ES2307583T3 - Inhibicion antisentido de expresion ptpib. - Google Patents

Abstract

Un compuesto antisentido de hasta 30 nucleobases en longitud que está formado por una de las SEQ ID NOS: 164-173 dirigido a una molécula de ácido nucleico codificadora de PTP1B, hibridizándose dicho compuesto antisentido específicamente e inhibiendo la expresión de PTP1B.

Description

Inhibición antisentido de expresión PTP1B.

Campo de la invención

La presente invención proporciona composiciones y métodos para modular la expresión de PTP1B. En particular, esta invención se refiere a compuestos antisentido, en particular oligonucleótidos, específicamente hibridizables con ácidos nucleicos codificadores de PTP1B. Tales oligonucleótidos han demostrado que son capaces de modular la expresión de PTP1B.

Contexto de la invención

El proceso de fosforilación, definido como la unión de una fracción de fosfato con una molécula biológica por medio de la acción de enzimas llamadas quinasas, representa un medio por el cual las señales intracelulares se propagan dando como resultado finalmente una respuesta celular. En el interior de la célula, las proteínas pueden fosforilarse sobre residuos de serina, treonina o tirosina y el alcance de la fosforilación está regulado por la acción opuesta de las fosfatasas, que eliminan las fracciones de fosfato. Mientras la mayoría de la fosforilación proteica dentro de la célula sobre residuos de serina o treonina, la fosforilación se modula en su mayor extensión durante la transformación oncogénica y la estimulación del factor de crecimiento (Zhang, Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol., 1998, 33, 1-52).

Debido a que la fosforilación es un proceso consabido en el interior de las células y debido a que los fenotipos celulares están influenciados en gran medida por la actividad de estas rutas, actualmente se cree que el número de estados de enfermedad y/o desórdenes son el resultado de una activación atípica o anómala de, o mutaciones funcionales en, quinasas y fosfatasas. Como consecuencia, recientemente se ha prestado una considerable atención a la caracterización de quinasas de tirosinas y fosfatasas de quirosina.

PTPB1 (también conocido como fosfatasa de proteína 1B y PTPN1) es un retículo endoplásmico (ER)-enzima asociada originalmente aislada como la principal fosfatasa de tirosina proteica de la placenta humana (Tonks et al., J. Biol. Chem., 1988, 263, 6731-6737; Tonks et al., J. Biol. Chem., 1988, 263, 6722-6730).

PTPB1 ha establecido un papel regulador esencial en la señalización mediada por el receptor de insulina. PTP1B interactúa y desfosforila el receptor de insulina activado tanto en células in vitro con en células intactas dando como resultado la desregulación de la ruta señalizadora (Goldstein et al., Mol. Cell. Biochem., 1998, 182, 91-99; Seely et al., Diabetes, 1996, 45, 1379-1385). Además, PTP1B modula las acciones mitogénicas de la insulina (Goldstein et al., Mol. Cell. Biochem., 1998, 182, 91-99). En células de adiposa de ratas las células que sobreexpresan PTP1B, las translocalización del transportador de glucosa GLUT4 fue inhibido, implicando también que PTP1B fue un regulador negativo en el transporte de glucosa (Chen et al., J. Biol. Chem., 1997, 272, 8026-8031).

Los modelos de ratones knockout sin el gen PTP1B también señalan hacia la regulación negativa de la insulina señalizadora de PTP1B. Ratones que albergan un gen PTP1B afectado mostraron una mayor sensibilidad a la insulina, una mayor fosforilación del receptor de insulina y cuando fueron administrados una dieta alta en grasa, los ratones PTP1B -/- resistieron al aumento de peso y permanecieron sensibles a la insulina (Elchebly et al., Science, 1999, 283, 1544-1548). Estos estudios claramente establecieron que el PTP1B representa un objetivo terapéutico en el tratamiento de obesidad y diabetes.

PTP1B, que se regula diferencialmente durante el ciclo celular (Schievella et al., Cell. Growth Differ., 1993, 4, 239-246), se expresa en los tejidos sensibles a la insulina como dos isoformas diferentes que surgen a partir de uniones alternas del pre-mARN (Shifrin y Neel, J. Biol. Chem., 1993, 268, 25376-25384). Recientemente se ha demostrado que el radio de productos unidos alternativamente se ve afectado por factores del crecimiento tales como la insulina y difiere en varios tejidos examinados (Sell y Reese, Mol. Genet. Metab., 1999, 66, 189-192). En estos estudios también se descubrió que los niveles de las variantes estaban relacionados con la concentración de insulina en el plasma y el porcentaje de grasa corporal y por lo tanto podía emplearse como un biomarcador para paciente con hiperinsulinemia crónica o diabetes del tipo 2.

Liu y Chernoff han demostrado que PTP1B se enlaza y sirve como sustrato para el receptor de factor de crecimiento epidérmico (EGFR) (Liu y Chernoff, Biochem. J., 1997, 327, 139-145). Además, en las células del carcinoma epidermoide humano A431, PT1 B demostró estar inactivo a causa de la presencia de H202 generado por la adición de EGF. Estos estudios indican que PTP1B puede regularse negativamente por el estado de oxidación de la célula, que a menudos se desregula durante la tumorogénesis (Lee et al., J. Biol. Chem., 1998, 273, 15366-15372).

La sobreexpresión de PTP1B se ha demostrado en cánceres de ovario malignos y esta correlación ha ido acompañada de un concomitante aumento en la expresión de receptor del factor de crecimiento asociado (Wiener et al., Am. Obstet. Gynecol., 1994, 170, 1177-1183).

PTP1B ha demostrado que puede suprimir la transformación en células NIH3T3 inducidas por el nuevo oncogén (Brown-Shimer et al., Cancer Res., 1992, 52, 478-482), así como en fibroblastos 3Y1 de ratas inducidos por v-srk, v-src, y v-ras (Liu et al., Mol. Cell. Biol., 1998, 18, 250-259) y fibroblastos rat-1 inducidos por bcr-abl (LaMontagne et al., Proc. Natl. Acad. Sic. U.S.A, 1998, 95, 14094-14099). También se ha demostrado que PTP1B promueve la diferenciación de células K562, una línea celular de leucemia mielógena crónica, de manera similar a como lo hace un inhibidor de la oncoproteína bcr-abl. Estos estudios describen el posible papel de PTP1B en el control de patogénesis de leucemia mielógena crónica, (LaMontagne et al., Proc. Natl. Acad. Sic. U.S.A, 1998, 95, 14094-14099).

PTB1B regula de manera negativa la integrina señalizadora mediante la interacción con uno o más componentes señalizadores dependientes de adhesión y reprimiendo la activación de quinasa MAP mediada por integrina (Liu et al., Curr. Biol., 1998, 8, 173-176). Otros estudios diseñados para estudiar la integrina señalizadora, usando una forma catalíticamente inactiva de PTP1B, han demostrado que PTP1B regula la adhesión celular mediada por cadherina (Balsamo et al., J. Cell. Biol., 1998, 143, 523-532), así como la extensión celular, la adhesión focal y la formación de fibra tensa y la fosforilación de tirosina (Arregui et al., J. Cell. Biol., 1998, 143, 861-873).

Actualmente, los agentes terapéuticos diseñados para inhibir la síntesis o acción de PTP1B incluyen moléculas pequeñas (Ham et al., Bioorg. Med. Chem. Left., 1999, 9, 185-186; Skorey et al., J. Biol. Chem., 1997, 272, 22472-22480; Taing et al.,Biochemistry, 1999, 38, 3793-3803; Taylor et al., Bioorg. Med. Chem., 1998, 6, 1457-1468; Wang et al., Bioorg. Med. Chem. Left., 1998, 8, 345-350; Wang et al., Biochem. Pharmacol., 1997, 54, 703-711; Yao et al., Bioorg. Med. Chem., 1998, 6, 1799-1810) y péptidos (Chen et al., Biochemistry, 1999, 38, 384-389; Desmarais et al., Arch. Biochem. Biophys., 1998, 354, 225-231; Roller et al., Bioorg. Med. Chem. Left., 1998, 8, 2149-2150). Además, en la publicación PCT WO 97/32595 se describen fofopéptidos y anticuerpos que inhiben la asociación de PTP1B con el receptor de insulina activado para el tratamiento de desórdenes asociados con la resistencia a la insulina. También se describen en términos generales los nucleótidos antisentido contra PTP1B (Olefsky, 1997).

Aún queda una gran necesidad de agentes adicionales capaces de inhibir de manera efectiva la función PTP1B y la tecnología antisentido está emergiendo como un medio efectivo y para reducir la expresión de productos genéticos específicos. Por lo tanto, esta tecnología puede resultar ser únicamente útil en un número de aplicaciones terapéuticas, diagnósticas y de investigación para la modulación de expresión PTP1B.

Por consiguiente, la presente invención proporciona composiciones y métodos para modular la expresión PTP1B, incluyendo la modulación de la forma alternativamente unida de PTP 1B.

Resumen de la invención

La presente invención se encuentra dirigida a compuestos antisentido, particularmente oligonucleótidos, que están dirigidos a un ácido nucleico que codifica PTP1B. De acuerdo con la reivindicación 1 de la presente invención, los compuestos antisentido tienen la secuencia de SEQ ID NO: 164-173. También se proporcionan las composiciones farmacéuticas y otras composiciones que están formadas por los compuestos antisentido de la invención. También se proporcionan métodos para modular la expresión de PTP1B en células o tejidos que consisten en poner en contacto dichas células o dichos tejidos in vitro con uno o más de los compuestos antisentido o composiciones de la invención.

Descripción detallada de la invención

La presente invención emplea compuestos antisentido oligoméricos, en particular oligonucleótidos, para uso en la modulación de la función de moléculas de ácido nucleico que codifican PTP1B, modulando en última instancia la cantidad producida de PTP1B. Esto se consigue proporcionando compuestos antisentido que específicamente se hibridizan con uno o más ácido nucleicos codificadores de PTP1B. Tal y como aquí se emplean, los términos "ácido nucleico objetivo" y "ácido nucleico codificador de PTP1B" engloban o abarcan ADN codificador de PTP1B, ARN (incluyendo pre-mARN y mARN) trascrito del citado ADN y también cADN derivado de dicho ARN: La hibridización específica de un compuesto oligomérico con su ácido nucleico objetivo interfiere con la función normal del ácido nucleico. Esta modulación de la función de un ácido nucleico objetivo por los compuestos que específicamente se hibridizan con él generalmente se refiere como "antisentido". Las funciones de ADN con el que interfiere incluyen la réplica o transcripción. Las funciones de ARN con el que interfiere incluyen todas las funciones vitales, como por ejemplo, translocalización de ARN en el punto de la translación proteica, la translación de proteína de ARN, la unión de ARN para producir una o más especies de mARN, y la actividad catalítica que puede contraerse o facilitarse por medio de la acción de RNA. El efecto total de esta interferencia con la función del ácido nucleico objetivo es la modulación de la expresión de PTP1B. En el contexto de la presente invención, "modulación" significa bien un aumento (estimulación) o un descenso (inhibición) en la expresión de un gen. En el contexto de la presente invención, inhibición es la forma preferente de modulación de la expresión de gen y mARN es un objetivo preferente.

Es preferible dirigir ácidos nucleicos específicos para antisentido. "Dirigir" un compuesto antisentido hacia un ácido nucleico particular, en el contexto de esta invención, es un proceso que implica múltiples pasos. El proceso normalmente comienza con la identificación de una secuencia de ácido nucleico cuya función hay que modular. Esto puede ser, por ejemplo, un gen celular (o mARN trascrito de un gen) cuya expresión está asociada con un desorden o un estado de enfermedad particular, o una molécula de ácido nucleico de un agente infeccioso. En la presente invención, el objetivo es una molécula de ácido nucleico que codifica PTP1B. El proceso de selección de objetivo también incluye la determinación de un punto o puntos dentro del gen para que se de la interacción antisentido con el efecto deseado, es decir, la detección o modulación de expresión de la proteína serán los resultados. En el contexto de la presente invención, un punto intragénico preferente es la región que comprende el codón de iniciación o terminación de traslación del marco abierto de lectura (ORF) del gen. Por ello, como se conoce en la técnica, el codón de iniciación de traslación es normalmente 5'-AUG (en moléculas de mARN trascrito; 5'ATG en la molécula correspondiente de ADN), el codón de iniciación de traslación también es denominado "codón AUG", el "codón de inicio" o el "codón de inicio AUG". Una minoría de genes tienen un codón de iniciación de traslación que posee la secuencia de RNA 5'-GUG, 5'-UUG o 5'-CUG, y 5'-AUA, 5'-ACG y 5'-CUG han demostrado que pueden funcionar in vivo. Por lo tanto, los términos "codón de iniciación de traslación" y "codón de inicio" pueden comprender muchas secuencias de codón, incluso si el aminoácido iniciador en cada caso normalmente sea metionina (en eucariotas) o formilmetionina (en procariotas). También se conoce en la técnica que los genes eucarióticos y procarióticos pueden tener dos o más codones de inicio alternativos, y cualquiera de ellos puede emplearse preferentemente para la iniciación de traslación en un tipo o tejido celular particular, o bajo un conjunto particular de condiciones. En el contexto de la invención, "codón de inicio" y "codón de inicio de traslación" hacen referencia a el codón o codones que se emplean in vivo para iniciar la traslación de una molécula mARN trascrita a partir de un gen codificador de PTP1B, con independencia de la secuencia o secuencias de dichos codones.

También representa un hecho conocido en la técnica que un codón de terminación de traslación (o "codón de parada") de un gen puede tener una o tres secuencias, es decir, 5'-UAA, 5'-UAG y 5'-UGA (las secuencias correspondientes de ADN son 5'-TAA, 5'-TAG y 5'-TGA, respectivamente). Los términos "región de codón de inicio" y "región de codón de iniciación de traslación" hacen referencia a una parte de dicho mARN o gen que engloba desde aproximadamente 25 a aproximadamente 50 nucleótidos contiguos en cada dirección (es decir, 5' o 3') desde un codón de iniciación de traslación. De manera similar, los términos "región de codón de parada" y "región de terminación de traslación" hacen referencia a una parte de dicho mARN o gen que engloba desde aproximadamente 25 a aproximada-
mente 50 nucleótidos contiguos en cada dirección (es decir, 5' o 3') desde un codón de finalización de traslación.

El marco abierto de lectura (ORF) o "región codificadora", que es conocida en la técnica por hacer referencia a la región entre el codón de iniciación de traslación y el codón de finalización de traslación, es también la región que puede ser un objetivo o blanco de manera eficaz. Otras regiones que sirven como objetivo incluyen la región 5' no traducida (5' UTR), conocida en la técnica por hacer referencia a la parte de un mARN en la dirección 5' desde el codón de iniciación de traslación, y que por lo tanto incluye los nucleótidos entre el punto límite 5' y el codón de iniciación de traslación de un mARN o los nucleótidos correspondientes en el gen, y la región 3' no traducida (3' UTR), conocida en la técnica por hacer referencia a la parte de un mARN en la dirección 3' desde el codón de terminación de traslación, y que por lo tanto incluye los nucleótidos entre el codón de terminación de traslación y el extremo 3' de un mARN o los nucleótidos correspondientes en el gen. El extremo 5' de un mARN comprende un residuo de N7-guanosina metilada unido a el residuo más 5' del mRNA por medio de un enlace 5'-5' trifosfato. Se considera que la región del extremo 5' de un mRNA incluye la propia estructura de la punta o extremo 5' así como los primeros 50 nucleótidos adyacentes al extremo. La región del extremo 5' también puede ser denominada región objetivo.

A pesar de que algunas transcripciones eucarióticas de mARN se traducen directamente, muchas contienen una o dos regiones conocidas como "intrones", que se eliminan de una transcripción antes de que se traduzca. Las regiones restantes (y por lo tanto traducidas) son conocidas como "exones" y se unen para formar una secuencia continua de mARN. Los puntos de unión de mARN, es decir, las uniones intrón-exón, pueden también considerarse como regiones objetivos preferentes, y resultan particularmente útiles en situaciones en las que se implica una unión anómala en una enfermedad, o cuando se implica una sobreproducción de un producto de unión particular mARN en una enfermedad. Las uniones de fusión anómalas debido a recolocaciones o a eliminaciones también son preferentes. También se ha descubierto que los intrones también pueden ser efectivos, y por lo tanto preferentes, regiones objetivo para compuestos antisentido objetivo, por ejemplo, para ADN o mARN.

Una vez que se han identificado uno o más puntos para blanco u objetivo, se eligen los oligonucleótidos que son los suficientemente complementarios con el objetivo, es decir, se hibridizan suficientemente bien y con suficiente especificidad, para otorgar el efecto deseado.

En el contexto de la invención, "hibridización" significa enlace de hidrógeno, que puede ser enlace de hidrógeno Watson-Crick, Hoogsteen o Hoogsteen inverso, entre bases de nucleósido o nucleótido complementarias. Por ejemplo, adenina y timina son nucleobases complementarias que forman pareja a través de la formación de enlaces de hidrógeno. "Complementario", tal y como aquí se emplea, hace referencia a la capacidad para practicar el apareamiento entre dos nucleótidos. Por ejemplo, si un nucleótido en una cierta posición de un oligonucleótido es capaz de lograr un enlace de hidrógeno con un nucleótido en la misma posición de una molécula de ADN o ARN, entonces el oligonucleótido y el ADN o ARN son considerados que son complementarios entres sí en esa posición. El oligonucleótido y el ADN o ARN son complementarios entre sí cuando un número suficiente de posiciones correspondientes en cada molécula se ocupan por nucleótidos que pueden formar enlaces de hidrógeno entre sí. Por lo tanto, "específicamente hibridizables" y "complementarios" son términos que se emplean para indicar un grado suficiente de complementariedad o de emparejamiento preciso de modo que se de un enlace específico y estable entre el oligonucleótido y el ADN o ARN objetivo. En la técnica se entiende que la secuencia de un compuesto antisentido no tiene por qué ser 100% complementaria con las del ácido nucleico objetivo que con la que será específicamente hibridizable. Un compuesto antisentido es específicamente hibridizable cuando el enlace del compuesto con la molécula objetivo ADN o ARN interfiere con la función normal de ADN o ARN objetivo para provocar una pérdida de utilidad, y existe un grado suficiente de complementariedad para evitar el enlace no específico del compuesto antisentido con las secuencias no objetivo bajo condiciones en las cuales se desea el enlace específico, es decir, bajo condiciones fisiológicas en el caso de ensayos in vivo o tratamiento terapéutico, y en el caso de ensayos in vitro, bajo condiciones en las cuales se llevan a cabo los ensayos.

Los compuestos antisentido comúnmente se emplean como reagentes de investigación y diagnósticos. Por ejemplo, los oligonucleótidos antisentido, que son capaces de inhibir la expresión de gen con exquisita especificidad, a menudo se emplean por parte de expertos en la técnica para aclarar la función de genes particulares. Los compuestos antisentido también se emplean, por ejemplo, para distinguir entre funciones de varios miembros de una ruta biológica. Por lo tanto, se ha empleado modulación antisentido con fines relacionados con la investigación.

Los expertos en la técnica también han empleado la especificidad y la sensibilidad del antisentido con fines terapéuticos. Los oligonucleótidos antisentido han sido empleados como fracciones terapéuticas en el tratamiento de estados enfermos en animales y en el hombre. Los oligonucleótidos antisentido han sido administrados de manera segura y efectiva a humanos y en el presente se están llevando a cabo varios ensayos clínicos. Como consecuencia, se establece que los oligonucleótidos pueden ser útiles modalidades terapéuticas capaces de configurarse para resultar útiles en regímenes de tratamiento para tratamientos de células, tejidos y animales, especialmente
humanos.

En el contexto de esta invención, el término "oligonucleótido" hace referencia a un oligómero o polímero de ácido ribonucleico (ARN) o ácido desoxirribonucleico (ADN) o análogos de los mismos. Este término incluye oligonucleótidos compuestos por nucleobases que se dan de manera natural, azúcares y enlaces internucleósidos covalentes (esqueleto) así como oligonucleótidos que tienen partes que no ocurren de manera natural y que funcionan de manera similar. Tales oligonucleótidos modificados o sustituidos con frecuencia son preferentes en relación con las formas nativas debido a sus propiedades más adecuadas como por ejemplo una mayor respuesta celular, una mayor afinidad para el ácido nucleico objetivo y una mayor estabilidad en la presencia de nucleasas.

Mientras que los oligonucleótidos son una forma preferente de compuesto antisentido, la presente invención abarca otras compuestos oligoméricos antisentido, incluyendo aunque no limitando, análogos oligonucleótidos como los descritos anteriormente. Los compuestos antisentido de acuerdo con esta invención comprenden aproximadamente de 8 a 30 nucleobases (es decir de 8 a 30 nucleósidos enlazados). En particular, los compuestos antisentido preferentes son oligonucleótidos antisentido, incluso son más preferentes aquellos que contienen aproximadamente entre 12 y 25 nucleobases. Tal y como se conoce en la técnica, un nucleósido es una combinación base-azúcar. La porción de la base del nucleósido es normalmente una base heterocíclica. Las dos clases más comunes de dichas bases heterocíclicas son las purinas y las pirimidinas. Los nucleótidos son nucleósidos que además incluyen un grupo de fosfato covalentemente enlazado con la parte de azúcar del nucleósido. De aquellos nucleósidos que incluyen un azúcar pentofuranosil, el grupo de fosfato puede enlazarse con la fracción hidroxil 2', 3' o 5' del azúcar. Para formar oligonucleótidos, los grupos de fosfato enlazan de manera covalente nucleósidos adyacentes entre sí para formar un compuesto polimérico lineal. A su vez, los respectivos extremos de esta estructura polimérica lineal pueden además unidos para formar una estructura circular, a pesar de que generalmente son preferentes las estructuras lineales abiertas. Respecto a la estructura del oligonucleótido, los grupos de fosfato son comúnmente preferentes por formar el esqueleto o eje internucleótido del oligonucleótido. El enlace normal o el eje de ARN o ADN es una unión fosfodiéster 3' a 5'.

