでアルキル、アルケニルおよびアルキニルは、置換されたまたは置換されていないＣ1−Ｃ10アルキルまたはＣ2−Ｃ10アルケニルおよびアルキニルであることができる。特に好適であるのは、O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2)nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2、およびO(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2であり、ここでｎおよびｍは１から約10である。他の好適なオリゴヌクレオチドは、2'位に１以上の以下の基を含んで成る：Ｃ1−Ｃ10低級アルキル、置換された低級アルキル、アルクアリール、アラルキル、O-アルクアリールまたはO-アラルキル、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、Ｎ3、NH2、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルクアリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換されたシリル、RNA開裂基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を向上する基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を向上する基、および類似の特性を有する他の置換基。好適な修飾には、2'-メトキシエトキシ（2'-O-CH2CH2OCH3、2'-O-(2-メトキシエチル)または2'-MOEとしても知られている）（Martin et al.,Helv.Chim.Acta,1995,78,486-504）、すなわちアルコキシアルコキシ基を含む。さらに好適な修飾には、以下の実施例に記載するような2'-ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわちO(CH2)2ON(CH3)2基（2'-DMAOEとしても知られている）、およびこれも以下の実施例に記載するような2'-O-ジメチルアミノエトキシエトキシ（当該技術分野では2'-O-ジメチルアミノエトキシエチルまたは2'-DMAEOEとしても知られている）、すなわち2'-O-CH2-O-CH2-N(CH2)2を含む。
【００３３】
他の好適な修飾には、2'-メトキシ（2'-O-CH3）、2'-アミノプロポキシ（2'-OCH2CH2CH2NH2）および2'-フルオロ（2'-F）を含む。同様な修飾が、オリゴヌクレオチドの他の位置、特に3'末端ヌクレオチドまたは2'-5'結合オリゴヌクレオチド上の糖の3'位、および5'末端ヌクレオチドの5'位でなされてもよい。オリゴヌクレオチドはペンタフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分のような糖模造物を有してもよい。そのような修飾された糖構造の調製を教示する代表的な米国特許には限定するわけではないが：米国特許第4,981,957号;同第5,118,800号;同第5,319,080号;同第5,359,044号;同第5,393,878号;同第5,446,137号;同第5,466,786号;同第5,514,785号;同第5,519,134号;同第5,567,811号;同第5,576,427号;同第5,591,722号;同第5,597,909号;同第5,610,300号;同第5,627,053号;同第5,639,873号;同第5,646,265号;同第5,658,873号;同第5,670,633号;および同第5,700,920号明細書を含み、その中の特定の特許は本出願と共有され、そして各々は引用により全部、本明細書に編入する。
【００３４】
オリゴヌクレオチドは核酸塩基（当該技術分野では単に「塩基」と呼ぶことが多い）修飾または置換も含んでよい。本明細書で使用するように、「非修飾」または「天然の」核酸塩基には、プリン塩基のアデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、およびピリミジン塩基のチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）を含む。修飾された核酸塩基には、5-メチルシトシン(5-me-C）、5-ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、2-アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの6-メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの2-プロピルおよび他のアルキル誘導体、2-チオウラシル、2-チオチミンおよび2-チオシトシン、5-ハロウラシルおよびシトシン、5-プロピニルウラシルおよびシトシン、6-アゾウラシル、シトシンおよびチミン、5-ウラシル(プソイドウラシル）、4-チオウラシル、8-ハロ、8-アミノ、8-チオール、8-チオアルキル、8-ヒドロキシおよび他の8-置換アデニンおよびグアニン、5-ハロ特に5-ブロモ、5-トリフルオロメチルおよび他の5-置換ウラシルおよびシトシン、7-メチルグアニンおよび7-メチルアデニン、8-アザグアニンおよび8-アザアデニン、7-デアザグアニンおよび7-デアザアデニンおよび3-デアザグアニンおよび3-デアザアデニンのような他の合成および天然の核酸塩基を含む。さらに核酸塩基には、米国特許第3,687,808号明細書に記載されているもの、ポリマー科学および工学の簡易辞典（The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering）、第858〜859頁、Kroschwitz,J.I.,編集、ジョン ウィリー＆サンズ、1990に開示されたもの、Englisch et al.、応用(Angewandte Chemie)、国際版、1991、30,613に開示されているもの、およびSanghvi,Y.S.、第15章、アンチセンスの調査および応用（Antisense Research and Applications）、第289〜302頁、Crooke,S.T.およびLebleu,B.編集、CRC出版、1993 に開示されているものを含む。これらの核酸塩基のある種のものは、本発明のオリゴマー化合物の結合親和性の上昇に有用である。これらには2-アミノプロピルアデニン、5-プロピニルウラシルおよび5-プロピニルシトシンを含む5-置換ピリミジン、6-アザピリミジンおよびN-2、N-6およびO-6置換プリンを含む。5-メチルシトシン置換が0.6−1.2℃による核酸二重鎖安定性を上昇させることを示し（Sanghvi,Y.S.,Crooke,S.T.and Lebleu,B.編集、アンチセンスの調査および応用（Antisense Research and Applications）、CRC出版、ボカラトン、1993、第276〜278頁）、そして現在好適な塩基置換であり、2'-O-メトキシエチル糖修飾と組み合わせる時により一層好ましい。
【００３５】
特定の上記の特記した修飾した核酸塩基ならびに他の修飾した核酸塩基の調製を教示する代表的な米国特許には限定するわけではないが上記の米国特許第3,687,808号明細書ならびに：米国特許第4,845,205号;同第5,130,302号;同第5,134,066号;同第5,175,273号;同第5,367,066号;同第5,432,272号;同第5,457,187号;同第5,459,255号;同第5,484,908号;同第5,502,177号;同第5,525,711号;同第5,552,540号;同第5,587,469号;同第5,594,121号;同第5,596,091号;同第5,614,617号;および同第5,681,941号明細書を含み、その中の特定の特許は本出願と共有され、そして各々は引用により本明細書に編入され、そして米国特許第5,750,692号明細書は本出願と共有され、そして引用により本明細書に編入される。
【００３６】
本発明のオリゴヌクレオチドの別の修飾には、活性、オリゴヌクレオチドの細胞分布または細胞取り込みを強化する１以上の部分または結合物にオリゴヌクレオチドを化学的に連結することが関与する。そのような部分には限定するわけではないが、コレステロール部分のような脂質部分（Letsinger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1989,86,6553-6556）、コリン酸（Manoharan et al.,Bioorg.Med.Chem.Let.,1994,4,1053-1060）、チオエーテル、例えばヘキシル S-トリチルチオール（Manoharan et al.,Ann.N.Y.Acad.Sci.,1992,660,306-309;Manoharan et al.,Bioorg.Med.Chem.Let.,1993,3,2765-2770）、チオコレステロール（Oberhauser et al.,Nucl.Acids Res.,1992,20,533-538）、脂肪族鎖、例えばドデカンジオールまたはウンデシル残基（Saison-Behmoaras et al.,EMBO J.,1991,10,1111-1118;Kabanov et al.,FEBS Lett.,1990,259,327-330;Svinarchuk et al.,Biochimie,1993,75,49-54)、リン脂質、例えばジヘキサデシル-rac-グリセロールまたはトリエチルアンモニウム 1,2-ジ-O-ヘキサデシル-rac-グリセロ-3-H-ホスホネート（Manoharan et al.,Tetrahedron Lett.,1995,36,3651-3654;Shea et al.,Nucleic Acids Res.,1990,18,3777-3783）、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖（Manoharan et al.,Nucleosides & Nucleotides,1995,14,964-973）、またはアダマンタン酢酸（Manoharan et al.,Tetrahedron Lett.,1995,36,3651-3654）、パルミチル部分（Mishra et al.,Biochim.Biophys.Acta,1995,1264,229-237）、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノカルボニル-オキシコレステロール部分（Crooke et al.,J.Pharmacol.Exp.Ther.,1996,277,923-937）を含む。
【００３７】
そのようなオリゴヌクレオチド結合物の調製を教示する代表的な米国特許には限定するわけではないが米国特許第4,828,979号;同第5,948,882号;同第5,218,105号;同第5,525,465号;同第5,541,313号;同第5,545,730号;同第5,552,538号;同第5,578,717号;同第5,580,731号;同第5,580,731号;同第5,591,584号;同第5,109,124号;同第5,118,802号;同第5,138,045号;同第5,414,077号;同第5,486,603号;同第5,512,439号;同第5,578,718号;同第5,608,046号;同第4,587,044号;同第4,605,735号;同第4,667,025号;同第4,762,779号;同第4,789,737号;同第4,824,941号;同第4,835,263号;同第4,876,335号;同第4,904,582号;同第4,958,013号;同第5,082,830号;同第5,112,963号;同第5,214,136号;同第5,082,830号;同第5,112,963号;同第5,214,136号;同第5,245,022号;同第5,254,469号;同第5,258,506号;同第5,262,536号;同第5,272,250号;同第5,292,873号;同第5,317,098号;同第5,371,241号;同第5,391,723号;同第5,416,203号;同第5,451,463号;同第5,510,475号;同第5,512,667号;同第5,514,785号;同第5,565,552号;同第5,567,810号;同第5,574,142号;同第5,585,481号;同第5,587,371号;同第5,595,726号;同第5,597,696号;同第5,599,923号;同第5,599,928号および同第5,688,941号明細書を含み、その中の特定の特許は本出願と共有され、そして各々は引用により本明細書に編入される。
【００３８】
上記化合物のすべての位置が均一に修飾される必要はなく、そして実際には上記修飾の１以上が１つの化合物中に、またはオリゴヌクレオチド中のただ１つヌクレオシドに包含されてもよい。本発明はキメラ化合物であるアンチセンス化合物も含む。本発明の内容では「キメラ」アンチセンス化合物または「キメラ」は、各々が少なくとも１つのモノマー単位、すなわちオリゴヌクレオチド化合物の場合はヌクレオチドからできた２以上の化学的に異なる領域を含むアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは典型的には少なくとも１つの領域を含み、ここでオリゴヌクレオチドにヌクレアーゼ分解に対する耐性の上昇、細胞の取り込みの上昇、および／または標的核酸に対する結合親和性の上昇を付与するように修飾される。オリゴヌクレオチドのさらなる領域は、RNA:DNAまたはRNA:RNAハイブリッドを開裂することができる酵素の基質として役立つことができる。例としてRNaseHはRNA:DNA二本鎖のRNA鎖を開裂する細胞性エンドヌクレアーゼである。したがってRNaseHの活性化はRNA標的の開裂をもたらし、これにより遺伝子発現のオリゴヌクレオチド阻害の効率を大変強化する。その結果、キメラオリゴヌクレオチドを使用した時に、同じ標的領域とハイブリダイズするホスホロチオエートデオキシオリゴヌクレオチドと比較して、匹敵する結果をより短いオリゴヌクレオチドでしばしば得ることができる。RNA標的の開裂は、ゲル電気泳動そして必要ならば当該技術分野で既知の関連する核酸ハイブリダイゼーション法により日常的に検出することができる。
【００３９】
本発明のキメラアンチセンス化合物は、上記の２以上のオリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシドおよび／またはオリゴヌクレオチド模造物の複合構造として形成され得る。そのような化合物は当該技術分野ではハイブリッドまたはギャップマー（gapmer）と呼ばれる。そのようなハイブリッド構造の調製を教示する代表的な米国特許は、限定するわけではないが：第5,013,830号;同第5,149,797号;同第5,220,007号;同第5,256,775号;同第5,366,878号;同第5,403,711号;同第5,491,133号;同第5,565,350号;同第5,623,065号;同第5,652,355号;同第5,652,356号;および同第5,700,922号明細書を含み、その中の特定の特許は本出願と共有され、そして各々は引用により本明細書に編入される。
【００４０】
本発明に従い使用されるアンチセンス化合物は、固相合成の周知技術を通して従来通り、そして日常的に作成することができる。そのような合成の装置は、例えばアプライドバイオシステムズ（Applied Biosystems）（フォスター市、カリフォルニア州）を含む数社の売主から販売されている。当該技術分野で既知のそのような合成のための他の手段をさらに、または代替的に採用してもよい。ホスホロチオエートおよびアルキル化誘導体のようなオリゴヌクレオチドを調製するために、類似技法を使用することは周知である。
【００４１】
本発明のアンチセンス化合物はインビトロで合成され、そして生物起源のアンチセンス組成物、またはインビボのアンチセンス分子の合成を支配するように設計された遺伝子ベクター構築物は含まない。
【００４２】
本発明の化合物は、取り込み、分布および／または吸収を補助するために、例えばリポソーム、受容体標的分子、経口、直腸、局所または他の製剤のような他の分子、分子構造または化合物の混合物と混合、カプセル化、結合または会合（associated）してもよい。そのような取り込み、分布および／または吸収を補助する製剤の調製を教示する代表的な米国特許は、限定するわけではないが：同第5,108,921号;同第5,354,844号;同第5,416,016号;同第5,459,127号;同第5,521,291号;同第5,543,158号;同第4,547,932号;同第5,583,020号;同第5,591,721号;同第4,426,330号;同第4,534,899号;同第5,013,556号;同第5,108,921号;同第5,213,804号;同第5,227,170号;同第5,264,221号;同第5,356,633号;同第5,395,619号;同第5,416,016号;同第5,417,978号;同第5,462,854号;同第5,469,854号;同第5,512,295号;同第5,527,528号;同第5,534,259号;同第5,543,152号;同第5,556,948号;同第5,580,575号;および同第5,595,756号明細書を含み、各々は引用により本明細書に編入される。
【００４３】
本発明のアンチセンス化合物は、製薬学的に許容される塩、エステル、そのようなエステルの塩、またはヒトを含む動物に投与した時、生物学的に活性な代謝産物またはそれらの残基を（直接的または間接的に）提供することができる他の化合物を包含する。したがって例えば開示にはまた本発明の化合物のプロドラッグおよび製薬学的に許容される塩、そのようなプロドラッグの製薬学的に許容される塩、および他の生物均等物が引き出される。
【００４４】
用語「プロドラッグ」は、内因性の酵素または他の化学品および／または条件の作用により体内またはそれらの細胞内で活性形（すなわち薬剤）に転換される不活性形で調製される治療剤を示す。特に本発明のオリゴヌクレオチドのプロドラッグ変更体（version）は、1993年12月9日に公開されたGosselin et al.の国際公開第93/24510号明細書またはImbach et al.の国際公開第94/26764号明細書に開示された方法に従いSATE[(S-アセチル-2-チオエチル)ホスフェート]誘導体として調製される。
【００４５】
用語「製薬学的に許容される塩」とは、本発明の化合物の生理学的かつ製薬学的に許容される塩を称する：すなわち元の化合物の所望する生物学的活性を保持し、そしてそれらに望ましくない毒物学上の効果を与えない塩である。
【００４６】
