ES2307583T3 - Inhibicion antisentido de expresion ptpib. - Google Patents
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Abstract
Un compuesto antisentido de hasta 30 nucleobases en longitud que está formado por una de las SEQ ID NOS: 164-173 dirigido a una molécula de ácido nucleico codificadora de PTP1B, hibridizándose dicho compuesto antisentido específicamente e inhibiendo la expresión de PTP1B.
Description
Inhibición antisentido de expresión PTP1B.
La presente invención proporciona composiciones
y métodos para modular la expresión de PTP1B. En particular, esta
invención se refiere a compuestos antisentido, en particular
oligonucleótidos, específicamente hibridizables con ácidos
nucleicos codificadores de PTP1B. Tales oligonucleótidos han
demostrado que son capaces de modular la expresión de PTP1B.
El proceso de fosforilación, definido como la
unión de una fracción de fosfato con una molécula biológica por
medio de la acción de enzimas llamadas quinasas, representa un
medio por el cual las señales intracelulares se propagan dando como
resultado finalmente una respuesta celular. En el interior de la
célula, las proteínas pueden fosforilarse sobre residuos de serina,
treonina o tirosina y el alcance de la fosforilación está regulado
por la acción opuesta de las fosfatasas, que eliminan las
fracciones de fosfato. Mientras la mayoría de la fosforilación
proteica dentro de la célula sobre residuos de serina o treonina,
la fosforilación se modula en su mayor extensión durante la
transformación oncogénica y la estimulación del factor de
crecimiento (Zhang, Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol., 1998, 33,
1-52).
Debido a que la fosforilación es un proceso
consabido en el interior de las células y debido a que los
fenotipos celulares están influenciados en gran medida por la
actividad de estas rutas, actualmente se cree que el número de
estados de enfermedad y/o desórdenes son el resultado de una
activación atípica o anómala de, o mutaciones funcionales en,
quinasas y fosfatasas. Como consecuencia, recientemente se ha
prestado una considerable atención a la caracterización de quinasas
de tirosinas y fosfatasas de quirosina.
PTPB1 (también conocido como fosfatasa de
proteína 1B y PTPN1) es un retículo endoplásmico
(ER)-enzima asociada originalmente aislada como la
principal fosfatasa de tirosina proteica de la placenta humana
(Tonks et al., J. Biol. Chem., 1988, 263,
6731-6737; Tonks et al., J. Biol. Chem.,
1988, 263, 6722-6730).
PTPB1 ha establecido un papel regulador esencial
en la señalización mediada por el receptor de insulina. PTP1B
interactúa y desfosforila el receptor de insulina activado tanto en
células in vitro con en células intactas dando como
resultado la desregulación de la ruta señalizadora (Goldstein et
al., Mol. Cell. Biochem., 1998, 182, 91-99;
Seely et al., Diabetes, 1996, 45, 1379-1385).
Además, PTP1B modula las acciones mitogénicas de la insulina
(Goldstein et al., Mol. Cell. Biochem., 1998, 182,
91-99). En células de adiposa de ratas las células
que sobreexpresan PTP1B, las translocalización del transportador de
glucosa GLUT4 fue inhibido, implicando también que PTP1B fue un
regulador negativo en el transporte de glucosa (Chen et al.,
J. Biol. Chem., 1997, 272, 8026-8031).
Los modelos de ratones knockout sin el gen PTP1B
también señalan hacia la regulación negativa de la insulina
señalizadora de PTP1B. Ratones que albergan un gen PTP1B afectado
mostraron una mayor sensibilidad a la insulina, una mayor
fosforilación del receptor de insulina y cuando fueron
administrados una dieta alta en grasa, los ratones PTP1B -/-
resistieron al aumento de peso y permanecieron sensibles a la
insulina (Elchebly et al., Science, 1999, 283,
1544-1548). Estos estudios claramente establecieron
que el PTP1B representa un objetivo terapéutico en el tratamiento
de obesidad y diabetes.
PTP1B, que se regula diferencialmente durante el
ciclo celular (Schievella et al., Cell. Growth Differ.,
1993, 4, 239-246), se expresa en los tejidos
sensibles a la insulina como dos isoformas diferentes que surgen a
partir de uniones alternas del pre-mARN (Shifrin y
Neel, J. Biol. Chem., 1993, 268, 25376-25384).
Recientemente se ha demostrado que el radio de productos unidos
alternativamente se ve afectado por factores del crecimiento tales
como la insulina y difiere en varios tejidos examinados (Sell y
Reese, Mol. Genet. Metab., 1999, 66, 189-192). En
estos estudios también se descubrió que los niveles de las
variantes estaban relacionados con la concentración de insulina en
el plasma y el porcentaje de grasa corporal y por lo tanto podía
emplearse como un biomarcador para paciente con hiperinsulinemia
crónica o diabetes del tipo 2.
Liu y Chernoff han demostrado que PTP1B se
enlaza y sirve como sustrato para el receptor de factor de
crecimiento epidérmico (EGFR) (Liu y Chernoff, Biochem. J., 1997,
327, 139-145). Además, en las células del carcinoma
epidermoide humano A431, PT1 B demostró estar inactivo a causa de
la presencia de H202 generado por la adición de EGF. Estos estudios
indican que PTP1B puede regularse negativamente por el estado de
oxidación de la célula, que a menudos se desregula durante la
tumorogénesis (Lee et al., J. Biol. Chem., 1998, 273,
15366-15372).
La sobreexpresión de PTP1B se ha demostrado en
cánceres de ovario malignos y esta correlación ha ido acompañada de
un concomitante aumento en la expresión de receptor del factor de
crecimiento asociado (Wiener et al., Am. Obstet. Gynecol.,
1994, 170, 1177-1183).
PTP1B ha demostrado que puede suprimir la
transformación en células NIH3T3 inducidas por el nuevo oncogén
(Brown-Shimer et al., Cancer Res., 1992, 52,
478-482), así como en fibroblastos 3Y1 de ratas
inducidos por v-srk, v-src, y
v-ras (Liu et al., Mol. Cell. Biol., 1998,
18, 250-259) y fibroblastos rat-1
inducidos por bcr-abl (LaMontagne et al.,
Proc. Natl. Acad. Sic. U.S.A, 1998, 95,
14094-14099). También se ha demostrado que PTP1B
promueve la diferenciación de células K562, una línea celular de
leucemia mielógena crónica, de manera similar a como lo hace un
inhibidor de la oncoproteína bcr-abl. Estos
estudios describen el posible papel de PTP1B en el control de
patogénesis de leucemia mielógena crónica, (LaMontagne et
al., Proc. Natl. Acad. Sic. U.S.A, 1998, 95,
14094-14099).
PTB1B regula de manera negativa la integrina
señalizadora mediante la interacción con uno o más componentes
señalizadores dependientes de adhesión y reprimiendo la activación
de quinasa MAP mediada por integrina (Liu et al., Curr.
Biol., 1998, 8, 173-176). Otros estudios diseñados
para estudiar la integrina señalizadora, usando una forma
catalíticamente inactiva de PTP1B, han demostrado que PTP1B regula
la adhesión celular mediada por cadherina (Balsamo et al.,
J. Cell. Biol., 1998, 143, 523-532), así como la
extensión celular, la adhesión focal y la formación de fibra tensa
y la fosforilación de tirosina (Arregui et al., J. Cell.
Biol., 1998, 143, 861-873).
Actualmente, los agentes terapéuticos diseñados
para inhibir la síntesis o acción de PTP1B incluyen moléculas
pequeñas (Ham et al., Bioorg. Med. Chem. Left., 1999, 9,
185-186; Skorey et al., J. Biol. Chem.,
1997, 272, 22472-22480; Taing et
al.,Biochemistry, 1999, 38, 3793-3803; Taylor
et al., Bioorg. Med. Chem., 1998, 6,
1457-1468; Wang et al., Bioorg. Med. Chem.
Left., 1998, 8, 345-350; Wang et al.,
Biochem. Pharmacol., 1997, 54, 703-711; Yao et
al., Bioorg. Med. Chem., 1998, 6, 1799-1810) y
péptidos (Chen et al., Biochemistry, 1999, 38,
384-389; Desmarais et al., Arch. Biochem.
Biophys., 1998, 354, 225-231; Roller et al.,
Bioorg. Med. Chem. Left., 1998, 8, 2149-2150).
Además, en la publicación PCT WO 97/32595 se describen fofopéptidos
y anticuerpos que inhiben la asociación de PTP1B con el receptor de
insulina activado para el tratamiento de desórdenes asociados con
la resistencia a la insulina. También se describen en términos
generales los nucleótidos antisentido contra PTP1B (Olefsky,
1997).
Aún queda una gran necesidad de agentes
adicionales capaces de inhibir de manera efectiva la función PTP1B
y la tecnología antisentido está emergiendo como un medio efectivo
y para reducir la expresión de productos genéticos específicos. Por
lo tanto, esta tecnología puede resultar ser únicamente útil en un
número de aplicaciones terapéuticas, diagnósticas y de
investigación para la modulación de expresión PTP1B.
Por consiguiente, la presente invención
proporciona composiciones y métodos para modular la expresión
PTP1B, incluyendo la modulación de la forma alternativamente unida
de PTP 1B.
La presente invención se encuentra dirigida a
compuestos antisentido, particularmente oligonucleótidos, que están
dirigidos a un ácido nucleico que codifica PTP1B. De acuerdo con la
reivindicación 1 de la presente invención, los compuestos
antisentido tienen la secuencia de SEQ ID NO:
164-173. También se proporcionan las composiciones
farmacéuticas y otras composiciones que están formadas por los
compuestos antisentido de la invención. También se proporcionan
métodos para modular la expresión de PTP1B en células o tejidos que
consisten en poner en contacto dichas células o dichos tejidos
in vitro con uno o más de los compuestos antisentido o
composiciones de la invención.
La presente invención emplea compuestos
antisentido oligoméricos, en particular oligonucleótidos, para uso
en la modulación de la función de moléculas de ácido nucleico que
codifican PTP1B, modulando en última instancia la cantidad
producida de PTP1B. Esto se consigue proporcionando compuestos
antisentido que específicamente se hibridizan con uno o más ácido
nucleicos codificadores de PTP1B. Tal y como aquí se emplean, los
términos "ácido nucleico objetivo" y "ácido nucleico
codificador de PTP1B" engloban o abarcan ADN codificador de
PTP1B, ARN (incluyendo pre-mARN y mARN) trascrito
del citado ADN y también cADN derivado de dicho ARN: La
hibridización específica de un compuesto oligomérico con su ácido
nucleico objetivo interfiere con la función normal del ácido
nucleico. Esta modulación de la función de un ácido nucleico
objetivo por los compuestos que específicamente se hibridizan con
él generalmente se refiere como "antisentido". Las funciones
de ADN con el que interfiere incluyen la réplica o transcripción.
Las funciones de ARN con el que interfiere incluyen todas las
funciones vitales, como por ejemplo, translocalización de ARN en el
punto de la translación proteica, la translación de proteína de
ARN, la unión de ARN para producir una o más especies de mARN, y la
actividad catalítica que puede contraerse o facilitarse por medio
de la acción de RNA. El efecto total de esta interferencia con la
función del ácido nucleico objetivo es la modulación de la
expresión de PTP1B. En el contexto de la presente invención,
"modulación" significa bien un aumento (estimulación) o un
descenso (inhibición) en la expresión de un gen. En el contexto de
la presente invención, inhibición es la forma preferente de
modulación de la expresión de gen y mARN es un objetivo
preferente.
Es preferible dirigir ácidos nucleicos
específicos para antisentido. "Dirigir" un compuesto
antisentido hacia un ácido nucleico particular, en el contexto de
esta invención, es un proceso que implica múltiples pasos. El
proceso normalmente comienza con la identificación de una secuencia
de ácido nucleico cuya función hay que modular. Esto puede ser, por
ejemplo, un gen celular (o mARN trascrito de un gen) cuya expresión
está asociada con un desorden o un estado de enfermedad particular,
o una molécula de ácido nucleico de un agente infeccioso. En la
presente invención, el objetivo es una molécula de ácido nucleico
que codifica PTP1B. El proceso de selección de objetivo también
incluye la determinación de un punto o puntos dentro del gen para
que se de la interacción antisentido con el efecto deseado, es
decir, la detección o modulación de expresión de la proteína serán
los resultados. En el contexto de la presente invención, un punto
intragénico preferente es la región que comprende el codón de
iniciación o terminación de traslación del marco abierto de lectura
(ORF) del gen. Por ello, como se conoce en la técnica, el codón de
iniciación de traslación es normalmente 5'-AUG (en
moléculas de mARN trascrito; 5'ATG en la molécula correspondiente
de ADN), el codón de iniciación de traslación también es denominado
"codón AUG", el "codón de inicio" o el "codón de inicio
AUG". Una minoría de genes tienen un codón de iniciación de
traslación que posee la secuencia de RNA 5'-GUG,
5'-UUG o 5'-CUG, y
5'-AUA, 5'-ACG y
5'-CUG han demostrado que pueden funcionar in
vivo. Por lo tanto, los términos "codón de iniciación de
traslación" y "codón de inicio" pueden comprender muchas
secuencias de codón, incluso si el aminoácido iniciador en cada
caso normalmente sea metionina (en eucariotas) o formilmetionina
(en procariotas). También se conoce en la técnica que los genes
eucarióticos y procarióticos pueden tener dos o más codones de
inicio alternativos, y cualquiera de ellos puede emplearse
preferentemente para la iniciación de traslación en un tipo o
tejido celular particular, o bajo un conjunto particular de
condiciones. En el contexto de la invención, "codón de inicio"
y "codón de inicio de traslación" hacen referencia a el codón
o codones que se emplean in vivo para iniciar la traslación
de una molécula mARN trascrita a partir de un gen codificador de
PTP1B, con independencia de la secuencia o secuencias de dichos
codones.
También representa un hecho conocido en la
técnica que un codón de terminación de traslación (o "codón de
parada") de un gen puede tener una o tres secuencias, es decir,
5'-UAA, 5'-UAG y
5'-UGA (las secuencias correspondientes de ADN son
5'-TAA, 5'-TAG y
5'-TGA, respectivamente). Los términos "región de
codón de inicio" y "región de codón de iniciación de
traslación" hacen referencia a una parte de dicho mARN o gen que
engloba desde aproximadamente 25 a aproximadamente 50 nucleótidos
contiguos en cada dirección (es decir, 5' o 3') desde un codón de
iniciación de traslación. De manera similar, los términos "región
de codón de parada" y "región de terminación de traslación"
hacen referencia a una parte de dicho mARN o gen que engloba desde
aproximadamente 25 a aproximada-
mente 50 nucleótidos contiguos en cada dirección (es decir, 5' o 3') desde un codón de finalización de traslación.
mente 50 nucleótidos contiguos en cada dirección (es decir, 5' o 3') desde un codón de finalización de traslación.
El marco abierto de lectura (ORF) o "región
codificadora", que es conocida en la técnica por hacer
referencia a la región entre el codón de iniciación de traslación y
el codón de finalización de traslación, es también la región que
puede ser un objetivo o blanco de manera eficaz. Otras regiones que
sirven como objetivo incluyen la región 5' no traducida (5' UTR),
conocida en la técnica por hacer referencia a la parte de un mARN
en la dirección 5' desde el codón de iniciación de traslación, y
que por lo tanto incluye los nucleótidos entre el punto límite 5' y
el codón de iniciación de traslación de un mARN o los nucleótidos
correspondientes en el gen, y la región 3' no traducida (3' UTR),
conocida en la técnica por hacer referencia a la parte de un mARN
en la dirección 3' desde el codón de terminación de traslación, y
que por lo tanto incluye los nucleótidos entre el codón de
terminación de traslación y el extremo 3' de un mARN o los
nucleótidos correspondientes en el gen. El extremo 5' de un mARN
comprende un residuo de N7-guanosina metilada unido
a el residuo más 5' del mRNA por medio de un enlace
5'-5' trifosfato. Se considera que la región del
extremo 5' de un mRNA incluye la propia estructura de la punta o
extremo 5' así como los primeros 50 nucleótidos adyacentes al
extremo. La región del extremo 5' también puede ser denominada
región objetivo.
A pesar de que algunas transcripciones
eucarióticas de mARN se traducen directamente, muchas contienen una
o dos regiones conocidas como "intrones", que se eliminan de
una transcripción antes de que se traduzca. Las regiones restantes
(y por lo tanto traducidas) son conocidas como "exones" y se
unen para formar una secuencia continua de mARN. Los puntos de
unión de mARN, es decir, las uniones intrón-exón,
pueden también considerarse como regiones objetivos preferentes, y
resultan particularmente útiles en situaciones en las que se
implica una unión anómala en una enfermedad, o cuando se implica
una sobreproducción de un producto de unión particular mARN en una
enfermedad. Las uniones de fusión anómalas debido a recolocaciones
o a eliminaciones también son preferentes. También se ha
descubierto que los intrones también pueden ser efectivos, y por lo
tanto preferentes, regiones objetivo para compuestos antisentido
objetivo, por ejemplo, para ADN o mARN.
Una vez que se han identificado uno o más puntos
para blanco u objetivo, se eligen los oligonucleótidos que son los
suficientemente complementarios con el objetivo, es decir, se
hibridizan suficientemente bien y con suficiente especificidad, para
otorgar el efecto deseado.
En el contexto de la invención,
"hibridización" significa enlace de hidrógeno, que puede ser
enlace de hidrógeno Watson-Crick, Hoogsteen o
Hoogsteen inverso, entre bases de nucleósido o nucleótido
complementarias. Por ejemplo, adenina y timina son nucleobases
complementarias que forman pareja a través de la formación de
enlaces de hidrógeno. "Complementario", tal y como aquí se
emplea, hace referencia a la capacidad para practicar el
apareamiento entre dos nucleótidos. Por ejemplo, si un nucleótido
en una cierta posición de un oligonucleótido es capaz de lograr un
enlace de hidrógeno con un nucleótido en la misma posición de una
molécula de ADN o ARN, entonces el oligonucleótido y el ADN o ARN
son considerados que son complementarios entres sí en esa posición.
El oligonucleótido y el ADN o ARN son complementarios entre sí
cuando un número suficiente de posiciones correspondientes en cada
molécula se ocupan por nucleótidos que pueden formar enlaces de
hidrógeno entre sí. Por lo tanto, "específicamente
hibridizables" y "complementarios" son términos que se
emplean para indicar un grado suficiente de complementariedad o de
emparejamiento preciso de modo que se de un enlace específico y
estable entre el oligonucleótido y el ADN o ARN objetivo. En la
técnica se entiende que la secuencia de un compuesto antisentido no
tiene por qué ser 100% complementaria con las del ácido nucleico
objetivo que con la que será específicamente hibridizable. Un
compuesto antisentido es específicamente hibridizable cuando el
enlace del compuesto con la molécula objetivo ADN o ARN interfiere
con la función normal de ADN o ARN objetivo para provocar una
pérdida de utilidad, y existe un grado suficiente de
complementariedad para evitar el enlace no específico del compuesto
antisentido con las secuencias no objetivo bajo condiciones en las
cuales se desea el enlace específico, es decir, bajo condiciones
fisiológicas en el caso de ensayos in vivo o tratamiento
terapéutico, y en el caso de ensayos in vitro, bajo
condiciones en las cuales se llevan a cabo los ensayos.
Los compuestos antisentido comúnmente se emplean
como reagentes de investigación y diagnósticos. Por ejemplo, los
oligonucleótidos antisentido, que son capaces de inhibir la
expresión de gen con exquisita especificidad, a menudo se emplean
por parte de expertos en la técnica para aclarar la función de genes
particulares. Los compuestos antisentido también se emplean, por
ejemplo, para distinguir entre funciones de varios miembros de una
ruta biológica. Por lo tanto, se ha empleado modulación antisentido
con fines relacionados con la investigación.
Los expertos en la técnica también han empleado
la especificidad y la sensibilidad del antisentido con fines
terapéuticos. Los oligonucleótidos antisentido han sido empleados
como fracciones terapéuticas en el tratamiento de estados enfermos
en animales y en el hombre. Los oligonucleótidos antisentido han
sido administrados de manera segura y efectiva a humanos y en el
presente se están llevando a cabo varios ensayos clínicos. Como
consecuencia, se establece que los oligonucleótidos pueden ser
útiles modalidades terapéuticas capaces de configurarse para
resultar útiles en regímenes de tratamiento para tratamientos de
células, tejidos y animales, especialmente
humanos.
humanos.
En el contexto de esta invención, el término
"oligonucleótido" hace referencia a un oligómero o polímero de
ácido ribonucleico (ARN) o ácido desoxirribonucleico (ADN) o
análogos de los mismos. Este término incluye oligonucleótidos
compuestos por nucleobases que se dan de manera natural, azúcares y
enlaces internucleósidos covalentes (esqueleto) así como
oligonucleótidos que tienen partes que no ocurren de manera natural
y que funcionan de manera similar. Tales oligonucleótidos
modificados o sustituidos con frecuencia son preferentes en
relación con las formas nativas debido a sus propiedades más
adecuadas como por ejemplo una mayor respuesta celular, una mayor
afinidad para el ácido nucleico objetivo y una mayor estabilidad en
la presencia de nucleasas.
Mientras que los oligonucleótidos son una forma
preferente de compuesto antisentido, la presente invención abarca
otras compuestos oligoméricos antisentido, incluyendo aunque no
limitando, análogos oligonucleótidos como los descritos
anteriormente. Los compuestos antisentido de acuerdo con esta
invención comprenden aproximadamente de 8 a 30 nucleobases (es
decir de 8 a 30 nucleósidos enlazados). En particular, los
compuestos antisentido preferentes son oligonucleótidos
antisentido, incluso son más preferentes aquellos que contienen
aproximadamente entre 12 y 25 nucleobases. Tal y como se conoce en
la técnica, un nucleósido es una combinación
base-azúcar. La porción de la base del nucleósido
es normalmente una base heterocíclica. Las dos clases más comunes de
dichas bases heterocíclicas son las purinas y las pirimidinas. Los
nucleótidos son nucleósidos que además incluyen un grupo de fosfato
covalentemente enlazado con la parte de azúcar del nucleósido. De
aquellos nucleósidos que incluyen un azúcar pentofuranosil, el
grupo de fosfato puede enlazarse con la fracción hidroxil 2', 3' o
5' del azúcar. Para formar oligonucleótidos, los grupos de fosfato
enlazan de manera covalente nucleósidos adyacentes entre sí para
formar un compuesto polimérico lineal. A su vez, los respectivos
extremos de esta estructura polimérica lineal pueden además unidos
para formar una estructura circular, a pesar de que generalmente
son preferentes las estructuras lineales abiertas. Respecto a la
estructura del oligonucleótido, los grupos de fosfato son
comúnmente preferentes por formar el esqueleto o eje
internucleótido del oligonucleótido. El enlace normal o el eje de
ARN o ADN es una unión fosfodiéster 3' a 5'.