Ejemplos específicos de compuesto antisentido preferentes útiles en esta invención incluyen oligonucleótidos que contienen ejes modificados o enlaces internucleótidos no naturales. Tal y como se define en la descripción, los oligonucleótidos que tienen ejes modificados incluyen aquellos que retienen un átomo fosfórico en el eje. Con fines descriptivos, y tal y como se hace referencia en ocasiones en la técnica, los oligonucleótidos modificados que no tiene un átomo fosfórico en sus eje internucleótido también pueden considerarse como oligonucleótidos.

Los ejes de oligonucleótidos modificados preferentes incluyen, por ejemplo, fosforotioatos, fosforotioatos quirales, fosforoditioatos, fosforotriester, aminoalquil-fosfotriester, metil y otros fosfonatos alquil incluyendo 3'-fosfonatos alquileno y fosfonatos quirales, fosfinatos, fosforomidatos incluyendo 3'-amino fosforamidato y aminoalquil-fosforamidatos, trionofosforamidatos, tionoalquil-fosfonatos, tionoalquil-fosfotriesteres, y borano-fosfatos que tienen enlaces normales 3'-5', análogos enlazados de estos 3'-5', y aquellos que poseen polaridad invertida donde las parejas adyacentes de unidades nucleótidas son enlaces de 3'-5' con 5'-3' o 2'-5' con 5'-2'. También se incluyen varias sales, sales mezcladas y formas libres de ácido.

Patentes representativas de Estados Unidos que presentan la preparación de los enlaces que contienen fósforo anteriormente mencionados incluyen, aunque no se limitan a: U.S.: 3,687,808; 4,469,863; 4,476,301; 5,023,243; 5,177,196; 5,188,897; 5,264,423; 5,276,019; 5,278,302; 5,286,717; 5,321,131; 5,399,676; 5,405,939; 5,453,496;
5,455,233; 5,466,677; 5,476,925; 5,519,126; 5,536,821; 5,541,306; 5,550,111; 5,563,253; 5,571,799; 5,587,361; y 5, 625, 050, algunas de las cuales son comúnmente reconocidas con esta solicitud.

Ejes de oligonucleótidos modificados preferentes que no incluyen un átomo fosfórico en ellos tienen ejes que se forman mediante un enlaces internucleósidos cortos de cadena de alquilo o cicloalquilo, heteroátomos mezclados y enlaces internucleósidos de alquilo o cicloalquilo, o uno o más enlaces internucleósidos cortos de cadena heteroatómica o heterocíclica. Estos incluyen aquellos que tiene enlaces morfolinos (formados en parte a partir de una porción de azúcar de un nucleósido); ejes siloxano; ejes de sulfuro, sulfoxido y sulfota; ejes de form-acetilo y tioform-acetilo; ejes de metileno form-acetilo y tioform-acetilo; ejes que contienen alqueno; ejes de sulfamato; ejes de metileneimino y metilenehidrazino; ejes de sulfonato y sulfoamida; ejes de amida; y otros que tienen partes de componentes N, O, S y CH_{2} mezcladas.

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Patentes representativas de Estados Unidos que presentan la preparación de los oligonucleósidos anteriormente mencionados incluyen, aunque no se limitan a: U.S.: 5,034,506; 5,166,315; 5,185,444; 5,214,134; 5,216,141; 5,235,033; 5,264,562; 5,264,564; 5,405,938; 5,434,257; 5,466,677; 5,470,967; 5,489,677; 5,541,307; 5,561,225;
5,596,086; 5,602,240; 5,610,289; 5,602,240; 5,608,046; 5,610,289; 5,618,704; 5,623,070; 5,663,312; 5,633,360;
5,677,437; y 5,677,439, algunas de las cuales son comúnmente reconocidas con esta solicitud.

En otros análogos nucleótidos preferentes, tanto el azúcar como el enlace nucleósido, es decir, el eje, de las unidades nucleótidas se sustituyen por grupos nuevos. Las unidades base se mantienen para la hibridización con un compuesto objetivo de ácido nucleico apropiado. Dicho compuesto oligomérico, un análogo oligonucleótido que ha demostrado tener excelentes propiedades de hibridización, es denominado como un ácido nucleico péptido (PNA). En compuestos PNA, el eje de azúcar de un oligonucleótido es su sustituido por un eje que contiene amida, en particular por un eje aminoetilglicina. Las nucleobases se retienen y se enlazan directamente o indirectamente a átomos de aza-nitrógeno de la porción de amida del eje. Patentes representantes que describen la preparación de compuestos PNA incluyen, aunque no se limitan a: U.S. : 5,539,082; 5,714,331; y 5,719,262. Se puede encontrar más información sobre los compuestos PNA en Nielsen et al.; Science, 1991, 254, 1497-1500.

Las realizaciones preferentes de la invención son oligonucleótidos con ejes de fosforotioato y oligonucleósidos con ejes de heteroátomo, y en particular -CH_{2}-NH-O-CH_{2}-, -CH_{2}-N(CH_{3})-O-CH_{2}- [conocido como un metileno (metillimino) o MMI], -CH_{2}-O-N(CH_{3})-CH_{2}-, -CH_{2}-N(CH_{3})-N(CH_{3})-CH_{2}- y -O-N(CH_{3})-CH_{2}-CH_{2}- [donde el eje fosfodiéster nativo se representa como -O-P-O-CH_{2}] de la patente U.S arriba referenciada 5,602,240. También se consideran preferentes los oligonucleótidos que tiene estructuras con eje de morfolino de la patente U.S arriba referenciada 5, 034, 506.

Los oligonucleótidos modificados también pueden contener una o más fracciones de azúcar sustituidas. Los oligonucleótidos preferentes comprenden uno de los siguientes en la posición 2': OH; F; O-, S-, o N-alquilo; O-, S-, o N-alquenilo; O-, S-, o N-alquinilo; o O-alquilo-O-alquilo, donde el alquilo, alquenilo y alquinilo pueden ser C_{1} a C_{10} alquilo o C_{2} a C_{10} alquenilo o alquinilo sustituidos o no sustituidos. En particular son preferentes O[(CH_{2})_{n}O]_{m}
CH_{3}, O(CH_{2})_{n}OCH_{3}, O(CH_{2})_{n}NH_{2}, O(CH_{2})_{n}CH_{3}, O (CH_{2})_{n}ONH_{2}, y O(CH_{2})_{n}ON[(CH_{2})_{n}CH_{3})]_{2}, donde n y m son desde 1 a 10. Otros oligonucleótidos preferentes comprenden uno de los siguientes en la posición 2': C_{1} a C_{10} alquilo bajo, alquilo bajo sustituido, alcarilo, aralquilo, O-alcaril u O-aralquilo, SH, SCH_{3}, OCN, Cl, Br, CN, CF_{3}, OCF_{3}, SOCH_{3}, SO2CH_{3}, ONO_{2}, NO_{2}, N_{3}, NH_{2}, heterocicloalquilo, heterocicloalcarilo, aminoalquilamino, polialquilamino, silil sustituido, un grupo de partición ARN, un grupo reportero, un intercalador, un grupo para mejorar las propiedades farmacocinéticas de un oligonucleótido, o un grupo para mejorar las propiedades farmacodinámicas de un oligonucleótido, y otros sustituyentes que tienen propiedades similares. Una modificación preferente incluye 2'-metoxietoxi (2'-O-CH_{2}CH_{2}OCH_{3}, también conocido como 2'-O-(2-metoxietilo) o 2'-MOE) (Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504), es decir, un grupo alcoxialcoxi. Una modificación más preferente incluye 2'-dimetilaminooxietoxi, es decir, un grupo O (CH_{2})_{2}ON(CH_{3})_{2}, también conocido como 2'-DMOE, tal y como se describe en los ejemplos a continuación, y 2'-dimetilaminoetoxietoxi (también conocido en la técnica como 2'-O-dimetilaminoetoxietil o 2'-DMAEOE), es decir, 2'-O-CH_{2}-O-CH_{2}-N(CH_{2})_{2}, también descrito en los ejemplos a continuación.

Otras modificaciones preferentes incluyen 2'-metoxi (2'-O-CH_{3}), 2'-aminpropoxi (2'-OCH_{2}CH_{2}CH_{2}NH_{2}) y 2'-fluoro (2'-F). Se pueden realizar modificaciones similares en otras posiciones en los oligonucleótidos, en particular en la posición 3' del azúcar en el nucleótido terminal 3' o en los oligonucleótidos enlazados 2'-5' y en la posición 5' del nucleótido terminal 5'. Los oligonucleótidos también pueden tener análogos de azúcar, como fracciones de ciclobutilo en lugar del azúcar pentofuranosil. Patentes de Estados Unidos representativas que muestran la preparación de las mencionadas estructuras de azúcar modificadas incluyen, aunque no se limitan a: U.S.: 4,981,957; 5,118,800; 5,319,080; 5,359,044; 5,393,878; 5,446,137; 5,466,786; 5,514,785; 5,519,134; 5,567,811; 5,576,427; 5,591,722; 5,597,909;
5,610,300; 5,627,053; 5,639,873; 5,646,265; 5,658,873; 5,670,633; y 5,700,920,algunas de las cuales son comúnmente reconocidas con esta solicitud.

Los oligonucleótidos también pueden incluir modificaciones de nucleobases (a menudo denominadas en la técnica simplemente "bases") o sustituciones. Tal y como aquí se emplean, nucleobases "no modificadas" o "naturales" incluyen las bases de purina adenina (A) y guanina (G), y las bases pirimidina timina (T), citosina (G) y uracilo (U). Las nucleobases modificadas incluyen otras nucleobases sintéticas o naturales tales como 5'-metilcitosina (5-me-C), 5-hidroximetil citosina, xantina, hipoxantina, 2-amino adenina, 6-metil y otros derivados de alquil de adenina y guanina, 2-propil y otros derivados de alquil de adenina y guanina, 2-tiouracilo, 2-tiotimina y 2-tiocistina, 5-halouracilo y citosina, 5-propinil uracilo y citosina, 6-azo uracilo, citosina y timina, 5-uracilo (pseudouracilo), 4-tiouracilo, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquil, 8-hidroxil y otras adeninas y guaninas 8-sustituidas, 5-halo particularmente 5-bromo, 5-trifluorometil y otros uracilos y citosinas 5-sustituidos, 7-metilguanina y 7-metiladenina, 8-azaguanina y 8-azaadenina, 7-deazaguanina y 7-deazaadenina y 3-deazaguanina y 3-deazaadenina. Nucleobases adicionales incluyen aquellas descritas en la Patente de Estados Unidos Nº 3,687,808, aquellas descritas en The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, páginas 858-859, Kroschwitz, J. II, ed. John Wiley & Sons, 1990, aquellas descritas por Engisch et al., Angewandte Chemie, Edición Internacional, 1991, 30, 613, y aquellas descritas por Sanghvi, Y. S. Capítulo 15, Antisense Research And Applications, páginas 289-302, Croque, S.T. y Lebleu, B., ed., CRC Press, 1993. Algunas de estas nucleobases resultan particularmente útiles para aumentar la afinidad de enlace de los compuestos oligoméricos de la invención. Estos incluyen 5-pirimidinas sustituidas, 6-azapiramidinas y N-2, N-6 y O-6 purinas sustituidas, incluyendo 2-aminopropiladenina, 5-propiniluracilo y 5-propinilcitosina. Las sustituciones 5-metilcitosina han demostrado aumentar la estabilidad doble de ácido nucleico mediante 0-6-1.2ºC (Sanghvi, Y. S., Croque y Lebelu, B. eds., Antisense Research And Applications, CRC Press, Boca Raton, 1003, páginas 276-278) y son en el presente sustituciones base preferentes, incluso más en particular cuando se combinan con modificaciones de azúcar 2'-O-metoxietil.

Patentes de Estados Unidos representativas que muestran la preparación de algunas de las nucleobases modificadas anteriormente mencionadas así como otras nucleobases modificadas incluyen, aunque no están limitadas a: U.S. 3,687,808, as well as U.S.: 4,845,205; 5,130,302; 5,134,066; 5,175,273; 5,367,066; 5,432,272; 5,457,187; 5,459,255; 5,484,908; 5.502,177; 5,525,711; 5,552,540; 5,587,469; 5,594,121, 5,596,091; 5,614,617; y 5,681,941, algunas de las cuales son comúnmente reconocidas con esta solicitud, y la Patente de Estados Unidos 5,750,692, que comúnmente es reconocida con la presente solicitud.

Otras modificaciones de los oligonucleótidos de la invención incluyen enlazar químicamente con el nucleótido una o más fracciones o conjugados que aumentan la actividad, la distribución celular o la respuesta celular del oligonucleótido. Tales fracciones incluyen aunque no se limitan a fracciones lípidas como el radical de colesterol (Letsinger et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553-6556), ácido cólico (Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let.., 1994, 4, 1053-1060), un tioéter, por ejemplo, hexil-S-tritiltiol (Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765-2770), un tiocolesterol (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533-538), una cadena alifática, por ejemplo, residuos dodecandiol o undecilo (Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10, 1111-1118; Kabanov et al., FEBS Left., 1990, 259, 327-330; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75, 49-54), un fosfolípido, por ejemplo, di-hexadecil-rac-glicerol o rietilamonio 1,2-di-O-hexadecil-rac-glicero-3-H-fosfonato (Manoharan et al., Tetrahedron Left., 1995, 36, 3651-3654; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777-3783), una poliamina o una cadena de polietileno glicol (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969-973), o ácido de adamantano acético (Manoharan et al., Tetrahedron Left., 1995, 36, 3651-3654), un radical palmitil (Mishra et al., Biochim. Biphys. Acta, 1995, 1264, 229-237), o una fracción actadecilamina o hexilamino-carbonil-oxicolesterol (Croque et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277, 923-937.

Patentes de Estados Unidos representativas que presentan la preparación de tales conjugado de oligonucleótidos incluyen, aunque no están limitadas a: 4,828,979; 4,948,882; 5,218,105; 5,525,465; 5,541,313; 5,545,730; 5,552,538; 5,578,717,5,580,731; 5,580,731; 5,591,584; 5,109,124; 5,118,802; 5,138,045; 5,414,077; 5,486,603; 5,512,439;
5,578,718; 5,608,046; 4,587,044; 4,605,735; 4,667,025; 4,762,779; 4,789,737; 4,824,941; 4,835,263; 4,876,335;
4,904,582; 4,958,013; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,245,022; 5,254,469;
5,258,506; 5,262,536; 5,272,250; 5,292,873; 5,317,098; 5,371,241, 5,391,723; 5,416,203, 5,451,463; 5,510,475;
5,512,667; 5,514,785; 5,565,552; 5,567,810; 5,574,142; 5,585,481; 5,587,371; 5,595,726; 5,597,696; 5,599,923;
5,599,928 y 5,688,941, algunas de las cuales son comúnmente reconocidas con esta solicitud.

No es necesario que todas las posiciones en un compuesto determinado se modifiquen de manera uniforme, y de hecho más de una de las modificaciones anteriormente mencionadas puede incorporarse en un único compuesto o incluso en un único nucleósido en un oligonucleótido. La presente invención también incluye compuestos antisentido que son compuestos quiméricos. Compuestos antisentido "quiméricos" o "quimeras", en el contexto de esta invención, son compuestos antisentido, en particular oligonucleótidos, que contienen dos o más regiones químicamente distintas, cada una de ellas hecha por al menos una unidad de monómero, es decir, un nucleótido en el caso de un compuesto oligonucleótido. Estos oligonucleótidos normalmente contiene al menos una región donde el oligonucleótido se modifica de modo que otorgue al oligonucleótido mayor resistencia a la degradación nucleasa, mayor respuesta celular, y/o mayor afinidad de enlace para el ácido nucleico objetivo. Una región adicional del oligonucleótido puede servir como un sustrato para enzimas capaz de dividir híbridos ARN:ADN o ARN:ARN. Como modo de ejemplo, ARNasa H es una endonucleasa celular que divide la cadena de ADN de un dúplex ARN:ADN. Por lo tanto, la activación de ARAsa H da como resultado la división del ARN objetivo, aumentando de este modo y en gran medida la eficacia de la inhibición del oligonucleótido de la expresión genética. Como consecuencia, los resultados comparables pueden obtenerse a menudo con oligonucleótidos más cortos cuando se emplean oligonucleótidos quiméricos, en comparación con deoxioligonucleótidos de fosforotioato que hibridizan la misma región objetivo. La división del ARN objetivo puede detectarse de modo rutinario mediante electroforesis en gel y, si es necesario, mediante técnicas de hibridización con ácido nucleico asociado conocidas en la técnica.

Los compuestos antisentido quiméricos de la invención pueden formarse como estructuras compuestas de dos o más oligonucleótidos, oligonucleótidos modificados, oligonucleósidos y/o análogos de oligonucleótido tal y como se ha descrito anteriormente. Tales compuestos también han sido referidos en la técnica como híbridos o gapmers. Patentes representativas de Estados Unidos que muestran la preparación de dichas estructuras híbridas incluyen, aunque no se limitan a:U.S.:5,013,830, 5,149,797; 5,220,007; 5,256,775; 5,366,878; 5,403,711; 5,491,133; 5,565,350; 5,623,065; 5,652,355; 5,652,356; y 5,700, algunas de las cuales son comúnmente reconocidas con esta solicitud.

Los compuestos antisentido empleados de acuerdo con esta invención pueden realizarse de manera conveniente y rutinaria por medio de técnicas bien conocidas y de síntesis con fase sólida. Los equipos para dicha síntesis se venden en varios distribuidores incluyendo, por ejemplo, Applied Biosystems (Foster City, CA). También se pueden emplear adicionalmente o alternativamente para dicha síntesis. Es bien conocido que se emplean técnicas similares para preparar oligonucleótidos como los fosforotioatos y derivados alquilatados.

Los compuestos antisentido de la invención se sintetizan in vitro y no incluyen composiciones antisentido de origen biológico, o construcciones con vector genético diseñadas para dirigir la síntesis in vitro de las moléculas antisentido. Los compuestos de la invención también pueden mezclarse, encapsularse, conjugarse o sino asociarse con otras moléculas, estructuras moleculares o mezclas de compuestos, como por ejemplo, liposomas, moléculas dirigidas al receptor, formulaciones orales, rectales, tópicas u otras, para ayudar en la respuesta, distribución y/o absorción. Patentes representativas de Estados Unidos que describen la preparación dicha respuesta, distribución y/o absorción que ayudan a las formulaciones incluyen, aunque no de manera limitada: U.S.: 5,108,921; 5,354,844; 5,416,016; 5,459,127; 5,521,291; 5,543,158; 5,547,932; 5,583,020; 5,591,721; 4,426,330; 4,534,899; 5,013,556; 5,108,921; 5,213,804; 5,227,170;
5,264,221; 5,356,633; 5,395,619; 5,416,016; 5,417,978; 5,462,854; 5,469,854; 5,512,295; 5,527,528; 5,534,259;
5,543,152; 5,556,948; 5,580,575; y 5, 595, 756.

Los compuestos antisentido de la invención comprenden sales farmacéuticamente aceptables, esteres, o sales de dichos esteres, o cualquier otro compuesto que, tras la administración a un animal incluyendo un humano, sea capaz de proporcionar (directamente o indirectamente) el metabolito biológicamente activo o un residuo del mismo. Por consiguiente, por ejemplo, la descripción también engloba profármacos y sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos de la invención, sales farmacéuticamente aceptables de dichos profármacos y otros bioequivalentes.

El término "profármaco" indica un agente terapéutico que se prepara de una forma inactiva que se convierte en una forma activa (es decir, un fármaco) en el interior del cuerpo o las células de éste mediante la acción de enzimas endógenas u otras sustancias químicas y/o condiciones. En particular, las versiones profármacos de los oligonucleótidos de la invención se preparan como derivados SATE [(S-acetil-2-tioetil)fosfato] de acuerdo con los métodos descritos en WO 93/24510 de Gosselin et al., publicado en 9 de diciembre, 1993, o en WO 94/26764 de Imbach et al.

El término "sales farmacéuticamente aceptables" hace referencia a sales fisiológicamente y farmacéuticamente aceptables de los compuestos de la invención, es decir, sales que retienen la actividad biológica deseada del compuesto matriz y que no imparten los efectos toxicológicos no deseados del mismo.

Las sales de adición de base farmacéuticamente aceptables se forman con metales o aminas, como metales terrestres alcali o alcalina o aminas orgánicas. Ejemplos de metales empleados como cationes son el sodio, potasio, magnesio, calcio, y similares. Ejemplos de aminas adecuadas son N,N'-dibenziletilenediamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, diciclohexilamina, etilenediamina, N-metilglucamina, y procaína (ver, por ejemplo, Bege et al., "Pharmaceutical Salts", J. of Pharma ZIL, 1977, 66, 1-19). Las sales de adición base de dichos compuestos ácidos se preparan poniendo en contacto la forma libre de ácido con una cantidad suficiente de la base deseada para producir la sal de la manera convencional. La forma libre de ácido puede regenerarse poniendo en contacto la forma de sal con un ácido y aislando la forma libre de ácido de la manera convencional. Las formas libres de ácido difieren de sus respectivas formas con sal en ciertas propiedades físicas como la solubilidad en disolventes polares, pero sino las sales son equivalentes a sus respectivas formas libres de ácido para los fines de la presente invención. Como aquí se emplea, una "sal de adición farmacéutica" incluye una sal farmacéuticamente aceptable de una forma ácida de uno de los componentes de la composición de la invención. Estos incluyen sales ácidas orgánicas e inorgánicas de las aminas. Las sales ácidas preferentes son los hidrocloruros, acetatos, salicilatos, nitratos y fosfatos. Otras sales farmacéuticamente aceptables son bien conocidas por aquellos expertos en la técnica e incluyen sales básicas de una variedad de ácidos orgánicos e inorgánicos, como por ejemplo, con ácidos inorgánicos, como por ejemplo, ácido hidroclórico, ácido hidrobrómico, ácido sulfúrico o ácido fosfórico; con ácidos orgánicos carboxílicos, sulfónicos, sulfa o fosfo o ácidos sulfámicos N-sustituidos, por ejemplo, ácido acético, ácido propiónico, ácido glicólico, ácido succínico, ácido maleico, ácido hidroximaleico, ácido metilmaleico, ácido fumárico, ácido málico, ácido tartárico, ácido láctico, ácido oxálico, ácido glucónico, ácido glucárico, ácido glucurónico, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido cinnámico, ácido mandélico, ácido salicílico, ácido 4-aminosalicílico, ácido 2-fenoxibenzoico, ácido 2-acetoxibenzoico, ácido embónico, ácido nicotínico o ácido isonicotínico; y con aminoácidos, como los ácidos 20 alfa-amino implicados en la síntesis de proteínas en la naturaleza, por ejemplo ácidos glutámicos o ácido aspártico, y también con ácido fenilacético, ácido metanosulfónico, ácido etanosulfónico, ácido 2-hidroxietanosulfónico, ácido etano-1,2,disulfónico, ácido benzanosulfónico, ácido 4-metilbenzanosulfoico, ácido naftaleno-2-sulfónico, ácido nafataleno-1,5-disulfónico, 2- o 3-fosfoglicerato, glucosa-6-fosfato, ácido N-ciclohexilsulfámico (con la formación de ciclamatos), o con otros compuestos ácidos orgánicos, como el ácido ascórbico. Las sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos pueden a su vez prepararse con un catión farmacéuticamente aceptable. Los cationes adecuados farmacéuticamente aceptables son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica e incluyen alcalina, alcalina terrestre, amonio y cationes de amonio cuaternarios. Los carbonatos y los carbonatos de hidrógeno también son posibles.