製薬学的に許容される塩基付加塩は、アルカリおよびアルカリ土類金属または有機アミンのような金属またはアミンを用いて形成される。カチオンとして使用される金属を例は、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム等である。適当なアミンの例は、N,N-ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、エチレレンジアミン、N-メチルグルカミン、およびプロカイン（例えばBerge et al.,「製薬用の塩（Pharmaceutical Salts)」、J.of Pharma Sci.,1977,66,1-19）。該酸性化合物の塩基付加塩は、通例の様式で塩を生成するために遊離酸形を十分な量の所望する塩基と接触させることにより調製される。遊離酸形は、塩形を酸と接触させ、そして通例の様式で遊離酸を単離することにより再生することができる。遊離酸形は、極性溶媒中での溶解度のようなある種の物理的特性がそれぞれの酸形とは幾分異なるが、その他は本発明の目的に関して塩はそれぞれの遊離酸と均等である。本明細書で使用する「製薬学的な付加塩」には、発明の組成物の成分の１つの酸形の製薬学的に許容される塩を含む。これらにはアミンの有機または無機酸塩を含む。好適な酸塩は、塩酸塩、酢酸塩、サリチル酸塩、硝酸塩およびリン酸塩である。他の適当な製薬学的に許容される塩は当業者には周知であり、そして例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸またはリン酸のような例えば無機酸とのような；例えば酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、コハク酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、メチルマレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、乳酸、蓚酸、グルコン酸、グルタル酸、グルクロン酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、サリチル酸、4-アミノサリチル酸、2-フェノキシ安息香酸、2-アセトキシ安息香酸、エンボン酸(embonic acid)、ニコチン酸またはイソニコチン酸のような有機カルボン酸、スルホン酸、スルホおよびホスホ酸またはN-置換スルファミン酸とのような；および天然のタンパク質の合成に関与する20アルファ-アミノ酸のようなアミノ酸、例えばグルタミン酸またはアスパラギン酸とのような、およびまたフェニル酢酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、2-ヒドロキシエタンスルホン酸、エタン-1,2-ジスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、4-メチルベンゼンスルホン酸、ナフタレン-2-スルホン酸、ナフタレン-1,5-ジスルホン酸、2-または3-ホスホグリセレート、グルコース-6-ホスフェート、N-シクロヘキシルスルファミン酸（シクラメートの形成に）とのような、あるいはアスコルビン酸のような他の酸性有機化合物とのような種々の無機および有機酸の塩基性塩を含む。
【００４７】
オリゴヌクレオチドに関して、製薬学的に許容される塩の好適な例には限定するわけではないが、（ａ）ナトリウム、カリウム、アンモニウム、マグネシウム、カルシウム、スペルミンおよびスペルミジンのようなポリアミン等のようなカチオンと形成される塩；（ｂ）例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸等の無機酸と形成される酸付加塩；（ｃ）例えば酢酸、蓚酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、パルミチン酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンスルホン酸、メタンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、ポリガラクツロン酸等のような有機酸と形成される塩；（ｄ）塩素、臭素およびヨウ素のような元素アニオンから形成される塩を含む。
【００４８】
本発明のアンチセンス化合物は、診断薬、治療薬、予防薬および研究試薬およびキットに利用することができる。治療薬については、PTP1Bの発現をモジュレートすることにより処置することができる疾患または障害を有すると疑われる動物好ましくはヒトが、本発明によるアンチセンス化合物を投与することにより処置される。本発明の化合物は効果的な量のアンチセンス化合物を適当な製薬学的に許容される希釈剤またはキャリアーに加えることにより製薬学的組成物中で使用することができる。本発明のアンチセンス化合物の使用および方法は、例えば感染、炎症または腫瘍形成を防止または遅らせるために予防的にも有用となり得る。
【００４９】
本発明のアンチセンス化合物は、これらの化合物がPTP1Bをコードする核酸とハイブリダイズし、この事実を容易に利用するために構成されるサンドイッチおよび他のアッセイを可能とするので、研究および診断薬としても有用である。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドとPTP1Bをコードする核酸とのハイブリダイゼーションは、当該技術分野で既知の手段により検出することができる。そのような手段には、酵素とオリゴヌクレオチドとの結合物、オリゴヌクレオチドの放射性標識または他の適当な検出手段を含むことができる。サンプル中のPTP1Bレベルを検出するためにそのような検出手段を使用するキットも調製することができる。
【００５０】
本発明には本発明のアンチセンス化合物を含む医薬組成物および製剤も含む。本発明の医薬組成物は、局所的または全身的処置が望まれるかどうか、および処置する領域に依存して、多数の方法で投与することができる。投与は局所的（目および膣および直腸送達を含む粘膜を含む）、ネブライザーによる行為を含む例えば粉末もしくはエアゾールの吸入または吹送による肺；気管内、鼻内、上皮または経皮）、経口または非経口でよい。非経口投与には、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内または筋肉内注射または注入；あるいは頭蓋内、例えば鞘内または脳室内投与を含む。少なくとも１つの2'-O-メトキシエチル修飾を含むオリゴヌクレオチドが経口投与には特に有用であると考えられる。
【００５１】
局所投与用の医薬組成物および製剤には、経皮用パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、座薬、スプレー、液体および粉末を含む。通例の医薬キャリアー、水性、粉末または油状基剤、増粘剤等が必要または望ましいかもしれない。被覆されたコンドーム、手袋等も有用である。
【００５２】
経口投与用の組成物および製剤には、粉末または粒子、水または非水性媒体の懸濁液または溶液、カプセル、小袋または錠剤を含む。増粘剤、香料、希釈剤、乳化剤、分散剤または結合剤も望ましいかもしれない。
【００５３】
非経口、頭蓋内または脳室内投与用の組成物および製剤には、バッファー、希釈剤および限定するわけではないが浸透強化剤、キャリアー化合物のような適当な添加剤、および他の製薬学的に許容されるキャリアーおよび賦形剤も含んでよい滅菌水溶液を含むことができる。
【００５４】
本発明の医薬組成物には、限定するわけではないが、溶液、乳液およびリポソーム含有製剤を含む。これらの組成物は限定するわけではないが予め形成された液体、自己−乳化型固体および自己−乳化型半固体を含む種々の成分から生成することができる。
【００５５】
通常は単位剤形で存在し得る本発明の医薬製剤は、製薬産業で周知な通例の技法に従い調製することができる。そのような技法には有効成分を医薬キャリアー（1つまたは複数）または賦形剤（1つまたは複数）と合わせるようにする工程を含む。一般に製剤は有効成分を液体キャリアーまたは微細に分割した固体キャリアーまたは両方と均一かつ完全に合わせ、そして次いで必要ならば生成物に成形することにより調製する。
【００５６】
本発明の組成物は、限定するわけではないが錠剤、カプセル、液体シロップ、柔軟ゲル、座薬および軟膏のような任意の多くの可能な剤形に配合することができる。本発明の組成物は、水性、非−水性または混合媒質中の懸濁液としても配合することができる。水性懸濁液はさらに、例えばナトリウムカルボシキメチルセルロース、ソルビトールおよび／またはデキストランを含む懸濁液の粘性を上げる物質を含んでもよい。また懸濁液は、安定化剤を含んでもよい。
【００５７】
本発明の１態様では、医薬組成物は泡沫として配合され、そして使用することもできる。医薬泡沫には限定するわけではないが、乳液、ミクロエマルジョン、クリーム、ゼリーおよびリポソームのような製剤を含む。基本的には同様の性質であるが、これらの製剤は最終生成物の成分およびコンシステンシーが変動する。そのような組成物および製剤の調製は一般に、製薬および製剤技術の当業者には知られており、そして本発明の組成物の配合に応用することができる。
乳液
本発明の組成物は乳液として調製し、そして配合することができる。乳液は典型的には１つの液体が通常、0.1μmの直径を越えない液滴の状態で別の液体に分散されているヘテロロガスな系である。（Idson、製薬用の剤形（Pharmaceutical Dosage Forms）で、Lieberman，Rieger および Banker（編集）、1988、マルセルデッカー社(Marcel Dekker,Inc.）、ニューヨーク、ニューヨーク州、第１巻、第199頁；Rosoff、製薬用の剤形（Pharmaceutical Dosage Forms）で、Lieberman，Rieger および Banker（編集）、1988、マルセルデッカー社、ニューヨーク、ニューヨーク州、第１巻、第245頁；Block、製薬用の剤形（Pharmaceutical Dosage Forms）で、Lieberman，Rieger および Banker（編集）、1988、マルセルデッカー社、ニューヨーク、ニューヨーク州、第２巻、第335頁；Higuchi et al.、レミングトンの製薬科学（Remington's Pharmaceutical Sciences）で、マック出版社(Mack Publishing Co.）、イーストン、ペンシルベニア州、第301頁）。乳液はしばしば、完全に混合し、そして互いに分散した２種の非混和性液体相を含んで成る二相系である。一般に乳液は油中水型（W/O)または水中油型(O/W)の種類のいずれかであり得る。水性相が大量の油性相に微細に分割され、そして微小な液滴として分散している時、生成した組成物は油中水型（W/O)乳液と呼ばれる。あるいは油性相が大量の水性相に微細に分割され、そして微小な液滴として分散している時、生成した組成物は水中油型（O/W)乳液と呼ばれる。乳液は分散した相および活性薬剤に加えて、水性相、油性相中の溶液として、または別の相としてそれ自体で存在し得るさらなる成分を含んでもよい。乳化剤、安定化剤、色素および酸化防止剤のような製薬用賦形剤は、必要に応じて乳液中に存在してよい。製薬用乳液は、例えば油中水中油型（O/W/O）および水中油中水型（W/O/W）乳液の場合のように、２以上の相から成る多相乳液（multiple emulsion）でもよい。そのような複雑な製剤はしばしば、単なる二相乳液にはない特定の利点を提供する。O/W型乳液の個々の油液滴が小さい水の液滴を包む多相乳液は、W/O/W乳液を構成する。同様に、油性の連続する中に安定化された水の球に封入された油滴の系は、O/W/O型乳液を提供する。
【００５８】
乳液は熱力学的安定性がほとんど無いか、または無いことが特徴である。しばしば乳液の分散または不連続相が，外部のまたは連続する相中でよく分散され、そしてこの形態が乳化剤または製剤の粘度の手段を通して維持されている。乳液型の軟膏基剤およびクリームの場合のように、乳液のいずれかの相は半固体または固体であることができる。乳液を安定化するための他の手段には、乳液のいずれかの相に包含され得る乳化剤の使用が必要である。乳化剤は広く４つの種類に分類することができる：合成表面活性剤、自然に存在する乳化剤、吸収基剤および微細に分割された固体（Idson、製薬用の剤形（Pharmaceutical Dosage Forms）で、Lieberman，Rieger および Banker（編集）、1988、マルセルデッカー社、ニューヨーク、ニューヨーク州、第１巻、第199頁）。
【００５９】
表面活性剤として知られている合成表面活性剤は、乳液の製剤に広く応用できることが分かり、そして技術文献で総説されている（Rieger、製薬用の剤形（Pharmaceutical Dosage Forms）で、Lieberman，Riegerおよび Banker（編集）、1988、マルセルデッカー社、ニューヨーク、ニューヨーク州、第１巻、第245頁；Idson、製薬用の剤形（Pharmaceutical Dosage Forms）で、Lieberman，Rieger および Banker（編集）、マルセルデッカー社、ニューヨーク、ニューヨーク州、1988、第１巻、第199頁）。表面活性剤は典型的には両親媒性であり、そして親水性および疎水性部分を含んで成る。表面活性剤の親水性対疎水性の性質の比率は、親水性／親油性バランス（HLB）と名付けられ、そして製剤の調製における表面活性剤の分類および選択に価値ある道具である。表面活性剤は親水性基の性質に基づき、異なる種類に分類することができる：非イオン性、アニオン性、カチオン性および両イオン性（Rieger、製薬用の剤形（Pharmaceutical Dosage Forms）で、Lieberman，Rieger および Banker（編集）、1988、マルセルデッカー社、ニューヨーク、ニューヨーク州、第１巻、第285頁）。
【００６０】
乳液製剤中に自然に存在する乳化剤には、ラノリン、蜜蝋、ホスファチド、レシチンおよびアカシアを含む。吸収基剤は、それらが水を吸い込んでW/O型乳液を形成することができるが、それでも無水ラノリンおよび親水性ペトロラタムのような半固体のコンシステンシーを保持するように、親水性の特性を保有する。微細に分割した固体は、特に表面活性剤との組み合わせ物中および粘稠な調製物中で良好な乳化剤としても使用された。これらには重金属水酸化物のような極性の無機固体、ベントナイト、アタパルジャイト、ヘクトライト、カオリン、モンモリロナイト、コロイド状珪酸アルミニウムおよびコロイド状珪酸アルミニウムマグネシウム、顔料のような非膨潤性のクレー、および炭素またはグリセリルトリステアレートのような非極性固体を含む。
【００６１】
多様な非乳化性材料を乳液製剤に含め、そして乳液の特性に貢献させる。これらには脂肪、油、ワックス、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪エステル、浸潤剤、親水性コロイド、保存剤および酸化防止剤を含む（Block、製薬用の剤形（Pharm aceutical Dosage Forms）で、Lieberman，Rieger および Banker（編集）、1988、マルセルデッカー社、ニューヨーク、ニューヨーク州、第１巻、第335頁；Idson、製薬用の剤形（Pharmaceutical Dosage Forms）で、Lieberman，Rieger および Banker（編集）、1988、マルセルデッカー社、ニューヨーク、ニューヨーク州、第１巻、第199頁）。
【００６２】
親水性コロイドまたはヒドロコロイドには、多糖（例えばアカシア、寒天、アルギン酸、カラゲーナン、グアガム、カラヤガム、およびトラガカント）、セルロース誘導体（例えばカルボキシメチルセルロースおよびカルボキシプロピルセルロース）、および合成ポリマー（例えばカルボマー、セルロースエーテルおよびカルボキシビニルポリマー）のような自然に存在するガムおよび合成ポリマーを含む。これらは水中で分散または膨潤して、分散した相の液滴の回りに強力な界面フィルムを形成することにより、および外部相の粘度を上げることにより乳液を安定化させるコロイド溶液を形成する。
【００６３】
乳液は、微生物の成長を直ちに支持することができる炭水化物、タンパク質、ステロールおよびホステァチドのような多数の材料を含むことが多いので、これらの製剤には保存剤を包含することが多い。乳液製剤に包含される通常に使用される保存剤は、メチルパラベン、プロピルパラベン、４級アンモニウム塩、塩化ベンザルコニウム、p-ヒドロキシ安息香酸のエステルおよびホウ酸を含む。酸化防止剤も通常、乳液製剤に加えられて製剤の劣化を防止する。使用される酸化防止剤は、トコフェロール、アルキルガレート、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエンのようなフリーラジカルスカベンジャー、あるいはアスコルビン酸およびメタ重亜硫酸ナトリウムのような還元剤、およびクエン酸、酒石酸およびレシチンのような酸化防止相乗剤を含む。
【００６４】
皮膚化学的、経口的および非経口的経路を介する乳液製剤の適用およびそれらの製造法は、技術文献で再考した（Idson、製薬用の剤形（Pharmaceutical Dosage Forms）で、Lieberman，Rieger および Banker（編集）、1988、マルセルデッカー社、ニューヨーク、ニューヨーク州、第１巻、第199頁）。経口送達のための乳液製剤は、配合のし易さ、吸収からの効力および生物学的利用性の観点の理由から大変広く使用されてきた。（Rosoff、製薬用の剤形（Pharmaceutical Dosage Forms）で、Lieberman，Rieger および Banker（編集）、1988、マルセルデッカー社、ニューヨーク、ニューヨーク州、第１巻、第245頁；Idson、製薬用の剤形（Pharmaceutical Dosage Forms）で、Lieberman，Rieger および Banker（編集）、1988、マルセルデッカー社、ニューヨーク、ニューヨーク州、第１巻、第199頁）。鉱物-油基剤の緩下剤、脂溶性ビタミンおよび高脂肪栄養調製物は、O/W乳液として通常、経口的に投与されてきた材料である。
【００６５】
本発明の１つの態様では、オリゴヌクレオチドおよび核酸の組成物をミクロエマルジョンとして配合する。ミクロエマルジョンは水、油および両親媒性の系として定められる、単一の光学的に等方性かつ熱力学的に安定な液体溶液であることができる（Rosoff、製薬用の剤形（Pharmaceutical Dosage Forms）で、Lieberman，Rieger および Banker（編集）、1988、マルセルデッカー社、ニューヨーク、ニューヨーク州、第１巻、第245頁）。典型的なミクロエマルジョンは、最初に油を水性表面活性剤溶液に分散し、そして次いで十分な量の第４成分、一般的には中鎖長のアルコールを加えることにより透明な系が調製される系である。その上ミクロエマルジョンは、熱力学的に安定であり、表面−活性分子の界面フィルムにより安定化される２つの非混和性液体の等方的に透明な分散物であると記載された（Leung and Shah：薬剤の放出制御：ポリマーおよび凝集物系（Controlled Release of Drugs:Polymers and Aggregates Systems)で、Rosoff,M.編集、1989、VCH出版社、ニューヨーク、第185〜215頁）。ミクロエマルジョンは通常、油、水、表面活性剤、共表面活性剤（cosurfactant）および電解質を含む３〜４種の成分の組み合わせを介して調製される。ミクロエマルジョンが油中水型（W/O)または水中油型（O/W）であるかどうかは、使用する油および表面活性剤の特性および表面活性剤分子の極性ヘッドおよび炭化水素尾の構造的および幾何学的パッキングに依存する（Schott、レミングトンの製薬科学（Remington's Pharmaceutical Science）で、マック出版社、イーストン、ペンシルベニア州、1985、第271頁）。
