ES2644138T3

ES2644138T3 - N,N,N-trialquilpolímeros, métodos para su preparación y usos de los mismos

Info

Publication number: ES2644138T3
Application number: ES12800482.7T
Authority: ES
Inventors: Jonathan Gagnon
Original assignee: Rival SC
Current assignee: Rival SC
Priority date: 2011-06-13
Filing date: 2012-06-13
Publication date: 2017-11-27
Anticipated expiration: 2032-06-13
Also published as: EP2718331A4; EP2718331B1; JP2017222869A; EP2718331A1; JP6346561B2; US20140107329A1; WO2012171125A1; JP2014518289A; US9505852B2; CA2869821C; CA2869821A1

Description

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DESCRIPCION

N,N,N-trialquilpoKmeros, metodos para su preparacion y usos de los mismos Referencia cruzada con solicitudes relacionadas

Esta solicitud reivindica prioridad de la solicitud provisional de EE.UU. con n° de serie 61/496.225, depositada el 13 dejunio de 2011.

Campo de la invencion

La presente invencion se refiere de forma general a N,N,N-trialquilaminopoUmeros. Mas espedficamente, la invencion se refiere a N,N,N-trialquilaminopolisacaridos. Tambien, la invencion tambien se refiere a N,N,N- trialquilquitosano, a los metodos para la preparacion del mismo, y a sus diversos usos, por ejemplo, en los campos farmaceutico, nutraceutico y cosmeceutico.

Antecedentes de la invencion

La quitina es un polisacarido de cadena larga de unidades de N-acetil-D-glucosamina unidas por p-(1 -4) y se encuentra en muchos lugares en cualquier parte del mundo natural. Es el principal componente de las paredes celulares de los hongos, los exoesqueletos de artropodos tales como los crustaceos (por ejemplo, cangrejos, langostas y langostinos (incluyendo Pandalus Borealis)) y de insectos, las radulas de moluscos y los picos de los cefalopodos, incluyendo calamares y pulpos. Es el segundo polisacarido natural mas comun, con una produccion mundial anual estimada en 2,3 x 109 T (vease Biopolfmeros, Vol. 6: Polysacharides II: Polysacharides from Eukaryotes, Vandamme E. J., De Baets S., Steinbuchel A., Wiley-VCH, Nueva York, 2002, pag. 488.).

imagen1

El quitosano, una poli[p-(1^4)-2-amino-2-desoxi-D-glucopiranosa], es un aminopolisacarido lineal biodegradable, biocompatible y no toxico obtenido mediante la desacetilacion de la quitina. La desacetilacion completa de la quitina produce quitosano con un grado de desacetilacion (DD) del 100 % y formado unicamente por D-glucosamina unida por p-(1-4) (unidades desacetiladas):

imagen2

El quitosano con unos grados de desacetilacion (DD) menores del 100% comprende adicionalmente algunas unidades originales de N-acetil-D-glucosamina. El grado de desacetilacion del quitosano disponible comercialmente esta habitualmente en el intervalo del 50-100 %.

El quitosano es uno de los pocos biopolfmeros que es cationico cuando esta protonado. Los polfmeros cationicos generalmente pueden adsorberse en las paredes celulares de las bacterias y actuar asf como antibacterianos. Por ejemplo, muchos estudios describen la eficacia del quitosano en el tratamiento de heridas. La utilizacion del

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quitosano en otras aplicaciones ha estado, sin embargo, limitada debido a su insolubilidad en agua cuando esta en forma neutra. Su solubilidad esta limitada a una solucion acida acuosa diluida con un pH < 6,5.

El W,A/,W-trimetilquitosano (TMC) es un polication que se obtiene generalmente mediante la metilacion del quitosano. Tiene la siguiente formula qmmica ideal:

imagen3

con un contraion para equilibrar la carga electrica.

Sin embargo, dicho TMC "ideal" nunca ha sido producido. De hecho, el TMC notificado en la bibliograffa tiene un bajo grado de cuaternizacion (DQ) del atomo de nitrogeno (30-40 % como mucho), lo que significa que al menos algunas unidades de D-glucosamina unicamente portan cero, uno o dos grupos metilo en su atomo de nitrogeno, en lugar de portar tres de esos grupos.

Normalmente, los metodos para la produccion del TMC comprenden llevar a cabo reacciones sucesivas de metilacion sobre el quitosano, usando yodometano (yoduro de metilo) o dimetilsulfato en presencia de una base, a menudo hidroxido de sodio, en diversas condiciones experimentales (vease Curti E., Britto D., Campana-Filho S. P., Macromol. Biosci., 2003, 3, 571-576 y Hamman J. H., Kotze A. F., Drug Dev. Ind. Pharm., 2001, 27, 373-380). Sin embargo, la metilacion del quitosano en estas condiciones da lugar a la formacion de una mezcla de aminas no metiladas, mono, di y trimetiladas.

De hecho, la modificacion qmmica de los polisacaridos presenta muchas dificultades, tales como la ausencia de solubilidad de los polisacaridos en otros disolventes organicos e inorganicos (incluyendo el agua), la presencia de otras diversas funciones qmmicas (por lo tanto, la modificacion debe ser regioselectiva) y el elevado numero de unidades repetitivas. No obstante, la smtesis de TMC ha sido el sujeto de muchos artfculos academicos, ya que proporciona un derivado de quitosano policationico que es soluble en agua. La formacion del TMC introduce de hecho cargas positivas, y por lo tanto proporciona un producto soluble en agua en un amplio intervalo de pH, incluso cuando esta parcialmente cuaternizado. Es por lo tanto deseable producir un TMC que tenga un elevado grado de cuaternizacion.

Adicionalmente se han notificado intentos de aumentar el grado de cuaternizacion hasta mas del 30-40 %, dando como resultado la metilacion de los atomos de oxfgeno de los grupos OH en la posicion 3 y/o en la posicion 6 hasta un punto que se conoce como grado de O-sustitucion (O-DS). Unos elevados grados de O-sustitucion dan lugar a una disminucion en la solubilidad del TMC en agua, ya que los grupos -OH hidrofilos son sustituidos por grupos - OCH3 mas hidrofobos. Por lo tanto, es deseable producir un TMC tenga un bajo grado de O-sustitucion.

El quitosano con un elevado grado de cuaternizacion (DQ) en el quitosano se ha obtenido (DQ del 90,5%) en un proceso que implica tres etapas de metilacion, usando yodometano e hidroxido de sodio; sin embargo, estas condiciones tambien dan lugar a unos elevados grados de O-sustitucion, particularmente en las posiciones 3 y 6 (metilacion 0-3 y 0-6), respectivamente del 82,8 y del 98,5 % (Polnok A., et al., Eur. J. Pharm. Biopharm., 2004, 57, 77-83). La formacion del metil eter (O-metilacion) mediante la sustitucion de los grupos alcohol da lugar de forma indeseable a una disminucion en la solubilidad de los derivados de quitosano, y posiblemente a un producto insoluble en agua (Curti E., Britto D., Campana-Filho S. P., Macromol. Biosci., 2003, 3, 571-576, Polnok A., et al., Eur. J. Pharm. Biopharm., 2004, 57, 77-83, y Snyman D., Hamman J. H., Kotze J. S., Rollings J. E., Kotze A. F., Carbohidr. Polym., 2002, 50, 145-150).

Ademas, el uso de hidroxido de sodio o de un entorno fuertemente alcalino disminuye el peso molecular del polfmero. Con unas condiciones experimentales que impidan la O-metilacion generalmente se ha obtenido un bajo grado de cuaternizacion (Polnok A., et al., Eur. J. Pharm. Biopharm., 2004, 57, 77-83).

Alternativamente, cuando se uso como base W,W-dimetilaminopiridina en lugar de hidroxido de sodio para evitar la degradacion del quitosano, se obtuvieron unos bajos DQ (del 7,3-9,6 %) (Hamman J. H., Kotze A. F., Drug Dev. Ind. Pharm., 2001, 27, 373-380).

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Tambien se ha sintetizado el TMC usando dimetilsulfato como agente metilante (Britto D., Forato L. A., Assis O. B. G., Carbohidr. Polym., 2008, 74, 86-91, Britto D., Assis B. G. O., Carbohidr. Polym., 2007, 69, 305, y Britto D., Assis

B. G. O., Intl. J. Biol. Macromol., 2007, 41, 198).

El quitosano tambien ha sido W-permetilado mediante una reaccion con formaldetudo, seguida por borhidruro de sodio. El quitosano W-permetilado se hizo reaccionar con yodometano para obtener el TMC. El yoduro de TMC resultante tiene un elevado grado de O-sustitucion del 60 % y muestra actividad antibiotica, pero es insoluble en agua (Muzzarelli R. A. A., Tanfani F., Carbohidr. Polym., 1985, 5, 297).

Tambien se ha notificado la preparacion de derivados mixtos de W,W,W-trialquilquitosano con diferentes yoduros de alquilo (Avadi M. R., Zohuriaan-Mehr M. J., Younessi P., Amini M., Rafiee Tehrani M., Shafiee A., J. Bioact. Compat. Polym., 2003, 18, 469, y Bayat A., Sadeghi A. M. M., Avadi M.R., Amini M., Rafiee-Tehrani M., Shafiee A., Majlesi R., Junginger H. E., J. Bioact. Compat. Polym., 2006, 21,433).

El TMC ha despertado interes debido a sus multiples usos. Algunos usos conocidos del TMC incluyen, por ejemplo:

■ el aumento de la absorcion de moleculas a traves de las mucosas (por ejemplo, a traves de la pared intestinal),

■ la liberacion controlada de diversas sustancias, incluyendo genes y protemas, y

■ su uso como un agente antimicrobiano.

El W,W,W-trimetilquitosano tiene una densidad creciente de carga positiva (en comparacion con el quitosano) y se ha demostrado que abre las uniones estrechas de las celulas epiteliales. Por lo tanto, ha demostrado ser un potente potenciador de la absorcion intestinal para farmacos hidrofilos y macromoleculares al pH fisiologico (Thanou M., Florea B. I. Langemeyer M. W. E., Verhoef J. C., Junginger H. E., Pharm. Res., 2000, 17, 27; Thanou M., Verhoef J.

C. , Verheijden J. H. M., Junginger H. E., Pharm. Res., 2001, 18, 823; Thanou M., Kotze A. F., Scharringhausen T., Leuben H. L., De Boer A. G., Verhoef J. C., Junginger H. E., J. Controlled Release, 2000, 64, 15; Thanou M., Verhoef J. C., Junginger H. E., Adv. Drug Delivery Rev., 2001,52, 117; y Florea B.I., Thanou M., Junginger H. E., Borchard G., J. Control. Release, 2006, 110, 353). Se sabe que la densidad de carga positiva tiene un efecto importante sobre las propiedades potenciadoras de la absorcion de farmacos (Kotze A. F., LuepEn H. L., Leeuw B. J., Boer B. G., Verhoef J. C., Junginger H. E., Pharmaceutical Research, 1997, 14, 1197; y Kotze A. F., Thanou M., Lueben H. L., de Boer A. G., Verhoef J. C., Junginger H. E., Eur. J. Pharm. Biopharm., 1999, 47, 269). Se ha notificado que cuanto mayor sea el grado de cuaternizacion, mayor es el aumento en la absorcion.

Segun J. Pharm. Sci., 2008, 97 (5), 1652-1680, los polfmeros que aumentan la penetracion transepitelial son policationes (quitosano, poli-L-arginina (poli-L-Arg), gelatina aminada), polianiones (N-carboximetilquitosano, acido poliacnlico) y polfmeros tiolados (carboximetil cistema-celulosa, policarbofilo (PCP)-cistema, quitosano- tiobutilamidina, quitosano-acido tioglicolico, conjugado de quitosano-glutation).

El TMC se ha usado en otras determinadas aplicaciones tales como la administracion genica, en la administracion colonica de farmacos y como antibacteriano (Runarsson O. V., et al., Eur. Polym. J., 2007, 43, 2660-2671; Borchard G., Adv. Drug Delivery Rev., 2001, 52, 145; Dodou D., Breedveld P., Wieringa P. A., Euro. J. Pharm. Biopharm., 2005, 60, 1; Kim C. H., Choi J. W., Chun H. J., Choi K. S., Polym. Bull., 1997, 38, 387; Kean T., Roth S., Thanou M., J. Control. Release, 2005, 103, 643; y Jia Z., Shen D., Xu W., Carbohidr. Res., 2001, 333, 1). Un estudio de relacion entre la estructura y la actividad revela que la W-cuaternizacion del quitosano y de los quitooligomeros era responsable de la actividad antibacteriana frente a Staphylococcus aureus a un pH de 7,2 (Runarsson O. V., et al., Eur. Polym. J., 2007, 43, 2660-2671).

Se sabe que los polfmeros cationicos, incluyendo el quitosano protonado, poseen propiedades antibacterianas (Lim,

S. H. et al. J. Macromol. Sci.-Polym. Rev., 2003, C43, 223.). Los factores que afectan a la actividad anti bacteriana de los polfmeros son generalmente la estructura, el peso molecular, la naturaleza de los contraiones y la hidrofobicidad (Kenawy, E. et al. Biomacromolecules, 2007, 8, 1359-1384). El tiempo de eliminacion puede ser tan bajo como de 30 min para el quitosano (El-Sharif, A. A. et al. Curr. Microbiol., 2011, 62, 739-745).

Adicionalmente, se sabe de forma general que los biopolfmeros hidrofilos tienen un efecto emoliente.

Consecuentemente, sigue habiendo por lo tanto una necesidad de metodos mejorados para la produccion de W,W,W- trialquilaminopolfmeros, particularmente de W,W,W-trialquilaminopolisacaridos que tengan un elevado grado de cuaternizacion y un bajo grado de otra sustitucion con heteroatomos. Particularmente, existe una necesidad de metodos mejorados para la produccion de W,W,W-trialquilquitosano que tenga un elevado grado de cuaternizacion y un bajo grado de O-sustitucion.

Sumario de la invencion

El presente inventor ha disenado un metodo nuevo y mejorado para la preparacion de un W,W,W-trialquilquitosano. El metodo da lugar a un W,W,W-trialquilquitosano que tiene un elevado grado de cuaternizacion y un bajo grado de O-

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sustitucion. El N,N,N-trialquilquitosano producido mediante el metodo segun la invencion tiene varios usos. El metodo segun la invencion puede ser aplicado en la preparacion de N,N,N-trialquilaminopoKmeros que tengan otros heteroatomos diferentes al N. Mas espedficamente, el metodo segun la invencion puede ser aplicado a N,N,N- trialquilaminopolisacaridos.

En una realizacion, el metodo implica una primera etapa de alquilacion de un aminopolfmero para producir un N,N- dialquilaminopoKmero que tiene un elevado grado de N-sustitucion, sin ninguna formacion del N,N,N- trialquilaminopoKmero. El metodo tambien implica una etapa posterior de alquilacion del N,N-dialquilaminopolfmero para producir el N,N,N-trialquilaminopolfmero. Mas espedficamente, cuando se obtiene el N,N-dialquilaminopolfmero mediante una reaccion de aminacion reductora que implica el uso de un aldeddo y de acido formico (reaccion de Escheweiler-Clarke). La reaccion de alquilacion del N,N-dialquilaminopolfmero en la etapa posterior implica el uso de un agente de alquilacion y de una base.

En una realizacion del metodo segun la invencion para la produccion del N,N,N-trimetilquitosano, se usa un quitosano que tiene un grado de N-sustitucion (N-DS) de 2,0.

La presente invencion proporciona por tanto:

1. Un metodo para la preparacion de un N,N,N-trialquilaminopolfmero, que comprende:

a) proporcionar un aminopolfmero que tiene uno o mas heteroatomos no sustituidos diferentes del atomo de nitrogeno;

b) alquilar el aminopolfmero para producir un N,N-dialquilaminopolfmero, en el que sustancialmente no se produce N,N,N-trialquilaminopolfmero; y

c) alquilar el N,N-diaminopolfmero para producir el N,N,N-trialquilaminopolfmero, en el que unicamente esta alquilado un bajo porcentaje de los heteroatomos no sustituidos.

2. Un metodo para la preparacion de un N,N,N-trialquilaminopolisacarido, que comprende:

a) proporcionar un aminopolisacarido que tiene uno o mas heteroatomos no sustituidos diferentes del atomo de nitrogeno;

b) alquilar el aminopolisacarido para producir un N,N-dialquilaminopolisacarido, en el que sustancialmente no se produce N,N,N-trialquilaminopolisacarido; y

c) alquilar el N,N-diaminopolisacarido para producir el N,N,N-trialquilaminopolisacarido, en el que unicamente esta alquilado un bajo porcentaje de los heteroatomos no sustituidos.

3. Un metodo segun el punto 1 o 2, en el que cada grupo alquilo es independientemente un grupo alquilo Ci a Ca, preferentemente un grupo alquilo Ci a C3, que esta saturado o insaturado, ramificado o no ramificado, que opcionalmente tiene un heteroatomo, mas preferentemente el grupo alquilo es independientemente el grupo metilo o el grupo propilo.

4. Un metodo segun uno cualquiera de los puntos 1 a 3, en el que cada heteroatomo no sustituido es independientemente un atomo de oxfgeno o de azufre.