Ejemplos específicos de compuesto antisentido
preferentes útiles en esta invención incluyen oligonucleótidos que
contienen ejes modificados o enlaces internucleótidos no naturales.
Tal y como se define en la descripción, los oligonucleótidos que
tienen ejes modificados incluyen aquellos que retienen un átomo
fosfórico en el eje. Con fines descriptivos, y tal y como se hace
referencia en ocasiones en la técnica, los oligonucleótidos
modificados que no tiene un átomo fosfórico en sus eje
internucleótido también pueden considerarse como
oligonucleótidos.
Los ejes de oligonucleótidos modificados
preferentes incluyen, por ejemplo, fosforotioatos, fosforotioatos
quirales, fosforoditioatos, fosforotriester,
aminoalquil-fosfotriester, metil y otros fosfonatos
alquil incluyendo 3'-fosfonatos alquileno y
fosfonatos quirales, fosfinatos, fosforomidatos incluyendo
3'-amino fosforamidato y
aminoalquil-fosforamidatos, trionofosforamidatos,
tionoalquil-fosfonatos,
tionoalquil-fosfotriesteres, y
borano-fosfatos que tienen enlaces normales
3'-5', análogos enlazados de estos
3'-5', y aquellos que poseen polaridad invertida
donde las parejas adyacentes de unidades nucleótidas son enlaces de
3'-5' con 5'-3' o
2'-5' con 5'-2'. También se incluyen
varias sales, sales mezcladas y formas libres de ácido.
Patentes representativas de Estados Unidos que
presentan la preparación de los enlaces que contienen fósforo
anteriormente mencionados incluyen, aunque no se limitan a: U.S.:
3,687,808; 4,469,863; 4,476,301; 5,023,243; 5,177,196; 5,188,897;
5,264,423; 5,276,019; 5,278,302; 5,286,717; 5,321,131; 5,399,676;
5,405,939; 5,453,496;
5,455,233; 5,466,677; 5,476,925; 5,519,126; 5,536,821; 5,541,306; 5,550,111; 5,563,253; 5,571,799; 5,587,361; y 5, 625, 050, algunas de las cuales son comúnmente reconocidas con esta solicitud.
5,455,233; 5,466,677; 5,476,925; 5,519,126; 5,536,821; 5,541,306; 5,550,111; 5,563,253; 5,571,799; 5,587,361; y 5, 625, 050, algunas de las cuales son comúnmente reconocidas con esta solicitud.
Ejes de oligonucleótidos modificados preferentes
que no incluyen un átomo fosfórico en ellos tienen ejes que se
forman mediante un enlaces internucleósidos cortos de cadena de
alquilo o cicloalquilo, heteroátomos mezclados y enlaces
internucleósidos de alquilo o cicloalquilo, o uno o más enlaces
internucleósidos cortos de cadena heteroatómica o heterocíclica.
Estos incluyen aquellos que tiene enlaces morfolinos (formados en
parte a partir de una porción de azúcar de un nucleósido); ejes
siloxano; ejes de sulfuro, sulfoxido y sulfota; ejes de
form-acetilo y tioform-acetilo; ejes
de metileno form-acetilo y
tioform-acetilo; ejes que contienen alqueno; ejes
de sulfamato; ejes de metileneimino y metilenehidrazino; ejes de
sulfonato y sulfoamida; ejes de amida; y otros que tienen partes de
componentes N, O, S y CH_{2} mezcladas.
\newpage
Patentes representativas de Estados Unidos que
presentan la preparación de los oligonucleósidos anteriormente
mencionados incluyen, aunque no se limitan a: U.S.: 5,034,506;
5,166,315; 5,185,444; 5,214,134; 5,216,141; 5,235,033; 5,264,562;
5,264,564; 5,405,938; 5,434,257; 5,466,677; 5,470,967; 5,489,677;
5,541,307; 5,561,225;
5,596,086; 5,602,240; 5,610,289; 5,602,240; 5,608,046; 5,610,289; 5,618,704; 5,623,070; 5,663,312; 5,633,360;
5,677,437; y 5,677,439, algunas de las cuales son comúnmente reconocidas con esta solicitud.
5,596,086; 5,602,240; 5,610,289; 5,602,240; 5,608,046; 5,610,289; 5,618,704; 5,623,070; 5,663,312; 5,633,360;
5,677,437; y 5,677,439, algunas de las cuales son comúnmente reconocidas con esta solicitud.
En otros análogos nucleótidos preferentes, tanto
el azúcar como el enlace nucleósido, es decir, el eje, de las
unidades nucleótidas se sustituyen por grupos nuevos. Las unidades
base se mantienen para la hibridización con un compuesto objetivo
de ácido nucleico apropiado. Dicho compuesto oligomérico, un
análogo oligonucleótido que ha demostrado tener excelentes
propiedades de hibridización, es denominado como un ácido nucleico
péptido (PNA). En compuestos PNA, el eje de azúcar de un
oligonucleótido es su sustituido por un eje que contiene amida, en
particular por un eje aminoetilglicina. Las nucleobases se retienen
y se enlazan directamente o indirectamente a átomos de
aza-nitrógeno de la porción de amida del eje.
Patentes representantes que describen la preparación de compuestos
PNA incluyen, aunque no se limitan a: U.S. : 5,539,082; 5,714,331;
y 5,719,262. Se puede encontrar más información sobre los
compuestos PNA en Nielsen et al.; Science, 1991, 254,
1497-1500.
Las realizaciones preferentes de la invención
son oligonucleótidos con ejes de fosforotioato y oligonucleósidos
con ejes de heteroátomo, y en particular
-CH_{2}-NH-O-CH_{2}-,
-CH_{2}-N(CH_{3})-O-CH_{2}-
[conocido como un metileno (metillimino) o MMI],
-CH_{2}-O-N(CH_{3})-CH_{2}-,
-CH_{2}-N(CH_{3})-N(CH_{3})-CH_{2}-
y
-O-N(CH_{3})-CH_{2}-CH_{2}-
[donde el eje fosfodiéster nativo se representa como
-O-P-O-CH_{2}] de
la patente U.S arriba referenciada 5,602,240. También se consideran
preferentes los oligonucleótidos que tiene estructuras con eje de
morfolino de la patente U.S arriba referenciada 5, 034, 506.
Los oligonucleótidos modificados también pueden
contener una o más fracciones de azúcar sustituidas. Los
oligonucleótidos preferentes comprenden uno de los siguientes en la
posición 2': OH; F; O-, S-, o N-alquilo; O-, S-, o
N-alquenilo; O-, S-, o N-alquinilo;
o
O-alquilo-O-alquilo,
donde el alquilo, alquenilo y alquinilo pueden ser C_{1} a
C_{10} alquilo o C_{2} a C_{10} alquenilo o alquinilo
sustituidos o no sustituidos. En particular son preferentes
O[(CH_{2})_{n}O]_{m}
CH_{3}, O(CH_{2})_{n}OCH_{3}, O(CH_{2})_{n}NH_{2}, O(CH_{2})_{n}CH_{3}, O (CH_{2})_{n}ONH_{2}, y O(CH_{2})_{n}ON[(CH_{2})_{n}CH_{3})]_{2}, donde n y m son desde 1 a 10. Otros oligonucleótidos preferentes comprenden uno de los siguientes en la posición 2': C_{1} a C_{10} alquilo bajo, alquilo bajo sustituido, alcarilo, aralquilo, O-alcaril u O-aralquilo, SH, SCH_{3}, OCN, Cl, Br, CN, CF_{3}, OCF_{3}, SOCH_{3}, SO2CH_{3}, ONO_{2}, NO_{2}, N_{3}, NH_{2}, heterocicloalquilo, heterocicloalcarilo, aminoalquilamino, polialquilamino, silil sustituido, un grupo de partición ARN, un grupo reportero, un intercalador, un grupo para mejorar las propiedades farmacocinéticas de un oligonucleótido, o un grupo para mejorar las propiedades farmacodinámicas de un oligonucleótido, y otros sustituyentes que tienen propiedades similares. Una modificación preferente incluye 2'-metoxietoxi (2'-O-CH_{2}CH_{2}OCH_{3}, también conocido como 2'-O-(2-metoxietilo) o 2'-MOE) (Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504), es decir, un grupo alcoxialcoxi. Una modificación más preferente incluye 2'-dimetilaminooxietoxi, es decir, un grupo O (CH_{2})_{2}ON(CH_{3})_{2}, también conocido como 2'-DMOE, tal y como se describe en los ejemplos a continuación, y 2'-dimetilaminoetoxietoxi (también conocido en la técnica como 2'-O-dimetilaminoetoxietil o 2'-DMAEOE), es decir, 2'-O-CH_{2}-O-CH_{2}-N(CH_{2})_{2}, también descrito en los ejemplos a continuación.
CH_{3}, O(CH_{2})_{n}OCH_{3}, O(CH_{2})_{n}NH_{2}, O(CH_{2})_{n}CH_{3}, O (CH_{2})_{n}ONH_{2}, y O(CH_{2})_{n}ON[(CH_{2})_{n}CH_{3})]_{2}, donde n y m son desde 1 a 10. Otros oligonucleótidos preferentes comprenden uno de los siguientes en la posición 2': C_{1} a C_{10} alquilo bajo, alquilo bajo sustituido, alcarilo, aralquilo, O-alcaril u O-aralquilo, SH, SCH_{3}, OCN, Cl, Br, CN, CF_{3}, OCF_{3}, SOCH_{3}, SO2CH_{3}, ONO_{2}, NO_{2}, N_{3}, NH_{2}, heterocicloalquilo, heterocicloalcarilo, aminoalquilamino, polialquilamino, silil sustituido, un grupo de partición ARN, un grupo reportero, un intercalador, un grupo para mejorar las propiedades farmacocinéticas de un oligonucleótido, o un grupo para mejorar las propiedades farmacodinámicas de un oligonucleótido, y otros sustituyentes que tienen propiedades similares. Una modificación preferente incluye 2'-metoxietoxi (2'-O-CH_{2}CH_{2}OCH_{3}, también conocido como 2'-O-(2-metoxietilo) o 2'-MOE) (Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504), es decir, un grupo alcoxialcoxi. Una modificación más preferente incluye 2'-dimetilaminooxietoxi, es decir, un grupo O (CH_{2})_{2}ON(CH_{3})_{2}, también conocido como 2'-DMOE, tal y como se describe en los ejemplos a continuación, y 2'-dimetilaminoetoxietoxi (también conocido en la técnica como 2'-O-dimetilaminoetoxietil o 2'-DMAEOE), es decir, 2'-O-CH_{2}-O-CH_{2}-N(CH_{2})_{2}, también descrito en los ejemplos a continuación.
Otras modificaciones preferentes incluyen
2'-metoxi
(2'-O-CH_{3}),
2'-aminpropoxi
(2'-OCH_{2}CH_{2}CH_{2}NH_{2}) y
2'-fluoro (2'-F). Se pueden
realizar modificaciones similares en otras posiciones en los
oligonucleótidos, en particular en la posición 3' del azúcar en el
nucleótido terminal 3' o en los oligonucleótidos enlazados
2'-5' y en la posición 5' del nucleótido terminal
5'. Los oligonucleótidos también pueden tener análogos de azúcar,
como fracciones de ciclobutilo en lugar del azúcar pentofuranosil.
Patentes de Estados Unidos representativas que muestran la
preparación de las mencionadas estructuras de azúcar modificadas
incluyen, aunque no se limitan a: U.S.: 4,981,957; 5,118,800;
5,319,080; 5,359,044; 5,393,878; 5,446,137; 5,466,786; 5,514,785;
5,519,134; 5,567,811; 5,576,427; 5,591,722; 5,597,909;
5,610,300; 5,627,053; 5,639,873; 5,646,265; 5,658,873; 5,670,633; y 5,700,920,algunas de las cuales son comúnmente reconocidas con esta solicitud.
5,610,300; 5,627,053; 5,639,873; 5,646,265; 5,658,873; 5,670,633; y 5,700,920,algunas de las cuales son comúnmente reconocidas con esta solicitud.
Los oligonucleótidos también pueden incluir
modificaciones de nucleobases (a menudo denominadas en la técnica
simplemente "bases") o sustituciones. Tal y como aquí se
emplean, nucleobases "no modificadas" o "naturales"
incluyen las bases de purina adenina (A) y guanina (G), y las bases
pirimidina timina (T), citosina (G) y uracilo (U). Las nucleobases
modificadas incluyen otras nucleobases sintéticas o naturales tales
como 5'-metilcitosina
(5-me-C),
5-hidroximetil citosina, xantina, hipoxantina,
2-amino adenina, 6-metil y otros
derivados de alquil de adenina y guanina, 2-propil
y otros derivados de alquil de adenina y guanina,
2-tiouracilo, 2-tiotimina y
2-tiocistina, 5-halouracilo y
citosina, 5-propinil uracilo y citosina,
6-azo uracilo, citosina y timina,
5-uracilo (pseudouracilo),
4-tiouracilo, 8-halo,
8-amino, 8-tiol,
8-tioalquil, 8-hidroxil y otras
adeninas y guaninas 8-sustituidas,
5-halo particularmente 5-bromo,
5-trifluorometil y otros uracilos y citosinas
5-sustituidos, 7-metilguanina y
7-metiladenina, 8-azaguanina y
8-azaadenina, 7-deazaguanina y
7-deazaadenina y 3-deazaguanina y
3-deazaadenina. Nucleobases adicionales incluyen
aquellas descritas en la Patente de Estados Unidos Nº 3,687,808,
aquellas descritas en The Concise Encyclopedia Of Polymer
Science And Engineering, páginas 858-859,
Kroschwitz, J. II, ed. John Wiley & Sons, 1990, aquellas
descritas por Engisch et al., Angewandte Chemie, Edición
Internacional, 1991, 30, 613, y aquellas descritas por Sanghvi, Y.
S. Capítulo 15, Antisense Research And Applications, páginas
289-302, Croque, S.T. y Lebleu, B., ed., CRC Press,
1993. Algunas de estas nucleobases resultan particularmente útiles
para aumentar la afinidad de enlace de los compuestos oligoméricos
de la invención. Estos incluyen 5-pirimidinas
sustituidas, 6-azapiramidinas y N-2,
N-6 y O-6 purinas sustituidas,
incluyendo 2-aminopropiladenina,
5-propiniluracilo y
5-propinilcitosina. Las sustituciones
5-metilcitosina han demostrado aumentar la
estabilidad doble de ácido nucleico mediante
0-6-1.2ºC (Sanghvi, Y. S., Croque y
Lebelu, B. eds., Antisense Research And Applications, CRC
Press, Boca Raton, 1003, páginas 276-278) y son en
el presente sustituciones base preferentes, incluso más en
particular cuando se combinan con modificaciones de azúcar
2'-O-metoxietil.
Patentes de Estados Unidos representativas que
muestran la preparación de algunas de las nucleobases modificadas
anteriormente mencionadas así como otras nucleobases modificadas
incluyen, aunque no están limitadas a: U.S. 3,687,808, as well as
U.S.: 4,845,205; 5,130,302; 5,134,066; 5,175,273; 5,367,066;
5,432,272; 5,457,187; 5,459,255; 5,484,908; 5.502,177; 5,525,711;
5,552,540; 5,587,469; 5,594,121, 5,596,091; 5,614,617; y 5,681,941,
algunas de las cuales son comúnmente reconocidas con esta
solicitud, y la Patente de Estados Unidos 5,750,692, que comúnmente
es reconocida con la presente solicitud.
Otras modificaciones de los oligonucleótidos de
la invención incluyen enlazar químicamente con el nucleótido una o
más fracciones o conjugados que aumentan la actividad, la
distribución celular o la respuesta celular del oligonucleótido.
Tales fracciones incluyen aunque no se limitan a fracciones lípidas
como el radical de colesterol (Letsinger et al, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553-6556), ácido cólico
(Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let.., 1994, 4,
1053-1060), un tioéter, por ejemplo,
hexil-S-tritiltiol (Manoharan et
al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3,
2765-2770), un tiocolesterol (Oberhauser et
al., Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533-538), una
cadena alifática, por ejemplo, residuos dodecandiol o undecilo
(Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10,
1111-1118; Kabanov et al., FEBS Left., 1990,
259, 327-330; Svinarchuk et al., Biochimie,
1993, 75, 49-54), un fosfolípido, por ejemplo,
di-hexadecil-rac-glicerol
o rietilamonio
1,2-di-O-hexadecil-rac-glicero-3-H-fosfonato
(Manoharan et al., Tetrahedron Left., 1995, 36,
3651-3654; Shea et al., Nucl. Acids Res.,
1990, 18, 3777-3783), una poliamina o una cadena de
polietileno glicol (Manoharan et al., Nucleosides &
Nucleotides, 1995, 14, 969-973), o ácido de
adamantano acético (Manoharan et al., Tetrahedron Left.,
1995, 36, 3651-3654), un radical palmitil (Mishra
et al., Biochim. Biphys. Acta, 1995, 1264,
229-237), o una fracción actadecilamina o
hexilamino-carbonil-oxicolesterol
(Croque et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277,
923-937.
Patentes de Estados Unidos representativas que
presentan la preparación de tales conjugado de oligonucleótidos
incluyen, aunque no están limitadas a: 4,828,979; 4,948,882;
5,218,105; 5,525,465; 5,541,313; 5,545,730; 5,552,538;
5,578,717,5,580,731; 5,580,731; 5,591,584; 5,109,124; 5,118,802;
5,138,045; 5,414,077; 5,486,603; 5,512,439;
5,578,718; 5,608,046; 4,587,044; 4,605,735; 4,667,025; 4,762,779; 4,789,737; 4,824,941; 4,835,263; 4,876,335;
4,904,582; 4,958,013; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,245,022; 5,254,469;
5,258,506; 5,262,536; 5,272,250; 5,292,873; 5,317,098; 5,371,241, 5,391,723; 5,416,203, 5,451,463; 5,510,475;
5,512,667; 5,514,785; 5,565,552; 5,567,810; 5,574,142; 5,585,481; 5,587,371; 5,595,726; 5,597,696; 5,599,923;
5,599,928 y 5,688,941, algunas de las cuales son comúnmente reconocidas con esta solicitud.
5,578,718; 5,608,046; 4,587,044; 4,605,735; 4,667,025; 4,762,779; 4,789,737; 4,824,941; 4,835,263; 4,876,335;
4,904,582; 4,958,013; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,245,022; 5,254,469;
5,258,506; 5,262,536; 5,272,250; 5,292,873; 5,317,098; 5,371,241, 5,391,723; 5,416,203, 5,451,463; 5,510,475;
5,512,667; 5,514,785; 5,565,552; 5,567,810; 5,574,142; 5,585,481; 5,587,371; 5,595,726; 5,597,696; 5,599,923;
5,599,928 y 5,688,941, algunas de las cuales son comúnmente reconocidas con esta solicitud.
No es necesario que todas las posiciones en un
compuesto determinado se modifiquen de manera uniforme, y de hecho
más de una de las modificaciones anteriormente mencionadas puede
incorporarse en un único compuesto o incluso en un único nucleósido
en un oligonucleótido. La presente invención también incluye
compuestos antisentido que son compuestos quiméricos. Compuestos
antisentido "quiméricos" o "quimeras", en el contexto de
esta invención, son compuestos antisentido, en particular
oligonucleótidos, que contienen dos o más regiones químicamente
distintas, cada una de ellas hecha por al menos una unidad de
monómero, es decir, un nucleótido en el caso de un compuesto
oligonucleótido. Estos oligonucleótidos normalmente contiene al
menos una región donde el oligonucleótido se modifica de modo que
otorgue al oligonucleótido mayor resistencia a la degradación
nucleasa, mayor respuesta celular, y/o mayor afinidad de enlace
para el ácido nucleico objetivo. Una región adicional del
oligonucleótido puede servir como un sustrato para enzimas capaz de
dividir híbridos ARN:ADN o ARN:ARN. Como modo de ejemplo, ARNasa H
es una endonucleasa celular que divide la cadena de ADN de un
dúplex ARN:ADN. Por lo tanto, la activación de ARAsa H da como
resultado la división del ARN objetivo, aumentando de este modo y
en gran medida la eficacia de la inhibición del oligonucleótido de
la expresión genética. Como consecuencia, los resultados
comparables pueden obtenerse a menudo con oligonucleótidos más
cortos cuando se emplean oligonucleótidos quiméricos, en
comparación con deoxioligonucleótidos de fosforotioato que
hibridizan la misma región objetivo. La división del ARN objetivo
puede detectarse de modo rutinario mediante electroforesis en gel
y, si es necesario, mediante técnicas de hibridización con ácido
nucleico asociado conocidas en la técnica.
Los compuestos antisentido quiméricos de la
invención pueden formarse como estructuras compuestas de dos o más
oligonucleótidos, oligonucleótidos modificados, oligonucleósidos y/o
análogos de oligonucleótido tal y como se ha descrito
anteriormente. Tales compuestos también han sido referidos en la
técnica como híbridos o gapmers. Patentes representativas de
Estados Unidos que muestran la preparación de dichas estructuras
híbridas incluyen, aunque no se limitan a:U.S.:5,013,830, 5,149,797;
5,220,007; 5,256,775; 5,366,878; 5,403,711; 5,491,133; 5,565,350;
5,623,065; 5,652,355; 5,652,356; y 5,700, algunas de las cuales son
comúnmente reconocidas con esta solicitud.
Los compuestos antisentido empleados de acuerdo
con esta invención pueden realizarse de manera conveniente y
rutinaria por medio de técnicas bien conocidas y de síntesis con
fase sólida. Los equipos para dicha síntesis se venden en varios
distribuidores incluyendo, por ejemplo, Applied Biosystems (Foster
City, CA). También se pueden emplear adicionalmente o
alternativamente para dicha síntesis. Es bien conocido que se
emplean técnicas similares para preparar oligonucleótidos como los
fosforotioatos y derivados alquilatados.