【００６６】
相の図形を利用した現象学的取り組みは徹底的に研究され、そしてどのようにミクロエマルジョンを配合するかの包括的知識を当業者に与えた（Rosoff、製薬用の剤形（Pharmaceutical Dosage Forms）で、Lieberman，Rieger および Banker（編集）、1988、マルセルデッカー社、ニューヨーク、ニューヨーク州、第１巻、第245頁；Block、製薬用の剤形（Pharmaceutical Dosage Forms）で、Lieberman，Rieger および Banker（編集）、1988、マルセルデッカー社、ニューヨーク、ニューヨーク州、第１巻、第335頁）。従来の乳液と比較して、ミクロエマルジョンは水不溶性薬剤を自然に形成される熱力学的に安定な液滴の製剤に可溶化する利点を提供する。
【００６７】
ミクロエマルジョンの調製に使用する表面活性剤は、限定するわけではないがイオン性表面活性剤、非イオン性表面活性剤、Brij96、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリグリセロール脂肪酸エステル、テトラグリセロールモノラルレート（ML310）、テトラクキリセロールモノオレート（MO310）、ヘキサグリセロールモノオレート（PO310）、ヘキサグリセロールペンタオレート（PO500）、デカグリセロールモノカプレート（MCA750）、デカグリセロールモノオレート（MO750）、デカグリセロールセキオレート（SO750）、デカグリセロールデカオレート（DAO750）を単独または共表面活性剤と組み合わせて含む。通常はエタノール、1-プロパノールおよび1-ブタノールのような短鎖アルコールである共表面活性剤は、表面活性剤フィルムに浸透し、そして続いて表面活性剤分子の回りに生じる空の空間（void volume）のために無秩序なフィルムを形成することにより界面の流動性の上げるために役立つ。しかしミクロエマルジョンは共表面活性剤を使用せずに調製してもよく、そしてアルコールを含まない自己−乳化型ミクロエマルジョン系が当該技術分野では知られている。水性相は典型的には、限定するわけではないが水、薬剤の水溶液、グリセロール、PEG300、PEG400、ポリグリセロール、プロピレングリコール、およびエチレングリコールの誘導体であることができる。油相には限定するわけではないがCaptex 300、Captex 355、Capmul MCM 脂肪酸エステル、中鎖（Ｃ８−Ｃ12）モノ、ジおよびトリグリセリド、ポリオキシエチル化グリセリル脂肪酸エステル、脂肪アルコール、ポリグリコール化グリセリド、飽和ポリグリコール化Ｃ８−Ｃ10グリセリド、植物油およびシリコーン油を含んでよい。
【００６８】
ミクロエマルジョンは、薬剤の可溶化および薬剤の強化された吸収の観点から特に興味深い。脂質を基剤としたミクロエマルジョン（o/wおよびw/oの両方）が、ペプチドを含む薬剤の経口的生物学的利用性を強化するために提案された（Constantinides et al.,Pharmaceutical Research,1994,11,1385-1390；Ritschel et al.,Meth.Find.Exp.Clin.Pharmacol.,1993,13,205）。ミクロエマルジョンには向上した薬剤の可溶化、酵素的加水分解からの薬剤の保護、膜の流動性および透過性において表面活性剤が誘導する改変による薬剤吸収強化の可能性、調製の容易さ、固体剤形に優る経口投与の容易さ、改善された臨床的効力、および毒性の減少といった利点がある（Constantinides et al.,Pharmaceutical Research,1994,11,1385-1390；Ho et al.,J.Pharm.Sci.,1996,85,138-143）。しばしばミクロエマルジョンはそれらの成分が周囲温度で一緒にされる時、自然に形成され得る。これは熱に不安定な薬剤、ペプチドまたはオリゴヌクレオチドを形成する時に特に有利となる。ミクロエマルジョンは化粧用および製薬用の適用の両方において、有効成分の経皮的送達にも効果的であった。本発明のミクロエマルジョン組成物および製剤は、胃腸管からのオリゴヌクレオチドおよび核酸の全身的吸収の上昇を促進し、ならびに胃腸管、膣、頬面窩洞および投与の他の領域内でのオリゴヌクレオチドおよび核酸の局所的細胞の取り込みを向上する。
【００６９】
本発明のミクロエマルジョンは、製剤の特性を改善し、そして本発明のオリゴヌクレオチドおよび核酸の吸収を強化するために、ソルビタンモノステアレート（Grill3）、Labrasolおよび浸透強化剤のようなさらなる成分および添加剤を含んでもよい。本発明のミクロエマルジョンに使用する浸透強化剤は、５つの広い範疇−表面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート剤および非−キレート非−表面活性剤の１つに属すると分類できる（Lee et al.,Critical Review in Therapeu tic Drug Carrier Systems,1991,p.92）。これらの分類の各々を上に記載した。
リポソーム
ミクロエマルジョンの外にも、研究され、そして薬剤の配合に使用された多くの組織化された表面活性剤構造がある。これらには単層、ミセル、二重層および小胞を含む。リポソームのような小胞は、薬剤送達の観点からそれらが提供するそれらの特異性および作用期間から、大いに関心が寄せられた。本明細書で使用するように用語「リポソーム」は、球状の二重層または二重層（複数）に配列された両親媒性の脂質から成る小胞を意味する。
【００７０】
リポソームは親油性材料および水性内部から形成される膜を有する一枚膜または多重層小胞である。水性部分は送達される組成物を含む。カチオン性リポソームは細胞壁に融合できる利点を有する。非カチオン性リポソームは細胞壁に効果的に融合することはできないが、インビボでマクロファージにより取り込まれる。
【００７１】
完全な哺乳動物の皮膚をわたるために、脂質小胞は適当な経皮勾配の影響下で各々が50nm未満の一連の細かい孔を通過しなければならない。したがって、高度に変形することができ、そしてそのような細かい孔を通過することができるリポソームを使用することが望ましい。
【００７２】
リポソームのさらなる利点には；自然のリン脂質から得られるリポソームは生物学的適合性があり、しかも生分解性である；リポソームは広範囲の水溶性および脂溶性薬剤を包含することができる；リポソームはカプセル化された薬剤をそれらの内部区分で代謝および分解から保護することができる（Rosoff、製薬用の剤形（Pharmaceutical Dosage Forms）で、Lieberman，Rieger および Banker（編集）、1988、マルセルデッカー社、ニューヨーク、ニューヨーク州、第１巻、第245頁）。リポソーム製剤の調製において重要な配慮は、脂質の表面電荷、小胞サイズおよびリポソームの水性容量である。
【００７３】
リポソームは有効成分を作用部位へ輸送および送達するために有用である。リポソーム膜は生物の膜に構造的に類似しているので、リポソームが組織に適用された時、リポソームは細胞膜中に移行する。リポソームが移行し、そして細胞が進行（progresses）すると、リポソーム内容物が細胞中に空けられ、ここで活性な作用物質は作用することができる。
【００７４】
リポソーム製剤は多くの薬剤の送達様式として集中的に徹底的に調査された。局所用投与について、リポソームには他の製剤に優る幾つかの利点が存在する証拠は増えている。そのような利点には、投与した薬剤の高い全身性吸収に関連する副作用の低下、所望する標的に投与した薬剤の蓄積の増加、および親水性および疎水性の両方の広範な薬剤を皮膚に投与するための能力を含む。
【００７５】
幾つかの報告は、高分子量DNAを含む作用物質を皮膚に送達するリポソームの能力を詳細に記載した。鎮痛剤、抗体、ホルモンおよび高分子量DNAを含む化合物が皮膚に投与された。投与のほとんどは表皮の上を標的とした。
【００７６】
リポソームは大きく２種類に分類される。カチオン性リポソームは、負に荷電したDNA分子と相互作用して安定な複合体を形成する正に荷電したリポソームである。正に荷電したDNA／リポソーム複合体は、負に荷電した細胞表面に結合し、そしてエンドソーム中に内面化される(internalized）。エンドソーム中の酸性pHにより、リポソームは破壊され、それらの内容物が細胞の細胞質に放出される（Wang et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.,1987,147,980-985）。
【００７７】
pH-感受性または負に荷電したリポソームは、DNAと複合化するよりはむしろDNAを封じ込める。DNAおよび脂質の両方が同様に荷電しているので、複合体の形成よりは反発が起こる。これにもかかわらず、DNAの中にはこれらリポソームの水性内部に封じ込められるものがある。pH-感受性リポソームはチミジンキナーゼ遺伝子をコードするDNAをカルチャー中の細胞単層に送達するために使用された。外因性遺伝子の発現が標的細胞中で検出された（Zhou et al.,Journal of Con trolled Release,1992,19,269-274）。
【００７８】
他の主要な種類のリポソーム組成物には、自然に誘導されるホステァチジルコリン以外のリン脂質を含む。自然なリポソーム組成物は、例えばジミリストイルホステァチジルコリン（DMPC）またはジパルミトイルホステァチジルコリン（DPPC）から形成することができる。アニオン性リポソーム組成物は一般に、ジミリストイルホステァチジルグリセロールから形成されるが、アニオン性のフューゾゲニック（fusogenic）リポソームは主にジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)から形成される。別の種類のリポソーム組成物は、例えばダイズのPCおよび卵のPCのようなホステァチジルコリンから形成される。別の種類は、リン脂質および／またはホステァチジルコリンおよび／またはコレステロールの混合物から形成される。
【００７９】
幾つかの研究で、リポソーム薬剤配合物の皮膚への局所的送達が評価された。インターフェロンを含有するリポソームのモルモットの皮膚への適用では、皮膚のヘルペスのただれが減少するが、他の手段を介するインターフェロンの送達は（例えば溶液または乳液）効果が無かった（Weiner et al., Journal of Drug Targeting,1992,2,405-410）。さらに付加的な実験で、水性系を使用したインターフェロンの投与に対してリポソーム製剤の一部として投与したインターフェロンの効力を試験し、そしてリポソーム製剤が水性投与に対して優れていると結論した（du Plessis et al.,Antiviral Research,1992,18,259-265)。
【００８０】
非イオン性のリポソーム系も調査して、それらの薬剤を皮膚へ送達する使用における利用性、特に非イオン性表面活性剤およびコレステロールを含んで成る系について決定した。Novasome(商標)I(グリセリルジラウレート／コレステロール／ポリオキシエチレン-10-ステアリルエーテル）およびNovasome(商標)II(グリセリルジステアレート／コレステロール／ポリオキシエチレン-10-ステアリルエーテル）を含んで成る非イオン性のリポソーム製剤を使用して、シクロスポリン-Aをマウスの皮膚の表皮に送達した。結果は、そのような非イオン性のリポソーム系がシクロスポリン-Aを皮膚の異なる層に蓄積することを容易にするのに効果的であることを示した（Hu et al.,S.T.P.Pharma.Sci.,1994,4,6,466）。
【００８１】
リポソームにはまた、「立体的に安定化された」リポソームを含み、本明細書で使用するこの用語は１以上の特殊化された脂質を含んで成るリポソームを称し、この脂質はリポソームに包含された時、そのような特殊化された脂質を欠くリポソームに比べて強化された循環寿命をもたらす。立体的に安定化されたリポソームの例は、リポソームの小胞−形成脂質部分の一部が（Ａ）モノシアロガングリオシド ＧM1のような１以上の糖脂質を含んで成るか、あるいは（Ｂ）ポリエチレングリコール（PEG）部分のような１以上の親水性ポリマーで誘導化されているものである。特定の理論に拘束されることを望まないが、当該技術分野ではガングリオシド、スフィンゴミエリンまたはPEG-誘導化脂質を含む少なくとも立体的に安定化されたリポソームについて、これらの立体的に安定化されたリポソームの強化された循環寿命が、網内系（RES）の細胞への取り込みの減少から来るものであると考えられている（Allen et al.,FEBS Letters,1987,223,42;Wu et al.,Cancer Research,1993,53,3765）。
【００８２】
１以上の糖脂質の含んで成る様々なリポソームが当該技術分野では知られている。Papahadjopoulos et al.（Ann.N.Y.Acad.Sci.,1987,507,64）は、モノシアロガングリオシド ＧM1、硫酸ガラクトセレブロシドおよびホステァチジルイノシトールがリポソームの血中半減期を向上させる能力を報告した。これらの知見はGabizon et al.（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,1988,85,6949）により詳細に説明されている。両方ともAllen et al.への米国特許第4,837,028号明細書および国際公開第88/04924号明細書は、（１）スフィンゴミエリンおよび（２）ガングリオシド ＧM1または硫酸ガラクトセレブロシドエステルを含んで成るリポソームを開示する。米国特許第5,543,152号明細書（Webb et al.）は、スフィンゴミエリンを含んで成るリポソームを開示する。1,2-sn-ジミリストイルホスファチジルコリン含んで成るリポソームが国際公開第97/13499号明細書（Lim et al.）で開示された。
【００８３】
１以上の親水性ポリマーで誘導化した脂質を含んで成る多くのリポソーム、およびそれらの調製法は当該技術分野で既知である。Sunamoto et al.(Bull.Chem.Soc.Jpn.,1980,53,2778）は、PEG部分を含む非イオン性界面活性剤である2C1215Gを含んで成るリポソームを記載する。Illum et al.(FEBS Lett.,1984,167,79）は、ポリマー性のグリコールでのポリスチレン粒子の親水性被覆が血中半減期を有意に強化することに注目した。ポリアルキレングリコール（例えばPEG）のカルボン酸基の付加により修飾した合成リン脂質が、Sears（米国特許第4,426,330号および同第4,534,899号明細書）により記載されている。Klibanov et al.（FEBS Lett.,1990,268,235）は、PEGまたはPEGステアレートで誘導化したホスファチジルエタノールアミン（PE）を含んで成るリポソームが血中循環半減期を有意に上昇させることを示す実験を記載した。Blume et al.（Biochimica et Biophysica Acta,1990,1029,91）は、そのような考察を他のPEG-誘導化リン脂質、例えばジステアロイルホスファチジルエタノールアミン(DSPE)およびPEGの組み合わせから形成されたDSPE-PEGにも広げた。リポソームの外部表面上でPEG部分との共有結合を有するリポソームが、Fisherへの欧州特許出願第0 445 131号明細書および国際公開第90/04384号明細書に記載されている。PEGで誘導化さたれた１〜20モルパーセントのPEを含有するリポソーム組成物およびそれらの使用法が、Woodle et al.（米国特許第5,013,556号および同5,356,633号明細書）およびMartin et al.（米国特許第5,213,804号明細書および欧州特許出願第0 496 813 号明細書)に記載されている。多数の他の脂質-ポリマー結合物を含んで成るリポソームが、国際公開第91/05545号明細書および米国特許第5,225,212号明細書（両方ともMartin et al.への）および国際公開第94/20073号明細書（Zalipsky et al.）に開示されている。PEG−修飾化セラミド脂質を含んで成るリポソームは、国際公開第96/10391号明細書（Choi et al.）に記載されている。米国特許第5,540,935号明細書（Miyazaki et al.）および同第5,556,948号明細書（Tagawa et al.）は、それらの表面上の官能基部分でさらに誘導化することができるPEGを含有するリポソームを記載する。
【００８４】
核酸を含んで成る限られた数のリポソームが当該技術分野では知られている。Thierry et al.への国際公開第96/40062号明細書は、リポソームに高分子量の核酸をカプセル化する方法を開示する。Tagawa et al.、米国特許第5,264,221号明細書は、タンパク質を結合したリポソームを開示し、そしてそのようなリポソームの内容物がアンチセンスRNAを含むことができることを明示する。Rahman et al.への米国特許第5,665,710号明細書は、リポソームにオリゴデオキシヌクレオチドをカプセル化する特定方法を記載する。Love et al.への国際公開第97/04787号明細書は、raf遺伝子を標的にするアンチセンスオリゴヌクレオチドを含んで成るリポソームを開示する。
【００８５】
トランスファーソーム（transfersome）も別の種類のリポソームであり、そして薬剤送達媒体として魅力的な候補となる高度に変形可能な脂質凝集物である。トランスファーソームは、大変高度に変形可能であるので液滴よりも小さい孔を容易に通り抜けることが可能な脂質液滴と説明することができる。トランスファーソームはそれらを使用する環境に適応させることができ、例えばそれらは自己至適型（self-otimizing:皮膚の孔の形状に合う）、自己修復型（self-repairing）で、断片化することなく標的に到達することが多く、そしてしばじは自己付加型（self-loading）である。トランスファーソームを作成するために、表面 エッジ-アクチベーター、通常は表面活性剤を標準的なリポソーム組成物に加えることが可能である。トランスファーソームは、血清アルブミンを皮膚に送達するために使用されてきた。トランスファーソームが媒介する血清アルブミンの送達は、血清アルブミンを含有する溶液の皮下注射と同様に効果的であることが示された。
【００８６】
表面活性剤は、乳液（ミクロエマルジョンを含む）およびリポソームのような製剤における応用に広く見いだされる。天然または合成の多くの異なる種類の表面活性剤の特性を分類し、そして等級に分ける最も普通の方法は、親水性／親油性バランス（HLB）を使用することによる。親水性基（「ヘッド（head）」としても知られている）の性質が、製剤で使用する様々な表面活性剤を分類するための最も有用な手段を提供する（Rieger、製薬用の剤形（Pharmaceutical Dosage Forms）で、マルセルデッカー社、ニューヨーク、ニューヨーク州、1988、第285頁）。