5. Un metodo segun uno cualquiera de los puntos 1 a 4, en el que la etapa b) se lleva a cabo usando un aldeddo y acido formico.

6. Un metodo segun uno cualquiera de los puntos 1 a 4, en el que la etapa b) es una reaccion de aminacion reductora.

7. Un metodo segun el punto 5, en el que el aldeddo es un aldeddo C1 a Ca, preferentemente un aldeddo C1 a C3, que esta saturado o insaturado, ramificado o no ramificado, que opcionalmente tiene un heteroatomo, mas preferentemente el aldeddo es formaldeddo o propanal.

8. Un metodo segun uno cualquiera de los puntos 1 a 7, en el que la etapa c) se lleva a cabo usando un agente de alquilacion tal como un haluro de alquilo o un carbonato de dialquilo y una base, en un disolvente de reaccion que comprende un disolvente organico, agua y/o un alcohol.

9. Un metodo segun el punto 1, que comprende adicionalmente la etapa de anadir HCl, HBr o HI para producir el N,N,N-trialquilaminopolfmero con un contraion de cloruro, de bromuro o de yoduro.

10. Un metodo segun el punto 2, que comprende adicionalmente la etapa de anadir HCl, HBr o HI para producir el N,N,N-trialquilaminopolisacarido con un contraion de cloruro, de bromuro o de yoduro.

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11. Un metodo para la preparacion de un N,N,N-trialquilquitosano, que comprende:

a) proporcionar quitosano;

b) alquilar el quitosano para producir un N,N-dialquilquitosano, en el que sustancialmente no se produce N,N,N-trialquilquitosano; y

c) alquilar el N,N-dialquilquitosano para producir el N,N,N-trialquilquitosano, en el que unicamente esta alquilado un bajo porcentaje de los atomos de ox^geno no sustituidos.

12. Un metodo segun el punto 11, en el que cada grupo alquilo es independientemente un grupo alquilo Ci a C6, preferentemente un grupo alquilo C1 a C3, que esta saturado o insaturado, ramificado o no ramificado, que opcionalmente tiene un heteroatomo, mas preferentemente el grupo alquilo es independientemente el grupo metilo o el grupo propilo.

13. Un metodo segun el punto 11 o 12, en el que el N,N-dialquilquitosano tiene un grado de N-sustitucion (N-DS) de aproximadamente el 2,0.

14. Un metodo segun la reivindicacion uno cualquiera de los puntos 11 a 13, en el que quitosano tiene un grado de desacetilacion (DD) de aproximadamente el 100%, de aproximadamente el 95% o mas, de aproximadamente el 90 % o mas, de aproximadamente el 85 % o mas, de aproximadamente el 80 % o mas, de aproximadamente el 75 % o mas, de aproximadamente el 70 % o mas, de aproximadamente el 65 % o mas, o de aproximadamente el 60 % o mas.

15. Un metodo segun uno cualquiera de los puntos 11 a 14, en el que la etapa b) se lleva a cabo usando un aldehudo y acido formico.

16. Un metodo segun el punto 15, en el que el aldehudo es un aldehudo C1 a C6, preferentemente un aldehudo C1 a C3, que esta saturado o insaturado, ramificado o no ramificado, que opcionalmente tiene un heteroatomo, mas preferentemente el aldehudo es formaldehudo o propanal.

17. Un metodo segun uno cualquiera de los puntos 11 a 14, en el que la etapa b) es una reaccion de aminacion reductora.

18. Un metodo segun uno cualquiera de los puntos 11 a 17, en el que la etapa c) se lleva a cabo usando un agente de alquilacion y una base, en un disolvente de reaccion.

19. Un metodo segun el punto 18, en el que el grupo alquilo del agente de alquilacion es un grupo alquilo C1 a C6, preferentemente un grupo alquilo C1 a C3, que esta saturado o insaturado, ramificado o no ramificado, opcionalmente que tiene un heteroatomo, mas preferentemente el grupo alquilo del agente de alquilacion es el grupo metilo grupo o el grupo propilo

20. Un metodo segun el punto 18 o 19, en el que el agente de alquilacion es un haloalcano o un carbonato de dialquilo, preferentemente el agente de alquilacion es yodometano, yodopropano o carbonato de dimetilo.

21. Un metodo segun uno cualquiera de los puntos 18 a 20, en el que la base es una sal de hidroxido o un carbonato o un bicarbonato alcalino.

22. Un metodo segun uno cualquiera de los puntos 18 a 21, en el que la base es hidroxido de sodio o carbonato de sodio.

23. Un metodo segun el punto 18, en el que el disolvente de reaccion es W,W-dimetilformamida (DMF), agua, un alcohol, una mezcla de DMF y agua, una mezcla de DMF y un alcohol, o una mezcla de alcoholes.

24. Un metodo segun uno cualquiera de los puntos 11 a 23, en el que al menos uno de la etapa b) y la etapa c) se lleva a cabo usando un microondas.

25. Un metodo segun uno cualquiera de los puntos 11 a 24, que comprende adicionalmente la etapa de anadir HCl, HBr o HI para producir el W,W,W-trialquilquitosano con un contraion de cloruro, de bromuro o de yoduro.

26. El W,W,W-trimetilquitosano producido segun el metodo de uno cualquiera de los puntos 1 a 25.

27. El W,W,W-trimetilquitosano producido segun el metodo de uno cualquiera de los puntos 1 a 25, en asociacion con un contraion de carbonato, de haluro, de bromuro, de yoduro o de hidroxido.

28. El W,W,W-trimetilquitosano producido segun el metodo de uno cualquiera de los puntos 1 a 25 que tiene un grado de cuaternizacion de aproximadamente el 30 % o mas, y un grado de O-sustitucion de aproximadamente el 95 % o menos.

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29. El N,N,N-trimetilquitosano que tiene un grado de cuaternizacion de aproximadamente el 30% o mas, y un grado de O-sustitucion de aproximadamente el 95 % o menos.

30. El N,N,N-trimetilquitosano producido segun el metodo de uno cualquiera de los puntos 1 a 25, que tiene un

grado de cuaternizacion de aproximadamente el 35 % o mas, de aproximadamente el 40 % o mas, de

aproximadamente el 45 % o mas, de aproximadamente el 46 % o mas, de aproximadamente el 50 % o mas, de

aproximadamente el 55 % o mas, de aproximadamente el 60 % o mas, de aproximadamente el 65 % o mas, de

aproximadamente el 70 % o mas, de aproximadamente el 75 % o mas, de aproximadamente el 80 % o mas, de

aproximadamente el 85 % o mas, de aproximadamente el 90 % o mas, de aproximadamente el 95 % o mas, de

aproximadamente el 98 % o mas, o de aproximadamente el 100 %.

31. El N,N,N-trimetilquitosano que tiene un grado de cuaternizacion de aproximadamente el 35% o mas, de

aproximadamente el 40 % o mas, de aproximadamente el 45 % o mas, de aproximadamente el 46 % o mas, de

aproximadamente el 50 % o mas, de aproximadamente el 55 % o mas, de aproximadamente el 60 % o mas, de

aproximadamente el 65 % o mas, de aproximadamente el 70 % o mas, de aproximadamente el 75 % o mas, de

aproximadamente el 80 % o mas, de aproximadamente el 85 % o mas, de aproximadamente el 90 % o mas, de

aproximadamente el 95 % o mas, de aproximadamente el 98 % o mas, o de aproximadamente el 100 %.

32. El N,N,N-trimetilquitosano producido segun el metodo de uno cualquiera de los puntos 1 a 25, que tiene un

grado de O-sustitucion de aproximadamente el 90 % o menos, de aproximadamente el 85 % o menos, de

aproximadamente el 80 % o menos, de aproximadamente el 75 % o menos, de aproximadamente el 70 % o menos, de aproximadamente el 65 % o menos, de aproximadamente el 60 % o menos, de aproximadamente el 45 % o menos, de aproximadamente el 40 % o menos, de aproximadamente el 35 % o menos, de

aproximadamente el 30 % o menos, de aproximadamente el 25 % o menos, de aproximadamente el 20 % o menos, de aproximadamente el 15 % o menos, de aproximadamente el 10 % o menos, de aproximadamente el 5 % o menos, de aproximadamente el 2 % o menos, o de aproximadamente el 0 %.

33. El N,N,N-trimetilquitosano que tiene un grado de O-sustitucion de aproximadamente el 90% o menos, de

aproximadamente el 85 % o menos, de aproximadamente el 80 % o menos, de aproximadamente el 75 % o menos, de aproximadamente el 70 % o menos, de aproximadamente el 65 % o menos, de aproximadamente el 60 % o menos, de aproximadamente el 45 % o menos, de aproximadamente el 40 % o menos, de

aproximadamente el 35 % o menos, de aproximadamente el 30 % o menos, de aproximadamente el 25 % o menos, de aproximadamente el 20 % o menos, de aproximadamente el 15 % o menos, de aproximadamente el 10% o menos, de aproximadamente el 5% o menos, de aproximadamente el 2% o menos, o de aproximadamente el 0 %.

34. El N,N,N-trimetilquitosano producido segun el metodo de uno cualquiera de los puntos 1 a 25, que tiene un

grado de desacetilacion de aproximadamente el 100%, de aproximadamente el 95% o mas, de aproximadamente el 90 % o mas, de aproximadamente el 85 % o mas, de aproximadamente el 80 % o mas, de

aproximadamente el 75 % o mas, de aproximadamente el 70 % o mas, de aproximadamente el 65 % o mas, o de

aproximadamente el 60 % o mas.

35. El N,N,N-trimetilquitosano que tiene un grado de desacetilacion de aproximadamente el 100%, de

aproximadamente el 95 % o mas, de aproximadamente el 90 % o mas, de aproximadamente el 85 % o mas, de

aproximadamente el 80 % o mas, de aproximadamente el 75 % o mas, de aproximadamente el 70 % o mas, de

aproximadamente el 65 % o mas, o de aproximadamente el 60 % o mas.

36. Una composicion farmaceutica que comprende N,N,N-trimetilquitosano segun uno cualquiera de los puntos 26 a 35 y un portador farmaceuticamente aceptable.

37. Un metodo para el tratamiento de la hipercolesterolemia, que comprende la administracion de N,N,N- trimetilquitosano segun uno cualquiera de los puntos 26 a 35 o la composicion farmaceutica segun el punto 36 a un sujeto en necesidad del mismo.

38. Un metodo para favorecer la curacion de una herida, comprendiendo el metodo la aplicacion local en la herida de un producto para el cuidado de la piel que comprende N,N,N-trimetilquitosano segun uno cualquiera de los puntos 26 a 35.

39. Un metodo para aumentar la absorcion de una molecula a traves de las mucosas, que comprende la administracion a un sujeto de la molecula junto con N,N,N-trimetilquitosano segun uno cualquiera de los puntos 26 a 35 o la composicion farmaceutica segun el punto 36.

40. Un metodo para llevar a cabo la liberacion controlada de una molecula, que comprende la administracion a un sujeto de la molecula junto con N,N,N-trimetilquitosano segun uno cualquiera de los puntos 26 a 35 o la composicion farmaceutica segun el punto 36.

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41. Uso del N,N,N-trimetilquitosano segun uno cualquiera de los puntos 26 a 35 o de la composicion farmaceutica segun el punto 36, para el tratamiento de la hipercolesterolemia en un sujeto.

42. Uso del N,N,N-trimetilquitosano segun uno cualquiera de los puntos 26 a 35 o de la composicion farmaceutica segun el punto 35, para favorecer la curacion de una herida en un sujeto.

43. Uso del N,N,N-trimetilquitosano segun uno cualquiera de los puntos 26 a 35 o de la composicion farmaceutica segun el punto 36, para aumentar la absorcion de una molecula a traves de las mucosas.

44. Uso del N,N,N-trimetilquitosano segun uno cualquiera de los puntos 26 a 35 o de la composicion farmaceutica segun el punto 36, para la liberacion controlada de una molecula.

45. Uso del N,N,N-trimetilquitosano segun uno cualquiera de los puntos 26 a 35 o de la composicion farmaceutica segun el punto 36 junto con un agente hipocolesterolemiante que es un inhibidor de la reductasa de la HMG-CoA o un inhibidor de la absorcion del colesterol.

46. Uso del N,N,N-trimetilquitosano segun uno cualquiera de los puntos 26 a 35 como un agente hipocolesterolemiante.

47. Uso del N,N,N-trimetilquitosano segun uno cualquiera de los puntos 26 a 35 como un polyquaternium.

48. Uso del N,N,N-trimetilquitosano segun uno cualquiera de los puntos 26 a 35 como un emoliente.

49. Uso del N,N,N-trimetilquitosano segun uno cualquiera de los puntos 26 a 35 como un agente antimicrobiano.

50. El N,N,N-trimetilquitosano segun uno cualquiera de los puntos 26 a 35 o la composicion farmaceutica del

punto 36 para el tratamiento de la hipercolesterolemia.

51. El N,N,N-trimetilquitosano segun uno cualquiera de los puntos 26 a 35 o la composicion farmaceutica del punto 36, para favorecer la curacion de heridas.

52. El N,N,N-trimetilquitosano segun uno cualquiera de los puntos 26 a 35 o la composicion farmaceutica segun el punto 36, para su administracion junto con un agente hipocolesterolemiante que es un inhibidor de la reductasa de la HMG-CoA o un inhibidor de la absorcion del colesterol.

53. Un producto natural para la salud que comprende el N,N,N-trimetilquitosano de uno cualquiera de los puntos 26 a 35.

54. Un producto nutraceutico que comprende el N,N,N-trimetilquitosano de uno cualquiera de los puntos 26 a 35.

55. Un producto para el cuidado personal que comprende el N,N,N-trimetilquitosano de uno cualquiera de los puntos 26 a 35.

56. Un producto para el cuidado personal del punto 55, en el que el producto para el cuidado personal es un producto para el cuidado del cabello o un producto para el cuidado de la piel.

57. El producto para el cuidado personal del punto 55 o 56, para favorecer la curacion de heridas.

58. Un producto oftalmico que comprende el N,N,N-trimetilquitosano de uno cualquiera de los puntos 26 a 35.

59. Un producto cosmeceutico que comprende el N,N,N-trimetilquitosano de uno cualquiera de los puntos 26 a 35.

60. El producto cosmeceutico del punto 59, para favorecer la curacion de heridas.

61. Un producto cosmetico que comprende el N,N,N-trimetilquitosano de uno cualquiera de los puntos 26 a 35.

62. Uso del N,N,N-trimetilquitosano segun uno cualquiera de los puntos 26 a 35, en la preparacion de un medicamento para el tratamiento de la hipercolesterolemia en un sujeto.

63. Uso del N,N,N-trimetilquitosano segun uno cualquiera de los puntos 26 a 35, en la preparacion de un medicamento para favorecer la curacion de heridas en un sujeto.

64. Uso del N,N,N-trimetilquitosano segun uno cualquiera de los puntos 26 a 35, en la preparacion de un medicamento para aumentar la absorcion de una molecula a traves de las mucosas.

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65. Uso del N,N,N-trimetilquitosano segun uno cualquiera de los puntos 26 a 35, en la preparacion de un medicamento para la liberacion controlada de una molecula.

66. El N,N,N-trialquilaminopoKmero producido segun el metodo del punto 1.

67. El N,N,N-trialquilaminopolisacarido producido segun el metodo del punto 2.

68. El N,N,N-tripropilquitosano producido segun el metodo de uno cualquiera de los puntos 1 a 25.

Breve descripcion de los dibujos

En los dibujos anexos:

la Figura 1 es el espectro de RMN del DMC ■ HCl en D2O; la Figura 2 es el espectro de IR de A) quitosano, B) DMC, y C) TMC;

la Figura 4 muestra los cambios en el peso corporal durante las cuatro semanas de tratamiento con celulosa (cuadrados), TMC (rombos) y colestiramina (triangulos);

la Figura 5 muestra el colesterol total (sfmbolos negros) y no HDL plasmatico (VLDL, LDL y MDL - sfmbolos grises) durante las cuatro semanas de tratamiento con celulosa (cuadrados), TMC (rombos) y colestiramina (triangulos);

la Figura 6 muestra los cambios en las HDL durante las cuatro semanas de tratamiento con celulosa (cuadrados), TMC (rombos) y colestiramina (triangulos);

la Figura 7 muestra la proporcion de HDL / no HDL durante las cuatro semanas de tratamiento con celulosa (cuadrados), TMC (rombos) y colestiramina (triangulos);

la Figura 8 muestra los trigliceridos en las cuatro semanas de tratamiento con celulosa (cuadrados), TMC (rombos) y colestiramina (triangulos);

la Figura 9 muestra la evolucion del crecimiento y la tasa de crecimiento de las bacterias gramnegativas E. coli y P. aeruginosa basadas en la concentracion de tMC;

la Figura 10 muestra la evolucion del crecimiento y la tasa de crecimiento de las bacterias grampositivas S. aureus y E. faecalis basadas en la concentracion de TMC;

la Figura 11 muestra la evolucion del crecimiento y la tasa de crecimiento de las bacterias grampositivas M. smegmatis y S. beta hemolftico basadas en la concentracion de TMC.