Los compuestos antisentido de la invención se
sintetizan in vitro y no incluyen composiciones antisentido
de origen biológico, o construcciones con vector genético diseñadas
para dirigir la síntesis in vitro de las moléculas
antisentido. Los compuestos de la invención también pueden
mezclarse, encapsularse, conjugarse o sino asociarse con otras
moléculas, estructuras moleculares o mezclas de compuestos, como
por ejemplo, liposomas, moléculas dirigidas al receptor,
formulaciones orales, rectales, tópicas u otras, para ayudar en la
respuesta, distribución y/o absorción. Patentes representativas de
Estados Unidos que describen la preparación dicha respuesta,
distribución y/o absorción que ayudan a las formulaciones incluyen,
aunque no de manera limitada: U.S.: 5,108,921; 5,354,844;
5,416,016; 5,459,127; 5,521,291; 5,543,158; 5,547,932; 5,583,020;
5,591,721; 4,426,330; 4,534,899; 5,013,556; 5,108,921; 5,213,804;
5,227,170;
5,264,221; 5,356,633; 5,395,619; 5,416,016; 5,417,978; 5,462,854; 5,469,854; 5,512,295; 5,527,528; 5,534,259;
5,543,152; 5,556,948; 5,580,575; y 5, 595, 756.
5,264,221; 5,356,633; 5,395,619; 5,416,016; 5,417,978; 5,462,854; 5,469,854; 5,512,295; 5,527,528; 5,534,259;
5,543,152; 5,556,948; 5,580,575; y 5, 595, 756.
Los compuestos antisentido de la invención
comprenden sales farmacéuticamente aceptables, esteres, o sales de
dichos esteres, o cualquier otro compuesto que, tras la
administración a un animal incluyendo un humano, sea capaz de
proporcionar (directamente o indirectamente) el metabolito
biológicamente activo o un residuo del mismo. Por consiguiente, por
ejemplo, la descripción también engloba profármacos y sales
farmacéuticamente aceptables de los compuestos de la invención,
sales farmacéuticamente aceptables de dichos profármacos y otros
bioequivalentes.
El término "profármaco" indica un agente
terapéutico que se prepara de una forma inactiva que se convierte
en una forma activa (es decir, un fármaco) en el interior del
cuerpo o las células de éste mediante la acción de enzimas
endógenas u otras sustancias químicas y/o condiciones. En
particular, las versiones profármacos de los oligonucleótidos de la
invención se preparan como derivados SATE
[(S-acetil-2-tioetil)fosfato]
de acuerdo con los métodos descritos en WO 93/24510 de Gosselin
et al., publicado en 9 de diciembre, 1993, o en WO 94/26764
de Imbach et al.
El término "sales farmacéuticamente
aceptables" hace referencia a sales fisiológicamente y
farmacéuticamente aceptables de los compuestos de la invención, es
decir, sales que retienen la actividad biológica deseada del
compuesto matriz y que no imparten los efectos toxicológicos no
deseados del mismo.
Las sales de adición de base farmacéuticamente
aceptables se forman con metales o aminas, como metales terrestres
alcali o alcalina o aminas orgánicas. Ejemplos de metales empleados
como cationes son el sodio, potasio, magnesio, calcio, y similares.
Ejemplos de aminas adecuadas son
N,N'-dibenziletilenediamina, cloroprocaína, colina,
dietanolamina, diciclohexilamina, etilenediamina,
N-metilglucamina, y procaína (ver, por ejemplo,
Bege et al., "Pharmaceutical Salts", J. of Pharma ZIL,
1977, 66, 1-19). Las sales de adición base de
dichos compuestos ácidos se preparan poniendo en contacto la forma
libre de ácido con una cantidad suficiente de la base deseada para
producir la sal de la manera convencional. La forma libre de ácido
puede regenerarse poniendo en contacto la forma de sal con un ácido
y aislando la forma libre de ácido de la manera convencional. Las
formas libres de ácido difieren de sus respectivas formas con sal
en ciertas propiedades físicas como la solubilidad en disolventes
polares, pero sino las sales son equivalentes a sus respectivas
formas libres de ácido para los fines de la presente invención.
Como aquí se emplea, una "sal de adición farmacéutica" incluye
una sal farmacéuticamente aceptable de una forma ácida de uno de
los componentes de la composición de la invención. Estos incluyen
sales ácidas orgánicas e inorgánicas de las aminas. Las sales
ácidas preferentes son los hidrocloruros, acetatos, salicilatos,
nitratos y fosfatos. Otras sales farmacéuticamente aceptables son
bien conocidas por aquellos expertos en la técnica e incluyen sales
básicas de una variedad de ácidos orgánicos e inorgánicos, como por
ejemplo, con ácidos inorgánicos, como por ejemplo, ácido
hidroclórico, ácido hidrobrómico, ácido sulfúrico o ácido fosfórico;
con ácidos orgánicos carboxílicos, sulfónicos, sulfa o fosfo o
ácidos sulfámicos N-sustituidos, por ejemplo, ácido
acético, ácido propiónico, ácido glicólico, ácido succínico, ácido
maleico, ácido hidroximaleico, ácido metilmaleico, ácido fumárico,
ácido málico, ácido tartárico, ácido láctico, ácido oxálico, ácido
glucónico, ácido glucárico, ácido glucurónico, ácido cítrico, ácido
benzoico, ácido cinnámico, ácido mandélico, ácido salicílico, ácido
4-aminosalicílico, ácido
2-fenoxibenzoico, ácido
2-acetoxibenzoico, ácido embónico, ácido nicotínico
o ácido isonicotínico; y con aminoácidos, como los ácidos 20
alfa-amino implicados en la síntesis de proteínas en
la naturaleza, por ejemplo ácidos glutámicos o ácido aspártico, y
también con ácido fenilacético, ácido metanosulfónico, ácido
etanosulfónico, ácido 2-hidroxietanosulfónico, ácido
etano-1,2,disulfónico, ácido benzanosulfónico,
ácido 4-metilbenzanosulfoico, ácido
naftaleno-2-sulfónico, ácido
nafataleno-1,5-disulfónico, 2- o
3-fosfoglicerato,
glucosa-6-fosfato, ácido
N-ciclohexilsulfámico (con la formación de
ciclamatos), o con otros compuestos ácidos orgánicos, como el ácido
ascórbico. Las sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos
pueden a su vez prepararse con un catión farmacéuticamente
aceptable. Los cationes adecuados farmacéuticamente aceptables son
bien conocidos por aquellos expertos en la técnica e incluyen
alcalina, alcalina terrestre, amonio y cationes de amonio
cuaternarios. Los carbonatos y los carbonatos de hidrógeno también
son posibles.
Para los oligonucleótidos, los ejemplos
preferentes de sales farmacéuticamente aceptables incluyen, aunque
no se limitan a, (a) sales formadas con cationes como el sodio,
potasio, amonio, magnesio, calcio, poliaminas como la espermina o
espermidina, etc.; (b) sales de adición ácidas formadas con ácidos
inorgánicos, por ejemplo ácido hidroclórico, ácido hidrobrómico,
ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido nítrico y similares; (c)
sales formadas con ácidos orgánicos como, por ejemplo, ácido
acético, ácido oxálico, ácido tartárico, ácido succínico, ácido
maleico, ácido fumárico, ácido glucónico, ácido cítrico, ácido
málico, ácido ascórbico, ácido benzoico, ácido tánico, ácido
palmítico, ácido algínico, ácido poliglutámico, ácido
naftalenosulfónico, ácido metanosulfónico, ácido
p-toluonosulfónico, ácido naftalenodisulfónico,
ácido poligalacturónico, y similares; y (d) sales formadas a partir
de aniones elementales tales como cloro, bromo y yodo.
Los compuestos antisentido de la presente
invención puede utilizarse para diagnóstico, terapia, profilaxis y
como reagentes de investigación y kits. Para terapia, se trata un
animal, preferentemente un humano, sospechoso de tener una
enfermedad o desorden que puede tratarse modulando la expresión de
PTP1B administrándole compuestos antisentido de acuerdo con esta
invención. Los compuestos de la invención pueden utilizarse en
composiciones farmacéuticas añadiendo una cantidad efectiva de un
compuesto antisentido a un diluyente o portador farmacéuticamente
aceptable. El uso de los compuestos antisentido y los métodos de la
invención también pueden resultar útiles profilácticamente, es
decir, para prevenir o retrasar la infección, la inflamación o la
formación del tumor, a modo de ejemplo.
Los compuestos antisentido de la invención son
útiles para investigación y diagnóstico por que estos compuestos
pueden hibridizarse con ácidos nucleicos codificadores de PTP1B,
permitiendo que el ensayo sándwich y otros ensayos puedan llevarse
a cabo de manera sencilla para explotar este hecho. La
hibridización de los oligonucleótidos antisentido de la invención
con un ácido nucleico codificador de PTP1B puede detectarse a
través de medios conocidos en la técnica. Tales medios pueden
incluir la conjugación de una enzima con el oligonucleótido, el
radioetiquetamiento del oligonucleótido o cualquier otro método
adecuado de detección. Los kits que emplean tales medios de
detección para detectar el nivel de PTP1B en una muestra también
pueden prepararse.
La presente invención también incluye
composiciones farmacéuticas y formulaciones que incluyen los
compuestos antisentido de la invención. Las composiciones
farmacéuticas de la presente invención pueden administrarse de un
número de formas dependiendo de si se desea un tratamiento local o
sistémico y del área a ser tratada. La administración puede ser
tópica (incluyendo la mucosa oftálmica y mucosa e incluyendo el
envío vaginal y rectal), pulmonar, por ejemplo, por inhalación o
insuflación de polvos o aerosoles, incluyendo mediante nebulizador;
intratraqueal, intranasal, epidérmico y transdérmico), oral o
parenteral. La administración parenteral incluye la inyección o
infusión intravenosa, intraarterial, subcutánea, intraperitoneal o
intramuscular; o intracraneal, por ejemplo, administración
intratecal o intraventricular. Se cree que los oligonucleótidos con
al menos una modificación
2'-O-metoxietil son particularmente
útiles para administración oral.
Las composiciones y formulaciones farmacéuticas
para administración tópica incluyen parches transdérmicos, pomadas,
lociones, cremas, geles, gotas, supositorios, sprays, líquidos y
polvos. Los portadores farmacéuticos convencionales, las bases
acuosas, en polvo o aceitosas, los espesantes y similares pueden
ser necesarios o deseables. Los preservativos cubiertos, guantes y
similares también pueden ser útiles.
Las composiciones y formulaciones para
administración oral incluyen polvos y gránulos, suspensiones o
soluciones en agua o medio no acuoso, cápsulas, sobres o pastillas.
Los espesantes, agentes aromatizantes, diluyentes, emulsionantes,
ayudas dispersadotas o aglutinantes también pueden ser
deseable.
Las composiciones y formulaciones para
administración parenteral, intratecal o intraventricular pueden
incluir soluciones acuosas estériles que pueden contener búferes,
diluyentes y otros aditivos adecuados como, aunque sin limitarse,
potenciadores de penetración, compuestos portadores y otros
portadores y excipientes farmacéuticamente aceptables.
Las composiciones farmacéuticas de la presente
invención incluyen, aunque sin limitarse a, soluciones, emulsiones,
y formulaciones que contiene liposomas. Estas composiciones pueden
generarse a partir de una variedad de componentes que incluye,
aunque no se limitan a, líquidos preformados, sólidos
auto-emulsionantes y semisólidos
auto-emulsionantes.
Las formulaciones farmacéuticas de la presente
invención, que pueden presentarse cómodamente en forma de unidad de
dosis, pueden prepararse de acuerdo con las técnicas
convencionales bien conocidas en la industria farmacéutica. Tales
técnicas incluyen el paso de asociar los ingredientes activos con
los portadores o excipientes farmacéuticos. En general, las
formulaciones se preparan asociando de manera uniforme e íntima los
ingredientes activos con portadores líquidos o portadores sólidos
finamente divididos o ambos, y a continuación dando forma al
producto en caso de que sea necesario.
Las composiciones de la presente invención
pueden formularse en cualquiera de las muchas formas de dosis
posibles como, aunque sin limitarse a, pastillas, cápsulas, jarabes
líquidos, geles suaves, supositorios y enemas. Las composiciones de
la presente invención pueden también formularse como suspensiones
en medios acuosos, no acuosos o una mezcla de los mismos. Las
suspensiones acuosas pueden además contener sustancias que
incrementan la viscosidad de la suspensión y que incluyen, por
ejemplo, carboximetilcelulosa sódica, sorbitol y/o dextrano. La
suspensión también puede contener estabilizadores.
En una realización de la presente invención, las
composiciones farmacéuticas pueden formularse y emplearse como
espumas. Las espumas farmacéuticas incluyen formulaciones como,
aunque sin limitarse a, emulsiones, microemulsiones, cremas,
gelatinas y liposomas. A pesar de que básicamente estas
formulaciones son similares en naturaleza, sus componentes y la
consistencia del producto final pueden variar. La preparación de
dichas composiciones y formulaciones generalmente es conocida por
aquellos expertos en la técnica farmacéutica y en la formulación y
puede aplicarse a la formulación de las composiciones de la
presente invención.
Las composiciones de la presente invención
pueden prepararse y formularse como emulsiones. Las emulsiones son
normalmente sistemas heterogéneos de un líquido disperso en otro en
la forma de pequeñas gotas que normalmente exceden de 0.1 \mum en
diámetro. (Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman,
Rieger and Baker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y.,
volumen 1, p. 199; Rosoff, en Pharmaceutical Dosage Forms,
Lieberman, Rieger and Baker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New
York, N.Y., volumen 1, p. 245; Block en Pharmaceutical Dosage
Forms, Lieberman, Rieger and Baker (Eds.), 1988, Marcel Dekker,
Inc., New York, N.Y., volumen 1, p. 335; Higuchi et al., en
Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co.,
Easton, PA, 1985, p. 301). Las emulsiones a menudo son sistemas
bifásicos que comprenden dos fases líquidas inmiscibles íntimamente
mezcladas y dispersas entre sí. En general, las emulsiones pueden
ser bien de la variedad agua en aceite (w/o) o aceite en agua
(w/o). Cuando una fase acuosa se divide finamente y se dispersa en
forma de gotitas diminutas en una base aceitosa a granel la
composición resultante se llama una emulsión agua en aceite (w/o).
De manera alternativa, cuando una fase aceitosa se divide finamente
y se dispersa en forma de gotitas diminutas en una fase acuosa a
granel la composición resultante se llama aceite en agua (o/w). Las
emulsiones pueden contener componentes adicionales además de las
fases dispersas tanto en la fase acuosa como en la fase aceitosa o
como una fase separada. Los excipientes farmacéuticos como los
emulsionantes, estabilizadores, colorantes y antioxidantes pueden
también estar presentes en la emulsiones en caso de ser necesarios.
Las emulsiones farmacéuticas pueden también ser emulsiones
múltiples que están formadas por más de dos fases como, por ejemplo
en el caso de emulsiones aceite en agua en aceite (o/w/o) y agua en
aceite en agua (w/o/w). Tales formulaciones complejas a menudo
proporcionan ciertas ventajas que las emulsiones binarias simples
no facilitan. Las emulsiones múltiples en las que gotitas
individuales de aceite de una emulsión o/w incluyen pequeñas gotas
de agua constituyen una emulsión w/o/w. De la misma manera, un
sistema de gotas de aceite incluido en glóbulos de agua
estabilizada en un continuo aceitoso proporciona una emulsión
o/w/o.
Las emulsiones se caracterizan por tener poca o
nada de estabilidad termodinámica. A menudo, la fase dispersa o
discontinua de la emulsión se dispersa correctamente en la fase
externa o continua y se mantiene en esta forma a través de medios
emulsionantes o la viscosidad de la formulación. Cualquiera de las
fases de la emulsión puede ser semisólida o sólida, como en el caso
de bases para pomadas y cremas de estilo emulsión. Otros medios
para estabilizar emulsiones implican el uso de emulsionantes que
pueden incorporarse en cualquiera de las fases de la emulsión. Los
emulsionantes pueden clasificarse en líneas generales en cuatro
categorías: surfactantes sintéticos, emulsionantes que ocurren de
manera natural, bases de absorción, y sólidos finamente dispersos
(Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger
and Baker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y.,
volumen 1, p. 199).
Los surfactantes sintéticos, también conocidos
como agentes activos superficiales, han encontrado una amplia
aplicabilidad en la formulación de emulsiones y han sido citados en
la bibliografía (Rieger, en Pharmaceutical Dosage Forms,
Lieberman, Rieger and Baker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New
York, N.Y., volumen 1, p.285, Idson, en Pharmaceutical Dosage
Forms, Lieberman, Rieger and Baker (Eds.), 1988, Marcel Dekker,
Inc., New York, N.Y., volumen 1, p.199). Los surfactantes son
normalmente anfifílicos y comprende una parte hidrofílica y una
parte hidrofóbica. El radio de la naturaleza hidrofílica a la
hidrofóbica del surfactante ha sido denominado balance
hidrófilo/lipófilo (HLB) y es considerada una valiosa herramienta
para categorizar y seleccionar surfactantes en la preparación de
formulaciones. Los surfactantes pueden clasificarse en diferentes
clases en base a la naturaleza del grupo hidrofílico:
no-iónico, aniónico, catiónico y anfotérico (Rieger
en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Baker
(Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volumen 1,
p.285).
Los emulsionantes que ocurren de manera natural
empleados en formulaciones de emulsiones incluyen lanolina, cera
estampada, fosfatidos, lecitina y acacia. Las bases de absorción
poseen propiedades hidrofílicas como la de absorber agua para
formar emulsiones w/o y retener sus consistencias semisólidas, como
la lanolina anhidro y el petrolato hidrofílico. Los sólidos
finamente divididos también se han empleado como buenos
emulsionantes sobre todo en combinación con surfactantes y en
preparaciones viscosas. Estos incluyen sólidos polares inorgánicos,
como los hidróxidos de metales pesados, arcillas no hinchables como
la bentonita, atapulgita, hectorita, caolín, montmorillonita,
silicato de aluminio coloidal y silicato de aluminio de magnesio
coloidal, pigmentos y sólidos no polares como el carbono o
tristearato de glicerina.
Una gran variedad de materiales no emulsionantes
también se incluyen en formulaciones de emulsiones y contribuyen a
las propiedades de las emulsiones. Estos incluyen grasas, aceites,
ceras, ácidos grasos, alcoholes grasos, ésteres grasos,
humectantes, coloides hidrofílicos, conservantes y antioxidantes
(Block, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and
Baker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volumen 1,
p. 335; Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman,
Rieger and Baker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y.,
volumen 1, p. 199).
Los coloides hidrofílicos o hidrocoloides
incluyen gomas que ocurren de manera natural y polímeros sintéticos
como los polisacáridos (por ejemplo, acacia, agar, ácido algínico,
carragenina, goma guar, goma Baraya, y goma tragacanto), derivados
de la celulosa (por ejemplo, carboximetilcelulosa y
carboxipropilcelulosa), y polímeros sintéticos (por ejemplo,
carbómeros, éteres de celulosa, y polimeros de carboxivinilo). Estos
se dispersan o hinchan en agua para formar soluciones coloidales
que estabilizan las emulsiones formando fuertes capas interfaciales
alrededor de las gotas de fase dispersa e incrementando la
viscosidad de la fase externa.
Debido a que las emulsiones a menudo contienen
un número de ingredientes tales como los carbohidratos, proteínas,
esteroles y fosfatidos que fácilmente mantienen el crecimiento de
microbios, estas formulaciones con frecuencia incorporan
conservantes. Los conservantes comúnmente empleados incluidos en
formulaciones de emulsiones son metil parabeno, propil parabeno,
sales cuaternarias de amonio, cloruro de benzalconio, ésteres de
ácido p-hidroxibenzoico, y ácido bórico. Los
antioxidantes también se añaden con frecuencia a las formulaciones
para emulsiones para evitar la deterioración de la formulación. Los
antioxidantes empleados pueden ser neutralizadores o bloqueadores
de radicales libres como tocoferoles, galatos de alquilo,
hidroxianisola butilada, hidroxitolueno butilado, o agentes
reductores como ácido ascórbico y metabisulfito sódico, y
sinergistas antioxidantes como el ácido cítrico, ácido tartárico, y
lecitina.
La aplicación de las formulaciones para emulsión
por medio de rutas dermatológica, oral y parenteral y los métodos
para su fabricación han sido recogidos en la bibliografía (Idson,
en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Baker
(Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volumen 1, p.
199). Las formulaciones para emulsión para envío oral se han
empleado de manera más frecuente debido a razones de facilidad en
la formulación, eficacia de absorción y desde el punto de vista de
biodisponibilidad (Rosoff, en Pharmaceutical Dosage Forms,
Lieberman, Rieger and Baker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New
York, N.Y., volumen 1, p. 245; Idson, en Pharmaceutical Dosage
Forms, Lieberman, Rieger and Baker (Eds.), 1988, Marcel Dekker,
Inc., New York, N.Y., volumen 1, p. 199). Los laxantes con base
mineral-aceite, las vitaminas solubles en aceite y
las preparaciones nutritivas altas en grasa son algunos de los
materiales que normalmente se han administrado oralmente como
emulsiones o/w.
En una realización de la presente invención, las
composiciones de oligonucleótidos y ácidos nucleicos se formulan
como microemulsiones. Una microemulsión puede definirse como un
sistema de agua, aceite y anfifilo que es una única solución
líquida óptimamente isotrópica y termodinámicamente estable
(Rosoff, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger
and Baker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y.,
volumen 1, p. 245). Normalmente, las microemulsiones son sistemas
que se preparan en primer lugar dispersando un aceite en una
solución surfactante acuosa y a continuación añadiendo una cantidad
suficiente de un cuarto componente, generalmente un alcohol
intermediario de longitud de cadena para formar un sistema
transparente. Por lo tanto, las microemulsiones se han descrito
como termodinámicamente estables, dispersiones isotrópicamente
claras de dos líquidos inmiscibles que se estabilizan mediante
capas interfaciales de moléculas con superficie activa (Leung y
Shah, en: Controlled Release Of Drugs: Polymers and Aggregate
Systems, Rosoff, M. Ed., 1989, VCH Publishers, New York, páginas
185-215). Las microemulsiones normalmente se
preparan mediante una combinación de tres a cinco componentes que
incluyen aceite, agua, surfactante, cosurfactante y electrolito. Si
la microemulsión es del tipo agua en aceite (w/o) o del tipo aceite
en agua (o/w) depende de las propiedades del aceite y el
surfactante empleados y de la estructura y el embalaje geométrico
de las cabezas polares y las colas de hidrocarbono de las moléculas
surfactantes (Schott, en Remington's Pharmaceutical
Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1985, p. 271).