【００８７】
表面活性剤分子がイオン化されていない場合、非イオン性表面活性剤と分類される。非イオン性表面活性剤は医薬および化粧用生成物の応用に広く見いだされ、そして広いpH値にわたり利用可能である。一般にそれらのHLB値は、それらの構造に依存して２〜約18の範囲である。非イオン性表面活性剤にはエチレングリコールエステル、プロピレングリコールエステル、グリセリルエステル、ポリグリセリルエステル、ソルビタンエステル、シュクロースエステルおよびエトキシル化エステルのような非イオン性のエステルを含む。脂肪アルコールエトキシレート、プロポキシル化アルコール、およびエトキシル化／プロポキシル化ブロックポリマーのような非イオン性アルカノールアミドおよびエーテルも、この種類に含まれる。ポリオキシエチレン表面活性剤は、非イオン性表面活性剤の種類の中で最も有名な員である。
【００８８】
表面活性剤分子が負電荷を持つならば、それを水に溶解または分散した時、表面活性剤はアニオン性に分類される。アニオン性の表面活性剤には、セッケンのようなカルボキシレート、アシルラクチレート、アミノ酸のアシルアミド、アルキル硫酸エステルおよびエトキシル化アルキル硫酸エステルのような硫酸のエステル、アルキルベンゼンスルホネートのようなスルホネート、アシルイセチオネート、アシルタウレート、およびスルホスクシネートおよびホスフェートを含む。アニオン性表面活性剤の種類の中で最も重要な員は、アルキル硫酸エステルおよびセッケンである。
【００８９】
表面活性剤分子が正電荷を持つならば、それを水に溶解または分散した時、表面活性剤はカチオン性に分類される。カチオン性表面活性剤には、４級アンモニウム塩およびエトキシル化アミンを含む。４級アンモニウム塩はこの種類の中で最も利用されている員である。
【００９０】
表面活性剤分子が負または正電荷のいずれかを持つ能力を有するならば、表面活性剤は両イオン性と分類される。両イオン性表面活性剤には、アクリル酸誘導体、置換アルキルアミド、N-アルキルベタインおよびホスファチドを含む。
【００９１】
薬剤生成物、製剤および乳液における表面活性剤の使用が総説された（Rieger、製薬用の剤形（Pharmaceutical Dosage Forms）で、マルセルデッカー社、ニューヨーク、ニューヨーク州、1988、第285頁）。
浸透強化剤
１つの態様では、本発明は種々の浸透強化剤を使用して核酸、特にオリゴヌクレオチドの動物の皮膚への効率的な送達を行う。ほとんどの薬剤がイオン化または非イオン化状態の両方で溶液中に存在する。しかし通常、脂質溶液または親油性薬剤は容易に細胞膜を通過する。通過する膜が浸透強化剤で処理されていれば、たとえ非親油性の薬剤でも細胞膜を通過することができることが見いだされた。非親油性の薬剤が細胞膜をわたって拡散するのを助けることに加えて、浸透強化剤は親油性の薬剤の浸透性も強化する。
【００９２】
浸透強化剤は５つの大きな範疇、すなわち表面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート剤および非キレート剤の１つに属すると分類することができる（Lee et al.,治療薬キャリアー系の論説（Critical Review in Therapeutic Drug Carrier Systems),1991,第92頁）。浸透強化剤の上記種類の各々を、以下に詳細に記載する。
【００９３】
表面活性剤：本発明に関連して、表面活性剤（surfactant）（または「表面−活性作用物（surface-active-agent)」）は水性溶液に溶解した時、溶液の表面張力または水溶液と別の液体との間の界面張力を下げ、その結果、粘膜を通るオリゴヌクレオチドの吸収を強化する化学的物体である。胆汁酸塩および脂肪酸に加えて、これらの浸透強化剤には、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン-9-ラウリル エーテルおよびポリオキシエチレン-20-セチル エーテル（Lee et al.,治療薬キャリアー系の論説（Critical Review in Therapeutic Drug Carrier Systems),1991,第92頁）：およびFC-43のようなペルフルオロケミカル乳液を含む。Takahashi et al.,J.Pharm.Pharmacol.,1988,40,252）。
【００９４】
脂肪酸：浸透強化剤として作用する種々の脂肪酸およびそれらの誘導体には、例えばオレイン酸、ラウリン酸、カプリン酸（n-デカン酸）、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン（1-モノオレイル-1-rac-グリセロール）、ジラウリン、カプリル酸、アラキドン酸、グリセロール 1-モノカプレート、1-ドデシルアザシクロヘプタン-2-オン、アシルカルニチン、アシルコリン、それらのＣ1-10アルキルエステル（例えば、メチル、イソプロピルおよびt-ブチル）、およびそれらのモノ-およびジ-グリセリド（すなわち、オレート、ラウレート、カプレート、ミリステート、パルミテート、ステアレート、リノレート等）（Lee et al.、治療薬キャリアー系の論説(Critical Review in Therapeutic Drug Carrier Systems),1991,第92頁：Muranishi、治療薬キャリアー系の論説(Critical Review in Therapeutic Drug Carrier Systems),1990,44,7,1-33：E1 Hariri et al.,J.Pharm.Pharmacol.,1992,44,651-654）。
【００９５】
胆汁酸塩：胆汁の生理学的役割には、脂質および脂溶性ビタミンの分散および吸収を助けることを含む（Brunton、Goodman & Gilmanの治療薬の薬理学的基礎（The Pharmacological Basis of Therapeutics）、第９版の第３８章で、Hardman et al.編集、マグロウヒル、ニューヨーク、1996、第934-935）。様々な天然の胆汁酸塩およびそれらの合成誘導体が、浸透強化剤として作用する。この用語「胆汁酸塩」には、任意の自然に存在する胆汁の成分ならびにそれらの合成誘導体を含む。本発明の胆汁酸塩には例えば、コール酸（またはその製薬学的に許容されるナトリウム塩、コール酸ナトリウム）、デヒドロコール酸（デヒドロコール酸ナトリウム）、デオキシコール酸（デオキシコール酸ナトリウム）、グルコール酸（グルコール酸ナトリウム）、 グリコール酸（グリコール酸ナトリウム）、グリコデオキシコール酸（グリコデオキシコール酸ナトリウム）、タウロコール酸（タウロコール酸ナトリウム）、タウロデオキシコール酸（タウロデオキシンコール酸ナトリウム）、ケノデオキシコール酸（ケノデオキシコール酸ナトリウム）、ウルソデオキシコール酸（UDCA）、ナトリウム タウロ-24,25-ジヒドロ-フシデート(STDHF）、ナトリウム グリコジヒドロフシデートおよびポリオキシエチレン-9-ラウリル エーテル(POE)（Lee et al.、治療薬キャリアー系の論説(Critical Review in Therapeutic Drug Carrier Systems),1991,第92頁：Swinyard、レミングトンの製薬科学（Remington's Pharmaceutical Science）、第18版の第３８章で、Gennaro、編集、マック出版社、イーストン、ペンシルベニア州、1990、第782-783：Muranishi、治療薬キャリアー系の論説(Critical Review in Therapeutic Drug Carrier Systems),1990,7,1-33：Yamamoto et al.,J.Pharm.Exp.Ther.,1992,263,25:Yamashita et al.,J.Pharm.Sci.,1990,79,579-583）。
【００９６】
キレート剤：本発明と関連して使用するキレート剤は、金属イオンと錯体を形成することにより溶液から金属イオンを除去する化合物と定めることができ、その結果、粘膜を通るオリゴヌクレオチドの吸収が強化される。本発明における浸透強化剤としてのそれらの使用に関して、最も特徴的なDNAヌクレアーゼには触媒に二価の金属イオンが必要であり、そしてこれはキレート剤により阻害されるので、キレート剤はDNaseインヒビターとしても役立つ付加的利点を有する（Jarrett,J.Chromatogr.,1993,618,315-339）。本発明のキレート剤には限定するわけではないが、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（EDTA）、クエン酸、サリチル酸（例えば、サリチルナトリウム、5-メトキシサリチレートおよびホモバリネート）、コラーゲンのN-アシル誘導体、ラウレス(laureth)-9およびベータジケトンのN-アミノアシル誘導体(エナミン)を含む（Lee et al.、治療薬キャリアー系の論説(Critical Review in Therapeutic Drug Carrier Systems),1991,第92頁：Muranishi、治療薬キャリアー系の論説(Critical Review in Therapeutic Drug Carrier Systems),1990,7,1-33；Buur et al.,J.Control Rel.,1990,14,43-51）。
【００９７】
非−キレート非−表面活性剤：本明細書で使用するように、非−キレート非−表面活性浸透強化化合物は、キレート剤または表面活性剤としては有意な活性を示さないにもかかわらず、消化（alimentary）粘膜通るオリゴヌクレオチドの吸収を強化する化合物と定めることができる（Muranishi、治療薬キャリアー系の論説(Critical Review in Therapeutic Drug Carrier Systems),1990,7,1-33）。この種の浸透強化剤には、例えば不飽和環式ウレア、1-アルキル-および1-アルケニルアザシクロアルカノン誘導体（Lee et al.、治療薬キャリアー系の論説(Critical Review in Therapeutic Drug Carrier Systems),1991,第92頁）：およびナトリウムジクロフェナク、インドメタシンおよびフェニルブタゾンのような非ステロイド系の抗-炎症剤（Yamashita et al.,J.Pharm.Pharmacol.,1987,39,621-626）を含む。
【００９８】
細胞レベルでオリゴヌクレオチドの取り込みを強化する作用物質も、本発明の医薬および他の組成物に加えることができる。例えば、リポフェクチンのようなカチオン性脂質（Junichi et al.、米国特許第5,705,188号明細書）、カチオン性グリセロール誘導体およびポリリシンのようなポリカチオン性分子（Lollo et al.,国際公開第97/30731号明細書）もオリゴヌクレオチドの細胞の取り込みを強化することが知られている。
【００９９】
他の作用物質も投与した核酸の浸透を強化するために利用することができ、それらにはエチレングリコールおよびプロピレングリコールのようなグリコール、2-ピロールのようなピロール、アゾンおよびリモネンおよびメントンのようなテルペンを含む。
キャリアー
本発明の特定の組成物は、製剤中にキャリアー化合物も包含する。本明細書で使用するように「キャリアー化合物」または「キャリアー」とは、核酸またはそれらの同族体を称し、これは不活性（すなわちそれ自体は生物学的活性をもたない）であるが、例えば生物学的に活性な核酸を分解するか、または循環系からそれらの除去を促進することにより生物学的活性を有する核酸の生物学的利用性を下げるインビボのプロセスにより核酸として認識される。核酸およびキャリアー化合物の同時投与は、典型的には後者の物質が過剰であるが、恐らく共通する受容体についてキャリアー化合物と核酸との間の競合により、肝臓、腎臓または他の循環外リザーバーに回収される核酸の量に実質的な低下を生じることができる。例えばホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの肝臓組織からの一部回収は、ポリイノシン酸、硫酸デキストラン、ポリシチジン酸または4-アセトアミド-4'-イソチオシアノ-スチルベン-2,2'-ジスルホン酸を同時投与する時に減少し得る（Miyao et al.,Antisense Res.Dev.,1995,5,115-121;Takakura et al.,Antisense & Nucl.Acid Drug Dev.,1996,6,177-183）。
賦形剤
キャリアー化合物とは対照的に、「製薬用キャリアー」または「賦形剤」は、動物に１以上の核酸を送達するための製薬学的に許容される溶媒、懸濁剤または任意の他の薬理学的に不活性な賦形剤である。賦形剤は液体または固体でよく、そして核酸および所定の医薬組成物中の他の成分を合わせた時、意図する投与の計画した様式で、所望する嵩、コンシステンシー等を提供するように選択される。典型的な医薬キャリアーには限定するわけではないが、結合剤（例えば、前ゼラチン化トウモロコシ澱粉、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース等）；増量剤（例えばラクトースまたは他の糖、微結晶セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレートまたはリン酸水素カルシウム等）；潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド二酸化シリコン、ステアリン酸、金属性ステアレート、水素化植物油、トウモロコシ澱粉、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム等）；崩壊剤（例えば、澱粉、グリコール酸ナトリウム澱粉等）；および湿潤剤（例えばラウリル硫酸ナトリウム）を含む。
【０１００】
核酸と有害に反応しない、非−腸管外投与に適する製薬学的に許容される有機または無機賦形剤も、本発明の組成物を配合するために使用することができる。適当な製薬学的に許容されるキャリアーには、限定するわけではないが水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、珪酸、種々のパラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等を含む。
【０１０１】
核酸の局所投与用の製剤は、滅菌および非滅菌水溶液、非水性溶液を、アルコールのような通例の溶媒、または液体または固体油基剤中の核酸溶液に含んでもよい。溶液はまた、バッファー、希釈剤および他の適当な添加剤を含むこともできる。核酸と有害に反応しない、製薬学的に許容される非−腸管外投与に適する有機または無機賦形剤を使用することができる。
【０１０２】
適当な製薬学的に許容される賦形剤には、限定するわけではないが、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、珪酸、種々のパラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等を含む。
他の成分
本発明の組成物は、医薬組成物中に通常見いだされる他の付加的な成分をそれらの技術的に確立された使用レベルでさらに含むこともできる。このように例えば、組成物は例えば抗そう痒剤、収斂剤、局所麻酔剤また抗炎症剤のような付加的な、適合性のある、製薬学的に活性な材料を含んでもよく、あるいは染料、香料、保存剤、酸化防止剤、不透明化剤、増粘剤および安定化剤のような本発明の組成物の種々の剤形を形成するために物理的に有用なさらなる材料を含んでもよい。しかしそのような材料は加えた時に本発明の組成物の成分の生物活性を不当に妨害すべきではない。製剤は滅菌することができ、そして所望により製剤の核酸（１つまたは複数）と有害に相互反応しない補助剤、例えば潤滑剤、保存剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響する塩、バッファー、着色剤、香料および／または芳香物質等と混合することができる。
【０１０３】
水性懸濁液は、例えばナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールおよび／またはデキストランを含む懸濁液の粘度を上げる物質を含んでよい。また懸濁液は、安定化剤を含んでもよい。
【０１０４】
本発明の特定の態様は、（ａ）１以上のアンチセンス化合物および（ｂ）非アンチセンスメカニズムにより機能する１以上の他の化学療法剤を含有する医薬組成物を提供する。そのような化学療法剤の例は、限定するわけではないがダウノルビシン、ダクチノマイシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、マイシマイシン、ナイトロジェンマスタード、クロラムブシル、メルファラン、シクロホスファミド、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、シタラビン（CA）、5-フルオロウラシル（5-FU）、フロクスウリジン（5-FUdR）、メトトレキセート（MTX）、コルヒチン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド、テニポシド、シスプラチンおよびジエチルスチルベステロール（DES）のような抗ガン剤を含む。一般的には、診断および治療のメルクマニュアル（The Merck Manual of Diagnosis and Therapy）、第15版、Berkow et al.編集、1987、ラーウェイ、ニュージャージー州、第1206-1228頁）を参照にされたい。限定するわけではないが非ステロイド系の抗炎症剤およびコルチコステロイドを含む抗炎症剤、および限定するわけではないがリビビリン（ribivirin）、ビダラビン、アシクロビルおよびガンシクロビルのような抗ウイルス剤も本発明の組成物と合わせることができる。一般的には、診断および治療のメルクマニュアル（The Merck Manual of Diagnosis and Therapy）、第15版、Berkow et al.編集、1987、ラーウェイ、ニュージャージー州、それぞれ第2499-2506および46-49頁）を参照にされたい。他の非−アンチセンス化学療法剤も本発明の範囲内である。２以上の合わせた化合物を一緒に、または連続して使用してもよい。
【０１０５】
別の関連する態様では、本発明の組成物は第１の核酸を標的とする１以上のアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチド、および第２の核酸標的を標的とする１以上のさらなるアンチセンス化合物を含んでよい。アンチセンス化合物の多数の例が当該技術分野では知られている。２以上の合わせた化合物を一緒に、または連続して使用してもよい。
【０１０６】
