ES2546360T3 - Modulación antisentido de la expresión de la apolipoproteína B - Google Patents

Modulación antisentido de la expresión de la apolipoproteína B Download PDF

Info

Publication number
ES2546360T3
ES2546360T3 ES09015376.8T ES09015376T ES2546360T3 ES 2546360 T3 ES2546360 T3 ES 2546360T3 ES 09015376 T ES09015376 T ES 09015376T ES 2546360 T3 ES2546360 T3 ES 2546360T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
apolipoprotein
animal
oligonucleotide
acid
treatment
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
ES09015376.8T
Other languages
English (en)
Inventor
Rosanne M. Crooke
Mark J. Graham
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Genzyme Corp
Original Assignee
Genzyme Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US09/920,033 external-priority patent/US7888324B2/en
Application filed by Genzyme Corp filed Critical Genzyme Corp
Application granted granted Critical
Publication of ES2546360T3 publication Critical patent/ES2546360T3/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/314—Phosphoramidates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/33—Chemical structure of the base
    • C12N2310/334—Modified C
    • C12N2310/3341—5-Methylcytosine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/341—Gapmers, i.e. of the type ===---===
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/346—Spatial arrangement of the modifications having a combination of backbone and sugar modifications
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/582—Recycling of unreacted starting or intermediate materials

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Child & Adolescent Psychology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Un oligonucleótido antisentido dirigido a una molécula de ácido nucleico que codifica una apolipoproteína B humana, en donde dicho oligonucleótido es 100 % complementario de dicha molécula de ácido nucleico y es un oligonucleótido quimérico de cadena simple que tiene 20 nucleótidos de longitud y está compuesto por una región de espacio central que consiste en diez 2'-desoxinucleótidos flanqueados en ambos lados por flancos de cinco nucleótidos compuestos por 2'-metoxietil (2'-MOE) nucleótidos, y en donde las uniones entre nucleósidos son fosforotioato (P>=S) a lo largo del oligonucleótido, y en donde todos los restos de citidina son 5-metilcitidinas, y en donde dicho oligonucleótido se hibrida específicamente con, e inhibe la expresión de una molécula de ácido nucleico que codifica la apolipoproteína B humana, para usar en: (a) el tratamiento de un animal que tiene una enfermedad o una afección asociadas a la apolipoproteína B que incluye metabolismo de lípidos anormal; (b) el tratamiento de un animal que tiene una enfermedad o una afección asociadas a la apolipoproteína B que incluye metabolismo de colesterol anormal; (c) el tratamiento de un animal que tiene una afección asociada a la apolipoproteína B, en donde la afección es ateroesclerosis; (d) el tratamiento de un animal que tiene una afección asociada a la apolipoproteína B, en donde la afección es hiperlipidemia; (e) el tratamiento de un animal que tiene una enfermedad asociada a la apolipoproteína B, en donde la enfermedad es diabetes; (f) el tratamiento de un animal que tiene una afección asociada a la apolipoproteína B, en donde la afección es obesidad; (g) el tratamiento de un animal que tiene una enfermedad asociada a la apolipoproteína B, en donde la enfermedad es una enfermedad cardiovascular; (h) terapia o profilaxis, en donde dicho uso comprende modular los niveles de glucosa en un animal; (i) terapia o profilaxis, en donde dicho uso comprende modular los niveles de colesterol en suero en un animal; (j) terapia o profilaxis, en donde dicho uso comprende modular los niveles de lipoproteína en un animal; o (k) terapia o profilaxis, en donde dicho uso comprende modular los niveles de triglicéridos en suero en un animal.