El enfoque fenomenológico que emplea diagramas
de fase se ha estudiado en profundidad y ha producido un
conocimiento exhaustivo para un experto en la técnica sobre cómo
formular emulsiones (Rosoff, en Pharmaceutical Dosage Forms,
Lieberman, Rieger and Baker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New
York, N.Y., volumen 1, p. 245; Block, en Pharmaceutical Dosage
Forms, Lieberman, Rieger and Baker (Eds.), 1988, Marcel Dekker,
Inc., New York, N.Y., volumen 1, p. 335). En comparación con las
emulsiones convencionales, las microemulsiones con frecuencia
ofrecen la ventaja de solubilizar fármacos insolubles en agua en
una formulación de pequeñas gotas termodinámicamente estables que
se forman de manera espontánea.
Los surfactantes empleados en la preparación de
microemulsiones incluyen, aunque no se limitan a, surfactantes
iónicos, surfactantes no iónicos, Brij 96, éteres polioxietileno
oleil, ésteres ácidos grasos de poliglicerol, monolaurato de
tetraglicerol (ML310), monooleato de tetraglicerol (MO310),
monooleato de hexaglicerol (PO310), pentaoleato de hexaglicerol
(PO500), monocrapato de decaglicerol (MCA750), monooleato de
decaglicerol (MO750), sequiolato de decaglicerol (SO750),
decaoleato de decaglicerol (DA0750), solos o en combinación con
cosurfactantes. El cosurfactante, normalmente un alcohol de cadena
corta como el etanol, 1-propanol, y
1-butanol, sirve para incrementar la fluidez
interfacial penetrando en la capa surfactante y como consecuencia
creando una capa desordenada del espacio vacío generado entre las
moléculas surfactantes. Sin embargo, las microemulsiones pueden
prepararse sin el uso de cosurfactantes y los sistemas de
microemulsión auto-emulsionantes y libres de
alcohol son conocidos en la técnica. La fase acuosa puede ser
normalmente, aunque no se limita a, agua, una solución acuosa del
fármaco, glicerol, PEG300, PEG400, poligliceroles, glicoles de
propileno, y derivados de glicol de etileno. Las fase aceitosa
incluye, aunque no se limita a, materiales tales como Captex 300,
Captex 355, Capmul MCM, ésteres ácidos grasos, cadena media
(C8-C12), mono-, di-, y
tri-glicéridos, ésteres ácidos grasos de gliceril
polioxietilados, alcoholes grasos, gliceridos poliglicolizados,
gliceridos C8-C10 poliglicolizados saturados,
aceites vegetales y aceite de silicona.
Las microemulsiones resultan particularmente
interesantes desde el punto de vista de la solubilización
farmacéutica y la absorción incrementada de los fármacos. Se han
propuesto las microemulsiones con base lípida (tanto w/o como o/w)
para incrementar la biodisponibilidad oral de los fármacos,
incluyendo los péptidos (Constantidines et al., Pharmaceutical
Research, 1994, 11, 1385-1390; Ritschel,
Meth. Find. Exp. Clin. Pharmacol., 1993, 13, 205). Las
microemulsiones tienen ventajas como la de mejorar la
solubilización de un fármaco, la protección del fármaco frente a la
hidrólisis enzimática, la posible mejora de la absorción del fármaco
debido a las alteraciones provocadas por el surfactante en la
fluidez y permeabilidad de la membrana, y a la toxicidad disminuida
(Constantidines et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11,
1385; Ho et al., J. Pharm. Sci., 1996, 85,
138-143). A menudo, las microemulsiones pueden
formarse de manera espontánea cuando sus componentes se unen a
temperatura ambiente. Este hecho puede resultar particularmente
ventajoso cuando se formulan medicamentos termolábiles, péptidos y
oligonucleótidos. Las microemulsiones han resultado efectivas en el
envío transdérmico de componentes activos tanto en aplicaciones
cosméticas como farmacéuticas. Se espera que las composiciones y
las formulaciones para microemulsión de la presente invención
faciliten la absorción sistemática incrementada de los
oligonucleótidos y ácidos nucleicos desde el tracto
gastrointestinal, así como la mejora de la respuesta celular local
de los oligonucleótidos y ácidos nucleicos en el interior del
tracto gastrointestinal, la vagina, la cavidad bucal y otras áreas
de administración.
Las microemulsiones de la presente invención
también pueden contener componentes adicionales y aditivos como el
monoestearato de sorbitan (Grill 3), Labrasol, y potenciadores para
la penetración para incrementar las propiedades de la formulación y
aumentar la absorción de los oligonucleótidos y ácidos nucleicos de
la presente invención. Los potenciadores para la penetración
empleados en las microemulsiones de la presente invención pueden
clasificarse por pertenecer a una de las cinco amplias
categorías-surfactantes, ácidos grasos, sales
biliares, agentes quelantes, y agentes no quelantes y no
surfactantes (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug
Carrier Systems, 1991, p. 92). Cada una de estas clases se ha
descrito con anterioridad.
Además de las microemulsiones existen muchas
estructuras surfactantes organizadas que han sido estudiadas y
empleadas para la formulación de fármacos. Estas estructuras
incluyen monocapas, micelas, bicapas y vesículas. Las vesículas,
como los liposomas han atraído un gran interés debido a su
especificidad y a la duración de acción que ofrecen desde el punto
de vista de envío del fármaco. Como se emplea en la presente
invención, el término "liposoma" significa una compuesta por
lípidos anfílicos colocados en una bicapa esférica o en
bicapas.
Los liposomas son vesículas unilamelar o
multilamelares que tienen una membrana formada por un material
lipofílico y con un interior acuoso. La parte acuosa contiene la
composición que se va a enviar. Los liposomas catiónicos poseen la
ventaja de ser capaces de fusionarse con la pared celular. Los
liposomas no catiónicos, a pesar de que no son capaces de fusionarse
de manera eficiente con la pared celular, son absorbidos por
macrófagos in vivo.
Con el fin de cruzar piel mamífera intacta, las
vesículas lípidas deben pasar a través de una serie de poros finos,
cada uno con diámetro inferior a los 5 mm, bajo la influencia de un
gradiente transdérmico adecuado. Por lo tanto, resulta deseable
emplear un liposoma que sea elevadamente deformable y capaz de
pasar a través de dichos poros finos.
Ventajas adicionales de los liposomas incluyen;
liposomas obtenidos a partir de fosfolípidos naturales son
biocompatibles y biodegradables; los liposomas pueden incorporarse
una gran cantidad de agua y fármacos solubles lípidos; los
liposomas pueden proteger fármacos encapsulados en sus
compartimentos internos del metabolismo y la degradación (Rosoff,
en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Baker
(Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volumen 1, p.
245). Entre las consideraciones importantes en la preparación de
formulaciones con liposomas se citan la carga superficial lípida,
el tamaño de la vesícula y el volumen acuoso de los liposomas.
Los liposomas son útiles para la transferencia y
envío de ingredientes activos a la zona de acción. A causa de que
la membrana liposómica es estructuralmente similar a las membranas
biológicas, cuando los liposomas se aplican al tejido, los liposomas
comienzan a fusionarse con las membranas celulares. A medida que
la fusión entre el liposoma y la célula progresa, los contenidos
liposómicos se vacían en la célula donde el agente activo
puede
actuar.
actuar.
Las formulaciones liposómicas han sido el centro
de atención de extensas investigaciones sobre el modo de envío para
muchos medicamentos. Existe una creciente evidencia de que para la
administración tópica, los liposomas presentan varias ventajas con
respecto a otras formulaciones. Dichas ventajas incluyen los
reducidos efectos secundarios relacionados con la elevada absorción
sistémica del fármaco administrado, la acumulación incrementada del
fármaco administrado en el objetivo deseado, y la habilidad para
administrar una gran variedad de fármacos, tanto hidrofílicos como
hidrofóbicos, en la piel.
Varios informes han detallado la habilidad de
los liposomas para enviar agentes incluyendo ADN de elevado peso
molecular en la piel. Los compuestos incluyendo analgésicos,
anticuerpos, hormonas y ADNs de elevado peso molecular se han
administrado a la piel. La mayor parte de las aplicaciones
resultaron en la selección del objetivo de la epidermis
superior.
Los liposomas se dividen en dos amplias clases.
Los liposomas catiónicos con liposomas positivamente cargados que
interactúan con las moléculas de ADN negativamente cargadas para
formar un complejo estable. El complejo positivamente cargado
ADN/liposoma se enlaza con la superficie celular negativamente
cargada y se internaliza en un endosoma. Debido al pH ácido el
endosoma, los liposomas se rompen, liberando sus contenidos en el
citoplasma celular (Wang et al., Biochem. Biphys. Res.
Commun., 1987, 147, 980-985).
Los liposomas que son sensibles al pH o que
están negativamente cargados, atrapan al ADN en vez de unirse a él.
Debido a que tanto el ADN como el lípido están cargados de manera
similar, se da una repulsión en vez de una formación de un
complejo. Sin embargo, algo de ADN se queda atrapado en el interior
acuoso de estos liposomas. Los liposomas sensibles al pH se han
empleado para enviar ADN codificador de gen de timidina quinasa a
las monocapas celulares en el cultivo. La expresión del gen
endógeno se detectó en las células objetivo (Zhou et al.,
Journal of Controlled Release, 1992, 19,
269-274).
Un principal tipo de composiciones liposómicas
incluye los fosfolípidos diferentes al fosfatidicolina naturalmente
derivada. Las composiciones liposómicas neutrales, por ejemplo,
pueden formarse a partir de dimiristoil fosfatidilcolina (DMPC), o
dipalmitoil fosfatidilcolina (DPPC). Las composiciones liposómicas
aniónicas normalmente se forman a partir de dimiristoil
fosfatidilglicerol, mientras que los liposomas fusogénicos
aniónicos se forman principalmente a partir de dioleoil
fosfatidiletanolamina (DOPE). Otro tipo de composición liposómica
se forma a partir de fosfatidilcolina (PC), como por ejemplo, soja
PC y huevo PC. Otro tipo se forma a partir de mezclas de
fosfolípido y/o fosfatidilcolina y/o colesterol.
Varios estudios han evaluado el envío tópico de
formulaciones con fármacos liposómicos a la piel. La aplicación de
liposomas que contiene interferón en piel de cerdo de guinea dio
como resultado una reducción de la heridas de herpes en la piel
mientras que el envío de interferón mediante otra vía (por ejemplo,
como una solución o como una emulsión) fue inefectivo. (Weiner
et al., Journal of Drug Targetting, 1992, 2,
405-410). Además, un estudio adicional probó la
eficacia de interferón administrado como parte de una formulación
liposómica a la administración de interferón empleando un sistema
acuoso, y concluyó que la formulación liposómica era superior a la
administración acuosa (du Plessis et al., Antiviral
Research, 1992, 18, 259-265).
Los sistemas liposómicos no iónicos también se
han examinado con el fin de determinar su utilidad en el envío de
fármacos a la piel, en particular sistemas que comprenden
surfactante no iónico y colesterol. Las formulaciones liposómicas no
iónicas que incorporan Novasome^{TM} I (dilaurato de
gliceril/colesterol/polioxietileno-10-éter estearil)
y Novasome^{TM} II (distearato de
gliceril/colesterol/polioxietileno-10-éter estearil)
se emplearon para enviar ciclosporina-A a la dermis
de la piel del ratón. Los resultados indicaron que dichos sistemas
liposómicos no iónicos fueron efectivos para facilitar la
deposición de ciclosporina-A en diferentes capas de
la piel (Hu et al., S.T.P. Pharma. Sci., 1994, 4, 6,
466).
Los liposomas también incluyen liposomas
"estéricamente estabilizados", un término que, tal y como aquí
se emplea, hace referencia a liposomas que comprenden uno o más
lípidos especializados que, cuando se incorporan a los liposomas,
dan como resultado vidas medias prolongadas de circulación en
relación con los liposomas que carecen de dichos lípidos
especializados. Ejemplos de liposomas estéricamente especializados
son aquellos en los cuales parte de la vesícula que forma la parte
lípida del liposoma (A) está constituida por uno o más
glicolípidos, como monosialogangliosido G_{M1}, o (B) se deriva
con uno o más polímeros hidrofílicos, como un radical de un glicol
de polietileno (PEG). A pesar de que no se desea basarse en ninguna
teoría en particular, se cree en la técnica que, al menos para
liposomas estabilizados estéricamente que contienen gangliosidos,
esfingomielina, o lípidos derivados de PEG, la vida media
prolongada de circulación de estos liposomas estéricamente
estabilizados se deriva de una reducida respuesta en las células
del sistema reticuloendotelial (RES) (Allen et al., FEBS
Letters, 1987, 223, 42; Wu et al., Cancer Research,
1993, 53, 3765). Varios liposomas que comprenden uno o más
glicolípidos son conocidos en la técnica. Papahadjopoulos et al.
(Ann. N. Y. Acad. Sci., 1987, 507, 64) escribió sobre la
habilidad de monosialogangliosido GM1, sulfato de
galactocerebrósido y fosfatidilinositol para incrementar la vida
media sanguínea de los liposomas. Estos hallazgos se expusieron por
parte de Gabizon et al., (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A,
1988, 85, 6949). La Patente U.S No. 4,837,028 y WO 88/04924, ambas
de Allen et al., describen liposomas que comprenden (1)
esfingomielina y (2) la gangliosida GM1 o un éster de sulfato de
galactocerebrósido. La Patente U.S No. 5,543,152 (Webb et
al.) describe liposomas que comprenden esfingomielina. Los
liposomas que contienen
1,2-sn-dimiristoilfsfatidilcolina
se describen en WO 97/13499 (Lim et al.).
Muchos liposomas que contiene lípidos derivados
con uno o más polímeros hidrofílicos, y métodos de preparación de
los mismos son conocidos en la técnica. Sunamoto et al.,
(Bull. Chem. Soc. Jpn., 1980, 53, 2778) describió liposomas que
contienen detergente naniónico, 2C_{12}15G, que contiene la
fracción PEG. Illum et al. (FEBS Lett., 1984, 167, 79) anotó
que la capa hidrofílica de las partículas de poliestireno con los
glicoles poliméricos da como resultado un significante incremento
en la vida media sanguínea. Los fosfolípidos modificados mediante
la adición de grupos carboxílicos de glicoles de polialquileno (por
ejemplo, PEG) se describen por parte de Sears (Patentes U.S Números
4,426,330 y 4,534,899). Klibanov et al., (FEBS Lett., 1990,
268, 235) describió experimentos que demostraban que los liposomas
que contenían fosfatidiletanolamina (PE) derivados con PEG o con
estearato PEG poseen un incremento en las vidas medias de
circulación sanguínea. Blume et al., (Biochimica et
Biophysica Acta, 1990, 1029, 91) extendió dichas observaciones a
otros fosfolípidos derivados de PEG, por ejemplo,
DSPE-PEG, formados a partir de la combinación de
distearoilfosfatidiletanolamina (DSPE) y PEG. Los liposomas que
tienen fracciones PEG enlazadas covalentemente en su superficie
externa se describen en la Patente Europea No. EP 0 445 131 B1 y en
WO 90/04384 de Fishner. Las composiciones de liposomas que
contienen 1-20 porcentaje molecular de PE derivado
con PEG, y métodos de uso de las mismas, se exponen en Woodle et
al. (Patentes U.S Números 5,013,556 y 5,356,633) y Martin et
al. (Patente U.S Número 5,213,804 y la Patente Europea Número
EP 9 496 813 B1). Los liposomas que contienen un número de otros
conjugados lípido-polímero se describen en WO
91/05545 y en la Patente U.S Número 5,225,212 (ambas de Martin
et al.) y en WO 94/20073 (Zalipsky et al.). Liposomas
que contienen lípidos de ceramida modificados con PEG se describen
en WO 96/10391 (Choi et al.). Los números de Patentes U.S
5,540,935 (Miyazaki et al.) y 5,556,948 (Tagawa et
al.) describen los liposomas que contienen PEG y que además
pueden derivarse con fracciones funcionales en sus superficies.
Un número limitado de liposomas que comprenden
ácidos nucleicos son conocidos en la técnica. WO 96/40062 de
Thierry et al. describe métodos para encapsular ácidos
nucleicos de elevado peso molecular en liposomas. El número de
Patente U.S 5,264,221 de Tagawa et al. describe liposomas
enlazados con proteína y afirma que los contenidos de dichos
liposomas pueden incluir un ARN antisentido. El número de Patente
U.S 5,665,710 de Rahman et al. describe ciertos métodos para
encapsular oligodeoxinucleótidos en liposomas. WO 97/04787 de Love
et al. describe liposomas que contienen oligonucleótidos
antisentido dirigidos al gen raf.
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\global\parskip0.950000\baselineskip
Las transfersomas son incluso otro tipo de
liposomas, y son agregados lípidos elevadamente transformables que
son candidatos atractivos para los vehículos de envió de
medicamentos o fármacos. Las transfersomas pueden describirse como
pequeñas gotas lípidas que se deforman en tal grado que son capaces
de penetrar fácilmente a través de los poros que son más pequeños
que las pequeñas gotas. Las transfersomas son adaptables al medio
en el que se emplean, por ejemplo, son
auto-optimizables (se adaptan a la forma de los
poros en la piel), auto-reparadoras, con frecuencia
alcanzan sus objetivos sin fragmentarse, y con frecuencia se
autocargan. Para hacer transfersomas es posible añadir activadores
laterales, normalmente surfactantes, a una composición liposómica
estándar. Las transfersomas se han empleado para enviar albúmina en
suero a la piel. El envío mediado por la transfersoma de albúmina
en suero ha demostrado se eficaz como inyección subcutánea de una
solución que contenía suero albúmina.
Los surfactantes encuentran una gran aplicación
en formulaciones tales como emulsiones (incluyendo microemulsiones)
y liposomas. El modo más común de clasificar las propiedades de
los diferentes tipos de surfactantes, tanto naturales como
sintéticos, es mediante el uso del balance hidrófilo/lipófilo
(HLB). La naturaleza del grupo hidrofílico (también conocido como
"cabeza") proporciona los medios más útiles para categorizar
los diferentes surfactantes empleados en las formulaciones (Rieger
en Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New
York, N.Y., 1988, p. 285).
Si la molécula surfactante no se ioniza, se
clasifica como surfactante no iónico. Los surfactantes no iónicos
encuentran una amplia aplicación en productos farmacéuticos y
cosméticos y se emplean con una gran variedad de valores pH. En
general, sus valores HLB oscilan entre aproximadamente 2 y 18
dependiendo de su estructura. Los surfactantes no iónicos incluyen
ésteres no iónicos, como ésteres de glicol de etileno, ésteres de
glicol de propileno, ésteres de gliceril, ésteres de poligliceril,
ésteres de sorbitano, ésteres de sacarosa, y ésteres etoxilados.
Las alcanolamidas no iónicas y los éteres tales como los etoxilatos
de alcohol graso, alcoholes propoxilatados, y polímeros de bloqueo
etoxilados/propoxilatados también se incluyen en esta clase. Los
surfactantes de polioxietileno son los miembros más populares de la
clase de surfactantes no iónicos.
Si la molécula surfactante transporta una carga
negativa cuando se disuelve o dispersa en agua, el surfactante se
clasifica como aniónico. Los surfactantes aniónicos incluyen
carboxilatos como los jabones, los lactilatos de acilo, amidas de
acilo de aminoácidos, ésteres de ácido sulfúrico como sulfatos de
alquilo y sulfatos de alquilo etoxilado, sulfanatos como sulfanatos
de benceno de alquilo, isetionatos de acilo, tauratos de acilo y
sulfosuccionatos, y fosfatos. Los miembros más importantes de la
clase surfactante aniónica son los sulfatos de alquilo y los
jabones.
Si la molécula surfactante transporta una carga
positiva cuando se disuelve o dispersa en agua, el surfactante se
clasifica como catiónico. Los surfactantes catiónicos incluyen
sales de amonio cuaternario y aminas etoxiladas. Las sales de
amonio cuaternario son los miembros más empleados de esta
clase.
Si la molécula surfactante tiene la habilidad de
transportar tanto carga positiva como negativa, el surfactante se
clasifica como anfotérico. Los surfactantes anfoféricos incluyen
derivados de ácido acrílico, alquilamidas sustituidas,
N-alquilbetaínas y fosfatidas.
Se ha revisado el uso de surfactantes en
productos farmacéuticos, formulaciones y en emulsiones (Rieger en
Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York,
N.Y., 1988, p. 285).
En una realización, la presente invención emplea
varios potenciadores de penetración para efectuar el envío eficaz
de ácidos nucleicos, en particular oligonucleótidos, a la piel del
animal. La mayoría de los fármacos están presentes en solución
tanto en forma ionizada como en forma no ionizadas. Sin embargo,
solamente lípidos solubles o fármacos lipofílicos son capaces de
cruzar fácilmente las membranas celulares. Se ha descubierto que
incluso los fármacos no lipofílicos pueden cruzar las membranas
celulares si la membrana a ser cruzada se ha tratado con un
potenciador de penetración. Además de ayudar a la difusión de
fármacos no lipofílicos a través de las membranas celulares, los
potenciadores de penetración también potencian la permeabilidad de
fármacos lipofílicos.
Los potenciadores de penetración pueden
clasificarse por pertenecer a una de las cinco amplias categorías,
es decir, surfactantes, ácidos grasos, sales biliares, agentes
quelantes, y agentes no quelantes y no surfactantes (Lee et al.,
Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.
92). Cada una de las clases arriba mencionadas de potenciadores de
penetración se describe a continuación con mayor detalle.
Surfactantes: En relación con la presente
invención, los surfactantes (o "agentes activos
superficiales") son entidades químicas que, cuando se disuelven
en una solución acuosa, reducen la tensión superficial de la
solución o la tensión interfacial entre la solución acuosa y otro
líquido, con el resultado de que la absorción de los
oligonucleótidos a través de la mucosa aumenta. Además de las sales
biliares y los ácidos grasos, estos potenciadores de penetración
incluyen, por ejemplo, lauril sulfato de sodio, éter
polioxietileno-9-lauril y éter
polioxietileno-20-cetil. (Lee et
al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991,
p. 92); y emulsiones perfluoroquímicas, como FC-43.
Takahashi et al, J. Pharm. Pharmacol., 1988, 40, 252).