治療用組成物の配合そして続いてそれらの投与は、当業者の技術範囲内であると考える。投薬用量は処置する疾患状態の重篤度および反応性に依存し、処置期間は数日から数カ月に及ぶか、または治癒が行われるまで、あるいは疾患状態の減少が達成されるまで続けられる。至適な投薬計画は、患者の身体における薬剤蓄積の測定から算出することができる。当業者は至適な投薬用量、投薬法および反復率（repetition rates）を容易に決定することができる。至適な投薬用量は個々のオリゴヌクレオチドの相対的効力に依存し、そして一般にはインビトロおよびインビボ動物モデルで効果的であると見いだされたEC50sに基づき予想される。一般に投薬用量は１Kgの体重あたり0.01μg〜100gであり、そして１日に１回以上、毎週、毎月または毎年、あるいは２〜20年毎に１回与えることができる。当業者は投薬の反復率を、体液または組織中の薬剤の測定した滞留時間および濃度に基づき容易に予測することができる。成功裏の処置後、患者は疾患状態の再発を防止するための維持治療を受けることが望ましく、ここでオリゴヌクレオチドは１Kgの体重あたり0.01μg〜100gの範囲で１日に１回以上から20年毎に１回投与する。
【０１０７】
本発明はその好適な特定の態様に従い具体的に記載したが、以下の実施例は本発明を具体的に説明するためのみに役立ち、本発明を限定することを意図するものではない。
【０１０８】
【実施例】
実施例１
オリゴヌクレオチド合成用のヌクレオシドホスホロアミダイト
デオキシおよび2'-アルコキシアミダイト
2'-デオキシおよび2'-メトキシ ベータ-シアノエチルジイソプロピルホスホロアミダイトは市販の供給源（例えばマサチューセッツ州、ニードハムのケムジーン(Chemgene）、またはバージニア州、スターリングのグレン リサーチ社(Glen Research,Inc.)）から購入した。他の2'-O-アルコキシ置換ヌクレオシドアミダイトは、引用により本明細書に編入する米国特許第5,506,351号明細書に記載されているように調製する。2'-アルコキシアミダイトを使用して合成したオリゴヌクレオチドについて、非修飾オリゴヌクレオチドに関しては標準的サイクルを利用したが、テトラゾールおよび塩基のパルス送達後の待ち工程を360秒に上げた。
【０１０９】
5-メチル-2'-デオキシシチジン(5-Me-C)ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドは、市販されているホスホロアミダイト（バージニア州、スターリングのグレン リサーチ社またはマサチューセッツ州、ニードハムのケムジーン）を使用して公開されている方法［Sanghvi et al.,Nucleic Acids Research,1993,21,3197-3203］に従い合成した。
2'-フルオロアミダイト
2'-フルオロデオキシアデノシンアミダイト
2'-フルオロオリゴヌクレオチドは、すでに記載し［Kawasaki,et al.,J.Med.Chem., 1993,36,831-841］、および引用により本明細書に編入する米国特許第5,670,633号明細書のように合成した。簡単に説明すると、保護したヌクレオシド N6-ベンゾイル-2'-デオキシ-2'-フルオロアデノシンを、出発材料として市販されている9-ベータ-D-アラビノフラノシルアデニンを使用し、そして2'-アルファ-フルオロ原子を2'-ベータ-トリチル基のSN2-置換により導入する技術文献の手法を変更することにより合成した。このようにN6-ベンゾイル-9-ベータ-D-アラビノフラノシルアデノシンは適度な収量で3',5'-ジテトラヒドロピラニル(THP)中間体として選択的に保護された。THPおよびN6-ベンゾイル基の脱保護は標準的な技法を使用して行い、そして標準的方法を使用して5'-ジメトキシトリチル-(DMT)および5'-DMT-3'-ホスホロアミダイト中間体を得た。
【０１１０】
2'-フルオロデオキシグアノシン
2'-デオキシ-2'-フルオログアノシンの合成は、テトライソプロピルジシロキサニル（TPDS）保護した9-ベータ-D-アラビノフラノシルグアニンを出発材料として使用して行い、そして中間体であるジイソブチリルアラビノフラノシルグアノシンに転換した。TPDS基の脱保護に続いてTHPでヒドロキシル基をTHPで保護してジイソブチリルジ-THP保護したアラビノフラノシルグアニンを得た。選択的なO-脱アシル化およびトリフラーションに続いて、粗生成物を弗化物で処理し、次いでTHP基を脱保護した。標準的技法を使用して、5'-DMT-および5'-DMT-3'-ホスホロアミダイトを得た。
【０１１１】
2'-フルオロウリジン
2'-デオキシ-2'-フルオロウリジンの合成は、2,2'-アンヒドロ-1-ベータ-D-アラビノフラノシルウラシルを70％弗化水素−ピリジンを用いて処理する技術文献の技法を変更して行った。標準的手法を使用して、5'-DMT-および5'-DMT-3'-ホスホロアミダイトを得た。
【０１１２】
2'-フルオロデオキシシチジン
2'-デオキシ-2'-フルオロシチジンは、2'-デオキシ-2'-フルオロウリジンのアミノ化を介して合成し、続いて選択的保護によりN4-ベンゾイル-2'-デオキシ-2'-フルオロシチジンを得た。標準的手法を使用して、5'-DMT-および5'-DMT-3'-ホスホロアミダイトを得た。
【０１１３】
2'-O-(2-メトキシエトキシ)修飾アミダイト
2'-O-メトキシエチル-置換したヌクレオシドアミダイトは以下のように、あるいはMartin,P.,Helvetica Chimica Acta,1995,78,486-504の方法により調製する。
【０１１４】
2,2'-アンヒドロ[1-(ベータ-D-アラビノフラノシル)-5-メチルウリジン]
5-メチルウリジン(リボシルチミン、日本、銚子のヤマサ（Yamasa)を通して市販されている）（72.0g、0.279M）、ジフェニルカルボネート(90.0g、0.420M)および重炭酸ナトリウム(2.0g、0.024M)をDMF(300mL)に加えた。混合物を撹拌しながら加熱還流し、制御した様式で発生する二酸化炭素ガスを放出させた。１時間後、わずかに暗くなった溶液を減圧下で濃縮した。生成したシロップをジエチルエーテル（2.5L）に撹拌しながら注いだ。生成物はガムを生じた。エーテルをデカントし、そして残渣を最少量のメタノール（約400mL）に溶解した。溶液を新しいエーテル（2.5L）注いで堅いガムを得た。エーテルをデカントし、そしてガムを真空オーブン中で乾燥させて（60℃、１mmHgで24時間）固体を得、これを明るい黄褐色の粉末に砕いた（57g、85％収率）。NMRスペクトルは構造と一致し、ナトリウム塩としてフェノールが混入していた（約５％）。この材料をそのままさらなる反応に使用した（またはこれは酢酸エチル中のメタノール勾配（10〜25％）を使用したカラムクロマトグラフィーによりさらに精製して、白色固体（融点222〜4℃）を得ることができる）。
【０１１５】
2'-O-メトキシエチル-5-メチルウリジン
2,2'-アンヒドロ-5-メチルウリジン（195g、0.81M）、トリス(2-メトキシエチル)ボラート(231g、0.98M）および2-メトキシエタノール（1.2L）を、２リットルのステンレス鋼製の圧力容器に加え、そして予め160℃に暖めた油浴においた。155〜160℃で48時間加熱した後、容器を開け、そして溶液を蒸発乾固し、そしてMeOH（200mL）でトリチュレートした。残渣を熱いアセトン（１L）に懸濁した。不溶性塩を濾過し、アセトン（150mL）で洗浄し、そして濾液を蒸発させた。残渣（280g）をCH3CN（600mL）に溶解し、そして蒸発させた。シリカゲルカラム（３kg）は、0.5％Et3NHを含有するCH2Cl2/アセトン/MeOH(20:5:3)で充填した。残渣をCH2Cl2（250mL）に溶解し、そしてシリカ（150g）に吸着させた後、カラムにのせた。生成物は充填溶媒で溶出して、160g（63％）の生成物を得た。さらなる材料は不純画分を再操作することにより得た。
【０１１６】
2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルウリジン
2'-O-メトキシエチル-5-メチルウリジン（160g、0.506M）をピリジン(250mL）と一緒に蒸発させ、そして乾燥した残渣をピリジン（1.3L）に溶解した。ジメトキシトリチルクロライドの最初のアリコート（94.3g、0.278M）を加え、そして混合物を室温で１時間撹拌した。ジメトキシトリチルクロライドの２番目のアリコート（94.3g、0.278M）を加え、そして反応はさらに１時間撹拌した。次いでメタノール（170mL）を加えて反応を止めた。HPLCは約70％の生成物の存在を示した。溶媒を蒸発させ、そしてCH3CN（200mL）でトリチュレートした。残渣をCHCl3(1.5L）に溶解し、そして２×500mLの飽和NaHCO3、そして２×500mLの飽和NaClで抽出した。有機相をNa2SO4で乾燥させ、濾過し、そして蒸発させた。275gの残渣を得た。残渣は、0.5％Et3NHを含有するEtOAc/ヘキサン/アセトン（5:5:1）で充填し、そして溶出した3.5kgのシリカゲルカラムで精製した。純粋な画分を蒸発させて164gの生成物を得た。約20gのさらなる生成物を不純な画分から得て、183g（57％）の総収量を得た。
【０１１７】
3'-O-アセチル-2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルウリジン
2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルウリジン（106g、0.167M）、DMF/ピリジン(750mL、562mLのDMFおよび188mLのピリジンから調製した3:1の混合物）および無水酢酸（24.38mL、0.258M）を合わせ、そして室温で24時間撹拌した。反応は、TLCサンプルをMeOHの添加で最初に止めることによりTLCにより監視した。TLCにより判断して反応が終了した時、MeOH（50mL）を加え、そして混合物を35℃で蒸発させた。残渣をCHCl3（800mL）に溶解し、そして２×200mLの飽和重炭酸ナトリウム、そして２×200mLの飽和NaClで抽出した。水層を200mLのCHCl3で逆抽出した。合わせた有機物を硫酸ナトリウムで乾燥させ、そして蒸発させて122gの残渣（約90％の生成物）を得た。残渣は3.5kgのシリカゲルカラムで精製し、そしてEtOAc/ヘキサン（4:1）を使用して溶出した。純粋な生成物画分を蒸発させて96g（84％）を得た。さらに1.5gを後の画分から回収した。
【０１１８】
3'-O-アセチル-2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチル-4-トリアゾールウリジン
最初の溶液は、CH3CN中(700mL)の3'-O-アセチル-2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルウリジン(96g、0.144M)に溶解することにより調製し、そして置いておいた。トリエチルアミン（189mL、1.44M）をCH3CN中(１L)のトリアゾール（90g，1.3M）溶液に加え、−５℃に冷却し、そして頭頂撹拌機を使用して0.5時間撹拌した。POCl3を30分間にわたり０〜10℃に維持した撹拌した溶液に滴下し、そして生成した混合物をさらに２時間撹拌した。最初の溶液を45分間にわたり後者の溶液に滴下した。生成した反応混合物を冷蔵室に一晩保存した。塩を反応混合物から濾過し、そして溶液を蒸発させた。残渣をEtOAc（１L）に溶解し、そして不溶性固体を濾過により除去した。濾液を１×300mLのNaHCO3、そして２×300mLの飽和NaClで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、そして蒸発させた。残渣をEtOAcでトリチュレートして表題化合物を得た。
【０１１９】
2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルシチジン
ジオキサン（500mL）およびNH4OH（30mL）中の3'-O-アセチル-2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチル-4-トリアゾールウリジン（103g、0.141M）の溶液を室温で２時間撹拌した。ジオキサン溶液を蒸発させ、そして残渣をMeOH（２×200mL）と共沸騰混合した。残渣をMeOH（300mL）に溶解し、そして２リットルのステンレス鋼製の圧力容器に移した。NH3ガスを飽和したMeOH（400mL）を加え、そして容器を100℃で２時間加熱した（TLCは完全な転換を示した）。容器の内容物を蒸発乾固させ、そして残渣をEtOAc（500mL）に溶解し、そして飽和NaCl（200mL）で１回洗浄した。有機物を硫酸ナトリウムで乾燥させ、そして溶媒を蒸発させて、85g（95％）の表題化合物を得た。
【０１２０】
N4-ベンゾイル-2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルシチジン
2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルシチジン（85g、0.134M）をDMF（800mL）に溶解し、そして無水安息香酸（37.2ｇ、0.165M）を撹拌しながら加えた。３時間撹拌した後、TLCは反応がおよそ95％完了したことを示した。溶媒を蒸発させ、残渣をMeOH（200mL）と共沸騰混合した。残渣をCHCl3（700mL）に溶解し、そして飽和NaHCl3（２×300mL）、そして飽和NaCl（２×300mL）で抽出し、有機物をMgSO4で乾燥させ、そして蒸発させて残渣（96g）を得た。残渣は0.5％のEt3NHを含有するEtOAc/ヘキサン(1:1)を溶出溶媒として使用して、1.5kgのシリカカラムでクロマトグラフィーを行った。純粋な生成物画分を蒸発させて90g（90％）の表題化合物を得た。
【０１２１】
N4-ベンゾイル-2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルシチジン-3'-アミダイト
N4-ベンゾイル-2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルシチジン（74g、0.10M）をCH2Cl2（１L）に溶解した。テトラゾール ジイソプロピルアミン（7.1g）および2-シアノエトキシ-テトラ(イソプロピル)ホスフィット(40.5mL、0.123M）を窒素雰囲気下で撹拌しながら加えた。生成した混合物を室温で20時間撹拌した（TLCは反応がおよそ95％完了したことを示した）。反応混合物を飽和NaHCO3（１×300mL）、そして飽和NaCl（３×300mL）で抽出した。水性洗浄物をCH2Cl2（300mL）で逆抽出し、そして抽出物を合わせ、MgSO4で乾燥させ、そして濃縮した。得られた残渣はEtOAc/ヘキサン(3:1)を溶出溶媒として使用して、1.5kgのシリカカラムでクロマトグラフィーを行った。純粋な画分を合わせて90.6g（87％）の表題化合物を得た。
【０１２２】
2'-O-(アミノオキシエチル)ヌクレオシドアミダイトおよび2'-O-(ジメチルアミノオキシエチル)ヌクレオシドアミダイト
2'-(ジメチルアミノオキシエトキシ)ヌクレオシドアミダイト
2'-(ジメチルアミノオキシエトキシ)ヌクレオシドアミダイト［当該技術分野では2'-O-(ジメチルアミノオキシエチル)ヌクレオシドアミダイトとしても知られている］は、以下の章に記載するように調製する。アデノシン、シチジンおよびグアノシンヌクレオシド アミダイトは、チミジン(5-メチルウリジン)に類似して調製するが、エキソ環式アミンはアデノシンおよびシチジンの場合はベンゾイル部分で保護し、そしてグアノシンの場合はイソブチリルで保護する。
【０１２３】
5'-O-tert-ブチルジフェニルシリル-O2-2'-アンヒドロ-5-メチルウリジン
O2-2'-アンヒドロ-5-メチルウリジン（プロ.バイオ.セイント.(Pro.Bio.Sint)、ヴァレセ、イタリア、100.0g、0.416ミリモル）、ジメチルアミノピリジン（0.66g、0.013eq、0.0054ミリモル）は、アルゴン雰囲気下にて周囲温度で乾燥ピリジン（500ml）に機械的撹拌を用いて溶解した。tert-ブチルジフェニルクロロシラン（125.8g、119.0mL、1.1eq、0.458ミリモル）を１回で加えた。反応は周囲温度で16時間撹拌した。TLC（Rf 0.22、酢酸エチル）は、完全な反応を示した。溶液を減圧下で濃い油に濃縮した。これをジクロロメタン（１L）と飽和重炭酸ナトリウム（２×１L）およびブライン（１L）の間に分配した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、そして減圧下で濃い油に濃縮した。油を酢酸エチルおよびエチルエーテルの混合物（600mL、1:1）に溶解し、そして溶液を-10℃に冷却した。生成した結晶生成物を濾過により集め、エチルエーテルで洗浄し（３×200mL）、そして乾燥（40℃、１mm Hg、24時間）して、149g（74.8％）の白色固体を得た。TLCおよびNMRは、純粋な生成物と一致した。
【０１２４】
5'-O-tert-ブチルジフェニルシリル-2'-O-(2-ヒドロキシエチル)-5-メチルウリジン
２リットルのステンレス鋼製の非撹拌圧力反応槽中に、テトラヒドロフラン中のボランを加えた（1.0M、2.0eq、622mL）。燻蒸気のフード中、そして手により撹拌しながら、エチレングリコール（350mL、過剰）を最初に、水素ガスの発生が静まるまで慎重に加えた。5'-O-tert-ブチルジフェニルシリル-O2-2'-アンヒドロ-5-メチルウリジン（149g、0.311モル）および重炭酸ナトリウム（0.074g、0.003eq）を手により撹拌しながら加えた。反応槽を密閉し、そして油浴中で160℃の内部温度に達するまで加熱し、そして次いで16時間維持した（圧力＜100psig）。反応容器を周囲温度に冷却し、そして開けた。TLC（所望の生成物についてはRf 0.67、そしてara-T副産物についてはRf 0.82、 酢酸エチル）は、生成物への約70％の転換を示した。さらなる副産物が形成されることを避けるために、反応を止め、減圧下（10〜１mm Hg）で暖めた水浴（40〜100℃）中にて濃縮し、エチレングリコールを除去するためにはより過激な条件を用いた。［あるいは、いったん低沸点溶媒が無くなったら、残る溶液は酢酸エチルと水の間に分配することができる。生成物は有機相にある。］残渣をカラムクロマトグラフィーにより精製した（２kg シリカゲル、酢酸エチル-ヘキサン勾配 1:1〜4:1）。適切な画分を合わせ、ストリッピングし、そして出発材料（17.4g）が混入する白色の砕け易い泡沫（84g、50％）および純粋な再利用可能な出発材料（20g）としての生成物に乾燥させた。回収された出発材料は純度が低く、出発材料に基づく収率は58％であった。TLCおよびNMRは99％純粋な生成物と一致した。
【０１２５】
2'-O-([2-フタルイミドオキシ)エチル]-5'-t-ブチルジフェニルシリル-5-メチルウリジン