Description

15
25
35
45
55
65
E09015376
14-09-2015
DESCRIPCIÓN
Modulación antisentido de la expresión de la apolipoproteína B
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a los compuestos y métodos para la modulación de la expresión de la apolipoproteína B. En particular, esta invención se refiere al uso de componentes, especialmente oligonucleótidos, específicamente hibridizables con los ácidos nucléicos que codifican la apolipoproteína B. Tales compuestos han demostrado modular la expresión de la apolipoproteína B.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Las lipoproteínas son globulares, partículas de tipo micela que constan de un núcleo no polar de acilglicéridos o acilgliceroles y esteres de colesteril rodeados por un recubrimiento anfifílico de proteína, fosfolípido y colesterol. Las lipoproteínas han sido clasificadas en cinco amplias categorías sobre la base de sus propiedades funcionales y físicas: quilomicrones, que transportan los lípidos alimentarios del intestino a los tejidos; lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL por sus sigla en inglés); lipoproteínas de densidad intermedia (IDL); lipoproteínas de densidad baja (LDL); todas las cuales transportan los triacilgliceroles y el colesterol desde el hígado a los tejidos; y lipoproteíans de alta densidad (HDL), que transportan el colesterol endógeno desde los tejidos hacia el hígado.
Las partículas de lipoproteínas están sometidas a procesos metabólicos continuos y poseen propiedades y composiciones variables. Las densidades de lipoproteína se incrementan sin disminuir el diámetro de la partícula, porque la densidad de sus revestimientos externos es menor que la del núcleo interior. Los componentes de las lipoproteíans se conocen como apoliproteínas. Al menos nueve apolipoproteínas se distribuyen en cantidades significativas entre las diferentes lipoproteínas humanas.
La Apolipoproteína B (también conocida como ApoB, apolipoproteína B-100, ApoB 100, apolipoproteína B-48, ApoB-48 y Antígeno Ag (x)), es una glicoproteína grande que juega un papel indispensable en la formación y la secreción de lípidos y en el transporte y la captación mediada por receptor y el suministro de distintas clases de lipoproteínas. La importancia de la apolipoproteína B abarca una variedad de funciones, a partir de la absorción y procesamiento de los lípidos alimentarios hasta la regulación de los niveles de lipoproteínas circulantes (Davidson y Shelness, Annu. Rev. Nutr., 2000, 20, 169-193). Esta última propiedad subraya su relevancia en términos de susceptibilidad de arterosclerosis, que se correlaciona notablemente con la concentración en el ambiente de lipoproteínas que contienen apolipoproteína B (Davidson y Shelness, Annu. Rev. Nutr., 2000, 20, 169-193).
Existen dos formas de apolipoproteína B en los mamíferos. La ApoB-100 representa la proteína de longitud completa que contiene 4536 residuos de aminoácido sintetizado exclusivamente en el hígado humano (Davidson y Shelness, Annu. Rev. Nutr., 2000, 20, 169-193). Una forma truncada conocida como ApoB-48 es colineal con los residuos 2152 aminoterminal y se sintetiza en el intestino delgado de todos los mamíferos (Davidson y Shelness, Annu. Rev. Nutr., 2000, 20, 169-193).
La ApoB-100 es el principal componente proteico de LDL y contiene el campo requerido para interacción de esta especie de lipoproteínas con el receptor LDL. De manera adicional, la ApoB-100 contiene un residuo de cisteína deteriorada que media una interacción con la apolipoproteína (a) y genera otra lipoproteína aterogénica distinta denominada lp (a) (Davidson y Shelness, Annu. Rev. Nutr., 2000, 20, 169-193).
En los humanos, la ApoB-48 circula en asociación con los quilomicrones y el quilomicrón restos y esas partículas son cleared by un receptor distinto conocido como proteína receptor LDL relacionado (Davidson y Shelness, Annu. Rev. Nutr., 2000, 20, 169-193). La ApoB-48 puede considerarse como una adaptacion crucial mediante la cual el lípido de la dieta se suministra desde el intestino delgado hacia el hígado, mientras que el ApoB100 participa en el transporte y suministro del colesterol plasmático endógeno (Davidson y Shelness, Annu. Rev. Nutr., 2000, 20, 169-193).
La base mediante la cual el gen estructural común para la apolipoproteína B produce dos isoformas de proteínas distintos es un proceso conocido como edición del ARN. Un sitio específico citosina-uracilo edición reacción produce una detención del UAA del codón y terminación translational de la apolipoproteína B para producir ApoB-48 (Davidson y Shelness, Annu. Rev. Nutr., 2000, 20, 169-193).
La apolipoproteína B se clonó en 1985 (Law et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1985, 82, 8340-8344) y localizado en el cromosoma 2p23-2p24 en 1986 (Deeb et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1986, 83, 419-422).
En la patente estadounidense 5.786.206, se describieron y publicaron métodos y composiciones para determinar el nivel de lipoproteínas de baja densidad (LDL) en el plasma que incluyen secuencuencias aisladas de ADN que codifican las regiones epítopo de la apolipoproteína B-100 (Smit et al., 1998).
Se encontró que los ratones transgénicos que expresan la apolipoproteína B humana y alimentados con
15
25
35
45
55
65
E09015376
14-09-2015
una dieta alta en grasas desarrollaron altos niveles de colesterol plasmático y desplegaron un aumento de en 11 veces las lesiones ateroscleróticas con respecto a los compañeros de camada no transgénicos (Kim y Young, J. Lipid Res., 1998, 39, 703-723; Nishina et al., J. Lipid Res., 1990, 31, 859-869).
De manera adicional, se utilizaron ratones transgénicos que expresan formas truncadas de apolipoproteína B humana, para identificar las características estructurales del terminal de carboxilo del ApoB-100 que se requieren para la interacciones con la apolipoproteína (a) para generar la partícula de lipoproteína Lp(a) y para investigar las características estructurales del a región de unión al repector del LDL de la ApoB-100 (Kim y Young, J. Lipid Res., 1998, 39, 703-723; McCormick et al., J. Biol. Chem., 1997, 272, 23616-23622).
La apolipoproteína B de los ratones eliminados (bearing disruptions tanto del ApoB-100 como del ApoB48) se han generado que estén protegidos de desarrollar hipercolesterolemia cuando reciben una alimentación alta en grasas (Faresse et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1995, 92, 1774-1778; Kim y Young, J. Lipid Res., 1998, 39, 703723). Se ha investigado la incidencia de la aterosclerosis en ratones que expresan exclusivamente ApoB-100 o ApoB-48 y se detectó que la susceptibilidad a la aterosclerosis dependería de los niveles de colesterol total. Mientras que los ratones con ApoB-100 o ApoB-48 sintetizada no afectaron el grado de la aterosclerosis, lo que indica que probablemente no hay mayor diferencia en la aterogenecidad intrínseca del ApoB-100 en comparación con el ApoB48 (Kim y Young, J. Lipid Res., 1998, 39, 703-723; Veniant et al., J. Clín. Invest., 1997, 100, 180-188).
Los altos niveles plasmáticos de la lipoproteín Lp (a) se asocian con el riesgo creciente de aterosclerosis y sus manifestaciones, que pueden incluir hipercolesterolemia (Seed et al. , N. Engl. J. Med., 1990, 322, 1494-1499), infarto al miocardio (Sandkamp et al., Clin. Chem., 1990, 36, 20-23) y trombosis (Nowak-Gottl et al., Pediatrics, 1997, 99, E11).
La concentración de plasma de la Lp(a) está fuertement influenciada por factores hereditarios y es refractario a la mayoría de las drogas y la manipulación dietética (Katan y Beynen, Am. J. Epidemiol., 1987, 125, 387-399; Vessby et al., Atherosclerosis, 1982, 44, 61-71). La terapia farmacológica de altos niveles de Lp(a) solo ha sido modestamente exitosa y la aféresis sigue siendo el la modalidad terapéutica más efectiva (Hajjar and Nachmanm, Annu. Rev. Med., 1996, 47, 423-442).
En la patente estadounidense 6.156.315 y la correspondiente publicación PCT WO99/18986 se describen y reivindican un método para inhibir la nión del LDL a la matriz de los vasos sanguíneos en un sujeto, que comprendía la administración de un anticuerpo o frangemento del mismo, que es capaz de unir a la región aminoterminal de la apolipoproteína B, inhibiendo de este modo la unión de la lipoproteína de baja densidad a la matriz de vasos sanguíneos. (Goldberg and Pillarisetti, 2000; Goldberg and Pillarisetti, 1999).
En la patente estadounidense 6.096.516 se describen los vectores que contienen ADNc que condifica anticuerpos recombinantes murinos que se unen a la ApoB-1000 humana con el objetivo de diagnosticar y tratar las enfermedades cardiovasculares. (Kwak et al., 2000).
Lo que se describe y reivindica en la publicación PCT EP 911344 es un anticuerpo monoclonal que une de manera específica a la ApoB-48 y no se une de manera específica a la ApoB-100, que es útil para el diagnóstico y terapia de la hiperlipidemia y la esclerosis arterial (Uchida y Kurano, 1998).
Lo que se describe y reivindica en la publicación PCT WO 01/30354 son métodos de tratamiento a un paciente con trastorno cardiovascular, que comprende la administración de una dosis terapéuticamente efectiva de un compuesto a dicho paciente, en quien dicho compuesto actúa durante un período de tiempo para disminuir las concentraciones plasmáticas de la apolipoproteína B o las lipoproteínas que contienen apolipoproteína B mediante la estimulación de una vía para la degradación de la apolipoproteína B (Fisher and Williams, 2001).
En la patente estadounidense 5.222.006 se describe una secuencia de ADN que actúa en cis clonado que media la eliminación de la apolipoproteína B aterogénica (Ross et al., 1993).
En la publicación PCT WO 01/12789 se describe y reivindica una ribozima que disocia el ARNm de la ApoB-100 específicamente en la posición 6679 (Chan et al., 2001).
Hasta la fecha, las estrategias dirigidas a la inhibición de la función de la apolipoproteína se ha limitado a la aféresis de la Lp(a), los anticuerpos, fragmentos de anticuerpos y ribozimas. Sin embargo, a excepción de la aféresis de Lp(a), estas estrategias investigativas no se han probado como protocolos terapéuticos. Consecuentemente, sigue existiendo una necesidad ampliamente sentida de agentes adicionales capaces de inhibir efectivamente la función de la apolipoproteína B.
Está surgiendo la tecnología antisentido como un medio efectivo para reducir la expresión de productos génicos específicos y, por lo tanto, puede llegar a ser únicamente útil en un número de aplicaciones terapéuticas, de diagnóstico y de investigación que implican la modulación de la expresión de la apolipoproteína B.
15
25
35
45
55
65
E09015376
14-09-2015
La presente invención se refiere a composiciones y métodos para la modulación de la expresión de la apolipoproteína B, incluida la inhibición de la isoforma alternativa de la apolipoproteína B, la ApoB-48.
RESUMEN DE LA INVENCIÓN
La presente invención se orienta a un oligonucleótido antisentido dirigido a una molécula de ácido nucleico que codifica la apolipoproteína B humana, en la que dicho oligonuclétido es 100% complementario para dicha molécula de ácido nucléico y es un oligonucléotido de una sola cadena quimérica de 20 nucleótidos de longitud compuesto por una región central hueca que consiste en diez 2’-desoxinucleótidos, flanqueada en ambos lados por bandas de cinco nucleótidos compuestas de nucléotidos de 2’-metoxietilo (2’-MOE) y en los que los enlaces entre nucleósidos son fosforotioato (P=S) en todo el oligonucleótido, y en los que todos los residuos de citina son 5-metilcitidinas y en los que dicho oligonucleótido hibridiza específicamente con e inhibe la expresión de una molécula de ácido nucleótido que codifica la apolipoproteína B huma, para utilizar en:
(a)
el tratamiento de un animal que tiene una enfermedad o condición asociada con apolipoproteína B que implica el metabolismo lipídico anormal;
(b)
el tratamiento de un animal que tiene una enfermedad o condición asociada con la apolipoproteína B que implica el metabolismo anormal del colesterol;
(c)
el tratamiento de un animal que presenta una condición asociada con la apolipoproteína B en la que la codición es la aterosclerosis;
(d)
el tratamiento de un animal que presenta una condición asociada con la apolipoproteína B, en la que la condición es la hiperlipidemia;
(e)
el tratamiento de un animal que tiene una enfermedad asociada con la apolipoproteína B, en la que la enfermedad es la diabetes;
(f)
el tratamiento de un animal que tiene una condición asociada con la apolipoproteína B, en la que la condción es la obesidad;
(g)
el tratamiento de un animal que tiene una enfermedad asociada con la apolipoproteína B, en la que la enfermedad es una dolencia cardiovascular;
(h)
la terapia o profilaxis, en la que dicho uso implica la modulación de los niveles de glucosa en un animal;
(i)
la terapia o profilaxis, en la que dicho uso implica la modulación de los niveles de colesterol sérico en un animal;
(j)
la terapia o profilaxis, en la que dicho uso implica la modulación de los niveles de lipoproteína en un animal; o
(k)
la terapia o profilaxis, en la que dicho uso implica la modulación de los niveles de triglicérido sérico en un animal;
RESUMEN DE LA DIVULGACIÓN
La presente divulgación se refiere a compuestos, particularmente, oligonucleótidos antisentido, que están dirigidos a un ácido nucleico que condifica la apolipoproteína B y que modulan la expresión de la apolipoproteína B. Se dan a conocer también las composiciones farmacéuticas y otras que incluyen los compuestos descritos en este documento. Además, se describen métodos de modulación de la expresión de la apolipoproteína Be en células o tejidos que implican poner en contacto dichas células o tejidos con uno o más de los compuestos o composociones antisentido descritos en este documento. Además, se describen métodos de tratamiento en un animal, particularmente un humano, sospechoso de tener o ser propenso a una enfermedad o condición asociada con la expresión de la apolipoproteína B mediante la administración de una dosis terapéutica o profilácticamente efectiviva de uno o más compuestos o composiciones antisentido descritos en este documento.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La presente invención utiliza compuestos oligoméricos, particularmente oligonucleótidos antisentido, en la modulación de la función de las moléculas de ácido nucleico que codifica la apolipoproteína B, en última instancia, la modulación de la cantidad de apolipoproteína B que se produce. Esto se consigue proporcionando compuestos antisentido que hibridizan específicamente con uno o más ácidos nucléicos que codifican la apolipoproteína B. Tal como se utiliza en este documentno los términos “ácido nucleico objetivo” y apolipoproteína B que codifica el ácido nucleico” abarca el ADN que codifica la apolipoproteína B, el ARN (incluido el pre-ARNm y el ARNm) transcrito de tal ADN y, también, el ADNc que se deriva de tal ARN. La hibridización específica de un compuesto oligomérico con su ácido nucleico objetivo interfiere con la función normal del ácido nucleico. La modulación es la función de un ácido nucleico objetivo mediante compuestos que hibridan específicamente a él es lo que se conoce generalmente como “antisentido”. Las funciones del ADN a interferirse incluyen todas las funciones vitales, tales como, por ejemplo, la translocación del ARN al sitio de la traducción proteica, traducción de la proteína del ARN, el empalme del ARNpara producir una o más especies de ARNm, y la actividad catalítica que puede estar involucrado en o ser facilitado por el ARN. El efecto global de tal interferencia con la función del ácido nucleico objetivo es la modulación de la expresión
15
25
35
45
55
65
E09015376
14-09-2015
de la apolipoproteína B. En el contexto de la presente invención, “modulación” significa un aumento (estimulación) o una disminución (inhibición) en la expresión de un gen. En el contexto de la presente invención, la inhibición es la forma preferida de modulación de la expresión génica y el ARNm es un objetivo preferido.
Se prefeiren los ácidos nucleicos específicos objetivo para el antisentido. La focalización de un compuesto antisentido a un ácido nucleico particular, en el contexto de esta invención, es un proceso de múltiples pasos. El proceso normalmente comienza con la identificación de una secuencia de ácido nucleico, cuya función consiste en ser modulada. Esto puede ser, por ejemplo, un gen celular (o un ARNm transcrito del gen) cuya expresión se asocia con un trastorno o estado de enfermedad particular, o una molécula de ácido nucleico de un agente infeccioso. En la presente invención, el objetivo es una molécula de ácido nucleico que condifica la alipoproteína B. El proceso de focalización incluye también la determinación de un sitio o sitios dentro de este gen para que la interacción antisentido se produzca tal como el efecto deseado, por ej., lo que dará como resultado la detección o modulación de la expresión de la proteína. Dentro del contexto de la presente invención, un sitio intragénico es la región que abarca el codón de inicio o término de la traducción del marco de lectura abierto (ORF) del gen. Dado que, como se conoce en la técnica, el codón de inicio de la traducción es típicamente 5’-AUG (en las moléculas del ARNm transcrito; 5’-ATG en la correspondiente molécula de ADN), el codón de inicio de la traducción se conoce también como el “codón AUG”, el “codón de inicio” o el “codón de inicio AUG”. Una minoría de los genes tiene un codón de inicio de la traduccion que tiene la secuencia de ARN 5’-GUG, 5’-UUG o 5’-CUG, y 5’-AUA, 5’-ACG y 5’-CUG han demostrado funcionar in vivo. Así, los términos “codón de inicio de la traducción” y “codón de inicio” pueden abarcar varias secuencias de codones, aunque el aminoácido inicador en cada caso es típicamente metionina (en las eucariotas) o formilmetionina (en las procariotas). Se conoce también en la técnica que los genes eucarióticos y procarióticos pueden tener dos o más codones de inicio alternativos, cada uno de los cuales puede ser utilizado preferentemente para el inicio de la traducción en un tipo de célula particular o tejido, o bajo un determinado conjunto de condiciones. En el contexto de la invención, el “codón de inicio” y el “codón de inicio de la traducción” se refiere al codón o codones que se usan in vivo para iniciar la tradución de una molécula de ARNm transcrita de un gen que codifica la apolipoproteína B, independientemente de la(s) secuencia(s) de tales codones.
Se conoce también en la técnica que un codón de término de la traducción (o “codón de parada”) de un gen puede tener una de tres secuencias, por ej., 5’-UAA, 5’-UAG y 5’UGA (las correspondientes secuencias de ADN son 5’-TAA, 5’-TAG y 5’-TGA, respectivamente). Los términos “región del codón de inicio” y “región del codón de inicio de la traducción” se refiere a una porción de tal ARNm o gen que abarca de aproximadamente 25 a aproximadamente 50 nucleótidos contiguos en cualquier dirección (por ej., 5’ o 3’) de un codón de término de traducción.
El marco de lectura abierto (ORF) o “región de codificación” que se conoce en la técnica para referirse a la región entre el codón de inicio de la traducción y el codón de término de la traducción. Otras regiones objetivo incluyen la región 5’ no traducida (5’UTR), conocida en la técnica para referirse a la porción de un ARNm en la dirección 3’ del codón de término de la traducción e, incluyendo tanto los nucleótidos entre el codón de término de la traducción y el extremo 3’ de un ARN o los nucleótidos correspondientes sobre el gen. El tope 5’ de un ARN contiene un residuo de guanosina metilado N7 unido a la mayoría de los residuos 5’ del ARN a través de un vínculo de trifosfato 5’-5’. La región del tope 5’ de un ARN se considera que incluye la propia estructura del tope 5’ así como los primeros 50 nucleótidos adyacentes al tope. La región del tope 5’ puede también ser una región objetivo preferida.
Aunque algunos transcritos de ARNm eucarióticos se traducen directamente, muchos contienen una o más regiones, conocidas como “intrones”, que se escinden a partir de una transcripción antes de que sea traducido. Las regiones restantes (y, por lo tanto, traducidas) se las conoce como “exones” y se empalman juntos para formar una secuencia de ARNm continua. Los sitios de empalme del ARNm, por ej., uniones intrón-exón, también se puede preferir regiones objetivo y son particularmente muy útiles, donde el empalme anormal está implicado en la enfermedad. Uniones de fusión anormales debido a que los reordenamientos y supresiones son también objetivos preferidos.
Se ha encontrado también que los intrones pueden también ser efectivos y, por consiguiente, preferidos las regiones objetivo para compuestos antisentido dirigidos, por ejemplo, al ADN o al pre-ARNm.
Una vez que se ha identificado uno o más sitios objetivo, se seleccionan los oligonucleótidos que son suficientemente complementarios al objetivo, por ej., hibridizan suficientemente bien y con suficiente especificidad, para provocar el efecto deseado.
En el contexto de esta invención, “hibridación” significa enlace de hidrógeno, que pueden ser Watson-Crick, Hoogteen o enlace de hidrógeno Hoogsteen revertido, entre bases de nucleósidos o nucleótidos complementarias. Por ejemplo, la adenina y la timina son nucleobases complementarias que se emparejan a través de la formación de enlaces de hidrógeno. “Complementario”, como se usa en este documento, se refiere a la capacidad para el emparejamiento preciso entre dos nucleótidos. Por ejemplo, si un nucleótido en una posición determinada de un oligonucleótido es capaz de formar enlaces de hidrógeno con un nucleótido en la misma posición de una molécula de ADN o ARN, entonces, el oligonucleótido y el ADN o el ARN se considera que son
15
25
35
45
55
65
E09015376
14-09-2015
complementarios entre sí en esa posición. El oligonucleótido y el ADN o el ARN son complementarios entre sí cuando un número suficiente de posiciones correspondientes en cada molécula es ocupada por nucleótidos que puede enlazar un hidrógeno con otro. De este modo, “específicamente hibridable” y “complementario” son términos que se usan para indicar un grado suficiente de complimentaridad o de emparejamiento preciso de tal manera que se produce la unión estable y específica entre el oligonucleótido y el ADN o ARN objetivo. Se entiende en la técnica que la secuencia de un compuesto antisentido no necesita ser 100% complementario a la de su ácido nucleico objetivo para ser específicamente hibridable. Un compuesto antisentido es específicamente hibridable cuando la unión del compuesto con la molécula de ADN o ARN objetivo interfiere con la función normal del ADN o ARN objetivo para causar una pérdida de utilidad, y hay un grado suficiente de complementaridad para evitar la unión no específica del compuesto antisentido a una secuencia no objetivo bajo condicones en el que se desea la uniónn específica, por ej., bajo condicones psicológicas en el caso de ensayos in vivo o tratamiento terapéutico, y en el caso de ensayos in vitro, bajo condciones en las que se realizan los ensayos.
Los compuestos antisentido y otros dela descripción que hibridan al objetivo e inhiben la expresión del objetivo se identifican mediante la experimentación y las secuencias de esos compuestos se identifican a continuación como realizaciones preferidas de la descripción. Los sitios objetivo a los que estas secuencias preferentes son complementarias se denomina en lo que sigue como “sitios activos” y, por lo tanto, se refieren a los sitios de localización. Por consiguiente, otra realización de la descripción abarca compuestos que hibridan a esos sitios activos.
Los compuestos antisentido se utilizan comúnmente como reactivos de investigación y diagnóstico. Por ejemplo los oligonucleótidos antisentido, que son capaces de inhibir la expresión génica con exquisita especificidad, se usan a menudo por los especialistas para elucidar la función de genes particulares. Los compuestos antisentido se usan también, por ejemplo, para distinguir entre las funciones de varios miembros de una vía biológica. Por lo tanto, la modulación antisentido se ha aprovechado para uso en investigación.
Por su uso en kits y diagnósticos, los compuestos antisentido de la presente divulgación, ya sea solos o en combinación con otros compuestos antisentido o terapias, pueden utilizarse como herramientas en análisis diferenciales o combinatorios para dilucidar los patrones de expresión de una porción o de todo el complemento de genes expresados dentro de las células y los tejidos.
Los patrones de expresión dentro de las células y los tejidos tratados con uno o más compuestos antisentido se comparan con el control de las células y los tejidos no tratados con compuestos antisentido y los patrones producidos se analizan para los niveles diferenciales de expresión génica en lo que se refiere, por ejemplo, a la asociación a la enfermedad, vía de señalización, localización celular, nivel de expresión, tamaño, estructura o función de los genes examinados. Esos análisis pueden realizarse sobre células estimuladas o no estimuladas y en presencia o ausencia de otros compuestos que afecten los patrones de expresión.
Los ejemplos de métodos de análisis de expresión génica conocidos en la técnica incluyen matrices o micromatrices de ADN (Brazma y Vilo, FEBS Lett., 2000, 480, 17-24; Celism et al., FEBS Lett., 2000, 480, 2-16) SAGE (análisis en serie de la expresion génica) (Madden et al., Drug Discov. Today, 2000, 5, 415-425), READS (amplificación de enzimas de restricción de ADNc digeridas) (Prachar y Weissman, Methods Enzymol., 1999, 303, 258-72), TOGA (análisis de expresión génica total) (Sutcliffe, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2000, 97, 1976-81), matrices de proteína y proteómica (Celis, et al., FEBS Lett., 2000, 480, 2-16; Jungblut et al., Electrophoresis, 1999, 20, 2100-10), marcadores de secuencias expresadas (EST) secuenciación (Celis et al., J. Biotechnol., 2000, 80, 14357), sustractivo RNA huellas (SuRF) (Fuchs, et al., Anal. Biochem., 2000, 286, 91-98 ; Larson, et al., Cytometry, 2000, 41, 203-208), sustractivo clonación, differencial display (DD) (Juresic and Belmont, Curr. Opin. Microbiol., 2000, 3, 316-21), hibridación genómica comparativa (Carulli, et al., Cell Biochem. Suppl., 1998, 31, 286-96), técnicas FISH (hibridación fluorescente in situ) (Going and Gusterson, Eur. J. Cancer, 1999, 35, 1895-904) y métodos de espectometría en masa (retomado en (To, Comb. Chem. High Throughput Screen, 2000, 3, 235-41).
La especificidad y la sensibilidad del antisentido es también aprovechado por aquellos expertos en la materia para usos terapeuticos. Los oligonucleótidos antisentido se han utilizado como moieties terapéuticos en el tratamiento de estados de enfermedad en animales y humanos. Las drogas de oligonucléotidos antisentido incluidas las ribozimas, se han administrado cuidadosa y eficazmente a humanos y numerosos ensayos clínicos están actualmente en curso. De esta forma se ha establecido que los oligonucleótidos pueden ser una modalidad terapéutica útil que puede configurarse para ser útil en regímenes de tratamiento de células, tejidos y animales, especialmente humanos.
En el contexto de esta invención, el término “oligonucleótido” se refiere a un oligómero o polímero de ácido ribonucleico (ARN) o ácido desoxiribonuleico (ADN) o miméticos de los mismos. Este término incluye oligonucleótidos compuestos de nucleobases de origen natural, azúcares y enlaces (principales) internucleosídicos covalentes así como oligonucleótidos que tienen porciones de origen no natural que funcionan de manera similar. Tales oligonucleótidos modificados o sustituidos, a menudo, se prefieren por sobre las formas originales, debido a las propiedades adecuadas tales como, por ejemplo, absorción celular mejorada, mayor afinidad por el ácido
15
25
35
45
55
65
E09015376
14-09-2015
nucleico objetivo y aumento de la estabilidad en presencia de nucleasas.
Mientras que los oligonucleótidos son una forma preferida de compuesto antisentido, la presente descripción comprende otros compuestos antisentido oligoméricos, incluido pero no limitado a miméticos de oligonucleótido tales como los que se describen a continuación. Los compuestos antisentido en concordancia con esta divulgación preferiblemente comprenden de aproximadamente 8 a aproximadamente 50 nucleósidos vinculados). De manera particular, los compuestos antisentido preferidos son los oligonucleótidos antisentido, y aún más preferiblemente aquellos que comprenden de aproximadamente 12 a aproximadamente 30 nucleobases. Los compuestos antisentido incluyen las ribozimas, oligonucleótidos de secuencia de guía externa (SGE) (oligoenzimas) y otro ARN catalítico corto o oligonucleótidos catalíticos que hibridan al ácido nucleico objetivo y modulan su expresión.
Como se conoce en la materia, un nucleósido es una combinación de azúcar base. La porción básica del nucleósido normalmente es una base heterocíclica. Las dos clases más comunes de tales bases heterocíclicas son las purinas y las pirimidinas. Los nucleótidos son nucleósidos que además incluyen un grupo fosfato covalentemente ligado a la porción de azúcar del nucleósido. Para esos nucleósidos que incluyen un azúcar de pentofuranosil, el grupo de fosfato puede ligarse ya sea al radical de hidroxilo 2’, 3’ o 5’ del azúcar. En la formación de oligonucleótidos los grupos de fosfato unen covalentemente los nucleósidos adyacentes a otro para formar un compuesto polimérico lineal. A su vez, los respectivos extremos de esta estructura polimérica lineal pueden además unirse para formar una estructura circular, sin embargo, generalmente, se prefieren las estructuras lineales. Dentro de la estructura del oligonucleótido, los grupos de fosfato se conoce comúnmente como que forman la cadena principal del internucleósido del oligonucleótido. El vínculo normal o cadena principal de ARN y de ADN es 3’ a 5’ enlaces de phosphodiester (phosphodiester).
Los ejemplos específicos de compuestos antisentido preferidos útiles en concordancia con la revelación incluye los oligonucleótidos que contienen espinas modificadas o enlaces internucleósidos no naturales. Como se define en esta especificación, los oligonucleótidos que tienen espinas modificadas incluyen a aquellos que retienen un átomo de fósforo en el espinas y aquellos que no tiene un átomo de fósforo en las espinas. Para los propósitos de esta especificación y como a veces se referncia en la técnica, los oligonucleótidos modificados que no tienen un átomo de fósforo en su espina internucleósido pueden considerarse como oligonucleósidos.
Los backbones de oligonucleótido modificados preferido incluyen, por ejemplo, fosforoditioatos, fosforotriésteres, aminoalkil-fosfotriésteres, metil y otros fosfonatos alquilos, incluidos fosfonatos alquilenos-3’, fosfonatos alquilenos-5’ y fosfonatos chiral, fosfinatos, fosforamidatos, incluidos los fosforamidatos amino-3’ y los aminoalquilofosforamidatos, tionofosforamidatos, tionoalquilofosfonatos, tionoalquilofosfotriésteres, selenofosfatos y boranofosfatos que tienen enlaces 3’-5’, 2’-5’ asociado análogos de estos, y aquellos que tienen polaridad invertida en la que uno o más enlaces internucleótidos es un enlace 3’ a 3’, 5’ a 5’ o 2’ a 2’. Los oligonucleótidos preferidos que tienen polaridad invertida comprende un enlace 3’ a 3’ individual en el enlace internucleótido most-3’, por ej., residuo de nucleósido invertido individual que puede ser abasic (se ha perdido el nucleobase o tiene un grupo hidroxilo en lugar de eso). Se incluyen también varias sales, sales mezcladas y formas de ácido libres.
Las patentes estadounidenses representativas que enseñan la preparación de los siguientes enlaces que contienen fósforo incluyen, pero no se limitan a, las patentes 3.687.808; 4.469.863; 4.476.301; 5.023.243; 5.177.196; 5.188.897; 5.264.423; 5.276.019; 5.278.302; 5.286.717; 5.321.131; 5.399.676; 5.405.939; 5.453.496; 5.455.233; 5.466.677; 5.476.925; 5.519.126; 5.536.821; 5.541.306; 5.550.111; 5.563.253; 5.571.799; 5.587.361; 5.194.599; 5.565.555; 5.527.899; 5.721.218; 5.672.697 y 5.625.050 algunas de las cuales se corresponden comúnmente con esta solicitud.
Las estructuras principales del oligonucleótido modificado preferidos que no incluyen en ellas un átomo de fósforo tienen cadenas principales que se forman mediante enlaces internucleósidos de alquilo y cocloalquilo de cadena corta, heteroátomo mixto y enlaces internucleósidos de alquilo o cicloalquilo, o uno o más enlaces internucleósidos heteroatómicos o heterocíclicos de cadena corta. Estos incluyen aquellos que tienen enlaces morfolino (formados en parte por la porción de azúcar de un nucleósido); estructuras principales de siloxano; cadenas principales de sulfuro, sulfóxido y sulfona; cadenas principales de formacetilo y tioformacetilo; cadenas principales de formacetilo y tioformacetilo de metileno; cadenas principales de riboacetilo; alqueno que contiene cadenas principales; cadenas principales de sulfamato; cadenas principales de metileneimino y metileno de hidrazina cadenas principales de sulfonato y sulfonamida; cadenas principales de amida y otros que tienen partes de componentes mezclados N, O, S Y CH2.
Las patentes estadounidenses representativas que enseñan la preparación de los siguientes enlaces incluyen, pero no se limitan a, las patentes: 5.034.506; 5.166.315; 5.185.444; 5.214.134; 5.216.141; 5.235.033; 5.264.562; 5.264.564; 5.405.938; 5.434.257; 5.466.677; 5.470.967; 5.489.677; 5.541.307; 5.561.225; 5.596.086; 5.602.240; 5.610.289; 5.602.240; 5.608.046; 5.610.289; 5.618.704; 5.623.070; 5.663.312; 5.633.360; 5.677.437; 5.792.608; 5.646.269 y 5.677.439, algunos de los cuales comúnmente se corresponden con esta solicitud.
15
25
35
45
55
65
E09015376
14-09-2015
En otros miméticos de oligonucléotido preferido, tanto el enlace del azúcar como el enlace del internucleósido, por ejemplo, la estructura principal, de las unidades de nucleótido se reemplazan con grupos nuevos. Las unidades básicas se mantienen mediante hibridación con un compuesto objetivo de ácido nucleico adecuado. Tal comopuesto oligomérico, un mimético de oligonucleótido que ha mostrado tener excelentes propiedades de hibridación, se conoce como un ácido nucleico peptídico (PNA). En los compuestos PNA, la estructura principal del azúcar de un oligonucleótido es reemplazado por un amida que contiene la estructura principal, en particular una estructura principal aminoetilglicina. Se retienen las nucleobases y se unen directa o indirectamente a los átomos de nitrógeno aza de la porción de amida del la estructura principal. Las patentes estadounidenses representativas que enseñan la preparación de los compuestos PNA incluyen, pero no se limitan a, las patentes: 5.539.082; 5.714.331 y 5.719.262. Además, otras que enseñan los compuestos PNA se pueden encontrar en Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500.
Las representaciones más preferidas son los oligonucleótidos con estructuras principales de fosforotioato y oligonucleótidos con las cadenas principales de heteroátomo y, en particular, -CH2-NH-O-CH2-, -CH2-N(CH3)-OCH2-[conocido como un metileno (metilimino) o estructura central MMI], -CH2-O-N(CH3)-CHA2-, -CH2-N(CH3)N(CH3)-CH2-y –O-N(CH3)-CH2-CH2-[en el que el estructura central de fosfodiéster se representa como O-P-O-CH2-] de la patente estadounidense Nº 5.489.677 antes mencionada y de las estructura central de la patente estadounidense Nº 5.602.240 antes mencionada. Se prefieren también los oligonucleótidos que comprenden uno de los siguientes en la posición 2’: OH, F, O-M S-O N-alquilo; O-, S-, o N-alquenil; o-, S-o N-alquinil; o O-alquilo-Oalquilo; en los que el alquilo, el alquenil y el alquinil puede sustituirse o no sustituirse por alquilo C1 a C10 o alquenil y alquenil C2 a C10. Se prefiere particularmente O[(CH2)nO]mCH3, O(CH2)nOCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2 y O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2, donde n y m de 1 a aproximadamente 10. Otros oligonucleótidos preferidos comprenden uno de los siguientes en la posición 2’: C1 a C10 alquilo inferior, se sustituye por alquilo inferior, alquenilo, alquinilo, alcarilo, aralquilo, 0-alcarilo o O-aralquilo, SH, SCH3, OCN, C1, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2,N3,NH2, hetorocicloalquilo, heterocicloalcarilo, aminoalquilo amino, polialquilamino, sililo sustituido, un grupo de escisión del ARN, un grupo informador, un intercalador, un grupo para mejorar las propiedades farmacokinéticas de un oligonucleótido, o un grupo para mejorar las propiedades farmacodinámicas de un oligonucleótido, y otros sustituyentes que tengan propiedades similares. Una modificación preferida incluye metoxietoxi-2’ (2’-O-CH2CH2OCH3, conocido también como 2’-O-(2-metoxietilo) o 2’-MOE) (Martin et al., Helv. Chim. Acta., 1995, 78, 486-504) por ej., un grupo de alcoxialcoxi. Una modificación más preferida incluye 2’dimetilaminooxietoxi, por ej., un grupo O(CH2)2ON(CH3)2, conocido también como 2’DMAOE, como se describe en los ejemplos en este documento a continuación, y 2’dimetilamino-etoxietoxi (conocido también en la técnica como 2’O-dimetilaminoetoxietilo o 2’-DMAEOE), por ej., 2’-O-CH2-O-CH2-N(CH2)2, que se decribe también lo los ejemplos de este documento a continuación.
Una modificación más preferida incluye los Ácidos Nucleicos Bloqueados (LNAs, en inglés) en los que el grupo 2’-hidroxilo está unido al átomo de carbono 3’ o 4’ del anillo de azúcar, formando así una porción de azúcar bicíclica. El vínculo es preferentemente un grupo metelino (-CH2-) que une al átomo de oxígeno 2’ y el átomo de carbono 4’ wherein n es 1 o 2. Los ANLs y la preparación de los mismos se describen en WO 98/39352 y en WO 99/14266.
Otras modificaciones preferidas incluyen 2’-metoxi (2’-O-CH3), 2’-aminopropoxi (2 1-OCH2CH2CH2NH2), 2’-alilo (2’ –CH2-CH=CH2), 2’-O-alilo (2’-O-CH2-CH=CH2) y 2-fluoro (2’-F). La modificación-2’ puede ser en la posición arabino (arriba) o posición ribo (abajo). Una modificación arabino-2’ preferida es F-2’. Se pueden hacer similares modificaciones a otras posiciones en el oligonucleótido, particularmente la posición 3’ del azúcar en el nucleótido terminal 3’ o en los oligonucleótidos unidos 2’-5’ y la posición 5’ del nucleótido terminal 5’. Los oligonucleótidos pueden también tener miméticos de azúcar tales como fracciones de ciclobutilo en lugar de azúcar pentofuranosilo. Las patentes estadounidenses representativas que enseñan la preparación de tales estructuras de azúcar modificada incluyen, pero no se limitan a, las patentes: 4.981.957; 5.118.800; 5.319.080; 5.359.044; 5.393.878; 5.446.137; 5.466.786; 5.514.785; 5.519.134; 5.567.811; 5.576.427; 5.591.722; 5.597.909; 5.610.300; 5.627.053; 5.639.873; 5.646.265; 5.658.873; 5.670.633; 5.792.747 y 5.700.920, algunas de las cuales comúnmente corresponden con la presente solicitud.
Los oligonucleótidos pueden también incluir modificaciones o sustituciones de la nucleobase (a menudo denominada en la técnica simplemente como “base”). Como se utiliza en este documento, las nucleobases “no modificadas” o “naturales” incluyen las bases de purina: adenina (A) y guanina (G), y base de pirimidina: timina (T), citosina (C) y uracilo (U). Las nucleobases modificadas incluyen otras nucleobases sintéticas y naturales tales como 5-metilcitosina (5-me-C), citosina 5-hidroximetilo, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metilo y otro alquilo derivado de la adenina y la guanina, 2-propylo y otros alquilos derivados de la adenina y la guanina, 2-tiouracilo, 2tiotimina y 2-tiocitosina, 5-halouracilo y citosina, 5-propinilo (-C≡C-CH3) uracilo y citosina y otro alquinilo derivados de las bases de pirimidina, 6-azo uracilo, citosina y timina, 5-uracilo (pseudouracilo), 4-tiouracilo, 8-halo, 8-amino, 8tiol, 8-tioalquilo, 8-hidroxilo y otras adeninas y guaninas 8-sustituidasm 5-halo, particularmente 5-bromo, 5trifluorometil y otros uracilos y citosinas 5-sustituidas, 7-metilguanina y 7-metiladenina, 2-F-adenina, 2-aminoadenina, 8-azaguanina y 8-azaadenina, 7-deazaguanina y 7-deazaadenina y 3-deazaguanina y 3-deazaadenina. Otras nucleobases modificadas incluyen pirimidinas tricíclicas tales como la citidina fenoxanina (1H-pirimido[5,4
15
25
35
45
55
65
E09015376
14-09-2015
b][1,4] benzoxazina-2(3H)-ona), citidina fenotiazina (1H-pirimido[5,4-b][1,4]benzotiazina-2(3H)-ona), G-clamps tales como una citidina fenoxazina sustituida (por ej., 9-(2-aminoetoxi)-H-primido[5,4-b][1,4] benzoxazina-2(3H)-ona), citidina carabazol (2H-pirimido[4,5-b]indol-2-ona), citidina piridoindol (H-pirido[3’,2’:4,5]pirrollo[2,3-d]pirimidina-2-ona). Las nucleobases modificadas pueden incluir también aquellas en las que la base de purina o de pirimidina se reemplaza con otros heterociclos, por ejemplo, 7-deaza-adenina, 7-deazaguanosina, 2-aminopiridina y 2-piridona. Otras nucleobases incluyen aquellas descritas en la Patente Estadounidense Nº 3.687.808, aquellas descritas en The Concise Encyclopedia of Polymer Science And Engineering, pages 858-859, Kroschwitz, J.I., ed. John Wiley & Sons 1990, aquellas descritas por Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition 1991, 30, 613, y aquellas descritas por Sanghvi, Y.S. Capítulo 15, Antisense Research and Applications, pages 289-302, Crooke, S.T. and Lebleu, B., ed., CRC Press 1993. Algunas de esas nucleobases son particularmente útiles para aumentar la afinidad de unión de los compuestos oligoméricos descritos en este documento. Estos incluyen las pirimidinas 5sustituidas, las 6-azapirimidinas y las purinas sustituidas N-2, N-6 y O-6, incluidas la 2-aminopropyl-adenine, 5propynyluracil y 5-propynylcytosin. Las sustituciones de 5-methylcytosine se han mostrado al aumentar la estabilidad dúplex del ácido nucleico mediante 0.6-1.2ºC (Sanghvi, Y.S., Crooke, S.T. y Lebleu, B., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Ratón, 1993, pp. 276-278) y se prefieren actualmente sustituciones de base, incluso más particularmente cuando se combina con modificaciones de azúcar 2’-O-metoxietilo.
Las patentes estadounidenses representativas que enseñan la preparación de algunas de las nucleobases modificadas indicadas anteriormente, así como otras nucleobases modificadas incluyen, pero no se limitan a, la patente estadounidense ante mencionada 3.687.808, como también a las patentes estadounidenses 4.845.205; 5.301.302; 5.134.066; 5.175.273; 255.367.066; 5.432.272; 5.457.187; 5.459.255; 5.484.908; 5.502.177; 5.525.711; 5.552.540; 5.587.469; 5.594.121; 5.596.091; 5.614.617; 5.645.985; 5.830.653; 5.763.588; 6.005.096 y 5.681.941, algunas de las cuales comúnmente corresponden con la presente solicitud y la patente estadounidense
5.750.692 la cual comúnmente corresponde con la presente solicitud.
La modificación e los oligonucleótidos de uso en la invención implica la unión química al oligonucleótido de una o más fracciones o conjugados que mejoran la actividad, la distribución celular o la captación celular del oligonucleótido. Los compuestos de uso en la invención pueden incluir grupos conjugados unidos covalentemente a grupos funcionales tales como grupos hidroxilo primarios o secundarios. Los grupos conjugados de uso en la invención incluyen intercaladores, moléculas informadoras, poliaminas, poliamidas, glicoles de polietileno, poliésteres, grupos que mejoran las propiedades farmacodinámicas de los oligómeros, y grupos que mejoran las propiedades farmacocinéticas de los oligómeros. Los grupos conjugados típicos incluyen colesteroles, lípidos, fosfolípidos, biotina, fenacina, folato, fenantridina, antraquinona, acridina, fluoresceínas, rodaminas, cumarinas y colorantes. Los grupos que mejoran las propiedades fármacodinámicas, en el contexto de esta invención, incluyen los gruipos que mejoran la captación del oligómero, mejoran la resistencia del oligómero a la degradación y/o fortalecen la hibridación específica de la secuencia con el ARN. Los grupos que mejoran las propiedades farmacocinéticas, en el contexto de esta invención, incluyen grupos que mejoran la captación, la distrución, el metabolismo y la excreción del oligómero. Los grupos conjugados representtivos se describen en la Solicitud de Patente Internacional PCT/US92/09196, presentada en octubre 23 de 1992. Las porciones conjugadas incluyen, pero no se limitan a las porciones lipídicas tales como una porción de colesterol (Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553-6556), ácido cólico (Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1994, 4, 1053-1060), un tioéter, por ej., hexilo-S-tritiltiol (Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660, 306-309; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765-2770), un tiocolesterol (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533538), una cadena alifática, por ej., residuos dodecanodiol o residuos de undecilo (Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10, 1111-1118; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259, 327-330; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75, 4954), un fosfolípido, por ej., di-hexadecilo-rac-glicerol o trietilamonio 1,2-di-O-hexadecilo-rac-glicero-3-H fosfonato (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777-3783), una poliamina o una cadena de glicol polietileno (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969-973) o ácido acético adamantano (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654), una fracción de palmitilo (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229-1 237), o una octadecilamina o una fracción de hexilaminocarbonilo-oxicolesterol (Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277, 923-937. Los oligonucleótidos de uso en la invención pueden también conjugarse con sustancias farmacológicas activas, por ejemplo, aspirina, warfarina, fenilbutazona, ibuprofeno, suprofeno, fenbufeno, ketoprofeno, (S)-(+)-pranoprofeno, carprofeno, dansilsarcosina, ácido triyodobenzoico-2,3,5, ácido flufenámico, ácido folínico, una benzotiadiazida, clorotiazida, una diazepina, indometacina, un barbitúrico, una cefalosporina, una droga sulfa, un antidiabético, un antibateriano o un antibiótico. Los conjugados de oligonucleótidos con drogas y su preparación se describen en la Solicitud de Patente Estadounidense 09/334,130 (presentada en junio 15 de 1999).
Las patentes estadounidenses representativas que enseñan la preparación de tales conjugados de oligonucleótidos incluyen, pero no se limitan a, las patentes estadounidenses: 4.828.979; 4.948.882; 5.218.105; 5.525.465; 5.541.313; 5.545.730; 5.552.538; 5.578.717; 5.580.731; 5.580.731; 5.591.584; 5.109.124; 5.118.802; 5.138.045; 5.414.077; 5.486.603; 5.512.439; 5.578.718; 5.608.046; 4.587.044; 4.605.735; 4.667.025; 4.762.779; 4.789.737; 4.824.941; 4.835.263; 4.876.335; 4.904.582; 4.958.013; 5.082.830; 5.112.963; 5.214.136; 5.082.830; 5.112.963; 5.214.136; 5.245.022; 5.254.469; 5.258.506; 5.262.536; 5.272.250; 5.292.873; 5.317.098; 5.371.241; 5.391.723; 5.416.203; 5.451.463; 5.510.475; 5.512.667; 5.514.785; 5.565.552; 5.567.810; 5.574.142; 5.585.481;
15
25
35
45
55
65
E09015376
14-09-2015
5.587.371; 5.595.726; 5.597.696; 5.599.923; 5.599.928 y 5.688.941, algunas de las cuales corresponden con la presente solicitud.
No es necesario para todas las posiciones en un compuesto dado ser modificadas de manera uniforme, y, de hecho, más de las modificaciones ya mencionadas pueden incorporarse en un compuesto único o incluso en un único nucleósido dentro de un oligonucleótido. La presente divulgación también incluye compuestos antisentido que son compuestos quiméricos. Los compuestos antisentido “quiméricos” o “quimeras” en el contexto de esta invención, son compuestos antisentido, particularmente oligonucleótidos que contienen dos o más regiones químicamente distintas, cada una compuesta de al menos una unidad de monómero, es decir, un nucleótido en el caso de un compuesto de oligonucleótido. Esos oligonucleótidos típicamente contienen al menos una región en la que el oligonucleótido se modifica de modo que se confiere al oligonucleótido aumento de la resistencia a la degradación de la nucleasa, incremento de la captación celular y/o aumento de la afinidad de unión al ácido nucleico objetivo. Una región adicional del oligonucleótido puede servir como un sutrato para las enzimas capaces de escindir el ARN:ADN o híbridos del ARN:ADN. A modo de ejemplo, la Rnasa H es una endonucleasa celular que escinde la cadena de RN o un dúplex ce ARN:ADN. La activación de la Rnasa H, por lo tanto, resulta en la escisión del ARN objetivo, mejorando así considerablemente la eficiencia de inhibición del oligonucleótido de la expresión génica. Consecuentemente, resultados comparativos pueden a menudo obtenerse con oligonucleótidos más cortos si se usan oligonucleótidos quiméricos, en comparación con desoxyoligonucleótidos fosforoticatos que hibridan a la misma región objetivo. La escisión del ARN objetivo puede detectarse de manera sistemática mediante electrofóresis de gel y, si es necesario, mediante técnicas de hibridación del ácido nucleico asociado conocido en la materia.
Los compuestos quiméricos antisentido de la divulgación pueden formarse como estructuras composite de dos o más oligonucleótidos, oligonucleóitdos modificados, miméticos de oligonucleósidos y/u oligonucleótidos como se describe más arriba. Tales compuestos se los conoce también en la técnica como híbridos o gapmers. Las patentes estadounidenses representativas que enseñan la preparación de tales estructuras híbridas incluyen, pero no se limitan a, las patentes estadounidenses: 5.013.830; 5.149.797; 5.220.007; 5.256.775; 5.366.878; 5.403.711; 5.491.133; 5.565.350; 5.623.065; 5.652.355; 5.652.356 y5.700.922, algunas de las cuales corresponden con la presente solicitud.