Descripcion detallada de la invencion

La presente invencion proporciona, segun un aspecto, un metodo para la preparacion de N,N,N- trialquilaminopolfmeros que tienen otros heteroatomos no sustituidos diferentes del N, particularmente N,N,N- trialquilpolisacaridos. En algunas realizaciones, los grupos alquilo son cada uno independientemente un grupo alquilo C1 a C6, preferentemente C1 a C3, que esta saturado o insaturado, ramificado o no ramificado. Mas preferentemente, el grupo alquilo es el grupo metilo o el grupo etilo. Los otros heteroatomos presentes pueden ser O o S. unicamente es alquilado un bajo porcentaje de los demas heteroatomos durante el metodo de preparacion segun la invencion.

En las realizaciones de la invencion, el N,N-dialquilaminopolfmero y el N,N-dialquilaminopolisacarido son el N,N- dimetilaminopolfmero y el N,N-dimetilaminopolfmero, respectivamente. En estas realizaciones, la preparacion del N,N-dialquilaminopolfmero y del N,N-dialquilaminopolfmero se lleva a cabo mediante una aminacion reductora que implica el uso de un aldehudo tal como formaldehudo o propanal, y de acido formico (reaccion de Eschweiler-Clarke). En las realizaciones de la invencion en las que el grupo alquilo no es metilo, la persona experta comprendera que se lleva a cabo una reaccion de alquilacion adecuada, que se detiene en la doble N-alquilacion.

El N,N-dimetilaminopolfmero y el N,N-dimetilaminopolisacarido son sometidos posteriormente a una reaccion de alquilacion que implica el uso de un agente de alquilacion y de una base. La reaccion de alquilacion se lleva a cabo en un disolvente adecuado que puede incluir o no un disolvente organico. Un disolvente de reaccion adecuado puede ser dimetilformamida (DMF), agua y/o un alcohol. El agente de alquilacion puede ser un haluro de alquilo o un carbonato de dialquilo.

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La invencion proporciona adicionalmente, segun otro aspecto, un metodo para la preparacion de N,N,N- trimetilquitosano (TMC). La preparacion del N,N-dimetilquitosano se lleva a cabo mediante una aminacion reductora que implica el uso de formaldehudo y de acido formico (reaccion de Eschweiler-Clarke). El N,N-dimetilquitosano es sometido posteriormente a una reaccion de alquilacion que implica el uso de un agente de alquilacion y de una base.

La reaccion de alquilacion se lleva a cabo en un disolvente de reaccion que DMF, agua, un alcohol, una mezcla de DMF y agua, una mezcla de DMF y un alcohol o una mezcla de alcoholes. Una base adecuada usada en la reaccion de alquilacion es hidroxido de sodio o carbonato de sodio. En las realizaciones de la invencion, la reaccion de alquilacion se lleva a cabo en un microondas. El quitosano usado en el metodo segun la invencion tiene un grado de N-sustitucion (N-DS) de aproximadamente 2,0. Unicamente un bajo porcentaje de los atomos de O que no estan sustituidos son metilados durante el metodo de preparacion.

En un aspecto, la presente invencion proporciona N,N,N-trimetilquitosano (TMC) con un grado de cuaternizacion de aproximadamente el 30 % o mas, y un grado de O-sustitucion (O-DS) de aproximadamente el 95 % o menos.

En el presente documento, el grado de cuaternizacion (DQ) del N,N,N-trimetilquitosano (TMC) es la proporcion entre el numero de atomos de nitrogeno del TMC portadores de tres grupos metilo y el numero total de atomos de nitrogeno del TMC. El grado de cuaternizacion puede ser expresado como una proporcion o como un porcentaje.

En algunas realizaciones, el TMC tiene un grado de cuaternizacion de aproximadamente el 35 % o mas, de aproximadamente el 40 % o mas, de aproximadamente el 45 % o mas, de aproximadamente el 46 % o mas, de

En el presente documento, el grado de O-sustitucion (O-DS) es la proporcion entre el numero de atomos de oxfgeno en las posiciones 3 y 6 del TMC portadores de un grupo metilo y el numero total de atomos de oxfgeno en las posiciones 3 y 6 del TMC. El grado de O-sustitucion (O-DS) puede ser expresado como una proporcion o como un porcentaje. El grado de O-sustitucion es bajo. Tambien, en los N,N,N-trialquilaminopolfmeros y los N,N,N- trialquilaminopolisacaridos segun la invencion en los que los otros heteroatomos diferentes al atomo de nitrogeno no son atomos de oxfgeno, el grado de sustitucion de dicho heteroatomo es bajo. Segun se usa en el presente documento, un "bajo grado de sustitucion" de los heteroatomos diferentes al atomo de nitrogeno tales como atomos de oxfgeno significa un grado de sustitucion de aproximadamente el 90 % o menos, 85 % o menos de aproximadamente el 85 % o menos, de aproximadamente el 80 % o menos, de aproximadamente el 75 % o menos, de aproximadamente el 70 % o menos, de aproximadamente el 65 % o menos, de aproximadamente el 60 % o menos, de aproximadamente el 45 % o menos, de aproximadamente el 40 % o menos, de aproximadamente el 35 % o menos, de aproximadamente el 30 % o menos, de aproximadamente el 25 % o menos, de aproximadamente el 20 % o menos, de aproximadamente el 15 % o menos, de aproximadamente el 10 % o menos, de aproximadamente el 5 % o menos, de aproximadamente el 2 % o menos, o de aproximadamente el 0 %.

En algunas realizaciones, el TMC tiene un grado de O-sustitucion de aproximadamente el 90 % o menos, del 85 % o menos de aproximadamente el 85 % o menos, de aproximadamente el 80 % o menos, de aproximadamente el 75 % o menos, de aproximadamente el 70 % o menos, de aproximadamente el 65 % o menos, de aproximadamente el 60 % o menos, de aproximadamente el 45 % o menos, de aproximadamente el 40 % o menos, de aproximadamente el 35 % o menos, de aproximadamente el 30 % o menos, de aproximadamente el 25 % o menos, de aproximadamente el 20 % o menos, de aproximadamente el 15 % o menos, de aproximadamente el 10 % o menos, de aproximadamente el 5 % o menos, de aproximadamente el 2 % o menos, o de aproximadamente el 0 %.

El N,N,N-trimetilquitosano de la invencion es un polication, y por lo tanto esta en asociacion, al menos en su forma solida, con un contraion. Puede usarse cualquier contraion adecuado. La persona experta seleccionara este contraion dependiendo del uso final del TMC. En algunas realizaciones, el contraion es un ion de carbonato (CO32'), un ion de haluro, tal como un ion de cloruro (Cl-) o de yoduro (I-), o un ion de hidroxido (OH-).

El N,N,N-trimetilquitosano de la invencion tambien tiene un grado de desacetilacion (DD) que depende del DD del quitosano a partir del cual se elabora el N,N,N-trimetilquitosano. En el presente documento, el grado de desacetilacion del TMC o del quitosano es la proporcion entre el numero de atomos de nitrogeno del TMC o del quitosano que no portan un grupo acetilo y el numero total de atomos de nitrogeno del TMC o del quitosano. El grado de desacetilacion puede ser expresado como una proporcion o como un porcentaje.

Debe apreciarse que unicamente los atomos de nitrogeno del quitosano que no porten un grupo acetilo pueden portar tres grupos metilo. Por lo tanto, el mayor DQ obtenible para un TMC dado depende directamente del DD del quitosano usado para su elaboracion. Por ejemplo, un quitosano con un DD del 85 % unicamente tiene disponibles un 85 % de sus atomos de nitrogeno para ser cuaternizados. Por lo tanto, el mayor DQ para el TMC producido a partir de este quitosano sera del 85 %.

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En algunas realizaciones, el TMC (y tambien el quitosano a partir del cual se ha preparado) tiene un DD de aproximadamente el 100%, de aproximadamente el 95% o mas, de aproximadamente el 90% o mas, de aproximadamente el 85 % o mas, de aproximadamente el 80 % o mas, de aproximadamente el 75 % o mas, de aproximadamente el 70 % o mas, de aproximadamente el 65 % o mas, o de aproximadamente el 60 % o mas.

Como sera evidente para la persona experta, se espera que el TMC de la invencion, al ser un derivado el quitosano, que es biodegradable, sea biodegradable.

Dependiendo del contraion, el TMC de la invencion puede ser soluble o insoluble en agua. Por ejemplo, el inventor ha observado que el carbonato de TMC es insoluble en agua, mientras que el cloruro de TMC cloruro es soluble en este disolvente. Esto es diferente de la tecnica anterior, en la que la insolubilidad generalmente es debida a una excesiva O-metilacion o a la presencia de aniones sulfato.

Smtesis

Se preve un metodo para la preparacion de TMC. El inventor intento en primer lugar la produccion del TMC directamente a partir del quitosano (con un DD del 95-96 %) usando un agente de alquilacion y una base, segun se ensena en los informes previos, pero unicamente se obtuvieron unos TMC con unos bajos DQ. Por ejemplo, en una mezcla de agua:DMF, el DQ puede ser de aproximadamente el 29 %, con un 59 % de unidades dimetiladas, y un 2 % de unidades monometiladas. Los intentos adicionales de usar diversos nuevos agentes de alquilacion y bases fueron, de forma similar, infructuosos. Por ejemplo, la metilacion mediante el uso de dimetilsulfato da lugar a un producto insoluble.

Segun los estudios descritos en el presente documento, el inventor ha disenado y desarrollado un metodo mejorado para la preparacion de TMC.

En el metodo segun la invencion, el W,W-dimetilquitosano (DMC) tiene esencialmente todos los atomos de nitrogeno sustituidos (grado de W-sustitucion de aproximadamente 2,0).

En primer lugar, el metodo segun la invencion implica la preparacion de W,W-dimetilquitosano. Esta primera parte del metodo comprende:

■ proporcionar quitosano; y

■ metilar el quitosano a traves de una reaccion de Eschweiler-Clarke usando acido formico y formaldetudo.

El metodo permite la produccion de DMC con esencialmente todos los atomos de nitrogeno doblemente metilados (es decir, un grado de W-sustitucion de aproximadamente 2,0). El metodo tambien permite la produccion de DMC con un buen rendimiento y pureza.

Ventajosamente, el quitosano usado como material de partida puede tener un DD de aproximadamente el 95-96 % y una viscosidad de 150 cps (acido acetico acuoso al 1 %), que se corresponde con un quitosano de calidad comercial que esta disponible a bajo coste. El quitosano esta disponible con diversos pesos moleculares que permiten la obtencion de DMC (y finalmente de TMC) de los correspondientes diversos pesos moleculares. En algunas realizaciones de la invencion, el quitosano tiene un DD de aproximadamente el 100 %, de aproximadamente el 95 % o mas, de aproximadamente el 90 % o mas, de aproximadamente el 85 % o mas, de aproximadamente el 80 % o mas, de aproximadamente el 75 % o mas, de aproximadamente el 70 % o mas, de aproximadamente el 65 % o mas, o de aproximadamente el 60 % o mas, de aproximadamente el 55 % o mas, o de aproximadamente el 50 % o mas.

Ventajosamente, la reaccion de Eschweiler-Clarke puede llevarse a cabo en agua y con unas cantidades reducidas de reactivos, particularmente de acido formico. La reaccion de Eschweiler-Clarke o la metilacion de Eschweiler- Clarke es una reaccion qmmica mediante la cual una amina primaria (o secundaria) es metilada usando un exceso de acido formico y formaldetudo. Esta reaccion de aminacion reductora no produce sales de amonio cuaternario, sino que en su lugar se detiene en la etapa de la amina terciaria.

El mecanismo de la reaccion de Eschweiler-Clark es:

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La primera metilacion de la amina comienza con la formacion de una imina con formaldetndo. El acido formico actua como una fuente de hidruro y reduce la imina a una amina secundaria. La fuerza directriz es la formacion de dioxido de carbono gaseoso. La formacion de la amina terciaria es similar. A partir de este mecanismo esta claro que nunca se formara una sal de amonio cuaternario, debido a que para una amina terciaria es imposible formar otra imina o un ion iminio.

En segundo lugar, el metodo segun la invencion implica la preparacion del TMC. Esta segunda parte del metodo comprende:

■ proporcionar el W,A/-dimetilquitosano que tiene esencialmente todos los atomos de nitrogeno doblemente metilados (es decir, un grado de W-sustitucion de aproximadamente 2,0), y

■ metilar el W,W-dimetilquitosano usando un agente de alquilacion y una base.

En algunas realizaciones, el agente de alquilacion es yodometano.

En algunas realizaciones, la etapa de metilacion se lleva a cabo en un disolvente organico, tal como DMF.

En algunas realizaciones, la etapa de metilacion se lleva a cabo en una mezcla de DMF:H2O, por ejemplo, una mezcla al 50:50 (v/v). En dicha mezcla el agua puede estar presente en unos porcentajes de aproximadamente el 15 % o mas.

En otras realizaciones, la etapa de metilacion se lleva a cabo en agua.

En otras realizaciones, la etapa de metilacion se lleva a cabo en agua mezclada con un disolvente organico miscible en agua. El proposito de este disolvente organico miscible en agua es aumentar la miscibilidad del yodometano en el medio de reaccion. Algunos ejemplos no limitantes de disolventes incluyen metanol y etanol. Pueden estar presentes en una cantidad de desde aproximadamente el 0 % hasta aproximadamente el 50 %, y posiblemente mas dependiendo de la solubilidad de los reactivos exactos usados en el medio de reaccion. En algunas realizaciones, el disolvente es una mezcla de agua-metanol, por ejemplo, una mezcla al 90:10 (v/v).

La evitacion de la W,W-dimetilformamida (DMF), que es el disolvente habitual para la metilacion del quitosano para producir TMC, elimina la produccion secundaria de tetrametilamonio, que puede producirse cuando se usa una base fuerte, tal como hidroxido de sodio. En los casos en los que se produzca, el tetrametilamonio debe ser eliminado durante la purificacion del TMC, por ejemplo, mediante una ultrafiltracion.

En algunas realizaciones, la base es un carbonato o un bicarbonato alcalino, tal como bicarbonato de sodio o carbonato de sodio. El uso de esta base reduce la metilacion de los grupos alcohol en las posiciones 3 y 6. Otra ventaja del uso de esta base es que los carbonatos de TMC son insolubles en agua, lo que facilita la purificacion del TMC (que por lo tanto puede ser efectuada mediante una simple filtracion) cuando se usa agua junto con un disolvente organico como disolvente de reaccion.

En otras realizaciones, la base es hidroxido de sodio.

En una realizacion, el agente de alquilacion es yodometano, la etapa de metilacion se lleva a cabo en agua y la base es bicarbonato de sodio. Esta realizacion esta ilustrada en el siguiente esquema, junto con la produccion de DMC.

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Esto evita la produccion de impurezas y reduce o elimina la O-metilacion. Esto tambien reduce los costes y elimina la necesidad de una ultrafiltracion. El carbonato de TMC asf producido puede ser transformado en cloruro de TMC mediante la simple adicion de HCl. Tambien sena posible la transformacion en cloruro de TMC en el estomago, que contiene HCl. Dicho cloruro de TMC es soluble en agua, se obtuvo con una excelente pureza (veanse los siguientes ejemplos), un elevado DQ, y finalmente, no se observo O-alquilacion.

En algunas realizaciones, en la metilacion del W,A/-dimetilquitosano se usa adicionalmente una sal tal como Nal o NaCl, usando el agente de alquilacion y la base. En algunas realizaciones, esta sal es Nal.

El TMC se ha sintetizado con exito a una escala de 10 g usando el metodo anterior.

El metodo anterior de elaboracion del TMC tiene varias ventajas:

■ proporciona un buen control del DQ (de entre el 0 % y el 100 %) a traves de la variacion de la reaccion y de la cantidad de reactivos usada,

■ proporciona un buen control del peso molecular y del DD del TMC (a traves de la seleccion del quitosano usado como material de partida, ya que no es hidrolizado significativamente durante la reaccion),

■ el TMC tiene un bajo O-DS (metilacion de los atomos de oxfgeno de las posiciones 3 y 6),

■ el TMC se proporciona con un buen rendimiento y una buena pureza.

Tambien, cuando se compara con la tecnica anterior, no es preciso repetir la etapa de metilacion varias veces para obtener unos elevados DQ. Cuando la reaccion se lleva a cabo en un horno microondas, se usa un exceso de yodometano, pero puede ser reciclado y reutilizado.

En algunas realizaciones, los metodos de la invencion para la elaboracion de DMC y de TMC usan algunos reactivos Generalmente Reconocidos Como Seguros (GRAS) y ningun disolvente organico, excepto los alcoholes.

Para la persona experta sera evidente que el metodo segun la invencion puede usarse para la cuaternizacion de poli-L-arginina, asf como de otros aminopolfmeros.

Usos

Los TMC en general, y el compuesto de la invencion en particular, tienen diversos usos. Pueden usarse por aumentar la absorcion de moleculas a traves de las mucosas, lo que puede ser util en la elaboracion de vacunas y de algunos farmacos. Tambien pueden usarse para la liberacion controlada de diversas sustancias, incluyendo genes y protemas.