5'-O-tert-ブチルジフェニルシリル-2'-O-(2-ヒドロキシエチル)-5-メチルウリジン（20g、36.98ミリモル）を、トリフェニルホスフィン（11.63g、44.36ミリモル）およびN-ヒドロキシフタルイミド（7.24g、44.36ミリモル）と混合した。これを次いでP2O5で高真空下にて40℃で２日間、乾燥させた。反応混合物にアルゴンを流し、そしてTHF（369.8mL、アルドリッチ(Aldrich)、確実に密閉したボトル）を加えて透明溶液を得た。ジエチル-アゾジカルボキシレート（6.98mL、44.36ミリモル）を反応混合物に滴下した。添加速度は、生成する深い赤色の変色ちょうど消えた後に次の液滴を加えるように維持する。完全に加えた後、反応は４時間撹拌する。その時までにTLC（酢酸エチル／ヘキサン 60:40）は反応が完了したことを示した。溶媒を真空で蒸発させた。得られた残渣をフラッシュカラムに置き、そして酢酸エチル：ヘキサン（60:40）で溶出して、2'-O-([2-フタルイミドオキシ)エチル]-5'-t-ブチルジフェニルシリル-5-メチルウリジンを白色泡沫として得た（21.819g、86％）。
【０１２６】
5'-O-tert-ブチルジフェニルシリル-2'-O-[(2-ホルムアドキシミノオキシ)エチル]-5-メチルウリジン
2'-O-([2-フタルイミドオキシ)エチル]-5'-t-ブチルジフェニルシリル-5-メチルウリジン(3.1g、4.5ミリモル）を乾燥CH2Cl2（4.5mL）に溶解し、そしてメチルヒドラジン（300mL、4.64ミリモル）を−10℃から０℃で滴下した。１時間後、混合物を濾過し、濾液を氷冷CH2Cl2で洗浄し、そして合わせた有機相を水、ブラインで洗浄し、そして無水Na2SO4で乾燥させた。溶液を濃縮して2'-O-(アミノオキシエチル)チミジンを得、これをMeOH（67.5mL）に溶解した。これにホルムアルデヒド（20％水溶液、重量/重量、1.1eq）を加え、そして生成した混合物を１時間撹拌した。溶媒を真空下で除去した；残渣をクロマトグラフィーにかけて5'-O-tert-ブチルジフェニルシリル-2'-O-[(2-ホルムアドキシミノオキシ)エチル]-5-メチルウリジンを白色泡沫として得た（1.95g、78％）。
【０１２７】
5'-O-tert-ブチルジフェニルシリル-2'-O-[N,N-ジメチルアミノオキシエチル]-5-メチルウリジン
5'-O-tert-ブチルジフェニルシリル-2'-O-[(2-ホルムアドキシミノオキシ)エチル]-5-メチルウリジン（1.77g、3.12ミリモル）を、１M のピリジニウム p-トルエンスルホネート（PPTS）溶液（30.6mLの乾燥MeOH中）に溶解した。シアノ硼水素化ナトリウム（0.39g、6.13ミリモル）をこの溶液に10℃で不活性雰囲気下にて加えた。反応混合物を10℃で10分間撹拌した。反応容器を氷浴から取り出し、そして室温で２時間撹拌した後、反応をTLC（CH2Cl2中の５％MeOH）により監視した。水性NaHCO3溶液（５％、10mL）を加え、そして酢酸エチル（２×20mL）で抽出した。酢酸エチル相を無水Na2SO4で乾燥させ、蒸発乾固した。残渣はMeOH（30.6mL）中の１M PPTS溶液に溶解した。ホルムアルデヒド（20重量／重量％、30mL、3.37ミリモル）を加え、そして反応混合物を室温で10分間撹拌した。反応混合物は氷浴中で10℃に冷却し、シアノ硼水素化ナトリウム（0.39g、6.13ミリモル）を加え、そして反応混合物を10℃で10分間撹拌した。10分後、反応混合物を氷浴から取り出し、そして室温で２時間撹拌した。反応混合物に５％NaHCO3（25mL）溶液を加え、そして酢酸エチル（２×25mL）で抽出した。酢酸エチル相を無水Na2SO4で乾燥させ、そして蒸発乾固した。得られた残渣はフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製し、そしてCH2Cl2中の５％ MeOHで溶出して、5'-O-tert-ブチルジフェニルシリル-2'-O-[N,N-ジメチルアミノオキシエチル]-5-メチルウリジンを白色泡沫として得た（14.6g、80％）。
【０１２８】
2'-O-(ジメチルアミノオキシエチル)-5-メチルウリジン
トリエチルアミン トリヒドロフルオライド（3.91mL、24.0ミリモル）を乾燥THFおよびトリエチルアミン（1.67mL、12ミリモル、乾燥、KOH上に維持）に溶解した。次いでこのトリエチルアミン-2HFの混合物を5'-O-tert-ブチルジフェニルシリル-2'-O-[N,N-ジメチルアミノオキシエチル]-5-メチルウリジン（1.40g、2.4ミリモル）に加え、そして室温で24時間撹拌した。反応はTLC（CH2Cl2中の５％MeOH）により監視した。溶媒を真空下で除去し、そして残渣をフラッシュカラムに置き、そしてCH2Cl2中の10％MeOHで溶出して、2'-O-(ジメチルアミノオキシエチル)-5-メチルウリジン（766mg、92.5％）を得た。
【０１２９】
5'-O-DMT-2'-O-(ジメチルアミノオキシエチル)-5-メチルウリジン
2'-O-(ジメチルアミノオキシエチル)-5-メチルウリジン（750mg、2.17ミリモル）をP2O5で高真空下にて40℃で一晩、乾燥させた。これを無水ピリジン（20mL）と一緒に蒸発させた。得られた残渣をピリジン（11mL）にアルゴン雰囲気下で溶解した。4-ジメチルアミノピリジン（26.5mg、2.60ミリモル）、4,4'-ジメトキシトリチルクロライド（880mg、2.60ミリモル）を混合物に加え、そして反応混合物を室温ですべての出発材料が消えるまで撹拌した。ピリジンを真空下で除去し、そして残渣をクロマトグラフィーにかけ、そしてCH2Cl2中の10％MeOH（数滴のピリジンを含む）で溶出して、5'-O-DMT-2'-O-(ジメチルアミノ-オキシエチル)-5-メチルウリジン（1.13g、80％）を得た。
【０１３０】
5'-O-DMT-2'-O-(2-N,N-ジメチルアミノオキシエチル)-5-メチルウリジン-3'-[(2-シアノエチル)-N,N-ジイソプロピルホスホロアミダイト］
5'-O-DMT-2'-O-(ジメチルアミノオキシエチル)-5-メチルウリジン（1.08g、1.67ミリモル）をトルエン（20mL）と一緒に蒸発させた。残渣にN,N-ジイソプロピルアミンテトラゾニド（0.29g、1.67ミリモル）を加え、そしてP2O5上で一晩、高真空下で40℃にて乾燥させた。次いで反応混合物を無水アセトニトリル（8.4mL）に溶解し，そして2-シアノエチル-N,N,N1,N1-テトライソプロピルホスホロアミダイト（2.12mL、6.08ミリモル）を加えた。反応混合物を室温で４時間、不活性雰囲気下で撹拌した。反応を進行はTLC（ヘキサン:酢酸エチル 1:1）により監視した。溶媒を蒸発させ、次いで残渣を酢酸エチル（70mL)に溶解し、そして５％水性Na2SO4（40mL）で洗浄した。酢酸エチル層を無水Na2SO4で乾燥させ、そして濃縮した。得られた残渣をクロマトグラフィーにかけて（溶出液として酢酸エチル）、5'-O-DMT-2'-O-(2-N,N-ジメチルアミノオキシエチル)-5-メチルウリジン-3'-[(2-シアノミチル)-N,N-ジイソプロピルホスホロアミダイト］を泡沫（1.04g、74.9％）として得た。
【０１３１】
2'-(アミノオキシエトキシ)ヌクレオシドアミダイト
2'-(アミノオキシエトキシ)ヌクレオシドアミダイト［当該技術分野では2'-O-(アミノオキシエチル)ヌクレオシドアミダイトとしても知られている］は、以下の章に記載するように調製する。アデノシン、シチジンおよびチミジンヌクレオシドアミダイドは同様に調製する。
【０１３２】
N2-イソブチリル-6-O-ジフェニルカルバモイル-2'-O-(2-エチルアセチル)-5'-O-(4,4'-ジメトキシトリチル)グアノシン-3'-[(2-シアノエチル)-N,N-ジイソプロピルホスホロアミダイト]
2'-O-アミノオキシエチルグアノシン同族体は、ジアミノプリンリボシドの選択的な2'-O-アルキル化により得ることができる。数ミリグラム量のジアミノプリンリボシドは、シェーリング社（Schering AG）（ベルリン）から購入して、わずかな量の3'-O-異性体を含む2'-O-(2-エチルアセチル)ジアミノプリンリボシド同族体を提供することができる。2'-O-(2-エチルアセチル)ジアミノプリンリボシドを分割し、そしてアデノシンデアミナーゼを用いた処理により2'-O-(2-エチルアセチル)グアノシンに転換することができる。（McGee,D.P.C.,Cook,P.D.,Guinosso,C.J.、国際公開第94/02501号明細書、940203。）標準的な保護手法では、2'-O-(2-エチルアセチル)-5'-O-(4,4'-ジメトキシトリチル)グアノシン、および還元して2-N-イソブチリル-6-O-ジフェニルカルバモイル-2'-O-(2-エチルアセチル)-5'-O-(4,4'-ジメトキシトリチル)グアノシンを提供することができる2-N-イソブチリル-6-O-ジフェニルカルバモイル-2'-(2-エチルアセチル)-5'-O-(4,4'-ジメトキシトリチル)グアノシンを提供するはずである。前に記載したように、ヒドロキシル基をミツノブ反応によりN-ヒドロキシフタルイミドに置き換え、そして保護したヌクレオシドは通常のように亜燐酸化して、2-N-イソブチリル-6-O-ジフェニルカルバモイル-2'-O-(2-エチルアセチル)-5'-O-(4,4'-ジメトキシトリチル)グアノシン-3'-[(2-シアノエチル)-N,N-ジイソプロピルホスホロアミダイト]を得ることができる。
【０１３３】
2'-ジメチルアミノエトキシエトキシ(2'-DMAEOE)ヌクレオシドアミダイト
2'-ジメチルアミノエトキシエトキシヌクレオシドアミダイト（当該技術分野では2'-O-ジメチルアミノエトキシエチル、すなわち2'-O-CH2-O-CH2-N(CH2)2、または2'-DMAEOEヌクレオシドアミダイトとしても知られている）は、以下のように調製する。他のヌクレオシドアミダイトは同様に調製する。
【０１３４】
2'-O-[2(2-N,N-ジメチルアミノエトキシ)エチル]-5-メチルウリジン
2[2-(ジメチルアミノ)エトキシ]エタノール（アルドリッチ、6.66g、50ミリモル）は、100mLのボンベ中のテトラヒドロフラン(１M、10mL、10ミリモル）中のボラン溶液に撹拌しながらゆっくりと加える。固体が溶解すると水素ガスが発生する。O2-,2'-アンヒドロ-5-メチルウリジン（1.2g、５ミリモル)、および重炭酸ナトリウム（2.5mg）を加え、そしてボンベを密閉し、油浴に置き、そして155℃で26時間加熱する。ボンベを室温に冷却し、そして開ける。粗溶液を濃縮し、そして残渣を水（200mL）とヘキサン（200mL）の間に分配する。過剰なフェノールがヘキサン層に抽出される。水性層を酢酸エチル（３×200mL）で抽出し、そして合わせた有機層を水で１回洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、そして濃縮する。残渣は、溶出液としてメタノール／塩化メチレン(1:20）（これは２％トリエチルアミンを含有する）を使用したシリカゲルのカラムにかける。カラム画分を濃縮すると無色の固体が形成し、これを集めて表題化合物を白色固体として得る。
【０１３５】
5'-O-ジメトキシトリチル-2'-O-[2-(2-N,N-ジメチルアミノエトキシ)エチル)]-5-メチルウリジン
0.5g（1.3ミリモル）の2'-O-[2-(2-N,N-ジメチルアミノエトキシ)エチル)]-5-メチルウリジン（８mLの無水ピリジン中）に、トリエチルアミン（0.36mL）およびジメトキシトリチルクロライド（DMT-Cl、0.87g、２eq）を加え、そして１時間撹拌した。反応混合物を水（200mL）に注ぎ、そしてCH2Cl2（２×200mL）で抽出する。合わせたCH2Cl2層を飽和NaHCO3溶液、続いて飽和NaCl溶液で洗浄し、そして無水硫酸ナトリウム上で乾燥させる。溶媒の蒸発、続いてMeOH:CH2Cl2:Et3N（20:1、容量／容量、１％のトリエチルアミンを含む）を使用したシリカゲルクロマトグラフィーにより表題化合物を得る。
【０１３６】
5'-O-ジメトキシトリチル-2'-O-[2-(2-N,N-ジメチルアミノエトキシ)エチル)]-5-メチルウリジン-3'-O-(シアノエチル-N,N-ジイソプロピル)ホスホロアミダイト
ジイソプロピルアミノテトラゾリド（0.6g）および2-シアノエトキシ-N,N-ジイソプロピルホスホロアミダイト（1.1mL、２eq）は、5'-O-ジメトキシトリチル-2'-O-[2-(2-N,N-ジメチルアミノエトキシ)エチル)]-5-メチルウリジン（2.17g、３ミリモル）の溶液（20mLのCH2Cl2に溶解）に、アルゴン雰囲気下で加える。反応混合物を一晩撹拌し、そして溶媒を蒸発させる。生成した残渣は溶出液として酢酸エチルを用いてシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製して表題化合物を得る。
実施例２
オリゴヌクレオチド合成
非置換および置換ホスホジエステル（P=O）オリゴヌクレオチドは、自動化DNA合成器（アプライド バイオシステムズ(Applied Biosystems）、モデル380B）で、ヨウ素を用いた酸化による標準的なホスホロアミダイト化学を使用して合成する。
【０１３７】
ホスホロチオエート（P=S）はホスホジエステルオリゴヌクレオチド用として合成するが、標準的な酸化ボトルはホスフィット結合の段階的チア化ために、アセトニトリル中の3H-1,2-ベンゾジチオール-3-オン 1,1-ジオキシドの0.2M溶液に置き換えた。チア化の待ち工程は68秒に増加し、そしてキャッピング工程が続いた。CPGカラムからの開裂および濃水酸化アンモニウム中、55℃での脱ブロッキング後、オリゴヌクレオチドは2.5容量のエタノールを用いて0.5M NaCl溶液から２回、沈殿することにより精製した。
【０１３８】
ホスフィネートオリゴヌクレオチドは、引用により本明細書に編入する米国特許第5,508,270号明細書に記載されているように調製する。
【０１３９】
アルキルスルホネートオリゴヌクレオチドは、引用により本明細書に編入する米国特許第4,469,863号明細書に記載されているように調製する。
【０１４０】
3'-デオキシ-3'-メチレン ホスホネートオリゴヌクレオチドは、引用により本明細書に編入する米国特許第5,610,289号または同第5,625,050明細書に記載されているように調製する。
【０１４１】
ホスホロアミダイトオリゴヌクレオチドは、引用により本明細書に編入する米国特許第5,256,775号または同第5,366,878明細書に記載されているように調製する。
【０１４２】
アルキルホスホノチオエートオリゴヌクレオチドは、引用により本明細書に編入するPCT出願第PCT/US94/00902号および同第PCT/US93/06976号明細書（それぞれ国際公開第94/17093号および同第94/02499号明細書として公開）に記載されているように調製する。
【０１４３】
3'-デオキシ-3'-アミノホスホロアミダイトオリゴヌクレオチドは、引用により本明細書に編入する米国特許第5,476,925号明細書に記載されているように調製する。
【０１４４】
ホスホトリエステルオリゴヌクレオチドは、引用により本明細書に編入する米国特許第5,023,243号明細書に記載されているように調製する。
【０１４５】
ボラノ ホスフェートオリゴヌクレオチドは、引用により本明細書に編入する米国特許第5,130,302号および同第5,177,198号明細書に記載されているように調製する。
実施例３
オリゴヌクレオシド合成
メチレンメチルイミノ結合オリゴヌクレオチド（MMI結合-オリゴヌクレオシドとしても確認される）、メチレンジメチルヒドラゾ結合オリゴヌクレオチド（MDH結合オリゴヌクレオシドとしても確認される）、およびメチレンカルボニルアミノ結合オリゴヌクレオシド（アミド-3結合オリゴヌクレオシドとしても確認される）、およびメチレンアミノカルボニル結合オリゴヌクレオシド（アミド-4結合オリゴヌクレオシドとしても確認される）、ならびに例えば交互のMMIおよびP=OまたはP=S結合を有する混合骨格化合物は、すべて引用により本明細書に編入する米国特許第5,378,825号および同第5,386,023号、同第5,489,677号、同第5,602,240号および同第5,610,289号明細書に記載されているように調製する。
【０１４６】
ホルムアセタールおよびチオホルムアセタール結合オリゴヌクレオシドは、引用により本明細書に編入する米国特許第5,264,562号および同第5,264,564号明細書に記載されているように調製する。
【０１４７】
エチレンオキシド結合オリゴヌクレオシドは、引用により本明細書に編入する米国特許第5,223,618号明細書に記載されているように調製する。
実施例４
PNA合成
ペプチド核酸（PNA）は、ペプチド核酸：合成、特性および応用の可能性（Peptide Nucleic Acid(PNA):Synthesis,Properties and Potential Applications)、Bioorganic & Medical Chemistry,1996,4,5-23に示される種々の手法に従い調製される。それらはまた引用により本明細書に編入する米国特許第5,539,082号、同第5,700,922号および同第5,719,262号明細書に記載されているようにも調製できる。
実施例５
キメラオリゴヌクレオチドの合成
本発明のキメラオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシドまたは混合したオリゴヌクレオチド／オリゴヌクレオシドは、数種の異なる型であることができる。これらには第１型（ここで結合したヌクレオシドの「ギャップ」セグメントは結合したヌクレオシドの5'および3'「ウイング」セグメント間に配置されている）、および第２の「オープンエンド」型（ここで「ギャップ」セグメントはオリゴマー化合物の3'まよは5'末端のいずれかに位置する）を含む。第１型のオリゴヌクレオチドは、当該技術分野では「ギャップマー（gapmer）」またはギャップのあるオリゴヌクレオチドとして知られている。第２型のオリゴヌクレオチドは、当該技術分野では「ヘミマー（hemimer)」または「ウイングマー（wingmer)」として知られている。
【０１４８】
[2'-O-Me]--[2'-デオキシ]--[2'-O-Me]キメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチド
2'-0-アルキルホスホロチオエートおよび2'-デオキシホスホロチオエートオリゴヌクレオチド セグメントを有するキメラオリゴヌクレオチドは、上記のアプライド バイオシステムズの自動化DNA合成器モデル380Bを使用して合成する。オリゴヌクレオチドは、DNA部分については自動化合成器および2'-デオキシ-5'-ジメトキシトリチル-3'-ホスホロアミダイトを、そして5'および3'ウイングについては5'-ジメトキシトリチル-2'-O-メチル-3'-O-ホスホラアミダイトを使用して合成する。標準的合成サイクルは、テトラゾールおよび塩基の送達後の待ち時間を600秒に増し、RNAについては４回そして2'-O-メチルについては２回繰り返すことにより変更する。完全に保護したオリゴヌクレオチドを支持体から開裂し、そしてリン酸基を3:1のアンモニア／エタノール中で室温にて一晩、脱保護し、次いで凍結乾燥する。次に室温にてメタノール性アンモニア中で24時間処理して、すべての塩基の脱保護を行い、そしてサンプルを再度凍結乾燥する。ペレットを１M TBAF中（THF中）で24時間、室温で懸濁して2'位置を脱保護する。次いで反応は１M TEAAで止め、そしてサンプルは次いでrotovacにより1/2容量に減らした後、G25サイズ排除カラムにより脱塩する。回収したオリゴは次いで収率について分光光学的に、そして純度に関してはキャピラリー電気泳動およびマススペクロメトリーにより分析する。