Para los oligonucleótidos, los ejemplos preferentes de sales farmacéuticamente aceptables incluyen, aunque no se limitan a, (a) sales formadas con cationes como el sodio, potasio, amonio, magnesio, calcio, poliaminas como la espermina o espermidina, etc.; (b) sales de adición ácidas formadas con ácidos inorgánicos, por ejemplo ácido hidroclórico, ácido hidrobrómico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido nítrico y similares; (c) sales formadas con ácidos orgánicos como, por ejemplo, ácido acético, ácido oxálico, ácido tartárico, ácido succínico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido glucónico, ácido cítrico, ácido málico, ácido ascórbico, ácido benzoico, ácido tánico, ácido palmítico, ácido algínico, ácido poliglutámico, ácido naftalenosulfónico, ácido metanosulfónico, ácido p-toluonosulfónico, ácido naftalenodisulfónico, ácido poligalacturónico, y similares; y (d) sales formadas a partir de aniones elementales tales como cloro, bromo y yodo.

Los compuestos antisentido de la presente invención puede utilizarse para diagnóstico, terapia, profilaxis y como reagentes de investigación y kits. Para terapia, se trata un animal, preferentemente un humano, sospechoso de tener una enfermedad o desorden que puede tratarse modulando la expresión de PTP1B administrándole compuestos antisentido de acuerdo con esta invención. Los compuestos de la invención pueden utilizarse en composiciones farmacéuticas añadiendo una cantidad efectiva de un compuesto antisentido a un diluyente o portador farmacéuticamente aceptable. El uso de los compuestos antisentido y los métodos de la invención también pueden resultar útiles profilácticamente, es decir, para prevenir o retrasar la infección, la inflamación o la formación del tumor, a modo de ejemplo.

Los compuestos antisentido de la invención son útiles para investigación y diagnóstico por que estos compuestos pueden hibridizarse con ácidos nucleicos codificadores de PTP1B, permitiendo que el ensayo sándwich y otros ensayos puedan llevarse a cabo de manera sencilla para explotar este hecho. La hibridización de los oligonucleótidos antisentido de la invención con un ácido nucleico codificador de PTP1B puede detectarse a través de medios conocidos en la técnica. Tales medios pueden incluir la conjugación de una enzima con el oligonucleótido, el radioetiquetamiento del oligonucleótido o cualquier otro método adecuado de detección. Los kits que emplean tales medios de detección para detectar el nivel de PTP1B en una muestra también pueden prepararse.

La presente invención también incluye composiciones farmacéuticas y formulaciones que incluyen los compuestos antisentido de la invención. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden administrarse de un número de formas dependiendo de si se desea un tratamiento local o sistémico y del área a ser tratada. La administración puede ser tópica (incluyendo la mucosa oftálmica y mucosa e incluyendo el envío vaginal y rectal), pulmonar, por ejemplo, por inhalación o insuflación de polvos o aerosoles, incluyendo mediante nebulizador; intratraqueal, intranasal, epidérmico y transdérmico), oral o parenteral. La administración parenteral incluye la inyección o infusión intravenosa, intraarterial, subcutánea, intraperitoneal o intramuscular; o intracraneal, por ejemplo, administración intratecal o intraventricular. Se cree que los oligonucleótidos con al menos una modificación 2'-O-metoxietil son particularmente útiles para administración oral.

Las composiciones y formulaciones farmacéuticas para administración tópica incluyen parches transdérmicos, pomadas, lociones, cremas, geles, gotas, supositorios, sprays, líquidos y polvos. Los portadores farmacéuticos convencionales, las bases acuosas, en polvo o aceitosas, los espesantes y similares pueden ser necesarios o deseables. Los preservativos cubiertos, guantes y similares también pueden ser útiles.

Las composiciones y formulaciones para administración oral incluyen polvos y gránulos, suspensiones o soluciones en agua o medio no acuoso, cápsulas, sobres o pastillas. Los espesantes, agentes aromatizantes, diluyentes, emulsionantes, ayudas dispersadotas o aglutinantes también pueden ser deseable.

Las composiciones y formulaciones para administración parenteral, intratecal o intraventricular pueden incluir soluciones acuosas estériles que pueden contener búferes, diluyentes y otros aditivos adecuados como, aunque sin limitarse, potenciadores de penetración, compuestos portadores y otros portadores y excipientes farmacéuticamente aceptables.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención incluyen, aunque sin limitarse a, soluciones, emulsiones, y formulaciones que contiene liposomas. Estas composiciones pueden generarse a partir de una variedad de componentes que incluye, aunque no se limitan a, líquidos preformados, sólidos auto-emulsionantes y semisólidos auto-emulsionantes.

Las formulaciones farmacéuticas de la presente invención, que pueden presentarse cómodamente en forma de unidad de dosis, pueden prepararse de acuerdo con las técnicas convencionales bien conocidas en la industria farmacéutica. Tales técnicas incluyen el paso de asociar los ingredientes activos con los portadores o excipientes farmacéuticos. En general, las formulaciones se preparan asociando de manera uniforme e íntima los ingredientes activos con portadores líquidos o portadores sólidos finamente divididos o ambos, y a continuación dando forma al producto en caso de que sea necesario.

Las composiciones de la presente invención pueden formularse en cualquiera de las muchas formas de dosis posibles como, aunque sin limitarse a, pastillas, cápsulas, jarabes líquidos, geles suaves, supositorios y enemas. Las composiciones de la presente invención pueden también formularse como suspensiones en medios acuosos, no acuosos o una mezcla de los mismos. Las suspensiones acuosas pueden además contener sustancias que incrementan la viscosidad de la suspensión y que incluyen, por ejemplo, carboximetilcelulosa sódica, sorbitol y/o dextrano. La suspensión también puede contener estabilizadores.

En una realización de la presente invención, las composiciones farmacéuticas pueden formularse y emplearse como espumas. Las espumas farmacéuticas incluyen formulaciones como, aunque sin limitarse a, emulsiones, microemulsiones, cremas, gelatinas y liposomas. A pesar de que básicamente estas formulaciones son similares en naturaleza, sus componentes y la consistencia del producto final pueden variar. La preparación de dichas composiciones y formulaciones generalmente es conocida por aquellos expertos en la técnica farmacéutica y en la formulación y puede aplicarse a la formulación de las composiciones de la presente invención.

Emulsiones

Las composiciones de la presente invención pueden prepararse y formularse como emulsiones. Las emulsiones son normalmente sistemas heterogéneos de un líquido disperso en otro en la forma de pequeñas gotas que normalmente exceden de 0.1 \mum en diámetro. (Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Baker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volumen 1, p. 199; Rosoff, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Baker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volumen 1, p. 245; Block en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Baker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volumen 1, p. 335; Higuchi et al., en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1985, p. 301). Las emulsiones a menudo son sistemas bifásicos que comprenden dos fases líquidas inmiscibles íntimamente mezcladas y dispersas entre sí. En general, las emulsiones pueden ser bien de la variedad agua en aceite (w/o) o aceite en agua (w/o). Cuando una fase acuosa se divide finamente y se dispersa en forma de gotitas diminutas en una base aceitosa a granel la composición resultante se llama una emulsión agua en aceite (w/o). De manera alternativa, cuando una fase aceitosa se divide finamente y se dispersa en forma de gotitas diminutas en una fase acuosa a granel la composición resultante se llama aceite en agua (o/w). Las emulsiones pueden contener componentes adicionales además de las fases dispersas tanto en la fase acuosa como en la fase aceitosa o como una fase separada. Los excipientes farmacéuticos como los emulsionantes, estabilizadores, colorantes y antioxidantes pueden también estar presentes en la emulsiones en caso de ser necesarios. Las emulsiones farmacéuticas pueden también ser emulsiones múltiples que están formadas por más de dos fases como, por ejemplo en el caso de emulsiones aceite en agua en aceite (o/w/o) y agua en aceite en agua (w/o/w). Tales formulaciones complejas a menudo proporcionan ciertas ventajas que las emulsiones binarias simples no facilitan. Las emulsiones múltiples en las que gotitas individuales de aceite de una emulsión o/w incluyen pequeñas gotas de agua constituyen una emulsión w/o/w. De la misma manera, un sistema de gotas de aceite incluido en glóbulos de agua estabilizada en un continuo aceitoso proporciona una emulsión o/w/o.

Las emulsiones se caracterizan por tener poca o nada de estabilidad termodinámica. A menudo, la fase dispersa o discontinua de la emulsión se dispersa correctamente en la fase externa o continua y se mantiene en esta forma a través de medios emulsionantes o la viscosidad de la formulación. Cualquiera de las fases de la emulsión puede ser semisólida o sólida, como en el caso de bases para pomadas y cremas de estilo emulsión. Otros medios para estabilizar emulsiones implican el uso de emulsionantes que pueden incorporarse en cualquiera de las fases de la emulsión. Los emulsionantes pueden clasificarse en líneas generales en cuatro categorías: surfactantes sintéticos, emulsionantes que ocurren de manera natural, bases de absorción, y sólidos finamente dispersos (Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Baker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volumen 1, p. 199).

Los surfactantes sintéticos, también conocidos como agentes activos superficiales, han encontrado una amplia aplicabilidad en la formulación de emulsiones y han sido citados en la bibliografía (Rieger, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Baker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volumen 1, p.285, Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Baker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volumen 1, p.199). Los surfactantes son normalmente anfifílicos y comprende una parte hidrofílica y una parte hidrofóbica. El radio de la naturaleza hidrofílica a la hidrofóbica del surfactante ha sido denominado balance hidrófilo/lipófilo (HLB) y es considerada una valiosa herramienta para categorizar y seleccionar surfactantes en la preparación de formulaciones. Los surfactantes pueden clasificarse en diferentes clases en base a la naturaleza del grupo hidrofílico: no-iónico, aniónico, catiónico y anfotérico (Rieger en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Baker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volumen 1, p.285).

Los emulsionantes que ocurren de manera natural empleados en formulaciones de emulsiones incluyen lanolina, cera estampada, fosfatidos, lecitina y acacia. Las bases de absorción poseen propiedades hidrofílicas como la de absorber agua para formar emulsiones w/o y retener sus consistencias semisólidas, como la lanolina anhidro y el petrolato hidrofílico. Los sólidos finamente divididos también se han empleado como buenos emulsionantes sobre todo en combinación con surfactantes y en preparaciones viscosas. Estos incluyen sólidos polares inorgánicos, como los hidróxidos de metales pesados, arcillas no hinchables como la bentonita, atapulgita, hectorita, caolín, montmorillonita, silicato de aluminio coloidal y silicato de aluminio de magnesio coloidal, pigmentos y sólidos no polares como el carbono o tristearato de glicerina.

Una gran variedad de materiales no emulsionantes también se incluyen en formulaciones de emulsiones y contribuyen a las propiedades de las emulsiones. Estos incluyen grasas, aceites, ceras, ácidos grasos, alcoholes grasos, ésteres grasos, humectantes, coloides hidrofílicos, conservantes y antioxidantes (Block, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Baker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volumen 1, p. 335; Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Baker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volumen 1, p. 199).

Los coloides hidrofílicos o hidrocoloides incluyen gomas que ocurren de manera natural y polímeros sintéticos como los polisacáridos (por ejemplo, acacia, agar, ácido algínico, carragenina, goma guar, goma Baraya, y goma tragacanto), derivados de la celulosa (por ejemplo, carboximetilcelulosa y carboxipropilcelulosa), y polímeros sintéticos (por ejemplo, carbómeros, éteres de celulosa, y polimeros de carboxivinilo). Estos se dispersan o hinchan en agua para formar soluciones coloidales que estabilizan las emulsiones formando fuertes capas interfaciales alrededor de las gotas de fase dispersa e incrementando la viscosidad de la fase externa.

Debido a que las emulsiones a menudo contienen un número de ingredientes tales como los carbohidratos, proteínas, esteroles y fosfatidos que fácilmente mantienen el crecimiento de microbios, estas formulaciones con frecuencia incorporan conservantes. Los conservantes comúnmente empleados incluidos en formulaciones de emulsiones son metil parabeno, propil parabeno, sales cuaternarias de amonio, cloruro de benzalconio, ésteres de ácido p-hidroxibenzoico, y ácido bórico. Los antioxidantes también se añaden con frecuencia a las formulaciones para emulsiones para evitar la deterioración de la formulación. Los antioxidantes empleados pueden ser neutralizadores o bloqueadores de radicales libres como tocoferoles, galatos de alquilo, hidroxianisola butilada, hidroxitolueno butilado, o agentes reductores como ácido ascórbico y metabisulfito sódico, y sinergistas antioxidantes como el ácido cítrico, ácido tartárico, y lecitina.

La aplicación de las formulaciones para emulsión por medio de rutas dermatológica, oral y parenteral y los métodos para su fabricación han sido recogidos en la bibliografía (Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Baker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volumen 1, p. 199). Las formulaciones para emulsión para envío oral se han empleado de manera más frecuente debido a razones de facilidad en la formulación, eficacia de absorción y desde el punto de vista de biodisponibilidad (Rosoff, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Baker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volumen 1, p. 245; Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Baker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volumen 1, p. 199). Los laxantes con base mineral-aceite, las vitaminas solubles en aceite y las preparaciones nutritivas altas en grasa son algunos de los materiales que normalmente se han administrado oralmente como emulsiones o/w.

En una realización de la presente invención, las composiciones de oligonucleótidos y ácidos nucleicos se formulan como microemulsiones. Una microemulsión puede definirse como un sistema de agua, aceite y anfifilo que es una única solución líquida óptimamente isotrópica y termodinámicamente estable (Rosoff, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Baker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volumen 1, p. 245). Normalmente, las microemulsiones son sistemas que se preparan en primer lugar dispersando un aceite en una solución surfactante acuosa y a continuación añadiendo una cantidad suficiente de un cuarto componente, generalmente un alcohol intermediario de longitud de cadena para formar un sistema transparente. Por lo tanto, las microemulsiones se han descrito como termodinámicamente estables, dispersiones isotrópicamente claras de dos líquidos inmiscibles que se estabilizan mediante capas interfaciales de moléculas con superficie activa (Leung y Shah, en: Controlled Release Of Drugs: Polymers and Aggregate Systems, Rosoff, M. Ed., 1989, VCH Publishers, New York, páginas 185-215). Las microemulsiones normalmente se preparan mediante una combinación de tres a cinco componentes que incluyen aceite, agua, surfactante, cosurfactante y electrolito. Si la microemulsión es del tipo agua en aceite (w/o) o del tipo aceite en agua (o/w) depende de las propiedades del aceite y el surfactante empleados y de la estructura y el embalaje geométrico de las cabezas polares y las colas de hidrocarbono de las moléculas surfactantes (Schott, en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1985, p. 271).

El enfoque fenomenológico que emplea diagramas de fase se ha estudiado en profundidad y ha producido un conocimiento exhaustivo para un experto en la técnica sobre cómo formular emulsiones (Rosoff, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Baker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volumen 1, p. 245; Block, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Baker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volumen 1, p. 335). En comparación con las emulsiones convencionales, las microemulsiones con frecuencia ofrecen la ventaja de solubilizar fármacos insolubles en agua en una formulación de pequeñas gotas termodinámicamente estables que se forman de manera espontánea.

Los surfactantes empleados en la preparación de microemulsiones incluyen, aunque no se limitan a, surfactantes iónicos, surfactantes no iónicos, Brij 96, éteres polioxietileno oleil, ésteres ácidos grasos de poliglicerol, monolaurato de tetraglicerol (ML310), monooleato de tetraglicerol (MO310), monooleato de hexaglicerol (PO310), pentaoleato de hexaglicerol (PO500), monocrapato de decaglicerol (MCA750), monooleato de decaglicerol (MO750), sequiolato de decaglicerol (SO750), decaoleato de decaglicerol (DA0750), solos o en combinación con cosurfactantes. El cosurfactante, normalmente un alcohol de cadena corta como el etanol, 1-propanol, y 1-butanol, sirve para incrementar la fluidez interfacial penetrando en la capa surfactante y como consecuencia creando una capa desordenada del espacio vacío generado entre las moléculas surfactantes. Sin embargo, las microemulsiones pueden prepararse sin el uso de cosurfactantes y los sistemas de microemulsión auto-emulsionantes y libres de alcohol son conocidos en la técnica. La fase acuosa puede ser normalmente, aunque no se limita a, agua, una solución acuosa del fármaco, glicerol, PEG300, PEG400, poligliceroles, glicoles de propileno, y derivados de glicol de etileno. Las fase aceitosa incluye, aunque no se limita a, materiales tales como Captex 300, Captex 355, Capmul MCM, ésteres ácidos grasos, cadena media (C8-C12), mono-, di-, y tri-glicéridos, ésteres ácidos grasos de gliceril polioxietilados, alcoholes grasos, gliceridos poliglicolizados, gliceridos C8-C10 poliglicolizados saturados, aceites vegetales y aceite de silicona.

Las microemulsiones resultan particularmente interesantes desde el punto de vista de la solubilización farmacéutica y la absorción incrementada de los fármacos. Se han propuesto las microemulsiones con base lípida (tanto w/o como o/w) para incrementar la biodisponibilidad oral de los fármacos, incluyendo los péptidos (Constantidines et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385-1390; Ritschel, Meth. Find. Exp. Clin. Pharmacol., 1993, 13, 205). Las microemulsiones tienen ventajas como la de mejorar la solubilización de un fármaco, la protección del fármaco frente a la hidrólisis enzimática, la posible mejora de la absorción del fármaco debido a las alteraciones provocadas por el surfactante en la fluidez y permeabilidad de la membrana, y a la toxicidad disminuida (Constantidines et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385; Ho et al., J. Pharm. Sci., 1996, 85, 138-143). A menudo, las microemulsiones pueden formarse de manera espontánea cuando sus componentes se unen a temperatura ambiente. Este hecho puede resultar particularmente ventajoso cuando se formulan medicamentos termolábiles, péptidos y oligonucleótidos. Las microemulsiones han resultado efectivas en el envío transdérmico de componentes activos tanto en aplicaciones cosméticas como farmacéuticas. Se espera que las composiciones y las formulaciones para microemulsión de la presente invención faciliten la absorción sistemática incrementada de los oligonucleótidos y ácidos nucleicos desde el tracto gastrointestinal, así como la mejora de la respuesta celular local de los oligonucleótidos y ácidos nucleicos en el interior del tracto gastrointestinal, la vagina, la cavidad bucal y otras áreas de administración.

Las microemulsiones de la presente invención también pueden contener componentes adicionales y aditivos como el monoestearato de sorbitan (Grill 3), Labrasol, y potenciadores para la penetración para incrementar las propiedades de la formulación y aumentar la absorción de los oligonucleótidos y ácidos nucleicos de la presente invención. Los potenciadores para la penetración empleados en las microemulsiones de la presente invención pueden clasificarse por pertenecer a una de las cinco amplias categorías-surfactantes, ácidos grasos, sales biliares, agentes quelantes, y agentes no quelantes y no surfactantes (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92). Cada una de estas clases se ha descrito con anterioridad.

Liposomas

Además de las microemulsiones existen muchas estructuras surfactantes organizadas que han sido estudiadas y empleadas para la formulación de fármacos. Estas estructuras incluyen monocapas, micelas, bicapas y vesículas. Las vesículas, como los liposomas han atraído un gran interés debido a su especificidad y a la duración de acción que ofrecen desde el punto de vista de envío del fármaco. Como se emplea en la presente invención, el término "liposoma" significa una compuesta por lípidos anfílicos colocados en una bicapa esférica o en bicapas.

Los liposomas son vesículas unilamelar o multilamelares que tienen una membrana formada por un material lipofílico y con un interior acuoso. La parte acuosa contiene la composición que se va a enviar. Los liposomas catiónicos poseen la ventaja de ser capaces de fusionarse con la pared celular. Los liposomas no catiónicos, a pesar de que no son capaces de fusionarse de manera eficiente con la pared celular, son absorbidos por macrófagos in vivo.

Con el fin de cruzar piel mamífera intacta, las vesículas lípidas deben pasar a través de una serie de poros finos, cada uno con diámetro inferior a los 5 mm, bajo la influencia de un gradiente transdérmico adecuado. Por lo tanto, resulta deseable emplear un liposoma que sea elevadamente deformable y capaz de pasar a través de dichos poros finos.

Ventajas adicionales de los liposomas incluyen; liposomas obtenidos a partir de fosfolípidos naturales son biocompatibles y biodegradables; los liposomas pueden incorporarse una gran cantidad de agua y fármacos solubles lípidos; los liposomas pueden proteger fármacos encapsulados en sus compartimentos internos del metabolismo y la degradación (Rosoff, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Baker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volumen 1, p. 245). Entre las consideraciones importantes en la preparación de formulaciones con liposomas se citan la carga superficial lípida, el tamaño de la vesícula y el volumen acuoso de los liposomas.