Los compuestos antisentido utilizados en concordancia con esta invención pueden elaborarse de manera conveniente y sistemática a través de la técnica bien conocida de síntesis en fase sólida. Varios proveedores venden equipos para dicho síntesis, por ejemplo, Applied Biosystems (Foster City, CA). Algunos otros medios para tal síntesis conocidos en la técnica pueden emplearse de manera adicional o alternativa. Es bien conocido el uso de técnicas similares para preparar oligonucleótidos tales como los fosforotioatos y los derivados alquilados.
Los compuestos antisentido de uso en la invención se sintetizan in vitro y no incluyen composiciones antisentido de orgen biológico o contructos de vectores genéticos diseñados para dirigir la síntesis in vivo de moléculas antisentido.
Los compuestos de uso en esta invención pueden tambien mezclarse, encapsularse, conjugarse o bien asociarse a otras moléculas, estructuras de moléculas o mezclas de compuestos, como por ejemplo, liposomas, moléculas receptoras específicas, formulaciones orales, rectales, tópicas u otras, para ayudar en la captación, distribución y/o absorción. Las patentes estadounidenses representativas que enseñan la preparación de las formulaciones que ayudan a la capatación, distribución y/o absorción incluyen, pero no se limitan a, las patentes estadounidenses: 5.108.921;5.354.844; 5.416.016; 5.459.127; 5.521.291; 5.543.158; 5.547.932; 5.583.020; 5.591.721; 4.426.330; 4.534.899; 5.013.556; 5.108.921; 5.213.804; 5.227.170; 5.264.221; 5.356.633; 5.395.619; 5.416.016; 5.417.978; 5.462.854; 5.469.854; 5.512.295; 5.527.528; 5.534.259; 5.543.152; 5.556.948; 5.580.575 y
5.595.756.
Los compuestos antisentdo de uso en la invención abarcan cualquier sal, éster o sales de tales ésteres farmacológicamente aceptable o cualquier otro compuesto que, luego de su administración a un animal, incluido un humano, sea capaz de proporcionar (directa o indirectamente) el metabolito biológicamente activo o residuo del mismo. Por consiguiente, por ejemplo, la descripción se refiere también a profármacos y sales farmacéuticamente aceptablesde los compuestos, sales farmacéuticamente aceptables de tales profármacos y otros bioequivalentes.
El término “profármaco” corresponde a un agente terapéutico que se prepara de una forma inactiva que se convierte a una forma activa (es decir, una droga) dentro del cuerpo y las células del mismo mediante la acción de enzimas endógenas y/u otras condiciones químicas. En particular, se preparan versiones de profármacos de los oligonucleótidos como derivados SATE [(S-acetil-2-tioetilo)fosfato] de acuerdo con los métodos descritos en WO 93/24510 a Gosselin et al., publicada en diciembre 9 de 1993 o en WO 94/26764 y en la patente estadounidense Nº 5.770.713, de Imbach et al.
El término “sales farmacéuticamente aceptables” se refiere a sales fisiológica y farmacéuticamente aceptables de los compuestos: es decir, sales que retienen la actividad biológica deseada del compuesto original y no provocan efectos toxicológicos no deseados al mismo.
15
25
35
45
55
65
E09015376
14-09-2015
Las sales de adición básicas farmacéuticamente aceptables están formada por metales o aminas, tales como metales alcalinos y alcalinotérreos o aminas orgánicas. Entre los metales usados como cationes están, por ejemplo: sodio, potasio magnesio, calcio y otros similares. Ejemplos de aminas adecuadas son N, N’dibenciletilenodiamina, cloroprocaína, colina, dietalonamina, diciclohexilamina, etilenodiamina, N-metilglucamina y procaína (ver, por ejemplo, Berge et al., “Pharmaceutical Salts” (Sales farmacéuticas), J. of Pharma Sci., 1977, 66, 119). Las sales de adición básica de dichos compuestos ácidos se preparan poniendo en contacto la forma de ácido libre con una cantidad suficiente de la base deseada para producir la sal en la manera convencional. La forma de ácido libre puede generarse poniendo en contacto la forma de sal con un ácido y aislando el ácido libre de la manera convencional. Las formas de ácido libre difieren de sus respectivas formas de sal en algunas de ciertas propiedades físicas tales como la solubilidad en solventes polares, pero por lo demás, las sales son equivalentes a su ácido libre respectivo para propósitos de la presente invención. Como se utiliza en este documento, una “sal de adición farmacéutica” incluye una sal farmacéuticamente aceptable de una forma ácida de uno de los compentes de las composiciones. Éstas incluyen sales ácidas orgánicas e inorgánicas de las aminas. Las sales ácidas preferidas son el ácido clorídrico, los acetatos, salicilatos, nitratos y fosfatos. Otras sales adecuadas farmacéuticamente aceptables son bien conocidas para los expertos en la materia e incluyen las sales básicas de una variedad de ácidos orgánicos e inorgánicos, tales como, por ejemplo, con los ácidos inorgánicos, tales como, por ejemplo, ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico y ácido fosfórico; con carboxílico orgánico, ácido sulfónico, sulfo y fosfo ácidos o ácidos sulfámicos sustituidos-N, por ejemplo ácido acético, ácido propiónico, ácido glicólico, ácido sucínico, ácido maleico, ácido hidroximaleico, ácido metilmaleico, ácido fumárico, ácido málico, ácido tartárico, acido láctico, ácido oxálico, ácido glucónico, ácido glucárico, ácido glucurónico, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido cinámico, ácido mandélico, ácido salicílico, ácido 4-aminosalicílico, ácido 2-fenoxibenzoico, ácido 2-acetoxibenzoico, ácido embónico, ácido nicotínico, o ácido isonicotínico; y con aminoácidos tales como los 20 alfa-aminoácidos implicados en la síntesis de proteínas en la naturaleza, por ejemplo, el ácido glutámico o el ácido aspártico y, también, el ácido fenilacético, ácido metanosulfónico, ácido etanosulfónico, ácido 2-hidroxietanosulfónico, ácido etano-1,2-disulfónico, ácido benenosulfónico, ácido 4-metilbencenosulfónico, ácido nafaleno-2-sulfónico, ácido naftaleno-1,5-disulfónico, 2-o 3fosfoglicerato, glucosa-6-fosfato, ácido N-ciclohexisulfámico (con la formación de ciclamatos) o con otros compuestos orgánicos ácidos, tales como el ácido ascórbico. Las sales de compuestos farmacéuticamente aceptables pueden también prepararse con cationes farmacéuticamente aceptables. Los cationes adecuados farmacéuticamente aceptables son bien conocidos por los expertos en la materia e incluyen los cationes alcalinos, alcalinos térreos, amonio y amonio cuaternario. Los carbonatos y carbonatos de hidrógeno también son posibles.
Para los oligonucleótidosk, los ejemplos preferidos de sales farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a las sales formadas con cationes tales como el sodio, potasio, amonio, magnesio, calcio, poliaminas tales como la espermina y espermidina, etc.; (b) sales de adición de ácido formadas con ácidos inorgánicos, por ejemplo, ácido hidroclorhídrico, ácido hidrobrómico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido nítrico y similares; (c) sales formadas con ácidos orgánicos tales como, por ejemplo, ácido acético, ácido oxálico, ácido tartárico, ácido sucínico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido glucónico, ácido cítrico, ácido málico, ácido ascórbico, ácido benzoico, ácido tánico, ácido palmítico, ácido algínico, ácido poliglutámico, ácido naftaleno sulfónico, ácido metanosulfónico, ácido ptolueonosulfónico, ácido naftalenodisulfónico, ácido poligalacturónico, y similares; y (d) sales formadas por aniones elementales tales como clorina, broina y yodina.
Los compuestos antisentido descritos en este documento pueden utilizarse para fines diagnósticos, terapéuticos, profilácticos y como reactivos de investigación y kits. Para fines terapéutos, un animal, preferentemente un humano, sospechoso de tener una enfermedad o un trastorno que pueda tratarse mediante la modulación de la expresión de la apolipoproteína B se trata administrando compuestos antisentido en concordancia con esta descripción. Los compuestos descritos en este documento pueden utilizarse en composiciones farmacéuticas mediante la adición de una cantidad efectiva de un compuesto antisentido a un adecuado diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable. Los compuestos y métodos antisentido descritos en este documento pueden ser profilácticamente útiles, es decir, para prevenir o retrasar la infección, inflamación o formación del tumor, por ejemplo.
Los compuestos antisentido descritos en este documento son útiles en la investigación y el diagnóstico, porque dichos compuestos hibridan a los ácidos nucleicos que codifican la apolipoproteína B, permitiendo el formato sándwich y otros ensayos para construirlo fácilmente para explotar este hecho. La hibridación de los oligonucleótidos antisentido con un ácido nucleico que codifica la apolipoproteína B puede detectarse por medios conocidos en la técnica. Tales medios puede incluir la conjugación de una enzima al oligonucleótido, radiomarcado del oligonucleótido o cualquier otro medio de detección adecuado. Los kits que utilizan tales medios de detección para evaluar el nivel de la apolipoproteína Ben una muestra pueden prepararse.
La presente descripción también incluye composiciones y formulaciones farmacéuticas que contienen los compuestos antisentido descritos en este documento. Las composiciones farmacéuticas descritas en este documento pueden administrarse en un número de maneras, dependiendo de si se desea tratamiento local o sistémico y de la zona a tratar. La administración puede ser tópica (incluyendo las membranas oftálmicas y mucosas, incluidas las vías reactal y vaginal), pulmonar, por ej., mediante inhalación o insuflación de polvos o aerosoles,
15
25
35
45
55
65
E09015376
14-09-2015
incluyendo mediante nebulizador; intratraqueal, intranasal, epidérmica y transdérmica), oral o parenteral. La administración parenteral incluye la vía intravenosa, intraarterial, subcutánea, intraperitoneal o inyección intramuscular o infusión; o intracraneal, por ej., administración intratecal o intraventricular. Se cree que los oligonucleótidos con al menos una modificación 2’-O-metoxietilo son particularmente útiles para la administración oral.
Las composiciones y formulaciones farmacéuticas para la administración tópica puede incluir parches transdérmicos, ungüentos, lociones, cremas, geles, gotas, supositorios, aerosoles, líquidos y polvos. Pueden ser necesarios o deseables vehículos farmacéuticos convencionales, bases acuosas, en polvo u oleosas, espesantes y similares. Condones recubiertos, guantes y similares también pueden ser útiles. Las formulaciones tópicas preferidas incluyen aquellas en las que los oligonucleótidos están mezclados con un agente de suministro tópico tales como lípidos y liposomas, ácidos grasos, ésteres de ácidos grasos, esteroides, agentes quelantes y tensioactivos. Los lípidos y liposomas preferidos, incluidos los neutrales (por ej., dioleoilfosfatidil DOPE etanolamina, dimiristoilfosfatidil colina DMPC, diestearoilfosfatidil colina) negativas (por ej., dimiristoilfosfatidil glicerol DMPG) y catiónicos (por ej., dioleoiltetrametilaminopropil DOTAP y dioleoilfosfatidil etanolamina DOTMA). Los oligonucleótidos pueden encapsularse dentro de liposomas o pueden formar complejos de los mismos, en particular en liposomas catiónicos. De forma alternativa, los oligonucleótidos pueden ser “complejados” a los lípidos, en particular, a lípidos catiónicos. Los ácidos grasos y ésteres preferidos incluyen, pero no se limitan al ácido araquidónico, ácido oleico, ácido eicosanoico, ácido láurico, ácido caprílico, ácido cáprico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido linoleico, ácido linolénico, dicaprato, tricaprato, monooleína, dilaurina, glicerilo 1-monocaprate, 1dodecilazacicloheptan-2-ona, un acilcarnitina, un acilcolina, o un éster alquilo c1-10 (por ej., isopropilmiristate IPM), monoglicérido, diglicérido o sal similar farmacéuticamente aceptable. Las formulaciones se describen en detalle en la solicitud patente estadounidense 09/315,298 presentada en mayo 20 de 1999.
Las composiciones y formulaciones para administración oral incluyen polvos o gránulos, microparticulados, nanoparticulados, supensiones o soluciones en agua o medio no acuoso, cápsulas, cápsulas en gel, sachets, tabletas o minitabletas. Los espesantes, agentes saborizantes, diluyentes, emulsionantes, agentes auxiliares de dispersión o aglutinantes pueden ser deseables. Las formulaciones orales preferidas son aquellas en las que se administran oligonucleótidos en conjunto con una o más potenciadores de penetración tensioactivos y quelantes. Los tensioactivos preferidos incluyen los ácidos grasos y/o ésteres o sales de ellos ácidos biliares y/o sales de ellos. Los ácidos/sales biliares preferidos incluyen ácido quenodeoxicólico (CDCA) y ácido ursodeoxiquenodeoxicólico (UDCA), ácido cólico, ácido dehidrocólico, ácido deoxicólico, ácido glucólico, ácido glicólico, ácido glicodesoxicólico, ácido taurocólico, ácido taurodesoxicólico, sodio tauro-24,25-dihidro-fusidato, sodio glicodihidrofusidato. Los ácidos grasos preferidos incluyen ácido aracidónico, ácido undecanoico, ácido oleico, ácido láurico, ácido caprílico, ácido cáprico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido linoleico, ácido linolénico, dicaprato, tricaprato, monooleína, dilaurina, glicerilo 1-monocaprato, 1-dodecilazacicloheptano-2-ona, una acilcarnitina, una acilcolina o una monoglicérido, un diglicérido o una sal de ellos farmacéuticamente aceptable (por ej., sodio). También se prefieren combinaciones de potenciadores de la penetración, por ejemplo, ácidos grasos/sales en combinación con ácidos/sales biliares. Una combinación particularmente preferida es la sal sódica del ácido láurico, ácido cáprico y UDCA. Otros potenciadores de la penetración incluyen el éter polioxietileno-9laurilo, el éter polioxietileno-20-cetilo. Los oligonucleótidos pueden ser suministrados oralmente en forma granular, incluyendo partículas secas pulverizadas o “complejadas” para formar micro o nanopartículas. Los agentes complejantes del oligonucleótido incluyen poliaminoácidos, poliminas, poliacrilatos, polialquiloacrilatos, polioxetanos, polialquilocianoacrilatos, gelatinas cationizadas, albúminas, almidones, acrilatos, polietilenoglicoles (PEG) y almidones; polialquilocianoacrilatos; poliiminas derivatizadas-DEAE, contaminantes, celulosas y almidones. Los agentes complejantes particularmente preferidos incluyen quitosano, N-trimetilquitosano, poli-L-lisina, polihistidina, poliornitina, poliesperminas, protamina, polivinilpiridina, politiodietilamino-metiloetileno P(TDAE), poliaminoestireno (por ej., p-amino), poli(metilcianoacrilato), poli(etilcianoacrilato), poli(butilcianoacrilato), poli(isobutilcianoacrilato), poli(isohexilcianoacrilato), DEAE-metaacrilato, DEAE-hexilacrilato, DEAE-acrilamida, DEAE-albúmina y DEAEdextran, polimetiloacrilato, polihexiloacrilato, poli(D,L-ácido láctico), poli(DL-ácido glicólico-co-láctico (PLGA), alginato y polietilenoglicol (PEG). Las formulaciones orales para oligonucleótidos y su preparación se describen en detalle en las solicitudes estadounidenses 08/886,829 (presentada el 1 de julio de 1997), 09/108,673 (presentada el 1 de julio de 1998), 09/256,515 (presentada el 23 de febrero de 1999), 09/082,624 (presentada el 21 de mayo de 1998) y 09/315,298 (presentada el 20 de mayo de 1999).
Las composiciones y formulaciones para administración parenteral, intratecal o intraventricular puede incluir soluciones acuosas estériles que pueden también contener búfers, diluyentes y otros aditivos adecuados tales como, pero no limitado a, potenciadores de penetración, compuestos portadores y otros vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables.
Las composiciones farmacéuticas de uso en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, soluciones, emulsiones y formulaciones que contienen liposomas. Esas composiciones pueden generarse de una variedad de componentes que incluyen, pero no se limitan a, líquidos preformados, sólidos autoemulsionantes y semisólidos autoemulsionantes.
15
25
35
45
55
65
E09015376
14-09-2015
Las formulaciones farmacéuticas de uso en la presente invención, que pueden presentarse convenientemente en forma de composición unitaria, pueden prepararse de acuerdo con las técnicas convencionales bien conocidas en la industria farmacéutica. Tales técnicas incluyen la etapa de poner en asociación los ingredientes activos con los portadores farmacéutidos o excipientes. En general, las formulaciones se preparan uniforme e íntimamente poniendo en asociación los ingredientes activos con vehículos líquidos o vehículos sólidos finamente divididos o ambos y, entonces, si es necesario, conformando el producto.
Las composiciones de uso en la presente invención pueden formularse en cualquiera de las muchas dosificaciones posibles, tales como, pero no limintadas a, tabletas, cápsulas, cápsulas en gel, jarabes líquidos, geles suaves, supositorios y enemas. Las composiciones de uso en la presente invención pueden también formularse como suspensiones en medios acuosos, no acuosos o mixtos. Las suspensiones acuosas pueden además contener sustancias que incrementan la viscosidad de la suspensión, incluyendo, por ejemplo, carboximetilcelulosa, sorbitol y/o dextran. La suspesión puede también contener estabilizadores.
En una representación, las composiciones farmacéuticas pueden formularse y usarse como espumas. Las espumas pueden incluir formulaciones tales como, pero no se limmitan a, emulsiones, microemulsiones, cremas, jaleas y liposomas. Si bien son básicamente similares en naturaleza, esas formulaciones varían en los componentes y la consistencia del producto final. La preparación de tales composiciones y formulaciones es generalente conocida para esos expertos en farmacéutica y en las técnicas de formulación y puede aplicarse a la formulación de las composiciones de uso en la presente invención.
Emulsiones
Las composiciones de uso en la presente invención pueden prepararse y formularse como emulsiones. Las emulsiones son típicamente sistemas heterogéneos de un líquido disperso en otro en la forma de gotitas que usualmente exceden 0.1 µ de diámetro (Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1998, Marcel Dekker, Ink., New York, N.Y., volume 1, p. 199; Rosoff, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1998, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Volume 1, p. 245; Block in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 2, p. 355; Higuchi et al., in Remingon’ Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1985, p. 301). Las emulsiones a menudo son sistemas bifásicos que constan de dos fases líquidas inmiscibles íntimamente mezcladas y dispersas con cada una de las otras En general, las emulsiones pueden ser ya sea una variedad de agua-en-aceite (w/o) o de aceite-en agua (o/w). Cuando una fase acuosa se divide finamente en y se dispersa en forma de gotitas diminutas en una fase oleosa mayor, la composición resultante se denomina emulsión de agua-enóleo (w/o). De forma alternativa, cuando una fase oleosa se divide finamente en y se dispersa en forma de gotitas diminutas en una fase acuosa mayor, la composición resultante se denomina emulsión de óleo-en-agua (o/w).
Las emulsiones pueden contener componentes adicionales además de las fases dispersas y el fármaco activo, que puede presentarse como una solución tanto para la fase acuosa, oleosa, o éste mismo como una fase separada. Excipientes farmacéuticos tales como emulsionantes, estabilizadores, colorantes y antioxidantes también pueden estar presentes en las emulsiones según sea necesario. Las emulsiones farmacéuticas también pueden ser emulsiones múltiples que están formadas por más de dos fases, tales como, por ejemplo, en el caso de las emulsiones aceite en agua en aceite (o/w/o) y agua en aceite en agua (w/o/w). Tales formulaciones complejas a menudo proporcionan ciertas ventajas que las simples emulsiones binarias no brindan. Las emulsiones múltiples en las cuales las gotas individuales de aceite de una emulsión o/w contienen pequeñas gotas de agua constituyen una emulsión w/o/w. De la misma forma, un sistema de gotas de aceite contenido en glóbulos de agua estabilizados en continuo aceite genera una emulsión o/w/o.
Las emulsiones se caracterizan por tener baja o nula estabilidad termodinámica. Con frecuencia, la fase dispersa o discontinua de la emulsión se encuentra bien dispersada dentro de la fase externa o continua y se mantiene en esta forma a través de los emulsionantes o de la viscosidad de la formulación. Cada una de las fases de la emulsión puede estar en estado semisólido o sólido, como en el caso de las emulsiones a base de ungüentos y cremas. Otros medios para estabilizar las emulsiones comportan el uso de emulsionantes que puedan incorporarse a cada fase de la emulsión. Los emulsionantes se pueden clasificar ampliamente en cuatro categorías: sintéticos, surfactantes, emulsionantes naturales, basados en absorción, y sólidos finamente dispersos (Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volumen 1, p. 199). Surfactantes sintéticos, también conocidos como agentes activos superficiales, constataron una amplia aplicabilidad en la formulación de emulsiones y han sido citados en (Rieger, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume l, p. 285; Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, volumen 1, p. 199). Los surfactantes tienen propiedades anfifílicas típicas y comprenden una porción hidrofílica e hidrofóbica. El radio de la naturaleza hidrofílica hacia la hidrofóbica del surfactante se ha denominado como balance hidrófilo/lipófilo (HLB) y es una herramienta valiosa a la hora de categorizar y seleccionar surfactantes en la preparación de formulaciones. Dependiendo de la naturaleza del grupo hidrofílico, los surfactantes se pueden clasificar en distintas clases: no-iónicos, aniónicos, catiónicos y anfotéricos (Rieger, en Pharmaceutical Dosage
15
25
35
45
55
65
E09015376
14-09-2015
Pbrms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.>, 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volumen l, p. 285).
Los emulsionantes que ocurren de forma natural utilizados en formulaciones de emulsiones incluyen lanolina, cera de abejas, fosfátidos, lecitina y acacia. Los basados en absorción poseen propiedades hidrofílicas tales que éstos pueden absorber agua para formar emulsiones tipo w/o y seguir reteniendo sus consistencias semisólidas, tales como la lanolina anhidra y el petrolato hidrofílico. Los sólidos finamente divididos también se han utilizado como buenos emulsionantes, especialmente en combinación con surfactantes y en preparaciones viscosas. Éstas incluyen sólidos inorgánicos polares, como los hidróxidos de metales pesados, arcillas de grano fino como la bentonita, atapulgita, hectorita, caolín, montmorillonita, silicato coloidal de aluminio, pigmentos y sólidos no-polares tales como el carbono o el triestearato de glicerol.
También se incluye en una gran variedad de materiales no-emulsionantes en las formulaciones de emulsiones, las cuales contribuyen a las propiedades de las emulsiones. Éstos incluyen grasas, aceites, ceras, ácidos grasos, alcoholes grasos, grasas esterificadas, humectantes, coloides hidrofílicos, preservativos y antioxidantes (Block, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1983, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume l, p. 335; Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, volumen 1, p. 199).
Los coloides hidrofílicos o hidrocoloides incluyen gomas producidas naturalmente y polímeros sintéticos, tales como polisacáridos (por ejemplo, acacia, agar, ácido algínico, carragenano, goma guar, goma karaya y tragacanto), derivados de la celulosa (por ejemplo, carboximetilcelulosa y carboxipropilcelulosa), y polímeros sintéticos (por ejemplo, carbómeros, éteres de celulosa y polímeros de carboxivinilo). Éstos se dispersan o se hinchan en el agua para formar soluciones coloidales que estabilizan las emulsiones formando fuertes películas interfaciales alrededor de las gotas de fase dispersa y aumentando la viscosidad de la fase externa.
Dado que las emulsiones con frecuencia contienen una cantidad de ingredientes tales como carbohidratos, proteínas, esteroles y fosfátidos que pueden estimular con facilidad el crecimiento de microbios, estas formulaciones a menudo incorporan preservativos. Los preservativos de uso común presentes en formulaciones de emulsiones contienen metilparabeno, propilparabeno, sales de amonio cuaternario, cloruro de benzalconio, ésteres de phidroxibenzoico, y ácido bórico. Los antioxidantes también se añaden comúnmente a las formulaciones de emulsiones para evitar la deterioro de la formulación. Los antioxidantes utilizados pueden ser radicales libres tales como tocoferoles, galatos de alquilo, hidroxibutilanisol, hidroxibutiltolueno, o agentes reductores tales como ácido ascórbico y metabisulfito sódico, y antioxidantes sinergistas tales como ácido cítrico, ácido tartárico y lecitina.
La aplicación de las formulaciones de emulsiones vía dermatológica, oral y parental, así como los métodos para su fabricación fueron citados en la literatura (Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, volumen 1, p. 10 199). Las formulaciones de emulsiones de administración oral se han utilizado ampliamente debido a la facilidad de formulación, eficacia desde una absorción y perspectiva de biodisponibilidad. (Rosoff, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volumen 1, p. 245; Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, volumen 15, p. 199). Laxantes a base de aceite mineral, vitaminas solubles en aceite y preparaciones con alto contenido graso se encuentran entre los materiales que se administran normalmente por vía oral como las emulsiones o/w.
En una realización, la composición de oligonucleótidos y ácidos nucleicos se formulan como microemulsiones. Una microemulsión se puede definir como un sistema de agua, aceite y anfifila la cual es un isotrópico óptico simple y una solución líquida termodinámicamente estable (Rosoff, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volumen 1, p. 245). Por lo general, las microemulsiones corresponden a sistemas que se preparan primeramente para dispersar un aceite en una solución de surfactante acuosa y luego añadir una cantidad suficiente de un cuarto componente, generalmente un alcohol de longitud de cadena intermedia para formar un sistema transparente. Por lo tanto, las microemulsiones también se han descrito como termodinámicamente estables, dispersiones isótropas claras de dos líquidos inmiscibles que se estabilizan mediante películas interfaciales de moléculas activas superficiales (Leung y Shah, en: Controlled Release of Drugs: Polymers and Aggregate Systems, Rosoff, M., Ed., 1989, VCH Publishers, New York, páginas 185-215).
Las microemulsiones se preparan normalmente a través de una combinación de tres a cinco componentes que contienen aceite, agua, surfactante, co-surfactante y electrolito. Ya sea que la microemulsión es de tipo agua en aceite (w/o) o de tipo aceite en agua (o/w), depende de las propiedades del aceite y del surfactante utilizado y sobre la estructura y empaque geométrico de las cabezas polares y colas de hidrocarburos de las moléculas surfactantes (Schott, in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1985, p. 271).
El enfoque fenomenológico que utiliza diagramas de fase se ha estudiado extensivamente y el mismo ha aportado un conocimiento integral a un experto en la materia sobre cómo formular microemulsiones (Rosoff, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y.,
15
25
35
45
55
65
E09015376
14-09-2015
volumen 1, p. 245; Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, volumen 1, p. 335). En comparación con las emulsiones convencionales, las microemulsiones ofrecen la ventaja de solubilizar fármacos insolubles en agua en una formulación de gotas termodinámicamente estables que se forman espontáneamente.
Los surfactantes utilizados en la preparación de microemulsiones incluyen, aunque no se limitan a, surfactantes iónicos, surfactantes no-iónicos, Brij 96, éteres polioxietilenos oleicos, ésteres de poliglicerol de ácidos grasos, monolaurato de tetraglicerol (ML310), monooleato de tetraglicerol (MO310), monooleato de hexaglicerol (PO310), pentaoleato de hexaglicerol (PO500), monocaprato de decaglicerol (MCA750), monooleato de decaglicerol (MO750), sequioleato de glicerol (80750), decaoleato de decaglicerol (DAO750), solo o en combinación con cosurfactantes. El co-surfactante, generalmente un alcohol de cadena corta tal como el etanol, 1-propanol, y 1-butanol, sirve para aumentar la fluidez interfacial al penetrar dentro de la película del surfactante y en consecuencia, crea una película desordenada producto del espacio vacío generado entre las moléculas surfactantes. Las microemulsiones pueden, sin embargo, estar preparadas sin la necesidad de utilizar co-surfactantes y sistemas de microemulsión de autoemulsificación libres de alcohol que se dan a conocer en la materia. La fase acuosa puede ser normalmente, aunque no se limita a, agua, una solución acuosa de fármaco, glicerol, PEG300, PEG400, poligliceroles, propilenglicoles, y derivados de etileneglicol. La fase oleosa puede contener, aunque no se limita a, materiales tales como Captex 300, Captex 355, Capmul MCM, ésteres de ácido graso, mono, di y tri-glicéridos, ésteres de glicerol de ácido grasos polioxietilados, alcoholes grasos, glicéridos poliglicolizados, glicéridos saturados poliglicolizados C8-C10, aceites vegetales y aceite de silicona.
Las microemulsiones son de un interés particular desde la pesperctiva de solubilización de fármaco y de una mayor absorción de fármacos. Se han propuesto microemulsiones en base a lípidos (ambas o/w y w/o) para mejorar la biodisponibilidad oral de los fármacos, incluyendo péptidos (Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385-1390; Ritschel, Meth. Find. Exp. Clin. Pharmacol., 1993, 13, 205). Las microemulsiones aportan ventajas de mejor solibilización de fármacos, protección de fármaco contra hidrólisis enzimática, posible mejora de absorción de fármaco debido a alteraciones inducidas por surfactante en la fluidez y permeabilidad de membrana, facilidad de preparación, facilidad de administración por sobre la forma farmacéutica sólida, potencia clínica mejorada y toxicidad reducida (Constantinides et al, Pharmaceutical Research, 1994, 11,1385; Ho et al., J. Pharm. Sei., 1996, 85, 138-143). A menudo las microemulsiones pueden formarse espontáneamente cuando sus componentes se reúnen a temperatura ambiente. Esto puede ser particularmente ventajoso cuando se formulan fármacos termolábilies, péptidos u oligonucleótidos. Las microemulsiones también han probado ser efectivas en el envío transdermal de componentes activos tanto en aplicaciones cosméticas como farmacéuticas. Se espera que las composiciones de microemulsiones y las formulaciones de uso en la presente invención, faciliten la absorción sistémica creciente de oligonucleótidos y ácidos nucleicos desde el tracto gastrointestinal, así como también mejoren la absorción celular local de oligonucleótidos y ácidos nucleicos dentro del tracto gastrointestinal, vagina, cavidad bucal y otras áreas de administración.
Las microemulsiones de uso en la presente invención también pueden contener componentes adicionales y aditivos tales como monoestearato de sorbitan (Grill 3), Labrasol, y potenciadores de penetración para mejorar las propiedades de la formulación y la absorción de oligonucleótidos. Los potenciadores de penetración utilizados en las microemulsiones se pueden clasificar como pertenecientes a una de las cinco categorías amplías -surfactantes, ácidos grasos, sales biliares, agentes quelantes, y no-quelantes no surfactantes (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92). Cada una de estas clases se mencionaron anteriormente.
Liposomas
Existen muchas estructuras organizadas de surfactantes además de las microemulsiones que han sido estudiadas y utilizadas en la formulación de fármacos. Éstas incluyen monocapas, micelas, bicapas y vesículas. Las vesículas, tales como liposomas, han atraído un gran interés debido a su especificidad y tiempo de acción que ofrecen desde la perspectiva de envío de fármacos. Como se ha utilizado en la presente invención, el término "liposoma" supone una vesícula compuesta de lípidos anfifílicos organizados en una bicapa esférica o bicapas.
Los liposomas son vesículas unilamelares o multilamelares las cuales tienen una membrana formada desde un material lipofílico y un interior acuoso. La porción acuosa contiene la composición para enviar. Los liposomas catiónicos poseen la ventaja de ser capaces de fundirse con la pared celular. Los liposomas no-catiónicos, aunque no tan capaces de fundirse eficientemente con la pared celular, son recogidos por macrófagos in vivo.
Para poder atravesar la piel intacta de los mamíferos, las vesículas lípidicas deben pasar por una serie de poros finos, cada uno con un diámetro menor a 50 nm, bajo la influencia de un gradiente transdermal adecuado. Por lo tanto, es recomendable utilizar un liposoma que sea extremadamente deformable y que sea capaz de atravesar tales poros finos.
Otras ventajas de utilizar liposomas incluyen; los liposomas obtenidos de fosfolípidos naturales son biocompatibles y biodegradables; los liposomas pueden incorporar una amplia gama de agua y fármacos
15
25
35
45
55
65
E09015376
14-09-2015
liposolubles; los liposomas pueden proteger a los fármacos encapsulados en sus compartimentos internos del metabolismo y la degradación (Rosoff, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volumen 1, p. 245). Algunas consideraciones importantes en la preparación de formulaciones de liposoma son la carga superficial del lípido, tamaño de la vesícula y el volumen acuoso de los liposomas.
Los liposomas son útiles para la transferencia y envío de ingredientes activos al lugar de acción. Debido a que la membrana liposómica es estructuralmente similar a las membranas biológicas, cuando los liposomas se aplican al tejido, los liposomas comienzan a unirse a las membranas celulares. A medida que avanza la unión entre liposoma y célula, los contenidos liposómicos se vacían dentro de la célula donde el agente activo puede actuar.
Las formulaciones liposómicas han sido el foco de investigaciones profundas como también el método de envío para muchos fármacos. Hay un número creciente de evidencia que indica que los liposomas presentan varias ventajas por sobre otras formulaciones en la administración tópica. Tales ventajas incluyen la reducción de efectos secundarios relacionados a la alta absorción sistémica del fármaco administrado, mayor acumulación del fármaco administrado en el objetivo deseado, y la habilidad de administrar una amplia gama de fármacos, tanto hidrofílicos e hidrofóbicos, dentro de la piel.
Varios informes han detallado la habilidad de los liposomas para entregar agentes incluyendo ADN de alto peso molecular dentro de la piel. Los compuestos como analgésicos, anticuerpos, hormonas y ADNs de alto peso molecular se han administrado a la piel. La mayoría de las aplicaciones se traducen en la focalización de la epidermis superior.
Los liposomas se clasifican en dos categorías amplias. Liposomas catiónicos corresponden a liposomas positivamente cargados los cuales interactúan con las moléculas de ADN negativamente cargadas para formar un complejo estable. El complejo de ADN o liposoma positivamente cargado se une a la superficie celular negativamente cargada y se internaliza en un endosoma. Debido al pH ácido dentro del endosoma, los liposomas se rompen, liberando sus contenidos dentro del citoplasma celular (Wang et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1987, 147, 980-985).
Aquellos liposomas que son sensibles al pH o están negativamente cargados, atrapan el ADN antes que crear complejos de éste. Ya que el ADN y el lípido están cargados de igual forma, ocurre una repulsión en lugar de la formación de complejo. Sin embargo, algo del ADN queda atrapado en el interior acuoso de estos liposomas. Los liposomas sensibles al pH se han utilizado para entregar codificación de ADN del gen timidinquinasa a las monocapas celulares en el cultivo. La manifestación del gen exógeno se detectó en las células de destino (Zhou et al., Journal of Controlled Release, 1992, 19, 269-274).
Un tipo principal de composición liposómica incluye fosfolípidos más que otros derivados naturales de la fosfatidilcolina. Composiciones liposómicas neutrales, por ejemplo, se pueden formar a partir de dimiristoil fosfatidilcolina (DMPC) o dipalmitoil fosfatildicolina (DPPC). Las composiciones aniónicas de liposoma generalmente se forman a partir de dimiristoil fosfatidilglicerol, mientras que los liposomas aniónicos fusogénicos se forman principalmente a partir de dioleoil-fosfatidiletanomelamina (DOPE). Otro tipo de composición liposómica se forma a partir de fosfatidilcolina (PC) tal como, por ejemplo, PC de soja, y PC de huevo. Otro tipo se forma a partir de mezclas entre fosfolípidos y/o fosfatidilcolina y/o colesterol.
Varios estudios han evaluado el envío tópico de formulaciones de fármacos liposómicos en la piel. La aplicación de liposomas que contienen interferón a la piel de un conejillo de Indias se tradujo en una reducción de las heridas causadas por herpes en la piel mientras que el envío de interferón a través de otros medios (ej. como una solución o como una emulsión) fue ineficiente (Weiner et al., JOurnal of Drug Targeting, 1992, 2, 405-410). Es más, un estudio complementario evaluó la eficacia del interferón administrado como parte de una formulación liposómica hacia la administración de interferón utilizando un sistema acuoso, y se concluyó que la formulación liposómica fue superior a la administración acuosa (du Plessis et al., Antiviral Research, 1992, 18, 259-26S).
Los sistemas liposómicos no-iónicos también se han examinado para determinar su utilidad en el envío de fármacos para la piel, particularmente aquellos sistemas que incluyen surfactante no-iónico y colesterol. Las formulaciones liposomales no-iónicas incluyen Novasome (TM) I (dilaurato de gliceril/colesterol/estearil éter de polioxioetileno-10) y Novasoma (TM) II (distearato de gliceril/colesterol/estearil éter de polioxietileno-10) los cuales se utilizaron para entregar cicloesporina A en la dermis de la piel de un ratón. Los resultados indicaron que tales sistemas no-iónicos liposómicos fueron eficaces para facilitar la deposición de cicloesporina A en diferentes capas de la piel (Hu et al. S.T.P.Pharmá. Sci., 1994, 4, 6, 466).
Los liposomas también incluyen liposomas “estéricamente estabilizados”, un término que, como se usa en el presente, se refiere a los liposomas que comprenden uno o más lípidos especializados que, cuando se incorporan dentro de los liposomas, se traducen en una mejora a la circulación de las vidas medias relativas a los liposomas que carecen de aquellos lípidos especializados. Algunos ejemplos de liposomas estéricamente estabilizados son aquellos en los cuales parte de la porción lipídica que forma la vesícula del liposoma (A) comprende uno o más
15
25
35
45
55
65
E09015376
14-09-2015
glicolípidos, tales como el monosialongangliócido Gm1 o (B) se deriva de uno o más polímeros hidrofílicos, tal como una fracción de polietilenglicol (PEG). Mientras que deseando no ser parte de cualquier teoría en particular, se piensa en la materia que, al menos en lo que respecta a liposomas estéricamente estabilizados que contienen gangliósidos, esfingomielina, o lípidos derivados de PEG, la mejora de circulación de la media vida de estos liposomas estéricamente estabilizados deriva de una disminución de absorbsión en células del sistema reticuloendotelial (RES) (Allen et al., FEBS Letters, 1987, 223, 42; Wu et al., Cancer Research, 1993, 53, 3765). Se conocen en la materia varios liposomas que comprenden uno o más glicolípidos. Papahadjopoulos et al. (Ann. N.Y. Acad. Sci., 1987, 507, 64) informó la capacidad del monosialogangliósido Gm1 sulfato de galactocerebrósido y del fosfatidillinositol para mejorar periodos de vida media de la sangre en liposomas. Estos hallazgos fueron presentados por Gabizon et al. (Proa. Nati. Acad. Sci . U.S.A. , 1988, 85, 6949) . U.S. Patente No. 4 , 837, 028 y WO 88/04924, ambos de Allen et al., describe la composición de liposomas (1) esfingomielina y (2) el gangliósido Gm1 o un éstersulfato de galactocerebrósido. U.S. Patente No. 20 5,543,152 (Webb et al.) describe liposomas que comprenden esfingomielina. Los liposomas que comprenden 1,2-sn-dimiristoilfosfatidilcolina fueron descritos en WO 97/13499 (Lim et al.).
Muchos liposomas que comprenden lípidos derivados de uno o más polímeros hidrofílicos, así como los métodos de preparación de los mismos, se conocen en la materia. Sunamoto et al. (Bull. Chem. Soc. Jpn., 1980, 53, 2778) describió liposomas que incluyen un detergente no-iónico, 2Cn15G, que contiene una fracción de PEG. Illum et al. (FEBS Lett., 1984, 167, 79) notó que el revestimiento hidrofílico de las particulas de poliestireno con glicoles poliméricos se traduce en una mejora importante en las vidas medias de la sangre. Fosfolípidos sintéticos modificados por la inclusión de grupos carboxílicos de glicoles de polialquilenos (e.g., PEG) se describen por Sears
(U.S. Patente No. 4.426.330 y 4.534.899). Klibanov et al. (FEBS Lett., 1990, 268, 235) describió experimentos que demuestran que los liposomas que comprenden fosfatidiletanomelamina (PE) derivados de PEG o estearato de PEG presentaban aumentos significativos en las vidas medias de la circulación de la sangre. Blume et al. (Biochimica et Biophysica Acta, 1990, 1029, 91) amplió tales observaciones a otros fosfolípidos derivados de PEG, por ej., DSPE-PEG, formado a partir de la combinación entre distearoil-fosfatidiletanomelamina (DESPE) y PEG. Los liposomas que tienen fracciones de PEG covalentemente unidas sobre su superficie externa se describen en European Patente No. EP 0445 131 B1 y wo 90/04384 a Fisher. Las composiciones de liposomas que contienen porcentaje de mol de 1 a 20 de PE derivado de PEG, así como los métodos de uso de los mismos, se describen por Woodle et al. (U.S. Patente No. 5,013,556 y 5,356,633) y Martin et al. (U.S. Patente No. 5.213.804 y European Patente No. EP O 496 813 B1). Los liposomas que comprenden una cantidad de otros conjugados de polímeros lípidos se describen en WO 91/05545 and U.S. Patente No. 5,225,212 (ambos de Martin et al.) y en WO 94/20073 (Zalipsky et al.) Los liposomas que incluyen lípidos cerámidos modificados de PEG se describen en WO 96/10391 (Choi et al.). U.S. Patente No. 5,540,935 (Miyazaki et al.) y 5,556,948 (Tagawa et al.) describen liposomas que contienen PEG, los cuales se pueden derivar más tarde a fracciones funcionales sobre sus superficies.
Se conocen en la materia varios liposomas que incluyen ácidos nucleicos. WO 96/40062 a Thierry et al. revela los métodos para encapsular ácidos nucleicos con alto peso molecular en liposomas. U.S. Patente No. 5,264,221 a Tagawa et al. describe liposomas con proteína unida y afirma que los contenidos de tales liposomas pueden contener un ARN antisentido. U.S. Patente No. 5,665,710 a Rahman et al.describe ciertos métodos de encapsulamiento oligodeoxinucleótidos en liposomas. WO 97/04787 a Love et al. revela liposomas que contienen oligonucleótidos antisentido dirigidos al gen raf.
Las transfersomas son incluso otro tipo de liposomas, y son agregados lípidos altamente transformables los cuales se consideran candidatos atractivos para los vehículos de envío de fármacos. Las transfersomas se pueden describir como pequeñas gotas lípidicas que se deforman de tal manera que son capaces de penetrar fácilmente a través de los poros que son más pequeños que las gotas. Las transfersomas se adaptan al ambiente en cual se utilizan, por ejemplo, son auto-optimizables (se adaptan a la forma de los poros en la piel), auto-reparadoras, alcanzan con frecuencia sus objetivos sin fragmentarse, y a menudo se auto-cargan. Para crear transfersomas es posible añadir activadores latelares de superficie, generalmente surfactantes, a la composición liposómica estándar. Las transfersomas se han utilizado para entregar albúmina en suero a la piel. La entrega mediada de transfersoma para albúmina en suero ha demostrado ser tan eficaz como una inyección subcutánea de una solución que contiene albúmina en suero.
Los surfactantes encuentran una amplia aplicación en formulaciones tales como emulsiones (incluyendo microemulsiones) y liposomas. La manera más común de clasificar y medir las propiedades de los distintos tipos de surfactantes, tanto naturales como sintéticos, es mediante el uso del balance hidrófilo/lipófilo (HLB). La naturaleza del grupo hidrofílico (también conocido como "cabeza") proporciona los medios más útiles para categorizar los diferentes surfactantes utilizados en formulaciones (Rieger en Pharmaceutical Dosage Fbrms, Marcel Dekker, Inc., New York, NY, 1988, p. 285). Si la molecula surfactante no se ioniza, se clasifica como un surfactante no iónico. Los surfactantes no-iónicos encuentran una amplia aplicación en productos farmacéuticos y cosméticos y se utilizan con una gran variedad de valores pH. En general, sus valores HLB varían entre 2 a 18, dependiendo de su estructura. Los surfactantes no iónicos incluyen ésteres no-iónicos tales como ésteres de glicol de etileno, ésteres de glicol de propileno, ésteres de gliceril, ésteres poliglicériles, ésteres de sorbitano, ésteres de sacarosa, y ésteres de etoxilado. Las alcanolamidas no-iónicas y ésteres tales como etoxilados de alcohol graso, alcoholes propoxilados, y polímeros
15
25
35
45
55
65
E09015376
14-09-2015
de bloqueo etoxilados/propoxilados también se incluyen en esta clase. Los surfactantes de polioxietileno son los miembros más populares de la clase de surfactantes no iónicos.
Si la molécula de surfactante lleva una carga negativa cuando se disuelve o dispersa en el agua, el surfactante se clasifica como aniónico. Los surfactantes aniónicos incluyen carboxilatos tales como jabones, lactilatos de acilo, amidas de acilo de aminoácidos, ésteres de ácido sulfúrico tales como los sulfatos de alquilo y los sulfatos de alquilo etoxilado, sulfonatos tales como los sulfonatos de benceno de alquilo, isetionatos de alquilo, tauratos de acilo y sulfosuccionatos, y fosfatos. Los miembros más importantes de la clase de surfactantes aniónicos son los sulfatos de alquilo y los jabones.
Si la molécula de surfactante lleva una carga positiva cuando se disuelve o dispersa en el agua, el surfactante se clasifica como catiónico. Los surfactantes catiónicos incluyen sales de amonio cuaternario y aminas etoxiladas. Las sales de amonio cuaternario son los miembros más utilizados de esta clase.
Si la molécula de surfactante tiene la habilidad de llevar ambas cargas, positiva y negativa, el surfactante se clasifica como anfotérico. Los surfactantes anfotéricos incluyen derivados de ácido acrílico, alquilamidas substituidas, N-alquilobetaínas y fosfátidos.
El uso de surfactantes en fármacos, formulaciones y emulsiones (Rieger, en Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc , New York, NY, 1988, p. 285).
Potenciadores de penetración
En una realización, la presente invención emplea varios potenciadores de penetración para efectuar el envío eficaz de ácidos nucleicos, particularmente oligonucleótidos, a la piel de animales. La mayoría de los fármacos están presentes en solución, tanto en forma ionizada como no-ionizada. Sin embargo, solamente lípidos solubles o los fármacos lipofílicos son capaces de cruzar las membranas celulares. Se ha descubierto que incluso los fármacos no-lipofílicos pueden cruzar las membranas celulares si la membrana a cruzar se trata con un potenciador de penetración. Además de ayudar a la difusión de fármacos no-lipofílicos a través de las membranas celulares, los potenciadores de penetración también aumentan la permeabilidad de los fármacos lipofílicos.
Los potenciadores de penetración se pueden clasificar como pertenecientes a una de las cinco categorías amplías, por ejemplo, surfactantes, ácidos grasos, sales biliares, agentes quelantes, y no-quelantes y nosurfactantes (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92). Cada una de las clases mencionadas de potenciadores de penetración se describen en detalle más adelante.
Surfactantes: En relación a la presente invención, los surfactantes (o "agentes activos superficiales") son entidades químicas que, cuando se disuelven en una solución acuosa, reducen la tensión superficial de la solución o la tensión interfacial entre la solución acuosa y otro líquido, con el resultado de que la absorción de oligonucleótidos a través de la mucosa se potencia. Además de las sales biliares y los ácidos grasos, estos potenciadores de penetración incluyen, por ejemplo, lauril sulfato de sodio, éter polioxietileno-9-lauril y éter polioxietileno-20-cetil) (Lee et a1., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92); y emulsiones perfluoroquímicas, como FC
43. Takahashi et al., J. Pharm. Pharmacol., 1988, 40, 252).
Ácidos grasos: Varios ácidos grasos y sus derivados que actúan como potenciadores de penetración incluyen, por ejemplo, ácido oléico, ácido láurico, ácido cáprico (ácido n-decanoico), ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido linoleico, dicaprato, tricaprato, monooleina (1-monooleina-rac-glicerol), dilaurina, ácido caprílico, ácido araquidónico, glicerol 1-monocaprato, 1-dodecilazacicloheptano-2-uno, acilcarnitinas, acilcolinas, C110 ésteres de alquilo de los mismos (por ejemplo, metil, isopropil y t-butilo), y mono-y di-glicéridos de los mismos (por ejemplo, oleato, laurato, caprato, miristato, palmitato, estearato, linoleato, etc.) (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; El Hariri et a1., J. Pharm. Pharmacol., 1992, 44, 651-654).