【０１４９】
[2'-O-(2-メトキシエチル)]--[2'-デオキシ]--[2'-O-(メトキシエチル)]キメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチド
[2'-O-(2-メトキシエチル)]--[2'-デオキシ]--[2'-O-(メトキシエチル)]キメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、2'-O-メチルキメラオリゴヌクレオチドに関しては上記の手法のように調製したが、2'-O-メチルアミダイトを2'-O-(メトキシエチル)アミダイトに置き換えた。
【０１５０】
[2'-O-(2-メトキシエチル)ホスホジエステル]--[2'-デオキシホスホロチオエート]--[2'-O-(2-メトキシエチル)ホスホジエステル]キメラオリゴヌクレオチド
[2'-O-(2-メトキシエチル)ホスホジエステル]--[2'-デオキシホスホロチオエート]--[2'-O-(メトキシエチル)ホスホジエステル]キメラオリゴヌクレオチドは、2'-O-メチルキメラオリゴヌクレオチドに関しては上記手法のように調製し、2'-O-メチルアミダイトを2'-O-(メトキシエチル)アミダイトに置き換え、ヨウ素を用いた酸化によりキメラ構造中のウイング部分にホスホジエステルヌクレオシド間結合を生成し、そして3,H-1,2-ベンゾチアゾール-3-オン 1,1-ジオキシド（Beaucage試薬）を使用した硫化によりセンターギャップのホスホロチオエートオヌクレオチド間結合を生成する。
【０１５１】
他のキメラオリゴヌクレオチド、キメラオリゴヌクレオシドおよび混合キメラオリゴヌクレオチド／オリゴヌクレオシドは、引用により本明細書に編入する米国特許第5,623,065号明細書に従い合成する。
実施例６
オリゴヌクレオチドの単離
制御された孔のガラスカラム（アプライドバイオシステムズ）からの開裂および55℃で濃水酸化アンモニウム中での脱ブロッキング後、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオシドは2.5容量のエタノールを含む0.5M NaClで、２回沈殿することにより精製する。合成したオリゴヌクレオチドは変性ゲルでのポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析し、そして少なくとも85％が完全長の材料であると判断された。合成で得たホスホロチオエートおよびホスホジエステル結合の相対量は、31Ｐ核磁気共鳴分光法により定期的に検査し、そして幾つかの実験にはオリゴヌクレオチドをHPLCによりChiang et al.,J.Biol.Chem.,1991,266,18162-18171に記載されているように精製した。HPLCで精製した材料を用いた結果は、HPLCで精製しなかった材料で得た結果と同様であった。
実施例７
オリゴヌクレオチド合成−96ウェルプレート形式
オリゴヌクレオチドは、固相P(III)ホスホロアミダイト化学を介して、標準の96ウェル形式で同時に96配列を集成することができる自動化合成器で合成した。ホスホジエステルヌクレオチド間結合は水性ヨウ素を用いた酸化により得た。ホスホロチオエートヌクレオチド間結合は、無水アセトニトリル中の3,H-1,2-ベンゾチオール-3-オン 1,1-ジオキシド（Beaucage試薬）を使用した硫化により生成した。標準的な塩基を保護したベータ-シアノエチルジイソプロピルホスホロ アミダイトは、市販の販売元から購入した（例えばPE-アプライドバイオシステムズ、フォスター市、カリフォルニア州、またはファルマシア（Pharmacia）、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）。標準ではないヌクレオシドは、技術文献または特許を付与された方法で合成する。それらは塩基を保護したベータ-シアノエチルジイソプロピルホスホロ アミダイトとして使用する。
【０１５２】
オリゴヌクレオチドは支持体から開裂し、そして濃NH4OH中で高温（55〜60℃）で12〜16時間、脱保護し、そして生成物を放出し、ついで真空中で乾燥させた。乾燥した生成物は次いで滅菌水に再懸濁してマスタープレートとし、これからすべての分析用および試験プレートサンプルが次いでロボットのピペットを使用して希釈される。
実施例８
オリゴヌクレオチド分析−96ウェルプレート形式
各ウェル中のオリゴヌクレオチド濃度はサンプルを希釈し、そしてUV吸収分光法により評価した。個々の生成物の完全長の完全性は、96ウェル形式（Beckman P/ACE(商標) MDQ）ではキャピラリー電気泳動（CE）により、あるいは個々に調製されたサンプルについては市販のCE装置（例えばBeckman P/ACE(商標)、ABI 270）のいずれかで評価した。塩基および骨格組成は、エレクトロスプレー−マススペクトロメトリを使用した質量分析により確認した。すべてのアッセイ試験プレートは、シングルおよびマルチチャンネルのロボットピペットを使用して、マスタープレートから希釈した。プレートは、プレート上の少なくとも85％の化合物が少なくとも85％の完全長であれば許容できると判断した。
実施例９
細胞培養およびオリゴヌクレオチド処理
アンチセンス化合物が標的核酸発現に及ぼす効果は、標的核酸が測定可能なレベルで存在すれば種々の細胞型で試験することができる。これは例えばPCRまたはノーザンブロット分析を使用して日常的に測定することができる。以下の５種類の細胞型は具体的な説明のために提供するが、他の細胞型も標的が選択した細胞型で発現されれば日常的に使用することができる。これは当該技術分野で日常的な方法、例えばノーザンブロット分析、リボヌクレアーゼ保護アッセイ、またはRT-PCRにより容易に測定することができる。
【０１５３】
Ｔ-24細胞：
ヒトの移行性細胞膀胱ガン腫細胞系T-24は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC）（マナッサス、バージニア州）から得た。T-24細胞は、10％ウシ胎児血清（ギブコ（Gibco）／ライフテクノロジーズ（Life Technologies）、ゲチスバーグ、メリーランド州）、mLあたり100単位のペニシリンおよびmLあたり100マイクログラムのストレプトマイシン（ギブコ／ライフテクノロジーズ、ゲチスバーグ、メリーランド州）を補充した完全マッコイ5A基礎培地（ギブコ／ライフテクノロジーズ、ゲチスバーグ、メリーランド州）中で日常的に培養した。細胞は90％の集密度に達した時にトリプシン処理および希釈により日常的に継代した。細胞はRT-PCR分析で使用するために、96-ウェルプレート（ファルコン(Falcon）−プリマリア（Primaria）＃3872）中に7000細胞／ウェルの密度でまいた。＃
【０１５４】
ノーザンブロッティングまたは他の分析には、細胞を100mmまたは他の標準組織培養プレートにまき、そして適当な容量の培地およびオリゴヌクレオチドを使用して同様に処理することができる。
【０１５５】
A549細胞：
ヒトの肺ガン腫細胞系A549は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC）（マナッサス、バージニア州）から得た。A549細胞は、10％ウシ胎児血清（ギブコ／ライフテクノロジーズ、ゲチスバーグ、メリーランド州）、mLあたり100単位のペニシリンおよびmLあたり100マイクログラムのストレプトマイシン（ギブコ／ライフテクノロジーズ、ゲチスバーグ、メリーランド州）を補充したDMEM基礎培地（ギブコ／ライフテクノロジーズ、ゲチスバーグ、メリーランド州）中で日常的に培養した。細胞は90％の集密度に達した時にトリプシン処理および希釈により日常的に継代した。
【０１５６】
NHDF細胞：
ヒトの新生児皮膚繊維芽細胞（NHDF）は、クローンテックス社（Clonetics Corporation）、ウォーカーズヴィレ、メリーランド州）から得た。NHDFは、供給元により薦められるように補充した繊維芽成長培地（クローンテックス社、ウォーカーズヴィレ、メリーランド州）で日常的に維持した。細胞は供給元により薦められるように10継代まで維持した。
【０１５７】
HEK細胞：
ヒトの胚性ケラチノサイト（HEK）は、クローンテックス社（ウォーカーズヴィレ、メリーランド州）から得た。HEKは、供給元により薦められるように配合したケラチサイト成長培地（クローンテックス社、ウォーカーズヴィレ、メリーランド州）で日常的に維持した。細胞は供給元により薦められるように10継代まで維持した。
【０１５８】
PC-12細胞：
ラットのニューロン細胞系PC-12は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（マナッサス、バージニア州）から得た。PC-12細胞は、10％ウマ血清＋５％ウシ胎児血清（ギブコ／ライフテクノロジーズ、ゲチスバーグ、メリーランド州）を補充したDEME、高グルコース（ギブコ／ライフテクノロジーズ、ゲチスバーグ、メリーランド州）中で日常的に培養した。細胞は90％の集密度に達した時にトリプシン処理および希釈により日常的に継代した。細胞はRT-PCR分析で使用するために、96-ウェルプレート（ファルコン−プリマリア＃3872）中に20000細胞／ウェルの密度でまいた。
【０１５９】
ノーザンブロッティングまたは他の分析には、細胞を100mmまたは他の標準組織培養プレートにまき、そして適当な容量の培地およびオリゴヌクレオチドを使用して同様に処理することができる。
アンチセンス化合物を用いた処理：
細胞が80％の集密度に達した時、細胞をオリゴヌクレオチドで処理した。96-ウェルプレートで成長させた細胞について、ウェルを200μLのOPTI-MEM(商標)-1還元型-血清培地（ギブコBRL）で１回洗浄し、そして次いで3.75μg/mLのLIPOFECTIN(商標)(ギブコBRL)を含有する130μLのOPTI-MEM(商標)-1で処理し、そして所望のオリゴヌクレオチド濃度とした。処置から４〜７時間後、培地を新しい培地に置き換えた。細胞はオリゴヌクレオチド処理から16〜24時間後に回収した。
【０１６０】
使用したオリゴヌクレオチド濃度は、細胞系毎に変わる。特定の細胞系のための至適なオリゴヌクレオチド濃度を決定するために、細胞はある濃度範囲で陽性対照オリゴヌクレオチドを用いて処理する。ヒトの細胞については、陽性対照オリゴヌクレオチドは、ヒトH-rasを標的とするホスホロチオエート骨格をもつISIS 13920、TCCGTCATCGCTCCTCAGGG、（配列番号１）、2'-O-メトキシエチルギャップマー（太字で示す2'-O-メトキシエチル）である。マウスまたはラットの細胞については、陽性対照オリゴヌクレオチドは、マウスおよびラットの両方のc-rafを標的とするホスホロチオエート骨格をもつISIS 15770、ATGCATTCTGCCCCCAAGGA、（配列番号２）、2'-O-メトキシエチルギャップマー（太字で示す2'-O-メトキシエチル）である。c-Ha-ras（ISIS 13920について）またはc-raf（ISIS 15770について）mRNAの80％阻害をもたらす陽性対照オリゴヌクレオチドの濃度を、その細胞系に関する後の実験において、新規オリゴヌクレオチドに関するスクリーニング濃度として利用する。80％阻害が達成されない場合、H-rasまたはc-raf mRNAの60％阻害をもたらす陽性対照オリゴヌクレオチドの最低濃度を、その細胞系に関する後の実験において、オリゴヌクレオチドのスクリーニング濃度として利用する。60％阻害が達成されない場合、その特定の細胞系はオリゴヌクレオチドトランスフェクション実験には適さないとみなす。
実施例１０
PTP1B発現のオリゴヌクレオチド阻害の分析
PTP1B発現のアンチセンスモジュレーションは、当該技術分野で知られている種々の方法でアッセイすることができる。例えばPTP1B mRNAレベルは例えばノーザンブロット分析、競合的ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、またはリアル−タイムPCR(RT-PCR)により定量することができる。リアル−タイム定量的PCRが現在好適である。RNA分析は全細胞RNAまたはポリ(A)+mRNAで行うことができる。RNAの単離法は、例えばAusubel,F.M.et al.,分子生物学における現在の手法（Current Protocols in Molecular Biology）、第１巻、第4.1.1〜4.2.9および4.5.1〜4.5.3、ジョン ウィリー アンド サンズ社（John Wiley & Sons ,Inc.）、1993に教示されている。ノーザンブロット分析は当該技術分野では日常的であり、そして例えばAusubel,F.M.et al.,分子生物学における現在の手法（Current Protocols in Molecular Biology）、第１巻、第4.2.1〜4.2.9、ジョン ウィリー アンド サンズ社（John Wiley & Sons ,Inc.）、1996に教示されている。リアル-タイム定量的(PCR)は、カリフォルニア州、フォスター市のPE-アプライドバイオシステムズから販売され、そして製造元の指示に従い使用する市販のABI PRISM(商標)7700配列検出システムを使用して便利に行うことができる。定量的PCR分析の前に、測定される標的遺伝子に特異的なプライマー−プローブの組を、それらがGAPDH増幅反応で「マルチプレックス(multiplexed)」する能力について評価する。マルチプレキシング(multiplexing)では、標的遺伝子および内部標準遺伝子GAPDHの両方が１つのサンプル中で同時に増幅される。この分析では、未処理細胞から単離したmRNAが連続希釈される。各希釈はGAPDHにのみ、標的遺伝子のみ（「シングル−プレキシング(single-plexing)」）、あるいは両方（マルチプレキシング）に特異的なプライマー−プローブ組の存在下で増幅される。PCR増幅後、希釈の関数としてGAPDHおよび標的mRNAシグナルの標準曲線がシングル−プレキシングおよびマルチプレキシングサンプルから作成される。マルチプレックスサンプルから生成されたGAPDHおよび標的シグナルの両方の傾斜および相関係数が、シングル−プレックスサンプルから生成されたそれらの対応する値の10％内にあれば、その標的に特異的なこのプライマー−プローブ組はマルチプレックス可能であるとみなす。PCRの他の方法も当該技術分野では既知である。
【０１６１】
PTP1Bのタンパク質レベルは、免疫沈降法、ウエスタンブロット分析（イムノブロッティング）、ELISAまたは蛍光-活性化細胞ソーティング（FACS）のような当該技術分野で周知な種々の方法で定量することができる。PTP1Bに対する抗体は、抗体のMSRSカタログ（エリー社（Aerie Corporation)、バーミンガム、ミシガン州）のような種々の供給源から同定し、そして得るか、または通例の抗体生成法を介して調製することができる。ポリクローナル抗血清を調製する方法は、例えばAusubel,F.M.et al.,分子生物学における現在の手法（Current Protocols in Molecular Biology）、第２巻、第11.12.1〜11.12.9、ジョン ウィリー アンド サンズ社、1997に教示されている。モノクローナル抗体の調製は、例えばAusubel,F.M.et al.,分子生物学における現在の手法（Current Protocols in Molecular Biology）、第２巻、第11.4.1〜11.11.5、ジョン ウィリー アンド サンズ社、1997に教示されている。
【０１６２】
免疫沈降法は当該技術分野では標準的であり、そして例えばAusubel,F.M.et al.,分子生物学における現在の手法（Current Protocols in Molecular Biology）、第２巻、第10.16.1〜10.16.11、ジョン ウィリー アンド サンズ社、1998に見いだすことができる。ウエスタンブロット（イムノブロット）分析は当該技術分野では標準的であり、そして例えばAusubel,F.M.et al.,分子生物学における現在の手法（Current Protocols in Molecular Biology）、第２巻、第10.8.1〜10.8.21、ジョン ウィリー アンド サンズ社、1997に見いだすことができる。酵素-結合-免疫吸着アッセイ(ELISA)は当該技術分野では標準的であり、そして例えばAusubel,F.M.et al.,分子生物学における現在の手法（Current Protocols in Molecular Biology）、第２巻、第11.2.1〜11.2.22、ジョン ウィリー アンド サンズ社、1991に見いだすことができる。
実施例１１
ポリ(A)+mRNAの単離
ポリ(A)+mRNAは、Miura et al.,Clin.Chem.,1996,42,1758-1764に従い単離した。ポリ(A)+mRNAの単離に関する他の方法は、例えばAusubel,F.M.et al.,分子生物学における現在の手法（Current Protocols in Molecular Biology）、第１巻、第4.5.1〜4.5.3、ジョン ウィリー アンド サンズ社、1993に教示されている。簡単に説明すると、96-ウェルプレートで成長させた細胞について、成長培地を細胞から取り出し、そして各ウェルを200μLの冷PBSで洗浄した。60μLの溶解バッファー(10mM Tris-HCl、pH7.6、１mM EDTA、0.5M NaCl、0.5％NP-40、20mM バナジル-リボヌクレオシド複合体)を各ウェルに加え、プレートをゆるやかに撹拌し、そして次いで室温で５分間インキューベーションした。55μLの溶解物をオリゴd(T)を被覆した96-ウェルプレート（AGCT社、イルバイン、カリフォルニア州）に移した。プレートを室温で60分間インキューベーションし、200μLの洗浄バッファー（10mM Tris-HCl pH7.6、1mM EDTA、0.3M NaCl）で３回、洗浄した。最後の洗浄後、プレートをペーパータオルにブロットして過剰な洗浄バッファーを除去し、そして次いで５分間、風乾した。予め70℃に加熱した60μLの溶出バッファー（５mM Tris-HCl、pH7.6）を各ウェルに加え、プレートを90℃のホットプレート上に５分間インキューベーションし、そして次いで溶出液を新しい96-ウェルプレートに移した。
【０１６３】
100mmまたは他の標準的なプレート上で成長した細胞は、適当量のすべての溶液を使用して同様に処理することができる。
実施例１２
全RNAの単離