Los liposomas son útiles para la transferencia y envío de ingredientes activos a la zona de acción. A causa de que la membrana liposómica es estructuralmente similar a las membranas biológicas, cuando los liposomas se aplican al tejido, los liposomas comienzan a fusionarse con las membranas celulares. A medida que la fusión entre el liposoma y la célula progresa, los contenidos liposómicos se vacían en la célula donde el agente activo puede
actuar.

Las formulaciones liposómicas han sido el centro de atención de extensas investigaciones sobre el modo de envío para muchos medicamentos. Existe una creciente evidencia de que para la administración tópica, los liposomas presentan varias ventajas con respecto a otras formulaciones. Dichas ventajas incluyen los reducidos efectos secundarios relacionados con la elevada absorción sistémica del fármaco administrado, la acumulación incrementada del fármaco administrado en el objetivo deseado, y la habilidad para administrar una gran variedad de fármacos, tanto hidrofílicos como hidrofóbicos, en la piel.

Varios informes han detallado la habilidad de los liposomas para enviar agentes incluyendo ADN de elevado peso molecular en la piel. Los compuestos incluyendo analgésicos, anticuerpos, hormonas y ADNs de elevado peso molecular se han administrado a la piel. La mayor parte de las aplicaciones resultaron en la selección del objetivo de la epidermis superior.

Los liposomas se dividen en dos amplias clases. Los liposomas catiónicos con liposomas positivamente cargados que interactúan con las moléculas de ADN negativamente cargadas para formar un complejo estable. El complejo positivamente cargado ADN/liposoma se enlaza con la superficie celular negativamente cargada y se internaliza en un endosoma. Debido al pH ácido el endosoma, los liposomas se rompen, liberando sus contenidos en el citoplasma celular (Wang et al., Biochem. Biphys. Res. Commun., 1987, 147, 980-985).

Los liposomas que son sensibles al pH o que están negativamente cargados, atrapan al ADN en vez de unirse a él. Debido a que tanto el ADN como el lípido están cargados de manera similar, se da una repulsión en vez de una formación de un complejo. Sin embargo, algo de ADN se queda atrapado en el interior acuoso de estos liposomas. Los liposomas sensibles al pH se han empleado para enviar ADN codificador de gen de timidina quinasa a las monocapas celulares en el cultivo. La expresión del gen endógeno se detectó en las células objetivo (Zhou et al., Journal of Controlled Release, 1992, 19, 269-274).

Un principal tipo de composiciones liposómicas incluye los fosfolípidos diferentes al fosfatidicolina naturalmente derivada. Las composiciones liposómicas neutrales, por ejemplo, pueden formarse a partir de dimiristoil fosfatidilcolina (DMPC), o dipalmitoil fosfatidilcolina (DPPC). Las composiciones liposómicas aniónicas normalmente se forman a partir de dimiristoil fosfatidilglicerol, mientras que los liposomas fusogénicos aniónicos se forman principalmente a partir de dioleoil fosfatidiletanolamina (DOPE). Otro tipo de composición liposómica se forma a partir de fosfatidilcolina (PC), como por ejemplo, soja PC y huevo PC. Otro tipo se forma a partir de mezclas de fosfolípido y/o fosfatidilcolina y/o colesterol.

Varios estudios han evaluado el envío tópico de formulaciones con fármacos liposómicos a la piel. La aplicación de liposomas que contiene interferón en piel de cerdo de guinea dio como resultado una reducción de la heridas de herpes en la piel mientras que el envío de interferón mediante otra vía (por ejemplo, como una solución o como una emulsión) fue inefectivo. (Weiner et al., Journal of Drug Targetting, 1992, 2, 405-410). Además, un estudio adicional probó la eficacia de interferón administrado como parte de una formulación liposómica a la administración de interferón empleando un sistema acuoso, y concluyó que la formulación liposómica era superior a la administración acuosa (du Plessis et al., Antiviral Research, 1992, 18, 259-265).

Los sistemas liposómicos no iónicos también se han examinado con el fin de determinar su utilidad en el envío de fármacos a la piel, en particular sistemas que comprenden surfactante no iónico y colesterol. Las formulaciones liposómicas no iónicas que incorporan Novasome^{TM} I (dilaurato de gliceril/colesterol/polioxietileno-10-éter estearil) y Novasome^{TM} II (distearato de gliceril/colesterol/polioxietileno-10-éter estearil) se emplearon para enviar ciclosporina-A a la dermis de la piel del ratón. Los resultados indicaron que dichos sistemas liposómicos no iónicos fueron efectivos para facilitar la deposición de ciclosporina-A en diferentes capas de la piel (Hu et al., S.T.P. Pharma. Sci., 1994, 4, 6, 466).

Los liposomas también incluyen liposomas "estéricamente estabilizados", un término que, tal y como aquí se emplea, hace referencia a liposomas que comprenden uno o más lípidos especializados que, cuando se incorporan a los liposomas, dan como resultado vidas medias prolongadas de circulación en relación con los liposomas que carecen de dichos lípidos especializados. Ejemplos de liposomas estéricamente especializados son aquellos en los cuales parte de la vesícula que forma la parte lípida del liposoma (A) está constituida por uno o más glicolípidos, como monosialogangliosido G_{M1}, o (B) se deriva con uno o más polímeros hidrofílicos, como un radical de un glicol de polietileno (PEG). A pesar de que no se desea basarse en ninguna teoría en particular, se cree en la técnica que, al menos para liposomas estabilizados estéricamente que contienen gangliosidos, esfingomielina, o lípidos derivados de PEG, la vida media prolongada de circulación de estos liposomas estéricamente estabilizados se deriva de una reducida respuesta en las células del sistema reticuloendotelial (RES) (Allen et al., FEBS Letters, 1987, 223, 42; Wu et al., Cancer Research, 1993, 53, 3765). Varios liposomas que comprenden uno o más glicolípidos son conocidos en la técnica. Papahadjopoulos et al. (Ann. N. Y. Acad. Sci., 1987, 507, 64) escribió sobre la habilidad de monosialogangliosido GM1, sulfato de galactocerebrósido y fosfatidilinositol para incrementar la vida media sanguínea de los liposomas. Estos hallazgos se expusieron por parte de Gabizon et al., (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 1988, 85, 6949). La Patente U.S No. 4,837,028 y WO 88/04924, ambas de Allen et al., describen liposomas que comprenden (1) esfingomielina y (2) la gangliosida GM1 o un éster de sulfato de galactocerebrósido. La Patente U.S No. 5,543,152 (Webb et al.) describe liposomas que comprenden esfingomielina. Los liposomas que contienen 1,2-sn-dimiristoilfsfatidilcolina se describen en WO 97/13499 (Lim et al.).

Muchos liposomas que contiene lípidos derivados con uno o más polímeros hidrofílicos, y métodos de preparación de los mismos son conocidos en la técnica. Sunamoto et al., (Bull. Chem. Soc. Jpn., 1980, 53, 2778) describió liposomas que contienen detergente naniónico, 2C_{12}15G, que contiene la fracción PEG. Illum et al. (FEBS Lett., 1984, 167, 79) anotó que la capa hidrofílica de las partículas de poliestireno con los glicoles poliméricos da como resultado un significante incremento en la vida media sanguínea. Los fosfolípidos modificados mediante la adición de grupos carboxílicos de glicoles de polialquileno (por ejemplo, PEG) se describen por parte de Sears (Patentes U.S Números 4,426,330 y 4,534,899). Klibanov et al., (FEBS Lett., 1990, 268, 235) describió experimentos que demostraban que los liposomas que contenían fosfatidiletanolamina (PE) derivados con PEG o con estearato PEG poseen un incremento en las vidas medias de circulación sanguínea. Blume et al., (Biochimica et Biophysica Acta, 1990, 1029, 91) extendió dichas observaciones a otros fosfolípidos derivados de PEG, por ejemplo, DSPE-PEG, formados a partir de la combinación de distearoilfosfatidiletanolamina (DSPE) y PEG. Los liposomas que tienen fracciones PEG enlazadas covalentemente en su superficie externa se describen en la Patente Europea No. EP 0 445 131 B1 y en WO 90/04384 de Fishner. Las composiciones de liposomas que contienen 1-20 porcentaje molecular de PE derivado con PEG, y métodos de uso de las mismas, se exponen en Woodle et al. (Patentes U.S Números 5,013,556 y 5,356,633) y Martin et al. (Patente U.S Número 5,213,804 y la Patente Europea Número EP 9 496 813 B1). Los liposomas que contienen un número de otros conjugados lípido-polímero se describen en WO 91/05545 y en la Patente U.S Número 5,225,212 (ambas de Martin et al.) y en WO 94/20073 (Zalipsky et al.). Liposomas que contienen lípidos de ceramida modificados con PEG se describen en WO 96/10391 (Choi et al.). Los números de Patentes U.S 5,540,935 (Miyazaki et al.) y 5,556,948 (Tagawa et al.) describen los liposomas que contienen PEG y que además pueden derivarse con fracciones funcionales en sus superficies.

Un número limitado de liposomas que comprenden ácidos nucleicos son conocidos en la técnica. WO 96/40062 de Thierry et al. describe métodos para encapsular ácidos nucleicos de elevado peso molecular en liposomas. El número de Patente U.S 5,264,221 de Tagawa et al. describe liposomas enlazados con proteína y afirma que los contenidos de dichos liposomas pueden incluir un ARN antisentido. El número de Patente U.S 5,665,710 de Rahman et al. describe ciertos métodos para encapsular oligodeoxinucleótidos en liposomas. WO 97/04787 de Love et al. describe liposomas que contienen oligonucleótidos antisentido dirigidos al gen raf.

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Las transfersomas son incluso otro tipo de liposomas, y son agregados lípidos elevadamente transformables que son candidatos atractivos para los vehículos de envió de medicamentos o fármacos. Las transfersomas pueden describirse como pequeñas gotas lípidas que se deforman en tal grado que son capaces de penetrar fácilmente a través de los poros que son más pequeños que las pequeñas gotas. Las transfersomas son adaptables al medio en el que se emplean, por ejemplo, son auto-optimizables (se adaptan a la forma de los poros en la piel), auto-reparadoras, con frecuencia alcanzan sus objetivos sin fragmentarse, y con frecuencia se autocargan. Para hacer transfersomas es posible añadir activadores laterales, normalmente surfactantes, a una composición liposómica estándar. Las transfersomas se han empleado para enviar albúmina en suero a la piel. El envío mediado por la transfersoma de albúmina en suero ha demostrado se eficaz como inyección subcutánea de una solución que contenía suero albúmina.

Los surfactantes encuentran una gran aplicación en formulaciones tales como emulsiones (incluyendo microemulsiones) y liposomas. El modo más común de clasificar las propiedades de los diferentes tipos de surfactantes, tanto naturales como sintéticos, es mediante el uso del balance hidrófilo/lipófilo (HLB). La naturaleza del grupo hidrofílico (también conocido como "cabeza") proporciona los medios más útiles para categorizar los diferentes surfactantes empleados en las formulaciones (Rieger en Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, p. 285).

Si la molécula surfactante no se ioniza, se clasifica como surfactante no iónico. Los surfactantes no iónicos encuentran una amplia aplicación en productos farmacéuticos y cosméticos y se emplean con una gran variedad de valores pH. En general, sus valores HLB oscilan entre aproximadamente 2 y 18 dependiendo de su estructura. Los surfactantes no iónicos incluyen ésteres no iónicos, como ésteres de glicol de etileno, ésteres de glicol de propileno, ésteres de gliceril, ésteres de poligliceril, ésteres de sorbitano, ésteres de sacarosa, y ésteres etoxilados. Las alcanolamidas no iónicas y los éteres tales como los etoxilatos de alcohol graso, alcoholes propoxilatados, y polímeros de bloqueo etoxilados/propoxilatados también se incluyen en esta clase. Los surfactantes de polioxietileno son los miembros más populares de la clase de surfactantes no iónicos.

Si la molécula surfactante transporta una carga negativa cuando se disuelve o dispersa en agua, el surfactante se clasifica como aniónico. Los surfactantes aniónicos incluyen carboxilatos como los jabones, los lactilatos de acilo, amidas de acilo de aminoácidos, ésteres de ácido sulfúrico como sulfatos de alquilo y sulfatos de alquilo etoxilado, sulfanatos como sulfanatos de benceno de alquilo, isetionatos de acilo, tauratos de acilo y sulfosuccionatos, y fosfatos. Los miembros más importantes de la clase surfactante aniónica son los sulfatos de alquilo y los jabones.

Si la molécula surfactante transporta una carga positiva cuando se disuelve o dispersa en agua, el surfactante se clasifica como catiónico. Los surfactantes catiónicos incluyen sales de amonio cuaternario y aminas etoxiladas. Las sales de amonio cuaternario son los miembros más empleados de esta clase.

Si la molécula surfactante tiene la habilidad de transportar tanto carga positiva como negativa, el surfactante se clasifica como anfotérico. Los surfactantes anfoféricos incluyen derivados de ácido acrílico, alquilamidas sustituidas, N-alquilbetaínas y fosfatidas.

Se ha revisado el uso de surfactantes en productos farmacéuticos, formulaciones y en emulsiones (Rieger en Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, p. 285).

Potenciadores de Penetración

En una realización, la presente invención emplea varios potenciadores de penetración para efectuar el envío eficaz de ácidos nucleicos, en particular oligonucleótidos, a la piel del animal. La mayoría de los fármacos están presentes en solución tanto en forma ionizada como en forma no ionizadas. Sin embargo, solamente lípidos solubles o fármacos lipofílicos son capaces de cruzar fácilmente las membranas celulares. Se ha descubierto que incluso los fármacos no lipofílicos pueden cruzar las membranas celulares si la membrana a ser cruzada se ha tratado con un potenciador de penetración. Además de ayudar a la difusión de fármacos no lipofílicos a través de las membranas celulares, los potenciadores de penetración también potencian la permeabilidad de fármacos lipofílicos.

Los potenciadores de penetración pueden clasificarse por pertenecer a una de las cinco amplias categorías, es decir, surfactantes, ácidos grasos, sales biliares, agentes quelantes, y agentes no quelantes y no surfactantes (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92). Cada una de las clases arriba mencionadas de potenciadores de penetración se describe a continuación con mayor detalle.

Surfactantes: En relación con la presente invención, los surfactantes (o "agentes activos superficiales") son entidades químicas que, cuando se disuelven en una solución acuosa, reducen la tensión superficial de la solución o la tensión interfacial entre la solución acuosa y otro líquido, con el resultado de que la absorción de los oligonucleótidos a través de la mucosa aumenta. Además de las sales biliares y los ácidos grasos, estos potenciadores de penetración incluyen, por ejemplo, lauril sulfato de sodio, éter polioxietileno-9-lauril y éter polioxietileno-20-cetil. (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92); y emulsiones perfluoroquímicas, como FC-43. Takahashi et al, J. Pharm. Pharmacol., 1988, 40, 252).

Ácidos grasos: Varios ácidos grasos y sus derivados que actúan como potenciadores de penetración incluyen, por ejemplo, ácido oleico, ácido láurico, ácido cáprico, (ácido n-decanoico), ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido linoleico, ácido linolénico, dicaprato, tricaprato, monooleina (1-monooleoil-rac-glicerol), dilaurina, ácido caprílico, ácido araquidónico, glicerol, 1-mocaprato, 1-dodecilazacicloheptano-2-uno, acilcarnitinas, acilcolinas, C_{1-10} ésteres de alquilo de los mismos (por ejemplo, metil, isopropil y t-butilo), y mono- y di-glicéridos de los mismos (es decir, oleato, laurato, caprato, miristato, palmitato, estearato, linoleato, etc.) (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; El Hariri et al., J. Pharm. Pharmacol., 1992, 44, 651-654).

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Sales biliares: El papel fisiológico de la bilis incluye la facilitación del proceso de dispersión y absorción de lípidos y de vitaminas solubles en grasa (Bunton, Capítulo 38 en: Goodman & Gilman's The Pharmaceutical Basis of Therapeutics, 9ª ed., Hardman et al, Eds., McGraw-Hill, New York, 1996, páginas 934-935). Varias sales biliares, y sus derivados sintéticos, actúan como potenciadores de penetración. Por lo tanto, el término "sales biliares" incluye cualquiera de los componentes que naturalmente ocurren en la bilis así como sus derivados sintéticos. Las sales biliares de la invención incluyen, por ejemplo, ácido cólico (o su sal sódica o colato sódico farmacéuticamente aceptables), ácido dehidrocólico (dehidrocolato sódico), ácido deoxicólico (deoxicolato sódico), ácido glucólico (glucolato sódico), ácido glicólico (glicolato sódico), ácido glicodeoxicólico (glicodeoxicolato sódico), ácido taurocólico (taurocolato sódico), ácido taurodeoxicólico (taurodeoxicolato sódico), ácido quenodeoxicólico (quenodeoxicolato sódico), ácido ursodeoxicólico (UDCA), tauro-24, 25-dihidro-fusidato sódico (STDHF), glicodihidrofusidato sódico y éter polioxietileno-9-lauril (POE). (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92; Swinyard, Capítulo 39 en: Remington's Pharmaceutical Sciences, 18^{th} Ed., Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990, páginas 782-783; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Yamamoto et al., J. Pharm. Exp. Ther., 1992, 263, 25; Yamashita et al., J. Pharm. Sci., 1990, 79, 579-583).

Agentes Quelantes: Los agentes quelantes, empleados en relación con la presente invención, pueden definirse como compuestos para retirar los iones metálicos de la solución formando complejos con ellos, dando como resultado el incremento de la absorción de oligonucleótidos a través de la mucosa. Con respecto a su uso como potenciadores de penetración en la presente invención, los agentes quelantes han añadido la ventaja de servir también como inhibidores de ADNasa, ya que la mayoría de las nucleasas de ADN caracterizadas requieren un ión metálico divalente para la catálisis y se inhiben por lo tanto por agentes quelantes (Jarret, J. Chromatogr., 1993, 618, 315-339). Los agentes quelantes de la invención incluyen, aunque no se limitan a, etilenodiaminetetraacetato sódico (EDTA), ácido cítrico, salicilatos (por ejemplo, salicilato sódico, 5-metoxisalicilato y homovanilato), derivados N-acil de colágeno, laureth-9 y derivados N-amino acil de beta-diquetonas (enaminas) (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Buur et al., J. Control Rel., 1990, 14, 43-51).

No-surfactantes no-quelantes: Tal y como aquí se emplean, los compuestos potenciadores de penetración no-surfactantes no-quelantes pueden definirse como compuestos que demuestran actividad insignificante como agentes quelantes o como agentes surfactantes pero que a pesar de ello potencian la absorción de oligonucleótidos a través de la mucosa alimenticia (Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33). Esta clase de potenciadores de penetración incluye, por ejemplo, ureas cíclicas no saturadas, 1-alquilo y derivados de 1-alquenilazaciclo-alcalona (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92), y agentes no esteroides antiinflamatorios como sodio de diclofenaco, indometacina y fenilbutazona (Yamashita et al., J. Pharm. Pharmacol., 1987, 39, 621-626).

Agentes que potencian la respuesta de oligonucleótidos en el nivel celular también pueden añadirse a las composiciones farmacéuticas o a otras composiciones de la presente invención. Por ejemplo, los lípidos catiónicos, como la lipofectina (Junichi et al., Patente U.S Nº 5,705,188), derivados de glicerol catiónico, y moléculas policatiónicas, como polilisina (Lollo et al., Solicitud PCT WO 97/30731), también son conocidos por potenciar la respuesta celular de los oligonucleótidos.

Pueden utilizarse otros agentes para potenciar la penetración de los ácidos nucleicos administrados, incluyendo glicoles tales como el glicol de etileno y el glicol de propileno, pirroles tales como 2-pirrol, azonas, y terpenos como limoneno y mentona.

Portadores

Ciertas composiciones de la presente invención también incorporan compuestos portadores en la formulación. Tal y como aquí se emplea, "compuesto portador" o "portador" puede hacer referencia a un ácido nucleico, o un análogo del mismo, que es inerte (es decir, no posee actividad biológica por sí mismo) pero ser reconoce como un ácido nucleico por procesos in vivo que reducen la biodisponibilidad de un ácido nucleico que posee actividad biológica, por ejemplo degradando el ácido nucleico biológicamente activo o promoviendo su retirada de la circulación. La coadministración de un ácido nucleico y de un compuesto portador, normalmente con un exceso de esta última sustancia, puede dar como resultado una sustancial reducción de la cantidad de ácido nucleico recuperada en el hígado, riñón u otras reservas extracirculatorias, presumiblemente debido a la competición entre el compuesto portador y el ácido nucleico por un receptor común. Por ejemplo, la recuperación de un oligonucleótido parcialmente fosforotioato en tejido hepático puede reducirse si se administra con ácido poliinosínico, sulfato de dextrano, ácido policitídico o ácido 4-acetamido-4'isotiociano-estilbeno-2,2'-disulfónico (Miyao et al., Antisense Res. Dev., 1995, 5, 115-121; Takakura et al., Antisense & Nucl. Acid Drug Dev., 1996, 6, 177-183).

Excipientes

A diferencia de un compuesto portador, un "portador farmacéutico" o "excipiente" es un disolvente farmacéuticamente aceptable, agente suspendedor u otro vehículo farmacológicamente inerte para el envío de uno o más ácidos nucleicos a un animal. El excipiente puede ser sólido o líquido y se selecciona, con la manera planeada de administración en mente, para proporcionar la cantidad y la consistencia necesarias cuando se combina con un ácido nucleico y con otros componentes de una composición farmacéutica determinada. Los portadores farmacéuticos habituales incluyen, aunque no se limitan a, agentes vinculantes (por ejemplo, almidón de maíz pregelatinizado, polivinilpirrolidina o metilcelulosa de hidroxipropil, etc.); rellenadores (por ejemplo, lactosa u otros azúcares, celulosa microcristalina, pectina, gelatina, sulfato cálcico, celulosa de etilo, poliacrilatos o fosfato de hidrógeno cálcico, etc.), lubricantes (por ejemplo, esterato de magnesio, talco, sílice, dióxido de silicona coloidal, ácido esteárico, estearatos metálicos, aceites vegetales hidrogenados, almidón de trigo, glicoles de polietileno, benzoato sódico, acetato sódico, etc.), desintegrantes (por ejemplo, almidón, glicolato de almidón sódico); y agentes humectantes (por ejemplo, sulfato de lauril sódico, etc.).