Sales biliares: El rol fisiológico de la bilis incluye la facilitación del proceso de dispersión y absorción de lípidos y vitaminas solubles en grasa (Brunton, Chapter 38 in: GoodmanGilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9th Ed., Hardman et al. Eds., McGraw-Hill, New York, 1996, pp. 30 934-935). Varias sales biliares naturales, y sus derivados sintéticos, actúan como potenciadores de penetración. Por lo tanto, el término "sales biliares" incluye cualquiera de los componentes que naturalmente ocurren así como también cualquiera de sus derivados sintéticos. Las sales biliares de uso en esta invención incluyen, por ejemplo, ácido cólico (o su sal sódica o colato sódico farmacéuticamente aceptado), ácido dehidrocólico (dehidrocolato sódico), ácido deoxicólico (deoxicolato sódico), ácido glucólico (glucolato sódico), ácido glicólico (glicolato sódico), ácido glicodeoxicólico (glicodeoxicolato sódico), ácido taurocólico (taurocolato sódico), ácido taurodeoxicólico (taurodioxicolato sódico), ácido quenodeoxicólico (quenodeoxicolato sódico), ácido ursodeoxicólico (UDCA), tauro-21, 25-dehidro-fusidato sódico (STDHF), glicodihidrofusidato sódico y éter polioxietileno-9-lauril (POE) (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92; Swinyard, Chapter 39 In: Remington's Pharmaceutical Sciences,
15
25
35
45
55
65
E09015376
14-09-2015
18th Ed., Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990, páginas 782-783; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Yamamoto et al., J. Pharm. Exp. Ther., 1992, 263, 25; Yamashita et al., JL Pharm. Sei., 1990, 79, 579-583).
Agentes Quelantes: Los agentes quelantes, como se utilizan en relación con la presente invención, se pueden definir como componentes que remueven iones metálicos de la solución al formar complejos con ellos, dando como resultado una mejora en la absorción de oligonucleótidos a través de la mucosa. Con respecto a su uso como potenciadores de penetración en la presente invención, los agentes quelantes tienen la ventaja añadida de servir también como inhibidores de ADNasa, ya que la mayoría de las nucleasas de ADN requieren de un ión metálico divalente para la catálisis y además se inhiben por agentes quelantes (Jarrett, J. Chromatogr., 1993, 618, 315-30 339). Los gentes quelantes de uso en la invención incluyen, aunque no se limitan a, etilenodiaminetetracetato disódico (EDTA), ácido cítrico, salicilatos (por ejemplo, salicilato de sodio, 5-metoxisalicilato y homovlinato), derivados N-acil de colágeno, laureth-9 y derivados N-acil de beta-diquetonas (enaminas) (Lee et al., Critical Reviews in Therape utic Drug Carrier Systems, 1991, page 92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Buur et al., J. Control Rel., 1990, 14, 43-51).
No-quelantes no-surfactantes: Tal como se utilizan aquí, los compuestos potenciadores de penetración nosurfactantes no-quelantes que pueden demostrar actividad insignificante como agentes quelantes o como surfactantes, pero que sin embargo, potencian la absorción de oligonucleótidos a través de la mucosa alimenticia (Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33). Esta clase de potenciadores de penetración incluyen, por ejemplo, ureas cíclicas no saturadas, 1-alquilo y derivados de 1-alquenilazacliclo-alcanona (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92); y agentes no-esteroidales antiinflamatorios tales como diclofenaco sódico, indometacina y fenilbutazona (Yamashita et al., J. Pharm. Pharmacol., 1987, 39, 252).
Agentes que potencian la respuesta de oligonucleótidos a nivel celular también se pueden añadir a las composiciones farmacéuticas y a otras composiciones de uso en la presente invención. Por ejemplo, lípidos catiónicos, tales como lipofectina (Junichi et al, U.S. Patente No. 5,705,188), derivados del glicerol catiónico, y moléculas, tales como el polisileno (Lollo et al., PCT Application WO 97/30731), se conocen también por potenciar la respuesta celular de los oligonucleótidos.
Se pueden utilizar otros agentes para potenciar la penetración de los ácidos nucleicos administrados, incluyendo glicoles tales como glicol de etileno y glicol de propileno, pirroles tales como 2-pirrol, azonas, y terpenos tales como limoneno y mentona.
Portadores
Ciertas composiciones de uso en la presente invención también incorporan compuestos portadores en la formulación. Tal como se utiliza en el presente, “compuesto portador“ o “portador“ puede referirse a un ácido nucleico, o análogo del mismo, el cual es inerte (vale decir, no posee actividad biológica por sí mismo), pero se reconoce como ácido nucleico por los procesos in vivo que reducen la biodisponibilidad de un ácido nucleico, refiriéndose a actividad biólogica como, por ejemplo, la degradación biológica del ácido nucleico activo o la promoción de su retirada de la circulación. La coadministración de un ácido nucleico y un compuesto portador, normalmente con un exceso de esta sustancia, puede traducirse en una reducción sustancial de la cantidad del ácido nucleico recuperado en el hígado, riñón u otras reservas extracirculatorias, presumiblemente debido a la competición entre el compuesto portador y el ácido nucleico por un receptor común. Por ejemplo, la recuperación de un oligonucleótido parcialmente fosforotiato en tejido hepático puede reducirse cuando éste se coadministra con ácido polinosínico, sulfato de dextrano, ácido policitídico o ácido 4-acetamido-4‘isotiociano-estilbeno-2,2‘-disulofónico (Miyao et al., Antisense Res. Dev., 1995, 5, 115-121; Takakura et al., Antisense & Nucl. Acid Drug Dev., 1996, 6, 177-183).
Excipientes
A diferencia de un compuesto portador, un “portador farmacéutico” o “excipiente” es un solvente farmacéuticamente aceptable, agente suspendedor o cualquier otro vehículo farmacológicamente inerte para enviar uno o más ácidos nucleicos a un animal. El excipiente puede ser líquido o sólido y se selecciona, con la manera planeada de administración en mente, para proporcionar el volumen, consistencia, etc., necesarios cuando se combina con un ácido nucleico y los otros componentes de una composición farmacéutica dada. Los portadores farmacéuticos habituales incluyen, aunque no se limitan a, agentes vinculantes (por ejemplo, almidón de maíz pregelatinizado, polivinilpirrolidona o metilcelulosa de hidroxipropil, etc.); rellenadores (por ejemplo, lactosa y otros azúcares, celulosa microcristalina, pectina, gelatina, sulfato de calcio, celulosa de etilo, poliacrilatos o fosfato de hidrógeno cálcico, etc.); lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio, talco, sílice, dióxido de silicona coloidal, ácido esteárico, estearatos metálicos, aceites vegetales hidrogenados, almidón de trigo, glicoles polietilenos, benzoato sódico, acetato sódico, etc.); y agentes humectantes (por ejemplo, sulfato lauril sódico, etc.).
15
25
35
45
55
65
E09015376
14-09-2015
Excipientes orgánicos e inorgánicos farmacéuticamente aceptables adecuados para administración no parental que no reaccionan con deterioro a los ácidos nucleicos también pueden utilizarse para formular las composiciones de uso en la presente invención. Los portadores farmacéuticamente aceptables incluyen, aunque no se limitan a, agua, soluciones salinas, alcoholes, glicoles de polietileno, gelatina, lactosa, amilosa, estearato de magnesio, talco, ácido silicílico, parafina viscosa, hidroximetilcelulosa, polivinilpirrolidona y similares.
Las formulaciones para administración tópica de ácidos nucleicos pueden incluir soluciones acuosas estériles y no-estériles, soluciones no-acuosas en solventes comunes tales como alcoholes, o soluciones de los ácidos en líquido o bases de aceite sólida. Las soluciones también pueden contener búferes, diluyentes y otros aditivos adecuados. Los excipientes orgánicos e inorgánicos farmacéuticamente aceptables adecuados para administración no parental que no reaccionan con deterioro a los ácidos nucleicos se pueden utilizar.
Excipientes farmacéuticamente aceptables incluyen, aunque no se limitan a, agua, soluciones salinas, alcoholes, glicoles de polietileno, gelatina, lactosa, amilosa, estearato de magnesio, talco, ácido silicílico, parafina viscosa, hidroximetilcelulosa, polivinilpirrolidona y similares.
Otros Componentes
La composición de uso en la presente invención puede contener adicionalmente otros componentes adjuntos convencionalmente encontrados en las composiciones farmacéuticas, en sus niveles de uso establecidos por la materia. Por lo tanto, por ejemplo, las composiciones pueden contener materiales adicionales, compatibles, farmacéuticamente activos tales como, por ejemplo, antipruríticos, astrigentes, anestésicos locales o agentes antiinflamatorios, o pueden contener materiales adicionales útiles en la formulación física de varias formas farmacéuticas de las composiciones de uso en la presente invención, tales como colorantes, agentes saborizantes, preservativos, antioxidantes, opacificadores, agentes espesantes y estabilizadores. Sin embargo, dichos materiales, al añadirse, no deberían interferir excesivamente con las actividades biológicas de los compuestos de composiciones de uso en la presente invención. Las formulaciones pueden esterilizarse y, si se desea, combinarse con agentes auxiliares, por ejemplo, lubricantes, preservativos, estabilizadores, agentes humectantes, emulsificadores, sales para influenciar la presión osmótica, búferes, colorantes, saborizantes y/o sustancias aromáticas y similares que no reaccionen con deterioro a los ácidos nucleicos de la formulación.
Las suspensiones acuosas pueden contener sustancias que aumenten la viscosidad de la suspensión incluyendo, por ejemplo, carboximetilcelulosa sódica, sorbitol y/o dextrano. La suspensión también puede contener estabilizadores.
Ciertas realizaciones de la invención utilizan composiciones farmacéuticas que contienen (a) uno o más compuestos antisentido y (b) uno u otros agentes quimioterapéuticos que funcionan mediante un mecanismo antisentido. Ejemplos de tales agentes quimioterapéuticos incluyen, pero no se limitan a, daunorubicina, daunomicina, dactinomicina, doxorubicina, epirubicina, idarubicina, esorubicina, bleomicina, mafosfmida, ifosfamida, citosina arabinosa, biscloroetilnitrosurea, busulfano, mitomicina C, actinomicina D, mitramicina, prednisona, hidroxiprogesterona, testosterona, tamoxifeno, decarbazina, procarbazina, hexametilmelamina, pentametilmelamina, mitoxantrona, amsacrina, clorambucilo, metilciclohexilnitrosurea, mostazas de nitrógeno, melfalán, ciclofosfámida, 6mercaptopurina, 6-thioguanina, citarabina, 5-azacitidina, hidroxiurea, deoxicoformicina, 4hidroxiperoxiciclofosforamida, 5-fluorouracilo (5-FU), 5-fluorodeoxiuridina (5-FUDr), metotrexato (MTX), colchicina, taxol, vincristina, vinblastina, etopósido (VP-16), trimetrexato, irinotecán, topotecán, gemcitabina, tenipósido, cisplatina y dietilestilbestrol (DES). Ver, en términos generales, The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 15th Ed. 1987, pp. 1206-1228, Berkow et al., eds., Rahway, N.J. Cuando se utilizan en los compuestos de uso en la invención, dichos agentes quimioterapéuticos pueden utilizarse de forma individual (por ejemplo, 5-FU y oligonucleótido), secuencialmente (por ejemplo, 5-FU y un oligonucleótido por un periodo de tiempo limitado seguido por MTX y oligonucleótido), o en combinación con uno o varios otros tales como agentes terapéuticos (por ejemplo,5-FU, MTX y oligonucleótido, o 5-FU, radioterapia y oligonucleótido). Fármacos anti-inflamatorios, incluyendo, pero no limitándose a fármacos no-esteroidales anti-inflamatorios y corticoesteroides, y fármacos antivirales, incluyendo pero no se limitan a ribivirina, vidarabina, aciclovir y ganciclovir. Véase, en general, The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 15ª ed., Berkow et al., eds., 1987, Rahway, N.J., pp. 2499-2506 y 46-49, respectivamente). Otros agentes quimioterapéuticos no antisentido también se encuentran dentro del alcance de la invención. Dos o más compuestos combinados pueden utilizarse juntos o de manera secuencial.
En otra realización relacionada, las composiciones de la invención pueden contener uno o más oligonucleótidos antisentido dirigidos a un primer ácido nucleico, y uno o más compuestos antisentido adicionales dirigidos a un segundo ácido nucleico. Existen numerosos ejemplos de oligonucleótidos antisentido. Dos o más compuestos combinados pueden utilizarse juntos o secuencialmente.
Se cree que la formulación de las composiciones terapéuticas y su posterior administración está dentro del conocimiento de los expertos en la técnica. La dosificación depende de la gravedad y de la capacidad de respuesta del estado de enfermedad que se va a tratar, y la duración del tratamiento es de varios días a varios meses o hasta
15
25
35
45
55
65
E09015376
14-09-2015
que se logra la curación o una disminución del estado de enfermedad. Los programas de dosificación óptimos pueden calcularse a partir de las mediciones de acumulación del fármaco en el cuerpo del paciente. Los expertos en la técnica pueden determinar con facilidad las dosificaciones óptimas, las metodologías de dosificación y las tasas de repetición. Las dosificaciones óptimas pueden variar dependiendo de la potencia relativa de los oligonucleótidos individuales y pueden estimarse, en general, basándose en las EC50 que son eficaces en modelos animales in vitro e in vivo. En general, una dosificación es de 0,01µg a 100 g por kg de peso corporal, y puede administrarse una o más veces diarias, semanales, mensuales o anuales, o incluso una vez cada 2 a 20 años. Los expertos en la técnica pueden estimar con facilidad las tasas de repetición para la dosificación basándose en los tiempos de residencia y las concentraciones del fármaco medidas en los fluidos corporales o los tejidos. Tras un tratamiento que haya tenido éxito puede ser deseable que el paciente se someta a una terapia de mantenimiento para evitar la recurrencia del estado de enfermedad, en la que el oligonucleótido se administra en dosis de mantenimiento, que varían de 0,01µga 100 g por kg de peso corporal, de una o más veces diarias a una vez cada 20 años.
Aunque la presente invención se ha descrito específicamente según ciertas de sus realizaciones preferidas, los siguientes ejemplos sirven sólo para ilustrar la invención y no pretenden limitarla.
EJEMPLOS
Ejemplo 1
Fosforamiditas de nucleósidos para Oligonucleotide Synthesis desoxi y amiditas de 2'-alcoxi
2'-desoxi-2 'y metoxi fosforamiditas beta-cianoetildiisopropil se compraron de fuentes comerciales (por ejemplo ChemGenes, Needham MA o Glen Research, Inc. Sterling VA). Otros de 2'-0-alcoxi sustituidos amiditas de nucleósido se preparan como se describe en la patente US 5.506.351. Para los oligonucleótidos sintetizados utilizando amiditas de 2'-alcoxi, se utilizó el ciclo estándar para oligonucleótidos no modificados, excepto la etapa de espera después de la entrega del pulso de tetrazol y la base se aumentó a 360 segundos.
Los oligonucleótidos que contienen 5-metil-2 1-desoxicitidina (5-Me-C) nucleótidos se sintetizaron de acuerdo con métodos publicados [Sanghvi, et. al., Nucleic Acids Research, 1993, 21, 3197-3.203] utilizando fosforamiditas disponibles comercialmente (Glen Research, Sterling VA o ChemGenes, Needham MA).
2’-fluoroamiditas
2’-fluorodesoxiadenosina amiditas
Los 2’-fluorooligonucleótidos se sintetizaron como se describió previamente [Kawasaki, et. al ., J. Med. Chem., 1993, 36, 831-841] y la patente de EEUU 5.670.633, incorporada en la presente como referencia. Brevemente, el nucleósido protegido de N6-benzoil-2’-desoxi-2’-fluoroadenosina se sintetizó utilizando la 9-beta-Darabinofuranosiladenina disponible en el mercado como material de partida y mediante procedimientos bibliográficos modificados, en los que el átomo 2’-alfa-flúor es introducido por un SN 2-desplazamiento de un grupo 2’-beta-tritilo. Por tanto, la N6-benzoil-9-beta-D-arabinofuranosiladenina se protegió selectivamente en rendimientos moderados como el intermedio de 3’,5’-ditetrahidropiranilo (THP). La desprotección de los grupos THP y N6-benzoílo se realizó utilizando metodologías convencionales, y se emplearon procedimientos convencionales para obtener los intermedios de 5’-dimetoxitritil-(DMT) y 5’-DMT-3’-fosforamidita.
2’-fluorodesoxiguanosina
La síntesis de 2’-desoxi-2’-fluoroguanosina se realizó utilizando 9-beta-D-arabinofuranosilguanina protegida con tetraisopropildisiloxanilo (TPDS) como material de partida. y la conversión en el intermedio de diisobutirilarabinofuranosilguanosina. Tras la desprotección del grupo TPDS se realizó la protección del grupo hidroxilo con THP para producir arabinofuranosilguanina protegida con diisobutiril di-THP. Tras una O-desacetilación y triflación selectivas se realizó un tratamiento del producto bruto con fluoruro, y después una desprotección de los grupos THP.
Se emplearon metodologías convencionales para obtener las 5’-DMT-y 5’-DMT-3’-fosforamiditas.
2’-fluorouridina
La síntesis de 2’-desoxi-2’-fluorouridina se realizó mediante la modificación de un procedimiento bibliográfico en que el 2,2’-anhidro-1-beta-D-arabinofuranosiluracilo se trató con fluoruro de hidrógeno al 70%piridina. Se emplearon metodologías convencionales para obtener las 5’-DMT-y 5’-DMT-3’-fosforamiditas.
2’-fluorodesoxicitidina
15
25
35
45
55
65
E09015376
14-09-2015
La 2’-desoxi-2’-fluorocitidina se sintetizó mediante la aminación de 2’-desoxi-2’-fluorouridina, seguido de una protección selectiva para producir N4-benzoil-2’-desoxi-2’-fluorocitidina. Se emplearon procedimientos convencionales para obtener las 5’-DMT-y 5’-DMT-3’-fosforamiditas.
Amiditas modificadas con 2’-O-(2-metoxietilo)
Las nucleósido amiditas sustituidas con 2’-O-metoxietilo se prepararon como sigue o, como alternativa, mediante los procedimientos de Martin, P., Helvetica Chimica Acta, 1995, 78, 486-504.
2,2’-anhidro[1-(beta-D-arabinofuranosil)-5-metiluridina]
Se añadieron 5-metiluridina (ribosiltimina, disponible en el mercado en Yamasa, Choshi, Japón) (72,0 g, 0,279 M), difenilcarbonato (90,0 g, 0,420 M) y bicarbonato de sodio (2,0 g, 0,024 M) a DMF (300 ml). La mezcla se calentó a reflujo, con agitación, dejando que el dióxido de carbono gaseoso producido se liberase de una manera controlada. Después de 1 hora la disolución ligeramente oscura se concentró a presión reducida. El jarabe resultante se vertió en éter dietílico (2,5 l) con agitación. El producto formó una goma. El éter se decantó y el residuo se disolvió en una cantidad mínima de metanol (aproximadamente 400 ml). La disolución se vertió en éter fresco (2,5 l) para producir una goma rígida. El éter se decantó y la goma se secó en un horno de vacío (60 ºC a 1 mm de Hg durante 24 h) para producir un sólido que se trituró hasta obtener un polvo de color tostado claro (57 g, rendimiento bruto 85%). El espectro de RMN resultó coherente con la estructura, contaminada con fenol en forma de su sal sódica (aproximadamente 5%). El material se utilizó para posteriores reacciones (o puede purificarse aún más mediante una cromatografía en columna utilizando un gradiente de metanol en acetato de etilo (al 10-25%) para producir un sólido blanco, p.f. 222-224 ºC).
2’-O-metoxietil-5-metiluridina
Se añadieron 2,2’-anhidro-5-metiluridina (195 g, 0,81 M), borato de tris (2-metoxietilo) (231 g, 0,98 M) y 2metoxietanol (1,2 l) a un recipiente de presión de acero inoxidable de 2 l y se colocó en un baño de aceite precalentado a 160ºC. Después de calentar durante 48 horas a 155-160ºC, el recipiente se abrió y la disolución se evaporó hasta la sequedad y se trituró con MeOH (200 ml). El residuo se suspendió en acetona caliente (1 l). Las sales insolubles se retiraron mediante filtración, se lavaron con acetona (150 ml) y el filtrado se evaporó. El residuo (280 g) se disolvió en CH3 CN (600 ml) y se evaporó. Una columna de gel de sílice (3 kg) se cargó con CH2 Cl2/acetona/MeOH (20:5:3) que contenía Et3 NH al 0,5%. El residuo se disolvió en CH2 Cl2 (250 ml) y se adsorbió sobre sílice (150 g) antes de cargarlo a la columna. El producto eluyó con el disolvente de carga para producir 160 g (63%) del producto. Se obtuvo más material volviendo a tratar las fracciones impuras.
2’-O-metoxietil-5’-O-dimetoxitritil-5-metiluridina
La 2’-O-metoxietil-5-metiluridina (160 g, 0,506 M) se coevaporó con piridina (250 ml) y el residuo secado se disolvió en piridina (1,3 l). Se añadió una primera parte alícuota de cloruro de dimetoxitritilo (94,3 g, 0,278 M) y mla mezcla se agitó a temperatura ambiente durante una hora. Se añadió una segunda parte alícuota de cloruro de dimetoxitritilo (94,3 g, 0,278 M) y la reacción se agitó durante una hora más. Entonces se añadió metanol (170 ml) para detener la reacción. Una HPLC mostró la presencia de aproximadamente 70% del producto. El disolvente se evaporó y se trituró con CH2 CN (200 ml). El residuo se disolvió en CHCl3 (1,5 l) y se extrajo con 2 x 500 ml de NaHCO3 saturado y 2 x 500 ml de NaCl saturado. La fase orgánica se secó sobre Na2 SO4, se filtró y se evaporó. Se obtuvieron 275 g de residuo. El residuo se purificó sobre una columna de 3,5 kg de gel de sílice, se cargó y se eluyó con EtOAc/hexano/acetona (5:5:1) que contenía Et2 NH al 0,5%. Las fracciones puras se evaporaron para producir 164 g del producto. Se obtuvieron aproximadamente 20 g más a partir de las fracciones impuras, dando un rendimiento total de 183 g (57%).
3’-O-acetil-2’-O-metoxietil-5’-O-dimetoxitritil-5-metiluridina
Se reunieron 2’-O-metoxietil-5’-O-dimetoxitritil-5-metiluridina (106 g, 0,167 M), DMF/piridina (750 ml de una mezcla 3:1 preparada a partir de 562 ml de DMF y 188 ml de piridina) y anhídrido acético (24,38 ml, 0,258 M) y se agitaron a temperatura ambiente durante 24 horas. La reacción se controló mediante TLC extinguiendo en primer lugar la muestra de TLC mediante la adición de MeOH. Tras haberse completado la reacción, según se considera mediante TLC, se añadió MeOH (50 ml) y la mezcla se evaporó a 35 ºC. El residuo se disolvió en CHCl3 (800 ml) y se extrajo con 2 x 200 ml de bicarbonato de sodio saturado y 2 x 200 ml de NaCl saturado. Las capas acuosas se retroextrajeron con 200 ml de CHCl3. Las capas orgánicas reunidas se secaron con sulfato de sodio y se evaporaron para producir 122 g de residuo (aproximadamente 90% del producto). El residuo se purificó sobre una columna de gel de sílice de 3,5 kg y se eluyó utilizando EtOAc/hexano (4:1). Las fracciones del producto puro se evaporaron para producir 96 g (84%). Se recuperaron 1,5 g más de las fracciones que eluyeron después.
3’-O-acetil-2’-O-metoxietil-5’-O-dimetoxitritil-5-metil-4-triazoluridina
15
25
35
45
55
65
E09015376
14-09-2015
Se preparó una primera disolución disolviendo 3’-O-acetil-2’-O-metoxietil-5’-O-dimetoxitritil-5-metiluridina (96 g, 0,144 m) en CH3 CN (700 ml ) y se dejaron aparte. Se añadió trietilamina (189 ml, 1,44 M) a una disolución de triazol (90 g, 1,3 M) en CH3 CN (1 l), se enfrió hasta -5 ºC y se agitó durante 0,5 horas utilizando un agitador suspendido. Se añadió POCl3 gota a gota a lo largo de un periodo de 30 minutos a la disolución agitada mantenida a 0-10 ºC, y la mezcla resultante se agitó durante 2 horas más. La primera disolución se añadió gota a gota, a lo largo de un periodo de 45 minutos, a la última disolución. La mezcla de reacción resultante se conservó durante la noche en una habitación fresca. Las sales se filtraron de la mezcla de reacción y la disolución se evaporó. El residuo se disolvió en EtOAc (1 l) y los sólidos insolubles se eliminaron mediante filtración. El filtrado se lavó con 1 x 300 ml de NaHCO3 y 2 x 300 ml de NaCl saturado, se secó sobre sulfato de sodio y se evaporó. El residuo se trituró con EtOAc para producir el compuesto del título.
2’-O-metoxietil-5’-O-dimetoxitritil-5-metilcitidina
Una disolución de 3’-O-acetil-2’-O-metoxietil-5’-O-dimetoxitritil-5-metil-4-triazoluridina (103 g, 0,141 M) en dioxano (500 ml) y NH4 OH (30 ml) se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. La disolución de dioxano se evaporó y el residuo se evaporó azeotrópicamente con MeOH (2 x 200 ml). El residuo se disolvió en MeOH (300 ml) y se trasladó a un recipiente de presión de acero inoxidable de 2 litros. Se añadió MeOH (400 ml) saturado con NH3 gaseoso y el recipiente se calentó hasta 100ºC durante 2 horas (una TLC mostró que la conversión había sido completa). Los contenidos del recipiente se evaporaron hasta la sequedad y el residuo se disolvió en EtOAc (500 ml) y se lavó una vez con NaCl saturado (200 ml). Las fases orgánicas se secaron sobre sulfato de sodio y el disolvente se evaporó para producir 85 g (95%) del compuesto del título.
N4-benzoil-2’-O-metoxietil-5’-O-dimetoxitritil-5-metilcitidina
Se disolvió 2’-O-metoxietil-5’-O-dimetoxitritil-5-metilcitidina (85 g, 0,134 M) en DMF (800 ml) y se añadió anhídrido benzoico (37,2 g, 0,165 M) con agitación. Después de agitar durante 3 horas, una TLC mostró que la reacción se había completado en aproximadamente 95%. El disolvente se evaporó y el residuo se evaporó azeotrópicamente con MeOH (200 ml). El residuo se disolvió en CHCl3 (700 ml) y se extrajo con NaHCO3 saturado (2 x 300 ml) y NaCl saturado (2 x 300 ml), se secó sobre MgSO4 , y se evaporó para producir un residuo (96 g). El residuo se cromatografió sobre una columna de sílice de 1,5 kg utilizando EtOAc/hexano (1:1) que contenía Et3 NH al 0,5% como disolvente de elución. Las fracciones del producto bruto se evaporaron para producir 90 g (90%) del compuesto del título.
N4-benzoil-2’-O-metoxietil-5’-O-dimetoxitritil-5-metilcitidina-3’-amidita
Se disolvió N4-benzoil-2’-O-metoxietil-5’-O-dimetoxitritil-5-metilcitidina (74 g, 0,10 M) en CH2 Cl2 (1 l). Se añadieron tetrazoldiisopropilamina (7,1 g) y 2-cianoetoxi-tetra-(isopropil)fosfita (40,5 ml, 0,123 M) con agitación bajo una atmósfera de nitrógeno. La mezcla resultante se agitó durante 20 horas a temperatura ambiente (una TLC mostró que la reacción se había completado en 95%). La mezcla de reacción se extrajo con NaHCO3 saturado (1 x 300 ml) y NaCl saturado (3 x 300 ml). Los lavados acuosos se retroextrajeron con CH2 Cl2 (300 ml) y los extractos se reunieron, se secaron sobre MgSO4 y se concentraron. El residuo obtenido se cromatografió en una columna de sílice de 1,5 kg utilizando EtOAc/hexano (3:1) como disolvente de elución. Las fracciones puras se reunieron para producir 90,6 g (87%) del compuesto del título.
Amiditas 2’-O-(Aminooxietil)nucleósido y amiditas 2’-O-(dimetilaminooxietil)nucleósido
Amiditas 2’-(Dimetilaminooxietil)nucleósido
Las amiditas 2’-(Dimetilaminooxietil)nucleósido [también conocidas en la técnica como amiditas 2’-O(dimetilaminooxietil)nucleósido] se preparan tal y como se describe en los siguientes párrafos. Se preparan adenosina, citidina y amiditas de nucleósido de guanosina de manera similar a la timidina (5-metilburidina) excepto que las aminas exocíclicas se protegen con fracción de benzoil en el caso de la adenosina y la citidina y con isobutiril en el caso de guanosina.
5’-O-tert-Butildifenilsilil-O2 -2’-anhidro-5-metiluridina
Se disolvieron O2-2’-anhidro-5-metiluridina (Pro. Bio. Sint., Varese, Italia, 100,0 g, 0,416 mol), dimetilaminopiridina (0,66 g, 0,013 eq, 0,0054 mmol) en piridina seca (500 ml) a temperatura ambiente bajo una atmósfera de argón y con agitación mecánica. Se añadió tert-Butildifenilclorosilano (125,8 g, 119,0 ml, 1,1 eq, 0,458 mmol) en una porción. La reacción se agitó durante 16 horas a temperatura ambiente. TLC (Rf 0,22, acetato de etil) indicó una reacción completa. La solución se concentró bajo presión reducida con un aceite denso. Esto se dividió entre diclorometano (1 l) y agua salada (1 l). La capa orgánica se secó sobre sulfato sódico y se concentró bajo presión reducida con un aceite denso. El aceite se disolvió en una mezcla 1:1 de acetato de etilo y éter de etilo (600 ml) y la solución se enfrió a -100 ºC. El producto cristalino resultante fue recogido mediante filtración, se lavó con éter de etilo (3x200 ml) y se secó (40 ºC, 1 mm Hg, 24 h) con 149 g (74,8%) de sólido blanco. TLC y NMR fueron
15
25
35
45
55
65
E09015376
14-09-2015
consistentes con el producto puro.
5’-O-tert-Butildifenilsilil-2’-O-(2-hidroxietil)-5-metiluridina
Se añadió borano en tetrahidrofurán (1,0 M, 2,0 eq, 622 ml) en un reactor de presión sin agitar de 2 L de acero inoxidable. En la campana de gases y mediante agitación manual, se añadió de manera precavida y en primer lugar glicol de etileno (350 ml, exceso) hasta que la evolución del hidrógeno disminuyó. Se añadieron 5’-O-tertButildifenilsilil-O2-2’-anhidro-5-metiluridina (149 g, 0,311 mol) y bicarbonato sódico (0,074 g, 0,003 eq) mediante agitación manual. El reactor se selló y se calentó en un baño de aceite hasta que se alcanzó una temperatura interna de 160 ºC y a continuación se mantuvo durante 16 horas (presión < 100 psig). El recipiente se reacción se enfrió a temperatura ambiente y se abrió. TLC (Rf 0-67 para el producto deseado y Rf 0,82 para el producto secundario ara-T, acetato de etilo) indicó aproximadamente la conversión del 70% al producto. Con el fin de evitar la formación de productos secundarios adicionales, la reacción se frenó, se concentró bajo presión reducida (10 a 1 mm Hg) en un baño de agua cálida (40-100 ºC) con el empleo de condiciones más extremas para retirar el glicol de etileno. (De manera alternativa, una vez que desaparece el disolvente de baja cocción, la solución restante puede dividirse entre acetato de etilo y agua. El producto se encontrará en la fase orgánica). El residuo se purificó mediante cromatografía de columna (2 kg gel de sílice, gradiente acetato de etilo-hexano 1:1 a 4:1). Las fracciones apropiadas se combinaron, se vaciaron y se secaron al producto como una espuma blanca y crujiente (84 g, 50%), material de inicio contaminado (17,4 g) y material de inicio puro y reutilizable 20 g. La producción basada en el material inicial menos puro recuperado fue del 58%. TLC y NMR fueron consistentes con el 99% del producto puro.
2’-O-([2-phthalimidoxy)etilo]-5’-t-butildifenilsilil-5-metiluridina
Se mezcló 5’-O-tert-Butildifenilsilil-2’-O-(2-hidroxietil)-5-metiluridina (20 g, 36.98 mmol) con trifenilfosfina (11,63 g, 44,36 mmol) y N-hidroxiftalimida (7,24 g, 44,36 mmol). A continuación se secó sobre P2O2 sometido a un elevado vacío durante dos días as 40 ºC. La mezcla de la reacción se purgó con argón y se añadió THF seco (369,9 ml, Aldrich, botella de sellado seguro) para conseguir una solución clara. Se añadió dietil-azodicarboxilato (6,98 ml, 44,36 mmol) en forma de gotas a la mezcla de la reacción. La velocidad de adición se mantuvo de tal modo que la coloración resultante roja profunda se descargue justo antes de añadir la siguiente gota. Después de que la adición esté completada, la reacción se agitó durante 4 horas. Para ese momento, TLC mostró la finalización de la reacción (etilacetato:hexano, 60:40). El disolvente se evaporó en vacío. El residuo obtenido se colocó en una columna con destellos y se eluyó con acetato de etilo:hexano (60:40), para conseguir 2’-O-([2-phthalimidoxy)etilo]-5’-tbutildifenilsilil-5-metiluridina como espuma blanca (21,819 g, 86%).
5’-O-tert-butildifenilsilil-2’-O-[(2 formadoximinooxi)etil]-5-metiluridina
Se disolvió 2’-O-([2-phthalimidoxy)etilo]-5’-t-butildifenilsilil-5-metiluridina (3,1 g, 4,5 mmol) en CH2Cl2 (4,5 ml) y se añadió metilhidrazina (300 ml, 4,64 mmol) en forma de gotas a -10 ºC a 0 ºC. Tras una hora, la mezcla se filtró y el filtrado se lavó con agua, agua salada y se secó sobre Na2SO4 anhidroso. La solución se concentró para conseguir 2’-O-(aminoetil) timina, que a continuación se disolvió en MeOH (67,5 ml). A esto se le añadió formaldehído (20% solución acuosa, w/w, 1.1 eq.) y la mezcla resultante fue agitada durante una hora. El disolvente se retiro bajo vacío; el residuo fue sometido a cromatografía para obtener 5’-O-tert-butildifenilsilil-2’-O-[(2formadoximinooxi)etil]-5-metiluridina como espuma blanca (1,95 g, 78%).
5’-O-tert-Butildifenilsilil-2’-O-[N, N-dimetilaminooxietil]-5-metiluridina
Se disolvió 5’-O-tert-butildifenilsilil-2’-O-[(2-formadoximinooxi)etil]-5-metiluridina (1,77 g, 3,12 mol) en una solución de 1M piridina p-toluenesulfonato (PPTS) en MeOH seco (30.6 ml). Se añadió cianoborohídrido sódico (0,39 g, 6,13 mmol) a esta solución a 10ºC bajo atmósfera inerte. La mezcla de la reacción fue agitada durante 10 minutos a 10 ºC. A continuación, se retiró el envase de la reacción del baño de hielo y se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas, la reacción fue controlada por TLC (5% MeOH en CH2Cl2). La solución acuosa NaHCO3 (2x20 ml). La fase de acetato de etilo se secó sobre Na2SO4 y se evaporó hasta alcanzar la sequedad. El residuo se disolvió en una solución de 1 M PPTS en MeOH (30,6 ml). Se añadió formaldehído (20% w/w, 30 ml, 3,37 mmol) y la mezcla de la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 10 minutos. La mezcla de la reacción se enfrió a 10 ºC en un baño de hielo, se añadió cianoborohídrido sódico (0,39 g, 6,13 mmol) y la mezcla de la reacción se agitó a 10 ºC durante 10 minutos. Tras 10 minutos, la mezcla de la reacción se retiró del baño de hielo y se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. Se añadió 5% NaHCO3 (25 ml) a la mezcla de la reacción y se extrajo con acetato de etilo (2x25 ml). La capa de acetato de etilo se secó sobre Na2SO4 y se evaporó hasta alcanzar la sequedad. El residuo obtenido fue purificado mediante cromatografía de columna con destellos y se eluyó con 5% MeOH en CH2Cl2 para obtener 5’-O-tert-butildifenilsilil-2’-O-[N,N-dimetilaminooxietil]-5-metiluridina como una espuma blanca (14,6 g, 80%).
2’-O-(dimetilaminooxietil)-5-metiluridina
Se disolvió trietilamina trihidrofluoruro (3,91 ml, 24,0 mmol) en THF seco y trietilamina (1,67 ml, 12 mmol,
15
25
35
45
55
65
E09015376
14-09-2015
seco, mantenido sobre KOH). Esta mezcla de trietilamina-2HF se añadió a continuación a 5’-O-tert-butildifenilsilil-2’O-[N,N-dimetilaminooxietil]-5-metiluridina (1,40 g, 2,4 mmol) y se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas. La reacción fue controlada por TLC (5% MeOH en CH2Cl2). El disolvente fue retirado mediante vacío y el residuo se colocó en una columna de destellos y se eluyó con 10% MeOH en CH2Cl2 para obtener 2’-O-(dimetilaminooxietil)-5metiluridina (766 mg, 92,5%).
5’-O-DMT-2’-O-(dimetilaminooxietil)-5-metiluridina
Se secó 2’-O-(dimetilaminooxietil)-5-metiluridina (750 mg, 2,17 mmol) sobre P2O5 bajo elevado vacío durante toda la noche a 40 ºC. A continuación se co-evaporó con piridina de anhidro (20 ml). El residuo obtenido se disolvió en piridina (11 ml) bajo atmósfera de argón. Se añadieron 4-dimetilaminopiridina (26,5 mg, 2,60 mmol), 4,4’dimetoxitritil cloruro (880 mg, 2,60 mmol) a la mezcla y se agitó la mezcla de la reacción a temperatura ambiente hasta que todo el material inicial despareció. Se retiró la piridina bajo vacío y el residuo fue sometido a cromatografía y se eluyó con 10% MeOH en CH2Cl2 (que contenía unas pocas gotas de piridina) para conseguir 5’-O-DMT-2’-O(dimetilamino-oxietil)-5-metiluridina (1,13 g, 80%).
5’-O-DMT-2’-O-(dimetilaminooxietil)-5-metiluridina-3’-[(2-cianoetil)-N,N-diisopropilfosforamidita]
5’-O-DMT-2’-O-(dimetilaminooxietil)-5-metiluridina (1,08 g, 1,67 mmol) se co-evaporó con tolueno (20ml). Se añadió N,N-diisopropilamina tetrazoide (0,29 g, 1,27 mmol) al residuo y se secó sobre P205 bajo elevado vacío durante la noche a 40 ºC. A continuación, la reacción se disolvió en acetonitrilo de anhidro (8.4 ml) y se añadió 2cianoetil-N,N,N1,N1-tetraisopropilfosforamidita (2,12 ml, 6,08 mmol). La mezcla de la reacción fue mezclada a temperatura ambiente durante 4 horas bajo atmósfera inerte. El progreso de la reacción fue controlado por TLC (hexano:acetato de etil 1:1): El disolvente se evaporó, a continuación el residuo se disolvió en acetato de etilo (70 ml) y se lavó con 5% NaHCO3 acuoso (40 ml). La capa de acetato de etilo se secó sobre Na2SO4 de anhidro y se concentró. El residuo obtenido se sometió a cromatografía (acetato de etilo como eluyente) para conseguir 5’-ODMT-2’-O-(dimetilaminooxietil)-5-metiluridina-3’-[(2-cianoetil)-N, N-diisopropilfosforamidita] como espuma blanca (1,04 g, 74,9%).
Amiditas 2’-(Aminooxietoxi)nucleósido
Amiditas 2’-(Aminooxietoxi)nucleósido [también conocidas en la técnica como amiditas 2’-O-(aminooxietil) se preparan tal y como se describe en los siguientes párrafos. Las amiditas de adenosina, citidina y timidina nucleósido se preparan de manera similar.
N2-isobutiril-6-O-difenilcarbamoil-2’-O-(2-etilacetil)-5’-O-(4,4-dimetoxitritil)guanosina-3’-[(2-cianoetil)N,Ndiisopropilfosforamidita]
El análogo de guanosina 2’-O-aminooxietil puede obtenerse mediante 2’-O-alquilación selectiva de diaminopurina ribosido. Las cantidades multigramos de diaminopurina ribosido pueden adquirirse en Schering AG (Berlín) para proporcionar 2’-O-(2-etilacetil)diaminopurina ribosido junto con una cantidad menor de 3’-O-isómero. 2’O-(2-etilacetil) diaminopurina ribosido puede resolverse y convertirse en 2’-O-(2-etilacetil) guanosina mediante tratamiento con adenosina deaminasa. (McGee, D. P., C., Cook, P. D., Guinosso, C. J.,WO 94/02501 Al 940203.). Los procedimientos de protección estándar deberían permitir que 2’-O-(2-etilacetil) -5’-O-(4,4-dimetoxitritil)guanosina y 2-N-isobutiril-6-O-difenilcarbamoil-2’-O-(2-etilacetil)-5’-O-(4,4-dimetoxitritil)guanosina puedan reducirse para proporcionar 2-Nisobutiril-6-O-difenilcarbamoil-2’-O-(2-etilacetil)-5’-O-(4,4-dimetoxitritil)guanosina. Al igual que anteriormente, el grupo hidroxil puede sustituirse por N-hidroxiftalimida por medio de una reacción Mitsunobu, y el nucleósido protegido puede fosfatizarse como es habitual para producir 2-N-isobutiril-6-O-difenilcarbamoil-2’-O-(2etilacetil)-5’-O-(4,4-dimetoxitritil)guanosina-3’-[(2-cianoetil)-N,N-diisopropilfosforamidita].
Amiditas 2’-dimetilaminoetoxietoxi (2’-DMAEOE) nucleósido
Las amiditas 2-dimetilaminoetoxietoxi nucleósido (también conocidas en la técnica como 2’-Odimetilaminoetoxietoxietil, es decir, 2’-O-CH2-O-CH2-N(CH2)2 o amiditas 2-DMAEOE nucleósido) se preparan del siguiente modo. Otras amiditas de nucleósido se preparan de manera similar.
2’-O-[2(2-N,N-dimetilaminoetoxi)etil]-5-metil uridina
Se añade de manera lenta 2[2-(Dimetilamino) etanol (Aldrich, 6.66 g, 50 mmol) a una solución de borano en tetrahidrofurano (1 M, 10 ml, 10 mmol) agitando en una bomba de 100 ml. Se desarrolla gas de hidrógeno según el sólido se disuelve. O2-,2’-anhidro-5-metiluridina (1,2 g, 5 mmol), y bicarbonato sódico (2.5 mg) se añaden y la bomba se sella, se coloca en un baño de aceite y se calienta a 155ºC durante 26 horas. La bomba se enfría a temperatura ambiente y se abre. Se concentra la solución en crudo y el residuo se divide entre agua (200 ml) y hexanos (200 ml). El fenol de exceso se extrae con acetato de etilo (3x200 ml) y las capas orgánicas combinadas se lavan una vez con agua, se secan sobre sulfato sódico de anhidro y se concentran. El residuo se somete a columna
15
25
35
45
55
65
E09015376
14-09-2015
de gel de sílice usando metanol/cloruro de metileno 1:20 (que tiene un 2% trietilamina) como el eluyente. Cuando las fracciones de columna se concentran se forma un sólido incoloro que se recoge para dar el compuesto del título como un sólido blanco.
5’-O-dimetoxitritil-2’-O-[2(2-N,N-dimetilaminoetoxi)etil)]-5-metil uridina
A 0,5 g (1,3 mmol) de 2’-O-[2(2-N,N-dimetilaminoetoxi)etil]-5-metil uridina en piridina de anhidro (8 ml), se añadieron trietilamina (0,36 ml) y cloruro de dimetoxitritil (DMT-Cl, 0,87 g, 2 eq.) y se agitan durante una hora. La mezcla de la reacción se vierte en agua (200 ml) y se extrae con CH2Cl2 (2x200 ml). Las capas CH2Cl2 combinadas se lavan con solución NaHCO3 saturada, seguido por la solución NaCl saturada y se secan sobre sulfato sódico de anhidro. La evaporación del disolvente seguida por la cromatografía de gel de sílice usando MeOH: CH2Cl2:Et3N (20:1, v/v, con 1% trietilamina) da como resultado el compuesto del título.
5’-O-Dimetoxitritil-2’-O-[2(2-N,N-dimetilaminoetoxi) etil)]-5-metil uridina-3’-O-(cianoetil-N,N-diisopropil) fosforamidita
Se añaden diisopropilaminotetrazolida (0,6 g) y 2-cianoetoxi-N,N-diisopropil fosforamidita (1,1 ml, 2 eq.) a una solución de 5’-O-dimetoxitritil-2’-O-[2(2-N, N-dimetilaminoetoxi) etil)]-5-metil uridina (2,17 g, 3 mmol) disuelta en CH2Cl2 (20 ml) bajo una atmósfera de argón. La mezcla de la reacción se agita durante la noche y el disolvente se evapora. El residuo resultante se purifica mediante una cromatografía de columna con destellos de gel de sílice con acetato de etilo como eluyente para dar el compuesto del título.
Ejemplo 2
Síntesis de oligonucleótido
Se sintetizaron fosfodiéster (P=O) oligonucleótidos sustituidos y no sustituidos con un sintetizador de ADN automático (Applied Biosystems, modelo 380B) utilizando la química de las fosforamiditas convencional con oxidación mediante yodo.
Los fosforotioatos (P=S) se sintetizaron igual que los fosfodiéster oligonucleótidos excepto que la botella de oxidación convencional fue sustituida por una disolución 0,2 M de 1,1-dióxido de 3H-1,2-benzoditiol-3-uno en acetonitrilo para la tiación discontinua de los enlaces fosfita. La etapa de retención de la tiación aumentó hasta 68 segundos y tras ella se realizó una etapa de formación de casquete. Después de la escisión de la columna de CPG y de desbloquear en hidróxido de amonio concentrado a 55 ºC (18 horas), los oligonucleótidos se purificaron precipitando dos veces con 2,5 volúmenes de etanol a partir de una disolución de NaCl 0,5 M. Los fosfinato oligonucleótidos se prepararon como se describe en la patente de EEUU 5.508.270.
Los alquilfosfonato oligonucleótidos se prepararon como se describe en la patente de EEUU 4.469.863.
Los 3’-desoxi-3’-metilenfosfonato oligonucleótidos se prepararon como se describe en las patentes de EEUU 5.610.289 o 5.625.050.
Los fosforamidita oligonucleótidos se prepararon como se describe en la patente de EEUU 5.256.775 o en la patente de EEUU 5.366.878.
Los alquilfosfonotioato oligonucleótidos se prepararon como se describe en las solicitudes PCT publicadas PCT/US94/00902 y PCT/US93/06976 (publicadas como documentos WO 99/17093 y WO 94/02499, respectivamente).
Los 3’-desoxi-3’-aminofosforamidato oligonucleótidos se prepararon como se describe en la patente de EEUU 5.476.925.
Los fosfotriéster oligonucleótidos se prepararon como se describe en la patente de EEUU 5.023.243.
Los boranofosfato oligonucleótidos se prepararon como se describe en las patentes de EEUU 5.130.302 y
5.177.198.
Ejemplo 3
Síntesis de oligonucleósidos
Los oligonucleósidos enlazados con metilenemetilimino, también identificados como oligonucleósidos enlazados con MMI, oligonucleósidos enlazados con metilenedi-metilhidrazo, también identificados como oligonucleósidos enlazados con MDH, y oligonucleósidos enlazados con metilenecarbonilamino, también
15
25
35
45
55
65
E09015376
14-09-2015
identificados como oligonucleósidos enlazados con amida-3, y oligonucleósidos enlazados con metileneaminocarbonil, también identificados como oligonucleósidos enlazados con amida-4, así como compuestos mezclados de espina dorsal que tienen, por ejemplo, MMI alternativos y enlaces P=O o P=S se preparan tal y como se describe en las patentes de EEUU 5.378.825, 5.386.023, 5.489.677, 5.602.240 y 5.610.289.
Los oligonucleósidos enlazados con formacetal o tioformacetal se preparan tal y como se describe en las patentes de EEUU 5.264.562 y 5.264.564.
Los oligonucleósidos enlazados con óxido de etileno se preparan tal y como se describe en la patente de EEUU 5.223.618.
Ejemplo 4
Síntesis de ANP
Se preparan ácidos nucleicos peptídicos (ANP) según uno de diversos procedimientos indicados en Peptide Nucleic Acids (PNA): Synthesis, Properties and Potential Applications, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 1996, 4, 5
23. También pueden prepararse según las patentes de EEUU 5.539.082, 5.700.922, y 5.719.262.
Ejemplo 5
Síntesis de oligonucleótidos quiméricos
Los oligonucleótidos quiméricos, oligonucleósidos o oligonucleótidos/oligonucleósidos mezclados de la invención pueden se de varios tipos diferentes. Estos incluyen un primer tipo donde el segmento “vacío” de nucleósidos enlazados se posiciona entre los segmentos “ala” 5’ y 3’ de nucleósidos enlazados y un segundo tipo “extremo abierto” donde el segmento “vacío” se localiza bien en la terminal 3’ o 5’ del compuesto oligomérico. Los oligonucleótidos del primer tipo también son conocidos en la técnica como “gapmer” u oligonucleótidos con separación. Los oligonucleótidos del segundo tipo también son conocidos en la técnica como “hemimer” o “wingmer”.
[2’-O-Me]--[2’-deoxi]--[2’-O-Me] Oligonucleótidos de fosforotioato quiméricos
Los oligonucleótidos quiméricos que tienen segmentos 2’-O-alquil fosforotioato y oligonucleótidos 2’-deoxi fosforotioato se sintetizan usando un sintetizador de ADN automatizado Applied Biosystems Modelo 380B, como en el caso anterior. Los oligonucleótidos se sintetizan usando el sintetizador automatizado y 2’-deoxi-5’-dimetoxitritil-3’O-fosforamidita para la parte ADN y 5’-dimetoxitritil-2’-O-metil-3’-O-fosforamidita para las alas 5’ y 3’. El ciclo estándar de síntesis se modifica aumentando el paso de espera tras el envío de tetrazola y base a 600 segundos repetidos cuatro veces para ARN y dos veces para 2’-O-metilo. El oligonucleótido totalmente protegido se divide desde el soporte y el grupo fosfato se desprotege en 3:1 amonio/etanol a temperatura ambiente y a continuación se liofiliza hasta alcanzar la sequedad. Posteriormente se realiza el tratamiento en amonio metanólico durante 24 horas a temperatura ambiente para desproteger todas las bases y la muestra se vuelve a liofilizar hasta alcanzar la sequedad. La paleta se suspende en 1M TBAF en THF durante 24 horas a temperatura ambiente para desproteger las posiciones 2’. A continuación la reacción se enfría con 1M TEAA y la muestra se reduce posteriormente a ó del volumen mediante Rotovac antes de desalarse en una columna de exclusión de tamaño G25. A continuación, el oligo recuperado se analiza mediante espectrometría para la producción y para pureza mediante electroforesis capilar y mediante espectrometría de masa.
Oligonucleótidos quiméricos fosforotioato [2’-O-(2-Metoxietil)]--[2’-deoxi]--[2’-O-(2-Metoxietil)]
Los oligonucleótidos quiméricos fosforotioato [2’-O-(2-metoxietil)]--[2’-deoxi]--[2’-O-(2-Metoxietil)] se prepararon siguiendo el procedimiento anteriormente mencionado para el oligonucleótido quimérico 2’-O-metil, con la sustitución de amiditas 2’-O-(metoxietil) por amiditas 2’-O-metil.
Oligonucleótidos quiméricos [2’-O-(2-Metoxietil)Fosfodiéster]--[2’-deoxi Fosforotioato]--[2’-O-(2Metoxietil)Fosfodiéster]
Los oligonucleótidos quiméricos [2’-O-(2-Metoxietil)Fosfodiéster]--[2’-deoxi Fosforotioato]--[2’-O-(2Metoxietil)Fosfodiéster] se preparan siguiendo el procedimiento anteriormente mencionado para el oligonucleótido quimérico 2’-O-metil, con la sustitución de amiditas 2’-O-(metoxietil) por amiditas 2’-O-metil, la oxidación con yodo para generar los enlaces de internucleótido fosfodiéster en el interior de las porciones ala de las estructuras quimérica y la sulfurización utilizando 3,H-1,2, benzoditiol-3-uno 1,1 dióxido (Beaucage Reagent) para generar los enlaces de internucleótido fosfodiéster para el hueco central.
Otros oligonucleótidos quiméricos, oligonucleósidos quiméricos y oligonucleótidos/oligonucleósidos quiméricos mezclados se sintetizan de acuerdo con la patente de EEUU 5.623.065.
15
25
35
45
55
65
E09015376
14-09-2015
Ejemplo 6
Aislamiento de oligonucleótidos
Después de la escisión de la columna de vidrio con tamaño de poro controlado (Applied Biosystems) y de desbloquear en hidróxido de amonio concentrado a 55ºC durante 18 horas, los oligonucleótidos o los oligonucleósidos se purificaron precipitando dos veces en NaCl 0,5 M con 2,5 volúmenes de etanol. Los oligonucleótidos sintetizados se analizaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida sobre geles desnaturalizantes y se consideró que eran al menos 85% de material de longitud completa. Las cantidades relativas de enlaces fosforotioato y fosfodiéster obtenidas en la síntesis se comprobaron periódicamente mediante espectroscopia de resonancia magnética nuclear de 31 P, y en algunos estudios los oligonucleótidos se purificaron mediante HPLC, como se describe en Chiang et al ., J. Biol. Chem., 1991, 266, 18162-18171. Los resultados obtenidos con el material purificado mediante HPLC fueron similares a los obtenidos con el material no purificado mediante HPLC.
Ejemplo 7
Síntesis de oligonucleótidos -formato con placa de 96 pozos
Los oligonucleótidos se sintetizaron por medio de química con fosforamidita en fase sólida P(III) en un sintetizador automatizado capaz de acumular 96 secuencias de manera simultánea en un formato estándar con 96 pozos. Los enlaces de internucleótido fosfodiéster fueron posibles gracias a la oxidación con yodo acuoso. Los enlaces de internucleótido fosforotioato se generaron mediante sulfurización utilizando 3,H-1,2, benzoditiol-3-uno 1,1 dióxido (Beaucage Reagent) en acetonitrilo de anhidro. Las fosforamiditas con base protegida estándar betacianoetildiisopropil se compraron en vendedores comerciales (por ejemplo, PE-Applied Biosystems, Foster City, CA,
o Pharmacia, Piscataway, NJ). Los nucleósidos no-estándar se sintetizan siguiendo los sistemas publicados o los métodos patentados. Se utilizan como fosforamiditas con base protegida beta-cianoetildiisopropil.