全RNAは、キアジェン社（Qiagen Inc.、バレニカ、カリフォルニア州)から購入したRNEASY 96(商標)キットおよびバッファーを、製造元が推薦する手順に従い使用して単離した。簡単に説明すると、96-ウェルで成長させた細胞について、成長培地を細胞から除去し、そして各ウェルを200μLの冷PBSで洗浄した。100μLのバッファーRLTを各ウェルに加え、そしてプレートを20秒間、激しく撹拌した。次いで100μLの70％エタノールを各ウェルに加え、そして内容物をピペットで３回、上下することにより混合した。次いでサンプルは、廃液回収皿を備え、そして真空源に付けられたQIAVAC(商標)マニホールドに付けられたRNEASY 96(商標)ウェルプレートに移した。15秒間、真空とした。１mLのバッファーRW1をRNEASY 96(商標)プレートの各ウェルに加え、そして再度、15秒間、真空とした。次いで１mLのバッファーRPEをRNEASY 96(商標)プレートの各ウェルに加え、そして15秒間、真空とした。次いでバッファーRPEの洗浄を繰り返し、そしてさらに10分間真空とした。次いでプレートをQIAVAC(商標)マニホールドから取り出し、そしてペーパータオル上に乾燥ブロットした。次いでプレートは、1.2mLの回収管を含む回収管ラックを備えたQIAVAC(商標)マニホールドに再び取り付けた。次いでRNAは60μLの水を各ウェルにピペットで入れ、１分間インキューベーションし、そして次いで30秒間真空にすることにより溶出した。溶出工程はさらに60μLの水で繰り返した。
【０１６４】
反復ピペット操作および溶出工程は、QIAGEN Bio-Robot 9604（キアジェン社、バレニカ、カリフォルニア州）を使用して自動化してもよい。本質的に、培養プレート上の細胞を溶解した後、プレートをロボットのデッキに移し、ここでピペット操作、DNase処理および溶出工程が行われる。
実施例１３
PTP1B mRNAレベルのリアル−タイムの定量的PCR分析
PTP1B mRNAレベルの定量は、ABI PRISM(商標)7700配列検出システム（PE-アプライド バイオシステムズ、フォスター市、カリフォルニア州）を使用して、製造元の指示に従いリアル-タイムの定量的PCR分析により測定した。これはリアル-タイムで高処理量のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）生成物の定量を可能とする閉鎖した管の、ゲルに基づくものではない蛍光検出システムである。PCRが完了した後に増幅した生成物を定量する標準的なPCRとは反対に、リアル−タイムの定量的PCRは生成物が蓄積すると定量する。これは、前方および逆PCRプライマー間で特異的にアニールし、そして２種類の蛍光染料を含むオリゴヌクレオチドプローブをPCR反応に含めることにより行われる。レポーター染料（例えば、カリフォルニア州、アラメダのオペロンテクノロジーズ社（Operon Technologies Inc.）またはカリフォルニア州、フォスター市のPE-アプライドバイオシステムズのいずれかから得られるJOE、FAMまたはVIC）を、プローブの5'末端に付け、そして消光染料（例えばカリフォルニア州、アラメダのオペロンテクノロジーズ社またはカリフォルニア州、フォスター市のPE-アプライドバイオシステムズのいずれかから得られるTAMRA）をプローブの3'末端に付ける。プローブおよび染料が完全である時、レポーター染料の発光は3'消光染料の近位で消される。増幅中、プローブの標的配列に対するアニーリングは、Taqポリメラーゼの5'-エキソヌクレアーゼ活性により開裂され得る基質を作成する。PCR増幅サイクルの延長期に、Taqポリメラーゼによるプローブの開裂はプローブの残りから（したがって、消光部分から）レポーター染料を放出し、そして配列に特異的な蛍光シグナルが形成される。各サイクルで、さらなるレポーター染料分子がそれらの各プローブから開裂され、そして蛍光強度がABI PRISM(商標)7700配列検出システムに取り付けられたレーザー光学部により定期的間隔で監視される。各アッセイで、未処理対照サンプルに由来するmRNAの連続希釈を含有する一連の平行反応で、試験サンプルのアンチセンスオリゴヌクレオチド処理後のパーセント阻害を定量するために使用する標準曲線を作成する。
【０１６５】
PCR試薬は、カリフォルニア州、フォスター市のPE-アプライドバイオシステムズから得た。RT-PCR反応は、25μLのPCRカクテル（１×TAQMAN(商標)バッファーA、5.5mM MgCl2、300μMの各dATP、dCTPおよびdGTP、600μMのdUTP、100nMの各前方プライマー、逆プライマーおよびプローブ、20単位のRNaseインヒビター、1.25単位のAMPLITAQ GOLD(商標)、および1.25単位のMuLV逆転写酵素）を、25μLのポリ(A)mRNA溶液を含有する96ウェルプレートに加えた。RT反応は30分間、48℃にインキューベーションすることにより行った。95℃で10分間インキューベーションしてAMPLITAQ GOLD(商標)を活性化した後、40サイクルの２段階のPCRプロトコールを行った：95℃で15秒間（変性）続いて60℃で1.5分間（アニーリング／延長）。
【０１６６】
ヒトPTP1Bに対するプローブおよびプライマーは、公開された配列情報を使用して（GeneBank 寄託番号第Ｍ31724、配列番号３として本明細書に編入する）、ヒトPTP1B配列にハイブリダイズするように設計した。
ヒトのPTP1Bに関して、PCRプライマーは：
前方プライマー：GGAGTTCGAGCAGATCGACAA（配列番号４）
逆プライマー：GGCCACTCTACATGGGAAGTC（配列番号５）であり、そして
PCRプローブは：FAM-AGCTGGGCGGCCATTTACCAGGAT-TAMRA（配列番号６）であり、ここでFAM（PE-アプライドバイオシステムズ、フォスター市、カリフォルニア州）は蛍光レポーター染料であり、そしてTAMRA（PE-アプライドバイオシステムズ、フォスター市、カリフォルニア州）は消光染料である。
ヒトGAPDHについて、PCRプライマーは：
前方プライマー：GAAGGTGAAGGTCGGAGTC（配列番号７）
逆プライマー：GAAGATGGTGATGGGATTTC（配列番号８）であり、そして
PCRプローブは：5' JOE-CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC- TAMRA 3'（配列番号９）であり、ここでJOE（PE-アプライドバイオシステムズ、フォスター市、カリフォルニア州）は蛍光レポーター染料であり、そしてTAMRA（PE-アプライドバイオシステムズ、フォスター市、カリフォルニア州）は消光染料である。
【０１６７】
ラットPTP1Bに対するプローブおよびプライマーは、公開された配列情報を使用して（GeneBank 寄託番号第Ｍ33962、配列番号１０として本明細書に編入する）、ラットＰTP1B配列にハイブリダイズするように設計した。ラットのPTP1Bに関して、PCRプライマーは：
前方プライマー：CGAGGGTGCAAAGTTCATCAT（配列番号１１）
逆プライマー：CCAGGTCTTCATGGGAAAGCT（配列番号１２）であり、そして
PCRプローブは：FAM-CGACTCGTCAGTGCAGGATCAGTGGA-TAMRA（配列番号１３）であり、ここでFAM（PE-アプライドバイオシステムズ、フォスター市、カリフォルニア州）は蛍光レポーター染料であり、そしてTAMRA（PE-アプライドバイオシステムズ、フォスター市、カリフォルニア州）は消光染料である。
ラットGAPDHについて、PCRプライマーは：
前方プライマー：TGTTCTAGAGACAGCCGCATCTT（配列番号１４）
逆プライマー：CACCGACCTTCACCATCTTGT（配列番号１５）であり、そして
PCRプローブは：5' JOE-TTGTGCAGTGCCAGCCTCGTCTCA- TAMRA 3'（配列番号１６）であり、ここでJOE（PE-アプライドバイオシステムズ、フォスター市、カリフォルニア州）は蛍光レポーター染料であり、そしてTAMRA（PE-アプライドバイオシステムズ、フォスター市、カリフォルニア州）は消光染料である。
実施例１４
PTP1B mRNAレベルのノーザンブロット分析
アンチセンス処理から18時間後、細胞単層をPBSで２回洗浄し、そして１mLのRNAZOL(商標)(テル−テスト“Ｂ”社（TEL-TEST“B" Inc.）、フレンズウッド、テキサス州）で溶解した。全RNAは製造元が推薦するプロトコールに従い調製した。20マイクログラムの全RNAは、1.1％ホルムアルデヒドを含有する1.2％アガロースゲルを通すことにより、MOPSバッファー系（アムレスコ社（AMRESCO,Inc.）、ソロン、オハイオ州）を使用して分画した。RNAは、ノーザン／サザン転写バッファー系（テル−テスト“Ｂ”社、フレンズウッド、テキサス州）を使用して一晩のキャピラリー転写によりゲルからHYBOND(商標)-N＋ナイロン膜（アマーシャム ファルマシア バイオテック（Amersham Pharmacia Biotech)、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）に移した。RNA転写はUV視覚化により確認した。膜は、STRATALINKER(商標)UV クロスリンカー2400（ストラタジーン（Stratagene）社、ラ ジョラ、カリフォルニア州）を使用してUV架橋化により固定し、そして緊縮条件については製造元の推薦を使用してQUICKHYB(商標)ハイブリダイゼーション溶液（ストラタジーン社、ラ ジョラ、カリフォルニア州）を使用してかぶせた。
【０１６８】
ヒトPTP1Bを検出するために、ヒトPTP1B特異的プローブは、前方プライマー
GGAGTTCGAGCAGATCGACAA（配列番号４）および逆プライマーGGCCACTCTACATGGGAAGTC（配列番号５)を使用してPCRにより調製した。付加および転写効率の変動を標準化するために、膜ははがされ、そしてヒトグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）RNA（クローンテック（Clontech)、パロ アルト、リフォルニア州）についてプローブで釣り上げた。
【０１６９】
ラットPTP1Bを検出するために、ラットPTP1B特異的プローブは、前方プライマーCGAGGGTGCAAAGTTCATCAT（配列番号１１）および逆プライマーCCAGGTCTTCATGGGAAAGCT（配列番号１２)を使用してPCRにより調製した。付加および転写効率の変動を標準化するために、膜ははがされ、そしてラットグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）RNA（クローンテック、パロ アルト、リフォルニア州）についてプローブで釣り上げた。
【０１７０】
ハイブリダイゼーション膜はPHOSPHORIMAGER(商標)およびIMAGEQUANT(商標)ソフトウェアV3.3（モレキュラー ダイナミックス（Molecular Dynamics)、サニーヴァレ、カリフォルニア州）を使用して視覚化し、そして定量した。データは未処理対照でのGAPDHレベルに対して標準化した。
実施例１５
2'-MOEウイングおよびデオキシギャップを有するキメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドによるヒトPTP1B発現のアンチセンス阻害
本発明に従い、公開された配列情報（GeneBank 寄託番号第Ｍ31724、配列番号３として引用により本明細書に編入する）を使用して、一連のオリゴヌクレオチドはヒトPTP1B RNAの異なる領域を標的とするように設計された。このオリゴヌクレオチドを表１に示す。「標的部位」は、オリゴヌクレオチドが結合する特定の標的配列上の最初の（最も5')ヌクレオチド番号を示す。表１のすべての化合物は、５つのヌクレオチド「ウイング」により両側（5'および3'方向）を挟まれた、10個の2'-デオキシヌクレオチドから成る中央「ギャップ」領域から成る20ヌクレオチド長のキメラオリゴヌクレオチド（「ギャップマー」）である。このウイングは、2'-メトキシエチル(2'-MOE)ヌクレオチドから成る。ヌクレオシド間(骨格)結合は、オリゴヌクレオチドを通してホスホロチオエート(P=S）である。すべてのシチジン残基は5-メチルシチジンである。化合物はそれらがヒトのPTP1B mRNAレベルに及ぼす効果について、本明細書の他の実施例に記載するように定量的なリアル−タイムPCRにより分析した。データは２つの実験からの平均である。N.D.とあるのは、「データ無し」を示す。
【０１７１】
【表１】
Figure 0004054192
【０１７２】
【表２】
Figure 0004054192
【０１７３】
表１に示すように、配列番号：１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２６、２７、２９、３０、３２、３３、３５、３６、３８、３９、４０、４２、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６９、７０、７２、７３、７５、７８、７９、８０、８１、８３、８４、８６、８７、８９、９０、９２、９３、９４、９５および９６は、このアッセイでヒトPTP1B発現の少なくとも35％阻害を示し、それゆえに好適である。
実施例１７
2'-MOEウイングおよびデオキシギャップを有するキメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドによるラットPTP1B発現のアンチセンス阻害
本発明に従い、公開された配列情報（GeneBank 寄託番号第Ｍ33962、配列番号１０として引用により本明細書に編入する）を使用して、第２の一連のオリゴヌクレオチドはラットPTP1B RNAの異なる領域を標的とするように設計された。このオリゴヌクレオチドを表２に示す。「標的部位」は、オリゴヌクレオチドが結合する特定の標的配列上の最初の（最も5')ヌクレオチド番号を示す。表２のすべての化合物は、５つのヌクレオチド「ウイング」により両側（5'および3'方向）を挟まれた、10個の2'-デオキシヌクレオチドから成る中央「ギャップ」領域から成る20ヌクレオチド長のキメラオリゴヌクレオチド（「ギャップマー」）である。このウイングは、2'-メトキシエチル(2'-MOE)ヌクレオチドから成る。ヌクレオシド間（骨格）結合は、オリゴヌクレオチドを通してホスホロチオエート(P=S）である。すべてのシチジン残基は5-メチルシチジンである。化合物はそれらがラットのPTP1B mRNAレベルに及ぼす効果について、本明細書の他の実施例に記載するように定量的なリアル−タイムPCRにより分析した。データは２つの実験からの平均である。N.D.とあるのは、「データ無し」を示す。
【０１７４】
【表３】
Figure 0004054192
【０１７５】
【表４】
Figure 0004054192
【０１７６】
【表５】
Figure 0004054192
【０１７７】
表２に示すように、配列番号：９７、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１２、１１３、１１４、１１５、１１７、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２６、１２７、１２８、１３０、１３１、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９１、１９３、１９５、１９６、１９８、２０１、２０２、２０４、２０５、２０６、２１１、２１５、２１７、２１９、２２３、２２５、２２６、２２８、２２９、２３０、２３２、２３３、２３５、２３６、２３７、２３９または２４０は、この実験でラットPTP1B発現の少なくとも30％阻害を示し、それゆえに好適である。
実施例１７
PTP1Bタンパク質レベルのウエスタンブロット分析
ウエスタンブロット分析（イムノブロット分析）は、標準法を使用して行う。細胞はオリゴヌクレオチド処理から16〜20時間後に回収し、PBSで１回洗浄し、Laemmliバッファー（100μl／ウェル）に懸濁し、５分間煮沸し、そして16％ SDS-PAGEゲルに乗せる。ゲルは150Vで1.5時間泳動し、そしてウエスタンブロッティング用の膜に移す。PTP1Bに対して適当な第１抗体を使用し、第１抗体種に対する放射性または蛍光標識した対２抗体を用いる。バンドはPHOSPHORIMAGER(商標)（モレキュラーダイナミックス、サニーヴァレ、カリフォルニア州）を使用して視覚化する。
【配列表】
Figure 0004054192
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Claims (14)

  1. ＰＴＰ１Ｂをコードする核酸分子を標的とする配列番号１６４−１７３の１つを含んでなる３０核酸塩基長までのアンチセンス化合物であって、ＰＴＰ１Ｂに、特異的にハイブリダイズしそして発現を阻害する、上記化合物。
  2. アンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１に記載のアンチセンス化合物。
  3. アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号：１６４、１６５、１６６、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２または１７３からなる配列を有する、請求項２に記載のアンチセンス化合物。
  4. アンチセンスオリゴヌクレオチドが少なくとも１つの修飾されたヌクレオシド間結合を含んで成る、請求項２に記載のアンチセンス化合物。
  5. 修飾されたヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である、請求項４に記載のアンチセンス化合物。
  6. アンチセンスオリゴヌクレオチドが少なくとも１つの修飾された糖部分を含んで成る、請求項２に記載のアンチセンス化合物。
  7. 修飾された糖部分が２'−Ｏ−メトキシエチル糖部分である、請求項６に記載のアンチセンス化合物。
  8. アンチセンスオリゴヌクレオチドが少なくとも１つの修飾された核酸塩基を含んで成る、請求項２に記載のアンチセンス化合物。
  9. 修飾された核酸塩基が５−メチルシトシンである、請求項８に記載のアンチセンス化合物。
  10. アンチセンスオリゴヌクレオチドがキメラオリゴヌクレオチドである、請求項２に記載のアンチセンス化合物。
  11. 配列番号１６６の配列を有する、請求項１に記載のアンチセンス化合物。
  12. 配列番号１６６のヌクレオチド１−５及び１６−２０が２'−Ｏ−メトキシエチルヌクレオシドであり、ヌクレオチド６−１５が２’−デオキシヌクレオチドであり、全てのシチジン残基が５−メチルシチジンであり、そして全てのヌクレオシド間結合がホスホロチオエートである、請求項１１に記載のアンチセンス化合物。
  13. 糖尿病、肥満、ガンまたは高増殖性障害を処置するための医薬の製造における請求項１−１２に記載の化合物の使用。
  14. ＰＴＰ１Ｂの発現を阻害するように細胞または組織を請求項１−１２のいずれかに記載のアンチセンス化合物と接触させることを含んで成る、インビトロで細胞または組織中のＰＴＰ１Ｂの発現を阻害する方法。
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