Los excipientes orgánicos e inorgánicos farmacéuticamente aceptables para la administración no parenteral que no reaccionen de manera nociva con los ácidos nucleicos también pueden emplearse para formular las composiciones de la presente invención. Portadores farmacéuticamente aceptables incluyen, a pesar de que no se limitan a, agua, soluciones saladas, alcoholes, glicoles de polietileno, gelatina, lactosa, amilosa, estearato de magnesio, talco, ácido silicílico, parafina viscosa, hidroximetilcelulosa, polivinilpirrolidona y similares.

Las formulaciones para administración tópica de ácidos nucleicos pueden incluir soluciones acuosas estériles y no estériles, soluciones no acuosas, normalmente disolventes como alcoholes, o soluciones del los ácidos nucleicos en líquido o bases de aceite sólidas. Las soluciones también pueden contener búferes, diluyentes y otros aditivos adecuados. Pueden emplearse excipientes orgánicos o inorgánicos farmacéuticamente aceptables adecuados para la administración no parenteral que no reaccionen de manera nociva con los ácidos nucleicos.

Excipientes farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen, aunque no se limitan a, agua, soluciones saladas, alcoholes, glicoles de polietileno, gelatina, lactosa, amilosa, estearato de magnesio, talco, ácido silicílico, parafina viscosa, hidroximetilcelulosa, polivinilpirrolidona y similares.

Otros componentes

Las composiciones de la presente invención pueden contener de manera adicional otros componentes adjuntos encontrados de manera convencional en composiciones farmacéuticas, en sus niveles de uso establecidos por la técnica. Por lo tanto, por ejemplo, las composiciones pueden contener materiales adicionales, compatibles y farmacéuticamente activos como, por ejemplo, agentes antipruríticos, astringentes, anestésicos locales o agentes antiinflamatorios, o pueden contener materiales adicionales útiles para formular físicamente varias formas de dosis de las composiciones de la presente invención, como colorantes, agentes saborizantes, conservantes, antioxidantes, agentes generadores de opacidad, agentes espesantes y estabilizadores. Sin embargo, dichos materiales, cuando se añaden, no deberían interferir de manera indebida en las actividades biológicas de los componentes de las composiciones de la presente invención. Las formulaciones pueden esterilizarse y, si se desea, mezclarse con agentes auxiliares, por ejemplo, lubricantes, conservantes, estabilizadores, agentes humectantes, emulsionantes, sales para influenciar la presión osmótica, búferes, colorantes, saborizantes y/o sustancias aromáticas y similares que no interactúan de manera nociva con los ácidos nucleicos de la invención.

Las suspensiones acuosas pueden contener sustancia que incrementan la viscosidad de la suspensión incluyendo, por ejemplo, carboximetilcelulosa sódica, sorbitol y/o dextrano. Las suspensiones pueden también contener estabilizadores.

Ciertas realizaciones de la invención proporcionan composiciones farmacéuticas que contienen (a) uno o más compuestos antisentido y (b) uno o más agentes quimioterapéuticos que funcionan mediante un mecanismo anti-sentido. Ejemplos de dichos agentes quimioterapéuticos incluye, aunque no se limitan a, medicamentos contra el cáncer como daunorubicina, dactinomicina, doxorubicina, bleomicina, mitomicina, mostaza de nitrógeno, clorambucil, melfalán, ciclofosfamida, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina (CA), 5-fluorouracil (5-FU), floxuridina (5-FUdR), metotrexato (MTX), colchicina, vincristina, vinblastina, etoposida, teniposida, cisplatina y dietilestilbestrol (DES). En general, consultar The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 15th Ed., Berkow et al., eds., 1987, Rahway, N.J., páginas 1206-1228). Los medicamentos antiinflamatorios, incluyendo aunque no limitando los medicamentos antiinflamatorios no esteroideos y los corticosteroides y medicamentos antivirales, incluyendo aunque sin limitando, ribivirina, vidarabina, aciclovir y ganciclovir, también pueden combinarse en composiciones de la invención. En general, consultar The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 15th Ed., Berkow et al., eds., 1987, Rahway, N.J., páginas 2499-2506 y 46-49, respectivamente). Otros agentes quimioterapéuticos antisentido también se encuentran en el ámbito de esta invención. Dos o más compuestos combinados pueden emplearse juntos o de manera secuencial.

En otra realización relacionada, las composiciones de la invención pueden contener uno o más compuestos antisentido, en particular oligonucleótidos, dirigidos a un primer ácido nucleico y uno o más compuestos antisentido adicionales dirigidos a un segundo ácido nucleico objetivo. En la técnica se conocen numerosos ejemplos de compuestos antisentido. Dos o más compuestos combinados pueden emplearse juntos o de manera secuencial.

Se cree que formulación de composiciones terapéuticas y su posterior administración se encuentran dentro de los conocimientos de un experto en la técnica. La dosis depende de la severidad y de la respuesta al estado de enfermedad a ser tratada, durando el curso del tratamiento entre varios días y meses, o hasta que se efectúe la cura o hasta que se consiga una disminución de la enfermedad. Las dosis óptimas pueden calcularse a partir de medidas de la acumulación del fármaco en el cuerpo del paciente. Las personas con el conocimiento adecuado pueden determinar de manera sencilla dosis óptimas, metodologías de dosis y ritmos de repetición. Las dosis óptimas pueden variar dependiendo de la relativa potencia de los oligonucleótidos individuales, y en general pueden estimarse en modelos animales in vitro e in vivo. En general, la dosis varía entre 0.01 \mug y 100 g. por kg de peso corporal, y puede administrarse una vez o más veces a diario, a la semana, al mes o al año, o incluso una vez cada 2 a 20 años. Las personas expertas en la técnica fácilmente pueden determinar los ritmos estimados de repetición para las dosis en base a tiempos medidos de residencia y a concentraciones del fármaco en fluidos o tejidos corporales. Tras el tratamiento exitoso, se puede desear que el paciente que el paciente realice una terapia de mantenimiento para evitar la recurrencia del estado de enfermedad, donde el oligonucleótido se administra en dosis de mantenimiento, que oscilan entre 0.01 \mug y 100 g. por kg de peso corporal, una vez o más veces por día, a una vez cada 20 años.

Mientras la presente invención se ha descrito con la descripción de acuerdo con ciertas de sus realizaciones preferentes, los siguientes ejemplos únicamente sirven para ilustrar la invención.

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Ejemplos Ejemplo 1 Fosforamiditas de nucleósido para Síntesis de oligonucleótido Deoxi y 2'-alcoxi amiditas

Se compraron 2'-Deoxi y 2'-metoxi beta-cianoetildiisopropil fosforamiditas en fuentes comerciales (por ejemplo, Chemgenes, Needham MA o Glen Research, Inc. Serling VA). Se preparan otras amiditas de nucleósido 2'-O-alcoxi sustituidas tal y como se describe en la Patente U.S 5,506,351. Para los oligonucleótidos sintetizados que emplean 2'-alcoxi amiditas, se empleó el ciclo estándar para oligonucleótidos no modificados, excepto que el paso de espera tras el envío de pulso de tetrazola y la base se aumentó a 360 segundos.

Los oligonucleótidos que contienen nucleótidos 5-metil-2'-deoxicitidina (5-Mec-C) se sintetizaron de acuerdo con los métodos publicados (Sanghvi et al., Nucleic Acids Research, 1993, 21, 3197-3203) empleando fosforamiditas disponibles en el mercado (Glen Research, Sterling VA o Chem Genes, Needham MA).

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2'-Fluoro Amiditas 2'-Fluorodeoxiadenosina Amiditas

Oligonucleótidos 2'-fluoro se sintetizaron como se ha descrito previamente (Kawasaki et al., J. Med. Chem., 1993, 36, 831-841) y la patente de Estados Unidos 5,670,633. En resumen, el nucleósido protegido N6-benzoil-2'-deoxi-2'-fluoroadenosina se sintetizó empleando 9-beta-D-arabinofuranosiladenina disponible en el mercado como material de inicio y modificando los procedimientos escritos por lo que el átomo 2-alfa-fluoro se introdujo mediante un desplazamiento S_{N}2 de un grupo 2'-beta-tritil. Por lo tanto N6-benzoil-9-beta-D-arabinofuranosiladenina se protegió de manera selectiva en una producción moderada como el intermediario 3'-5'-ditetrahidropiranil (THP). La desprotección de los grupos THP y N6-benzoil se llevó a cabo empleando metodologías estándar y se usaron métodos estándar para obtener intermediarios 5'-dimetoxitritil-(DMT) y 5'-DMT-3'-fosforamidita.

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2'-Fluorodeoxiguanosina

La síntesis de 2'-deoxi-2'-Fluorodeoxiguanosina se llevó a cabo empleando tetraisopropildisiloxanil (TPDS) protegido 9-beta-D-arabinofuranosiladenina como material de inicio, y la conversión al intermediario diisobutiril-arabinofuranosiladenina. La desprotección del grupo TPDS fue seguido por la protección del grupo hidroxil con THP para dar diisobutiril di-THP protegido arabinofuranosiladenina. La O-deacilación y la combinación con triflato selectiva fueron seguidas por el tratamiento del producto en crudo con fluoruro, teniendo lugar a continuación la desprotección de los grupos THP. Las mitologías estándar se emplearon pata obtener 5'-DMT y 5'-DMT-3'-fosforamiditas.

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2'-Fluorouridina

La síntesis de 2'-deoxi-2'-fluorouridina se llevó a cabo a cabo mediante la modificación de un procedimiento escrito en el cual 2, 2'-deoxi-1-beta-D-arabinofuranosiluracil se trató con 70% hidrógeno fluoruro-piridina. Los procedimientos estándar se emplearon para obtener 5'-DMT-3'-fosforamiditas.

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2'- Fluorodeoxicitidina

2'-deoxi-2'-fluorocitidina se sintetizó mediante la aminación de 2'-deoxi-2'-fluorouridina, seguido de la protección selectiva para dar N4-benzoil-2'-deoxi-2'-fluorocitidina. Se emplearon procedimientos estándar para obtener fosforamiditas 5'-DMT y 5'-DMT-3'.

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Amiditas modificadas 2'-O-(2-Metoxietil)

Amiditas de nucleósido sustituidas 2'-O-Metoxietil se preparan del siguiente modo, o de manera alternativa, siguiendo los métodos de Martin, P., Helvetica Chimica Acta, 1995, 78, 486-504.

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2,2'-Anhidro [1-(beta-D-arabinofuranosil)-5-metiluridina]

Se añadieron 5-Metiluridina (ribosiltimina, disponible en el mercado en Yamasa, Choshi, Japón) (72.0 g, 0279 M), difenilcarbonato (90.0 g, 0420 M) y bicarbonato sódico (2.0 g, 0.024 M) a DMF (300 ml). La mezcla se calentó hasta reflujo, con agitación, permitiendo que el gas de dióxido de carbono desarrollado se liberase que un modo controlado. Tras una hora, la solución ligeramente oscurecida se concentró bajo presión reducida. El jarabe resultante se vertió en dietiléter (2.5 L), agitando. El producto formó una goma. El éter se trasvasó y el residuo se disolvió en una cantidad mínima de metanol (cerca de 400 mL). Las solución se vertió en éter fresco (2.5 L) para producir una goma dura y consistente. El éter se trasvasó y la coma se secó en un horno de vacío (60ºC a 1 mm Hg durante 24 horas) para dar un sólido que se aplastó hasta conseguir un polvo moreno claro (57 g, 85% producción en crudo). El espectro NMR fue consistente con la estructura, se contaminó con fenol al igual que su sal sódica (cerca del 5%). El material se empleó de este modo para más reacciones (o puede purificarse mediante cromatografía de columna empleando un gradiente de metanol en acetato de etil (10-25%) para dar un sólido blanco, mp 222-4ºC).

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2'-O-Metoxietil-5-metiluridina

Se añadieron 2,2'-Anhidro-5-metiluridina (195 g, 0.81 M), tris (2-metoxietil)borato (231 g, 0.98 M) y 2-metoxietanol (1.2 L) a un frasco de presión de acero inoxidable de 2 L y el frasco se colocó en un baño de aceite precalentado a 160ºC. Tras el calentamiento durante 48 horas a 155-160ºC, el frasco se abrió y la solución se evaporó hasta que se secó y se trituró con MeOH (200 mL). El residuo se suspendió en acetona caliente (1 L). Las sales insolubles se filtraron, se lavaron con acetona (150 mL) y el filtrado se evaporó. El residuo (280 g) se disolvió en CH_{3}CN (600 mL) y se evaporó. La columna de gel de sílice (3 kg) se empaquetó en CH_{2}Cl_{2}/acetona/MeOH (20:5:3) que contiene 0.5% Et_{3}NH. El residuo se disolvió en CH_{2}Cl_{2} (250 mL) y se adsorbió en sílice (150 g) antes de cargarlo en la columna. El producto se eluyó con el disolvente de empaquetado para dar 160 g (63%) del producto. Se obtuvo material adicional volviendo a trabajar las fracciones impuras.

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2'-O-Metoxietil-5'-O-dimetoxitritil-5-metiluridina

Se co-evaporó 2'-O-Metoxietil-5'-O-dimetoxitritil-5-metiluridina (160 g, 0.506 M) con piridina (250 mL) y el residuo seco se disolvió en piridina. (1.3 L). Se añadió una primera alícuota de cloruro de dimetoxitritil (94.3 g, 0.278 M) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante una hora. A continuación se añadió metanol (170 mL) para frenar la reacción. HPLC mostró la presencia de aproximadamente el 70% del producto. El disolvente se evaporó y se trituró con CH_{3}CN (200 mL). El residuo se disolvió en CHCl_{3} (1.5 L) y se extrajo con 2x500 mL de NaHCO_{3} saturado y 2x500 mL de NaCl saturado. La fase orgánica se secó sobre Na_{2}SO_{4}, se filtró y se evaporó. Se obtuvieron 275 gramos de residuo. El residuo se purificó sobre una columna de gel de sílice de 3.5 kg, se empaquetó y eluyó con EtOAc/hexano/acetona (5:5:1) que contiene 0.5% Et_{3}NH. Las fracciones puras se evaporaron para dar 164 g de producto. Se obtuvieron 20 gramos adicionales a partir de las fracciones impuras para dar una producción total de 183 g (57%).

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3'-O-Acetil-2'-O-metoxietil-5'-O-dimetoxitritil-5-metiluridina

Se combinaron 2'-O-Metoxietil-5'-O-dimetoxitritil-5-metiluridina (106 g, 0.167 M), DMF/piridina (750 mL de una mezcla 3:1 preparada a partir de 562 mL de DMF y 188 mL de piridina) y anhidro acético (24.38 mL) y se agitaron a temperatura ambiente durante 24 horas. La reacción se controló mediante TLC enfriando en primer lugar la muestra TLC con la adición de MeOH. Tras la finalización de la reacción, tras el juicio de TLC, se añadió MeOH (50 mL) y la mezcla se evaporó a 35ºC. El residuo se disolvió en CHCl_{3} (800 mL) y se extrajo con 2x200 mL de bicarbonato sódico saturado y 2x200 mL de NaCl saturado. Las capas de agua se volvieron se extrajeron con 200 mL de CHCl_{3}. Los orgánicos combinados se secaron con sulfato sódico y se evaporaron para dar 122 g de residuo (aproximadamente 90% del producto). El residuo se purificó sobre una columna de gel de sílice de 3.5 kg y se eluyó con EtOAc/hexano (4:1). Las fracciones de producto puro se evaporaron para producir 96 g (84%). Se recuperó un 1.5 g adicional a partir de fracciones posteriores.

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3'-O Acetil-2'-O-metoxietil-5'-O-dimetoxitritil-5-metil-4-triazoleuridina

Se preparó una primera solución disolviendo 3'-O-acetil-2'-O-metoxietil-5'-O-dimetoxitritil-5-metiluridina (96 g, 0.144 M) en CH_{3}CN (700 mL) y se dejó aparte. Se añadió trietilamina (189 mL, 1.44 M) a una solución de triazola (90 g, 1.3 M) en CH_{3}CN (1 L), se enfrió a -5ºC y se agitó durante 0.5 horas empleando un agitador elevado. Se añadió POCl_{3} en forma de gotas durante un periodo de 30 minutos a la solución agitada mantenida en 0-10ºC, y la mezcla resultante se agitó durante 2 horas adicionales. La primera solución se añadió en forma de gotas durante un periodo de 45 minutos a la segunda solución. La mezcla de reacción resultante se almacenó durante la noche en una habitación fría. Las sales se filtraron de la mezcla de reacción y la solución se evaporó. El residuo se disolvió en EtOAc (1 L) y los sólidos insolubles se retiraron mediante filtración. El filtrado se lavó con 1x300 mL de NaHCO_{3} y 2x300 mL de NaCl saturado, se secó sobre sulfato sódico y se evaporó. El residuo se trituró con EtOAc para dar el compuesto del título.

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2'-O-Metoxietil-5'-O-dimetoxitritil-5-metilcitidina

Se agitó una solución de 3'-O-Acetil-2'-O-metoxietil-5'-O-dimetoxitritil-5-metil-4-triazoleuridina (103 g, 0.141 M) en dioxano (500 mL) y NH_{4}OH (30 mL) a temperatura ambiente durante 2 horas. La solución de dioxano se evaporó y el residuo se volvió un azeótropo con MeOH (2x200 mL). El residuo se disolvió en MeOH (300 mL) y se transfirió a un frasco de presión de acero inoxidable de 2 L. Se añadió MeOH (400 mL) saturado con gas NH_{3} y el frasco se calentó a 100ºC durante 2 horas (TLC mostró la conversión completa). Los contenidos del frasco se evaporaron hasta la sequedad y el residuo se disolvió en EtOAc (500 mL) y se lavó una vez con NaCl saturado (200 mL). Los componentes orgánicos se secaron sobre sulfato sódico y el disolvente se evaporó para dar 85 g (95%) del compuesto del título.

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N4-Benzoil-2'-O-Metoxietil-5'-O-dimetoxitritil-5-metilcitidina

Se disolvió 2'-O-Metoxietil-5'-O-dimetoxitritil-5-metilcitidina (85 g, 0.134 M) en DMF (800 mL) y se añadió anhidro benzoico (37.2 g, 0.165 M) agitando. Tras la agitación durante 3 horas, TLC mostró que la reacción estaba aproximadamente 95% completa. El disolvente se evaporó y el residuo se volvió un azeótropo con MeOH (200 mL). El residuo se disolvió en CHCl_{3} (700 mL) y se extrajo con NaHCO_{3} saturado (2x300 mL) y NaCl saturado (2x300 mL), se segó sobre MgSO_{4} y se evaporó para dar un residuo (96 g). El residuo se sometió a cromatografía en una columna de sílice de 1.5 kg usando EtOAc/hexano (1:1) que contenía 0.5% Et_{3}NH como el disolvente eluyente. Las fracciones de producto puro se evaporaron para dar 90 g (90%) del compuesto del título.

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N4-Benzoil-2'-O-Metoxietil-5'-O-dimetoxitritil-5-metilcitidina-3'-amidita

Se disolvió N4-Benzoil-2'-O-Metoxietil-5'-O-dimetoxitritil-5-metilcitidina (74 g, 0.10 M) en CH_{2}Cl_{2} (1 L). Se añadieron tetrazola diisopropilamina (7.1 g) y 2-cianoetoxi-tetra-(isopropil)fosfita (40.5 mL, 0.123 M) agitando, bajo una atmósfera de nitrógeno. La mezcla resultante se agitó durante 20 horas a temperatura ambiente (TLC mostró que la reacción estaba 95% completa). La mezcla de la reacción se extrajo con NaHCO_{3} saturado (1x300 mL) y NaCl saturado (3x300 mL). Las capas acuosas se extrajeron de vuelta con CH_{2}Cl_{2} (300 mL), y los extractos se combinaron, se secaron sobre MgSO_{4} y se concentraron. El residuo obtenido fue sometido a cromatografía sobre una columna de sílice de 1.5 kg usando EtOAc/hexano (3:1) como el disolvente eluyente. Las fracciones de producto puro se combinaron para dar 90.6 g (87%) del compuesto del título.

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Amiditas 2'-O-(Aminooxietil)nucleósido y amiditas 2'-O-(dimetilaminooxietil)nucleósido Amiditas 2'-(Dimetilaminooxietil)nucleósido

Las amiditas 2'-(Dimetilaminooxietil)nucleósido [también conocidas en la técnica como amiditas 2'-O-(dimetil-
aminooxietil)nucleósido] se preparan tal y como se describe en los siguientes párrafos. Se preparan adenosina, citidina y amiditas de nucleósido de guanosina de manera similar a la timidina (5-metilburidina) excepto que las aminas exocíclicas se protegen con fracción de benzoil en el caso de la adenosina y la citidina y con isobutiril en el caso de guanosina.

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5'-O-tert-Butildifenilsilil-O^{2}-2'-anhidro-5-metiluridina

Se disolvieron O^{2}-2'-anhidro-5-metiluridina (Pro. Bio. Sint., Varese, Italia, 100.0 g, 0.416 mol), dimetilaminopiridina (0.66 g, 0.013 eq, 0.0054 mmol) en piridina seca (500 ml) a temperatura ambiente bajo una atmósfera de argón y con agitación mecánica. Se añadió tert-Butildifenilclorosilano (125.8 g, 119.0 mL, 1.1 eq, 0.458 mmol) en una porción. La reacción se agitó durante 16 horas a temperatura ambiente. TLC (Rf 0.22, acetato de etil) indicó una reacción completa. La solución se concentró bajo presión reducida con un aceite denso. Esto se dividió entre diclorometano (1 L) y agua salada (1 L). La capa orgánica se secó sobre sulfato sódico y se concentró bajo presión reducida con un aceite denso. El aceite se disolvió en una mezcla 1:1 de acetato de etilo y éter de etilo (600 mL) y la solución se enfrió a -100ºC. El producto cristalino resultante fue recogido mediante filtración, se lavó con éter de etilo (3x200 mL) y se seco (40ºC, 1 mm Hg, 24 h) con 149 g (74.8%) de sólido blanco. TLC y NMR fueron consistentes con el producto puro.