Los oligonucleótidos se dividen del soporte y se desprotegen con NH4 OH4 concentrado a elevada temperatura (55-60 ºC) durante 12-16 horas y el producto liberado se seca a continuación en vacío. A continuación, el producto seco se vuelve a suspender en agua estéril para formar una placa maestra desde la cual se diluyen a continuación todas las muestras analíticas y muestras de la placa del test utilizando pipetas robóticas.
Ejemplo 8
Análisis de oligonucleótidos -formato con placa de 96 pozos
La concentración de oligonucleótido en cada pozo se calculó mediante dilución de muestras y espectroscopia de absorción UV. La integridad de longitud completa de los productos individuales se evaluó mediante electroforesis capilar (CE) en el formato con 96 pozos (Beckham P/ACETM MDQ) o, para muestras preparadas individualmente, en un aparato comercial CE (por ejemplo, Beckham P/ACETM 5000, ABI 270). La composición de la base y el eje se confirmó mediante análisis de masa de los compuestos utilizando electroforesis de electrospray-masa. Todas las placas del ensayo se diluyeron a partir de la placa maestra usando pipetas robóticas de único canal y multi-canal. Se calculó que las placas eran aceptables si al menos el 85% de los compuestos sobre la placa eran al menos 85% de longitud completa.
Ejemplo 9
Cultivo celular y tratamiento de los oligonucleótidos
El efecto de compuestos antisentido en expresión de ácido nucleico objetivo puede comprobarse en cualquiera de los tipos celulares siempre y cuando el ácido nucleico objetivo esté presente en niveles mensurables. Esto se puede determinar de manera rutinaria usando, por ejemplo, NCR o el análisis de Northern blot. Los siguientes siete tipos de células son presentados con fines ilustrativos, pero se pueden emplear otros tipos de células, siembre y cuando el objetivo se exprese en el tipo de célula escogido. Esto se puede determinar de manera sencilla mediante métodos habituales en la técnica, por ejemplo, análisis de Northern blot, ensayos de protección de ribonucleasa, o RT-PCR.
Células T-24:
La línea celular T-24 de carcinoma de vejiga celular transicional humana se obtuvo a partir de la Colección Americana de Cultivos Tipo (AMCC) (Manassas, VA). Las células T-24 se cultivaron de manera rutinaria en un medio basal completo McCoy 5A (Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD), se complementaron con 10% de suero de ternero fetal (Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD), 100 unidades de penicilina por ml, y 100
15
25
35
45
55
65
E09015376
14-09-2015
microgramos de estreptomicina por ml (Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD). Las células se pasaron mediante tripsinización y dilución cuando alcanzaron 90% de confluencia. Las células se cultivaron en placas con 96 pozos (Falcon-Primaria #3872) en una densidad de 7000 células/pozo para uso en un análisis RT-PCR.
Para el ensayo Northern blot u otros análisis, las células pueden sembrarse en 100 mm o en otras placas de cultivo de tejido estándar y tratarse de manera similar, empleando volúmenes apropiados de medio y oligonucleótido.
Células A549:
La línea celular A594 de carcinoma pulmonar humano se obtuvo a partir de la Colección Americana de Cultivos Tipo (AMCC) (Manassas, VA). Las células A594 se cultivaron de manera rutinaria en un medio basal DMEM (Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD), se complementaron con 10% de suero de ternero fetal (Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD), 100 unidades de penicilina por ml, y 100 microgramos de estreptomicina por ml (Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD). Las células se pasaron mediante tripsinización y dilución cuando alcanzaron 90% de confluencia.
Células NHDF:
Se obtuvieron fibroblastos dérmicos neonatales humanos (NHDF) de Clonetics Corporation (Walkersville, MD). Las NHDF se mantuvieron de forma rutinaria en medio de crecimiento de fibroblastos (Clonetics Corporation, Walkersville, MD) suplementado según recomienda el fabricante. Las células se mantuvieron hasta 10 transferencias según recomienda el fabricante.
Células HEK:
Se obtuvieron queratinocitos enbriónicos humanos (HEK) de Clonetics Corporation (Walkersville, MD). Las HEK se mantuvieron de forma rutinaria en medio de crecimiento de queratinocitos (Clonetics Corporation, Walkersville, MD) formulado según recomienda el fabricante. Las células se mantuvieron de forma rutinaria hasta 10 transferencias según recomienda el fabricante.
Células HepG2:
La línea celular HepG2 de hepatoblastoma humano se obtuvo de la American Type Culture Collection (Manassas, VA). Las células HepG2 se cultivaron de manera rutinaria en Eagle's MEM se complementaron con 10% de suero de ternera fetal, aminoácidos no esenciales, y piruvato de sodio 1 mM (Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD). Las células se pasaron mediante tripsinización y dilución cuando alcanzaron 90% de confluencia. Las células se cultivaron en placas con 96 pozos (Falcon-Primaria #3872) en una densidad de 7000 células/pozo para uso en un análisis RT-PCR.
Para el ensayo Northern blot u otros análisis, las células pueden cultivarse en 100 mm o en otras placas de cultivo de tejido estándar y tratarse de manera similar, empleando volúmenes apropiados de medio y oligonucleótido.
Células AML12:
La línea celular AML12 (alfa hígado de ratón 12) se obtuvo a partir de hepatocitos de un ratón (cepa CDI, línea MT42) transgénicos para el TGF alfa humano. Las células se cultivaron en una mezcla 1:1 de medio de Eagle modificado por Dulbecco y medio F12 de Ham con 0,005 mg/ml de insulina, 0,005 mg/ml de transferrina, 5 ng/ml seleniuro, 40 ng/ml de dexametasona y 90%; Suero bovino fetal al 10%. Para el subcultivo, se retiró el medio gastado y medio fresco de 0,25% de tripsina, se añadió solución de EDTA 0,03%. Se añadió una solución de tripsina fresca (de 1 a 2 ml) y el cultivo se dejó reposar a temperatura ambiente hasta que las células se desprendieron.
Las células se pasaron mediante tripsinización y dilución cuando alcanzaron 90% de confluencia. Las células se cultivaron en placas con 96 pozos (Falcon-Primaria #3872) en una densidad de 7000 células/pozo para uso en un análisis RT-PCR.
Para el análisis de inmunotransferencia (Northern) u otros análisis, las células se siembran en placas de cultivo tisular de 100 mm o de otro tamaño estándar y se tratan de manera similar usando volúmenes adecuados de medio y oligonucleótido.
Hepatocitos de ratón primarios:
Los hepatocitos de ratón primarios se prepararon de ratones CD-1 adquiridos de Charles River Labs (Wilmington, MA) y se cultivaron de forma rutinaria en medio de unión de hepatocitos (Gibco) suplementado con suero de bovino fetal al 10 % (Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD), 250 nM de dexametanosa (Sigma) y 10
15
25
35
45
55
65
E09015376
14-09-2015
nM de insulina bovina (Sigma). Las células se sembraron en placas de 96 pocillos (Falcon-Primaria #3872) a una densidad de 10000 células/pocillo para utilizar en el análisis de RT-PCR.
Para el análisis de inmunotransferencia (Northern) u otros análisis, las células se colocan en placas de cultivo tisular de 100 mm o de otro tamaño estándar recubiertas con colágeno de cola de rata (200 µg/ml) (Becton Dickinson) y se tratan de manera similar usando volúmenes adecuados de medio y oligonucleótido.
Tratamiento con compuestos antisentido:
Cuando las células alcanzaron un 80 % de confluencia, se trataron con oligonucleótidos. Para las células cultivadas en placas de 96 pocillos, los pocillos se lavaron una vez con 200 µl de medio de suero reducido OPTIMEM™-1 (Gibco BRL) y luego se trataron con 130 µl de OPTI-MEM™-1 que contenía 3,75 µg/ml de LIPOFECTIN™ (Gibco BRL) y la concentración deseada de oligonucleótidos. Después de 4-7 horas de tratamiento, el medio se reemplazó por un medio nuevo. Las células se recolectaron 16-24 horas después del tratamiento con oligonucleótidos.
La concentración de oligonucleótido utilizada varía según la línea celular. Para determinar la concentración óptima de oligonucleótidos para una línea celular particular, las células se tratan con un oligonucleótido de control positivo en un rango de concentraciones. Para las células humanas, el oligonucleótido de control positivo es ISIS 13920 TCCGTCATCGCTCCTCAGGG, SEC ID N.º: 1, un 2’-O-metoxietil gapmero (2’-O-metoxietilos se muestran en negrita) con un esqueleto de fosforotioato que está dirigido a H-ras humano. Para las células de ratón o rata, el oligonucleótido de control positivo es ISIS 15770, ATGCATTCTGCCCCCAAGGA, SEC ID N.º: 2, un 2’-O-metoxietil gapmero (2’-O-metoxietilos se muestran en negrita) con un esqueleto de fosforotioato que está dirigido a c-raf tanto de ratón como de rata. La concentración de oligonucleótido de control positivo que da como resultado un 80 % de inhibición de ARNm de c-Ha-ras (para ISIS 13920) o c-raf (para ISIS 15770) luego se utiliza como la concentración de cribado de nuevos oligonucleótidos en posteriores experimentos para esa línea celular. Si no se logra una inhibición del 80 %, la concentración más baja de oligonucleótido de control positivo que da como resultado una inhibición del 60 % de ARNm de H-ras o c-raf luego se utiliza como la concentración de cribado de oligonucleótidos en posteriores experimentos para esa línea celular. Si no se logra una inhibición del 60 %, esa línea celular particular se considera inadecuada para los experimentos de transfección de oligonucleótidos.
Ejemplo 10
Análisis de la inhibición con oligonucleótidos de la expresión de la apolipoproteína B.
La modulación antisentido de la expresión de la apolipoproteína B puede analizarse mediante varias formas conocidas en la técnica. Por ejemplo, los niveles de ARNm de apolipoproteína B pueden cuantificarse, por ejemplo, mediante análisis de inmunotransferencia (Northern), reacción en cadena de la polimerasa (PCR) competitiva o PCR en tiempo real (RT-PCR). En la actualidad, se prefiere la PCR cuantitativa en tiempo real. Puede realizarse un análisis de ARN sobre el ARN celular total o ARNm de poli(A)+. Los métodos de aislamiento de ARN se explican, por ejemplo, en Ausubel, F. M. y col., Current Protocols in Molecular Biology, volumen 1, páginas 4.1.1-4.2.9 y 4.5.14.5.3, John Wiley & Sons, Inc., 1993. El análisis de inmunotransferencia (Northern) es rutinario en la técnica y se explica, por ejemplo, en Ausubel, F. M. y col., Current Protocols in Molecular Biology, volumen 1, páginas 4.2.14.2.9, John Wiley & Sons, Inc., 1996. La PCR cuantitativa en tiempo real puede realizarse convenientemente usando el sistema de detección de secuencias ABI PRISM™ 7700 disponible en el comercio de PE-Applied Biosystems, Foster City, CA y utilizar de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Los niveles proteicos de apolipoproteína B pueden cuantificarse de varias formas conocidas en la técnica, tales como inmunoprecipitación, análisis de inmunotransferencia (Western), ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) o selección celular activada por fluorescencia (FACS). Los anticuerpos dirigidos a la apolipoproteína B pueden identificarse y obtenerse de diversas fuentes, tales como el catálogo de anticuerpos MSRS (Aerie Corporation, Birmingham, MI), o pueden prepararse mediante métodos de generación de anticuerpos convencionales. Los métodos para la preparación de antisueros policlonales se explican, por ejemplo, en Ausubel, F.
M. y col., Current Protocols in Molecular Biology, volumen 2, páginas 11.12.1-11.12.9, John Wiley & Sons, Inc., 1997. La preparación de anticuerpos monoclonales se explica, por ejemplo, en Ausubel, F. M. y col., Current Protocols in Molecular Biology, volumen 2, páginas 11.4.1-11.11.5, John Wiley & Sons, Inc., 1997.
Los métodos de inmunoprecipitación son estándares en la técnica y pueden encontrarse, por ejemplo, en Ausubel, F. M. y col., Current Protocols in Molecular Biology, volumen 2, páginas 10.16.1-10.16.11, John Wiley & Sons, Inc., 1998. El análisis de inmunotransferencia (Western) es estándar en la técnica y puede encontrarse, por ejemplo, en Ausubel, F. M. y col., Current Protocols in Molecular Biology, volumen 2, páginas 10.8.1-10.8.21, John Wiley & Sons, Inc., 1997. Los ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA) son estándares en la técnica y pueden encontrarse, por ejemplo, en Ausubel, F. M. y col., Current Protocols in Molecular Biology, volumen 2, páginas 11.2.1-11.2.22, John Wiley & Sons, Inc., 1991.
15
25
35
45
55
65
E09015376
14-09-2015
Ejemplo 11
Aislamiento de ARNm de poli(A)+
Se aisló ARNm de poli(A)+ de acuerdo con Miura y col., Clin. Chem., 1996, 42, 1758-1764. Otros métodos para el aislamiento de ARNm de poli(A)+ se explican, por ejemplo, en Ausubel, F. M. y col., Current Protocols in Molecular Biology, volumen 1, páginas 4.5.1-4.5.3, John Wiley & Sons, Inc., 1993. Brevemente, para las células cultivadas en placas de 96 pocillos, el medio de cultivo se retiró de las células y cada pocillo se lavó con 200 µl de PBS frío. A cada pocillo, se añadieron 60 µl de tampón de lisis (10 mM Tris-HCl, pH 7,6, 1 mM EDTA, NaCl 0,5 M, NP-40 al 0,5 %, 20 mM complejo de vanadil-ribonucleósido), la placa se agitó suavemente y luego se incubó a temperatura ambiente durante cinco minutos. Se transfirieron 55 µl de lisado a placas de 96 pocillos recubiertas con Oligo d(T) (AGCT Inc., Irvine, CA). Las placas se incubaron durante 60 minutos a temperatura ambiente, se lavaron 3 veces con 200 µl de tampón de lavado (10 mM Tris-HCl, pH 7,6, 1 mM EDTA, NaCl 0,3 M). Después del lavado final, la placa se secó en toallas de papel para eliminar el exceso de tampón de lavado y después se secó al aire durante 5 minutos. A cada pocillo, se añadieron 60 µl de tampón de elución (5 mM Tris-HCl, pH 7,6), precalentado a 70 ºC; la placa se incubó sobre una placa caliente a 90 ºC durante 5 minutos y el eluato luego se transfirió a una placa nueva de 96 pocillos.
Las células cultivadas en placas de 100 mm o de otro tamaño estándar pueden tratarse de manera similar usando volúmenes adecuados de todas las soluciones.
Ejemplo 12
Aislamiento de ARN total.
El ARN total se aisló usando un kit RNEASY 96™ y tampones adquiridos de Qiagen Inc. (Valencia, CA) de acuerdo con los procedimientos recomendados por el fabricante. Brevemente, para las células cultivadas en placas de 96 pocillos, el medio de crecimiento se retiró de las células y cada pocillo se lavó con 200 µl de PBS frío. A cada pocillo, se añadieron 100 µl de tampón RLT y la placa se agitó vigorosamente durante 20 segundos. Luego se añadieron a cada pocillo 100 µl de etanol al 70 % y los contenidos se mezclaron con una pipeta tres veces hacia arriba y hacia abajo. Luego las muestras se transfirieron a una placa de pocillos RNEASY 96™ unida a un colector QIAVAC™ equipado con una bandeja de recolección de desechos y unido a una fuente de vacío. Se aplicó vacío durante 15 segundos. Se añadió 1 ml de tampón RW1 a cada pocillo de la placa RNEASY 96™ y se aplicó vacío de nuevo durante 15 segundos. Luego se añadió 1 ml de tampón RPE a cada pocillo de la placa RNEASY 96™ y se aplicó vacío durante un periodo de 15 segundos. Luego se repitió el lavado con tampón RPE y se aplicó vacío durante 10 minutos más. Luego se retiró la placa del colector QIAVAC™ y se transfirió a toallas de papel para que se secara. Después se volvió a unir la placa al colector QIAVAC™ equipado con una gradilla de tubos de recolección que contenía tubos de recolección de 1,2 ml. Después el ARN se eluyó colocando con una pipeta 60 µl de agua en cada pocillo, incubándolo durante 1 minuto y luego aplicando vacío durante 30 segundos. La etapa de elución se repitió con 60 µl más de agua.
Las etapas repetitivas de pipeteo y elución pueden automatizarse usando QIAGEN Bio-Robot 9604 (Qiagen, Inc., Valencia, CA). Esencialmente, después de lisar las células en la placa de cultivo, la placa se transfiere a la cubierta robótica donde se llevan a cabo las etapas de pipeteo, tratamiento de DNasa y elución.
Ejemplo 13
Análisis de PCR cuantitativa en tiempo real de los niveles de ARNm de apolipoproteína B.
La cuantificación de los niveles de ARNm de apolipoproteína B se determinó mediante PCR cuantitativa en tiempo real usando el sistema de detección de secuencias ABI PRISM™ 7700 (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Este es un sistema de detección por fluorescencia, de tubo cerrado, no basado en gel, que permite la cuantificación de alto rendimiento de los productos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real. A diferencia de la PCR estándar, en la que los productos de amplificación se cuantifican después de completar la PCR, los productos de la PCR cuantitativa en tiempo real se cuantifican a medida que se acumulan. Esto se logra al incluir, en la reacción de PCR, una sonda de oligonucleótidos que se aparea específicamente entre los cebadores de PCR directos e inversos y contiene dos colorantes fluorescentes. Un colorante indicador (por ejemplo, JOE, FAM o VIC, obtenidos de Operon Technologies Inc., Alameda, CA o de PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) se une al extremo 5’ de la sonda y un colorante inactivador (por ejemplo, TAMRA, obtenido de Operon Technologies Inc., Alameda, CA o de PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) se une al extremo 3’ de la sonda. Cuando la sonda y los colorantes están intactos, la emisión del colorante indicador se inactiva por la proximidad del colorante inactivador 3’. Durante la amplificación, el apareamiento de la sonda con la secuencia diana crea un sustrato que puede escindirse por la actividad de 5'exonucleasa de la Taq polimerasa. Durante la fase de extensión del ciclo de amplificación por PCR, la escisión de la sonda mediante Taq polimerasa libera el colorante indicador del resto de la sonda (y, en consecuencia, de la porción
15
25
35
45
55
65
E09015376
14-09-2015
inactivadora) y se genera una señal fluorescente específica de secuencia. Con cada ciclo, las moléculas del colorante indicador adicionales se escinden de sus sondas respectivas y se controla la intensidad de la fluorescencia en intervalos regulares mediante un láser óptico integrado en el sistema de detección de secuencias ABI PRISM™ 7700. En cada ensayo, una serie de reacciones paralelas que contienen diluciones seriales de ARNm de las muestras de control sin tratar genera una curva estándar que se usa para cuantificar el porcentaje de inhibición después del tratamiento con oligonucleótidos antisentido de las muestras de ensayo.
Antes del análisis por PCR cuantitativa, los conjuntos de cebador-sonda específicos del gen diana que se analiza se evalúan para determinar su capacidad de ser "multiplexados" con una reacción de amplificación GAPDH. En la multiplexación, tanto el gen diana como el gen estándar interno GAPDH se amplifican simultáneamente en una sola muestra. En este análisis, el ARNm aislado de las células sin tratar se diluye en serie. Cada dilución se amplifica en presencia de conjuntos de cebador-sonda específicos solo de GAPDH, solo del gen diana (“monoplexación”) o de ambos (multiplexación). Después de la amplificación por PCR, se generan curvas estándares de señal de GAPDH y ARNm diana como función de la dilución de las muestras monoplexadas y multiplexadas. Si tanto la pendiente como el coeficiente de correlación de las señales de GAPDH y diana generadas de las muestras multiplexadas se encuentran dentro del 10 % de sus valores correspondientes generados de las muestras monoplexadas, el conjunto de cebador-sonda específico de esa diana se considera multiplexable. También se conocen en la técnica otros métodos de PCR.
Los reactivos de PCR se obtuvieron de PE-Applied Biosystems, Foster City, CA. Las reacciones de RT-PCR se realizaron añadiendo 25 µl de cóctel de PCR (1 x tampón A TAQMANTM, 5,5 mM MgCl2, 300 µM de cada dATP, dCTP y dGTP, 600 µM de dUTP, 100 nM de cada cebador directo, cebador inverso y sonda, 20 unidades de inhibidor de RNasa, 1,25 unidades de AMPLITAQ GOLDTM y 12,5 unidades de transcriptasa inversa MuLV) a placas de 96 pocillos que contenían 25 µl de solución de ARN total. La reacción en tiempo real se llevó a cabo mediante incubación durante 30 minutos a 48ºC. Después de una incubación durante 10 minutos a 95ºC para activar AMPLITAQ GOLDTM, se llevaron a cabo 40 ciclos de un protocolo de PCR de dos etapas: 95ºC durante 15 segundos (desnaturalización) y, luego, 60 ºC durante 1,5 minutos (apareamiento/extensión).
Las cantidades de diana génica obtenidas por RT-PCR en tiempo real se normalizan usando el nivel de expresión de GAPDH, un gen cuya expresión es constante, o cuantificando el ARN total mediante RiboGreen™ (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR). La expresión de GAPDH se cuantifica mediante RT-PCR en tiempo real, ejecutándola de manera simultánea con la diana, multiplexándola o por separado. El ARN total se cuantifica usando un reactivo de cuantificación de ARN RiboGreen™ de Molecular Probes. Los métodos de cuantificación de ARN mediante RiboGreen™ se explican en Jones, L. J. y col., Analytical Biochemistry, 1998, 265, 368-374.
En este ensayo, se colocan con una pipeta 175 µl de reactivo de trabajo RiboGreen™ (reactivo RiboGreen™ diluido 1:2865 en 10 mM TrisHCl, 1 mM EDTA, pH 7,5) en una placa de 96 pocillos que contiene 25 µl de ARN celular purificado. La placa se lee en un lector CytoFluor 4000 (PE Applied Biosystems) con excitación a 480 nm y emisión a 520 nm.
Las sondas y los cebadores de la apolipoproteína B humana se diseñaron para que se hibridaran con una secuencia de apolipoproteínas B humanas usando la información de secuencias publicada (número de acceso a GenBank NT_000384, que se incorpora en la presente como SEC ID N.º: 3). Para la apolipoproteína B humana, los cebadores de PCR fueron: cebador directo: TGCTAAAGGCACATATGGCCT (SEC ID N.º: 4), cebador inverso: CTCAGGTTGGACTCTCCATTGAG (SEC ID N.º: 5) y la sonda de PCR fue: FAM-CTTGTCAGAGGGATCCTAACACTGGCCG-TAMRA (SEC ID N.º: 6), en la que FAM (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) es el colorante indicador fluorescente y TAMRA (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) es el colorante inactivador. Para el GAPDH humano, los cebadores de PCR fueron:
cebador directo: GAAGGTGAAGGTCGGAGTC (SEC ID N.º: 7); cebador inverso: GAAGATGGTGATGGGATTTC (SEC ID N.º: 8); y la sonda de PCR fue: 5’ JOE-CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC-TAMRA 3’ (SEC ID N.º: 9), en la que JOE (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) es el colorante indicador fluorescente y TAMRA (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) es el colorante inactivador.
Las sondas y los cebadores de la apolipoproteína B de ratón se diseñaron para que se hibridaran con una secuencia de apolipoproteínas B de ratón usando la información de secuencias publicada (número de acceso a GenBank M35186, que se incorpora en la presente como SEC ID N.º: 10). Para la apolipoproteína B de ratón, los cebadores de PRC fueron: cebador directo: CGTGGGCTCCAGCATTCTA (SEC ID N.º: 11); cebador inverso: AGTCATTTCTGCCTTTGCGTC (SEC ID N.º: 12); y la sonda de PCR fue: FAM-CCAATGGTCGGGCACTGCTCAA-TAMRA (SEC ID N.º: 13), en la que FAM (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) es el colorante indicador fluorescente y TAMRA (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) es el colorante inactivador. Para el GAPDH de ratón, los cebadores de PCR fueron:
cebador directo: GGCAAATTCAACGGCACAGT (SEC ID N.º: 14); cebador inverso:
15
25
35
45
55
65
E09015376
14-09-2015
GGGTCTCGCTCCTGGAAGAT (SEC ID N.º: 15); y la sonda de PCR fue: 5’ JOE-AAGGCCGAGAATGGGAAGCTTGTCATC-TAMRA 3’ (SEC ID N.º: 16), en la que JOE (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) es el colorante indicador fluorescente y TAMRA (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) es el colorante inactivador.
Ejemplo 14
Análisis de inmunotransferencia (Northern) de los niveles de ARNm de la apolipoproteína B.
Dieciocho horas después del tratamiento antisentido, las monocapas celulares se lavaron dos veces con PBS frío y se lisaron en 1 ml de RNAZOL™ (TEL-TEST "B" Inc., Friendswood, TX). El ARN total se preparó de acuerdo con los protocolos recomendados por el fabricante. Se fraccionaron 20 microgramos de ARN total mediante electroforesis a través de geles de agarosa al 1,2 % que contenían formaldehído al 1,1 % usando un sistema tampón MOPS (AMRESCO, Inc. Solon, OH). El ARN se transfirió del gel a membranas de nailon HYBOND™-N+ (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) mediante transferencia capilar durante la noche usando un sistema tampón de transferencia Northern/Southern (TEL-TEST "B" Inc., Friendswood, TX). La transferencia de ARN se confirmó mediante visualización UV. Las membranas se fijaron mediante reticulación UV usando un reticulador UV STRATALINKER™ 2400 (Stratagene, Inc., La Jolla, CA) y después se analizaron usando una solución de hibridación QUICKHYB™ (Stratagene, La Jolla, CA) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante para las condiciones restrictivas.
Para detectar la apolipoproteína B humana, se preparó una sonda específica de apolipoproteína B humana mediante PCR usando el cebador directo TGCTAAAGGCACATATGGCCT (SEC ID N.º: 4) y el cebador inverso CTCAGGTTGGACTCTCCATTGAG (SEC ID N.º: 5). Para normalizar las variaciones en la eficacia de carga y transferencia, se retiraron las membranas y se analizaron para evaluar el ARN de gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) humano (Clontech, Palo Alto, CA).
Para detectar la apolipoproteína B de ratón, se preparó una sonda específica de apolipoproteína B humana mediante PCR usando el cebador directo CGTGGGCTCCAGCATTCTA (SEC ID N.º: 11) y el cebador inverso AGTCATTTCTGCCTTTGCGTC (SEC ID N.º: 12). Para normalizar las variaciones en la eficacia de carga y transferencia, se retiraron las membranas y se analizaron para evaluar el ARN de gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) de ratón (Clontech, Palo Alto, CA).
Las membranas hibridadas se visualizaron y cuantificaron mediante el software PHOSPHORIMAGER™ e IMAGEQUANT™ v3.3 (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA). Los datos se normalizaron a los niveles de GAPDH en los controles sin tratar.
Ejemplo 15
Inhibición antisentido de la expresión de la apolipoproteína B humana mediante oligonucleótidos de fosforotioato quiméricos que tienen flancos 2’-MOE y un espacio desoxi.
Se diseñó una serie de oligonucleótidos para dirigirlos a diferentes regiones del ARN de la apolipoproteína B humana usando las secuencias publicadas (número de acceso a GenBank NT_000384, que se incorpora en la presente como SEC ID N.º: 3). Los oligonucleótidos se muestran en la Tabla 1. "Sitio diana" indica el primer nucleótido (extremo 5’) numerado en la secuencia diana particular al que se fija el oligonucleótido. Todos los compuestos de la Tabla 1 son oligonucleótidos quiméricos ("gapmeros") de 20 nucleótidos de longitud, compuestos por una región de “espacio” central que consiste en diez 2’-desoxinucleótidos, que están flanqueados en ambos lados (direcciones 5’ y 3’) por “flancos” de cinco nucleótidos. Los flancos están compuestos por 2’-metoxietil (2’-MOE) nucleótidos. Las uniones entre nucleósidos (esqueleto) son fosforotioato (P=S) a lo largo del oligonucleótido. Todos los restos de citidina son 5-metilcitidinas. Los compuestos se analizaron para determinar su efecto en los niveles de ARNm de la apolipoproteína B humana en células HepG2 mediante PCR cuantitativa en tiempo real, como se describe en otros ejemplos de la presente. Los datos son datos promedio de dos experimentos. Si está presente, "N.D." indica "sin datos".
E09015376
14-09-2015
Tabla 1 Inhibición de los niveles de ARNm de la apolipoproteína B humana mediante oligonucleótidos de fosforotioato quiméricos que tienen flancos 2’-MOE y un espacio desoxi
imagen1
E09015376
14-09-2015
imagen2
Como se muestra en la Tabla 1, las SEC ID N.º 17, 18, 19, 21, 23, 25, 27, 31, 38, 43, 46, 51, 52, 53, 55, 57, 62, 63 y 66 mostraron al menos un 30 % de inhibición de la expresión de la apolipoproteína B humana en este ensayo y, por lo tanto, son preferidas. Los sitios diana con los que estas secuencias preferidas son complementarias se denominan en la presente “sitios activos” y, por lo tanto, son sitios preferidos como diana de los compuestos de
25 uso de la presente invención. Debido a que la apolipoproteína B existe en dos formas en los mamíferos (ApoB-48 y ApoB-100) que son colineales en el terminal amino, los oligonucleótidos antisentido que se dirigen a los nucleótidos 1-6530 se hibridan con ambas formas, mientras que los que se dirigen a los nucleótidos 6531-14121 son específicos de la forma alargada de la apolipoproteína B.
Ejemplo 16
Inhibición antisentido de la expresión de la apolipoproteína B humana mediante oligonucleótidos de fosforotioato quiméricos que tienen flancos 2’-MOE y un espacio desoxi -Estudio de respuesta a la dosis.
35 Se investigó adicionalmente un subconjunto de los oligonucleótidos antisentido del Ejemplo 15 en estudios de respuesta a la dosis. Las dosis de tratamiento fueron 50, 150 y 250 nM. Los compuestos se analizaron para determinar su efecto en los niveles de ARNm de la apolipoproteína B humana en células HepG2 mediante PCR cuantitativa en tiempo real, como se describe en otros ejemplos de la presente. Los datos son datos promedio de dos experimentos y se muestran en la Tabla 2.
Tabla 2
Inhibición de los niveles de ARNm de la apolipoproteína B humana mediante oligonucleótidos de fosforotioato quiméricos que tienen flancos 2’-MOE y un espacio desoxi
Porcentaje de inhibición
ISIS N.°
50 nM 150 nM 250 nM
147788
54 63 72
147806
23 45 28
147816
25 81 65
147820
10 0 73
Ejemplo 17
Inhibición antisentido de la expresión de la apolipoproteína B de ratón mediante oligonucleótidos de 55 fosforotioato quiméricos que tienen flancos 2’-MOE y un espacio desoxi.
Se diseñó una serie de oligonucleótidos para dirigirlos a diferentes regiones del ARN de la apolipoproteína B de ratón usando las secuencias publicadas (número de acceso a GenBank M35186, que se incorpora en la presente como SEC ID N.º: 10). Los oligonucleótidos se muestran en la Tabla 3. "Sitio diana" indica el primer nucleótido (extremo 5’) numerado en la secuencia diana particular al que se fija el oligonucleótido. Todos los compuestos de la Tabla 3 son oligonucleótidos quiméricos ("gapmeros") de 20 nucleótidos de longitud, compuestos por una región de “espacio” central que consiste en diez 2’-desoxinucleótidos, que están flanqueados en ambos lados (direcciones 5’ y 3’) por “flancos” de cinco nucleótidos. Los flancos están compuestos por 2’-metoxietil (2’-MOE) nucleótidos. Las uniones entre nucleósidos (esqueleto) son fosforotioato (P=S) a lo largo del oligonucleótido.
65 Todos los restos de citidina son 5-metilcitidinas. Los compuestos se analizaron para determinar su efecto en los
E09015376
14-09-2015
niveles de ARNm de la apolipoproteína B de ratón en hepatocitos primarios mediante PCR cuantitativa en tiempo real, como se describe en otros ejemplos de la presente. Los datos son datos promedio de dos experimentos. Si está presente, "N.D." indica "sin datos".
Tabla 3 Inhibición de los niveles de ARNm de la apolipoproteína B de ratón mediante oligonucleótidos de fosforotioato quiméricos que tienen flancos 2’-MOE y un espacio desoxi
imagen3
E09015376
14-09-2015
imagen4
Como se muestra en la Tabla 3, las SEC ID N.º 71, 74, 76, 78, 81, 83, 84, 87, 88, 90, 101, 102, 103, 109,
25 111, 111, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120 y 121 mostraron al menos un 50 % de inhibición de la expresión de la apolipoproteína B de ratón en este ensayo y, por lo tanto, son preferidas. Los sitios diana con los que estas secuencias preferidas son complementarias se denominan en la presente “sitios activos” y, por lo tanto, son sitios preferidos como diana de los compuestos descritos en la presente.
Ejemplo 18
Inhibición antisentido de la expresión de la apolipoproteína B de ratón mediante oligonucleótidos de fosforotioato quiméricos que tienen flancos 2’-MOE y un espacio desoxi -Estudio de respuesta a la dosis.
35 Se investigó adicionalmente un subconjunto de los oligonucleótidos antisentido del Ejemplo 17 en estudios de respuesta a la dosis. Las dosis de tratamiento fueron 50, 150 y 300 nM. Los compuestos se analizaron para determinar su efecto en los niveles de ARNm de la apolipoproteína B de ratón en hepatocitos primarios mediante PCR cuantitativa en tiempo real, como se describe en otros ejemplos de la presente. Los datos son datos promedio de dos experimentos y se muestran en la Tabla 4.
Tabla 4
Inhibición de los niveles de ARNm de la apolipoproteína B de ratón mediante oligonucleótidos de fosforotioato quiméricos que tienen flancos 2’-MOE y un espacio desoxi
Porcentaje de inhibición
ISIS N.°
50 nM 150 nM 300 nM
147483
56 88 89
147764
48 84 90
147769
3 14 28
147776
0 17 44
Ejemplo 19
Análisis de inmunotransferencia (Western) de los niveles proteicos de la apolipoproteína B.
55 Se llevó a cabo un análisis de inmunotransferencia (Western) mediante métodos estándares. Las células se recolectaron 16-20 h después del tratamiento con oligonucleótidos, se lavaron una vez con PBS, se suspendieron en tampón de Laemmli (100 µl/pocillo), se hirvieron durante 5 minutos y se cargaron en un gel SDS-PAGE al 16 %. El gel se corrió durante 1,5 horas a 150 V y luego se transfirió a membranas para el análisis de inmunotransferencia (Western). Se utilizó un anticuerpo primario adecuado dirigido a la apolipoproteína B, con un anticuerpo secundario radioetiquetado o etiquetado de manera fluorescente dirigido contra las especies de anticuerpos primarios. Las bandas se visualizaron mediante PHOSPHORIMAGER™ (Molecular Dynamics, Sunnyvale CA).
Ejemplo 20
65
15
25
35
45
55
65
E09015376
14-09-2015
Efectos de la inhibición antisentido de la apolipoproteína B (ISIS 147764) en ratones C57BL/6: animales magros v. animales alimentados con una dieta rica en grasas.
Se utilizaron ratones C57BL/6 (una cepa que, según se informó, es susceptible a la formación de placas ateroescleróticas inducida por hiperlipidemia) en los siguientes estudios para evaluar los oligonucleótidos antisentido como posibles compuestos reductores de los niveles lipídicos en ratones magros y en ratones alimentados con una dieta rica en grasas.
Los ratones macho C57BL/6 se dividieron en dos grupos apareados: (1) animales de control naturales (animales magros); y (2) animales alimentados con una dieta rica en grasas (60 % kcal de grasas). Los animales de control recibieron un tratamiento con solución salina y se mantuvieron con una dieta normal para roedores. Después de ayunar durante la noche, los ratones de cada grupo recibieron una dosis intraperitoneal cada tres días con solución salina o 50 mg/kg de ISIS 147764 (SED ID N.°: 109) durante 6 semanas. Al finalizar el estudio y 48 horas después de las inyecciones finales, los animales se sacrificaron y se evaluaron para determinar los niveles de ARNm diana en el hígado, los niveles de colesterol y triglicéridos, los niveles de enzimas hepáticas y los niveles de glucosa en suero. Los resultados de los estudios comparativos se muestran en la Tabla 5.
Tabla 5
Efectos del tratamiento con ISIS 147764 en los niveles de ARNm de la apolipoproteína B, colesterol, lípidos, triglicéridos, enzimas hepáticas y glucosa en los ratones magros y en los ratones alimentados con una dieta rica en grasas.
Grupo de tratamiento
Porcentaje de cambio
Lipoproteínas
Enzimas hepáticas
ARNm
COL VLDL LDL HDL TRIG AST ALT GLUC
Magro – control
-73 -63 Sin cambios -64 -44 -34 Leve disminución Sin cambios Sin cambios
Grupo con dieta rica en grasas
-87 -67 Sin cambios -87 -65 Sin cambios Leve disminución Leve aumento -28
Es evidente a partir de estos datos que el tratamiento con ISIS 147764 disminuyó el colesterol y también las lipoproteínas LDL y HDL y la glucosa en suero tanto en los ratones magros como en los ratones alimentados con una dieta rica en grasas, y que los efectos mostrados se deben, de hecho, a la inhibición de la expresión de la apolipoproteína B según lo confirma la disminución de los niveles de ARNm. No se observaron cambios significativos en los niveles de enzimas hepáticas, lo cual indica que el oligonucleótido antisentido no era tóxico para ninguno de los grupos de tratamiento.
Ejemplo 21
Efectos de la inhibición antisentido de la apolipoproteína B (ISIS 147764) en los ratones alimentados con una dieta rica en grasas; estudio de 6 semanas de duración.
Se realizó un estudio de 6 semanas de duración para investigar aún más los efectos de ISIS 147764 en el metabolismo de los lípidos y la glucosa en los ratones alimentados con una dieta rica en grasas.
Se evaluaron ratones macho C57BL/6 (n=8) alimentados con una dieta rica en grasas (60 % kcal de grasas) durante 6 semanas para determinar los efectos del tratamiento con el oligonucleótido antisentido, ISIS 147764. Los animales de control recibieron un tratamiento con solución salina (50 mg/kg). Un subconjunto de animales recibió una dosis oral diaria (20 mg/kg) de atorvastatina de calcio (Lipitor®, Pfizer Inc.). Después de ayunar durante la noche, todos los ratones, excepto los animales tratados con atorvastatina, recibieron una dosis intraperitoneal cada tres días (dos veces por semana) con 5, 25, 50 mg/kg de ISIS 147764 (SED ID N.°: 109) o solución salina (50 mg/kg) durante 6 semanas. Se analizaron el colesterol y las lipoproteínas en suero a las 0, 2 y 6 semanas. Al finalizar el estudio, los animales se sacrificaron 48 horas después de las inyecciones finales y se evaluaron para determinar los niveles de ARNm diana en el hígado y los niveles de colesterol, lipoproteínas, triglicéridos, enzimas hepáticas (AST y ALT) y glucosa en suero, así como el peso corporal y el peso del hígado, bazo y almohadilla grasa.
Ejemplo 22
Efectos de la inhibición antisentido de la apolipoproteína B (ISIS 147764) en los ratones alimentados con una dieta rica en grasas -Expresión de ARNm en el hígado.
15
25
35
45
55
65
E09015376
14-09-2015
Se evaluaron ratones macho C57BL/6 (n=8) alimentados con una dieta rica en grasas (60 % kcal de grasas) durante 6 semanas para determinar los efectos de ISIS 147764 en la expresión de ARNm. Los animales de control recibieron un tratamiento con solución salina (50 mg/kg). Después de ayunar durante la noche, los ratones recibieron una dosis intraperitoneal cada tres días (dos veces por semana) con 5, 25, 50 mg/kg de ISIS 147764 (SED ID N.°: 109) o solución salina (50 mg/kg) durante 6 semanas. Al finalizar el estudio, los animales se sacrificaron 48 horas después de las inyecciones finales y se evaluaron para determinar los niveles de ARNm diana en el hígado. ISIS 147764 mostró un efecto de respuesta a la dosis, ya que redujo los niveles de ARNm en un 15, 75 y 88 % con las dosis de 5, 25 y 50 mg/kg, respectivamente.
Ejemplo 23
Efectos de la inhibición antisentido de la apolipoproteína B (ISIS 147764) en los niveles de colesterol y triglicéridos en suero.
Se evaluaron ratones macho C57BL/6 (n=8) alimentados con una dieta rica en grasas (60 % kcal de grasas) durante 6 semanas para determinar los efectos de ISIS 147764 en los niveles de colesterol y triglicéridos en suero. Los animales de control recibieron un tratamiento con solución salina (50 mg/kg). Después de ayunar durante la noche, los ratones recibieron una dosis intraperitoneal cada tres días (dos veces por semana) con 5, 25, 50 mg/kg de ISIS 147764 (SED ID N.°: 109) o solución salina (50 mg/kg) durante 6 semanas.
Los niveles de colesterol en suero se midieron a las 0, 2 y 6 semanas y estos datos se muestran en la Tabla 6. Los valores en la tabla se expresan como porcentaje de inhibición y se normalizan con el control salino.
Además del colesterol en suero, al finalizar el estudio, los animales se sacrificaron 48 horas después de las inyecciones finales y se evaluaron para determinar los niveles de triglicéridos.
Los ratones tratados con ISIS 147764 mostraron una reducción del colesterol (240 mg/dl para los animales de control y 225, 125 y 110 mg/dl para las dosis de 5, 25 y 50 mg/kg, respectivamente) y triglicéridos en suero (115 mg/dl para los animales de control y 125, 150 y 85 mg/dl para las dosis de 5, 25 y 50 mg/kg, respectivamente) para normalizar los niveles al finalizar el estudio. Estos datos también se compararon con los efectos de la atorvastatina de calcio en una dosis oral de 20 mg/kg que mostró solo una mínima disminución del 20 % del colesterol en suero a la conclusión del estudio.
Tabla 6
Porcentaje de inhibición de los niveles de colesterol de la apolipoproteína B de ratón mediante ISIS 147764
Porcentaje de inhibición
Tiempo
Solución salina 5 mg/kg 25 mg/kg 50 mg/kg
0 semanas
0 0 0 0
2 semanas
0 5 12 20
6 semanas
0 10 45 55
Ejemplo 24
Efectos de la inhibición antisentido de la apolipoproteína B (ISIS 147764) en los niveles de lipoproteínas.
Se evaluaron ratones macho C57BL/6 (n=8) alimentados con una dieta rica en grasas (60 % kcal de grasas) durante 6 semanas para determinar los efectos de ISIS 147764 en los niveles de lipoproteínas (VLDL, LDL y HDL). Los animales de control recibieron un tratamiento con solución salina (50 mg/kg). Después de ayunar durante la noche, los ratones recibieron una dosis intraperitoneal cada tres días (dos veces por semana) con 5, 25, 50 mg/kg de ISIS 147764 (SED ID N.°: 109) o solución salina (50 mg/kg) durante 6 semanas.
Los niveles de lipoproteínas se midieron a las 0, 2 y 6 semanas y estos datos se muestran en la Tabla 7. Los valores en la tabla se expresan como porcentaje de inhibición y se normalizan con el control salino. Los valores negativos indican que se observó un aumento de los niveles de lipoproteínas.
Estos datos también se compararon con los efectos de la atorvastatina de calcio en una dosis oral diaria de 20 mg/kg a las 0, 2 y 6 semanas.
Estos datos muestran que, con una dosis de 50 mg/kg, ISIS 147764 puede disminuir todas las categorías de lipoproteínas en suero investigadas en mayor medida que la atorvastatina.
E09015376
14-09-2015
Tabla 7
5
15
Porcentaje de inhibición de los niveles de lipoproteína de la apolipoproteína B de ratón mediante ISIS 147764 en comparación con la atorvastatina
Porcentaje de inhibición
Dosis
Lipoproteína
Tiempo (semanas) Solución salina 5 mg/kg 25 mg/kg 50 mg/kg Atorvastatina (20 mg/kg)
VLDL
0 0 0 0 0 0
2
0 25 30 40 15
6
0 10 -30 15 -5
LDL
0 0 0 0 0 0
2
0 -30 10 40 10
6
0 -10 55 90 -10
HDL
0 0 0 0 0 0
2
0 5 10 10 15
6
0 10 45 50 20
Ejemplo 25
Efectos de la inhibición antisentido de la apolipoproteína B (ISIS 147764) en los niveles de AST y ALT en 25 suero.
Se evaluaron ratones macho C57BL/6 (n=8) alimentados con una dieta rica en grasas (60 % kcal de grasas) durante 6 semanas para determinar los efectos de ISIS 147764 en los niveles de enzimas hepáticas (AST y ALT). Los animales de control recibieron un tratamiento con solución salina (50 mg/kg). Después de ayunar durante la noche, los ratones recibieron una dosis intraperitoneal cada tres días (dos veces por semana) con 5, 25, 50 mg/kg de ISIS 147764 (SED ID N.°: 109) o solución salina (50 mg/kg) durante 6 semanas.
Los niveles de AST y ALT se midieron a las 6 semanas y estos datos se muestran en la Tabla 8. Los valores en la tabla se expresan como IU/L. El aumento de los niveles de las enzimas hepáticas ALT y AST indica 35 toxicidad y daño hepático.
Los ratones tratados con ISIS 147764 no mostraron ningún cambio significativo en los niveles de AST durante el curso del estudio en comparación con los controles salinos (105, 70 y 80 IU/L para las dosis de 5, 25 y 50 mg/kg, respectivamente, en comparación con 65 IU/L para el control salino). Los ratones tratados con atorvastatina con una dosis oral diaria de 20 mg/kg presentaron niveles de AST de 85 IU/L.
Los niveles de ALT aumentaron en todos los tratamientos durante el curso del estudio en comparación con
los controles salinos (50, 70 y 100 IU/L para las dosis de 5, 25 y 50 mg/kg, respectivamente, en comparación con 25
IU/L para el control salino). Los ratones tratados con atorvastatina con una dosis oral diaria de 20 mg/kg presentaron
45 niveles de AST de 40 IU/L.
Ejemplo 26
Efectos de la inhibición antisentido de la apolipoproteína B (ISIS 147764) en los niveles de glucosa en suero.
Se evaluaron ratones macho C57BL/6 (n=8) alimentados con una dieta rica en grasas (60 % kcal de grasas) durante 6 semanas para determinar los efectos de ISIS 147764 en los niveles de glucosa en suero. Los animales de control recibieron un tratamiento con solución salina (50 mg/kg). Después de ayunar durante la noche, los ratones recibieron una dosis intraperitoneal cada tres días (dos veces por semana) con 5, 25, 50 mg/kg de ISIS
55 147764 (SED ID N.°: 109) o solución salina (50 mg/kg) durante 6 semanas.
Al finalizar el estudio, los animales se sacrificaron 48 horas después de las inyecciones finales y se evaluaron para determinar los niveles de glucosa en suero. ISIS 147764 mostró un efecto de respuesta a la dosis, ya que redujo los niveles de glucosa en suero a 225, 190 y 180 mg/dl con las dosis de 5, 25 y 50 mg/kg, respectivamente, en comparación con el control salino de 300 mg/dl. Los ratones tratados con atorvastatina con una dosis oral diaria de 20 mg/kg presentaron niveles de glucosa en suero de 215 mg/dl. Estos datos muestran que ISIS 147764 puede reducir los niveles de glucosa en suero en los ratones alimentados con una dieta rica en grasas.
Ejemplo 27
65
15
25
35
45
55
65
E09015376
14-09-2015
Efectos de la inhibición antisentido de la apolipoproteína B (ISIS 147764) en el peso corporal y en el peso del bazo, hígado y almohadilla grasa.
Se evaluaron ratones macho C57BL/6 (n=8) alimentados con una dieta rica en grasas (60 % kcal de grasas) durante 6 semanas para determinar los efectos de ISIS 147764 en el peso corporal y en el peso del bazo, hígado y almohadilla grasa. Los animales de control recibieron un tratamiento con solución salina (50 mg/kg). Después de ayunar durante la noche, los ratones recibieron una dosis intraperitoneal cada tres días (dos veces por semana) con 5, 25, 50 mg/kg de ISIS 147764 (SED ID N.°: 109) o solución salina (50 mg/kg) durante 6 semanas.
Al finalizar el estudio, los animales se sacrificaron 48 horas después de las inyecciones finales y se midió el peso corporal y el peso del bazo, hígado y almohadilla grasa. Estos datos se muestran en la Tabla 8. Los valores se expresan como porcentaje de cambio del peso corporal o peso del órgano en comparación con los animales de control tratados con solución salina. Los datos de los ratones tratados con atorvastatina con una dosis diaria de 20 mg/kg también se muestran en la tabla. Los valores negativos indican una disminución del peso.
Tabla 8
Efectos de la inhibición antisentido de la apolipoproteína B de ratón en el peso corporal y en el peso de los órganos
Porcentaje de cambio
Dosis
Atorvastatina (20 mg/kg)
Tejido
5 mg/kg 25 mg/kg 50 mg/kg
Peso corporal total
5 5 -4 1
Bazo
10 10 46 10
Hígado
18 70 80 15
Grasa
10 6 -47 7
Estos datos muestran una disminución de la grasa en el rango de dosis de ISIS 147764 que es compensada por un aumento del peso del bazo y del hígado con una mayor dosis para obtener una disminución general del peso corporal total.
Ejemplo 28
Efectos de la inhibición antisentido de la apolipoproteína B (ISIS 147764) en ratones con genes inactivados B6.129P-Apoetm1Unc: animales magros v. animales alimentados con una dieta rica en grasas.
Los ratones con genes inactivados B6.129P-ApoEtm1Unc (en adelante denominados ratones con genes inactivados ApoE) que se obtuvieron de The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) son homocigotas de la mutación Apoetm1Unc y muestran un marcado aumento de los niveles de colesterol en plasma total que no se ven afectados por la edad ni el sexo. Estos animales presentan estrías grasas en la aorta próxima a los 3 meses de edad. Estas lesiones aumentan con la edad y progresan hacia lesiones con menos lípidos pero con células más alargadas, lo cual es típico de un estadio más avanzado de la lesión preateroesclerótica.
La mutación en estos ratones se encuentra en el gen de la apolipoproteína E (ApoE). La función principal de la proteína ApoE es transportar el colesterol y los triglicéridos a todo el cuerpo. Estabiliza la estructura lipoproteica, se fija al receptor de lipoproteína de baja densidad (LDLR) y proteínas relacionadas y está presente en una subclase de HDL, lo cual les permite fijarse a LDLR. ApoE se expresa de manera más abundante en el hígado y en el cerebro. Se utilizaron ratones hembra con genes inactivados B6.129P-Apoetm1Unc (ratones con genes inactivados ApoE) en los siguientes estudios para evaluar los oligonucleótidos antisentido como posibles compuestos reductores de los niveles lipídicos.
Los ratones hembra con genes inactivados ApoE variaron de 5 a 7 semanas de edad y se alimentaron con una dieta normal durante dos semanas antes del inicio del estudio. Luego, los ratones con genes inactivados ApoE se alimentaron a voluntad con una dieta que contenía 60 % de grasas con 0,15 % de colesterol agregado para inducir la dislipidemia y la obesidad. Los animales de control se mantuvieron con una dieta rica en grasas sin colesterol agregado. Después de ayunar durante la noche, los ratones de cada grupo recibieron una dosis intraperitoneal cada tres días con solución salina, 50 mg/kg de un oligonucleótido antisentido de control (ISIS 29837 TCGATCTCCTTTTATGCCCG; SEC ID N.°: 124) o 5, 25 o 50 mg/kg de ISIS 147764 (SEC ID N.°: 109) durante 6 semanas.
El oligonucleótido de control es un oligonucleótido quimérico ("gapmero") de 20 nucleótidos de longitud, compuesto por una región de “espacio” central que consiste en diez 2’-desoxinucleótidos, que está flanqueado en ambos lados (direcciones 5’ y 3’) por “flancos” de cinco nucleótidos. Los flancos están compuestos por 2’-metoxietil