Ácidos grasos: Varios ácidos grasos y sus
derivados que actúan como potenciadores de penetración incluyen,
por ejemplo, ácido oleico, ácido láurico, ácido cáprico, (ácido
n-decanoico), ácido mirístico, ácido palmítico,
ácido esteárico, ácido linoleico, ácido linolénico, dicaprato,
tricaprato, monooleina
(1-monooleoil-rac-glicerol),
dilaurina, ácido caprílico, ácido araquidónico, glicerol,
1-mocaprato,
1-dodecilazacicloheptano-2-uno,
acilcarnitinas, acilcolinas, C_{1-10} ésteres de
alquilo de los mismos (por ejemplo, metil, isopropil y
t-butilo), y mono- y di-glicéridos
de los mismos (es decir, oleato, laurato, caprato, miristato,
palmitato, estearato, linoleato, etc.) (Lee et al., Critical
Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92;
Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier
Systems, 1990, 7, 1-33; El Hariri et al., J.
Pharm. Pharmacol., 1992, 44, 651-654).
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Sales biliares: El papel fisiológico de la bilis
incluye la facilitación del proceso de dispersión y absorción de
lípidos y de vitaminas solubles en grasa (Bunton, Capítulo 38 en:
Goodman & Gilman's The Pharmaceutical Basis of
Therapeutics, 9ª ed., Hardman et al, Eds.,
McGraw-Hill, New York, 1996, páginas
934-935). Varias sales biliares, y sus derivados
sintéticos, actúan como potenciadores de penetración. Por lo tanto,
el término "sales biliares" incluye cualquiera de los
componentes que naturalmente ocurren en la bilis así como sus
derivados sintéticos. Las sales biliares de la invención incluyen,
por ejemplo, ácido cólico (o su sal sódica o colato sódico
farmacéuticamente aceptables), ácido dehidrocólico (dehidrocolato
sódico), ácido deoxicólico (deoxicolato sódico), ácido glucólico
(glucolato sódico), ácido glicólico (glicolato sódico), ácido
glicodeoxicólico (glicodeoxicolato sódico), ácido taurocólico
(taurocolato sódico), ácido taurodeoxicólico (taurodeoxicolato
sódico), ácido quenodeoxicólico (quenodeoxicolato sódico), ácido
ursodeoxicólico (UDCA), tauro-24,
25-dihidro-fusidato sódico (STDHF),
glicodihidrofusidato sódico y éter
polioxietileno-9-lauril (POE). (Lee
et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier
Systems, 1991, p. 92; Swinyard, Capítulo 39 en: Remington's
Pharmaceutical Sciences, 18^{th} Ed., Gennaro, ed., Mack
Publishing Co., Easton, PA, 1990, páginas 782-783;
Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier
Systems, 1990, 7, 1-33; Yamamoto et al., J.
Pharm. Exp. Ther., 1992, 263, 25; Yamashita et al., J.
Pharm. Sci., 1990, 79, 579-583).
Agentes Quelantes: Los agentes quelantes,
empleados en relación con la presente invención, pueden definirse
como compuestos para retirar los iones metálicos de la solución
formando complejos con ellos, dando como resultado el incremento de
la absorción de oligonucleótidos a través de la mucosa. Con
respecto a su uso como potenciadores de penetración en la presente
invención, los agentes quelantes han añadido la ventaja de servir
también como inhibidores de ADNasa, ya que la mayoría de las
nucleasas de ADN caracterizadas requieren un ión metálico divalente
para la catálisis y se inhiben por lo tanto por agentes quelantes
(Jarret, J. Chromatogr., 1993, 618, 315-339).
Los agentes quelantes de la invención incluyen, aunque no se
limitan a, etilenodiaminetetraacetato sódico (EDTA), ácido cítrico,
salicilatos (por ejemplo, salicilato sódico,
5-metoxisalicilato y homovanilato), derivados
N-acil de colágeno, laureth-9 y
derivados N-amino acil de
beta-diquetonas (enaminas) (Lee et al., Critical
Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92;
Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier
Systems, 1990, 7, 1-33; Buur et al., J.
Control Rel., 1990, 14, 43-51).
No-surfactantes
no-quelantes: Tal y como aquí se emplean, los
compuestos potenciadores de penetración
no-surfactantes no-quelantes pueden
definirse como compuestos que demuestran actividad insignificante
como agentes quelantes o como agentes surfactantes pero que a pesar
de ello potencian la absorción de oligonucleótidos a través de la
mucosa alimenticia (Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic
Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33). Esta
clase de potenciadores de penetración incluye, por ejemplo, ureas
cíclicas no saturadas, 1-alquilo y derivados de
1-alquenilazaciclo-alcalona (Lee
et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier
Systems, 1991, p. 92), y agentes no esteroides
antiinflamatorios como sodio de diclofenaco, indometacina y
fenilbutazona (Yamashita et al., J. Pharm. Pharmacol., 1987,
39, 621-626).
Agentes que potencian la respuesta de
oligonucleótidos en el nivel celular también pueden añadirse a las
composiciones farmacéuticas o a otras composiciones de la presente
invención. Por ejemplo, los lípidos catiónicos, como la lipofectina
(Junichi et al., Patente U.S Nº 5,705,188), derivados de
glicerol catiónico, y moléculas policatiónicas, como polilisina
(Lollo et al., Solicitud PCT WO 97/30731), también son
conocidos por potenciar la respuesta celular de los
oligonucleótidos.
Pueden utilizarse otros agentes para potenciar
la penetración de los ácidos nucleicos administrados, incluyendo
glicoles tales como el glicol de etileno y el glicol de propileno,
pirroles tales como 2-pirrol, azonas, y terpenos
como limoneno y mentona.
Ciertas composiciones de la presente invención
también incorporan compuestos portadores en la formulación. Tal y
como aquí se emplea, "compuesto portador" o "portador"
puede hacer referencia a un ácido nucleico, o un análogo del mismo,
que es inerte (es decir, no posee actividad biológica por sí mismo)
pero ser reconoce como un ácido nucleico por procesos in
vivo que reducen la biodisponibilidad de un ácido nucleico que
posee actividad biológica, por ejemplo degradando el ácido nucleico
biológicamente activo o promoviendo su retirada de la circulación.
La coadministración de un ácido nucleico y de un compuesto
portador, normalmente con un exceso de esta última sustancia, puede
dar como resultado una sustancial reducción de la cantidad de ácido
nucleico recuperada en el hígado, riñón u otras reservas
extracirculatorias, presumiblemente debido a la competición entre el
compuesto portador y el ácido nucleico por un receptor común. Por
ejemplo, la recuperación de un oligonucleótido parcialmente
fosforotioato en tejido hepático puede reducirse si se administra
con ácido poliinosínico, sulfato de dextrano, ácido policitídico o
ácido
4-acetamido-4'isotiociano-estilbeno-2,2'-disulfónico
(Miyao et al., Antisense Res. Dev., 1995, 5,
115-121; Takakura et al., Antisense & Nucl.
Acid Drug Dev., 1996, 6, 177-183).
A diferencia de un compuesto portador, un
"portador farmacéutico" o "excipiente" es un disolvente
farmacéuticamente aceptable, agente suspendedor u otro vehículo
farmacológicamente inerte para el envío de uno o más ácidos
nucleicos a un animal. El excipiente puede ser sólido o líquido y
se selecciona, con la manera planeada de administración en mente,
para proporcionar la cantidad y la consistencia necesarias cuando
se combina con un ácido nucleico y con otros componentes de una
composición farmacéutica determinada. Los portadores farmacéuticos
habituales incluyen, aunque no se limitan a, agentes vinculantes
(por ejemplo, almidón de maíz pregelatinizado, polivinilpirrolidina
o metilcelulosa de hidroxipropil, etc.); rellenadores (por ejemplo,
lactosa u otros azúcares, celulosa microcristalina, pectina,
gelatina, sulfato cálcico, celulosa de etilo, poliacrilatos o
fosfato de hidrógeno cálcico, etc.), lubricantes (por ejemplo,
esterato de magnesio, talco, sílice, dióxido de silicona coloidal,
ácido esteárico, estearatos metálicos, aceites vegetales
hidrogenados, almidón de trigo, glicoles de polietileno, benzoato
sódico, acetato sódico, etc.), desintegrantes (por ejemplo,
almidón, glicolato de almidón sódico); y agentes humectantes (por
ejemplo, sulfato de lauril sódico, etc.).
Los excipientes orgánicos e inorgánicos
farmacéuticamente aceptables para la administración no parenteral
que no reaccionen de manera nociva con los ácidos nucleicos también
pueden emplearse para formular las composiciones de la presente
invención. Portadores farmacéuticamente aceptables incluyen, a
pesar de que no se limitan a, agua, soluciones saladas, alcoholes,
glicoles de polietileno, gelatina, lactosa, amilosa, estearato de
magnesio, talco, ácido silicílico, parafina viscosa,
hidroximetilcelulosa, polivinilpirrolidona y similares.
Las formulaciones para administración tópica de
ácidos nucleicos pueden incluir soluciones acuosas estériles y no
estériles, soluciones no acuosas, normalmente disolventes como
alcoholes, o soluciones del los ácidos nucleicos en líquido o bases
de aceite sólidas. Las soluciones también pueden contener búferes,
diluyentes y otros aditivos adecuados. Pueden emplearse excipientes
orgánicos o inorgánicos farmacéuticamente aceptables adecuados para
la administración no parenteral que no reaccionen de manera nociva
con los ácidos nucleicos.
Excipientes farmacéuticamente aceptables
adecuados incluyen, aunque no se limitan a, agua, soluciones
saladas, alcoholes, glicoles de polietileno, gelatina, lactosa,
amilosa, estearato de magnesio, talco, ácido silicílico, parafina
viscosa, hidroximetilcelulosa, polivinilpirrolidona y
similares.
Las composiciones de la presente invención
pueden contener de manera adicional otros componentes adjuntos
encontrados de manera convencional en composiciones farmacéuticas,
en sus niveles de uso establecidos por la técnica. Por lo tanto,
por ejemplo, las composiciones pueden contener materiales
adicionales, compatibles y farmacéuticamente activos como, por
ejemplo, agentes antipruríticos, astringentes, anestésicos locales
o agentes antiinflamatorios, o pueden contener materiales
adicionales útiles para formular físicamente varias formas de dosis
de las composiciones de la presente invención, como colorantes,
agentes saborizantes, conservantes, antioxidantes, agentes
generadores de opacidad, agentes espesantes y estabilizadores. Sin
embargo, dichos materiales, cuando se añaden, no deberían
interferir de manera indebida en las actividades biológicas de los
componentes de las composiciones de la presente invención. Las
formulaciones pueden esterilizarse y, si se desea, mezclarse con
agentes auxiliares, por ejemplo, lubricantes, conservantes,
estabilizadores, agentes humectantes, emulsionantes, sales para
influenciar la presión osmótica, búferes, colorantes, saborizantes
y/o sustancias aromáticas y similares que no interactúan de manera
nociva con los ácidos nucleicos de la invención.
Las suspensiones acuosas pueden contener
sustancia que incrementan la viscosidad de la suspensión
incluyendo, por ejemplo, carboximetilcelulosa sódica, sorbitol y/o
dextrano. Las suspensiones pueden también contener
estabilizadores.
Ciertas realizaciones de la invención
proporcionan composiciones farmacéuticas que contienen (a) uno o
más compuestos antisentido y (b) uno o más agentes
quimioterapéuticos que funcionan mediante un mecanismo
anti-sentido. Ejemplos de dichos agentes
quimioterapéuticos incluye, aunque no se limitan a, medicamentos
contra el cáncer como daunorubicina, dactinomicina, doxorubicina,
bleomicina, mitomicina, mostaza de nitrógeno, clorambucil,
melfalán, ciclofosfamida, 6-mercaptopurina,
6-tioguanina, citarabina (CA),
5-fluorouracil (5-FU), floxuridina
(5-FUdR), metotrexato (MTX), colchicina,
vincristina, vinblastina, etoposida, teniposida, cisplatina y
dietilestilbestrol (DES). En general, consultar The Merck Manual
of Diagnosis and Therapy, 15th Ed., Berkow et al., eds.,
1987, Rahway, N.J., páginas 1206-1228). Los
medicamentos antiinflamatorios, incluyendo aunque no limitando los
medicamentos antiinflamatorios no esteroideos y los
corticosteroides y medicamentos antivirales, incluyendo aunque sin
limitando, ribivirina, vidarabina, aciclovir y ganciclovir, también
pueden combinarse en composiciones de la invención. En general,
consultar The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 15th
Ed., Berkow et al., eds., 1987, Rahway, N.J., páginas
2499-2506 y 46-49,
respectivamente). Otros agentes quimioterapéuticos antisentido
también se encuentran en el ámbito de esta invención. Dos o más
compuestos combinados pueden emplearse juntos o de manera
secuencial.
En otra realización relacionada, las
composiciones de la invención pueden contener uno o más compuestos
antisentido, en particular oligonucleótidos, dirigidos a un primer
ácido nucleico y uno o más compuestos antisentido adicionales
dirigidos a un segundo ácido nucleico objetivo. En la técnica se
conocen numerosos ejemplos de compuestos antisentido. Dos o más
compuestos combinados pueden emplearse juntos o de manera
secuencial.
Se cree que formulación de composiciones
terapéuticas y su posterior administración se encuentran dentro de
los conocimientos de un experto en la técnica. La dosis depende de
la severidad y de la respuesta al estado de enfermedad a ser
tratada, durando el curso del tratamiento entre varios días y
meses, o hasta que se efectúe la cura o hasta que se consiga una
disminución de la enfermedad. Las dosis óptimas pueden calcularse a
partir de medidas de la acumulación del fármaco en el cuerpo del
paciente. Las personas con el conocimiento adecuado pueden
determinar de manera sencilla dosis óptimas, metodologías de dosis
y ritmos de repetición. Las dosis óptimas pueden variar dependiendo
de la relativa potencia de los oligonucleótidos individuales, y en
general pueden estimarse en modelos animales in vitro e in
vivo. En general, la dosis varía entre 0.01 \mug y 100 g. por
kg de peso corporal, y puede administrarse una vez o más veces a
diario, a la semana, al mes o al año, o incluso una vez cada 2 a 20
años. Las personas expertas en la técnica fácilmente pueden
determinar los ritmos estimados de repetición para las dosis en
base a tiempos medidos de residencia y a concentraciones del
fármaco en fluidos o tejidos corporales. Tras el tratamiento
exitoso, se puede desear que el paciente que el paciente realice
una terapia de mantenimiento para evitar la recurrencia del estado
de enfermedad, donde el oligonucleótido se administra en dosis de
mantenimiento, que oscilan entre 0.01 \mug y 100 g. por kg de
peso corporal, una vez o más veces por día, a una vez cada 20
años.
Mientras la presente invención se ha descrito
con la descripción de acuerdo con ciertas de sus realizaciones
preferentes, los siguientes ejemplos únicamente sirven para ilustrar
la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Se compraron 2'-Deoxi y
2'-metoxi beta-cianoetildiisopropil
fosforamiditas en fuentes comerciales (por ejemplo, Chemgenes,
Needham MA o Glen Research, Inc. Serling VA). Se preparan otras
amiditas de nucleósido 2'-O-alcoxi
sustituidas tal y como se describe en la Patente U.S 5,506,351.
Para los oligonucleótidos sintetizados que emplean
2'-alcoxi amiditas, se empleó el ciclo estándar
para oligonucleótidos no modificados, excepto que el paso de espera
tras el envío de pulso de tetrazola y la base se aumentó a 360
segundos.
Los oligonucleótidos que contienen nucleótidos
5-metil-2'-deoxicitidina
(5-Mec-C) se sintetizaron de
acuerdo con los métodos publicados (Sanghvi et al., Nucleic
Acids Research, 1993, 21, 3197-3203) empleando
fosforamiditas disponibles en el mercado (Glen Research, Sterling
VA o Chem Genes, Needham MA).
\vskip1.000000\baselineskip
Oligonucleótidos 2'-fluoro se
sintetizaron como se ha descrito previamente (Kawasaki et
al., J. Med. Chem., 1993, 36, 831-841) y la
patente de Estados Unidos 5,670,633. En resumen, el nucleósido
protegido
N6-benzoil-2'-deoxi-2'-fluoroadenosina
se sintetizó empleando
9-beta-D-arabinofuranosiladenina
disponible en el mercado como material de inicio y modificando los
procedimientos escritos por lo que el átomo
2-alfa-fluoro se introdujo mediante
un desplazamiento S_{N}2 de un grupo
2'-beta-tritil. Por lo tanto
N6-benzoil-9-beta-D-arabinofuranosiladenina
se protegió de manera selectiva en una producción moderada como el
intermediario
3'-5'-ditetrahidropiranil (THP). La
desprotección de los grupos THP y N6-benzoil se
llevó a cabo empleando metodologías estándar y se usaron métodos
estándar para obtener intermediarios
5'-dimetoxitritil-(DMT) y
5'-DMT-3'-fosforamidita.
\vskip1.000000\baselineskip
La síntesis de
2'-deoxi-2'-Fluorodeoxiguanosina
se llevó a cabo empleando tetraisopropildisiloxanil (TPDS)
protegido
9-beta-D-arabinofuranosiladenina
como material de inicio, y la conversión al intermediario
diisobutiril-arabinofuranosiladenina. La
desprotección del grupo TPDS fue seguido por la protección del
grupo hidroxil con THP para dar diisobutiril di-THP
protegido arabinofuranosiladenina. La O-deacilación
y la combinación con triflato selectiva fueron seguidas por el
tratamiento del producto en crudo con fluoruro, teniendo lugar a
continuación la desprotección de los grupos THP. Las mitologías
estándar se emplearon pata obtener 5'-DMT y
5'-DMT-3'-fosforamiditas.
\vskip1.000000\baselineskip
La síntesis de
2'-deoxi-2'-fluorouridina
se llevó a cabo a cabo mediante la modificación de un procedimiento
escrito en el cual 2,
2'-deoxi-1-beta-D-arabinofuranosiluracil
se trató con 70% hidrógeno fluoruro-piridina. Los
procedimientos estándar se emplearon para obtener
5'-DMT-3'-fosforamiditas.
\vskip1.000000\baselineskip
2'-deoxi-2'-fluorocitidina
se sintetizó mediante la aminación de
2'-deoxi-2'-fluorouridina,
seguido de la protección selectiva para dar
N4-benzoil-2'-deoxi-2'-fluorocitidina.
Se emplearon procedimientos estándar para obtener fosforamiditas
5'-DMT y
5'-DMT-3'.
\vskip1.000000\baselineskip
Amiditas de nucleósido sustituidas
2'-O-Metoxietil se preparan del
siguiente modo, o de manera alternativa, siguiendo los métodos de
Martin, P., Helvetica Chimica Acta, 1995, 78,
486-504.
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadieron 5-Metiluridina
(ribosiltimina, disponible en el mercado en Yamasa, Choshi, Japón)
(72.0 g, 0279 M), difenilcarbonato (90.0 g, 0420 M) y bicarbonato
sódico (2.0 g, 0.024 M) a DMF (300 ml). La mezcla se calentó hasta
reflujo, con agitación, permitiendo que el gas de dióxido de
carbono desarrollado se liberase que un modo controlado. Tras una
hora, la solución ligeramente oscurecida se concentró bajo presión
reducida. El jarabe resultante se vertió en dietiléter (2.5 L),
agitando. El producto formó una goma. El éter se trasvasó y el
residuo se disolvió en una cantidad mínima de metanol (cerca de 400
mL). Las solución se vertió en éter fresco (2.5 L) para producir
una goma dura y consistente. El éter se trasvasó y la coma se secó
en un horno de vacío (60ºC a 1 mm Hg durante 24 horas) para dar un
sólido que se aplastó hasta conseguir un polvo moreno claro (57 g,
85% producción en crudo). El espectro NMR fue consistente con la
estructura, se contaminó con fenol al igual que su sal sódica
(cerca del 5%). El material se empleó de este modo para más
reacciones (o puede purificarse mediante cromatografía de columna
empleando un gradiente de metanol en acetato de etil
(10-25%) para dar un sólido blanco, mp
222-4ºC).
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadieron
2,2'-Anhidro-5-metiluridina
(195 g, 0.81 M), tris (2-metoxietil)borato
(231 g, 0.98 M) y 2-metoxietanol (1.2 L) a un
frasco de presión de acero inoxidable de 2 L y el frasco se colocó
en un baño de aceite precalentado a 160ºC. Tras el calentamiento
durante 48 horas a 155-160ºC, el frasco se abrió y
la solución se evaporó hasta que se secó y se trituró con MeOH (200
mL). El residuo se suspendió en acetona caliente (1 L). Las sales
insolubles se filtraron, se lavaron con acetona (150 mL) y el
filtrado se evaporó. El residuo (280 g) se disolvió en CH_{3}CN
(600 mL) y se evaporó. La columna de gel de sílice (3 kg) se
empaquetó en CH_{2}Cl_{2}/acetona/MeOH (20:5:3) que contiene
0.5% Et_{3}NH. El residuo se disolvió en CH_{2}Cl_{2} (250
mL) y se adsorbió en sílice (150 g) antes de cargarlo en la
columna. El producto se eluyó con el disolvente de empaquetado para
dar 160 g (63%) del producto. Se obtuvo material adicional
volviendo a trabajar las fracciones impuras.
\vskip1.000000\baselineskip
Se co-evaporó
2'-O-Metoxietil-5'-O-dimetoxitritil-5-metiluridina
(160 g, 0.506 M) con piridina (250 mL) y el residuo seco se
disolvió en piridina. (1.3 L). Se añadió una primera alícuota de
cloruro de dimetoxitritil (94.3 g, 0.278 M) y la mezcla se agitó a
temperatura ambiente durante una hora. A continuación se añadió
metanol (170 mL) para frenar la reacción. HPLC mostró la presencia
de aproximadamente el 70% del producto. El disolvente se evaporó y
se trituró con CH_{3}CN (200 mL). El residuo se disolvió en
CHCl_{3} (1.5 L) y se extrajo con 2x500 mL de NaHCO_{3}
saturado y 2x500 mL de NaCl saturado. La fase orgánica se secó
sobre Na_{2}SO_{4}, se filtró y se evaporó. Se obtuvieron 275
gramos de residuo. El residuo se purificó sobre una columna de gel
de sílice de 3.5 kg, se empaquetó y eluyó con EtOAc/hexano/acetona
(5:5:1) que contiene 0.5% Et_{3}NH. Las fracciones puras se
evaporaron para dar 164 g de producto. Se obtuvieron 20 gramos
adicionales a partir de las fracciones impuras para dar una
producción total de 183 g (57%).