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5'-O-tert-Butildifenilsilil-2'-O-(2-hidroxietil)-5-metiluridina

Se añadió borano en tetrahidrofurán (1.0 M, 2.0 eq, 622 mL) en un reactor de presión sin agitar de 2 L de acero inoxidable. En la campana de gases y mediante agitación manual, se añadió de manera precavida y en primer lugar glicol de etileno (350 mL, exceso) hasta que la evolución del hidrógeno disminuyó. Se añadieron 5'-O-tert-Butildifenilsilil-O^{2}-2'-anhidro-5-metiluridina (149 g, 0.311 mol) y bicarbonato sódico (0.074 g, 0.003 eq) mediante agitación manual. El reactor se selló y se calentó en un baño de aceite hasta que se alcanzó una temperatura interna de 160ºC y a continuación se mantuvo durante 16 horas (presión < 100 psig). El recipiente se reacción se enfrió a temperatura ambiente y se abrió. TLC (Rf 0-67 para el producto deseado y Rf 0.82 para el producto secundario ara-T, acetato de etilo) indicó aproximadamente la conversión del 70% al producto. Con el fin de evitar la formación de productos secundarios adicionales, la reacción se frenó, se concentró bajo presión reducida (10 a 1 mm Hg) en un baño de agua cálida (40-100ºC) con el empleo de condiciones más extremas para retirar el glicol de etileno. [De manera alternativa, una vez que desaparece el disolvente de baja cocción, la solución restante puede dividirse entre acetato de etilo y agua. El producto se encontrará en la fase orgánica]. El residuo se purificó mediante cromatografía de columna (2 kg gel de sílice, gradiente acetato de etilo-hexano 1:1 a 4:1). Las fracciones apropiadas se combinaron, se vaciaron y se secaron al producto como una espuma blanca y crujiente (84 g, 50%), material de inicio contaminado (17.4 g) y material de inicio puro y reutilizable 20 g. La producción basada en el material inicial menos puro recuperado fue del 58%. TLC y NMR fueron consistentes con el 99% del producto puro.

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2'-O-([2-phthalimidoxy)etilo]-5'-t-butildifenilsilil-5-metiluridina

Se mezcló 5'-O-tert-Butildifenilsilil- 2'- O-(2-hidroxietil)-5-metiluridina (20 g, 36.98 mmol) con trifenilfosfina (11.63 g, 44.3 mmol) y N-hidroxiftalimida (7.24 g, 44.36 mmol). A continuación se secó sobre P_{2}O_{2} sometido a un elevado vacío durante dos días as 40ºC. La mezcla de la reacción se purgó con argón y se añadió THF seco (369.9 mL, Aldrich, botella de sellado seguro) para conseguir una solución clara. Se añadió dietil-azodicarboxilato (6.98 mL, 44.36 mmol) en forma de gotas a la mezcla de la reacción. La velocidad de adición se mantuvo de tal modo que la coloración resultante roja profunda se descargue justo antes de añadir la siguiente gota. Después de que la adición esté completada, la reacción se agitó durante 4 horas. Para ese momento, TLC mostró la finalización de la reacción (etilacetato:hexano, 60:40). El disolvente se evaporó en vacío. El residuo obtenido se colocó en una columna con destellos y se eluyó con acetato de etilo:hexano (60:40), para conseguir 2'-O- ([2-phthalimidoxy)etilo]-5'-t-butildifenilsilil-5-metiluridina como espuma blanca (21.819 g, 86%).

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5'-O-tert-butildifenilsilil- 2'- O-[(2 formadoximinooxi)etil]-5-metiluridina

Se disolvió 2'-O-([2-phthalimidoxy)etilo]-5'-t-butildifenilsilil-5-metiluridina (3.1 g, 4.5 mmol) en CH_{2}Cl_{2} (4.5 mL) y se añadió metilhidrazina (300 mL, 4.64 mmol) en forma de gotas a -10ºC a 0ºC. Tras una hora, la mezcla se filtró, y el filtrado se lavó con agua, agua salada y se secó sobre Na_{2}SO_{4} anhidroso. La solución se concentró para conseguir 2'-O-(aminoetil) timina, que a continuación se disolvió en MeOH (67.5 mL). A esto se le añadió formaldehído (20% solución acuosa, w/w, 1.1 eq.) y la mezcla resultante fue agitada durante una hora. El disolvente se retiro bajo vacío; el residuo fue sometido a cromatografía para obtener 5'-O-tert-butildifenilsilil-2'-O-[(2-formadoximinooxi)etil]-5-metiluridina como espuma blanca (1.95 g, 78%).

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5'-O-tert-Butildifenilsilil-2'-O-[N, N-dimetilaminooxietil]-5-metiluridina

Se disolvió 5'-O-tert-butildifenilsilil-2'-O-[(2-formadoximinooxi)etil]-5-metiluridina (1.77 g, 3.12 mol) en una solución de 1M piridina p-toluenesulfonato (PPTS) en MeOH seco (30.6 mL). Se añadió cianoborohídrido sódico (0.39 g, 6.13 mmol) a esta solución a 10ºC bajo atmósfera inerte. La mezcla de la reacción fue agitada durante 10 minutos a 10ºC. A continuación, se retiró el envase de la reacción del baño de hielo y se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas, la reacción fue controlada por TLC (5% MeOH en CH_{2}Cl_{2}). La solución acuosa NaHCO_{3} (2x20 mL). La fase de acetato de etilo se secó sobre Na_{2}SO_{4} y se evaporó hasta alcanzar la sequedad. El residuo se disolvió en una solución de 1 M PPTS en MeOH (30.6 mL). Se añadió formaldehído (20% w/w, 30 mL, 3.37 mmol) y la mezcla de la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 10 minutos. La mezcla de la reacción se enfrió a 10ºC en un baño de hielo, se añadió cianoborohídrido sódico (0.39 g, 6.13 mmol) y la mezcla de la reacción se agitó a 10ºC durante 10 minutos. Tras 10 minutos, la mezcla de la reacción se retiró del baño de hielo y se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. Se añadió 5% NaHCO_{3} (25 mL) a la mezcla de la reacción y se extrajo con acetato de etilo (2x25 mL). La capa de acetato de etilo se secó sobre Na_{2}SO_{4} y se evaporó hasta alcanzar la sequedad. El residuo obtenido fue purificado mediante cromatografía de columna con destellos y se eluyó con 5% MeOH en CH_{2}Cl_{2} para obtener 5'-O-tert-butildifenilsilil- 2'- O-[N,N-dimetilaminooxietil]-5-metiluridina como una espuma blanca (14.6 g, 80%).

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2'-O-(dimetilaminooxietil)-5-metiluridina

Se disolvió trietilamina trihidrofluoruro (3.91 mL, 24.0 mmol) en THF seco y trietilamina (1.67 mL, 12 mmol, seco, mantenido sobre KOH). Esta mezcla de trietilamina-2HF se añadió a continuación a 5'-O-tert-butildifenilsilil- 2'-O-[N,N-dimetilaminooxietil]-5-metiluridina (1.40 g, 2.4 mmol) y se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas. La reacción fue controlada por TLC (5% MeOH en CH_{2}Cl_{2}). El disolvente fue retirado mediante vacío y el residuo se colocó en una columna de destellos y se eluyó con 10% MeOH en CH_{2}Cl_{2} para obtener 2'-O-(dimetilaminooxietil)-5-metiluridina (766 mg, 92.5%).

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5'-O-DMT-2'-O-(dimetilaminooxietil)-5-metiluridina

Se secó 2'-O-(dimetilaminooxietil)-5-metiluridina (750 mg, 2.17 mmol) sobre P_{2}O_{5} bajo elevado vacío durante toda la noche a 40ºC. A continuación se co-evaporó con piridina de anhidro (20 mL). El residuo obtenido se disolvió en piridina (11 mL) bajo atmósfera de argón. Se añadieron 4-dimetilaminopiridina (26.5 mg, 2.60 mmol), 4,4'-dimetoxitritil cloruro (880 mg, 2.60 mmol) a la mezcla y se agitó la mezcla de la reacción a temperatura ambiente hasta que todo el material inicial despareció. Se retiró la piridina bajo vacío y el residuo fue sometido a cromatografía y se eluyó con 10% MeOH en CH_{2}Cl_{2} (que contenía unas pocas gotas de piridina) para conseguir 5'-O-DMT-2'-O-(dimetilamino-oxietil)-5-metiluridina (1.13 g, 80%).

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5'-O-DMT-2'-O-(dimetilaminooxietil)-5-metiluridina-3'-[(2-cianoetil)-N,N-diisopropilfosforamidita]

5'-O-DMT-2'-O-(dimetilaminooxietil)-5-metiluridina (1.08 g, 1.67 mmol) se co-evaporó con tolueno (20mL). Se añadió N,N-diisopropilamina tetrazoide (0.29 g, 1.27 mmol) al residuo y se secó sobre P205 bajo elevado vacío durante la noche a 40ºC. A continuación, la reacción se disolvió en acetonitrilo de anhidro (8.4 mL) y se añadió 2-cianoetil-N,N,N^{1},N^{1}-tetraisopropilfosforamidita (2.12 mL, 6.08 mmol). La mezcla de la reacción fue mezclada a temperatura ambiente durante 4 horas bajo atmósfera inerte. El progreso de la reacción fue controlado por TLC (hexano:acetato de etil 1:1): El disolvente se evaporó, a continuación el residuo se disolvió en acetato de etilo (70 mL) y se lavó con 5% NaHCO_{3} acuoso (40 mL). La capa de acetato de etilo se secó sobre Na_{2}SO_{4} de anhidro y se concentró. El residuo obtenido se sometió a cromatografía (acetato de etilo como eluyente) para conseguir 5'-O-DMT-2'-O-(dimetilaminooxietil)-5-metiluridina-3'-[(2-cianoetil)-N, N-diisopropilfosforamidita] como espuma blanca (1.04 g, 74.9%).

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Amiditas 2'-(Aminooxietoxi)nucleósido

Amiditas 2'-(Aminooxietoxi)nucleósido [también conocidas en la técnica como amiditas 2'-O-(aminooxietil) se preparan tal y como se describe en los siguientes párrafos. Las amiditas de adenosina, citidina y timidina nucleósido se preparan de manera similar.

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N2-isobutiril-6-O-difenilcarbamoil-2'-O-(2-etilacetil)-5'-O-(4,4-dimetoxitritil)guanosina-3'-[(2-cianoetil)-N,N-diisopropilfosforamidita]

El análogo de guanosina 2'-O-aminooxietil puede obtenerse mediante 2'-O-alquilación selectiva de diaminopurina ribosido. Las cantidades multigramos de diaminopurina ribosido pueden adquirirse en Schering AG (Berlín) para proporcionar 2'-O-(2-etilacetil)diaminopurina ribosido junto con una cantidad menor de 3'-O-isómero. 2'-O-(2-etilacetil) diaminopurina ribosido puede resolverse y convertirse en 2'-O-(2-etilacetil) guanosina mediante tratamiento con adenosina deaminasa. (McGee, D. P., C., Cook, P. D., Guinosso, C. J., WO 94/02501 Al 940203.). Los procedimientos de protección estándar deberían permitir que 2'-O-(2-etilacetil) -5'-O-(4,4-dimetoxitritil)guanosina y 2-N-isobutiril-6-O-difenilcarbamoil-2'-O-(2-etilacetil)-5'-O-(4,4-dimetoxitritil)guanosina puedan reducirse para proporcionar 2-N-isobutiril-6-O-difenilcarbamoil-2'-O-(2-etilacetil)-5'-O-(4,4-dimetoxitritil)guanosina. Al igual que anteriormente, el grupo hidroxil puede sustituirse por N-hidroxiftalimida por medio de una reacción Mitsunobu, y el nucleósido protegido puede fosfatizarse como es habitual para producir 2-N-isobutiril-6-O-difenilcarbamoil-2'-O-(2-etilacetil)-5'-O-(4,4-dimetoxitritil)guanosina-3'-[(2-cianoetil)-N,N-diisopropilfosforamidita].

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Amiditas 2'-dimetilaminoetoxietoxi (2'-DMAEOE) nucleósido

Las amiditas 2-dimetilaminoetoxietoxi nucleósido (también conocidas en la técnica como 2'-O- dimetilaminoetoxietoxietil, es decir, 2'-O-CH_{2}-O-CH_{2}-N(CH_{2})_{2} o amiditas 2-DMAEOE nucleósido) se preparan del siguiente modo. Otras amiditas de nucleósido se preparan de manera similar.

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2'-O-[2(2-N,N-dimetilaminoetoxi)etil]-5-metil uridina

Se añade de manera lenta 2[2-(Dimetilamino) etanol (Aldrich, 6.66 g, 50 mmol) a una solución de borano en tetrahidrofurano (1 M, 10 mL, 10 mmol) agitando en una bomba de 100 mL. Se desarrolla gas de hidrógeno según el sólido se disuelve. O^{2}-,2'-anhidro-5-metiluridina (1.2 g, 5 mmol), y bicarbonato sódico (2.5 mg) se añaden y la bomba se sella, se coloca en un baño de aceite y se calienta a 155ºC durante 26 horas. La bomba se enfría a temperatura ambiente y se abre. Se concentra la solución en crudo y el residuo se divide entre agua (200 mL) y hexanos (200 mL). el fenol de exceso se extrae con acetato de etilo (3x200 mL) y las capas orgánicas combinadas se lavan una vez con agua, se secan sobre sulfato sódico de anhidro y se concentran. El residuo se somete a columna de gel de sílice usando metanol/cloruro de metileno 1:20 (que tiene un 2% trietilamina) como el eluyente. Cuando las fracciones de columna se concentran se forma un sólido incoloro que se recoge para dar el compuesto del título como un sólido blanco.

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5'-O-dimetoxitritil-2'-O-[2(2-N,N-dimetilaminoetoxi)etil)]-5-metil uridina

A 0.5 g (1.3 mmol) de 2'-O-[2(2-N,N-dimetilaminoetoxi)etil]-5-metil uridina en piridina de anhidro (8 mL), se añadieron trietilamina (0.36 mL) y cloruro de dimetoxitritil (DMT-Cl, 0.87 g, 2 eq.) y se agitan durante una hora. La mezcla de la reacción se vierte en agua (200 mL) y se extrae con CH_{2}Cl_{2} (2x200 mL). Las capas CH_{2}Cl_{2} combinadas se lavan con solución NaHCO_{3} saturada, seguido por la solución NaCl saturada y se secan sobre sulfato sódico de anhidro. La evaporación del disolvente seguida por la cromatografía de gel de sílice usando MeOH: CH_{2}Cl_{2}:Et_{3}N (20:1, v/v, con 1% trietilamina) da como resultado el compuesto del título.

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5'-O-Dimetoxitritil-2'-O-[2(2-N,N-dimetilaminoetoxi) etil)]-5-metil uridina-3'-O-(cianoetil-N,N-diisopropil) fosforamidita

Se añaden diisopropilaminotetrazolida (0.6 g) y 2-cianoetoxi-N,N-diisopropil fosforamidita (1.1 mL, 2 eq.) a una solución de 5'-O-dimetoxitritil-2'-O-[2(2-N, N-dimetilaminoetoxi) etil)]-5-metil uridina (2.17 g, 3 mmol) disuelta en CH_{2}Cl_{2} (20 mL) bajo una atmósfera de argón. La mezcla de la reacción se agita durante la noche y el disolvente se evapora. El residuo resultante se purifica mediante una cromatografía de columna con destellos de gel de sílice con acetato de etilo como eluyente para dar el compuesto del título.

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Ejemplo 2 Síntesis de oligonucleótido

Oligonucleótidos de osfofiéster sustituido y no sustituido (P=O) se sintetizan en un sintetizador automatizado de ADN (Modelo Applied Biosystems 380B) usando química de fosforamidita estándar con oxidación mediante yodo.

Los fosforotioatos (P=O) se sintetizan en lo relativo a los oligonucleótidos fosfodiéster excepto que la botella de oxidación estándar fue sustituida por 0.2 M solución de 3H-1,2-benzoditiol-3-uno 1,1-dióxido en acetonitrilo para someter a tiación de manera gradual los enlaces de fosfato. El paso de espera de tiación aumentó a 68 segundos y fue seguido por el paso de colocar una capa o funda. Tras la división de la columna CPG y el desbloqueo en hidróxido de amonio concentrado a 55ºC (18 h), los oligonucleótidos se purificaron mediante precipitación dos veces con 2.5 volúmenes de etanol de una solución de 0.5 m NaCl. Los oligonucleótidos de fosfinato se preparan tal y como se describe en la Patente U.S. 5,508,270.

Los oligonucleótidos de fosfonato de alquilo se preparan tal y como se describe en la Patente U.S 4,469,863.

Los oligonucleótidos 3'-Deoxi-3'-metileno fosfonato se preparan tal y como se describe en las Patentes U.S 5,610,289 o 5,625,050.

Los oligonucleótidos de fosforamidita se preparan tal y como se describe en la Patente U.S 5,256,775 o la Patente U.S 5,366,878.

Los oligonucleótidos de alquilfosfonotioato se preparan tal y como se describe en las solicitudes PCT publicadas PCT/US94/00902 y PCT/US93/06976 (publicadas como WO 94/17093 y WO 94/02499, respectivamente).

Los oligonucleótidos 3'-Deoxi-3'-amino fosforamidato se preparan tal y como se describe en la Patente U.S 5,476,925.

Los oligonucleótidos de fosfodiéster se preparan tal y como se describe en la Patente U.S 5,023,243.

Los oligonucleótidos de borano fosfato se preparan tal y como se describe en las Patentes U.S 5,130,302 y 5,177,198.

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Ejemplo 3 Síntesis de oligonucleósido

Los oligonucleósidos enlazados con metilenemetilimino, también identificados como oligonucleósidos enlazados con MMI, oligonucleósidos enlazados con metilenedi-metilhidrazo, también identificados como oligonucleósidos enlazados con MDH, y oligonucleósidos enlazados con metilenecarbonilamino, también identificados como oligonucleósidos enlazados con amida-3, y oligonucleósidos enlazados con metileneaminocarbonil, también identificados como oligonucleósidos enlazados con amida-4, así como compuestos mezclados de espina dorsal que tienen, por ejemplo, MMI alternativos y enlaces P=O o P=S se preparan tal y como se describe en las Patentes U.S 5,378,825, 5,386,023, 5,489,677, 5,602,240 y 5,610,289.

Los oligonucleósidos enlazados con formacetal o tioformacetal se preparan tal y como se describe en las Patentes U.S 5,264,562 y 5,264,564.

Los oligonucleótidos enlazados con óxido de etileno se preparan tal y como se describe en la Patente U.S 5,223,618.

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Ejemplo 4 Síntesis de PNA

Los ácidos nucleicos de péptido (PNAs) se preparan de acuerdo con uno de los varios procedimientos referidos a los Ácidos Nucleicos de Péptido (PNA): Síntesis, Propiedades y Aplicaciones Potenciales, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 1996, 4, 5-23. También pueden prepararse de acuerdo con las Patentes U.S 5, 539, 082, 5,700,922 y 5, 719, 262.

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Ejemplo 5 Síntesis de Oligonucleótidos Quiméricos

Los oligonucleótidos quiméricos, oligonucleósidos o oligonucleótidos/oligonucleósidos mezclados de la invención pueden se de varios tipos diferentes. Estos incluyen un primer tipo donde el segmento "vacío" de nucleósidos enlazados se posiciona entre los segmentos "ala" 5' y 3' de nucleósidos enlazados y un segundo tipo "extremo abierto" donde el segmento "vacío" se localiza bien en la terminal 3' o 5' del compuesto oligomérico. Los oligonucleótidos del primer tipo también son conocidos en la técnica como "gapmer" u oligonucleótidos con separación. Los oligonucleótidos del segundo tipo también son conocidos en la técnica como "hemimer" o "wingmer".

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[2'-O-Me]- -[2'-deoxi]- -[2'-O-Me] Oligonucleótidos de fosforotioato quiméricos

Los oligonucleótidos quiméricos que tienen segmentos 2'-O-alquil fosforotioato y oligonucleótidos 2'-deoxi fosforotioato se sintetizan usando un sintetizador de ADN automatizado Applied Biosystems Modelo 380B, como en el caso anterior. Los oligonucleótidos se sintetizan usando el sintetizador automatizado y 2'-deoxi-5'-dimetoxitritil-3'-O-fosforamidita para la parte ADN y 5'- dimetoxitritil-2'-O-metil-3'-O-fosforamidita para las alas 5' y 3'. El ciclo estándar de síntesis se modifica aumentando el paso de espera tras el envío de tetrazola y base a 600 segundos repetidos cuatro veces para ARN y dos veces para 2'-O-metilo. El oligonucleótido totalmente protegido se divide desde el soporte y el grupo fosfato se desprotege en 3:1 amonio/etanol a temperatura ambiente y a continuación se liofiliza hasta alcanzar la sequedad. Posteriormente se realiza el tratamiento en amonio metanólico durante 24 horas a temperatura ambiente para desproteger todas las bases y la muestra se vuelve a liofilizar hasta alcanzar la sequedad. La paleta se suspende en 1M TBAF en THF durante 24 horas a temperatura ambiente para desproteger las posiciones 2'. A continuación la reacción se enfría con 1M TEAA y la muestra se reduce posteriormente a ½ del volumen mediante Rotovac antes de de desalarse en una columna de exclusión de tamaño G25. A continuación, el oligo recuperado se analiza mediante espectrometría para la producción y para pureza mediante electroforesis capilar y mediante espectrometría de masa.