Claims (8)

  1. 5
    15
    25
    35
    45
    55
    65
    REIVINDICACIONES
    1. Un oligonucleótido antisentido dirigido a una molécula de ácido nucleico que codifica una apolipoproteína B humana, en donde dicho oligonucleótido es 100 % complementario de dicha molécula de ácido nucleico y es un oligonucleótido quimérico de cadena simple que tiene 20 nucleótidos de longitud y está compuesto por una región de espacio central que consiste en diez 2’-desoxinucleótidos flanqueados en ambos lados por flancos de cinco nucleótidos compuestos por 2’-metoxietil (2’-MOE) nucleótidos, y en donde las uniones entre nucleósidos son fosforotioato (P=S) a lo largo del oligonucleótido, y en donde todos los restos de citidina son 5-metilcitidinas, y en donde dicho oligonucleótido se hibrida específicamente con, e inhibe la expresión de una molécula de ácido nucleico que codifica la apolipoproteína B humana, para usar en:
    (a)
    el tratamiento de un animal que tiene una enfermedad o una afección asociadas a la apolipoproteína B que incluye metabolismo de lípidos anormal;
    (b)
    el tratamiento de un animal que tiene una enfermedad o una afección asociadas a la apolipoproteína B que incluye metabolismo de colesterol anormal;
    (c)
    el tratamiento de un animal que tiene una afección asociada a la apolipoproteína B, en donde la afección es ateroesclerosis;
    (d)
    el tratamiento de un animal que tiene una afección asociada a la apolipoproteína B, en donde la afección es hiperlipidemia;
    (e)
    el tratamiento de un animal que tiene una enfermedad asociada a la apolipoproteína B, en donde la enfermedad es diabetes;
    (f)
    el tratamiento de un animal que tiene una afección asociada a la apolipoproteína B, en donde la afección es obesidad;
    (g)
    el tratamiento de un animal que tiene una enfermedad asociada a la apolipoproteína B, en donde la enfermedad es una enfermedad cardiovascular;
    (h)
    terapia o profilaxis, en donde dicho uso comprende modular los niveles de glucosa en un animal;
    (i)
    terapia o profilaxis, en donde dicho uso comprende modular los niveles de colesterol en suero en un animal;
    (j)
    terapia o profilaxis, en donde dicho uso comprende modular los niveles de lipoproteína en un animal; o
    (k)
    terapia o profilaxis, en donde dicho uso comprende modular los niveles de triglicéridos en suero en un animal.
  2. 2.
    El oligonucleótido para usar de acuerdo con la reivindicación 1(e), en donde la diabetes es diabetes de tipo 2.
  3. 3.
    El oligonucleótido para usar de acuerdo con la reivindicación 1(h), en donde los niveles de glucosa son niveles de glucosa en plasma.
  4. 4.
    El oligonucleótido para usar de acuerdo con la reivindicación 1(h), en donde los niveles de glucosa son niveles de glucosa en suero.
  5. 5.
    El oligonucleótido para usar de acuerdo con la reivindicación 1(h), en donde el animal es un animal diabético.
  6. 6.
    El oligonucleótido para usar de acuerdo con la reivindicación 1(j), en donde la lipoproteína es VLDL.
  7. 7.
    El oligonucleótido para usar de acuerdo con la reivindicación 1(j), en donde la lipoproteína es LDL.
  8. 8.
    El oligonucleótido antisentido para usar de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el animal es un humano.
    85
ES09015376.8T 2001-08-01 2002-07-30 Modulación antisentido de la expresión de la apolipoproteína B Expired - Lifetime ES2546360T3 (es)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US147196 1993-11-03
US09/920,033 US7888324B2 (en) 2001-08-01 2001-08-01 Antisense modulation of apolipoprotein B expression
US920033 2001-08-01
US13598502A 2002-04-30 2002-04-30
US135985 2002-04-30
US10/147,196 US7407943B2 (en) 2001-08-01 2002-05-15 Antisense modulation of apolipoprotein B expression