\vskip1.000000\baselineskip
Se combinaron
2'-O-Metoxietil-5'-O-dimetoxitritil-5-metiluridina
(106 g, 0.167 M), DMF/piridina (750 mL de una mezcla 3:1 preparada
a partir de 562 mL de DMF y 188 mL de piridina) y anhidro acético
(24.38 mL) y se agitaron a temperatura ambiente durante 24 horas.
La reacción se controló mediante TLC enfriando en primer lugar la
muestra TLC con la adición de MeOH. Tras la finalización de la
reacción, tras el juicio de TLC, se añadió MeOH (50 mL) y la mezcla
se evaporó a 35ºC. El residuo se disolvió en CHCl_{3} (800 mL) y
se extrajo con 2x200 mL de bicarbonato sódico saturado y 2x200 mL
de NaCl saturado. Las capas de agua se volvieron se extrajeron con
200 mL de CHCl_{3}. Los orgánicos combinados se secaron con
sulfato sódico y se evaporaron para dar 122 g de residuo
(aproximadamente 90% del producto). El residuo se purificó sobre
una columna de gel de sílice de 3.5 kg y se eluyó con EtOAc/hexano
(4:1). Las fracciones de producto puro se evaporaron para producir
96 g (84%). Se recuperó un 1.5 g adicional a partir de fracciones
posteriores.
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó una primera solución disolviendo
3'-O-acetil-2'-O-metoxietil-5'-O-dimetoxitritil-5-metiluridina
(96 g, 0.144 M) en CH_{3}CN (700 mL) y se dejó aparte. Se añadió
trietilamina (189 mL, 1.44 M) a una solución de triazola (90 g, 1.3
M) en CH_{3}CN (1 L), se enfrió a -5ºC y se agitó durante 0.5
horas empleando un agitador elevado. Se añadió POCl_{3} en forma
de gotas durante un periodo de 30 minutos a la solución agitada
mantenida en 0-10ºC, y la mezcla resultante se
agitó durante 2 horas adicionales. La primera solución se añadió en
forma de gotas durante un periodo de 45 minutos a la segunda
solución. La mezcla de reacción resultante se almacenó durante la
noche en una habitación fría. Las sales se filtraron de la mezcla
de reacción y la solución se evaporó. El residuo se disolvió en
EtOAc (1 L) y los sólidos insolubles se retiraron mediante
filtración. El filtrado se lavó con 1x300 mL de NaHCO_{3} y 2x300
mL de NaCl saturado, se secó sobre sulfato sódico y se evaporó. El
residuo se trituró con EtOAc para dar el compuesto del título.
\vskip1.000000\baselineskip
Se agitó una solución de
3'-O-Acetil-2'-O-metoxietil-5'-O-dimetoxitritil-5-metil-4-triazoleuridina
(103 g, 0.141 M) en dioxano (500 mL) y NH_{4}OH (30 mL) a
temperatura ambiente durante 2 horas. La solución de dioxano se
evaporó y el residuo se volvió un azeótropo con MeOH (2x200 mL). El
residuo se disolvió en MeOH (300 mL) y se transfirió a un frasco de
presión de acero inoxidable de 2 L. Se añadió MeOH (400 mL) saturado
con gas NH_{3} y el frasco se calentó a 100ºC durante 2 horas
(TLC mostró la conversión completa). Los contenidos del frasco se
evaporaron hasta la sequedad y el residuo se disolvió en EtOAc (500
mL) y se lavó una vez con NaCl saturado (200 mL). Los componentes
orgánicos se secaron sobre sulfato sódico y el disolvente se
evaporó para dar 85 g (95%) del compuesto del título.
\vskip1.000000\baselineskip
Se disolvió
2'-O-Metoxietil-5'-O-dimetoxitritil-5-metilcitidina
(85 g, 0.134 M) en DMF (800 mL) y se añadió anhidro benzoico (37.2
g, 0.165 M) agitando. Tras la agitación durante 3 horas, TLC mostró
que la reacción estaba aproximadamente 95% completa. El disolvente
se evaporó y el residuo se volvió un azeótropo con MeOH (200 mL).
El residuo se disolvió en CHCl_{3} (700 mL) y se extrajo con
NaHCO_{3} saturado (2x300 mL) y NaCl saturado (2x300 mL), se segó
sobre MgSO_{4} y se evaporó para dar un residuo (96 g). El
residuo se sometió a cromatografía en una columna de sílice de 1.5
kg usando EtOAc/hexano (1:1) que contenía 0.5% Et_{3}NH como el
disolvente eluyente. Las fracciones de producto puro se evaporaron
para dar 90 g (90%) del compuesto del título.
\vskip1.000000\baselineskip
Se disolvió
N4-Benzoil-2'-O-Metoxietil-5'-O-dimetoxitritil-5-metilcitidina
(74 g, 0.10 M) en CH_{2}Cl_{2} (1 L). Se añadieron tetrazola
diisopropilamina (7.1 g) y
2-cianoetoxi-tetra-(isopropil)fosfita
(40.5 mL, 0.123 M) agitando, bajo una atmósfera de nitrógeno. La
mezcla resultante se agitó durante 20 horas a temperatura ambiente
(TLC mostró que la reacción estaba 95% completa). La mezcla de la
reacción se extrajo con NaHCO_{3} saturado (1x300 mL) y NaCl
saturado (3x300 mL). Las capas acuosas se extrajeron de vuelta con
CH_{2}Cl_{2} (300 mL), y los extractos se combinaron, se secaron
sobre MgSO_{4} y se concentraron. El residuo obtenido fue
sometido a cromatografía sobre una columna de sílice de 1.5 kg
usando EtOAc/hexano (3:1) como el disolvente eluyente. Las
fracciones de producto puro se combinaron para dar 90.6 g (87%) del
compuesto del título.
\vskip1.000000\baselineskip
Las amiditas
2'-(Dimetilaminooxietil)nucleósido [también conocidas en la
técnica como amiditas
2'-O-(dimetil-
aminooxietil)nucleósido] se preparan tal y como se describe en los siguientes párrafos. Se preparan adenosina, citidina y amiditas de nucleósido de guanosina de manera similar a la timidina (5-metilburidina) excepto que las aminas exocíclicas se protegen con fracción de benzoil en el caso de la adenosina y la citidina y con isobutiril en el caso de guanosina.
aminooxietil)nucleósido] se preparan tal y como se describe en los siguientes párrafos. Se preparan adenosina, citidina y amiditas de nucleósido de guanosina de manera similar a la timidina (5-metilburidina) excepto que las aminas exocíclicas se protegen con fracción de benzoil en el caso de la adenosina y la citidina y con isobutiril en el caso de guanosina.
\vskip1.000000\baselineskip
Se disolvieron
O^{2}-2'-anhidro-5-metiluridina
(Pro. Bio. Sint., Varese, Italia, 100.0 g, 0.416 mol),
dimetilaminopiridina (0.66 g, 0.013 eq, 0.0054 mmol) en piridina
seca (500 ml) a temperatura ambiente bajo una atmósfera de argón y
con agitación mecánica. Se añadió
tert-Butildifenilclorosilano (125.8 g, 119.0 mL, 1.1
eq, 0.458 mmol) en una porción. La reacción se agitó durante 16
horas a temperatura ambiente. TLC (Rf 0.22, acetato de etil) indicó
una reacción completa. La solución se concentró bajo presión
reducida con un aceite denso. Esto se dividió entre diclorometano
(1 L) y agua salada (1 L). La capa orgánica se secó sobre sulfato
sódico y se concentró bajo presión reducida con un aceite denso. El
aceite se disolvió en una mezcla 1:1 de acetato de etilo y éter de
etilo (600 mL) y la solución se enfrió a -100ºC. El producto
cristalino resultante fue recogido mediante filtración, se lavó con
éter de etilo (3x200 mL) y se seco (40ºC, 1 mm Hg, 24 h) con 149 g
(74.8%) de sólido blanco. TLC y NMR fueron consistentes con el
producto puro.
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadió borano en tetrahidrofurán (1.0 M, 2.0
eq, 622 mL) en un reactor de presión sin agitar de 2 L de acero
inoxidable. En la campana de gases y mediante agitación manual, se
añadió de manera precavida y en primer lugar glicol de etileno (350
mL, exceso) hasta que la evolución del hidrógeno disminuyó. Se
añadieron
5'-O-tert-Butildifenilsilil-O^{2}-2'-anhidro-5-metiluridina
(149 g, 0.311 mol) y bicarbonato sódico (0.074 g, 0.003 eq)
mediante agitación manual. El reactor se selló y se calentó en un
baño de aceite hasta que se alcanzó una temperatura interna de
160ºC y a continuación se mantuvo durante 16 horas (presión <
100 psig). El recipiente se reacción se enfrió a temperatura
ambiente y se abrió. TLC (Rf 0-67 para el producto
deseado y Rf 0.82 para el producto secundario
ara-T, acetato de etilo) indicó aproximadamente la
conversión del 70% al producto. Con el fin de evitar la formación de
productos secundarios adicionales, la reacción se frenó, se
concentró bajo presión reducida (10 a 1 mm Hg) en un baño de agua
cálida (40-100ºC) con el empleo de condiciones más
extremas para retirar el glicol de etileno. [De manera alternativa,
una vez que desaparece el disolvente de baja cocción, la solución
restante puede dividirse entre acetato de etilo y agua. El producto
se encontrará en la fase orgánica]. El residuo se purificó mediante
cromatografía de columna (2 kg gel de sílice, gradiente acetato de
etilo-hexano 1:1 a 4:1). Las fracciones apropiadas
se combinaron, se vaciaron y se secaron al producto como una espuma
blanca y crujiente (84 g, 50%), material de inicio contaminado
(17.4 g) y material de inicio puro y reutilizable 20 g. La
producción basada en el material inicial menos puro recuperado fue
del 58%. TLC y NMR fueron consistentes con el 99% del producto
puro.
\vskip1.000000\baselineskip
Se mezcló
5'-O-tert-Butildifenilsilil-
2'-
O-(2-hidroxietil)-5-metiluridina
(20 g, 36.98 mmol) con trifenilfosfina (11.63 g, 44.3 mmol) y
N-hidroxiftalimida (7.24 g, 44.36 mmol). A
continuación se secó sobre P_{2}O_{2} sometido a un elevado
vacío durante dos días as 40ºC. La mezcla de la reacción se purgó
con argón y se añadió THF seco (369.9 mL, Aldrich, botella de
sellado seguro) para conseguir una solución clara. Se añadió
dietil-azodicarboxilato (6.98 mL, 44.36 mmol) en
forma de gotas a la mezcla de la reacción. La velocidad de adición
se mantuvo de tal modo que la coloración resultante roja profunda se
descargue justo antes de añadir la siguiente gota. Después de que
la adición esté completada, la reacción se agitó durante 4 horas.
Para ese momento, TLC mostró la finalización de la reacción
(etilacetato:hexano, 60:40). El disolvente se evaporó en vacío. El
residuo obtenido se colocó en una columna con destellos y se eluyó
con acetato de etilo:hexano (60:40), para conseguir
2'-O-
([2-phthalimidoxy)etilo]-5'-t-butildifenilsilil-5-metiluridina
como espuma blanca (21.819 g, 86%).
\vskip1.000000\baselineskip
Se disolvió
2'-O-([2-phthalimidoxy)etilo]-5'-t-butildifenilsilil-5-metiluridina
(3.1 g, 4.5 mmol) en CH_{2}Cl_{2} (4.5 mL) y se añadió
metilhidrazina (300 mL, 4.64 mmol) en forma de gotas a -10ºC a 0ºC.
Tras una hora, la mezcla se filtró, y el filtrado se lavó con agua,
agua salada y se secó sobre Na_{2}SO_{4} anhidroso. La solución
se concentró para conseguir 2'-O-(aminoetil)
timina, que a continuación se disolvió en MeOH (67.5 mL). A esto se
le añadió formaldehído (20% solución acuosa, w/w, 1.1 eq.) y la
mezcla resultante fue agitada durante una hora. El disolvente se
retiro bajo vacío; el residuo fue sometido a cromatografía para
obtener
5'-O-tert-butildifenilsilil-2'-O-[(2-formadoximinooxi)etil]-5-metiluridina
como espuma blanca (1.95 g, 78%).
\vskip1.000000\baselineskip
Se disolvió
5'-O-tert-butildifenilsilil-2'-O-[(2-formadoximinooxi)etil]-5-metiluridina
(1.77 g, 3.12 mol) en una solución de 1M piridina
p-toluenesulfonato (PPTS) en MeOH seco (30.6 mL).
Se añadió cianoborohídrido sódico (0.39 g, 6.13 mmol) a esta
solución a 10ºC bajo atmósfera inerte. La mezcla de la reacción fue
agitada durante 10 minutos a 10ºC. A continuación, se retiró el
envase de la reacción del baño de hielo y se agitó a temperatura
ambiente durante 2 horas, la reacción fue controlada por TLC (5%
MeOH en CH_{2}Cl_{2}). La solución acuosa NaHCO_{3} (2x20
mL). La fase de acetato de etilo se secó sobre Na_{2}SO_{4} y se
evaporó hasta alcanzar la sequedad. El residuo se disolvió en una
solución de 1 M PPTS en MeOH (30.6 mL). Se añadió formaldehído (20%
w/w, 30 mL, 3.37 mmol) y la mezcla de la reacción se agitó a
temperatura ambiente durante 10 minutos. La mezcla de la reacción
se enfrió a 10ºC en un baño de hielo, se añadió cianoborohídrido
sódico (0.39 g, 6.13 mmol) y la mezcla de la reacción se agitó a
10ºC durante 10 minutos. Tras 10 minutos, la mezcla de la reacción
se retiró del baño de hielo y se agitó a temperatura ambiente
durante 2 horas. Se añadió 5% NaHCO_{3} (25 mL) a la mezcla de la
reacción y se extrajo con acetato de etilo (2x25 mL). La capa de
acetato de etilo se secó sobre Na_{2}SO_{4} y se evaporó hasta
alcanzar la sequedad. El residuo obtenido fue purificado mediante
cromatografía de columna con destellos y se eluyó con 5% MeOH en
CH_{2}Cl_{2} para obtener
5'-O-tert-butildifenilsilil-
2'-
O-[N,N-dimetilaminooxietil]-5-metiluridina
como una espuma blanca (14.6 g, 80%).
\vskip1.000000\baselineskip
Se disolvió trietilamina trihidrofluoruro (3.91
mL, 24.0 mmol) en THF seco y trietilamina (1.67 mL, 12 mmol, seco,
mantenido sobre KOH). Esta mezcla de
trietilamina-2HF se añadió a continuación a
5'-O-tert-butildifenilsilil-
2'-O-[N,N-dimetilaminooxietil]-5-metiluridina
(1.40 g, 2.4 mmol) y se agitó a temperatura ambiente durante 24
horas. La reacción fue controlada por TLC (5% MeOH en
CH_{2}Cl_{2}). El disolvente fue retirado mediante vacío y el
residuo se colocó en una columna de destellos y se eluyó con 10%
MeOH en CH_{2}Cl_{2} para obtener
2'-O-(dimetilaminooxietil)-5-metiluridina
(766 mg, 92.5%).
\vskip1.000000\baselineskip
Se secó
2'-O-(dimetilaminooxietil)-5-metiluridina
(750 mg, 2.17 mmol) sobre P_{2}O_{5} bajo elevado vacío durante
toda la noche a 40ºC. A continuación se co-evaporó
con piridina de anhidro (20 mL). El residuo obtenido se disolvió en
piridina (11 mL) bajo atmósfera de argón. Se añadieron
4-dimetilaminopiridina (26.5 mg, 2.60 mmol),
4,4'-dimetoxitritil cloruro (880 mg, 2.60 mmol) a la
mezcla y se agitó la mezcla de la reacción a temperatura ambiente
hasta que todo el material inicial despareció. Se retiró la
piridina bajo vacío y el residuo fue sometido a cromatografía y se
eluyó con 10% MeOH en CH_{2}Cl_{2} (que contenía unas pocas
gotas de piridina) para conseguir
5'-O-DMT-2'-O-(dimetilamino-oxietil)-5-metiluridina
(1.13 g, 80%).
\vskip1.000000\baselineskip
5'-O-DMT-2'-O-(dimetilaminooxietil)-5-metiluridina
(1.08 g, 1.67 mmol) se co-evaporó con tolueno
(20mL). Se añadió N,N-diisopropilamina tetrazoide
(0.29 g, 1.27 mmol) al residuo y se secó sobre P205 bajo elevado
vacío durante la noche a 40ºC. A continuación, la reacción se
disolvió en acetonitrilo de anhidro (8.4 mL) y se añadió
2-cianoetil-N,N,N^{1},N^{1}-tetraisopropilfosforamidita
(2.12 mL, 6.08 mmol). La mezcla de la reacción fue mezclada a
temperatura ambiente durante 4 horas bajo atmósfera inerte. El
progreso de la reacción fue controlado por TLC (hexano:acetato de
etil 1:1): El disolvente se evaporó, a continuación el residuo se
disolvió en acetato de etilo (70 mL) y se lavó con 5% NaHCO_{3}
acuoso (40 mL). La capa de acetato de etilo se secó sobre
Na_{2}SO_{4} de anhidro y se concentró. El residuo obtenido se
sometió a cromatografía (acetato de etilo como eluyente) para
conseguir
5'-O-DMT-2'-O-(dimetilaminooxietil)-5-metiluridina-3'-[(2-cianoetil)-N,
N-diisopropilfosforamidita] como espuma blanca
(1.04 g, 74.9%).
\vskip1.000000\baselineskip
Amiditas 2'-(Aminooxietoxi)nucleósido
[también conocidas en la técnica como amiditas
2'-O-(aminooxietil) se preparan tal y como se
describe en los siguientes párrafos. Las amiditas de adenosina,
citidina y timidina nucleósido se preparan de manera similar.
\vskip1.000000\baselineskip
El análogo de guanosina
2'-O-aminooxietil puede obtenerse
mediante 2'-O-alquilación selectiva
de diaminopurina ribosido. Las cantidades multigramos de
diaminopurina ribosido pueden adquirirse en Schering AG (Berlín)
para proporcionar
2'-O-(2-etilacetil)diaminopurina
ribosido junto con una cantidad menor de
3'-O-isómero.
2'-O-(2-etilacetil) diaminopurina
ribosido puede resolverse y convertirse en
2'-O-(2-etilacetil) guanosina
mediante tratamiento con adenosina deaminasa. (McGee, D. P., C.,
Cook, P. D., Guinosso, C. J., WO 94/02501 Al 940203.). Los
procedimientos de protección estándar deberían permitir que
2'-O-(2-etilacetil)
-5'-O-(4,4-dimetoxitritil)guanosina
y
2-N-isobutiril-6-O-difenilcarbamoil-2'-O-(2-etilacetil)-5'-O-(4,4-dimetoxitritil)guanosina
puedan reducirse para proporcionar
2-N-isobutiril-6-O-difenilcarbamoil-2'-O-(2-etilacetil)-5'-O-(4,4-dimetoxitritil)guanosina.
Al igual que anteriormente, el grupo hidroxil puede sustituirse por
N-hidroxiftalimida por medio de una reacción
Mitsunobu, y el nucleósido protegido puede fosfatizarse como es
habitual para producir
2-N-isobutiril-6-O-difenilcarbamoil-2'-O-(2-etilacetil)-5'-O-(4,4-dimetoxitritil)guanosina-3'-[(2-cianoetil)-N,N-diisopropilfosforamidita].
\vskip1.000000\baselineskip
Las amiditas
2-dimetilaminoetoxietoxi nucleósido (también
conocidas en la técnica como 2'-O-
dimetilaminoetoxietoxietil, es decir,
2'-O-CH_{2}-O-CH_{2}-N(CH_{2})_{2}
o amiditas 2-DMAEOE nucleósido) se preparan del
siguiente modo. Otras amiditas de nucleósido se preparan de manera
similar.
\newpage
Se añade de manera lenta
2[2-(Dimetilamino) etanol (Aldrich, 6.66 g, 50 mmol) a una
solución de borano en tetrahidrofurano (1 M, 10 mL, 10 mmol)
agitando en una bomba de 100 mL. Se desarrolla gas de hidrógeno
según el sólido se disuelve.
O^{2}-,2'-anhidro-5-metiluridina
(1.2 g, 5 mmol), y bicarbonato sódico (2.5 mg) se añaden y la
bomba se sella, se coloca en un baño de aceite y se calienta a
155ºC durante 26 horas. La bomba se enfría a temperatura ambiente y
se abre. Se concentra la solución en crudo y el residuo se divide
entre agua (200 mL) y hexanos (200 mL). el fenol de exceso se
extrae con acetato de etilo (3x200 mL) y las capas orgánicas
combinadas se lavan una vez con agua, se secan sobre sulfato sódico
de anhidro y se concentran. El residuo se somete a columna de gel
de sílice usando metanol/cloruro de metileno 1:20 (que tiene un 2%
trietilamina) como el eluyente. Cuando las fracciones de columna se
concentran se forma un sólido incoloro que se recoge para dar el
compuesto del título como un sólido blanco.
\vskip1.000000\baselineskip
A 0.5 g (1.3 mmol) de
2'-O-[2(2-N,N-dimetilaminoetoxi)etil]-5-metil
uridina en piridina de anhidro (8 mL), se añadieron trietilamina
(0.36 mL) y cloruro de dimetoxitritil (DMT-Cl, 0.87
g, 2 eq.) y se agitan durante una hora. La mezcla de la reacción se
vierte en agua (200 mL) y se extrae con CH_{2}Cl_{2} (2x200
mL). Las capas CH_{2}Cl_{2} combinadas se lavan con solución
NaHCO_{3} saturada, seguido por la solución NaCl saturada y se
secan sobre sulfato sódico de anhidro. La evaporación del
disolvente seguida por la cromatografía de gel de sílice usando
MeOH: CH_{2}Cl_{2}:Et_{3}N (20:1, v/v, con 1% trietilamina)
da como resultado el compuesto del título.