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Oligonucleótidos quiméricos fosforotioato [2'-O-(2-Metoxietil)]- -[2'-deoxi]- -[2'-O-(2-Metoxietil)]

Los oligonucleótidos quiméricos fosforotioato [2'-O-(2-metoxietil)]- -[2'-deoxi]- -[2'-O-(2-Metoxietil)] se prepararon siguiendo el procedimiento anteriormente mencionado para el oligonucleótido quimérico 2'-O-metil, con la sustitución de amiditas 2'-O-(metoxietil) por amiditas 2'-O-metil.

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Oligonucleótidos quiméricos [2'-O-(2-Metoxietil)Fosfodiéster]- -[2'-deoxi Fosforotioato]- -[2'-O-(2-Metoxietil)Fosfodiéster]

Los oligonucleótidos quiméricos [2'-O-(2-Metoxietil)Fosfodiéster]- -[2'-deoxi Fosforotioato]- -[2'-O-(2-Metoxietil) Fosfodiéster] se preparan siguiendo el procedimiento anteriormente mencionado para el oligonucleótido quimérico 2'-O-metil, con la sustitución de amiditas 2'-O-(metoxietil) por amiditas 2'-O-metil, la oxidación con yodo para generar los enlaces de internucleótido fosfodiéster en el interior de las porciones ala de las estructuras quimérica y la sulfurización utilizando 3,H-1,2, benzoditiol-3-uno 1,1 dióxido (Beaucage Reagent) para generar los enlaces de internucleótido fosfodiéster para el hueco central.

Otros oligonucleótidos quiméricos, oligonucleósidos quiméricos y oligonucleótidos/oligonucleósidos quiméricos mezclados se sintetizan de acuerdo con la Patente de Estados Unidos 5,623,065.

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Ejemplo 6 Aislamiento de Oligonucleótidos

Tras la división de la columna de cristal con poros controlada (Applied Biosystems) y el desbloqueo en hidróxido de amonio con concentrado a 55ºC durante 18 horas, los oligonucleótidos u oligonucleósidos se analizan mediante electroforesis de gel de poliacrilamida sobre geles desnaturalizantes y se calcula que es al menos el 85% del material de longitud completa. Las cantidades relativas de enlaces de fosforotioato y fosfodiéster obtenidas mediante síntesis se comprueban periódicamente mediante espectroscopia de resonancia magnética nuclear ^{31}P, y para algunos estudios los oligonucleótidos se purificaron mediante HPLC, tal y como se describe en Chiang et al., J. Biol. Chem. 1991, 266, 18162-18171. Los resultados obtenidos con el material purificado HPLC fueron similares a los obtenidos con el material purificado no HPLC.

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Ejemplo 7 Síntesis de Oligonucleótidos - Formato con Placa de 96 Pozos

Los oligonucleótidos se sintetizaron por medio de química con fosforamidita en fase sólida P(III) en un sintetizador automatizado capaz de acumular 96 secuencias de manera simultánea en un formato estándar con 96 pozos. Los enlaces de internucleótido fosfodiéster fueron posibles gracias a la oxidación con yodo acuoso. Los enlaces de internucleótido fosforotioato se generaron mediante sulfurización utilizando 3,H-1,2, benzoditiol-3-uno 1,1 dióxido (Beaucage Reagent) en acetonitrilo de anhidro. Las fosforamiditas con base protegida estándar beta-cianoetildiisopropil se compraron en vendedores comerciales (por ejemplo, PE-Applied Biosystems, Foster City, CA, o Pharmacia, Piscataway, NJ). Los nucleósidos no-estándar se sintetizan siguiendo los sistemas publicados o los métodos patentados. Se utilizan como fosforamiditas con base protegida beta-cianoetildiisopropil.

Los oligonucleótidos se dividen del soporte y se desprotegen con NH_{4}OH_{4} concentrado a elevada temperatura (55-60ºC) durante 12-16 horas y el producto liberado se seca a continuación en vacío. A continuación, el producto seco se vuelve a suspender en agua estéril para formar una placa maestra desde la cual se diluyen a continuación todas las muestras analíticas y muestras de la placa del test utilizando pipetas robóticas.

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Ejemplo 8 Análisis de Oligonucleótidos - Formato con Placa de 96 Pozos

La concentración de oligonucleótido en cada pozo se calculó mediante dilución de muestras y espectroscopia de absorción UV. La integridad de longitud completa de los productos individuales se evaluó mediante electroforesis capilar (CE) en el formato con 96 pozos (Beckham P/ACE^{TM} MDQ) o, para muestras preparadas individualmente, en un aparato comercial CE (por ejemplo, Beckham P/ACE^{TM} 5000, ABI 270). La composición de la base y el eje se confirmó mediante análisis de masa de los compuestos utilizando electroforesis de electrospray-masa. Todas las placas del ensayo se diluyeron a partir de la placa maestra usando pipetas robóticas de único canal y multi-canal. Se calculó que las placas eran aceptables si al menos el 85% de los compuestos sobre la placa eran al menos 85% de longitud completa.

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Ejemplo 9 Cultivo celular y tratamiento de oligonucleótidos

El efecto de compuestos antisentido en expresión de ácido nucleico objetivo puede comprobarse en cualquiera de los tipos celulares siempre y cuando el ácido nucleico objetivo esté presente en niveles mensurables. Esto se puede determinar de manera rutinaria usando, por ejemplo, NCR o el análisis de Northern blot. Los siguientes cinco tipos de células son presentados con fines ilustrativos, pero se pueden emplear otros tipos de células, siembre y cuando el objetivo se exprese en el tipo de célula escogido. Esto se puede determinar de manera sencilla mediante métodos habituales en la técnica, por ejemplo, análisis de Northern blot, ensayos de protección de ribonucleasa, o RT-PCR.

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Células T-24

La línea celular T-24 de carcinoma de vejiga celular transicional humana se obtuvo a partir de la Colección Americana de Cultivos Tipo (AMCC) (Manassas, VA). Las células T-24 se cultivaron de manera rutinaria en un medio basal completo McCoy 5A (Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD), se complementaron con 10% de suero de ternero fetal (Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD), 100 unidades de penicilina por mL, y 100 microgramos de estreptomicina por mL (Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD). Las células se pasaron mediante tripsinización y dilución cuando alcanzaron 90% de confluencia. Las células se sembraron en placas con 96 pozos (Falcon-Primaria #3872) en una densidad de 7000 células/pozo para uso en un análisis RT-PCR.

Para el ensayo Northern blot u otros análisis, las células pueden sembrarse en 100 mm o en otras placas de cultivo de tejido estándar y tratarse de manera similar, empleando volúmenes apropiados de medio y oligonucleótido.

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Células A549

La línea celular A594 de carcinoma pulmonar humano se obtuvo a partir de la Colección Americana de Cultivos Tipo (AMCC) (Manassas, VA). Las células A594 se cultivaron de manera rutinaria en un medio basal DMEM (Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD), se complementaron con 10% de suero de ternero fetal (Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD), 100 unidades de penicilina por mL, y 100 microgramos de estreptomicina por mL (Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD). Las células se pasaron mediante tripsinización y dilución cuando alcanzaron 90% de confluencia.

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Células NHDF

Fibroblasto dérmico neonatal humano (NHDF) se obtuvo a partir de la Corporación Clonetics (Walkersville MD). Los NHDFs se mantuvieron de manera rutinaria en un Medio de Crecimiento de Fibroblasto (Corporación Clonetics, Walkersville MD) complementados siguiendo las recomendaciones del proveedor. Las células se mantuvieron hasta 10 pasos tal y como lo recomienda el proveedor.

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Células HEK

Los queratinocitos embrionarios humanos (HEK) se obtuvieron a partir de la Corporación Clonetics (Walkersville MD). Los HEKs se mantuvieron de manera rutinaria en un Medio de Crecimiento de Fibroblasto (Corporación Clonetics, Walkersville MD) formulados siguiendo las recomendaciones del proveedor. Las células se mantuvieron hasta 10 pasos tal y como lo recomienda el proveedor.

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Células PC-12

La línea celular PC-12 neuronal de rata se obtuvo a partir de la Colección Americana de Cultivos Tipo (AMCC) (Manassas, VA). Las células PC-12 se cultivaron de manera rutinaria en DMEM, con elevada glucosa (Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD), complementadas con 10% de suero de caballo + 5% de suero de ternero fetal (Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD). Las células se pasaron de manera rutinaria mediante tripsinización y dilución cuando alcanzaron 90% de confluencia. Las células se sembraron en placas con 96 pozos (Falcon-Primaria #3872) en una densidad de 20000 células/pozo para uso en un análisis RT-PCR.

Para el ensayo Northern blot u otros análisis, las células pueden sembrarse en 100 mm o en otras placas de cultivo de tejido estándar y tratarse de manera similar, empleando volúmenes apropiados de medio y oligonucleótido.

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Tratamiento con compuestos antisentido

Cuando las células alcanzaron el 80% de confluencia, fueron tratadas con oligonucleótido. Para células que crecieron en placas con 96 pozos, los pozos se lavaron una vez con 200 \muL OPTI-MEM^{TM}-1 medio de suero reducido (Gibco BRL) y a continuación se trataron con 30 \muL de OPTI-MEM^{TM}-1 que contenía 3.75 \mug/ml LIPOFECTIN^{TM} (Gibco BRL) y la concentración deseada de oligonucleótido. Tras 4-7 horas de tratamiento, el medio fue sustituido por un medio fresco. Las células se cosecharon 16-24 horas tras el tratamiento con el oligonucleótido.

La concentración de oligonucleótido empleada varía de línea celular a línea celular. Para determinar la concentración óptima de oligonucleótido para una línea celular en particular las células son tratadas con un oligonucleótido positivo de control en un rango de concentraciones. Para células humanas el oligonucleótido positivo de control es ISIS 13920, TCCGTCATCGCTCCTCAGGG, SEQ ID NO: 1, un gapmer 2'-O-metoxietil (2'-O-metoxietiles mostrados en negrita) con un eje de fosforotioato que se alcanza hasta el H-ras humano. Para células de ratones y ratas el oligonucleótido positivo de control es ISIS 15770, ATGCATTCTGCCCCCAAGGA, SEQ ID NO: 2, un gapmer 2'-O-metoxietil (2'-O-metoxietiles mostrados en negrita) con un eje de fosforotioato que se alcanza hasta el c-raf tanto del ratón como de la rata. La concentración de oligonucleótido positivo de control que da como resultado el 80% de inhibición de c-Ha-ras (para ISIS 13920) o c-raf (para ISIS 15770) mARN a continuación se utiliza como concentración analítica para nuevos oligonucleótidos en posteriores experimentos para esa línea celular. Si no se alcanza el 80% de inhibición, la concentración más baja de oligonucleótido de control positivo que da como resultado el 60% de inhibición de H-ras o c-raf mARN se utiliza a continuación como concentración analítica de oligonucleótido en posteriores experimentos para esa línea celular. Si no se alcanza el 60% de inhibición, se determina que esa línea celular en particular no resulta adecuada para experimentos de transfección de oligonucleótido.

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Ejemplo 10 Análisis de inhibición de oligonucleótido de expresión PTP1B

La modulación antisentido de expresión PTP1B puede analizarse de una variedad de maneras conocidas en la técnica. Por ejemplo, los niveles PTP1B mARN pueden contabilizarse mediante, por ejemplo, análisis Northern blot, reacción en cadena de la polimerasa competitiva (PCR), o PCR a tiempo real (RT-PCR). Actualmente, es preferible el PCR a tiempo real. El análisis de ARN puede llevarse a cabo sobre ARN celular total o en poli(A) + ARN. Los métodos para aislar ARN se presentan en, por ejemplo, Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Volumen 1, pp. 4.1.1-4.2.9 y 4.5.1-4.5.3, John Wiley & Sons, Inc., 1993. El análisis Northern blot supone una rutina en la técnica y se describe en, por ejemplo, Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Volumen 1, pp. 4.2.1-4.2.9, John Wiley & Sons, Inc., 1996. La contabilización a tiempo real (PCR) puede llevarse a cabo de manera correcta usando el Sistema de Detección Secuencial ABI PRISM^{TM} 7700 disponible en el mercado, disponible en PE-Applied Biosystems, Foster City, CA y emplearse de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Antes del análisis cuantitativo PCR, se evalúan equipos de sondas para imprimadores específicos para el gen objetivo que se está midiendo para su habilidad para "multiplicarse" con una reacción de amplificación GAPDH. En la multiplicación, tanto el gen objetivo o el gen interno estándar GADPH se amplifican concurrentemente en una única muestra. En este análisis, el mARN aislado de células no tratadas se diluye en serie. Cada dilución se amplifica en presencia del equipo de sonda imprimador específico solamente para GAPDH, solamente el gen objetivo ("único-plex"), o ambos (multiplicación). Tras la amplificación PCR, se generan curvas estándar de GAPDH y señal objetivo de mARN como una función de dilución a partir de muestras único-plex o multiplicadas. Si tanto el coeficiente de curva y correlación del GAPDH y las señales objetivo de las muestran multiplicadas corresponden al 10% de sus valores correspondientes generados por las muestras único-plex, el equipo imprimador-sonda específico para ese objetivo es considerado como multiplicable. Otros métodos de PCR también son conocidos en la técnica.

Los niveles de proteína de PTP1B pueden contabilizarse en una variedad de modos bien conocidos en la técnica, como inmunoprecipitación, análisis Western blot (inmunoblotting), ELISA o clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS). Los anticuerpos dirigidos a PTP1B pueden identificarse y obtenerse a partir de una variedad de fuentes, como el catálogo MSRS de anticuerpos (Aerie Corporation, Birmingham, MI), o pueden prepararse mediante métodos convencionales de preparación de anticuerpos. Los métodos para la preparación de antisuero policlonal se describen en, por ejemplo, Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Volumen 2, pp. 11.12.1-11.12.9, John Wiley & Sons, Inc., 1997. La preparación de anticuerpos monoclonales se describe en, por ejemplo, Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Volumen 2, pp. 11.4.1-11.11.5, John Wiley & Sons, Inc., 1997.

Los métodos de inmunoprecipitación son estándar en la técnica y pueden encontrarse en, por ejemplo, Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Volumen 2, pp. 10.16.1-10.16.11, John Wiley & Sons, Inc., 1998. El análisis Western blot (inmunoblot) es estándar en la técnica y puede encontrarse en, por ejemplo, Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Volumen 2, pp. 10.8.1-10.8.21, John Wiley & Sons, Inc., 1997. Los ensayos inmunosorbentes ligados a enzima (ELISA) son estándar en la técnica y pueden encontrarse en, por ejemplo, Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Volumen 2, pp. 11.2.1-11.2.22, John Wiley & Sons, Inc., 1998.

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Ejemplo 11 Aislamiento Poli(A) + mARN

Poli(A) + mARN fueron aislados de acuerdo con Miura et al., Clin. Chem., 1996, 42, 1758-1764. Otros métodos para el aislamiento poli (A) + mARN se describen en, por ejemplo, Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Volumen 1, pp. 4.5.1-4.5.3, John Wiley & Sons, Inc., 1993. En resumen, para células cultivadas en placas de 96 pozos, el medio de crecimiento fue retirado de las células y cada pozo se lavó con 200 \muL PBS frío. Se añadió 60 \muL de búfer tisis (10 mM Tris-HCl, pH 7.6, 1 mM EDTA, 0.5 M NaCl, 0.5% NP-40, 20 mM complejo vanadil-ribonucleósido) a cada pozo, la placa se agitó suavemente y a continuación se incubó a temperatura ambiente durante cinco minutos. 55 \muL del lisado se transfirió a placas de 96 pozos cubiertos con Oligo d(T) (AGCT Inc., Irving CA). Las placas se incubaron durante 60 minutos a temperatura ambiente, se lavaron 3 veces con 200 \muL de búfer de lavado (10 mM Tris-HCl, pH 7.6, 1mM EDTA, 0.3 M NaCl). Tras el lavado final, las placa se secó sobre toallas de papel para retirar el exceso de búfer de lavado y a continuación se secaron al aire durante 5 minutos. Se añadieron 60 \muL de búfer de elución (5 mM Tris-HCl pH 7.6), precalentado a 70ºC, a cada pozo, la placa se incubó en una placa caliente a 90ºC durante 5 minutos, y a continuación el eluído se transfirió a una placa fresca con 96 pozos.

Las células que crecieron en placas de 100 mm o en otras placas estándar pueden tratarse de manera similar, usando volúmenes apropiados de todas las soluciones.

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Ejemplo 12 Aislamiento del total de ARN

El total de ARN fue aislado empleando un kit RNEASY 96^{TM} y los búferes adquiridos en Qiagen Inc. (Valencia CA) siguiendo las instrucciones recomendadas por el fabricante. En resumen, para células cultivadas en placas de 96 pozos, el medio de crecimiento fue retirado de las células y cada pozo se lavó con 200 \muL PBS frío. Se añadieron 100 \mul de búfer RLT a cada pozo y la placa fue agitada de manera vigorosa durante 20 segundos. A continuación se añadieron 100 \muL de etanol 70& a cada pozo y los contenidos se mezclaron con pipetas tres veces hacia arriba y hacia abajo. Posteriormente, las muestras se transfirieron a la placa de pozos RNEASY 96^{TM} unida a un colector QIAVAC^{TM} con una bandeja de recogida de residuos y unido a una fuente de vacío. Se aplicó el vacío durante 15 segundos. Se añadió 1 mL de búfer RW1 a cada pozo de la placa RNEASY 96^{TM} y se volvió a aplicar el vacío durante 15 segundos. A continuación se añadió 1 mM de búfer RPE a cada pozo de la placa RNEASY 96^{TM} y se aplicó el vacío durante un periodo de 15 segundos. A continuación se repitió el lavado con búfer RPE y el vació se aplicó durante un periodo adicional de 10 minutos. La placa fue retirada posteriormente del colector QIAVAC^{TM} y se secó sobre toallas de papel. La placa se volvió a unir con el colector QIAVAC^{TM} adaptado con una rejilla de tubo de recogida que contenía tubos de colección de 1.2 mL. Después se eluyó el ARN mediante la introducción con pipetas de 60 \muL de agua en cada pozo, se incubó durante 1 minuto, y a continuación se aplicó el vacío durante 30 segundos. El paso de elución se repitió con 60 \muL de agua adicional.

Los pasos repetitivos de introducción de pipeta y elución pueden automatizarse empleando QIAGEN Bio-Robot 9604 (Qiagen, Inc., Valencia CA). En esencia, tras la tisis celular sobre la placa de cultivo, la placa es transferida a la cubierta del robot donde se llevan a cabo los pasos de introducción de pipeta, tratamiento de ADNasa y
elución.

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Ejemplo 13 Análisis PCR Cuantitativo a Tiempo Real de Niveles PTP1B mARN

La cuantificación de niveles PTP1B mARN se determinó mediante PCR cuantitativo a tiempo real usando el Sistema de Detección Secuencial ABRI PRISM^{TM} 7700 (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Este es un sistema con un tubo cerrado, basado en la falta de gel, con detección fluorescente que permite una cuantificación con un elevado rendimiento de productos en reacción en cadena de polimerasa (PCR) en tiempo real. Al contrario que el PCR estándar, en el cual los productos de amplificación son contabilizados después de la finalización de PCR, los productos de PCR cuantitativo en tiempo real son contabilizados a medida que se acumulan. Esto se consigue incluyendo en la reacción PCR una sonda de oligonucleótido que templa específicamente entre los imprimadores delantero y trasero, y contiene dos tintes fluorescentes. Un tinte reportero (por ejemplo, JOE, FAM o VIC, obtenido bien de Operon Technologies Inc., Alameda, CA o de PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) se une al extremo 5' de la sonda y un tinte enfriador (por ejemplo, TAMRA, obtenido bien de Operon Technologies Inc., Alameda, CA o de PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) se une al extremo 3' de la sonda. Cuando la sonda y los tintes están intactos, la emisión del tinte reportero se enfría mediante la proximidad del tinte enfriador 3'. Durante la amplificación, la acción de templar la sonda con la secuencia objetivo crea un sustrato que puede dividirse mediante la actividad de 5'-exonucleasa de polimerasa Taq. Durante la fase de extensión del ciclo de amplificación PCR, la división de la sonda mediante polimerasa Taq libera al tinte reportero del resto de la sonda (y por lo tanto de la fracción que enfría) y se genera una señal fluorescente específica de la secuencia. Con cada ciclo, moléculas de tinte reportero adicionales se parten de sus respectivas sondas, y la intensidad fluorescente se controla en intervalos regulares mediante óptica láser construida en el Sistema de Detección Secuencial ABRI PRISM^{TM} 7700. En cada ensayo, una serie de reacciones paralelas que contienen diluciones en serie de mARN de muestras de control no tratadas genera una curva estándar que se emplea para cuantificar el porcentaje de inhibición tras el tratamiento de oligonucleótidos antisentido de la muestras del ensayo.

Los reagentes PCR se obtuvieron de PE-Applied Biosystems, Foster City, CA. Las reacciones RT-PCR se llevaron a cabo añadiendo 25 \mul cocktail PCR (Ix búfer TAQMAN^{TM}A, 5.5 mM MgCl_{2}, 300 pM respectivamente de dATP, dCTP y dGTP, 600 pm de dUPT, 100 nM respectivamente de imprimador delantero, imprimador trasero, y sonda, 20 Unidades de inhibidor ARNasa, 1.25 Unidades de AMPLITAQ GOLD^{TM}, y 12.5 Unidades de transcriptasa inversa MuLV) a placas de 96 pozos que contenían 25 pL de solución poli(A) mARN. La reacción RT se llevó a cabo mediante incubación durante 30 minutos a 48ºC. Tras una incubación de 10 minutos a 95ºC para activar el AMPLITAQ GOLD^{TM}, se realizaron 40 ciclos de un protocolo PCR de dos pasos: 95ºC durante 15 segundos (desnaturalización) seguido de 60ºC durante 1.5 minutos (templanza/extensión).

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Las sondas y los imprimadores para PTP1B humano fueron diseñados para hibridizar la secuencia PTP1B humana, usando información secuencial publicada (Número de acceso GenBank M31724, aquí incorporado como SEQ ID NO: 3). Para PTP1B humano los imprimadores PCR fueron:

Imprimador delantero: GGAGTTCGAGCAGATCGACAA (SEQ ID NO: 4).