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2546360T3 true ES2546360T3 (es) 2015-09-22

Family

ID=27384801

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES09015376.8T Expired - Lifetime ES2546360T3 (es) 2001-08-01 2002-07-30 Modulación antisentido de la expresión de la apolipoproteína B

Country Status (10)

Country Link
US (4) US7407943B2 (es)
EP (3) EP1419168A4 (es)
JP (5) JP4471650B2 (es)
AU (1) AU2002326481B2 (es)
CA (1) CA2455228A1 (es)
CY (1) CY1116385T1 (es)
DK (1) DK2174945T3 (es)
ES (1) ES2546360T3 (es)
PT (1) PT2174945E (es)
WO (1) WO2003011887A2 (es)

Families Citing this family (89)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7888324B2 (en) * 2001-08-01 2011-02-15 Genzyme Corporation Antisense modulation of apolipoprotein B expression
US7407943B2 (en) 2001-08-01 2008-08-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of apolipoprotein B expression
PT2336318E (pt) * 2002-11-13 2013-06-12 Genzyme Corp Modulação anti-sentido da expressão de apolipoproteína b
US20060009410A1 (en) * 2002-11-13 2006-01-12 Crooke Rosanne M Effects of apolipoprotein B inhibition on gene expression profiles in animals
US7511131B2 (en) * 2002-11-13 2009-03-31 Genzyme Corporation Antisense modulation of apolipoprotein B expression
JP4986109B2 (ja) * 2002-11-13 2012-07-25 ジェンザイム・コーポレーション アポリポタンパク質ｂ発現のアンチセンス調節
EP2752488B1 (en) 2002-11-18 2020-02-12 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Antisense design
AU2004220556B2 (en) 2003-03-07 2009-05-07 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Therapeutic compositions
EP1615611B1 (en) * 2003-04-09 2013-02-13 Alnylam Pharmaceuticals Inc. iRNA CONJUGATES
CA2521464C (en) * 2003-04-09 2013-02-05 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Irna conjugates
JP4912873B2 (ja) * 2003-04-09 2012-04-11 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド ｉＲＮＡ複合体
US7598227B2 (en) 2003-04-16 2009-10-06 Isis Pharmaceuticals Inc. Modulation of apolipoprotein C-III expression
US7399853B2 (en) * 2003-04-28 2008-07-15 Isis Pharmaceuticals Modulation of glucagon receptor expression
WO2005013901A2 (en) 2003-07-31 2005-02-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds and compositions for use in modulation of small non-coding rnas
US20050261233A1 (en) * 2004-04-21 2005-11-24 Sanjay Bhanot Modulation of glucose-6-phosphatase translocase expression
US20050287558A1 (en) 2004-05-05 2005-12-29 Crooke Rosanne M SNPs of apolipoprotein B and modulation of their expression
AU2011254024B2 (en) * 2004-08-10 2014-08-07 Kastle Therapeutics, Llc Antisense Modulation of Apolipoprotein B Expression
PT2409713E (pt) * 2004-08-10 2015-10-09 Genzyme Corp Oligonucleótidos para utilização em modulação dos níveis de lipoproteínas e colesterol em humanos
CN101133074B (zh) 2004-09-24 2012-05-30 阿尔尼拉姆医药品有限公司 APOB的RNAi调节及其用途
AU2006216514C1 (en) * 2005-02-25 2012-09-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and their uses directed to IL-4R alpha
JP5523705B2 (ja) 2005-08-29 2014-06-18 レグルス・セラピューティクス・インコーポレイテッド Ｍｉｒ−１２２ａをモジュレートする使用方法
AU2006291836B2 (en) * 2005-09-15 2012-02-23 Santaris Pharma A/S RNA antagonist compounds for the inhibition of Apo-Bl00 expression
ES2715625T3 (es) 2006-04-03 2019-06-05 Roche Innovation Ct Copenhagen As Composición farmacéutica que comprende oligonucleótidos antisentido anti-miARN
PL2666859T3 (pl) 2006-04-03 2019-09-30 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Kompozycja farmaceutyczna zawierająca antysensowne oligonukleotydy anty-miRNA
CA3044969A1 (en) 2006-05-05 2007-12-21 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for modulating gene expression
CA2666191C (en) 2006-10-09 2017-07-11 Santaris Pharma A/S Rna antagonist compounds for the modulation of pcsk9
EP2076600A1 (en) * 2006-10-18 2009-07-08 Nastech Pharmaceutical Company Inc. Nicked or gapped nucleic acid molecules and uses thereof
DK2092065T4 (da) * 2006-10-18 2019-10-21 Ionis Pharmaceuticals Inc Antisense-forbindelser
US8093222B2 (en) 2006-11-27 2012-01-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating hypercholesterolemia
EP2453016A1 (en) * 2006-11-27 2012-05-16 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating hypercholesterolemia
US8580756B2 (en) * 2007-03-22 2013-11-12 Santaris Pharma A/S Short oligomer antagonist compounds for the modulation of target mRNA
EP2126079A1 (en) 2007-03-22 2009-12-02 Santaris Pharma A/S Rna antagonist compounds for the inhibition of apo-b100 expression
RU2559536C2 (ru) * 2007-03-24 2015-08-10 Джензим Корпорейшн Введение антисмысловых олигонуклеотидов, комплементарных человеческому аполипопротеину в
JP2010539961A (ja) * 2007-10-04 2010-12-24 サンタリス ファーマ アー／エス ＨＩＦ１αの調節のための短いＲＮＡアンタゴニスト化合物
DK2205737T3 (da) 2007-10-04 2013-05-21 Santaris Pharma As Mikromirer
JP2009171895A (ja) * 2008-01-24 2009-08-06 Hitachi Software Eng Co Ltd 核内ノンコーディングｒｎａの機能解析方法
WO2009109665A1 (en) 2008-03-07 2009-09-11 Santaris Pharma A/S Pharmaceutical compositions for treatment of microrna related diseases
WO2009148605A2 (en) * 2008-06-04 2009-12-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating hypercholesterolemia
WO2010000665A1 (en) * 2008-06-30 2010-01-07 Santaris Pharma A/S Antidote oligomers
WO2010012667A1 (en) 2008-08-01 2010-02-04 Santaris Pharma A/S Micro-rna mediated modulation of colony stimulating factors
US9394333B2 (en) 2008-12-02 2016-07-19 Wave Life Sciences Japan Method for the synthesis of phosphorus atom modified nucleic acids
US9132147B2 (en) 2008-12-31 2015-09-15 Roche Innovation Center Copenhagen Use of LNA ApoB antisense oligomers for the treatment of acute coronary syndromes
WO2010107838A1 (en) 2009-03-16 2010-09-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Targeting apolipoprotein b for the reduction of apolipoprotein c-iii
WO2010122538A1 (en) 2009-04-24 2010-10-28 Santaris Pharma A/S Pharmaceutical compositions for treatment of hcv patients that are non-responders to interferon
MX2011013078A (es) 2009-06-12 2012-02-01 Santaris Pharma As Nuevos compuestos potentes antisentido anti apolipoproteina b (apob).
MX342945B (es) 2009-07-06 2016-10-18 Ontorii Inc * Profármacos de ácido nucleico novedosos y métodos de uso de los mismos.
EP2456870A1 (en) 2009-07-21 2012-05-30 Santaris Pharma A/S Antisense oligomers targeting pcsk9
US20130079382A1 (en) 2009-10-12 2013-03-28 Larry J. Smith Methods and Compositions for Modulating Gene Expression Using Oligonucleotide Based Drugs Administered in vivo or in vitro
WO2012027033A1 (en) * 2010-07-19 2012-03-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for modulating target nuclear and sub-nuclear nucleic acid molecules in cells and animals
US20130225659A1 (en) * 2010-07-19 2013-08-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of nuclear-retained rna
DK2620428T3 (da) 2010-09-24 2019-07-01 Wave Life Sciences Ltd Asymmetrisk hjælpegruppe
US9920317B2 (en) 2010-11-12 2018-03-20 The General Hospital Corporation Polycomb-associated non-coding RNAs
AU2011325956B2 (en) 2010-11-12 2016-07-14 The General Hospital Corporation Polycomb-associated non-coding RNAs
US20150038549A1 (en) 2011-04-20 2015-02-05 Larry J. Smith Methods and Compositions for Modulating Gene Expression Using Components That Self Assemble in Cells and Produce RNAi Activity
KR101800333B1 (ko) 2011-04-27 2017-11-22 아이오니스 파마수티컬즈, 인코포레이티드 아포지방단백질 ｃｉｉｉ （ａｐｏｃｉｉｉ） 발현의 조정
ES2644138T3 (es) 2011-06-13 2017-11-27 Rival S.E.C N,N,N-trialquilpolímeros, métodos para su preparación y usos de los mismos
US9605019B2 (en) 2011-07-19 2017-03-28 Wave Life Sciences Ltd. Methods for the synthesis of functionalized nucleic acids
ES2897565T3 (es) 2011-10-18 2022-03-01 Dicerna Pharmaceuticals Inc Lípidos catiónicos de amina y uso de los mismos
WO2013138662A1 (en) * 2012-03-16 2013-09-19 4S3 Bioscience, Inc. Antisense conjugates for decreasing expression of dmpk
AU2013262709A1 (en) 2012-05-16 2015-01-22 Rana Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating MECP2 expression
SG11201407483YA (en) 2012-05-16 2014-12-30 Rana Therapeutics Inc Compositions and methods for modulating smn gene family expression
US10837014B2 (en) 2012-05-16 2020-11-17 Translate Bio Ma, Inc. Compositions and methods for modulating SMN gene family expression
SG11201500243WA (en) 2012-07-13 2015-04-29 Shin Nippon Biomedical Lab Ltd Chiral nucleic acid adjuvant
SG11201500239VA (en) 2012-07-13 2015-03-30 Wave Life Sciences Japan Asymmetric auxiliary group
KR20240148947A (ko) 2012-07-13 2024-10-11 웨이브 라이프 사이언시스 리미티드 키랄 제어
JP6452614B2 (ja) 2012-11-15 2019-01-16 ロシュ イノベーション センター コペンハーゲン エーエス オリゴヌクレオチドコンジュゲート
WO2014112144A1 (ja) * 2013-01-15 2014-07-24 国立大学法人熊本大学 染色体セントロメア由来のサテライトノンコーディングｒｎａを標的とした核酸抗癌剤、及び該抗癌剤を用いる方法
DK2951305T3 (en) 2013-01-30 2018-10-29 Hoffmann La Roche LNA oligonucleotide KULHYDRATKONJUGATER
CN105008533A (zh) 2013-03-01 2015-10-28 国立大学法人东京医科齿科大学 嵌合单链反义多核苷酸和双链反义试剂
AU2014272526A1 (en) 2013-05-30 2015-12-10 National University Corporation Tokyo Medical And Dental University Double-stranded agents for delivering therapeutic oligonucleotides
SG10201908122XA (en) 2013-06-27 2019-10-30 Roche Innovation Ct Copenhagen As Antisense oligomers and conjugates targeting pcsk9
TW201536329A (zh) 2013-08-09 2015-10-01 Isis Pharmaceuticals Inc 用於調節失養性肌強直蛋白質激酶(dmpk)表現之化合物及方法
WO2015051283A1 (en) 2013-10-04 2015-04-09 Rana Therapeutics, Inc. Compositions and methods for treating amyotrophic lateral sclerosis
EA201691039A1 (ru) 2013-11-20 2016-11-30 Саймабэй Терапьютикс, Инк. Лечение гомозиготной семейной гиперхолестеринемии
WO2015108048A1 (ja) 2014-01-15 2015-07-23 株式会社新日本科学 抗腫瘍作用を有するキラル核酸アジュバンド及び抗腫瘍剤
WO2015108047A1 (ja) 2014-01-15 2015-07-23 株式会社新日本科学 免疫誘導活性を有するキラル核酸アジュバンド及び免疫誘導活性剤
EP3095460A4 (en) 2014-01-15 2017-08-23 Shin Nippon Biomedical Laboratories, Ltd. Chiral nucleic acid adjuvant having anti-allergic activity, and anti-allergic agent
ES2917473T3 (es) 2014-01-16 2022-07-08 Wave Life Sciences Ltd Diseño quiral
DK3119384T3 (en) 2014-03-20 2018-12-03 Cymabay Therapeutics Inc TREATMENT OF INTRAHEPATHIC COLESTASTIC DISEASES
US10272058B2 (en) 2014-03-20 2019-04-30 Cymabay Therapeutics, Inc. Treatment of intrahepatic cholestatic diseases
UA121208C2 (uk) 2014-04-11 2020-04-27 Сімабей Терапьютікс, Інк. Лікування нажхп та насг
WO2016070060A1 (en) 2014-10-30 2016-05-06 The General Hospital Corporation Methods for modulating atrx-dependent gene repression
EP3271460A4 (en) 2015-03-17 2019-03-13 The General Hospital Corporation RNA INTERACTOM OF POLYCOMB REPRESSIVE COMPLEX 1 (PRC1)
KR20250078597A (ko) 2015-11-06 2025-06-02 아이오니스 파마수티컬즈, 인코포레이티드 아포리포프로테인 (a) 발현 조정
US11390867B2 (en) 2016-04-29 2022-07-19 Nanyang Technological University G-quadruplex-containing antisense oligonucleotides
US11306311B2 (en) 2017-06-08 2022-04-19 Chandrasekhar Kanduri Long non-coding RNA in cancer
WO2021224475A1 (en) 2020-05-07 2021-11-11 Xandrax Ab Cancer treatment and diagnosis involving lincrna
EP4396352A4 (en) 2021-09-01 2025-10-01 Ionis Pharmaceuticals Inc COMPOUNDS AND METHODS FOR REDUCING DMPK EXPRESSION
KR20230137242A (ko) * 2022-03-17 2023-10-04 주식회사 에이치피바이오 아포지단백 b100에 특이적으로 결합하는 dna 앱타머 및 상기 dna 앱타머의 용도