\vskip1.000000\baselineskip
Se añaden diisopropilaminotetrazolida (0.6 g) y
2-cianoetoxi-N,N-diisopropil
fosforamidita (1.1 mL, 2 eq.) a una solución de
5'-O-dimetoxitritil-2'-O-[2(2-N,
N-dimetilaminoetoxi)
etil)]-5-metil uridina (2.17 g, 3
mmol) disuelta en CH_{2}Cl_{2} (20 mL) bajo una atmósfera de
argón. La mezcla de la reacción se agita durante la noche y el
disolvente se evapora. El residuo resultante se purifica mediante
una cromatografía de columna con destellos de gel de sílice con
acetato de etilo como eluyente para dar el compuesto del título.
\vskip1.000000\baselineskip
Oligonucleótidos de osfofiéster sustituido y no
sustituido (P=O) se sintetizan en un sintetizador automatizado de
ADN (Modelo Applied Biosystems 380B) usando química de
fosforamidita estándar con oxidación mediante yodo.
Los fosforotioatos (P=O) se sintetizan en lo
relativo a los oligonucleótidos fosfodiéster excepto que la botella
de oxidación estándar fue sustituida por 0.2 M solución de
3H-1,2-benzoditiol-3-uno
1,1-dióxido en acetonitrilo para someter a tiación
de manera gradual los enlaces de fosfato. El paso de espera de
tiación aumentó a 68 segundos y fue seguido por el paso de colocar
una capa o funda. Tras la división de la columna CPG y el
desbloqueo en hidróxido de amonio concentrado a 55ºC (18 h), los
oligonucleótidos se purificaron mediante precipitación dos veces
con 2.5 volúmenes de etanol de una solución de 0.5 m NaCl. Los
oligonucleótidos de fosfinato se preparan tal y como se describe en
la Patente U.S. 5,508,270.
Los oligonucleótidos de fosfonato de alquilo se
preparan tal y como se describe en la Patente U.S 4,469,863.
Los oligonucleótidos
3'-Deoxi-3'-metileno
fosfonato se preparan tal y como se describe en las Patentes U.S
5,610,289 o 5,625,050.
Los oligonucleótidos de fosforamidita se
preparan tal y como se describe en la Patente U.S 5,256,775 o la
Patente U.S 5,366,878.
Los oligonucleótidos de alquilfosfonotioato se
preparan tal y como se describe en las solicitudes PCT publicadas
PCT/US94/00902 y PCT/US93/06976 (publicadas como WO 94/17093 y WO
94/02499, respectivamente).
Los oligonucleótidos
3'-Deoxi-3'-amino
fosforamidato se preparan tal y como se describe en la Patente U.S
5,476,925.
Los oligonucleótidos de fosfodiéster se preparan
tal y como se describe en la Patente U.S 5,023,243.
Los oligonucleótidos de borano fosfato se
preparan tal y como se describe en las Patentes U.S 5,130,302 y
5,177,198.
\vskip1.000000\baselineskip
Los oligonucleósidos enlazados con
metilenemetilimino, también identificados como oligonucleósidos
enlazados con MMI, oligonucleósidos enlazados con
metilenedi-metilhidrazo, también identificados como
oligonucleósidos enlazados con MDH, y oligonucleósidos enlazados
con metilenecarbonilamino, también identificados como
oligonucleósidos enlazados con amida-3, y
oligonucleósidos enlazados con metileneaminocarbonil, también
identificados como oligonucleósidos enlazados con
amida-4, así como compuestos mezclados de espina
dorsal que tienen, por ejemplo, MMI alternativos y enlaces P=O o
P=S se preparan tal y como se describe en las Patentes U.S
5,378,825, 5,386,023, 5,489,677, 5,602,240 y 5,610,289.
Los oligonucleósidos enlazados con formacetal o
tioformacetal se preparan tal y como se describe en las Patentes
U.S 5,264,562 y 5,264,564.
Los oligonucleótidos enlazados con óxido de
etileno se preparan tal y como se describe en la Patente U.S
5,223,618.
\vskip1.000000\baselineskip
Los ácidos nucleicos de péptido (PNAs) se
preparan de acuerdo con uno de los varios procedimientos referidos
a los Ácidos Nucleicos de Péptido (PNA): Síntesis, Propiedades y
Aplicaciones Potenciales, Bioorganic & Medicinal
Chemistry, 1996, 4, 5-23. También pueden
prepararse de acuerdo con las Patentes U.S 5, 539, 082, 5,700,922 y
5, 719, 262.
\vskip1.000000\baselineskip
Los oligonucleótidos quiméricos,
oligonucleósidos o oligonucleótidos/oligonucleósidos mezclados de
la invención pueden se de varios tipos diferentes. Estos incluyen
un primer tipo donde el segmento "vacío" de nucleósidos
enlazados se posiciona entre los segmentos "ala" 5' y 3' de
nucleósidos enlazados y un segundo tipo "extremo abierto"
donde el segmento "vacío" se localiza bien en la terminal 3' o
5' del compuesto oligomérico. Los oligonucleótidos del primer tipo
también son conocidos en la técnica como "gapmer" u
oligonucleótidos con separación. Los oligonucleótidos del segundo
tipo también son conocidos en la técnica como "hemimer" o
"wingmer".
\vskip1.000000\baselineskip
Los oligonucleótidos quiméricos que tienen
segmentos 2'-O-alquil fosforotioato
y oligonucleótidos 2'-deoxi fosforotioato se
sintetizan usando un sintetizador de ADN automatizado Applied
Biosystems Modelo 380B, como en el caso anterior. Los
oligonucleótidos se sintetizan usando el sintetizador automatizado y
2'-deoxi-5'-dimetoxitritil-3'-O-fosforamidita
para la parte ADN y 5'-
dimetoxitritil-2'-O-metil-3'-O-fosforamidita
para las alas 5' y 3'. El ciclo estándar de síntesis se modifica
aumentando el paso de espera tras el envío de tetrazola y base a
600 segundos repetidos cuatro veces para ARN y dos veces para
2'-O-metilo. El oligonucleótido
totalmente protegido se divide desde el soporte y el grupo fosfato
se desprotege en 3:1 amonio/etanol a temperatura ambiente y a
continuación se liofiliza hasta alcanzar la sequedad.
Posteriormente se realiza el tratamiento en amonio metanólico
durante 24 horas a temperatura ambiente para desproteger todas las
bases y la muestra se vuelve a liofilizar hasta alcanzar la
sequedad. La paleta se suspende en 1M TBAF en THF durante 24 horas
a temperatura ambiente para desproteger las posiciones 2'. A
continuación la reacción se enfría con 1M TEAA y la muestra se
reduce posteriormente a ½ del volumen mediante Rotovac antes de de
desalarse en una columna de exclusión de tamaño G25. A
continuación, el oligo recuperado se analiza mediante
espectrometría para la producción y para pureza mediante
electroforesis capilar y mediante espectrometría de masa.
\vskip1.000000\baselineskip
Los oligonucleótidos quiméricos fosforotioato
[2'-O-(2-metoxietil)]-
-[2'-deoxi]-
-[2'-O-(2-Metoxietil)] se prepararon
siguiendo el procedimiento anteriormente mencionado para el
oligonucleótido quimérico
2'-O-metil, con la sustitución de
amiditas 2'-O-(metoxietil) por amiditas
2'-O-metil.
\vskip1.000000\baselineskip
Los oligonucleótidos quiméricos
[2'-O-(2-Metoxietil)Fosfodiéster]-
-[2'-deoxi Fosforotioato]-
-[2'-O-(2-Metoxietil) Fosfodiéster]
se preparan siguiendo el procedimiento anteriormente mencionado
para el oligonucleótido quimérico
2'-O-metil, con la sustitución de
amiditas 2'-O-(metoxietil) por amiditas
2'-O-metil, la oxidación con yodo
para generar los enlaces de internucleótido fosfodiéster en el
interior de las porciones ala de las estructuras quimérica y la
sulfurización utilizando 3,H-1,2,
benzoditiol-3-uno 1,1 dióxido
(Beaucage Reagent) para generar los enlaces de internucleótido
fosfodiéster para el hueco central.
Otros oligonucleótidos quiméricos,
oligonucleósidos quiméricos y oligonucleótidos/oligonucleósidos
quiméricos mezclados se sintetizan de acuerdo con la Patente de
Estados Unidos 5,623,065.
\vskip1.000000\baselineskip
Tras la división de la columna de cristal con
poros controlada (Applied Biosystems) y el desbloqueo en hidróxido
de amonio con concentrado a 55ºC durante 18 horas, los
oligonucleótidos u oligonucleósidos se analizan mediante
electroforesis de gel de poliacrilamida sobre geles
desnaturalizantes y se calcula que es al menos el 85% del material
de longitud completa. Las cantidades relativas de enlaces de
fosforotioato y fosfodiéster obtenidas mediante síntesis se
comprueban periódicamente mediante espectroscopia de resonancia
magnética nuclear ^{31}P, y para algunos estudios los
oligonucleótidos se purificaron mediante HPLC, tal y como se
describe en Chiang et al., J. Biol. Chem. 1991, 266,
18162-18171. Los resultados obtenidos con el
material purificado HPLC fueron similares a los obtenidos con el
material purificado no HPLC.
\vskip1.000000\baselineskip
Los oligonucleótidos se sintetizaron por medio
de química con fosforamidita en fase sólida P(III) en un
sintetizador automatizado capaz de acumular 96 secuencias de manera
simultánea en un formato estándar con 96 pozos. Los enlaces de
internucleótido fosfodiéster fueron posibles gracias a la oxidación
con yodo acuoso. Los enlaces de internucleótido fosforotioato se
generaron mediante sulfurización utilizando 3,H-1,2,
benzoditiol-3-uno 1,1 dióxido
(Beaucage Reagent) en acetonitrilo de anhidro. Las fosforamiditas
con base protegida estándar
beta-cianoetildiisopropil se compraron en
vendedores comerciales (por ejemplo, PE-Applied
Biosystems, Foster City, CA, o Pharmacia, Piscataway, NJ). Los
nucleósidos no-estándar se sintetizan siguiendo los
sistemas publicados o los métodos patentados. Se utilizan como
fosforamiditas con base protegida
beta-cianoetildiisopropil.
Los oligonucleótidos se dividen del soporte y se
desprotegen con NH_{4}OH_{4} concentrado a elevada temperatura
(55-60ºC) durante 12-16 horas y el
producto liberado se seca a continuación en vacío. A continuación,
el producto seco se vuelve a suspender en agua estéril para formar
una placa maestra desde la cual se diluyen a continuación todas las
muestras analíticas y muestras de la placa del test utilizando
pipetas robóticas.
\vskip1.000000\baselineskip
La concentración de oligonucleótido en cada pozo
se calculó mediante dilución de muestras y espectroscopia de
absorción UV. La integridad de longitud completa de los productos
individuales se evaluó mediante electroforesis capilar (CE) en el
formato con 96 pozos (Beckham P/ACE^{TM} MDQ) o, para muestras
preparadas individualmente, en un aparato comercial CE (por
ejemplo, Beckham P/ACE^{TM} 5000, ABI 270). La composición de la
base y el eje se confirmó mediante análisis de masa de los
compuestos utilizando electroforesis de
electrospray-masa. Todas las placas del ensayo se
diluyeron a partir de la placa maestra usando pipetas robóticas de
único canal y multi-canal. Se calculó que las placas
eran aceptables si al menos el 85% de los compuestos sobre la
placa eran al menos 85% de longitud completa.
\vskip1.000000\baselineskip
El efecto de compuestos antisentido en expresión
de ácido nucleico objetivo puede comprobarse en cualquiera de los
tipos celulares siempre y cuando el ácido nucleico objetivo esté
presente en niveles mensurables. Esto se puede determinar de manera
rutinaria usando, por ejemplo, NCR o el análisis de Northern blot.
Los siguientes cinco tipos de células son presentados con fines
ilustrativos, pero se pueden emplear otros tipos de células, siembre
y cuando el objetivo se exprese en el tipo de célula escogido. Esto
se puede determinar de manera sencilla mediante métodos habituales
en la técnica, por ejemplo, análisis de Northern blot, ensayos de
protección de ribonucleasa, o RT-PCR.
\vskip1.000000\baselineskip
La línea celular T-24 de
carcinoma de vejiga celular transicional humana se obtuvo a partir
de la Colección Americana de Cultivos Tipo (AMCC) (Manassas, VA).
Las células T-24 se cultivaron de manera rutinaria
en un medio basal completo McCoy 5A (Gibco/Life Technologies,
Gaithersburg, MD), se complementaron con 10% de suero de ternero
fetal (Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD), 100 unidades de
penicilina por mL, y 100 microgramos de estreptomicina por mL
(Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD). Las células se pasaron
mediante tripsinización y dilución cuando alcanzaron 90% de
confluencia. Las células se sembraron en placas con 96 pozos
(Falcon-Primaria #3872) en una densidad de 7000
células/pozo para uso en un análisis RT-PCR.
Para el ensayo Northern blot u otros análisis,
las células pueden sembrarse en 100 mm o en otras placas de cultivo
de tejido estándar y tratarse de manera similar, empleando
volúmenes apropiados de medio y oligonucleótido.
\vskip1.000000\baselineskip
La línea celular A594 de carcinoma pulmonar
humano se obtuvo a partir de la Colección Americana de Cultivos
Tipo (AMCC) (Manassas, VA). Las células A594 se cultivaron de
manera rutinaria en un medio basal DMEM (Gibco/Life Technologies,
Gaithersburg, MD), se complementaron con 10% de suero de ternero
fetal (Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD), 100 unidades de
penicilina por mL, y 100 microgramos de estreptomicina por mL
(Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD). Las células se pasaron
mediante tripsinización y dilución cuando alcanzaron 90% de
confluencia.
\vskip1.000000\baselineskip
Fibroblasto dérmico neonatal humano (NHDF) se
obtuvo a partir de la Corporación Clonetics (Walkersville MD). Los
NHDFs se mantuvieron de manera rutinaria en un Medio de Crecimiento
de Fibroblasto (Corporación Clonetics, Walkersville MD)
complementados siguiendo las recomendaciones del proveedor. Las
células se mantuvieron hasta 10 pasos tal y como lo recomienda el
proveedor.
\vskip1.000000\baselineskip
Los queratinocitos embrionarios humanos (HEK) se
obtuvieron a partir de la Corporación Clonetics (Walkersville MD).
Los HEKs se mantuvieron de manera rutinaria en un Medio de
Crecimiento de Fibroblasto (Corporación Clonetics, Walkersville MD)
formulados siguiendo las recomendaciones del proveedor. Las células
se mantuvieron hasta 10 pasos tal y como lo recomienda el
proveedor.
\vskip1.000000\baselineskip
La línea celular PC-12 neuronal
de rata se obtuvo a partir de la Colección Americana de Cultivos
Tipo (AMCC) (Manassas, VA). Las células PC-12 se
cultivaron de manera rutinaria en DMEM, con elevada glucosa
(Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD), complementadas con 10%
de suero de caballo + 5% de suero de ternero fetal (Gibco/Life
Technologies, Gaithersburg, MD). Las células se pasaron de manera
rutinaria mediante tripsinización y dilución cuando alcanzaron 90%
de confluencia. Las células se sembraron en placas con 96 pozos
(Falcon-Primaria #3872) en una densidad de 20000
células/pozo para uso en un análisis RT-PCR.
Para el ensayo Northern blot u otros análisis,
las células pueden sembrarse en 100 mm o en otras placas de cultivo
de tejido estándar y tratarse de manera similar, empleando
volúmenes apropiados de medio y oligonucleótido.
\vskip1.000000\baselineskip
Cuando las células alcanzaron el 80% de
confluencia, fueron tratadas con oligonucleótido. Para células que
crecieron en placas con 96 pozos, los pozos se lavaron una vez con
200 \muL OPTI-MEM^{TM}-1 medio
de suero reducido (Gibco BRL) y a continuación se trataron con 30
\muL de OPTI-MEM^{TM}-1 que
contenía 3.75 \mug/ml LIPOFECTIN^{TM} (Gibco BRL) y la
concentración deseada de oligonucleótido. Tras 4-7
horas de tratamiento, el medio fue sustituido por un medio fresco.
Las células se cosecharon 16-24 horas tras el
tratamiento con el oligonucleótido.
La concentración de oligonucleótido empleada
varía de línea celular a línea celular. Para determinar la
concentración óptima de oligonucleótido para una línea celular en
particular las células son tratadas con un oligonucleótido positivo
de control en un rango de concentraciones. Para células humanas el
oligonucleótido positivo de control es ISIS 13920,
TCCGTCATCGCTCCTCAGGG, SEQ ID NO: 1, un gapmer
2'-O-metoxietil
(2'-O-metoxietiles mostrados en
negrita) con un eje de fosforotioato que se alcanza hasta el
H-ras humano. Para células de ratones y ratas el
oligonucleótido positivo de control es ISIS 15770,
ATGCATTCTGCCCCCAAGGA, SEQ ID NO: 2, un gapmer
2'-O-metoxietil
(2'-O-metoxietiles mostrados en
negrita) con un eje de fosforotioato que se alcanza hasta el
c-raf tanto del ratón como de la rata. La
concentración de oligonucleótido positivo de control que da como
resultado el 80% de inhibición de
c-Ha-ras (para ISIS 13920) o
c-raf (para ISIS 15770) mARN a continuación se
utiliza como concentración analítica para nuevos oligonucleótidos
en posteriores experimentos para esa línea celular. Si no se
alcanza el 80% de inhibición, la concentración más baja de
oligonucleótido de control positivo que da como resultado el 60% de
inhibición de H-ras o c-raf mARN se
utiliza a continuación como concentración analítica de
oligonucleótido en posteriores experimentos para esa línea celular.
Si no se alcanza el 60% de inhibición, se determina que esa línea
celular en particular no resulta adecuada para experimentos de
transfección de oligonucleótido.
\vskip1.000000\baselineskip
La modulación antisentido de expresión PTP1B
puede analizarse de una variedad de maneras conocidas en la
técnica. Por ejemplo, los niveles PTP1B mARN pueden contabilizarse
mediante, por ejemplo, análisis Northern blot, reacción en cadena
de la polimerasa competitiva (PCR), o PCR a tiempo real
(RT-PCR). Actualmente, es preferible el PCR a
tiempo real. El análisis de ARN puede llevarse a cabo sobre ARN
celular total o en poli(A) + ARN. Los métodos para aislar
ARN se presentan en, por ejemplo, Ausubel, F. M. et al., Current
Protocols in Molecular Biology, Volumen 1, pp.
4.1.1-4.2.9 y 4.5.1-4.5.3, John
Wiley & Sons, Inc., 1993. El análisis Northern blot supone una
rutina en la técnica y se describe en, por ejemplo, Ausubel, F. M.
et al., Current Protocols in Molecular Biology, Volumen 1,
pp. 4.2.1-4.2.9, John Wiley & Sons, Inc., 1996.
La contabilización a tiempo real (PCR) puede llevarse a cabo de
manera correcta usando el Sistema de Detección Secuencial ABI
PRISM^{TM} 7700 disponible en el mercado, disponible en
PE-Applied Biosystems, Foster City, CA y emplearse
de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Antes del análisis
cuantitativo PCR, se evalúan equipos de sondas para imprimadores
específicos para el gen objetivo que se está midiendo para su
habilidad para "multiplicarse" con una reacción de
amplificación GAPDH. En la multiplicación, tanto el gen objetivo o
el gen interno estándar GADPH se amplifican concurrentemente en una
única muestra. En este análisis, el mARN aislado de células no
tratadas se diluye en serie. Cada dilución se amplifica en
presencia del equipo de sonda imprimador específico solamente para
GAPDH, solamente el gen objetivo
("único-plex"), o ambos (multiplicación). Tras
la amplificación PCR, se generan curvas estándar de GAPDH y señal
objetivo de mARN como una función de dilución a partir de muestras
único-plex o multiplicadas. Si tanto el coeficiente
de curva y correlación del GAPDH y las señales objetivo de las
muestran multiplicadas corresponden al 10% de sus valores
correspondientes generados por las muestras
único-plex, el equipo
imprimador-sonda específico para ese objetivo es
considerado como multiplicable. Otros métodos de PCR también son
conocidos en la técnica.
Los niveles de proteína de PTP1B pueden
contabilizarse en una variedad de modos bien conocidos en la
técnica, como inmunoprecipitación, análisis Western blot
(inmunoblotting), ELISA o clasificación de células activadas por
fluorescencia (FACS). Los anticuerpos dirigidos a PTP1B pueden
identificarse y obtenerse a partir de una variedad de fuentes, como
el catálogo MSRS de anticuerpos (Aerie Corporation, Birmingham,
MI), o pueden prepararse mediante métodos convencionales de
preparación de anticuerpos. Los métodos para la preparación de
antisuero policlonal se describen en, por ejemplo, Ausubel, F. M.
et al., Current Protocols in Molecular Biology, Volumen 2,
pp. 11.12.1-11.12.9, John Wiley & Sons, Inc.,
1997. La preparación de anticuerpos monoclonales se describe en,
por ejemplo, Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in
Molecular Biology, Volumen 2, pp.
11.4.1-11.11.5, John Wiley & Sons, Inc.,
1997.
Los métodos de inmunoprecipitación son estándar
en la técnica y pueden encontrarse en, por ejemplo, Ausubel, F. M.
et al., Current Protocols in Molecular Biology, Volumen 2,
pp. 10.16.1-10.16.11, John Wiley & Sons, Inc.,
1998. El análisis Western blot (inmunoblot) es estándar en la
técnica y puede encontrarse en, por ejemplo, Ausubel, F. M. et
al., Current Protocols in Molecular Biology, Volumen 2, pp.
10.8.1-10.8.21, John Wiley & Sons, Inc., 1997.
Los ensayos inmunosorbentes ligados a enzima (ELISA) son estándar
en la técnica y pueden encontrarse en, por ejemplo, Ausubel, F. M.
et al., Current Protocols in Molecular Biology, Volumen 2,
pp. 11.2.1-11.2.22, John Wiley & Sons, Inc.,
1998.
\vskip1.000000\baselineskip
Poli(A) + mARN fueron aislados de acuerdo
con Miura et al., Clin. Chem., 1996, 42,
1758-1764. Otros métodos para el aislamiento poli
(A) + mARN se describen en, por ejemplo, Ausubel, F. M. et al.,
Current Protocols in Molecular Biology, Volumen 1, pp.