Imprimador trasero: GGCCACTCTACATGGGAAGTC (SEQ ID NO: 5) y la sonda PCR fue: FAM-AGCTGGGCG
GCCATTTACCAGGAT-TAMRA (SEQ ID NO: 6) donde FAM (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) es el tinte reportero fluorescente y TAMRA (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) es el tinte enfriador.

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Para GAPDH los imprimadores PCR fueron:

Imprimador delantero: GAAGGTGAAGGTCGGAGTC (SEQ ID NO: 7).

Imprimador trasero: GAAGATGGTGATGGGATTTC (SEQ ID NO: 8) y la sonda PCR fue: 5' JOE-CAAGCTTCC
CGTTCTCAGCC-TAMRA 3' (SEQ ID NO: 9) donde JOE (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) es el tinte reportero fluorescente y TAMRA (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) es el tinte enfriador.

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Las sondas y los imprimadores para PTP1B de rata fueron diseñados para hibridizar la secuencia PTP1B de rata, usando información secuencial publicada (Número de acceso GenBank M33962, aquí incorporado como SEQ ID NO:10). Para PTP1B de rata los imprimadores PCR fueron:

Imprimador delantero: CGAGGGTGCAAAGTTCATCAT (SEQ ID NO: 11).

Imprimador trasero: CCAGGTCTTCATGGGAAAGCT (SEQ ID NO: 12) y la sonda PCR fue: FAM-CGACTCGTCAGTGCAGGATCAGTGGA-TAMRA (SEQ ID NO: 13) FAM (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) es el tinte reportero fluorescente y TAMRA (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) es el tinte enfriador.

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Para GAPDH los imprimadores PCR fueron:

Imprimador delantero: TGTTCTAGAGACAGCCGCATCTT (SEQ ID NO: 14).

Imprimador trasero: CACCGACCTTCACCATCTTGT (SEQ ID NO: 15) y la sonda PCR fue: 5' JOE-TTGTGCAGTGCCAGCCTCGTCTCA-TAMRA 3' (SEQ ID NO: 16) donde JOE (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) es el tinte reportero fluorescente y TAMRA (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) es el tinte enfriador.

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Ejemplo 14 Análisis Northern blot de niveles PTP1B mARN

18 horas después del tratamiento antisentido, las monocapas celulares se lavaron dos veces con PBS frío y se lisaron en 1 mL RNAZOL^{TM} (TEL-TEST "B" Inc., Friendswood, TX). El ARN total se preparó siguiendo los protocolos recomendados por el fabricante. Se fraccionaron veinte microgramos del ARN total mediante electroforesis a través de geles 1.2% agarosa que contenían 1.1% formaldehído empleando un sistema búfer MOPS (AMRESCO, Inc. Solon, OH). El ARN fue transferido del gel a membranas de nylon HYBOND^{TM}-N+ (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) mediante transferencia capilar durante la noche empleando un sistema búfer de Transferencia Northern/Southern (TEL-TEST "B" Inc., Friendswood, TX). La transferencia de ARN se confirmó mediante visualización UV. Las membranas se fijaron mediante enlace cruzado UV usando un Crosslinker 2400 STRATALINKER^{TM} UV (Stratagene, Inc, La Jolla, CA) y a continuación se cubrió empleando solución de hibridización QUICKHIB^{TM} (Stratagene, Inc, La Jolla, CA) usando las recomendaciones del fabricante para condiciones
rigurosas.

Para detectar PTP1B humano, se preparó una sonda específica para PTP1B humano mediante PCR empleando el imprimador delantero GGAGTTCGAGCAGATCGACAA (SEQ ID NO: 4) y el imprimador trasero: GGCCACTCTACATGGGAAGTC (SEQ ID NO: 5). Para normalizar las variaciones en la eficiencia de carga y transferencia las membranas se vaciaron y se sondaron para hidrogenasasa humana gliceraldehído-3-fosfato (GAPDH) ARN (Clontech, Palo Alto, CA).

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Para detectar PTP1B de rata, se preparó una sonda específica para PTP1B de rata mediante PCR empleando el imprimador delantero CGAGGGTGCAAAGTTCATCAT (SEQ ID NO: 11) y el imprimador trasero: CCAGGTCTTCATGGGAAAGCT (SEQ ID NO: 12). Para normalizar las variaciones en la eficiencia de carga y transferencia las membranas se vaciaron y se sondaron para hidrogenasasa de rata gliceraldehído-3-fosfato (GAPDH) ARN (Clontech, Palo Alto, CA).

Las membranas hibridizadas se visualizaron y cuantificaron usando PHOSPHORIMAGER^{TM} e IMAGEQUANT^{TM} Software V3.3 (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA). Los datos se normalizaron para niveles GAPDH en controles no tratados.

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Ejemplo 15 Inhibición antisentido de expresión PTP1B humano mediante oligonucleótidos quiméricos de fosforotioato que tienen alas 2'-MOE y un hueco deoxi

De acuerdo con la presente invención, se diseñaron un conjunto de oligonucleótidos para diferentes regiones objetivo del ARN PTP1B humano empleando secuencias publicadas ((Número de acceso GenBank M31724, aquí incorporado como SEQ ID NO: 3). Los oligonucleótidos se muestran en la Tabla 1. "Punto Objetivo" indica el primer número de nucleótido (5'-máximo) en la secuencia objetivo particular con la cual el oligonucleótido se enlaza. Todos los compuestos en la Tabla 1 son oligonucleótidos quiméricos ("gapmers"), 20 nucleótidos en longitud, compuestos por una región central "hueco" consistente en diez 2'-oligonucleótidos, que se encuentran flanqueados en ambos lados (direcciones 5' y 3') por "alas" de cinco nucleótidos. Las alas están compuestas por nucleótidos 2'-metoxietil- (2'-MOE). Los enlaces de internucléosidos (eje) son fosforotioato (P=S) en todo el oligonucleótido. Todos los residuos de citidina son 5-metilcitidinas. Los compuestos se analizaron en busca de su efecto en niveles de PTP1B mARN humano mediante PCR cuantitativo en tiempo real tal y como se ha descrito aquí en otros ejemplos. Los datos son promedios de los dos experimentos. En el caso de que ocurra "N.D" indica "sin datos".

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1 Inhibición de niveles de PTP1B mARN humano mediante oligonucleótidos quiméricos de fosforotioato que tienen alas 2'-MOE y un hueco deoxi

1

TABLA 1 (continuación)

2

TABLA 1 (continuación)

3

Tal y como se muestra en la Tabla 1, las SEQ ID NOS 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 27, 29, 30, 32, 33, 35, 36, 38, 39, 40, 42, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 69, 70, 72, 73, 75, 78, 79, 80, 81, 83, 84, 86, 87, 89, 90, 92, 93, 94, 95 y 96 demuestran tener al menos el 95% de inhibición de la expresión humana PTP1B en este ensayo.

Ejemplo 16 Inhibición antisentido de expresión PTP1B de rata mediante oligonucleótidos quiméricos de fosforotioato que tienen alas 2'-MOE y un hueco deoxi

De acuerdo con la presente invención, se diseñó un segundo conjunto de oligonucleótidos para diferentes regiones objetivo de ARN PTP1B de rata, empleando secuencias publicadas (Número de acceso GenBank M33962, aquí incorporado como SEQ ID NO: 10). Los oligonucleótidos se muestran en la Tabla 2. "Punto Objetivo" indica el primer número de nucleótido (5'-máximo) en la secuencia objetivo particular con la cual el oligonucleótido se enlaza. Todos los compuestos en la Tabla 2 son oligonucleótidos quiméricos ("gapmers"), 20 nucleótidos en longitud, compuestos por una región central "hueco" consistente en diez 2'-oligonucleótidos, que se encuentran flanqueados en ambos lados (direcciones 5' y 3') por "alas" de cinco nucleótidos. Las alas están compuestas por nucleótidos 2'-metoxietil- (2'-MOE). Los enlaces de internucléosidos (eje) son fosforotioato (P=S) en todo el oligonucleótido. Todos los residuos de citidina son 5-metilcitidinas. Los compuestos se analizaron en busca de su efecto en niveles de PTP1B mARN de rata mediante PCR cuantitativo en tiempo real tal y como se ha descrito aquí en otros ejemplos. Los datos son promedios de los dos experimentos. En el caso de que ocurra "N.D" indica "sin datos".

TABLA 2 Inhibición de niveles de PTP1B mARN de rata mediante oligonucleótidos quiméricos de fosforotioato que tienen alas 2'-MOE y un hueco deoxi

5

TABLA 2 (continuación)

6

TABLA 2 (continuación)

7

TABLA 2 (continuación)

8

TABLA 2 (continuación)

9

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Tal y como se muestra en la Tabla 2, SEQ ID NOS 97, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 106, 107, 108, 109, 110, 112, 113, 114, 115, 117, 120, 121, 122, 123, 124, 126, 127, 128, 130, 131, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 144, 145, 146, 147, 148, 151, 152, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 164, 166, 167, 168, 168, 170, 171, 172, 173, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 191, 193, 195, 196, 198, 201, 202, 204, 205, 206, 211, 215, 217, 219, 223, 225, 226, 228, 229, 230, 232, 233, 235, 236, 237, 239 y 240 demuestran tener al menos el 30% de inhibición de la expresión de rata PTP1B en este experimento.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 17 Análisis Western blot de niveles de proteína PTP1B

El análisis Western blot (análisis inmunoblot) se lleva a cabo empleando métodos estándar. Las células se cultivan 16-20 horas tras el tratamiento de oligonucleótido, se lavan una vez con PBS, se suspenden en búfer Laemmli (100 \mul/pozo), se hierven durante 5 minutos y se cargan en un gel 16% SDS-GEL. Los geles de dejan actuar durante 1.5 horas a 150 V, y se transfieren a la membrana para Western blot. Se emplea el anticuerpo primario apropiado dirigido a PTP1B, con un anticuerpo secundario radioetiquetado o etiquetado de manera fluorescente dirigido contra la especie de anticuerpo primario. Las bandas se visualizan empleando un PHOSPHORIMAGER^{TM} (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA).

\global\parskip0.000000\baselineskip

<110> Isis Pharmaceuticals, Inc.

\hskip1cm

Lex M. Cowsert

\hskip1cm

Jacqueline Wyatt

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<120> MODULACIÓN ANTISENTIDO DE EXPRESIÓN PTP1B

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<130> RTSP-0086

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150> 091487,368

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 2000-01-18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 240

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 3247

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (91) (1398)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

12

14

15

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Imprimador PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\hskip1cm

16

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Imprimador PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\hskip1cm

17

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\hskip1cm

18

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Imprimador PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\hskip1cm

19

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Imprimador PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\hskip1cm

20

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\hskip1cm

21

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4127

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus norvergicus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (120)...(1418)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

22

24

25

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Imprimador PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Imprimador PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Imprimador PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Imprimador PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sonda PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

49

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

52

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

53

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

54

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

55

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

56

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

57

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

58

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

59

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

60

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

61

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

62

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

63

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

64

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

65

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 50

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

66

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 51

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

67

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 52

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

68

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 53

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

69

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 54

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

70

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonude6fida antisentido

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 55

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

71

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 56

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

72

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 57

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

73

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 58

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

74

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 59

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

75

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 60

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

76

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 61

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 61

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

77

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 62

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 62

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

78

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 63

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

79

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 64

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

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<400> 64

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\hskip1cm

80

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<220>

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<223> Oligonucleótido antisentido

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<400> 65

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\hskip1cm

81

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<212> ADN

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<220>

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<223> Oligonucleótido antisentido

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<400> 66

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\hskip1cm

82

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<212> ADN

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<220>

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<223> Oligonucleótido antisentido

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\hskip1cm

83

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<212> ADN

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<220>

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<223> Oligonucleótido antisentido

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\hskip1cm

84

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<220>

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<223> Oligonucleótido antisentido

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\hskip1cm

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<223> Oligonucleótido antisentido

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\hskip1cm

86

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\hskip1cm

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

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<400> 72

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\hskip1cm

88

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<212> ADN

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

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\hskip1cm

89

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<212> ADN

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<220>

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<223> Oligonucleótido antisentido

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<220>

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<223> Oligonucleótido antisentido

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\hskip1cm

91

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\hskip1cm

92

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<212> ADN

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<220>

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<223> Oligonucleótido antisentido

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<400> 77

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\hskip1cm

93

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<220>

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\hskip1cm

94

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\hskip1cm

95

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<220>

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<223> Oligonucleótido antisentido

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<400> 80

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\hskip1cm

96

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<221>

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<223> Oligonucleótido antisentido

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<400> 81

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\hskip1cm

97

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<212> ADN

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

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<400> 82

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\hskip1cm

98

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\vskip0.400000\baselineskip

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<220>

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<223> Oligonucleótido antisentido

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<400> 83

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\hskip1cm

99

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<220>

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<223> Oligonucleótido antisentido

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<400> 84

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\hskip1cm

100

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\vskip0.400000\baselineskip

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Oligonucleótido antisentido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 85

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\hskip1cm

101

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\vskip0.400000\baselineskip

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 86

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\hskip1cm

102

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 87

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<211> 20

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<212> ADN

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<220>

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<223> Oligonucleótido antisentido

\newpage

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\hskip1cm

103

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 88

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 88

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\hskip1cm

104

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\vskip0.400000\baselineskip

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<220>

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<223> Oligonucleótido antisentido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 89

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\hskip1cm

105

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<212> ADN

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<220>

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<223> Oligonucleótido antisentido

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<400> 90

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\hskip1cm

106

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 91

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\newpage

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<400> 91

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\hskip1cm

107

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 92

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<212> ADN

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\vskip1.000000\baselineskip

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 92

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\hskip1cm

108

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 93

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<211> 20

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<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 93

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\hskip1cm

109

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 94

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<211> 20

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<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 94

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\hskip1cm

110

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

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<212> ADN

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\vskip1.000000\baselineskip

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\newpage

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\hskip1cm

111

\vskip1.000000\baselineskip

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<212> ADN

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

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<400> 96

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\hskip1cm

112

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\vskip0.400000\baselineskip

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

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<400> 97

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\hskip1cm

113

\vskip1.000000\baselineskip

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<210> 98

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Oligonucleótido antisentido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 98

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\hskip1cm

114

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 99

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\newpage

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<400> 99

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\hskip1cm

115

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 100

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\hskip1cm

117

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 101

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

118

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 102

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 102

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

119

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 103

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Oligonucleótido antisentido

\newpage

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\hskip1cm

120

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<212> ADN

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 104

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\hskip1cm

121

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 105

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 105

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\hskip1cm

122

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 106

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 106

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\hskip1cm

123

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<211> 20

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<212> ADN

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<220>

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<223> Oligonucleótido antisentido

\newpage

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\hskip1cm

124

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<220>

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<223> Oligonucleótido antisentido

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<400> 108

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\hskip1cm

125

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<210> 109

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 109

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\hskip1cm

126

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<210> 110

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<211> 20

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<212> ADN

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<220>

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<223> Oligonucleótido antisentido

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<400> 110

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\hskip1cm

127

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\newpage

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<400> 111

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\hskip1cm

128

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 112

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 112

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\hskip1cm

129

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 113

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonutle6fido antisentido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 113

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\hskip1cm

130

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 114

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 114

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\hskip1cm

131

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 115

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\newpage

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<400> 115

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

132

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 116

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<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 116

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\hskip1cm

133

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 117

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 117

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\hskip1cm

134

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 118

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 118

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\hskip1cm

135

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 119

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\newpage

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<400> 119

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\hskip1cm

136

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 120

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 120

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\hskip1cm

137

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 121

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 121

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

138

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 122

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 122

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

139

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 123

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\newpage

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<400> 123

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

140

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 124

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<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 124

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

141

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 125

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 125

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

143

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 126

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 126

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

144

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 127

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 127

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

145

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 128

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<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 128

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\hskip1cm

146

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 129

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<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 129

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

147

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<210> 130

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\vskip1.000000\baselineskip

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<400> 130

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\hskip1cm

148

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<210> 131

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<223> Oligonucleótido antisentido

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152

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159

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167

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168

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169

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172

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173

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174

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175

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176

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<223> Oligonucleótido antisentido

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\hskip1cm

182

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<223> Oligonucleótido antisentido

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\hskip1cm

183

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<223> Oligonucleótido antisentido

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184

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185

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186

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187

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188

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189

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192

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193

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195

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196

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197

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198

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199

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200

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\hskip1cm

201

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\hskip1cm

202

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203

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204

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205

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<220>

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206

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<220>

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\hskip1cm

207

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<220>

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<400> 190

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\hskip1cm

208

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<220>

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<223> Oligonucleótido antisentido

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<400> 191

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\hskip1cm

209

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<212> ADN

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<220>

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<400> 192

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\hskip1cm

210

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

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<400> 193

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\hskip1cm

211

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<220>

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<223> Oligonucleótido antisentido

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<400> 194

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\hskip1cm

212

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<212> ADN

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<220>

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<223> Oligonucleótido antisentido

\newpage

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<400> 195

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\hskip1cm

213

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<220>

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<223> Oligonucleótido antisentido

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<400> 196

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\hskip1cm

214

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<210> 197

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 197

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

215

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 198

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

216

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 199

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Oligonucleótido antisentido

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 199

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\hskip1cm

217

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 200

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 200

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

218

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 201

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 201

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

219

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 202

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 202

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\hskip1cm

220

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 203

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Oligonucleótido antisentido

\newpage

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\hskip1cm

221

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 204

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<211> 20

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<212> ADN

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 204

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\hskip1cm

222

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 205

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 205

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\hskip1cm

223

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\vskip0.400000\baselineskip

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<211> 20

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<212> ADN

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 206

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\hskip1cm

224

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\vskip0.400000\baselineskip

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<211> 20

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<212> ADN

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\newpage

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\hskip1cm

225

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\vskip0.400000\baselineskip

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<220>

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<223> Oligonucleótido antisentido

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\hskip1cm

226

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 209

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<211> 20

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<212> ADN

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<220>

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<223> Oligonucleótido antisentido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 209

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\hskip1cm

227

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 210

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 210

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

228

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 211

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\newpage

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<400> 211

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

229

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 212

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<211> 20

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<212> ADN

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 212

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\hskip1cm

230

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 213

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 213

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\hskip1cm

231

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 214

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 214

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\hskip1cm

232

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 215

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 215

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

233

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 216

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 216

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\hskip1cm

234

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 217

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<211> 20

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<212> ADN

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 217

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\hskip1cm

235

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 218

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 218

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\hskip1cm

236

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 219

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<211> 20

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<212> ADN

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\newpage

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<400> 219

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\hskip1cm

237

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 220

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<211> 20

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<212> ADN

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 220

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

238

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 221

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<211> 20

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<212> ADN

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 221

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\hskip1cm

239

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 222

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 222

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\hskip1cm

240

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 223

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 223

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

241

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 224

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<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 224

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

242

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 225

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<211> 20

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<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 225

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

243

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 226

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 226

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

244

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 227

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 227

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

245

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 228

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<212> ADN

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 228

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\hskip1cm

246

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 229

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

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<400> 229

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\hskip1cm

247

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<210> 230

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 230

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

248

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 231

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 231

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

249

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 232

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 232

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

250

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 233

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 233

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

251

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 234

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 234

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

252

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 235

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 235

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

253

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 236

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 236

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

254

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 237

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 237

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

255

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 238

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 238

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

256

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 239

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 239

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

257

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 240

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido antisentido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 240

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

258

Claims (17)

1. Un compuesto antisentido de hasta 30 nucleobases en longitud que está formado por una de las SEQ ID NOS: 164-173 dirigido a una molécula de ácido nucleico codificadora de PTP1B, hibridizándose dicho compuesto antisentido específicamente e inhibiendo la expresión de PTP1B.

2. Un compuesto antisentido de acuerdo con la reivindicación 1 que es un oligonucleótido antisentido.

3. Un compuesto antisentido de acuerdo con la reivindicación 2, donde el oligonucleótido antisentido tiene una secuencia que comprende SEQ ID NO: 164, 165, 166, 168, 169, 170, 171, 172 o 173.

4. Un compuesto antisentido de acuerdo con la reivindicación 2, donde el oligonucleótido antisentido está compuesto al menos por un enlace de internucleósido modificado.

5. Un compuesto antisentido de acuerdo con la reivindicación 4, donde el enlace de internucleósido modificado es un enlace de fosforotioato.

6. Un compuesto antisentido de acuerdo con la reivindicación 2, donde el oligonucleótido antisentido comprende al menos una fracción modificada de azúcar.

7. Un compuesto antisentido de acuerdo con la reivindicación 6, donde la fracción modificada de azúcar es una fracción de azúcar 2'-O-metoxietil.

8. Un compuesto antisentido de acuerdo con la reivindicación 2, donde el oligonucleótido antisentido comprende al menos una nucleobase modificada.

9. Un compuesto antisentido de acuerdo con la reivindicación 8, donde la nucleobase modificada es una 5'-metilcitosina.

10. Un compuesto antisentido de acuerdo con la reivindicación 2, donde el oligonucleótido antisentido es un oligonucleótido quimérico.

11. Un compuesto antisentido de acuerdo con la reivindicación 1, que tiene la secuencia SEQ ID NO: 166.

12. Un compuesto antisentido de acuerdo con la reivindicación 11, donde los nucleótidos 1-5 y 16-20 de SEQ ID NO: 166 y nucleótidos 2'-metoxietil; nucleótidos 6-15 y 2'-deoxinucleótidos; todos los residuos de cistina son 5-metilcitidinas y todos los enlaces de internucleósido son fosforotioatos.

13. Una composición que consiste en un compuesto antisentido de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 12 y un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.

14. Una composición de acuerdo con la reivindicación 13, que además comprende un sistema de dispersión coloidal.

15. Un compuesto de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 12 para uso en medicina.

16. Uso de un compuesto de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 12 en la preparación de un medicamento para tratar diabetes, obesidad, cáncer, o un desorden hiperproliferativo.

17. Un método para inhibir la expresión de PTP1B in vitro en células o tejidos, que comprende la puesta en contacto de dichas células o tejidos con un compuesto antisentido de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 12 de modo que la expresión de PTP1B se inhiba.