Family Cites Families (276)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3687808A (en) 1969-08-14 1972-08-29 Univ Leland Stanford Junior Synthetic polynucleotides
US4469863A (en) 1980-11-12 1984-09-04 Ts O Paul O P Nonionic nucleic acid alkyl and aryl phosphonates and processes for manufacture and use thereof
US4534899A (en) 1981-07-20 1985-08-13 Lipid Specialties, Inc. Synthetic phospholipid compounds
US4426330A (en) 1981-07-20 1984-01-17 Lipid Specialties, Inc. Synthetic phospholipid compounds
US5023243A (en) 1981-10-23 1991-06-11 Molecular Biosystems, Inc. Oligonucleotide therapeutic agent and method of making same
US4476301A (en) 1982-04-29 1984-10-09 Centre National De La Recherche Scientifique Oligonucleotides, a process for preparing the same and their application as mediators of the action of interferon
JPS5927900A (ja) 1982-08-09 1984-02-14 Wakunaga Seiyaku Kk 固定化オリゴヌクレオチド
FR2540122B1 (fr) 1983-01-27 1985-11-29 Centre Nat Rech Scient Nouveaux composes comportant une sequence d'oligonucleotide liee a un agent d'intercalation, leur procede de synthese et leur application
US4605735A (en) 1983-02-14 1986-08-12 Wakunaga Seiyaku Kabushiki Kaisha Oligonucleotide derivatives
US4948882A (en) 1983-02-22 1990-08-14 Syngene, Inc. Single-stranded labelled oligonucleotides, reactive monomers and methods of synthesis
US4824941A (en) 1983-03-10 1989-04-25 Julian Gordon Specific antibody to the native form of 2'5'-oligonucleotides, the method of preparation and the use as reagents in immunoassays or for binding 2'5'-oligonucleotides in biological systems
US4587044A (en) 1983-09-01 1986-05-06 The Johns Hopkins University Linkage of proteins to nucleic acids
US5118800A (en) 1983-12-20 1992-06-02 California Institute Of Technology Oligonucleotides possessing a primary amino group in the terminal nucleotide
US5118802A (en) 1983-12-20 1992-06-02 California Institute Of Technology DNA-reporter conjugates linked via the 2' or 5'-primary amino group of the 5'-terminal nucleoside
US5550111A (en) 1984-07-11 1996-08-27 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education Dual action 2',5'-oligoadenylate antiviral derivatives and uses thereof
FR2567892B1 (fr) 1984-07-19 1989-02-17 Centre Nat Rech Scient Nouveaux oligonucleotides, leur procede de preparation et leurs applications comme mediateurs dans le developpement des effets des interferons
US5430136A (en) 1984-10-16 1995-07-04 Chiron Corporation Oligonucleotides having selectably cleavable and/or abasic sites
US5367066A (en) 1984-10-16 1994-11-22 Chiron Corporation Oligonucleotides with selectably cleavable and/or abasic sites
US5258506A (en) 1984-10-16 1993-11-02 Chiron Corporation Photolabile reagents for incorporation into oligonucleotide chains
US4828979A (en) 1984-11-08 1989-05-09 Life Technologies, Inc. Nucleotide analogs for nucleic acid labeling and detection
FR2575751B1 (fr) 1985-01-08 1987-04-03 Pasteur Institut Nouveaux nucleosides de derives de l'adenosine, leur preparation et leurs applications biologiques
US5166315A (en) 1989-12-20 1992-11-24 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US5185444A (en) 1985-03-15 1993-02-09 Anti-Gene Deveopment Group Uncharged morpolino-based polymers having phosphorous containing chiral intersubunit linkages
US5034506A (en) 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
US5235033A (en) 1985-03-15 1993-08-10 Anti-Gene Development Group Alpha-morpholino ribonucleoside derivatives and polymers thereof
US5405938A (en) 1989-12-20 1995-04-11 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US4762779A (en) 1985-06-13 1988-08-09 Amgen Inc. Compositions and methods for functionalizing nucleic acids
US5317098A (en) 1986-03-17 1994-05-31 Hiroaki Shizuya Non-radioisotope tagging of fragments
JPS638396A (ja) 1986-06-30 1988-01-14 Wakunaga Pharmaceut Co Ltd ポリ標識化オリゴヌクレオチド誘導体
EP0260032B1 (en) 1986-09-08 1994-01-26 Ajinomoto Co., Inc. Compounds for the cleavage at a specific position of RNA, oligomers employed for the formation of said compounds, and starting materials for the synthesis of said oligomers
US4837028A (en) 1986-12-24 1989-06-06 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US4920016A (en) 1986-12-24 1990-04-24 Linear Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5264423A (en) 1987-03-25 1993-11-23 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US5276019A (en) 1987-03-25 1994-01-04 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US4904582A (en) 1987-06-11 1990-02-27 Synthetic Genetics Novel amphiphilic nucleic acid conjugates
EP0366685B1 (en) 1987-06-24 1994-10-19 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine Nucleoside derivatives
US5712257A (en) * 1987-08-12 1998-01-27 Hem Research, Inc. Topically active compositions of mismatched dsRNAs
US5585481A (en) 1987-09-21 1996-12-17 Gen-Probe Incorporated Linking reagents for nucleotide probes
US4924624A (en) 1987-10-22 1990-05-15 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education 2,',5'-phosphorothioate oligoadenylates and plant antiviral uses thereof
US5188897A (en) 1987-10-22 1993-02-23 Temple University Of The Commonwealth System Of Higher Education Encapsulated 2',5'-phosphorothioate oligoadenylates
US5525465A (en) 1987-10-28 1996-06-11 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine Oligonucleotide-polyamide conjugates and methods of production and applications of the same
DE3738460A1 (de) 1987-11-12 1989-05-24 Max Planck Gesellschaft Modifizierte oligonukleotide
US5403711A (en) 1987-11-30 1995-04-04 University Of Iowa Research Foundation Nucleic acid hybridization and amplification method for detection of specific sequences in which a complementary labeled nucleic acid probe is cleaved
ATE151467T1 (de) 1987-11-30 1997-04-15 Univ Iowa Res Found Durch modifikationen an der 3'-terminalen phosphodiesterbindung stabilisierte dna moleküle, ihre verwendung als nukleinsäuresonden sowie als therapeutische mittel zur hemmung der expression spezifischer zielgene
US5082830A (en) 1988-02-26 1992-01-21 Enzo Biochem, Inc. End labeled nucleotide probe
IE61148B1 (en) 1988-03-10 1994-10-05 Ici Plc Method of detecting nucleotide sequences
WO1989009221A1 (en) 1988-03-25 1989-10-05 University Of Virginia Alumni Patents Foundation Oligonucleotide n-alkylphosphoramidates
US5278302A (en) 1988-05-26 1994-01-11 University Patents, Inc. Polynucleotide phosphorodithioates
US5109124A (en) 1988-06-01 1992-04-28 Biogen, Inc. Nucleic acid probe linked to a label having a terminal cysteine
US5216141A (en) 1988-06-06 1993-06-01 Benner Steven A Oligonucleotide analogs containing sulfur linkages
US5175273A (en) 1988-07-01 1992-12-29 Genentech, Inc. Nucleic acid intercalating agents
US5262536A (en) 1988-09-15 1993-11-16 E. I. Du Pont De Nemours And Company Reagents for the preparation of 5'-tagged oligonucleotides
US5194599A (en) 1988-09-23 1993-03-16 Gilead Sciences, Inc. Hydrogen phosphonodithioate compositions
GB8824593D0 (en) 1988-10-20 1988-11-23 Royal Free Hosp School Med Liposomes
US5512439A (en) 1988-11-21 1996-04-30 Dynal As Oligonucleotide-linked magnetic particles and uses thereof
US5599923A (en) 1989-03-06 1997-02-04 Board Of Regents, University Of Tx Texaphyrin metal complexes having improved functionalization
US5457183A (en) 1989-03-06 1995-10-10 Board Of Regents, The University Of Texas System Hydroxylated texaphyrins
US5354844A (en) 1989-03-16 1994-10-11 Boehringer Ingelheim International Gmbh Protein-polycation conjugates
US5108921A (en) 1989-04-03 1992-04-28 Purdue Research Foundation Method for enhanced transmembrane transport of exogenous molecules
US5391723A (en) 1989-05-31 1995-02-21 Neorx Corporation Oligonucleotide conjugates
US5256775A (en) 1989-06-05 1993-10-26 Gilead Sciences, Inc. Exonuclease-resistant oligonucleotides
US4958013A (en) 1989-06-06 1990-09-18 Northwestern University Cholesteryl modified oligonucleotides
US5227170A (en) 1989-06-22 1993-07-13 Vestar, Inc. Encapsulation process
US5451463A (en) 1989-08-28 1995-09-19 Clontech Laboratories, Inc. Non-nucleoside 1,3-diol reagents for labeling synthetic oligonucleotides
US5134066A (en) 1989-08-29 1992-07-28 Monsanto Company Improved probes using nucleosides containing 3-dezauracil analogs
US5254469A (en) 1989-09-12 1993-10-19 Eastman Kodak Company Oligonucleotide-enzyme conjugate that can be used as a probe in hybridization assays and polymerase chain reaction procedures
US5591722A (en) 1989-09-15 1997-01-07 Southern Research Institute 2'-deoxy-4'-thioribonucleosides and their antiviral activity
US5527528A (en) 1989-10-20 1996-06-18 Sequus Pharmaceuticals, Inc. Solid-tumor treatment method
US5225212A (en) 1989-10-20 1993-07-06 Liposome Technology, Inc. Microreservoir liposome composition and method
US5356633A (en) 1989-10-20 1994-10-18 Liposome Technology, Inc. Method of treatment of inflamed tissues
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5399676A (en) 1989-10-23 1995-03-21 Gilead Sciences Oligonucleotides with inverted polarity
US5721218A (en) 1989-10-23 1998-02-24 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotides with inverted polarity
EP0497875B1 (en) 1989-10-24 2000-03-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2' modified oligonucleotides
US5264562A (en) 1989-10-24 1993-11-23 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs with novel linkages
US5264564A (en) 1989-10-24 1993-11-23 Gilead Sciences Oligonucleotide analogs with novel linkages
US5292873A (en) 1989-11-29 1994-03-08 The Research Foundation Of State University Of New York Nucleic acids labeled with naphthoquinone probe
US5177198A (en) 1989-11-30 1993-01-05 University Of N.C. At Chapel Hill Process for preparing oligoribonucleoside and oligodeoxyribonucleoside boranophosphates
US5130302A (en) 1989-12-20 1992-07-14 Boron Bilogicals, Inc. Boronated nucleoside, nucleotide and oligonucleotide compounds, compositions and methods for using same
US5469854A (en) 1989-12-22 1995-11-28 Imarx Pharmaceutical Corp. Methods of preparing gas-filled liposomes
US5580575A (en) 1989-12-22 1996-12-03 Imarx Pharmaceutical Corp. Therapeutic drug delivery systems
US5486603A (en) 1990-01-08 1996-01-23 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide having enhanced binding affinity
US5623065A (en) 1990-08-13 1997-04-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Gapped 2' modified oligonucleotides
US5459255A (en) 1990-01-11 1995-10-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. N-2 substituted purines
US5646265A (en) 1990-01-11 1997-07-08 Isis Pharmceuticals, Inc. Process for the preparation of 2'-O-alkyl purine phosphoramidites
US5506351A (en) 1992-07-23 1996-04-09 Isis Pharmaceuticals Process for the preparation of 2'-O-alkyl guanosine and related compounds
US5670633A (en) 1990-01-11 1997-09-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Sugar modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression
US5578718A (en) 1990-01-11 1996-11-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Thiol-derivatized nucleosides
US5587361A (en) 1991-10-15 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having phosphorothioate linkages of high chiral purity
US5681941A (en) 1990-01-11 1997-10-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted purines and oligonucleotide cross-linking
US5587470A (en) 1990-01-11 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. 3-deazapurines
US5149797A (en) 1990-02-15 1992-09-22 The Worcester Foundation For Experimental Biology Method of site-specific alteration of rna and production of encoded polypeptides
US5220007A (en) 1990-02-15 1993-06-15 The Worcester Foundation For Experimental Biology Method of site-specific alteration of RNA and production of encoded polypeptides
US5214136A (en) 1990-02-20 1993-05-25 Gilead Sciences, Inc. Anthraquinone-derivatives oligonucleotides
WO1991013080A1 (en) 1990-02-20 1991-09-05 Gilead Sciences, Inc. Pseudonucleosides and pseudonucleotides and their polymers
US5321131A (en) 1990-03-08 1994-06-14 Hybridon, Inc. Site-specific functionalization of oligodeoxynucleotides for non-radioactive labelling
US5470967A (en) 1990-04-10 1995-11-28 The Dupont Merck Pharmaceutical Company Oligonucleotide analogs with sulfamate linkages
US5264618A (en) 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
US5665710A (en) 1990-04-30 1997-09-09 Georgetown University Method of making liposomal oligodeoxynucleotide compositions
GB9009980D0 (en) 1990-05-03 1990-06-27 Amersham Int Plc Phosphoramidite derivatives,their preparation and the use thereof in the incorporation of reporter groups on synthetic oligonucleotides
DE69032425T2 (de) 1990-05-11 1998-11-26 Microprobe Corp., Bothell, Wash. Teststreifen zum Eintauchen für Nukleinsäure-Hybridisierungsassays und Verfahren zur kovalenten Immobilisierung von Oligonucleotiden
US5602240A (en) 1990-07-27 1997-02-11 Ciba Geigy Ag. Backbone modified oligonucleotide analogs
US5386023A (en) 1990-07-27 1995-01-31 Isis Pharmaceuticals Backbone modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through reductive coupling
US5610289A (en) 1990-07-27 1997-03-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogues
US5688941A (en) 1990-07-27 1997-11-18 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods of making conjugated 4' desmethyl nucleoside analog compounds
US5541307A (en) 1990-07-27 1996-07-30 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogs and solid phase synthesis thereof
US5608046A (en) 1990-07-27 1997-03-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Conjugated 4'-desmethyl nucleoside analog compounds
US5218105A (en) 1990-07-27 1993-06-08 Isis Pharmaceuticals Polyamine conjugated oligonucleotides
US5138045A (en) 1990-07-27 1992-08-11 Isis Pharmaceuticals Polyamine conjugated oligonucleotides
US5618704A (en) 1990-07-27 1997-04-08 Isis Pharmacueticals, Inc. Backbone-modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through radical coupling
US5623070A (en) 1990-07-27 1997-04-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5677437A (en) 1990-07-27 1997-10-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5378825A (en) 1990-07-27 1995-01-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogs
EP0544824B1 (en) 1990-07-27 1997-06-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Nuclease resistant, pyrimidine modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression
US5489677A (en) 1990-07-27 1996-02-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleoside linkages containing adjacent oxygen and nitrogen atoms
US5223618A (en) 1990-08-13 1993-06-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. 4'-desmethyl nucleoside analog compounds
US5245022A (en) 1990-08-03 1993-09-14 Sterling Drug, Inc. Exonuclease resistant terminally substituted oligonucleotides
ES2083593T3 (es) 1990-08-03 1996-04-16 Sterling Winthrop Inc Compuestos y metodos para inhibir la expresion de genes.
US5177196A (en) 1990-08-16 1993-01-05 Microprobe Corporation Oligo (α-arabinofuranosyl nucleotides) and α-arabinofuranosyl precursors thereof
US5512667A (en) 1990-08-28 1996-04-30 Reed; Michael W. Trifunctional intermediates for preparing 3'-tailed oligonucleotides
US5214134A (en) 1990-09-12 1993-05-25 Sterling Winthrop Inc. Process of linking nucleosides with a siloxane bridge
US5561225A (en) 1990-09-19 1996-10-01 Southern Research Institute Polynucleotide analogs containing sulfonate and sulfonamide internucleoside linkages
JPH06505704A (ja) 1990-09-20 1994-06-30 ギリアド　サイエンシズ，インコーポレイテッド 改変ヌクレオシド間結合
US5432272A (en) 1990-10-09 1995-07-11 Benner; Steven A. Method for incorporating into a DNA or RNA oligonucleotide using nucleotides bearing heterocyclic bases
US5220006A (en) 1990-10-23 1993-06-15 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Identification of a suppressor of atherogenic apolipoprotein
CA2095212A1 (en) 1990-11-08 1992-05-09 Hybridon, Inc. Incorporation of multiple reporter groups on synthetic oligonucleotides
US6582908B2 (en) 1990-12-06 2003-06-24 Affymetrix, Inc. Oligonucleotides
US5672697A (en) 1991-02-08 1997-09-30 Gilead Sciences, Inc. Nucleoside 5'-methylene phosphonates
JP3220180B2 (ja) 1991-05-23 2001-10-22 三菱化学株式会社 薬剤含有タンパク質結合リポソーム
US5719262A (en) 1993-11-22 1998-02-17 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having amino acid side chains
US5539082A (en) 1993-04-26 1996-07-23 Nielsen; Peter E. Peptide nucleic acids
US5714331A (en) 1991-05-24 1998-02-03 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having enhanced binding affinity, sequence specificity and solubility
US5371241A (en) 1991-07-19 1994-12-06 Pharmacia P-L Biochemicals Inc. Fluorescein labelled phosphoramidites
US5571799A (en) 1991-08-12 1996-11-05 Basco, Ltd. (2'-5') oligoadenylate analogues useful as inhibitors of host-v5.-graft response
DE4129653A1 (de) 1991-09-06 1993-03-11 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zum nachweis aehnlicher nukleinsaeuren
NZ244306A (en) 1991-09-30 1995-07-26 Boehringer Ingelheim Int Composition for introducing nucleic acid complexes into eucaryotic cells, complex containing nucleic acid and endosomolytic agent, peptide with endosomolytic domain and nucleic acid binding domain and preparation
US5521291A (en) 1991-09-30 1996-05-28 Boehringer Ingelheim International, Gmbh Conjugates for introducing nucleic acid into higher eucaryotic cells
US5408038A (en) 1991-10-09 1995-04-18 The Scripps Research Institute Nonnatural apolipoprotein B-100 peptides and apolipoprotein B-100-apolipoprotein A-I fusion peptides
ES2103918T3 (es) 1991-10-17 1997-10-01 Ciba Geigy Ag Nucleosidos biciclicos, oligonucleotidos, procedimiento para su obtencion y productos intermedios.
US5594121A (en) 1991-11-07 1997-01-14 Gilead Sciences, Inc. Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified purines
US5484908A (en) 1991-11-26 1996-01-16 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotides containing 5-propynyl pyrimidines
TW393513B (en) 1991-11-26 2000-06-11 Isis Pharmaceuticals Inc Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified pyrimidines
AU3222793A (en) 1991-11-26 1993-06-28 Gilead Sciences, Inc. Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified pyrimidines
US5792608A (en) 1991-12-12 1998-08-11 Gilead Sciences, Inc. Nuclease stable and binding competent oligomers and methods for their use
US5359044A (en) 1991-12-13 1994-10-25 Isis Pharmaceuticals Cyclobutyl oligonucleotide surrogates
JPH07502414A (ja) 1991-12-23 1995-03-16 バイエル　コーポレイション 溶液相サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイに用いるためのクラミジアプローブ
US5700922A (en) 1991-12-24 1997-12-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. PNA-DNA-PNA chimeric macromolecules
US5595726A (en) 1992-01-21 1997-01-21 Pharmacyclics, Inc. Chromophore probe for detection of nucleic acid
US5565552A (en) 1992-01-21 1996-10-15 Pharmacyclics, Inc. Method of expanded porphyrin-oligonucleotide conjugate synthesis
FR2687679B1 (fr) 1992-02-05 1994-10-28 Centre Nat Rech Scient Oligothionucleotides.
US5633360A (en) 1992-04-14 1997-05-27 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs capable of passive cell membrane permeation
FR2692265B1 (fr) 1992-05-25 1996-11-08 Centre Nat Rech Scient Composes biologiquement actifs de type phosphotriesters.
US5434257A (en) 1992-06-01 1995-07-18 Gilead Sciences, Inc. Binding compentent oligomers containing unsaturated 3',5' and 2',5' linkages
WO1994000203A1 (en) 1992-06-30 1994-01-06 Velke, Willi, H. Tennis racquet having a surface structure adapted for the reduction of air resistance
EP0577558A2 (de) 1992-07-01 1994-01-05 Ciba-Geigy Ag Carbocyclische Nukleoside mit bicyclischen Ringen, Oligonukleotide daraus, Verfahren zu deren Herstellung, deren Verwendung und Zwischenproduckte
US5272250A (en) 1992-07-10 1993-12-21 Spielvogel Bernard F Boronated phosphoramidate compounds
US5652355A (en) 1992-07-23 1997-07-29 Worcester Foundation For Experimental Biology Hybrid oligonucleotide phosphorothioates
EP0651759B1 (en) 1992-07-23 2003-12-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Novel 2'-o-alkyl nucleosides and phosphoramidites processes for the preparation and uses thereof
WO1994002499A1 (en) 1992-07-27 1994-02-03 Hybridon, Inc. Oligonucleotide alkylphosphonothioates
US6001992A (en) * 1999-01-07 1999-12-14 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of novel anti-apoptotic bcl-2-related proteins
US6180403B1 (en) 1999-10-28 2001-01-30 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense inhibition of tumor necrosis factor alpha converting enzyme (TACE) expression
US5583020A (en) 1992-11-24 1996-12-10 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Permeability enhancers for negatively charged polynucleotides
WO1994013794A1 (en) 1992-12-04 1994-06-23 Brigham And Women's Hospital, Inc. Human thrombospondin-4
US5574142A (en) 1992-12-15 1996-11-12 Microprobe Corporation Peptide linkers for improved oligonucleotide delivery
JP3351476B2 (ja) 1993-01-22 2002-11-25 三菱化学株式会社 リン脂質誘導体及びそれを含有するリポソーム
AU6165494A (en) 1993-01-25 1994-08-15 Hybridon, Inc. Oligonucleotide alkylphosphonates and alkylphosphonothioates
US5476925A (en) 1993-02-01 1995-12-19 Northwestern University Oligodeoxyribonucleotides including 3'-aminonucleoside-phosphoramidate linkages and terminal 3'-amino groups
US5434058A (en) * 1993-02-09 1995-07-18 Arch Development Corporation Apolipoprotein B MRNA editing protein compositions and methods
EP0685234B1 (en) 1993-02-19 2000-05-10 Nippon Shinyaku Company, Limited Drug composition containing nucleic acid copolymer
US5395619A (en) 1993-03-03 1995-03-07 Liposome Technology, Inc. Lipid-polymer conjugates and liposomes
GB9304618D0 (en) 1993-03-06 1993-04-21 Ciba Geigy Ag Chemical compounds
GB9304620D0 (en) 1993-03-06 1993-04-21 Ciba Geigy Ag Compounds
AU6449394A (en) 1993-03-30 1994-10-24 Sterling Winthrop Inc. Acyclic nucleoside analogs and oligonucleotide sequences containing them
AU6412794A (en) 1993-03-31 1994-10-24 Sterling Winthrop Inc. Oligonucleotides with amide linkages replacing phosphodiester linkages
DE4311944A1 (de) 1993-04-10 1994-10-13 Degussa Umhüllte Natriumpercarbonatpartikel, Verfahren zu deren Herstellung und sie enthaltende Wasch-, Reinigungs- und Bleichmittelzusammensetzungen
US5462854A (en) 1993-04-19 1995-10-31 Beckman Instruments, Inc. Inverse linkage oligonucleotides for chemical and enzymatic processes
FR2705099B1 (fr) 1993-05-12 1995-08-04 Centre Nat Rech Scient Oligonucléotides phosphorothioates triesters et procédé de préparation.
US5534259A (en) 1993-07-08 1996-07-09 Liposome Technology, Inc. Polymer compound and coated particle composition
US5543158A (en) 1993-07-23 1996-08-06 Massachusetts Institute Of Technology Biodegradable injectable nanoparticles
US5417978A (en) 1993-07-29 1995-05-23 Board Of Regents, The University Of Texas System Liposomal antisense methyl phosphonate oligonucleotides and methods for their preparation and use
US5502177A (en) 1993-09-17 1996-03-26 Gilead Sciences, Inc. Pyrimidine derivatives for labeled binding partners
US5801154A (en) * 1993-10-18 1998-09-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide modulation of multidrug resistance-associated protein
US6235470B1 (en) * 1993-11-12 2001-05-22 The Johns Hopkins University School Of Medicine Detection of neoplasia by analysis of saliva
CA2137297C (en) 1993-12-06 2000-04-18 Tsuyoshi Miyazaki Reactive vesicle and functional substance-fixed vesicle
US5457187A (en) 1993-12-08 1995-10-10 Board Of Regents University Of Nebraska Oligonucleotides containing 5-fluorouracil
PT733059E (pt) 1993-12-09 2001-03-30 Univ Jefferson Compostos e metodos para mutacoes dirigidas ao local em celulas eucarioticas
US5446137B1 (en) 1993-12-09 1998-10-06 Behringwerke Ag Oligonucleotides containing 4'-substituted nucleotides
US5595756A (en) 1993-12-22 1997-01-21 Inex Pharmaceuticals Corporation Liposomal compositions for enhanced retention of bioactive agents
US5519134A (en) 1994-01-11 1996-05-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Pyrrolidine-containing monomers and oligomers
US5596091A (en) 1994-03-18 1997-01-21 The Regents Of The University Of California Antisense oligonucleotides comprising 5-aminoalkyl pyrimidine nucleotides
US5627053A (en) 1994-03-29 1997-05-06 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. 2'deoxy-2'-alkylnucleotide containing nucleic acid
US5625050A (en) 1994-03-31 1997-04-29 Amgen Inc. Modified oligonucleotides and intermediates useful in nucleic acid therapeutics
US5646269A (en) 1994-04-28 1997-07-08 Gilead Sciences, Inc. Method for oligonucleotide analog synthesis
US6103890A (en) 1994-05-18 2000-08-15 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Enzymatic nucleic acids that cleave C-fos
US5525711A (en) 1994-05-18 1996-06-11 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Pteridine nucleotide analogs as fluorescent DNA probes
US5656612A (en) * 1994-05-31 1997-08-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide modulation of raf gene expression
US5543152A (en) 1994-06-20 1996-08-06 Inex Pharmaceuticals Corporation Sphingosomes for enhanced drug delivery
US5597696A (en) 1994-07-18 1997-01-28 Becton Dickinson And Company Covalent cyanine dye oligonucleotide conjugates
US5597909A (en) 1994-08-25 1997-01-28 Chiron Corporation Polynucleotide reagents containing modified deoxyribose moieties, and associated methods of synthesis and use
US5580731A (en) 1994-08-25 1996-12-03 Chiron Corporation N-4 modified pyrimidine deoxynucleotides and oligonucleotide probes synthesized therewith
US5820873A (en) 1994-09-30 1998-10-13 The University Of British Columbia Polyethylene glycol modified ceramide lipids and liposome uses thereof
US5591721A (en) 1994-10-25 1997-01-07 Hybridon, Inc. Method of down-regulating gene expression
US5512295A (en) 1994-11-10 1996-04-30 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Synthetic liposomes for enhanced uptake and delivery
US5792747A (en) 1995-01-24 1998-08-11 The Administrators Of The Tulane Educational Fund Highly potent agonists of growth hormone releasing hormone
US5756122A (en) 1995-06-07 1998-05-26 Georgetown University Liposomally encapsulated nucleic acids having high entrapment efficiencies, method of manufacturer and use thereof for transfection of targeted cells
EP0843555B1 (en) 1995-08-01 2003-08-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Liposomal oligonucleotide compositions
US5652356A (en) 1995-08-17 1997-07-29 Hybridon, Inc. Inverted chimeric and hybrid oligonucleotides
US5858397A (en) 1995-10-11 1999-01-12 University Of British Columbia Liposomal formulations of mitoxantrone
KR0185334B1 (ko) 1995-11-02 1999-04-01 김은영 인간 혈장 아포지단백질 비-100에 결합하는 생쥐 항체를 암호하는 씨디엔에이
US5994316A (en) 1996-02-21 1999-11-30 The Immune Response Corporation Method of preparing polynucleotide-carrier complexes for delivery to cells
EP0900272A2 (en) 1996-03-26 1999-03-10 Glaxo Group Limited Tumor necrosis factor alpha convertase
CA2270132A1 (en) 1996-11-06 1998-05-14 Sequenom, Inc. Dna diagnostics based on mass spectrometry
AU6435698A (en) 1997-02-20 1998-09-09 Johns Hopkins School Of Medicine, The Control of (il4) production as a therapeutic regulator of immune function
JP3756313B2 (ja) 1997-03-07 2006-03-15 武 今西 新規ビシクロヌクレオシド及びオリゴヌクレオチド類縁体
US6383808B1 (en) * 2000-09-11 2002-05-07 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense inhibition of clusterin expression
US6794499B2 (en) 1997-09-12 2004-09-21 Exiqon A/S Oligonucleotide analogues
DE69829760T3 (de) 1997-09-12 2016-04-14 Exiqon A/S Bi- und tri-zyklische - nukleosid, nukleotid und oligonukleotid-analoga
GB9721240D0 (en) 1997-10-08 1997-12-03 Zeneca Ltd Assay
US6156315A (en) 1997-10-10 2000-12-05 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Method for inhibiting the binding of low density lipoprotein to blood vessel matrix
US6309844B1 (en) 1997-10-15 2001-10-30 Fujirebio Inc. Anti-apo-B-48 monoclonal antibody, hybridoma producing the same, and method for measuring apo-B-48 using the same
US6512161B1 (en) * 1998-01-08 2003-01-28 Aventis Pharmaceuticals, Inc. Transgenic rabbit that expresses a functional human lipoprotein (a)
US6238921B1 (en) 1998-03-26 2001-05-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide modulation of human mdm2 expression
US6949367B1 (en) * 1998-04-03 2005-09-27 Epoch Pharmaceuticals, Inc. Modified oligonucleotides for mismatch discrimination
US6007995A (en) 1998-06-26 1999-12-28 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense inhibition of TNFR1 expression
DE19832475C1 (de) * 1998-07-20 2000-03-09 Braun Gmbh Trockenrasierapparat
US5945290A (en) * 1998-09-18 1999-08-31 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of RhoA expression
US6172216B1 (en) * 1998-10-07 2001-01-09 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of BCL-X expression
AU3274500A (en) 1999-03-18 2000-10-09 Exiqon A/S Detection of mutations in genes by specific lna primers
JP4975905B2 (ja) 1999-03-18 2012-07-11 エクシコン エ／エス 複合生物試料における核酸の単工程調製及び検出
US20040171566A1 (en) 1999-04-06 2004-09-02 Monia Brett P. Antisense modulation of p38 mitogen activated protein kinase expression
US5998148A (en) * 1999-04-08 1999-12-07 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of microtubule-associated protein 4 expression
US6033910A (en) 1999-07-19 2000-03-07 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense inhibition of MAP kinase kinase 6 expression
AU6910100A (en) 1999-08-18 2001-03-13 Lawrence Chan Apolipoprotein b mrna-specific ribozyme
AU1350301A (en) 1999-10-26 2001-05-08 Thomas Jefferson University Regulation of apob for diagnosis, treatment and drug screening for cardiovascular and metabolic disorders or syndromes
US20020123617A1 (en) 1999-12-23 2002-09-05 Starling Gary C. Novel immunoglobulin superfamily members of APEX-1, APEX-2 and APEX-3 and uses thereof
WO2001052902A1 (en) 2000-01-24 2001-07-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of inducible nitric oxide synthase expression
JP2004509604A (ja) 2000-03-28 2004-04-02 アイシス・ファーマシューティカルス・インコーポレーテッド ｍＲＮＡプロセッシングのアンチセンスモジュレーションによる、細胞行動の改変
AU2001250572A1 (en) 2000-04-07 2001-10-23 Epigenomics Ag Detection of single nucleotide polymorphisms (snp's) and cytosine-methylations
AU2001251612A1 (en) 2000-04-14 2001-10-30 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Roles of jak/stat family members in tolerance induction
US6306655B1 (en) * 2000-06-13 2001-10-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense inhibition of C/EBP alpha expression
WO2002024717A1 (en) * 2000-09-20 2002-03-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of flip-c expression
AU2002211373A1 (en) 2000-09-29 2002-04-08 Genaissance Pharmaceuticals, Inc. Haplotypes of the por gene
JP2002355074A (ja) 2001-01-24 2002-12-10 Univ Tsukuba 腸管出血性病原性大腸菌ｏ１５７：ｈ７に特異的な核酸分子およびポリペプチド並びにこれらの使用方法
EP1239051A3 (en) 2001-01-30 2004-03-17 Aeomica, Inc. Human posh-like protein 1
US6878729B2 (en) 2001-05-04 2005-04-12 The Procter & Gamble Company Medicinal uses of dihydropyrazoles
US6660737B2 (en) 2001-05-04 2003-12-09 The Procter & Gamble Company Medicinal uses of hydrazones
US6964950B2 (en) 2001-07-25 2005-11-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of C-reactive protein expression
US7888324B2 (en) * 2001-08-01 2011-02-15 Genzyme Corporation Antisense modulation of apolipoprotein B expression
US7407943B2 (en) 2001-08-01 2008-08-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of apolipoprotein B expression
US7297485B2 (en) 2001-10-15 2007-11-20 Qiagen Gmbh Method for nucleic acid amplification that results in low amplification bias
CA2477761A1 (en) 2002-03-01 2003-09-12 Ravgen, Inc. Methods for detection of genetic disorders
JPWO2003097097A1 (ja) 2002-05-15 2005-10-20 洋司郎 新津 Ｖｌａ４アンタゴニストを含む治療用医薬組成物を用いた急性白血病の治療および／または再発予防方法ならびにｖｌａ４を指標とした急性白血病の予後の診断方法
AU2003237875A1 (en) 2002-05-15 2003-12-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of apolipoprotein b expression
US7887431B2 (en) 2008-05-16 2011-02-15 Taylor Made Golf Company, Inc. Golf club
JP4986109B2 (ja) 2002-11-13 2012-07-25 ジェンザイム・コーポレーション アポリポタンパク質ｂ発現のアンチセンス調節
US7511131B2 (en) * 2002-11-13 2009-03-31 Genzyme Corporation Antisense modulation of apolipoprotein B expression
US20060009410A1 (en) * 2002-11-13 2006-01-12 Crooke Rosanne M Effects of apolipoprotein B inhibition on gene expression profiles in animals
AU2003218674A1 (en) 2003-02-28 2004-09-17 Edmund John Gemmell Apparatus and method for displaying information
US20040185559A1 (en) 2003-03-21 2004-09-23 Isis Pharmaceuticals Inc. Modulation of diacylglycerol acyltransferase 1 expression
US7750142B2 (en) 2003-04-28 2010-07-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of glucagon receptor expression
US7399853B2 (en) 2003-04-28 2008-07-15 Isis Pharmaceuticals Modulation of glucagon receptor expression
US7825235B2 (en) 2003-08-18 2010-11-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of diacylglycerol acyltransferase 2 expression
EP2708541B1 (en) 2003-11-13 2015-01-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. 5,6-dihydroxy-isoindole derivatives as linkers for oligomer solid phase synthesis
US20050164271A1 (en) 2004-01-20 2005-07-28 Sanjay Bhanot Modulation of glucocorticoid receptor expression
US20050287558A1 (en) * 2004-05-05 2005-12-29 Crooke Rosanne M SNPs of apolipoprotein B and modulation of their expression
PT2409713E (pt) 2004-08-10 2015-10-09 Genzyme Corp Oligonucleótidos para utilização em modulação dos níveis de lipoproteínas e colesterol em humanos
AU2006291836B2 (en) 2005-09-15 2012-02-23 Santaris Pharma A/S RNA antagonist compounds for the inhibition of Apo-Bl00 expression
ES2369328T3 (es) 2005-09-19 2011-11-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulación de la expresión del receptor de glucagón.
US20070238698A1 (en) * 2006-04-07 2007-10-11 Hsien-Chih Lin Method for manufacturing drinking water having chitosan
US8935416B2 (en) 2006-04-21 2015-01-13 Fortinet, Inc. Method, apparatus, signals and medium for enforcing compliance with a policy on a client computer
CA3044969A1 (en) 2006-05-05 2007-12-21 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for modulating gene expression
RU2559536C2 (ru) 2007-03-24 2015-08-10 Джензим Корпорейшн Введение антисмысловых олигонуклеотидов, комплементарных человеческому аполипопротеину в
DE102011111510A1 (de) 2011-08-31 2013-02-28 ThyssenKrupp Fördertechnik GmbH Umschlagvorrichtung zum Umschlagen von Schüttgut
US9209196B2 (en) 2011-11-30 2015-12-08 Sharp Kabushiki Kaisha Memory circuit, method of driving the same, nonvolatile storage device using the same, and liquid crystal display device
US9400902B2 (en) 2012-05-22 2016-07-26 Trimble Navigation Limited Multi-modal entity tracking and display
US10867398B2 (en) 2017-11-21 2020-12-15 Reliance Core Consulting LLC Methods, systems, apparatuses and devices for facilitating motion analysis in an environment

Also Published As

Publication number Publication date
US7407943B2 (en) 2008-08-05
AU2002326481B2 (en) 2008-11-13
JP2009055925A (ja) 2009-03-19
JP4471650B2 (ja) 2010-06-02
US20150105440A1 (en) 2015-04-16
WO2003011887A2 (en) 2003-02-13
PT2174945E (pt) 2015-06-25
EP2174945A1 (en) 2010-04-14
EP1419168A4 (en) 2006-11-15
EP2174945B1 (en) 2015-04-08
JP2017127311A (ja) 2017-07-27
JP5797875B2 (ja) 2015-10-21
JP2015198669A (ja) 2015-11-12
JP2013066480A (ja) 2013-04-18
US20170355986A1 (en) 2017-12-14
US20080242629A1 (en) 2008-10-02
JP2005503142A (ja) 2005-02-03
EP1419168A2 (en) 2004-05-19
EP2336145A1 (en) 2011-06-22
US8735364B2 (en) 2014-05-27
DK2174945T3 (en) 2015-05-26
US20030215943A1 (en) 2003-11-20
WO2003011887A3 (en) 2003-04-24
CY1116385T1 (el) 2017-02-08
CA2455228A1 (en) 2003-02-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2546360T3 (es) Modulación antisentido de la expresión de la apolipoproteína B
JP5501202B2 (ja) Ｃ反応性タンパク質発現のアンチセンス調節
AU2008213712B2 (en) Antisense modulation of apolipoprotein (A) expression
US7888324B2 (en) Antisense modulation of apolipoprotein B expression
US20050227938A1 (en) Antisense modulation of TFAP2C expression
JP2014027936A (ja) クラスタリン発現のアンチセンスモジュレーション
US6379960B1 (en) Antisense modulation of damage-specific DNA binding protein 2, p48 expression
JP2006500066A (ja) ミクロソームのプロスタグランジンｅ２シンターゼ発現のアンチセンス調節
JP2005504522A (ja) トランスフォーム増殖因子β受容体ＩＩ発現のアンチセンスモジュレーション
KR100622275B1 (ko) 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 5 발현의 안티센스 조절
US20050074878A1 (en) Antisense modulation of ptpn2 expression
JP2002531469A (ja) アポトーシス−１の細胞性阻害物質の発現のアンチセンスモジュレーション
US6900306B2 (en) Antisense modulation of CoREST expression
US6867039B2 (en) Antisense modulation of dual specific phosphatase 5 expression
US20040076621A1 (en) Antisense modulation of CD36 expression
ES2420914T3 (es) Modulación antisentido de la expresión de la apolipoproteína B
US6855700B2 (en) Antisense modulation of damage-specific DNA binding protein 1, p127 expression
AU2012258396B2 (en) Antisense modulation of apolipoprotein (a) expression
AU2011203319B2 (en) Antisense modulation of C-reactive protein expression
US6492172B1 (en) Antisense modulation of GU protein expression
JP2005502331A (ja) ホルモン感受性リパーゼ発現のアンチセンス調節