4.5.1-4.5.3, John Wiley & Sons, Inc., 1993. En
resumen, para células cultivadas en placas de 96 pozos, el medio de
crecimiento fue retirado de las células y cada pozo se lavó con 200
\muL PBS frío. Se añadió 60 \muL de búfer tisis (10 mM
Tris-HCl, pH 7.6, 1 mM EDTA, 0.5 M NaCl, 0.5%
NP-40, 20 mM complejo
vanadil-ribonucleósido) a cada pozo, la placa se
agitó suavemente y a continuación se incubó a temperatura ambiente
durante cinco minutos. 55 \muL del lisado se transfirió a placas
de 96 pozos cubiertos con Oligo d(T) (AGCT Inc., Irving CA).
Las placas se incubaron durante 60 minutos a temperatura ambiente,
se lavaron 3 veces con 200 \muL de búfer de lavado (10 mM
Tris-HCl, pH 7.6, 1mM EDTA, 0.3 M NaCl). Tras el
lavado final, las placa se secó sobre toallas de papel para retirar
el exceso de búfer de lavado y a continuación se secaron al aire
durante 5 minutos. Se añadieron 60 \muL de búfer de elución (5 mM
Tris-HCl pH 7.6), precalentado a 70ºC, a cada pozo,
la placa se incubó en una placa caliente a 90ºC durante 5 minutos,
y a continuación el eluído se transfirió a una placa fresca con 96
pozos.
Las células que crecieron en placas de 100 mm o
en otras placas estándar pueden tratarse de manera similar, usando
volúmenes apropiados de todas las soluciones.
\vskip1.000000\baselineskip
El total de ARN fue aislado empleando un kit
RNEASY 96^{TM} y los búferes adquiridos en Qiagen Inc. (Valencia
CA) siguiendo las instrucciones recomendadas por el fabricante. En
resumen, para células cultivadas en placas de 96 pozos, el medio de
crecimiento fue retirado de las células y cada pozo se lavó con 200
\muL PBS frío. Se añadieron 100 \mul de búfer RLT a cada pozo y
la placa fue agitada de manera vigorosa durante 20 segundos. A
continuación se añadieron 100 \muL de etanol 70& a cada pozo
y los contenidos se mezclaron con pipetas tres veces hacia arriba y
hacia abajo. Posteriormente, las muestras se transfirieron a la
placa de pozos RNEASY 96^{TM} unida a un colector QIAVAC^{TM}
con una bandeja de recogida de residuos y unido a una fuente de
vacío. Se aplicó el vacío durante 15 segundos. Se añadió 1 mL de
búfer RW1 a cada pozo de la placa RNEASY 96^{TM} y se volvió a
aplicar el vacío durante 15 segundos. A continuación se añadió 1 mM
de búfer RPE a cada pozo de la placa RNEASY 96^{TM} y se aplicó
el vacío durante un periodo de 15 segundos. A continuación se
repitió el lavado con búfer RPE y el vació se aplicó durante un
periodo adicional de 10 minutos. La placa fue retirada
posteriormente del colector QIAVAC^{TM} y se secó sobre toallas
de papel. La placa se volvió a unir con el colector QIAVAC^{TM}
adaptado con una rejilla de tubo de recogida que contenía tubos de
colección de 1.2 mL. Después se eluyó el ARN mediante la
introducción con pipetas de 60 \muL de agua en cada pozo, se
incubó durante 1 minuto, y a continuación se aplicó el vacío
durante 30 segundos. El paso de elución se repitió con 60 \muL de
agua adicional.
Los pasos repetitivos de introducción de pipeta
y elución pueden automatizarse empleando QIAGEN
Bio-Robot 9604 (Qiagen, Inc., Valencia CA). En
esencia, tras la tisis celular sobre la placa de cultivo, la placa
es transferida a la cubierta del robot donde se llevan a cabo los
pasos de introducción de pipeta, tratamiento de ADNasa y
elución.
elución.
\vskip1.000000\baselineskip
La cuantificación de niveles PTP1B mARN se
determinó mediante PCR cuantitativo a tiempo real usando el Sistema
de Detección Secuencial ABRI PRISM^{TM} 7700
(PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) de acuerdo
con las instrucciones del fabricante. Este es un sistema con un
tubo cerrado, basado en la falta de gel, con detección fluorescente
que permite una cuantificación con un elevado rendimiento de
productos en reacción en cadena de polimerasa (PCR) en tiempo real.
Al contrario que el PCR estándar, en el cual los productos de
amplificación son contabilizados después de la finalización de PCR,
los productos de PCR cuantitativo en tiempo real son contabilizados
a medida que se acumulan. Esto se consigue incluyendo en la
reacción PCR una sonda de oligonucleótido que templa
específicamente entre los imprimadores delantero y trasero, y
contiene dos tintes fluorescentes. Un tinte reportero (por ejemplo,
JOE, FAM o VIC, obtenido bien de Operon Technologies Inc., Alameda,
CA o de PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) se
une al extremo 5' de la sonda y un tinte enfriador (por ejemplo,
TAMRA, obtenido bien de Operon Technologies Inc., Alameda, CA o de
PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) se une al
extremo 3' de la sonda. Cuando la sonda y los tintes están
intactos, la emisión del tinte reportero se enfría mediante la
proximidad del tinte enfriador 3'. Durante la amplificación, la
acción de templar la sonda con la secuencia objetivo crea un
sustrato que puede dividirse mediante la actividad de
5'-exonucleasa de polimerasa Taq. Durante la fase de
extensión del ciclo de amplificación PCR, la división de la sonda
mediante polimerasa Taq libera al tinte reportero del resto de la
sonda (y por lo tanto de la fracción que enfría) y se genera una
señal fluorescente específica de la secuencia. Con cada ciclo,
moléculas de tinte reportero adicionales se parten de sus
respectivas sondas, y la intensidad fluorescente se controla en
intervalos regulares mediante óptica láser construida en el Sistema
de Detección Secuencial ABRI PRISM^{TM} 7700. En cada ensayo, una
serie de reacciones paralelas que contienen diluciones en serie de
mARN de muestras de control no tratadas genera una curva estándar
que se emplea para cuantificar el porcentaje de inhibición tras el
tratamiento de oligonucleótidos antisentido de la muestras del
ensayo.
Los reagentes PCR se obtuvieron de
PE-Applied Biosystems, Foster City, CA. Las
reacciones RT-PCR se llevaron a cabo añadiendo 25
\mul cocktail PCR (Ix búfer TAQMAN^{TM}A, 5.5 mM MgCl_{2},
300 pM respectivamente de dATP, dCTP y dGTP, 600 pm de dUPT, 100 nM
respectivamente de imprimador delantero, imprimador trasero, y
sonda, 20 Unidades de inhibidor ARNasa, 1.25 Unidades de AMPLITAQ
GOLD^{TM}, y 12.5 Unidades de transcriptasa inversa MuLV) a
placas de 96 pozos que contenían 25 pL de solución poli(A)
mARN. La reacción RT se llevó a cabo mediante incubación durante 30
minutos a 48ºC. Tras una incubación de 10 minutos a 95ºC para
activar el AMPLITAQ GOLD^{TM}, se realizaron 40 ciclos de un
protocolo PCR de dos pasos: 95ºC durante 15 segundos
(desnaturalización) seguido de 60ºC durante 1.5 minutos
(templanza/extensión).
\vskip1.000000\baselineskip
Las sondas y los imprimadores para PTP1B humano
fueron diseñados para hibridizar la secuencia PTP1B humana, usando
información secuencial publicada (Número de acceso GenBank M31724,
aquí incorporado como SEQ ID NO: 3). Para PTP1B humano los
imprimadores PCR fueron:
Imprimador delantero: GGAGTTCGAGCAGATCGACAA (SEQ
ID NO: 4).
Imprimador trasero: GGCCACTCTACATGGGAAGTC (SEQ
ID NO: 5) y la sonda PCR fue:
FAM-AGCTGGGCG
GCCATTTACCAGGAT-TAMRA (SEQ ID NO: 6) donde FAM (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) es el tinte reportero fluorescente y TAMRA (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) es el tinte enfriador.
GCCATTTACCAGGAT-TAMRA (SEQ ID NO: 6) donde FAM (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) es el tinte reportero fluorescente y TAMRA (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) es el tinte enfriador.
\vskip1.000000\baselineskip
Para GAPDH los imprimadores PCR fueron:
Imprimador delantero: GAAGGTGAAGGTCGGAGTC (SEQ
ID NO: 7).
Imprimador trasero: GAAGATGGTGATGGGATTTC (SEQ ID
NO: 8) y la sonda PCR fue: 5'
JOE-CAAGCTTCC
CGTTCTCAGCC-TAMRA 3' (SEQ ID NO: 9) donde JOE (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) es el tinte reportero fluorescente y TAMRA (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) es el tinte enfriador.
CGTTCTCAGCC-TAMRA 3' (SEQ ID NO: 9) donde JOE (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) es el tinte reportero fluorescente y TAMRA (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) es el tinte enfriador.
\vskip1.000000\baselineskip
Las sondas y los imprimadores para PTP1B de rata
fueron diseñados para hibridizar la secuencia PTP1B de rata, usando
información secuencial publicada (Número de acceso GenBank M33962,
aquí incorporado como SEQ ID NO:10). Para PTP1B de rata los
imprimadores PCR fueron:
Imprimador delantero: CGAGGGTGCAAAGTTCATCAT (SEQ
ID NO: 11).
Imprimador trasero: CCAGGTCTTCATGGGAAAGCT (SEQ
ID NO: 12) y la sonda PCR fue:
FAM-CGACTCGTCAGTGCAGGATCAGTGGA-TAMRA
(SEQ ID NO: 13) FAM (PE-Applied Biosystems, Foster
City, CA) es el tinte reportero fluorescente y TAMRA
(PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) es el
tinte enfriador.
\vskip1.000000\baselineskip
Para GAPDH los imprimadores PCR fueron:
Imprimador delantero: TGTTCTAGAGACAGCCGCATCTT
(SEQ ID NO: 14).
Imprimador trasero: CACCGACCTTCACCATCTTGT (SEQ
ID NO: 15) y la sonda PCR fue: 5'
JOE-TTGTGCAGTGCCAGCCTCGTCTCA-TAMRA
3' (SEQ ID NO: 16) donde JOE (PE-Applied
Biosystems, Foster City, CA) es el tinte reportero fluorescente y
TAMRA (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) es
el tinte enfriador.
\vskip1.000000\baselineskip
18 horas después del tratamiento antisentido,
las monocapas celulares se lavaron dos veces con PBS frío y se
lisaron en 1 mL RNAZOL^{TM} (TEL-TEST "B"
Inc., Friendswood, TX). El ARN total se preparó siguiendo los
protocolos recomendados por el fabricante. Se fraccionaron veinte
microgramos del ARN total mediante electroforesis a través de geles
1.2% agarosa que contenían 1.1% formaldehído empleando un sistema
búfer MOPS (AMRESCO, Inc. Solon, OH). El ARN fue transferido del
gel a membranas de nylon HYBOND^{TM}-N+ (Amersham
Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) mediante transferencia capilar
durante la noche empleando un sistema búfer de Transferencia
Northern/Southern (TEL-TEST "B" Inc.,
Friendswood, TX). La transferencia de ARN se confirmó mediante
visualización UV. Las membranas se fijaron mediante enlace cruzado
UV usando un Crosslinker 2400 STRATALINKER^{TM} UV (Stratagene,
Inc, La Jolla, CA) y a continuación se cubrió empleando solución de
hibridización QUICKHIB^{TM} (Stratagene, Inc, La Jolla, CA)
usando las recomendaciones del fabricante para condiciones
rigurosas.
rigurosas.
Para detectar PTP1B humano, se preparó una sonda
específica para PTP1B humano mediante PCR empleando el imprimador
delantero GGAGTTCGAGCAGATCGACAA (SEQ ID NO: 4) y el imprimador
trasero: GGCCACTCTACATGGGAAGTC (SEQ ID NO: 5). Para normalizar las
variaciones en la eficiencia de carga y transferencia las membranas
se vaciaron y se sondaron para hidrogenasasa humana
gliceraldehído-3-fosfato (GAPDH) ARN
(Clontech, Palo Alto, CA).
\newpage
Para detectar PTP1B de rata, se preparó una
sonda específica para PTP1B de rata mediante PCR empleando el
imprimador delantero CGAGGGTGCAAAGTTCATCAT (SEQ ID NO: 11) y el
imprimador trasero: CCAGGTCTTCATGGGAAAGCT (SEQ ID NO: 12). Para
normalizar las variaciones en la eficiencia de carga y
transferencia las membranas se vaciaron y se sondaron para
hidrogenasasa de rata
gliceraldehído-3-fosfato (GAPDH) ARN
(Clontech, Palo Alto, CA).
Las membranas hibridizadas se visualizaron y
cuantificaron usando PHOSPHORIMAGER^{TM} e IMAGEQUANT^{TM}
Software V3.3 (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA). Los datos se
normalizaron para niveles GAPDH en controles no tratados.
\vskip1.000000\baselineskip
De acuerdo con la presente invención, se
diseñaron un conjunto de oligonucleótidos para diferentes regiones
objetivo del ARN PTP1B humano empleando secuencias publicadas
((Número de acceso GenBank M31724, aquí incorporado como SEQ ID NO:
3). Los oligonucleótidos se muestran en la Tabla 1. "Punto
Objetivo" indica el primer número de nucleótido
(5'-máximo) en la secuencia objetivo particular con
la cual el oligonucleótido se enlaza. Todos los compuestos en la
Tabla 1 son oligonucleótidos quiméricos ("gapmers"), 20
nucleótidos en longitud, compuestos por una región central
"hueco" consistente en diez
2'-oligonucleótidos, que se encuentran flanqueados
en ambos lados (direcciones 5' y 3') por "alas" de cinco
nucleótidos. Las alas están compuestas por nucleótidos
2'-metoxietil- (2'-MOE). Los enlaces
de internucléosidos (eje) son fosforotioato (P=S) en todo el
oligonucleótido. Todos los residuos de citidina son
5-metilcitidinas. Los compuestos se analizaron en
busca de su efecto en niveles de PTP1B mARN humano mediante PCR
cuantitativo en tiempo real tal y como se ha descrito aquí en otros
ejemplos. Los datos son promedios de los dos experimentos. En el
caso de que ocurra "N.D" indica "sin datos".
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
Tal y como se muestra en la Tabla 1, las SEQ ID
NOS 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 27, 29, 30, 32, 33, 35, 36, 38,
39, 40, 42, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59,
60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 69, 70, 72, 73, 75, 78, 79, 80, 81,
83, 84, 86, 87, 89, 90, 92, 93, 94, 95 y 96 demuestran tener al
menos el 95% de inhibición de la expresión humana PTP1B en este
ensayo.
De acuerdo con la presente invención, se diseñó
un segundo conjunto de oligonucleótidos para diferentes regiones
objetivo de ARN PTP1B de rata, empleando secuencias publicadas
(Número de acceso GenBank M33962, aquí incorporado como SEQ ID NO:
10). Los oligonucleótidos se muestran en la Tabla 2. "Punto
Objetivo" indica el primer número de nucleótido
(5'-máximo) en la secuencia objetivo particular con
la cual el oligonucleótido se enlaza. Todos los compuestos en la
Tabla 2 son oligonucleótidos quiméricos ("gapmers"), 20
nucleótidos en longitud, compuestos por una región central
"hueco" consistente en diez
2'-oligonucleótidos, que se encuentran flanqueados
en ambos lados (direcciones 5' y 3') por "alas" de cinco
nucleótidos. Las alas están compuestas por nucleótidos
2'-metoxietil- (2'-MOE). Los enlaces
de internucléosidos (eje) son fosforotioato (P=S) en todo el
oligonucleótido. Todos los residuos de citidina son
5-metilcitidinas. Los compuestos se analizaron en
busca de su efecto en niveles de PTP1B mARN de rata mediante PCR
cuantitativo en tiempo real tal y como se ha descrito aquí en otros
ejemplos. Los datos son promedios de los dos experimentos. En el
caso de que ocurra "N.D" indica "sin datos".
\vskip1.000000\baselineskip
Tal y como se muestra en la Tabla 2, SEQ ID NOS
97, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 106, 107, 108, 109, 110, 112, 113,
114, 115, 117, 120, 121, 122, 123, 124, 126, 127, 128, 130, 131,
133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 144, 145, 146,
147, 148, 151, 152, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162,
163, 164, 164, 166, 167, 168, 168, 170, 171, 172, 173, 177, 178,
179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 191, 193,
195, 196, 198, 201, 202, 204, 205, 206, 211, 215, 217, 219, 223,
225, 226, 228, 229, 230, 232, 233, 235, 236, 237, 239 y 240
demuestran tener al menos el 30% de inhibición de la expresión de
rata PTP1B en este experimento.
\vskip1.000000\baselineskip
El análisis Western blot (análisis inmunoblot)
se lleva a cabo empleando métodos estándar. Las células se cultivan
16-20 horas tras el tratamiento de oligonucleótido,
se lavan una vez con PBS, se suspenden en búfer Laemmli (100
\mul/pozo), se hierven durante 5 minutos y se cargan en un gel
16% SDS-GEL. Los geles de dejan actuar durante 1.5
horas a 150 V, y se transfieren a la membrana para Western blot. Se
emplea el anticuerpo primario apropiado dirigido a PTP1B, con un
anticuerpo secundario radioetiquetado o etiquetado de manera
fluorescente dirigido contra la especie de anticuerpo primario. Las
bandas se visualizan empleando un PHOSPHORIMAGER^{TM} (Molecular
Dynamics, Sunnyvale, CA).
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> Isis Pharmaceuticals, Inc.
\hskip1cmLex M. Cowsert
\hskip1cmJacqueline Wyatt
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> MODULACIÓN ANTISENTIDO DE EXPRESIÓN
PTP1B
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> RTSP-0086
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 091487,368
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2000-01-18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 240
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3247
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (91) (1398)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Imprimador PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
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<212> ADN
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Sonda PCR
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<212> ADN
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<213> Rattus norvergicus
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<220>
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<221> CDS
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<212> ADN
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<220>
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<223> Oligonucleótido antisentido
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<400> 210
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\hskip1cm
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<210> 211
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Oligonucleótido antisentido
\newpage
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<400> 211
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\hskip1cm
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<210> 212
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Oligonucleótido antisentido
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<400> 212
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\hskip1cm
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<210> 213
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Oligonucleótido antisentido
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<400> 213
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\hskip1cm
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<210> 214
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Oligonucleótido antisentido
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<400> 214
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\hskip1cm
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<210> 215
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<211> 20
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<212> ADN
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<220>
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<223> Oligonucleótido antisentido
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<400> 215
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\hskip1cm
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Oligonucleótido antisentido
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<400> 216
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Oligonucleótido antisentido
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<400> 217
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\hskip1cm
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<210> 218
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Oligonucleótido antisentido
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<400> 218
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\hskip1cm
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<210> 219
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Oligonucleótido antisentido
\newpage
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<400> 219
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\hskip1cm
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<210> 220
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Oligonucleótido antisentido
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<400> 220
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\hskip1cm
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<210> 221
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Oligonucleótido antisentido
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<400> 221
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\hskip1cm
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<210> 222
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Oligonucleótido antisentido
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<400> 222
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
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<210> 223
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Oligonucleótido antisentido
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<400> 223
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
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<210> 224
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido antisentido
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<400> 224
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 225
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 225
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 226
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido antisentido
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 226
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 227
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido antisentido
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 227
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 228
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 228
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 229
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 229
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 230
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 230
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 231
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido antisentido
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 231
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 232
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 232
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 233
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 233
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 234
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 234
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 235
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido antisentido
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 235
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 236
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 236
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 237
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 237
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 238
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 238
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 239
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido antisentido
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 239
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 240
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 240
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
Claims (17)
1. Un compuesto antisentido de hasta 30
nucleobases en longitud que está formado por una de las SEQ ID NOS:
164-173 dirigido a una molécula de ácido nucleico
codificadora de PTP1B, hibridizándose dicho compuesto antisentido
específicamente e inhibiendo la expresión de PTP1B.
2. Un compuesto antisentido de acuerdo con la
reivindicación 1 que es un oligonucleótido antisentido.
3. Un compuesto antisentido de acuerdo con la
reivindicación 2, donde el oligonucleótido antisentido tiene una
secuencia que comprende SEQ ID NO: 164, 165, 166, 168, 169, 170,
171, 172 o 173.
4. Un compuesto antisentido de acuerdo con la
reivindicación 2, donde el oligonucleótido antisentido está
compuesto al menos por un enlace de internucleósido modificado.
5. Un compuesto antisentido de acuerdo con la
reivindicación 4, donde el enlace de internucleósido modificado es
un enlace de fosforotioato.
6. Un compuesto antisentido de acuerdo con la
reivindicación 2, donde el oligonucleótido antisentido comprende al
menos una fracción modificada de azúcar.
7. Un compuesto antisentido de acuerdo con la
reivindicación 6, donde la fracción modificada de azúcar es una
fracción de azúcar
2'-O-metoxietil.
8. Un compuesto antisentido de acuerdo con la
reivindicación 2, donde el oligonucleótido antisentido comprende al
menos una nucleobase modificada.
9. Un compuesto antisentido de acuerdo con la
reivindicación 8, donde la nucleobase modificada es una
5'-metilcitosina.
10. Un compuesto antisentido de acuerdo con la
reivindicación 2, donde el oligonucleótido antisentido es un
oligonucleótido quimérico.
11. Un compuesto antisentido de acuerdo con la
reivindicación 1, que tiene la secuencia SEQ ID NO: 166.
12. Un compuesto antisentido de acuerdo con la
reivindicación 11, donde los nucleótidos 1-5 y
16-20 de SEQ ID NO: 166 y nucleótidos
2'-metoxietil; nucleótidos 6-15 y
2'-deoxinucleótidos; todos los residuos de cistina
son 5-metilcitidinas y todos los enlaces de
internucleósido son fosforotioatos.
13. Una composición que consiste en un compuesto
antisentido de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 12 y un
portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.
14. Una composición de acuerdo con la
reivindicación 13, que además comprende un sistema de dispersión
coloidal.
15. Un compuesto de acuerdo con las
reivindicaciones 1 a 12 para uso en medicina.
16. Uso de un compuesto de acuerdo con las
reivindicaciones 1 a 12 en la preparación de un medicamento para
tratar diabetes, obesidad, cáncer, o un desorden
hiperproliferativo.
17. Un método para inhibir la expresión de PTP1B
in vitro en células o tejidos, que comprende la puesta en
contacto de dichas células o tejidos con un compuesto antisentido
de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 12 de modo que la expresión
de PTP1B se inhiba.
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