Agente hipocolesterolemiante

La hipercolesterolemia afecta a mas del 4 % de la poblacion general (en comparacion con el 2 % para la diabetes) y en algunos pafses a un 20-30 % de las personas de mas de 45-50 anos. La hipercolesterolemia es el principal factor de riesgo de enfermedades cardiovasculares, que son la principal causa de muerte en las sociedades occidentales (un 37 % de todas las muertes en 1997).

La primera lmea de tratamiento de la hipercolesterolemia es la administracion de inhibidores de la reductasa de HMG-CoA (estatinas, tales como lovastatina (Mevacor, Altoprev), pravastatina (Pravachol), simvastatina (Zocor), fluvastatina (Lescol), atorvastatina (Lipitor), rosuvastatina (Crestor), nivastatina, mevastatina, mevinolin, atorvastatina de calcio et pitavastatina). Sin embargo, se estima que el 27-60 % de los pacientes en una monoterapia con estatinas no alcanza su nivel objetivo de colesterol de lipoprotemas de baja densidad (LDL-C). Adicionalmente, las estatinas tienen efectos secundarios tales como una miopatfa.

Tambien se usan otros metodos para reducir los niveles de colesterol en sangre. Estos incluyen el uso de inhibidores de la absorcion del colesterol (Ezetimibe) y secuestrantes de acidos biliares (BAS) tales como colestiramina

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(Questran), colestipol (Colestid), sevelamer HCl (Renagel de Genzima Corp.) y Covalesam (Welchol), que son resinas sinteticas. Los BAS estan cargados positivamente e interactuan fuertemente con las cargas negativas de las sales biliares. Los BAS eliminan las sales biliares mediante sorcion o precipitacion, lo que provoca su eliminacion con las heces, y por lo tanto impide su absorcion en el intestino. Para mantener la cantidad requerida de sales biliares, el hngado usara el colesterol para producir acidos biliares, reduciendo asf los niveles de colesterol.

Tambien existe un BAS natural disponible sin receta: Cholestol™. Es un oligosacarido de quitosano de 40 kDa. Cholestol™ es insoluble en agua a todos los pH.

Los TMC en general, y el compuesto de la invencion en particular, tambien pueden usarse como agentes hipocolesterolemiantes. De hecho, segun se muestra en los siguientes Ejemplos, el TMC de la invencion es un secuestrante de acidos biliares. Las interacciones electrostaticas entre el quitosano cuaternizado (cargado positivamente) y las sales biliares (cargadas negativamente) favorece el secuestro de las ultimas. Debido a su elevado peso molecular, el compuesto de la invencion no es absorbido por el cuerpo. Por lo tanto, mediante su union a los acidos biliares, el compuesto de la invencion impide su reabsorcion enterohepatica y provoca su eliminacion con las heces. Esto da lugar a un aumento en la produccion de acidos biliares por parte del hngado. El hngado usa el colesterol para producir los acidos biliares, lo que da como resultado una disminucion en los niveles plasmaticos de colesterol.

El compuesto de la invencion es por lo tanto util para el tratamiento de la hipercolesterolemia, especialmente de una hipercolesterolemia entre leve y moderada. En los siguientes Ejemplos, las pruebas han demostrado que el compuesto de la invencion es un mejor secuestrante de acidos biliares (glicocolato de sodio y taurocolato de sodio) que el Cholestol™ y es aproximadamente tan eficaz como la colestiramina. Se cree que la solubilidad del TMC de la invencion lo hace mas disponible para el atrapamiento de los acidos biliares en el intestino que los productos insolubles.

Como tal, el compuesto de la invencion representa una alternativa natural a los tratamientos existentes. Por lo tanto, podna ser parte de una composicion farmaceutica, de un producto para la salud natural, de un producto nutraceutico o de un producto alimenticio.

El compuesto de la invencion tambien puede usarse como se muestra en los siguientes Ejemplos, para aumentar la proporcion de colesterol HDL/no HDL.

Tomando como base los resultados presentados en los siguientes ejemplos, en la bibliograffa relativa a la tecnica anterior sobre TMC y el hecho de que el TMC deriva del quitosano, un producto natural no toxico, se concibe que el TMC no mostrara una toxicidad significativa. De hecho, el compuesto de la invencion es hidrofilo y soluble en agua al pH intestinal, al contrario que la colestiramina y el Cholestol™. Por lo tanto, se concibe que la hidrofilia del TMC reducira el dolor de estomago, el estrenimiento y/o la diarrea, que pueden estar asociados con la administracion de colestiramina y de Cholestol™.

El compuesto de la invencion tambien puede usarse junto con los agentes hipocolesterolemiante existentes, incluyendo, por ejemplo, inhibidores de la reductasa de HMG-CoA y/o inhibidores de la absorcion del colesterol.

Polyquaternium y emoliente

"Polyquaternium" es la denominacion de la Nomenclatura Internacional de Ingredientes Cosmeticos (INCI) para diversos polfmeros policationicos que se usan en la industria del cuidado personal. Polyquaternium es un neologismo usado para enfatizar la presencia de centros de amonio cuaternario en el polfmero. La INCI ha aprobado al menos 37 polfmeros diferentes con la denominacion de polyquaternium. Los diferentes polfmeros se distinguen por el valor numerico que sigue a la palabra "polyquaternium".

Polyquaternium: Identidad qrnmica

Polyquaternium-1: Etanol, 2,2',2"-nitrilotris-, polfmero con 1,4-dicloro-2-buteno y N,N,N',N'-tetrametil- 2-buten-1,4- diamina

Polyquaternium-2: Poli[bis(2-cloroetil) eter-alt-1,3-bis[3-(dimetilamino)propil]urea]

Polyquaternium-4: Copolfmero de hidroxietil celulosa y cloruro de dimetil dialilamonio; copolfmero de cloruro de dialildimetilamonio-hidroxietil celulosa

Polyquaternium-5: Copolfmero de acrilamida y metacrilato de dimetilamonioetilo cuaternizado

Polyquaternium-6: Poli(cloruro de dialildimetilamonio)

Polyquaternium-7: Copolfmero de acrilamida y cloruro de dialildimetilamonio

Polyquaternium-8

Polyquaternium-9

Polyquaternium: Identidad qrnmica

Polyquaternium-10: Hidroxietil celulosa cuaternizada

Polyquaternium-11: Copolfmero de vinilpirrolidona y metacrilato de dimetilaminoetilo cuaternizado

Polyquaternium-12

Polyquaternium-13

Polyquaternium-14

Polyquaternium-15: Copolfmero de acrilamida-cloruro de dimetilaminoetil metacrilato de metilo

Polyquaternium-16: Copolfmero de vinilpirrolidona y vinilimidazol cuaternizado

Polyquaternium-17

Polyquaternium-18

Polyquaternium-19

Polyquaternium-20

Polyquaternium-22: Copolfmero de acido acnlico y cloruro de dialildimetilamonio

Polyquaternium-24

Polyquaternium-27

Polyquaternium-28: Copolfmero de vinilpirrolidona y metacrilamidopropil trimetilamonio

Polyquaternium-29

Polyquaternium-30

Polyquaternium-31

Polyquaternium-32: Poli(cloruro de acrilamida 2-metacriloxietiltrimetil amonio)

Polyquaternium-33

Polyquaternium-34

Polyquaternium-35

Polyquaternium-36

Polyquaternium-37: Poli(cloruro de 2-metacriloxietiltrimetilamonio)

Polyquaternium-39: TerpoUmero de acido acnlico, acrilamida y cloruro de dialildimetilamonio

Polyquaternium-42

Polyquaternium-45

Polyquaternium-46: Terpolfmero de vinilcaprolactama, vinilpirrolidona y vinilimidazol cuaternizado

Polyquaternium-47: Terpolfmero de acido acnlico, cloruro de metacrilamidopropil trimetil amonio y acrilato de metilo

Los polyquaterniums (PQ) se usan en champus, acondicionadores, espumas para el cabello, lacas, colorantes para el cabello y geles para el cabello, jabones lfquidos y lociones, cremas para las manos y el cuerpo y soluciones para lentes de contacto. Debido a que estan cargados positivamente, neutralizan las cargas negativas de la mayona de 5 los champus y de las protemas del cabello y ayudan al alisado del cabello. Sus cargas positivas tambien les unen ionicamente al cabello y a la piel. Algunos tienen propiedades antimicrobianas.

Los PQ disponibles en el comercio generalmente son polfmeros solubles en agua cargados positivamente con multiples aminas cuaternarias que forman complejos ionicos con tensioactivos (documento EP 1250118 B1). Estas 10 propiedades fisicoqmmicas (complejacion y viscosidad) son buscadas cuando se formulan productos para el cuidado del cuerpo. Las fichas tecnicas de los PQ comerciales muestran diversos derivados de la misma molecula con unos pesos moleculares, unos grados de cuaternizacion y una hidrofobicidad variables (veanse, por ejemplo, los productos SoftCAT™ de The Dow Chemical Company). Esto permite a los formuladores elegir el derivado espedfico correspondiente a sus necesidades.

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Las formulaciones de champus actuales aspiran a hacer bastante mas que simplemente limpiar el cabello. A menudo tambien aspiran a acondicionar el cabello, suavizar la superficie del cabello, facilitar la manipulacion del cabello y que tenga un aspecto cremoso. Los PQ juegan un importante papel para conseguir estos objetivos. Los champus ahora son multifuncionales (2 en 1 y 3 en 1) e incorporan una gran diversidad de ingredientes (vitaminas, 20 siliconas, derivados de protemas...).

Teniendo en consideracion los grandes volumenes de productos implicados, asf como las preocupaciones relacionadas con el medio ambiente y la salud del consumidor, la industria cosmeceutica se esta orientando hacia

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productos mas naturales y biodegradables. Los actuales PQ son, sin embargo, de origen sintetico o incorporan grandes partes sinteticas.

Los PQ se usan en cosmetica debido a que se unen a las superficies cargadas negativamente, tales como las membranas celulares y las protemas. Ademas, debido a su naturaleza polimerica, los PQ (en unas proporciones de aproximadamente el 0,5 %) aumentan la viscosidad del producto, especialmente en las cremas para la piel. Un estudio sobre la toxicidad de once PQ demostro que la dosis toxica (CE50) es de entre <1,0 y 10 mg/l para diez de ellos, excepto para el polyquaternium-10 con bajas unas densidades de carga (Cumming J. L., Hawker D. W., Nugent K. W., Chapman H. F., Journal of Environmental Science and Health Parte A, 2008, 43, 113).

Los polfmeros cationicos tales como los PQ forman complejos (coacervacion) con tensioactivos, y por lo tanto actuan como un acondicionador para la deposicion de este complejo sobre el cabello y como un agente de estructuracion para las composiciones cosmeticas acuosas para el cabello o la piel. Cuando la proporcion molar del tensioactivo ionico es igual a la proporcion molar de la carga positiva del polyquaternium (PQ), la viscosidad de la solucion se reduce significativamente y se forma una segunda fase (Gruber J. V., Journal of Cosmetic Science, 2009, 60, 385).

La viscosidad y la turbidez de la solucion del PQ se ve afectada por la estructura y por la proporcion molar del tensioactivo.

El Polyquaternium-10 esta formado por una cadena principal de celulosa en la que se ha injertado un polietilenglicol portador de una amina cuaternaria. Se usa como agente antibacteriano en soluciones para lentes de contacto.

Los TMC en general, y el compuesto de TMC de la invencion en particular, puede usarse como un polyquaternium (PQ) y/o como un moliente en productos para el cuidado personal, especialmente en productos para el cabello y la piel, tales como champus, acondicionadores, espumas para el cabello, lacas, colorantes para el cabello, geles para el cabello, jabones lfquidos y lociones, cremas para las manos y/o el cuerpo, y similares.

El compuesto de la invencion tiene una estructura con aminas cuaternarias que es similar a la de los PQ comerciales. Al igual que ellos, forma complejos ionicos con tensioactivos naturales y sinteticos (por ejemplo, las sales biliares y el dodecilsulfato de sodio), y por lo tanto tiene unas propiedades similares. Ademas, el grado de cuaternizacion (DQ) y el peso molecular del compuesto de la invencion pueden ser controlados al igual que en los PQ comerciales, y por lo tanto permiten la optimizacion de sus propiedades dependiendo de las caractensticas deseadas de producto final. Por lo tanto, el compuesto de la invencion puede sustituir a los PQ comerciales.

El compuesto de la invencion (a) es un derivado del quitosano, que se sabe que no es toxico, y (b) no muestra ninguna toxicidad durante las pruebas in vivo descritas en el presente documento. Por lo tanto se concibe que los compuestos de la invencion sean aceptables en formulaciones que entren en contacto con la piel y/o el cuero cabelludo.

Agente antimicrobiano o bacteriostatico

Los TMC de la invencion tambien pueden usarse como un agente antimicrobiano o bacteriostatico en diversos productos, incluyendo productos para el cuidado personal, cosmeticos, farmaceuticos o cosmeceuticos, que incluyen, pero no se limitan a, los descritos anteriormente, y en productos para el tratamiento de heridas.

La formulacion de cremas y geles requiere normalmente la adicion de parabenos sinteticos como agente antimicrobiano, ejemplo, en productos cosmeticos y dermatologicos, incluyendo los productos destinados a favorecer la curacion de heridas. Esto es especialmente cierto para los productos que son de uso repetido (fuera de un recipiente individual) durante un periodo de tiempo. El compuesto de la invencion puede usarse como un agente bacteriostatico natural (agente antimicrobiano) en dichos productos.

Ademas, segun se hacen mas restrictivas las normativas medioambientales, la industria tiene que usar conservantes antimicrobianos con un menor impacto sobre el medio ambiente. El compuesto de la invencion sera muy ventajoso en ese contexto.

Ademas, el compuesto de la invencion, al ser un biopolfmero hidrofilo, actua como un emoliente, lo que es una propiedad deseable en muchos productos. Particularmente, esto permitira el mantenimiento de una herida tratada humeda, favoreciendo asf el proceso de curacion.

Las metaloproteinasas de la matriz (MMP) en exceso en heridas cronicas dan como resultado la degradacion de las protemas de la matriz extracelular y la inactivacion de los factores de crecimiento relativos a la reconstruccion del tejido. Con una cierta proporcion controlada de grupos amino no cuaternizados, el compuesto de la invencion regulara la actividad de las MMP que de otro modo desestabilizanan el proceso de curacion a traves de una coordinacion.

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Por lo tanto, el compuesto de la invencion tiene una accion triple, lo que lo hace muy atractivo como ingrediente antimicrobiano (o antibacteriano) en varios productos, especialmente en los productos para el tratamiento de heridas cronicas.

Otros objetos, ventajas y caractensticas de la presente invencion seran mas evidentes tras la lectura de las siguientes descripciones no restrictivas de realizaciones espedficas de la misma, proporcionadas unicamente a modo de ejemplo con referencia a los dibujos anexos.

Descripcion de las realizaciones ilustrativas

La presente invencion esta ilustrada con mas detalle por los siguientes ejemplos no limitantes.

Ejemplo 1 - Smtesis y caracterizacion del TMC

En este ejemplo se describe la preparacion de W,W-dimetilquitosano (DMC) usando el procedimiento de Eschweiler- Clarke.

Esta es una reaccion de metilacion con acido formico y formaldel'ndo. Segun se muestra a continuacion, este procedimiento de metilacion posee la ventaja de metilar exclusivamente los grupos amino a traves de una reduccion in situ de un grupo imino. El procedimiento de Eschweiler-Clarke permite la sustitucion del yodometano de la tecnica anterior por un donante primario y secundario.

Entonces, el DMC ha sido W-metilado selectivamente a TMC con un DQ de 0,46 usando yodometano y bicarbonato de sodio en una mezcla de DMF/agua. Segun se muestra en el Ejemplo 2, este TMC muestra una eficacia de sorcion de las sales biliares comparable a la de la colestiramina, el secuestrante de acidos biliares usado mas ampliamente.

Seccion experimental

Informacion general. Se adquirio quitosano de alto peso molecular a partir de conchas de langostinos nordicos (Pandalus borealis) con un grado de desacetilacion del 95,9% y una viscosidad de 157 cps para una solucion acuosa de acido acetico al 1 % en Marinard Biotech Inc. (Gaspe, Canada). El quitosano fue molido mecanicamente hasta 0,6 mm antes de su utilizacion. El agua se desionizo con un sistema nanopur Diamond (modelo D11931) de Barnestead. El glicocolato de sodio (NaGC), el taurocolato de sodio (NaTC), la colestiramina, el fosfato de potasio monobasico anhidro (de calidad analftica), el cloruro de sodio (de calidad SigmaUltra) y el 4-hidroxibencensulfonato de sodio se obtuvieron en Sigma-Aldrich. Las ultrafiltraciones se llevaron a cabo con membranas de filtracion de celulosa regeneradas (Amicon YM) que poseen un corte de 30.000 NMWL en una celda agitada adquirida en Millipore. Los espectros de IR y de rMn se registraron respectivamente con un espectrometro PerkinElmer modelo 1600 series IR mediante el metodo del KBr, y con un espectrometro de RMN Bruker a 700 MHz. Las constantes de acoplamiento se proporcionan en hercios. Los analisis elementales de los derivados de quitosano para determinar el grado de sustitucion se llevaron a cabo con un analizador elemental Costech 410. Las capacidades de union de los derivados del quitosano se llevaron a cabo con un sistema Shimadzu HPLC (modelo 10A DVP).

Ejemplo 1a - Preparacion de W,W-dimetilquitosano (DMC). En un matraz de fondo redondo de 250 ml se preparo una solucion de quitosano (2,01 g, 12,5 mmol de unidades de glucopiranosilo) en acido formico al 88% (100 ml). La solucion viscosa de color amarillo se trato con una solucion de formaldel'ndo al 37% (16,6 ml, 0,166 mol) y se calento a 90 °C durante 23 h. Precauciones: dependiendo de la velocidad de calentamiento puede observarse una vigorosa liberacion de dioxido de carbono. La solucion resultante se evaporo a sequedad a presion reducida. El solido se disolvio en agua (100 ml) y el pH de esta solucion se ajusto a 8-9 mediante la adicion de una solucion acuosa de hidroxido de sodio 5 M. El precipitado se filtro y se lavo con agua (50 ml), etanol (50 ml) y eter dietflico (50 ml). El solido finalmente se seco durante una noche a vado. Se obtuvo un solido de color blanquecino con un rendimiento del 73 % (1,71 g). IR (cm'1) 3449 (OH), 2927 y 2881 (CH), 1658, 1481, 1000 - 1200 (C-O), 851. RMN 1H en D2O del DMC protonado con HCl, 6 5,06 (d, 1H, ^12= 6,5, H1), 4,20 (t, 1H, J = 8,7, H3), 4,08 (t, 1 H, J = ~ 7, H4), 3,92 (d, 1 H, J = 10,4, H6), 3,80 (ancho, 1 H, H5), 3,73 (d, 1 H, J = 8,6, H6), 3,36 (t, J = ~ 7, H2), 3,03 (s, 6H, CH3) ppm. RMN 13C en D2O del DMC protonado con HCl, 6 95,05 (C1), 75,50 (C4), 74,53 (C5), 68,16 (C3), 67,31 (C6), 60,35 (C2), 41,88 (CH3) ppm.

Ejemplo 1b - Preparacion de yoduro de W,W,A/-trimetilquitosano (TMC) con un DQ del 46 % en forma protonada. Se trato una suspension de DMC (0,400 g, 2,11 mmol de unidades de glucopiranosilo), bicarbonato de sodio (0,532 g, 6,33 mmol) y yoduro de sodio (0,825 g, 5,50 mmol) en 100 ml de DMF/agua (90/10 v/v) con yodometano (0,80 ml, 12,8 mmol) y se calento a 75 °C durante 8 h. Se realizaron adiciones sucesivas de yodometano (0,80 ml, 12,8 mmol) y de bicarbonato de sodio (0,532 g, 6,33 mmol) despues de 2, 4 y 6 h. La solucion se evaporo y el solido resultante se disolvio en agua (75 ml). La solucion se ultrafiltro hasta un volumen de 10 ml y se lavo dos veces con agua (65 ml). La solucion polimerica se concentro (2-3 ml) mediante una evaporacion antes de ser precipitada con una mezcla de acetona (40 ml) y eter dietflico (25 ml). El solido se filtro, se lavo con eter dietflico (50 ml) y se seco durante una noche a vado. Se obtuvo un solido de color blanquecino con un rendimiento del 100 % (0,442 g). IR (cm-1) 3385

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(OH), 2936 y 2879 (CH), 1654, 1473, 900 - 1200 (C-O). RMN 1H en D2O, 8 5,0 - 5,7 (C1), 3,6 - 4,6 (hidrogenos del glucopironosilo), 3,3 (CH3), 3,04 (CH3), 2,05 (acetilo) ppm.

Ejemplo 1c - Smtesis de N,N-dimetilquitosano (DMquitosano). Se disolvio el quitosano (12 g, grado de desacetilacion del 90 %) en 600 ml de una solucion acuosa que contiene 28 ml de acido formico al 88 %. Se anadio formaldetndo (21 ml, 37 %) a la mezcla de reaccion y despues la solucion se calento a 70 °C con una manta termica durante 12 horas. La solucion se dejo alcanzar la temperatura ambiente y la solucion agitada se trato con aproximadamente 300 ml de hidroxido de sodio 5 N hasta alcanzar un pH de 11-12. La suspension resultante se filtro y se lavo con agua destilada hasta que el filtrado posefa un pH de 7. El solido se lavo con etanol (25 ml) seguido de etil eter (25 ml). El solido de color blanco se seco en la atmosfera normal. El A/-DS del N,N-dimetilquitosano es de 2,0.

Ejemplo 1d - Smtesis de DMC usando un horno de microondas. Se disolvio el quitosano (0,19 g, grado de desacetilacion del 90 %) en 9,2 ml de agua y 0,45 ml de acido formico al 88 %. Se anadio formaldetndo (0,34 ml, 37 %) a la mezcla de reaccion. En un sistema de microondas Mars usando recipientes cerrados MarsXpress™ de CEM Corporation, la solucion se calento a 130 °C durante 5 minutos y la temperatura se mantuvo a 130 °C durante 10 minutos con una potencia maxima de 480 W. Despues se dejo que la solucion alcanzara la temperatura ambiente. El pH se ajusto a entre 7-12 con la adicion de hidroxido de sodio 5 N. La suspension resultante se filtro y se lavo con agua. El solido se lavo con etanol seguido de etil eter. El solido de color blanco se seco en la atmosfera normal. Rendimiento del 95 %. El N-DS del N,N-dimetilquitosano es de 2,0.

Ejemplo 1e - Smtesis de TMC usando un horno de microondas (DMCarbonato). Se preparo una suspension que contiene 0,30 g de N,N-dimetilquitosano, 0,59 g de carbonato de sodio y 3,0 ml de carbonato de dimetilo en 7 ml de una mezcla de metanol/agua (1:9). En un sistema de microondas Mars usando recipientes cerrados MarsXpress™ de CEM Corporation, la suspension se calento a 140 °C durante 5 minutos y la temperatura se mantuvo a 140 °C durante 10 minutos con una potencia maxima de 1.600 W. Despues se dejo que la solucion alcanzara la temperatura ambiente. Si fue necesario, el pH se ajusto a entre 7-12 con la adicion de carbonato de sodio. El solido se lavo con agua. El solido de color blanco se seco en la atmosfera normal. Los espectros de IR mostraron una fuerte banda a 1480 cm'1.

Ejemplo 1f - Smtesis de TMC usando un horno de microondas (yodometano). Se preparo una suspension que contiene 0,30 g de N,N-dimetilquitosano, 0,90 g de carbonato de sodio y un agente de alquilacion (3,0 ml de yodometano) en 7 ml de una mezcla de metanol/agua (1:9). En un sistema de microondas Mars usando recipientes cerrados MarsXpress™ de CEM Corporation, la suspension se calento a 75 °C durante 5 minutos y la temperatura se mantuvo a 75 °C durante 15 minutos con una potencia maxima de 1.600 W. Despues se dejo que la solucion alcanzara la temperatura ambiente. El pH se ajusto a entre 7-12 con la adicion de carbonato de sodio. El solido se filtro y se lavo con agua. El solido de color blanco se seco en la atmosfera normal. Rendimiento cuantitativo, el DQ de las unidades repetitivas = 83 %, el peso molecular del TMC es mayor usando el procedimiento con microondas. La alquilacion del N,N-dimetilquitosano con diclorometano como agente de alquilacion demuestra que podnan usarse diferentes haluros de alquilo.

Ejemplo 1g - Smtesis de TMC usando un horno de microondas (DMCarbonato). Se preparo una suspension que contiene 0,30 g de N,N-dimetilquitosano y 3,0 ml de carbonato de dimetilo. En un sistema de microondas Mars usando recipientes cerrados MarsXpress™ de CEM Corporation, la suspension se calento a 140 °C durante 5 minutos y la temperatura se mantuvo a 140 °C durante 10 minutos con una potencia maxima de 1.600 W. Despues se dejo que la solucion alcanzara la temperatura ambiente. Si fue necesario, el pH se ajusto a entre 7-12 con la adicion de carbonato de sodio. El solido se lavo con agua. El solido de color blanco se seco en la atmosfera normal. Rendimiento cuantitativo, los espectros de IR mostraron una fuerte banda a 1480 cm-1.

Ejemplo 1h - Smtesis de TMC usando un recipiente a presion. Se preparo una suspension que contiene 0,30 g de N,N-dimetilquitosano, 0,59 g de Na2CO3, 0,72 g de Nal, 3,0 ml de carbonato de dimetilo, 30 ml de una mezcla de agua/metanol (9:1) en un recipiente a presion. Se anadio una barra magnetica al recipiente antes de cerrarlo. Se anadio una presion de 100 PSI de nitrogeno al recipiente. El recipiente a presion que contiene la suspension se calento a 150 °C durante 16 h con agitacion. Despues se dejo que la solucion alcanzara la temperatura ambiente. La suspension resultante se filtro y el solido se lavo con agua. El solido se lavo con etanol (25 ml) seguido de etil eter (25 ml). El solido se seco en la atmosfera normal. Los espectros de IR mostraron una banda a 1480 cm-1.

Ejemplo 1i - Mediciones de la viscosidad. La viscosidad se midio con un viscosfmetro Brookfield modelo DV-II+ Pro usando los agitadores LV1 a LV3 a 12 rpm. La viscosidad del cloruro de TMC al 0,50 % (p/v) en agua a 25 °C era de 4,37 cP y con la adicion de un 0,1 % de dodecilsulfato de sodio, la viscosidad era de 6,87 cP. Con la adicion de dodecilsulfato de sodio a una solucion acuosa de TMC se formo una suspension opaca de color blanco con una textura de locion para manos.

Ejemplo 1i - Smtesis de N,N-dipropilquitosano usando un horno de microondas. Se disolvio el quitosano (0,19 g, grado de desacetilacion del 90 %) en 9,2 ml de agua y 0,45 ml de acido formico al 88 %. Se anadieron 0,30 ml de propanal (propionaldehndo) a la mezcla de reaccion. En un sistema de microondas Mars usando recipientes cerrados MarsXpress™ de CEM Corporation, la solucion se calento a 130 °C durante 5 minutos y la temperatura se mantuvo

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Resultados

Sintesis y caracterizacion

W,W-dimetilquitosano (DMC). La alquilacion del quitosano con yodometano y una base de la tecnica anterior da lugar a la formacion de una mezcla de mono-, di- y trimetil aminas no sustituidas. Aqu se ha demostrado que el procedimiento de Eschweiler-Clarke posee puede llevarse a cabo en un medio acido en el que el quitosano es soluble y no alquila los grupos alcohol. Sin embargo, la reaccion de Eschweiler-Clarke se detiene en la amina terciaria. Si se desea el TMC, debe llevarse a cabo otra reaccion de alquilacion.

El DMC se obtuvo rapidamente y con un buen rendimiento y grado de W-sustitucion (N-DS) mediante una reaccion con formaldetndo en una solucion de acido formico.

imagen6

Un singlete a 3,1 ppm, correspondiente a una interaccion de seis protones, muestra la presencia de grupos metilo con un excelente Ds del 2,0, que tambien es confirmado en la RMN 13C por un pico a 41,88 ppm. En la region del piranosilo (3,3-5,3 ppm) del DMC se observan siete picos en la RMN 1H segun se muestra en la Figura 1. A partir de la integracion, cada uno de estos picos se corresponde con un atomo de hidrogeno. Estas observaciones pueden ser explicadas por los diferentes entornos qmmicos de los dos atomos de hidrogeno en las posiciones C-6, que pueden ser explicados por los enlaces de hidrogeno entre los grupos NH(CH3)2+ y 6-hidroxilo. El espectro del IR del DMC (Figura 2) muestra una banda mas estrecha de hidroxilo a 3300 cm-1 en comparacion con el quitosano, y la presencia de bandas a 2801 y a 1481 cm-1 atribuibles a un estiramiento asimetrico del C-H y a una deformacion asimetrica del CH3, respectivamente. El DMC es soluble en una solucion acuosa acida, y es insoluble en DMSO, etanol y agua.

Reaccion de cuaternizacion con una base mas debil: bicarbonato de sodio

La W-dialquilacion del quitosano aumenta la nucleofilia de los atomos de nitrogeno y facilita la W-metilacion exhaustiva, que puede conseguirse en unas condiciones de reaccion mas suaves. La N-metilacion selectiva del DMC puede llevarse a cabo usando una base debil como bicarbonato de sodio, carbonato de sodio o con hidroxido de sodio en una mezcla disolvente que contiene una gran cantidad de agua, es decir, del 50 %. La utilizacion de una base fuerte durante la reaccion de cuaternizacion favorece la O-metilacion debido a la desprotonacion parcial de los grupos hidroxilo.

La RMN de proton del TMC protonado sintetizado con bicarbonato de sodio revela dos picos de metilo a 3,3 y 3,0 ppm atribuibles, respectivamente, a los grupos metilo del TMC y del DMC. Se obtuvo un Dq de 0,46 despues de 8 h (95 % de DD). El dQ fue determinado a partir de la proporcion integral del pico de metilo a 3,3 ppm y de los atomos de hidrogeno del piranosilo. El espectro de IR del TMC (Figura 2) muestra una fuerte banda a 1480 cm-1 correspondiente a una deformacion asimetrica del CH3, que es caractenstica de las sales de quitosano muy W- metiladas y de las sales de W,W,W-trimetilamonio. Sobre ese punto, vease Kim C. H., Choi J.W., Chun H. J., Choi K. S., Polym. Bull., 1997, 38, 387; Britto D., Forato L. A., Assis O. B. G., Carbohidr. Polym., 2008, 74, 86-91; Britto D., Assis B. G. O., Carbohidr. Polym., 2007, 69, 305; Britto D., Assis B. G. O., Intl. J. Biol. Macromol., 2007, 41, 198; y Britto D., Campana-Filho S. P., Polym. Degrad. Stab., 2004, 84, 353.

El yoduro de TMC (DQ del 46 %) es soluble en agua e insoluble en metanol, etanol, acetona y eter dietflico.

Reaccion de cuaternizacion con una base mas fuerte: hidroxido de sodio

Para evitar la protonacion de los grupos amino durante la reaccion, el bicarbonato de sodio fue sustituido por hidroxido de sodio, una base mas fuerte. El uso de esta base en una mezcla de DMF/agua podna usarse para conseguir una W-alquilacion mas completa. Sin embargo, esta base favorece la reaccion de O-metilacion, pero la utilizacion de una mezcla disolvente que contenga un 50 % de agua impidio esta reaccion indeseada (sobre ese

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punto, vease Polnok A., Borchard G., Verhoef J. C., Sarisuta N., Junginger H. E., Eur. J. Pharm. Biopharm., 2004, 57, 77-83.)

Sin embargo, se formo yoduro de tetrametilamonio como subproducto debido a la alquilacion de la dimetilamina procedente de la descomposicion de la DMF en un medio alcalino. El yoduro de tetrametilamonio, que muestra fuertes bandas de IR a 3012, 1483, 1403, 1396 y 944 cm-1, fue eliminado mediante una ultrafiltracion.

El espectro de IR del TMC sintetizado en presencia de hidroxido de sodio acuoso muestra una banda mas fuerte a 1483 cm-1 en comparacion con la reaccion con bicarbonato de sodio, lo que indica un mayor DQ.

Se observo una debil banda de IR a 1658 cm-1 superpuesta con la banda de deformacion del NH2 en el quitosano; es atribuible al estiramiento del carbonilo de las unidades de W-acetilglucopiranosilo.

Conclusion

El DMC se obtuvo mediante el procedimiento de Eschweiler-Clarke. El procedimiento de Eschweiler-Clarke permite la formacion de la W,W-dimetilacion del quitosano en una simple etapa con un buen rendimiento. Los espectros de RMN del DMC muestran las constantes de acoplamiento entre los atomos de hidrogeno del glucopiranosilo y la no equivalencia magnetica de los atomos de hidrogeno en las posiciones C-6. Hemos demostrado que el DMC es un reactivo util para la smtesis del TMC. La W-alquilacion selectiva en presencia de una base debil permitio la cuaternizacion del 46 % de los grupos dimetilamino. De hecho, se sintetizo un TMC soluble en agua con un DQ de hasta un 46 % mediante una W-metilacion selectiva con yodometano en una mezcla de DMF/agua.

Ejemplo 2 - Union in vitro a acidos biliares

Se uso el TMC del Ejemplo 1.

Seccion experimental

Los reactivos usados eran los mismos que en el Ejemplo 1 como se ha establecido anteriormente.

Union de las sales biliares. En un Erlenmeyer de 25 ml se incubo una mezcla que contiene una solucion acuosa de cloruro de sodio 15 mM filtrada con un filtro de 0,2 pm y el sustrato (10 mg) a 37 °C durante 40 min. Despues se anadio una solucion acuosa de NaGC (100 mM) o de NaTC (100 mM) y la mezcla de 10 ml se agito con un agitador orbital (Thermoforma, modelo 420) a 170 rpm durante 1 h a 37 °C. Se filtro una alfcuota de 1 ml a traves de un filtro de 0,2 pm y el contenido de la solucion se analizo mediante una HPLC.

Cuantificacion mediante HPLC de las sales biliares. Se uso una columna Agilent C-18 Sorbax OSD (de 4,6 x 250 mm, 5 pm) para la cuantificacion de las sales biliares mediante una HPLC. La fase movil era una mezcla de hidrogenofosfato de potasio acuoso 0,04 M filtrado con un filtro de 0,2 pm y acetonitrilo (62/38 v/v) a una temperatura de 25 °C y un caudal de 0,7 ml/min. La longitud de onda de la deteccion UV-visible se establecio a 200 nm. Se uso 4-hidroxibencensulfonato de sodio como patron interno. El volumen de inyeccion era de 20 pl.

Resultados

La union de los acidos biliares con quitosano modificado fue determinada mediante la variacion de la concentracion en la HPLC con la adicion de los derivados de quitosano. Las condiciones experimentales de union estan adaptadas a partir de los metodos notificados para otros derivados de quitosano. Sobre ese punto, vease Lee J. K., Kim S. U., Kim J. H., Biosci. Biotechnol. Biochem., 1999, 63, 833 y Lee J. K., Kim S. Y., Kim S. U., Kim J. H., Biotechnol. Appl. Biochem., 2002, 35, 181. La W,W-dimetilacion del quitosano aumenta ligeramente la cantidad de sales biliares unidas en comparacion con el quitosano parental.

La sorcion de la colestiramina se satura rapidamente (por ejemplo, en 10 min). Vease Lee J. K., Kim S. U., Kim J. H., Biosci. Biotechnol. Biochem., 1999, 63, 833 y Lee J. K., Kim S. Y., Kim S. U., Kim J. H., Biotechnol. Appl. Biochem., 2002, 35, 181.

En el caso de yoduro de TMC, aparece un precipitado de color blanco practicamente instantaneamente cuando se mezclan entre sf las soluciones de NaGC y de tMc. La Figura 3 muestra la isoterma de sorcion del TMC. La sorcion se satura a 9 mmol y se une a un maximo de 2,89 mmol de colato en comparacion con la sorcion del Cholestol y de la colestiramina, que saturan respectivamente a 1,41 mmol y a 3,16 mmol (Tabla 1). La cantidad de NaGC unida por miligramo de TMC protonado con un DQ del 46 % se corresponde con 0,91 moleculas de NaGC por unidad de glucopiranosilo.

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Tabla 1. Sorcion del NaGC y del NaTC por parte de los derivados de quitosano y de los productos comerciales

Compuestos: [NaGC] (mM) NaGC NaGC unido (mmol/g de unido (%) sustrato) [NaTC] (mM) NaTC unido (%) NaTC unido (mmol/g de sustrato)

quitosano (DD del: 6 10 0,58 2 0,1 0,00

96 %)

Cholestol™: 1 0,0 0,00 - - -

: 6 18,1 1,00 2 10,0 0,19

: 9 14,1 1,07 3 9,7 0,34

Colestiramina: 1 82,2 0,88 1 89,4 0,66

: 6 35,9 1,95 2 53,9 1,21

DMC: 6 13,1 0,72 2 1 0,02

TMC (DQ = 46 %): 2 28,0 0,56

: 3 29,0 0,87

: 4 39,2 1,57

: 6 44,1 2,25

: 9 34,6 2,75

: 12 28,4 2,89

TMC (DQ = 38 %) *: 6 38,2 2,18 2 34,1 0,72

* Vease el TMC n° 115 del siguiente Ejemplo 3

Conclusion

Se averiguo que el TMC era un rapido y eficaz secuestrante de acidos biliares debido a las interacciones electrostaticas y a su solubilidad en agua. De hecho, el yoduro de TMC se une al NaGC con una eficacia similar a la de la colestiramina, una resina sintetica protonada.

Ejemplo 3 - Smtesis de un TMC con unos mayores DQ

El Ejemplo 1 informa, entre otros, de un procedimiento conveniente eficaz para la smtesis de W,W-dimetilquitosano (DMC) con un rendimiento excelente. Este procedimiento implica la W-alquilacion del quitosano usando la reaccion de Eschweiler-Clarke en una mezcla de acido formico/agua.

El presente ejemplo describe la cuaternizacion selectiva y eficaz de este DMC en diversas condiciones.

Preparacion de yoduro de W,W,A/-trimetilquitosano (TMC) con un DQ del 75 % (140)

Se trato una suspension de DMC (0,600 g, 3,17 mmol de unidades de glucopiranosilo) y yoduro de sodio (1,23 g,

8.20 mmol) en 100 ml de agua/metanol (90/10 v/v) con yodometano (1,20 ml, 19,3 mmol) y una solucion de hidroxido de sodio (0,388 g, 9,7 mmol), y se calento a 55-60 °C durante 24 h y a 70-75 °C durante 48 h. Se llevaron a cabo adiciones sucesivas de yodometano (1,20 ml, 19,3 mmol) despues de 2, 4, 6, 22, 24, 26 y 28 h. La solucion se ultrafiltro hasta un volumen de 10 ml y se lavo dos veces con agua (90 ml). La solucion polimerica se concentro (2-3 ml) mediante una evaporacion antes de ser precipitada con una mezcla de acetona (40 ml) y eter dietflico (25 ml). El solido se filtro, se lavo con eter dietflico (50 ml) y se seco durante una noche a vacfo. Se obtuvo un solido de color blanquecino (0,442 g). IR (cm'1) 3385 (OH), 2936 y 2879 (CH), 1654, 1473, 900 - 1200 (C-O). RMN 1H en D2O, 8 5,0 -5,7 (C1), 3,6 - 4,6 (hidrogenos del glucopiranosilo), 3,3 (CH3), 3,04 (CH3), 2,05 (acetilo) ppm.

Preparacion de yoduro de W,W,A/-trimetilquitosano (TMC) con un DQ del 95 % (146)

8.20 mmol) en 100 ml de agua/metanol (90/10 v/v) con yodometano (1,20 ml, 19,3 mmol) y carbonato de sodio (1,01 g, 9,51 mmol) y se calento a 70 °C durante 46 h. Se llevaron a cabo adiciones sucesivas de yodometano (1,20 ml,

19,3 mmol) despues de 2, 4, 6, 22, 24, 26 y 28 h. La suspension se filtro y el solido se lavo con agua (50 ml), se suspendio en agua (90 ml), se ultrafiltro (3 x 75 ml), se acidifico con HCl (1 M) durante 30 min, se llevo hasta un pH de 8-9 con NaOH (10 M), se concentro mediante una evaporacion y finalmente se precipito con etanol (75 ml). El solido se filtro, se lavo con eter dietflico (50 ml) y se seco durante una noche a vacm. Se obtuvo un solido de color amarillo claro (0,442 g). IR (cm-1) 3385 (OH), 2936 y 2879 (CH), 1654, 1473, 900 - 1200 (C-O). RMN 1H en D2O, 8

5,0 - 5,7 (C1), 3,6 - 4,6 (hidrogenos del glucopiranosilo), 3,3 (CH3), 3,04 (CH3), 2,05 (acetilo) ppm.

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Preparacion de yoduro de W,W,A/-trimetilquitosano (TMC) con un DQ del 90 % (149 a-f)

Se trato una suspension de DMC (10,0 g, 52,9 mmol de unidades de glucopiranosilo) y yoduro de sodio (20,5 g, 136,5 mmol) en 1,70 l de agua/metanol (90/10 v/v) con yodometano (19,8 ml, 317 mmol) y carbonato de sodio (16,8 g, 159 mmol) y se calento a 55 °C durante 46 h. Se llevaron a cabo adiciones sucesivas de yodometano (19,8 ml, 317 mmol) despues de 2, 4, 6, 22, 24, 26 y 28 h, y una adicion lenta de 2 eq de carbonato de sodio despues de 6 h y 1 eq a las 28 h. La suspension se filtro y el solido se lavo con agua (200 ml). El solido se vertio en 1,7 l de HCl 0,5 M, se anadieron 1,4 l de agua y se calento a 70-80 °C durante 15 min. La solucion se concentro mediante una evaporacion hasta que se obtuvo un gel. El gel se precipito con etanol (1,5 l), y el solido se filtro y se lavo con etanol. El solido se agito en eter dietflico (1 l) y se filtro, se seco durante una noche a vado. Se obtuvo un solido de color amarillo claro con un rendimiento del 90 % (10,8 g). IR (cm-1) 3385 (OH), 2936 y 2879 (CH), 1654, 1473, 900 - 1200 (C-O). RMN 1H en D2O, 6 5,0 - 5,7 (C1), 3,6 - 4,6 (hidrogenos del glucopiranosilo), 3,3 (CH3), 3,04 (CH3), 2,05 (acetilo) ppm.

La siguiente tabla resume las condiciones experimentales y la caracterizacion de estos y de otros TMC.

Notese que, salvo que se indique de otro modo, el material de partida era DMC y el reactivo era yodometano. En esta tabla, "DQ" es el grado de cuaternizacion, "% de DMC" es el porcentaje de unidades dimetiladas, "O-DS-3" es el grado de sustitucion en la posicion 3, "O-DS-6" es el grado de sustitucion en la posicion 6 y "DA" es el grado de acetilacion. Los valores indicados se determinan a partir de la integracion del respectivo pico en comparacion con los del hidrogeno del piranosilo en la RMN 1H.

Debe apreciarse que la suma de DQ + % de DMC + DA debena ser del 100 %. En la mayona de los casos, no es exactamente del 100 % debido a los inherentes errores experimentales. Por lo tanto, el DQ puede ser estimado usando 100 % - DA - % DMC. Por ejemplo, a partir de 146, se considera que DQ es muy alto porque unicamente 2 + 2,6 = 4,6 % de las unidades estan dimetiladas o acetiladas, lo que significa que el 95 % de las unidades estan trimetiladas.

Producto n°: Disolvente CH3I (Eq.) Base (3 eq.) Tiempo de reaccion Caracterizacion

DQ: % de DMC O-DS-3 O-DS-6 DA

55 1: MeOH 19,3 NaHCO3 entre 7 y 8 dfas 31,1 74,3 0 0 3,84

105a 2: DMF/H2O (90/10) 6 NaHCO3 4 h 35,1 76,2 0 0 2,51

105b 2: DMF/H2O (90/10) 6 NaHCO3 8 h 49,98 56,79 0 0 2,51

115 3: DMF/H2O (95/5) 16 NaHCO3 6 h 38

128 4qUF: H2O/MeOH (90/10) 6 NaOH 47 h 05 83,3 46,9 73,2 44,6

140 5: H2O/MeOH (90/10) 6 NaOH 46 h 25 77 10 42 24 3

146a 6: H2O/MeOH (90/10) 6 Na2CO3 21 h 55 70 14 5,7 6,4 3,4

146 6: H2O/MeOH (90/10) 6 Na2CO3 46 h 85 2 8 9 2,6

147 7: DMF/H2O (90/10) 6 Na2CO3 46 h30 54,7 40,9 - - 2,0

147an7: DMF/H2O (90/10) 6 Na2CO3 24 h 59,0 42,8 - -

148h 8: H2O/MeOH (90/10) 6 NaOH 71 h 30 89 1,8 48,4 23 1,3

149a-f9: H2O/MeOH (90/10) 6 Na2CO3 ~ 45 h 45 85 89 10 4 8 10 6,5 8 2 1

-------------------1------------------' '------------------1----------------------------------------1-----------------------------------------1-------------------------------------------------------1-------------------------------------1-----------------------------------------1-----------------------------------------1-----------------------------------------1----------------------------------

La reaccion de cuaternizacion se ha llevado a cabo con quitosano al 100 % (DD) en lugar de DMC. Se usaron 14,4 eq de NaHCO3, en lugar de 3. Se han llevado a cabo tres adiciones de CH3I (10,3 eq) durante la reaccion.

2 Para 105a, se anadieron 3 eq de NaHCO3 y 6 eq de CH3I despues de 2 horas de reaccion. Para 105b, se anadieron 3 eq de NaHCO3 y 6 eq de CH3I despues de 2, 4 et 6 horas de reaccion.

3 Se anadieron 3 eq de NaHCO3 y 6 eq de CH3I despues de 2 horas de reaccion. Entonces, despues de 4 horas de reaccion, se anadieron 6 eq de CH3I.

4 Se anadieron 6 eq de CH3I 2, 4, 6, 23, 25, 27 y 29 horas de reaccion. Se anadio NaOH segun fue necesario para mantener el pH de la solucion por encima de 7,0. "qUF" significa que el producto ha sido purificado mediante una ultrafiltracion.

5 No se uso Nal. Se anadieron 6 eq de CH3I despues de 2, 4, 6, 23, 25, 27 y 29 horas de reaccion. Se anadio

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NaOH segun fue necesario para mantener el pH de la solucion por encima de 7,0.

6 Se anadieron 6 eq de CH3I despues de 2, 4, 6, 22 h 30, 24 h 30, 26 h 30 y 28 h 30 horas de reaccion. Se anadio

NaOH segun fue necesario para mantener el pH de la solucion por encima de 7,0.

7 Para 146a, se anadieron 6 eq de CH3I despues de 2, 4 y 6 horas de reaccion. Para 146, se llevaron a cabo

adiciones adicionales despues de 22, 24, 26 y 28 horas de reaccion. El Na2CO3 solo ha sido anadido despues de 6 horas de reaccion para asegurar que el pH no cafa por debajo de 7 durante la primera noche. Despues de la reaccion, los productos (146a y 146) eran insolubles en agua. Sin embargo, cuando se anadio HCl o NaOH al agua, eran solubles. Las muestras enviadas para un analisis por RMN fueron acidificadas para eliminar los CO32-. Entonces, se anadio NaOH para llevar el pH cerca de 9.

8 Se anadieron 6 eq de CH3I despues de 2, 4, 6, 22, 24, 26 y 28 horas de reaccion. Se anadio Na2CO3 segun fue necesario para mantener el pH de la solucion por encima de 7,0. "147an" es 147 (solido) disuelto en agua y agitado durante un fin de semana en presencia de CH3COONa (10-15 eq).

9 No se ha anadido NaOH al comienzo de la reaccion. Solo se anadio segun fue necesario para mantener el pH de la solucion por encima de 7,0. Se anadieron 6 eq de CH3I despues de 2, 4, 6, 22, 24, 26, 28, 46 h 30, 48 h 30, 50 h 30 y 52 h 30 horas de reaccion. El producto 148 era insoluble en agua, y se acidifico para dar 148h. Para acidificarlo, el producto 148 se puso en agua y se anadio HCl 12 M hasta que el producto se solubilizo. Despues el aqua se elimino mediante una evaporacion a vado y el producto 148h se precipito usando metanol.

19 Para 149 a hasta f, hubo 7 adiciones de yodometano de 6 eq cada una. Se anadieron 2 eq de Na2CO3 junto con la ultima adicion de yodometano del dfa, y se anadio 1 eq de Na2CO3 con la ultima adicion de yodometano del segundo dfa. Se uso HCl para eliminar los CO32-. El pH no se llevo de nuevo hasta aproximadamente 9 usando NaOH para evitar la formacion de NaCl, lo que complicaria la purificacion._________________________________

Las condiciones de partida eran:

55: Quitosano (100 %) (0,300 g, 1,86 mmol) + NaHCO3 (2,250 g, 26,76 mmol) + CH3I (5,01 g, 36 mmol).

105a y b: DMC (0,401 g, 2,11 mmol) + NaHCO3 (0,532 g, 6,33 mmol) + Nal (0,825 g, 5,5 mol) + CH3I (1,82 g, 12,8 mmol).

115: DMC (0,401 g, 2,11 mmol) + NaHCO3 (0,532 g, 6,33 mmol) + Nal (0,825 g, 5,5 mol) + CH3I (4,79 g, 33,7 mmol).

128: DMC (0,301 g, 1,59 mmol) + NaOH (0,193 g, 4,82 mmol) + Nal (0,618 g, 4,12 mol) + CH3I (1,37 g, 9,63 mmol).

140: DMC (0,600 g, 3,17 mmol) + NaOH (0,388 g, 9,70 mmol) + Nal (1,23 g, 8,20 mol) + CH3I (2,73 g, 19,3 mmol).

146a y 146: DMC (0,600 g, 3,17 mmol) + Na2CO3 (1,01 g, 9,51 mmol) + Nal (1,23 g, 8,20 mol) + CH3I (2,73 g,

19,3 mmol).

147: DMC (0,600 g, 3,17 mmol) + Na2CO3 (1,01 g, 9,51 mmol) + Nal (1,23 g, 8,20 mol) + CH3I (2,73 g, 19,3 mmol).

147an: DMC (0,600 g, 3,17 mmol) + Na2CO3 (1,01 g, 9,51 mmol) + Nal (1,23 g, 8,20 mol) + CH3I (2,73 g, 19,3 mmol).

Ejemplo 4 - Eficacia in vivo del TMC como secuestrante de acidos biliares (BAS)

Se uso cloruro de TMC totalmente cuaternizado. Este TMC se produjo partiendo de quitosano con un DD del 90 %, que fue dimetilado usando la reaccion de Eschweiler-Clarke. Despues se llevo a cabo la cuaternizacion de forma similar a la del anterior producto n° 149. El DQ era de aproximadamente el 89%, es decir, todas las unidades desacetiladas disponibles estaban trimetiladas.

1. Contexto

El proposito de este estudio era probar el potencial del TMC como un agente hipocolesterolemiante usando un modelo animal de trastorno lipfdico. El modelo usado era hamsteres Golden Syrian alimentados con una dieta rica en grasas saturadas y colesterol (0,18%). En primer lugar se indujo una hipercolesterolemia con esta dieta rica durante un periodo de cuatro semanas. Al final de este periodo, se llevo a cabo un analisis del colesterol plasmatico total, de las HDL y de los trigliceridos, asf como mediciones del peso corporal. Estas mediciones se usaron para formar tres grupos uniformes de hamsteres. Despues de la formacion de estos tres grupos, los tratamientos fueron administrados durante un periodo de cuatro semanas. Los tres tratamientos individuales eran: un tratamiento de control negativo (celulosa), un tratamiento inicial reductor del colesterol (colestiramina) y un tratamiento con TMC.

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Estos tratamientos fueron administrados a los animales a traves de su comida (1 %). Al final del tratamiento de cuatro semanas se llevo a cabo un analisis del colesterol plasmatico total, de las HDL y de los trigliceridos para determinar el potencial hipocolesterolemiante del TMC.

2 Metodologfa

2.1 Animales

Para este estudio se usaron 24 hamsteres Syrian golden macho de 120-140 g (Charles Rivers, St-Constant, QC). Los animales fueron identificados al llegar. Se llevo a cabo una evaluacion corporal completa en cada animal. Se recogio el peso corporal de cada animal al llegar y a lo largo del estudio a intervalos semanales. Los animales fueron aclimatados a su entorno durante 14 dfas antes del inicio del estudio.

2.2 Acomodacion

Los hamsteres fueron alojados a dos por jaula durante el periodo de desarrollo de la hipercolesterolemia. A partir de la tercera semana de hipercolesterolemia, todos los hamsteres fueron alojados individualmente. Durante el estudio, cada jaula fue recubierta con un filtro de polisulfona. La distribucion de agua ad libitum fue proporcionada por un sistema manual. La comida tambien se proporciono ad libitum, excepto durante los periodos de ayuno previos al analisis de lfpidos. Las jaulas fueron claramente identificadas usando una caja con un codigo de color segun los grupos, indicando tambien el numero de estudio, el grupo y el numero y el sexo de los animales.

La sala se mantuvo generalmente a una temperatura ambiente de 22 ± 2 °C y una humedad relativa del 40 ± 20 %.

La temperatura y la humedad de la sala fueron medidas y registradas diariamente. Se proporciono un ciclo de luz y oscuridad de 12 horas mediante un sistema de control automatico, y se proporcionaron 8-10 cambios de aire por hora mediante un sistema de ventilacion.

Durante un periodo de cuatro semanas despues del inicio del tratamiento, los animales se pesaron a intervalos regulares y se sometieron a un examen ffsico diario, que aseguraba el bienestar de los animales. No se observaron smtomas adversos. Unicamente se aprecio una perdida de peso en el grupo tratado con el TMC, y se notifico en la siguiente seccion de resultados.

2.3 Dieta y tratamientos

Se administro un alimento en pienso para animales estandar a los animales durante el periodo de aclimatacion.

Posteriormente, la dieta rica en forma granulada fue administrada ad libitum a todos los animales durante un periodo total de ocho semanas. Esta dieta se uso para causar una hipercolesterolemia en los hamsteres. En terminos de ingesta calorica (kcal/g de la dieta), un 23 % de las calonas procedfa de las protemas, un 36 % de los carbohidratos y un 41 % de las grasas. Las protemas eran de origen vegetal (soja). Las grasas saturadas procedfan principalmente de aceite de palma y de grasas animales, despues de aceite de cartamo, mientras que las grasas poliinsaturadas procedfan principalmente de aceite de oliva y de aceite de cartamo. Se aumento el contenido en biotina (2 mg/kg), acido folico (10 mg/kg), niacina (37 mg/kg) y acido pantotenico (40 mg/kg) en la dieta para todos los animales en comparacion con las recomendaciones dieteticas para un hamster. Esta medida preventiva se tomo para reducir el riesgo de deficiencias vitammicas en los animales que recibfan el TMC. El TMC tiene una potencial afinidad por estas vitaminas solubles en agua cargadas negativamente, y por lo tanto aumenta el riesgo de malabsorcion.

Despues de cuatro semanas de la dieta rica, despues del desarrollo de la hipercolesterolemia, se incorporaron los tratamientos en la dieta. Para hacer esto, la dieta se pulverizo usando un procesador de alimentos, y los diversos tratamientos - celulosa microcristalina (Sigma-Aldrich Canada Ltd., Oakville, ON), colestiramina (Sigma-Aldrich Canada Ltd.) y TMC - fueron incorporados en la dieta en una cantidad del 1 %. Teniendo el TMC un cierto contenido en yoduro (0,005 %), la ingesta diaria de yodo para los animales tratados con el TMC era ligeramente superior a los 0,04 mg/kg para un animal que consuirna 12 g de alimento al dfa.

2.4 Analisis del colesterol y de los trigliceridos

El analisis del colesterol total, de las HDL y de los trigliceridos se llevo a cabo despues de un periodo de aclimatacion (semana -4) y cuatro semanas despues del inicio de la dieta rica (semana 0). Estas pruebas se llevaron a cabo en primer lugar para establecer si la dieta da como resultado una hipercolesterolemia, en segundo lugar para permitir la formacion de tres grupos uniformes al respecto de estos parametros. Posteriormente, las pruebas se repitieron dos y cuatro semanas despues del iniciado el tratamiento. Los animales ayunaron 12 horas antes de la recoleccion de las muestras sangumeas necesarias para la medicion del colesterol y de los trigliceridos. La recoleccion de estas muestras sangumeas se llevo a cabo mediante una puncion intravenosa bajo una anestesia general con isoflurano. Despues de la preparacion del plasma, las muestras se almacenaron a -80 °C hasta su analisis.

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El metodo usado para el analisis de los Ifpidos plasmaticos (Lemieux C, Gelinas Y Lalonde J Labrie F, Cianflone K, Deshaies Y. 2005. Hypolipidemic action of the SERM acolbifene is associated with decreased liver MTP and increased SR-BI and lDl receptors. J Lipid Res 46: 1285-94) ha sido adaptado para permitir la lectura en microplaca usando una espectrofotometna. La determinacion de los trigliceridos y del colesterol se llevo a cabo usando unos kits comerciales de Roche Diagnostics (TG # 11877771216 & CHoL # 1491458). Para cada uno de estos kits, Roche Diagnostics asegura una linealidad en la medicion de los trigliceridos plasmaticos para unos valores de entre 0,05 y 11,3 mmol/l, y para la medicion del colesterol, para unos valores de entre 0,08 y 20,70 mmol/l. Se creo una curva patron a partir de suero humano liofilizado (Roche Diagnostics, # 12016630122) para cada analisis lipfdico, tanto para los trigliceridos como para el colesterol. Validamos nuestra curva patron con un "patologico" de referencia (PrecipatL ®, # 11285874-122) suministrado por Roche Diagnostics, y que contema unas elevadas concentraciones de trigliceridos (3,80 mmol/l con un intervalo de confianza de entre 3,23 y 4,37) y de colesterol (7,56 mmol/l con un intervalo de confianza de entre 6,42 y 8,70). Este control patologico relativamente alto en los lfpidos sericos tambien confirma la fiabilidad del analisis para las muestras con un elevado contenido en grasa.

2.5 Analisis bioqmmico del suero

Al final del proyecto se recogio una muestra sangumea terminal mediante una puncion cardiaca bajo anestesia general con isoflurano, segun recomienda el Canadian Council on Animal Care (CCAC). La sangre se transfirio a un tubo de Eppendorf y despues se dejo a la temperatura ambiente durante entre 30 y 60 minutos para permitir la coagulacion. Los tubos se centrifugaron a una fuerza centnfuga relativa (rcf) de 1.500 a 4 °C durante diez minutos. La porcion de suero de cada muestra sangumea se transfirio a continuacion a tubos de Eppendorf para un posterior analisis en el laboratorio. El analisis bioqmmico del suero se llevo a cabo en las cuatro horas posteriores a la recoleccion de las muestras.

2.6 Analisis estadfstico

Se uso la prueba de Student con un intervalo de confianza del 95 % para evaluar el efecto de la dieta sobre el colesterol plasmatico total, las HDL, las no HDL, la proporcion HDL/no HDL y los trigliceridos (programa informatico Prism). Se uso un analisis de la varianza (ANOVA) con los criterios (tiempo y tratamiento), con un intervalo del 95 % para comparar los niveles plasmaticos de colesterol total, de HDL, de no HDL, de la proporcion HDL/no HDL y de trigliceridos entre los grupos de tratamiento (TMC y colestiramina) y el grupo de control (celulosa). El analisis post- hoc que se uso en este estudio es la comparacion multiple de Bonferroni.

3 Resultados

3.1 Desarrollo de la hipercolesterolemia

La Tabla 1 resume los resultados del analisis de los lfpidos obtenidos antes del inicio de la dieta rica y despues de cuatro semanas de consumo de la dieta rica.

Tabla 1: desarrollo de un colesterol elevado

: Colesterol total (mmol/l) HDL (mmol/l) No HDL (mmol/l) Proporcion TG (mmol/l) Peso corporal (g)

Antes de la dieta rica: 3,13 ± 0,09 1,73 ± 0,06 1,40 ± 0,06 1,30 ± 0,10 2,57 ± 0,23 141 ± 2

Despues de la dieta rica: 6,57 ± 0,15* 3,27 ± 0,07* 3,30 ±0,11 * 1,01 ± 0,04* 6,04 ± 0,31 * 162,3 ± 3*

Todas las cifras son los promedios ± error estandar * P < 0,05: diferencia significativa entre las mediciones tomadas antes (semana -4) y despues (semana 0) de la dieta rica segun la prueba de Student.

Estos resultados demuestran que los niveles plasmaticos de colesterol total, de HDL, de colesterol no HDL y de trigliceridos se han duplicado despues de cuatro semanas de consumo de la dieta rica en grasas saturadas y que contiene un 0,18 % de colesterol. Ademas, la proporcion de colesterol HDL / no HDL aumento un promedio de entre 1,30 y 1,01, lo que refleja la mayor ingesta de no HDL en comparacion con HDL.

A partir de estos resultados de las pruebas plasmaticas realizadas al final de las cuatro semanas de consumo de la dieta rica, se realizo la distribucion de los animales con objeto de obtener tres grupos hipercolesterolemicos, con una media y un error estandar comparables para cada uno de estos parametros (Tabla 2).

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Tabla 2: formacion de grupos uniformes

Grupo: Colesterol total (mmol/l) HDL (mmol/l) No HDL (mmol/l) Proporcion TG (mmol/l) Peso corporal (g)

Celulosa: 6,58 ± 0,24 3,25 ± 0,14 3,32 ± 0,16 0,99 ± 0,16 6,08 ± 0,48 166,75 ± 5,06

TMC: 6,60 ± 0,26 3,26 ± 0,02 3,34 ± 0,19 0,99 ± 0,05 6,17 ± 0,46 162,00 ± 4,36

Colestiramina: 6,54 ± 0,29 3,30 ± 0,14 3,24 ± 0,25 1,05 ± 0,25 5,87 ± 0,71 157,50 ± 3,74

Todas las cifras son los promedios ± error estandar

3.2 Efectos del TMC y de la colestiramina

A lo largo del estudio se midio el peso corporal cada semana y el consumo de alimento se estimo en la misma frecuencia para cada hamster. Estos resultados se muestran en la Figura 4, que muestra los cambios en el peso corporal durante las cuatro semanas de tratamiento con celulosa (cuadrado), con TMC (rombo) o con colestiramina (triangulo). En esta figura, * significa P < 0,05: diferencia significativa entre los grupos tratados y los grupos de control, independientemente del tiempo, segun el criterio de clasificacion del ANOVA 2.

La primera semana del tratamiento con TMC se observo una perdida de peso corporal de 4,25 g de media en los hamsteres que recibfan este tratamiento (Figura 4). Por el contrario, los grupos que recibfan celulosa o colestiramina teman una ganancia de peso de entre 1,50 y 1,75 g, respectivamente, durante el mismo periodo. Se observo una perdida adicional de peso corporal de 4,75 g de media en los hamsteres que recibfan el TMC durante la segunda semana de tratamiento (Figura 4). Sin embargo, el peso corporal de los hamsteres de los otros dos grupos era relativamente estable. Debena mencionarse que la perdida de peso corporal en los hamsteres que recibfan el TMC era muy variable entre un individuo y otro, estando los extremos en 19 g para el hamster que habfa perdido el mayor peso corporal en las primeras dos semanas, y en 1 g para el hamster con menor perdida de peso. A lo largo de las siguientes dos semanas, el peso corporal de los hamsteres que recibfan el TMC se habfa estabilizado. La monitorizacion del consumo de alimento de cada grupo sugiere que no hay ninguna diferencia estadfstica entre el grupo tratado con TMC y el grupo de control. Una reduccion en el consumo de alimento en el grupo tratado con TMC no parece explicar la perdida de peso asociada con este tratamiento.

La diferencia significativa entre el peso corporal del grupo tratado con colestiramina y el grupo de control (Figura 4) procede principalmente de la diferencia inicial de 9,25 g entre estos dos grupos. Esta diferencia no era significativa en la formacion de grupos, pero el ANOVA ha alcanzado el nivel de significacion, dado que la diferencia permaneda constante a lo largo de las cuatro semanas de tratamiento. Cuando se analiza estadfsticamente la ganancia de peso entre los grupos, no hay ninguna diferencia significativa evidente entre el grupo tratado con colestiramina y el grupo de control.

Los resultados de la prueba relativos al colesterol plasmatico y no HDL y HDL se presentan en las Figuras 5 y 6, respectivamente.

El colesterol total (sfmbolos negros) y el no HDL plasmatico (VLDL, LDL y MDL - sfmbolos grises) durante las cuatro semanas de tratamiento con celulosa (cuadrado), con TMC (rombo) o con colestiramina (triangulo) se muestran en la Figura 5. En esta figura, * significa P < 0,05: diferencia significativa entre los grupos tratados y el grupo de control en las semanas indicadas por el analisis post-hoc de Bonferroni. Esta figura muestra que el colesterol total y el no HDL siguen aproximadamente la misma tendencia en todo el tratamiento.

Los cambios en las HDL durante las cuatro semanas de tratamiento con celulosa (cuadrado), con TMC (rombo) o con colestiramina (triangulo) se muestran en la Figura 6. En esta figura, * significa P < 0,05: diferencia significativa entre el grupo tratado con TMC y el grupo de control en la segunda semana, despues entre el grupo tratado con colestiramina y el grupo de control en la cuarta semana de tratamiento, segun el analisis post-hoc de Bonferroni.

El TMC redujo significativamente el colesterol total en comparacion con el grupo de control que recida la celulosa (Figura 5). Al final de las cuatro semanas de tratamiento, la reduccion en el no HDL plasmatico por parte del TMC era del 19% (Figura 5) y la de las HDL era del 7% (Figura 6). Por lo tanto, aunque no se alcanzo el nivel de significacion, el TMC ha mejorado en un 13 % la proporcion de HDL / no HDL (Figura 7) despues de cuatro semanas de tratamiento.

La colestiramina redujo significativamente el colesterol plasmatico total, el no HDL (Figura 5) y las HDL (Figura 6). Considerando el efecto de reducir la mayor disminucion en el no HDL (38 %, Figura 5) que en las HDL (26 %, Figura 6), la colestiramina ha producido una mejora en la proporcion HDL/no HDL (Figura 7) pero de una forma no significativa.

La Figura 7 muestra la proporcion de HDL / no HDL durante las cuatro semanas de tratamiento con celulosa (cuadrado), con TMC (rombo) o con colestiramina (triangulo).

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En la cuarta semana de tratamiento, el TMC habfa producido una disminucion no significativa del 13% en los trigliceridos plasmaticos en comparacion con el grupo de control que recibfa la celulosa (Figura 8). En comparacion, la colestiramina provoco una reduccion significativa del 38 % en los trigliceridos plasmaticos en comparacion con el grupo de control (Figura 8).

La Figura 8 muestra los trigliceridos en las cuatro semanas de tratamiento con celulosa (cuadrado), con TMC (rombo) y con colestiramina (triangulo). En esta figura, * significa P < 0,05 entre el grupo tratado con colestiramina y el grupo de control en la cuarta semana de tratamiento, segun el analisis post-hoc de Bonferroni.

El proposito de este estudio era probar el potencial del TMC como agente hipocolesterolemiante, usando un modelo animal de trastorno lipfdico. El tMc es un secuestrante de acidos biliares, que provoca su eliminacion con las heces.

Al unirse a los acidos biliares, impide su reabsorcion enterohepatica. El principal precursor de los acidos biliares es el colesterol, la mayor parte del cual normalmente es recuperado cuando los acidos biliares son reabsorbidos en el intestino y devueltos al hngado a traves de la circulacion. Las resinas que se unen a los acidos biliares, tales como la colestiramina, tambien inhiben la reabsorcion de los acidos biliares. La excrecion de sales biliares aumenta por lo tanto diez veces. Esto da lugar a un aumento en la produccion de acidos biliares por parte del hngado, que da como resultado una perdida de colesterol. Esto tiene el efecto de aumentar la actividad del receptor de las LDL. El resultado neto es una disminucion en las LDL plasmaticas de entre aproximadamente un 10 y un 35%. Dado que estos agentes de union a los acidos biliares no son absorbidos, no se asocia ningun efecto sistemico significativo con ellos.

Una de los posibles efectos secundarios del TMC es una deficiencia vitammica. Esto esta asociado con la afinidad del TMC por ciertas vitaminas solubles en agua cargadas negativamente. Para investigar el efecto hipocolesterolemiante del TMC e impedir dichos efectos secundarios, se aumento el nivel de ciertas vitaminas en la dieta rica (Seccion 2.3). Dado que un exceso de estas vitaminas puede tener un efecto sobre la salud y el colesterol plasmatico (vease Luria MH. 1988. Effect of low-dosis niacin on high-density lipoprotein cholesterol and total cholesterol/high-density lipoprotein cholesterol ratio. Arch Intern Med 148: 2493-5 y Johansson J, Carlson LA. 1990 The effects of nicotinic acid treatment on high density lipoprotein particle size subclass levels in hiperlipidaemic subjects. Atherosclerosis 83: 207-16), el complemento vitammico era limitado para evitar efectos secundarios.

Adicionalmente, todos los animales recibieron esta dieta que contema un mayor nivel de vitaminas, de forma que se evite un sesgo entre los tres grupos.

Los nutrientes contenidos en la dieta hipercolesterolemica tambien fueron sometidos a un riguroso proceso de cribado. Necesitabamos establecer una dieta que aspirase a desarrollar un modelo de trastorno lipfdico en hamsteres, teniendo en consideracion que el modelo puede reproducir de forma aproximada las condiciones que se encuentran en los seres humanos. El modelo animal de trastorno lipfdico desarrollado implicaba inicialmente el consumo de una dieta cuya principal protema era la casema. La casema contribuye a un aumento mas importante en el colesterol plasmatico en comparacion con la protema de soja, y segun algunos autores, el contenido en protema vegetal en lugar de animal contribuye a reducir la eliminacion de esteroles, a alteraciones en la expresion de algunos receptores implicados en el metabolismo de las lipoprotemas, etc. (vease Beynen AC, West CE, Van Raaij JM, Katan MB. 1984. Dietary soybean protein and serum cholesterol. Am J Clin Nutr 39: 840-1; Fernandez ML, Wilson TA, Conde K, Vergara-Jimenez M, Nicolosi RJ. 1999. Hamsters and guinea pigs differ in their plasma lipoprotein cholesterol distribution when fed diets varying in animal protein, soluble fiber, o cholesterol content. J Nutr 129: 1323-32; Terpstra AH, Holmes JC, Nicolosi RJ. 1991. The hypocholesterolemic effect of dietary soybean protein vs. casein in hamsters fed cholesterol-free or cholesterol-enriched semipurified diets. J Nutr 121: 944-7; y Beynen AC. 1990. Comparison of the mechanisms proposed to explain the hypocholesterolemic effect of soybean protein versus casein in experimental animals. J Nutr Sci Vitaminol (Tokio) 36 Supl. 2: S87-93).

La elevada variacion interindividual provocada por la combinacion de protema animal y colesterol en comparacion con la observada por la combinacion de protema vegetal y colesterol (Terpstra AH, Holmes JC, Nicolosi RJ. 1991. The hypocholesterolemic effect of dietary soybean protein vs. casein in hamsters fed cholesterol-free or cholesterol- enriched semipurified diets. J Nutr 121: 944-7) nos motivaron a optar por esta segunda alternativa. Ademas, se llevaron a cabo estudios con hamsteres en los que se uso colestiramina como control positivo con dietas que contienen como fuente de protema la semilla de soja (vease Wilson TA, Nicolosi RJ, Rogers EJ, Sacchiero R, Goldberg DJ. 1998. Studies of cholesterol and bile acid metabolism, and early atherogenesis in hamsters fed GT16- 239, a novel bile acid sequestrant (BAS). Atherosclerosis 140: 315-24, y Daggy BP, O'Connell NC, Jerdack GR, Stinson BA, Setchell KD. 1997. Additive hypocholesterolemic effect of psyllium and cholestyramine in the hamster: influence on fecal sterol and bile acid profiles. J Lipid Res 38: 491-502). Con respecto a la cantidad de colesterol presente en la dieta normal de los seres humanos, el nivel es de aproximadamente 100-300 mg/1.000 kilocalonas consumidas. El nivel de contenido en colesterol en la dieta en la dieta preparada por el proyecto actual era de 406 mg/1.000 kilocalonas consumidas. Con respecto al contenido en grasas de la dieta, era del 20 % en peso (g) o del 41 % en terminos de ingesta calorica (Seccion 2.3), grasas que tienen una ingesta calorica (kcal/g) mayor que la de los carbohidratos o la de las protemas. La principal fuente de grasas saturadas contenida en la dieta rica elegida era el aceite de palma y las grasas animales, y despues el aceite de cartamo, mientras que las grasas insaturadas

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procedfan del aceite de oliva y del aceite de cartamo. La combinacion de grasas saturadas y colesterol en la dieta hipercolesterolemica reprodujo bastante bien una dieta rica consumida por la poblacion de seres humanos, y aseguraba que los niveles plasmaticos de colesterol aumentanan significativamente en los hamsteres alimentados con esta dieta (Fernandez ML, Wilson TA, Conde K, Vergara-Jimenez M, Nicolosi RJ. 1999. Hamsters and guinea pigs differ in their plasma lipoprotein cholesterol distribution when fed diets varying in animal protein, soluble fiber, o cholesterol content. J Nutr 129: 1323-32).

El TMC, administrado en una cantidad del 1 % en la dieta durante cuatro semanas, mostro un efecto hipocolesterolemiante sobre el nivel de colesterol total. Las HDL disminuyeron ligeramente (7 %) por el tratamiento con el TMC, mientras que el colesterol no HDL estaba reducido mas significativamente (19 %), lo que tema el efecto de favorecer una mejor proporcion de HDL/no HDL. El efecto mas deseado despues de la terapia reductora del colesterol era reducir el colesterol no HDL sin afectar a las HDL. Por lo tanto, el hecho de que el tMc produjera una mayor reduccion en el no HDL en comparacion con el HDL es positivo. No parece que el TMC afecte a los niveles plasmaticos de trigliceridos.

La colestiramina, un farmaco hipocolesterolemiante ya comercializado, sirvio como control positivo en este estudio.

Provoco una reduccion significativa en el colesterol plasmatico total, en el no HDL y en las HDL. Redujo el nivel del no HDL (38 %) mas que los niveles de las HDL (26 %), y por lo tanto mejoro la proporcion de HDL / no HDL de una forma comparable a la del TMC. La reduccion en el colesterol total era mayor con la colestiramina que con el TMC. Ademas, el nivel de trigliceridos plasmaticos estaba significativamente reducido con la colestiramina. Los resultados que obtuvimos con la colestiramina en los hamsteres corroboraron los notificados por otros autores (Wilson TA, Nicolosi RJ, Rogers EJ, Sacchiero R, Goldberg DJ. 1998. Studies of cholesterol and bile acid metabolism, and early atherogenesis in hamsters fed GT16-239, a novel bile acid sequestrant (BAS). Atherosclerosis 140: 315-24 y Nicolosi RJ, Wilson TA, Krause BR. 1998. The ACAT inhibitor, Cl-1011 is effective in the prevention and regression of aortic fatty streak area in hamsters. Atherosclerosis 137: 77-85).

Al final del experimento in vivo se llevaron a cabo pruebas sangumeas en los hamsteres (los tratados con TMC y el control negativo). Estas pruebas incluyen la concentracion de albumina, ALT (SGPT), ALT (SGOT), bilirrubina total, CK, creatinina, gamma-GT (GGT), glucosa, protemas totales, proporcion A/G, nitrogeno ureico (BUN) y globulina. Los resultados eran similares entre los dos grupos de hamsteres.

Ejemplo 5 - Efecto antimicrobiano del TMC

Se evaluo el efecto antimicrobiano del TMC a seis concentraciones diferentes (0,5 |jg, 5 |jg, 50 |jg, 500 |jg, 5 mg et 50 mg/ml) sobre las bacterias gramnegativas Escherichia coli y Pseudomonas aeruginosa, y sobre las bacterias grampositivas Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Streptococcus beta hemolftico y Mycobacterium smegmatis. Los experimentos fueron monitorizados mediante una espectrofotometna a una absorbancia de 600 nm. Las Figuras 9-11 resumen los resultados obtenidos.

Condiciones experimentales

Preparacion de la solucion de TMC: se disolvieron 0,3006 g de TMC en 6 ml de agua fisiologica para obtener una solucion madre a 50 mg/ml. Despues se diluyo la solucion madre en un factor de 10 para obtener una solucion a 5 mg/ml (600 jil de solucion madre + 5,4 ml de agua fisiologica). La solucion de 5 mg/ml se diluyo adicionalmente en un factor de 10. El proceso se repitio hasta que se obtuvo una solucion de 0,5 jig/ml.

Preparacion de las diferentes cepas bacterianas usadas: cada cepa fue trasplantada a un caldo nutriente Luria Bertani (LB) previamente pasado por el autoclave. El transplante se llevo a cabo como sigue: 100 jil de cepa en 10 ml de LB, incubacion en un horno a 35 °C entre 12 y 24 horas, medicion de la densidad optica (DO) a una absorbancia de 600 nm.

Experimento con microfagos: cada cepa se transplanta en primer lugar en LB con objeto de trabajar con cepas recientes en la fase de crecimiento. Se lleva a cabo una medicion de la DO a una absorbancia de 600 nm. Tomando como base la DO obtenida, la solucion se diluye en un factor de X con objeto de obtener una DO final cercana a 1,0 (solucion de trabajo).

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Tabla 3

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Blanco

Volumen total en cada pociMo: V = 200 |jl

Blanco: 180 jl de LB + 20 jl de agua fisiologica

Control: 160 jl de LB + 20 jl de cepa + 20 jl de agua fisiologica

[TMC]: para cada concentracion: 160 jl de LB + 20 jl de cepa + 20 jl de la solucion de TMC Control: 200 jl de LB

Se llevo a cabo una DO al comienzo del experimento (TO), despues se incubo la totalidad del sistema experimental a 35 °C en un horno. La DO se midio cada hora hasta que se alcanzo la fase estacionaria. Antes de cada medicion, el medio experimental se homogeneizo (usando una microplaca a 750 rpm). Cada medicion se llevo a cabo tres veces.

Para cada cepa se presentan los resultados en forma de graficas que muestran la evolucion de la DO frente al tiempo de incubacion para cada concentracion de TMC: DO = F(t). Posteriormente se calcula la tasa de crecimiento usando la siguiente formula: j = (logNt - logN0) / (0,301 * t)

Resultados

Los resultados se resumen en las Figuras 9-11. Como puede observarse en la Figura 9, el efecto del TMC es similar sobre todas las cepas. Las tasas de crecimiento de E. coli y de P. aeruginosa, aunque todavfa son altas, disminuyen ligeramente segun aumenta la concentracion de TMC. El crecimiento maximo, alcanzado para las dos mayores concentraciones de TMC (5 y 50 mg/ml), es significativamente menor que para el control. Estos resultados sugieren que el TMC tiene un efecto bacteriostatico, es decir, el TMC a unas concentraciones mayores o iguales a 5 mg/ml, limita la multiplicacion de las bacterias. Se aprecia una actividad similar para el TMC a una concentracion de 500 jg/ml. De hecho, el crecimiento maximo es significativamente menor que para el control. Sin embargo, el efecto bacteriostatico del TMC a esta concentracion es significativamente menor que para el TMC a unas concentraciones mayores (5 y 50 mg/ml). Se aprecia que para las concentraciones de TMC por debajo de 500 jg/ml, no se observa ningun efecto relevante sobre el crecimiento de las dos cepas.

Las Figuras 10 y 11 muestran los resultados obtenidos para las bacterias grampositivas. Los resultados obtenidos para S. aureus y E. faecalis (Figura 10) sugieren un efecto bactericida del TMC a unas concentraciones mayores.

Las tasas de crecimiento son de hecho bajas, y el crecimiento permanece por debajo de 0,1 para unas concentraciones de TMC mayores o iguales a 5 mg/ml para S. aureus, y por encima de 50 mg/ml para E. faecalis.

El efecto del TMC sobre el crecimiento de M. smegmatis (Figura 11) es similar al efecto sobre las dos cepas gramnegativas, E. coli y P. aeruginosa. A pesar de que hay un crecimiento positivo, el crecimiento maximo, alcanzado para las dos concentraciones mas altas (5 y 50 mg/ml), es significativamente menor que para el control y para las demas concentraciones, lo que tambien sugiere un efecto bacteriostatico del TMC a estas dos concentraciones.

Con respecto a la cepa S. hemolytic, no parece que el TMC tenga ningun efecto sobre el crecimiento de esta cepa a pesar de la ligera diferencia con el control a una concentracion de 50 mg/ml.

Tomando como base los resultados anteriores, parece que el TMC tiene (i) un efecto bacteriostatico (efecto limitante) sobre el crecimiento de la mayona de las cepas estudiadas, a unas concentraciones mayores o iguales a 5 mg/ml, y (ii) un efecto bactericida sobre ciertas cepas a unas concentraciones mayores o iguales a 5 mg/ml.

Aunque la presente invencion se ha descrito anteriormente en el presente documento a traves de realizaciones espedficas de la misma, puede ser modificada.

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5

10

15

20

25

30

35

40

45

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Documento CA 2580460.

Documento CA 2623475.

Documento CA 2631891.

Documento EP 1250118 B1.

Documento US5744166.

Documento US6207197.

Documento US6328967.

Documento US6410046.

Documento US6726920.

Documento US7282194.

Documento US7291598.

Documento US7381716.

Documento US7393666.

Documento US7407943.

Documento US7427470.

Documento US7455830.

Claims

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

REIVINDICACIONES

1. Un metodo para la preparacion de un N,N,N-trimetilquitosano, que comprende:

a) proporcionar quitosano;

b) metilar el quitosano para producir un N,N-dimetilquitosano a traves de una reaccion de aminacion reductora usando formaldetudo y acido formico, en el que sustancialmente no se produce N,N,N-trimetilquitosano; y

c) metilar el N,N-dimetilquitosano usando un agente metilante y una base seleccionada entre una sal de hidroxido o un carbonato o un bicarbonato alcalino, preferentemente hidroxido de sodio o carbonato de sodio, en agua o en agua mezclada con un disolvente miscible con el agua, para producir el N,N,N-trimetilquitosano,

en el que el N,N,N-trimetilquitosano producido tiene un grado de cuaternizacion del 46 % o mas determinado a partir de la proporcion integral del pico de metilo a 3,3 ppm y de los atomos de hidrogeno del piranosilo del N,N,N- trimetilquitosano protonado mediante una espectroscopia de RMN, y un grado de O-sustitucion del 40 % o menos.
2. Un metodo segun la reivindicacion 1, en el que el N,N-dimetilquitosano tiene un grado de N-sustitucion (N-DS) de 2,0.
3. Un metodo segun la reivindicacion 1 o 2, en el que el agente metilante es un haluro de metilo o un carbonato de dimetilo.
4. Un metodo segun la reivindicacion 3, en el que el agente metilante es yodometano.
5. Un metodo segun la reivindicacion 1, en el que el disolvente de reaccion es agua junto con hasta un 50 % de un alcohol.
6. Un metodo segun la reivindicacion 5, donde el disolvente de reaccion es agua junto con un 10 % de metanol.
7. Un metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que al menos uno de la etapa b) y la etapa c) se lleva a cabo usando un microondas.
8. Un metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende adicionalmente una etapa de anadir HCl, HBr o HI para producir el N,N,N-trimetilquitosano con un contraion de cloruro, de bromuro o de yoduro.
9. Un metodo segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el N,N,N-trimetilquitosano producido tiene un grado de cuaternizacion del 46 % o mas, y un grado de O-sustitucion del 0 %.
10. El N,N,N-trimetilquitosano que tiene un grado de cuaternizacion del 46 % o mas segun se determina partir de la proporcion integral del pico de metilo a 3,3 ppm y de los atomos de hidrogeno del piranosilo del N,N,N- trimetilquitosano protonado mediante una espectroscopia de RMN, y un grado de O-sustitucion del 40 % o menos.
11. El N,N,N-trimetilquitosano segun la reivindicacion 10, que tiene un grado de cuaternizacion del 50% o mas, preferentemente del 55 % o mas, mas preferentemente del 60 % o mas, incluso mas preferentemente del 65 % o mas, aun mas preferentemente del 75 % o mas, y lo mas preferentemente del 95 % o mas.
12. El N,N,N-trimetilquitosano segun la reivindicacion 10 u 11, que tiene un grado de O-sustitucion del 35% o menos, preferentemente del 25 % o menos, mas preferentemente del 15 % o menos, y lo mas preferentemente del 10 % o menos.
13. El N,N,N-trimetilquitosano segun una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, que tiene un grado de O- sustitucion del 0 %.
14. El N,N,N-trimetilquitosano segun una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, para su uso en el tratamiento de la hipercolesterolemia.