JP6346561B2 - Ｎ，ｎ，ｎ−トリアルキルポリマー、その調製方法およびその使用 - Google Patents

Description

本発明は、一般的に、Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリアルキルアミノポリマーに関する。さらに具体的には、本発明は、Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリアルキルアミノ多糖に関する。さらにまた、本発明は、例えば薬学的、栄養医薬的および美容医薬的分野における、Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリアルキルキトサン、その調製方法およびそれらの種々の利用にも関する。
（関連出願の相互参照）

本出願は、米国特許仮出願第６１／４９６，２２５号（２０１１年６月１３日出願）（この記載内容は参照により本明細書中で援用される）の優先権を主張する。

キチンは、β−（１−４）結合Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン単位の長鎖多糖であり、自然界全体に亘って多くの場所で見出される。それは真菌の細胞壁、節足動物、例えば甲殻類（例えば、カニ、ロブスターおよびエビ（例えばホッコクアカエビ Ｐａｎｄａｌｕｓ ｂｏｒｅａｌｉｓ））および昆虫の外骨格、軟体動物の歯舌、頭足類、例えばイカおよびタコの嘴の主要構成成分である。それは、第二の最も一般的な天然多糖であり、世界の年間生産量は２．３×１０^９トンと概算されている（Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ， Ｖｏｌ． ６： Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ＩＩ： Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｆｒｏｍ Ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ， Ｖａｎｄａｍｍｅ Ｅ．Ｊ．， Ｄｅ Ｂａｅｔｓ Ｓ．， Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ Ａ．， Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ２００２， ｐ． ４８８参照）。

キチン

キトサン ポリ［β−（１→４）−２−アミノ−２−でオキシ−Ｄ−グルコピラノース］は、キチンを脱アセチル化することにより得られる生分解性、生体適合性および非毒性の線状アミノ多糖である。キチンの完全脱アセチル化は、１００％の脱アセチル化度（ＤＤ）を有し、β−（１−４）結合Ｄ−グルコサミン（脱アセチル化単位）のみからなるキトサンを生じる：

キトサン

１００％より小さい脱アセチル化度（ＤＤ）を有するキトサンは、さらに、いくつかの元のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン単位を含む。市販のキトサンの脱アセチル化度は、通常は、５０〜１００％の範囲である。

キトサンは、プロトン化された場合に陽イオン性である少数の生体ポリマーのうちの１つである。陽イオン性ポリマーは、一般的に、細菌の細胞壁上に吸着し、したがって抗菌剤として作用し得る。例えば多数の研究が、創傷処置におけるキトサンの効力を略述している。しかしながら、その他の用途におけるキトサンの利用は、中性形態である場合の水中でのその不溶性のため、限定されてきた。その可溶性は、ｐＨ＜６．５の希酸水溶液に限定される。

Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルキトサン（ＴＭＣ）は、キトサンをメチル化することにより一般的に得られるポリカチオンである。それは、以下の理想的化学式を有し、電荷を平衡させるために対イオンを伴う：

Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルキトサン（ＴＭＣ）

しかしながら、このような「理想的」ＴＭＣは生成されていない。実際、文献で報告されているＴＭＣは、低四級化度（ＤＱ）の窒素原子（せいぜい３０〜４０％）を有し、これは、少なくともいくつかのＤ−グルコサミン単位が、０、１または２つのメチル基を有するに過ぎず、３つを保有することはない、ということを意味する。

典型的には、ＴＭＣの調製方法は、種々の実験条件下で、塩基、しばしば水酸化ナトリウムの存在下で、ヨードメタン（ヨウ化メチル）またはジメチルスルフェートを用いて、キトサンにおけるメチル化反応を首尾よく実行することを包含する（Ｃｕｒｔｉ Ｅ．， Ｂｒｉｔｔｏ Ｄ．， Ｃａｍｐａｎａ−Ｆｉｌｈｏ Ｓ．Ｐ．， Ｍａｃｒｏｍｏｌ． Ｂｉｏｓｃｉ．， ２００３， ３， ５７１−５７６ ａｎｄ Ｈａｍｍａｎ Ｊ．Ｈ．， Ｋｏｔｚｅ Ａ．Ｆ．， Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ． Ｉｎｄ． Ｐｈａｒｍ．， ２００１， ２７， ３７３−３８０参照）。しかしながら、これらの条件下でのキトサンのメチル化は、非メチル化モノ、ジおよびトリメチル化アミンの混合物の生成をもたらす。

確かに、多糖の化学的修飾は、多数の有機および無機溶媒（水を含む）中の多糖の可溶性の欠如、種々の他の化学的機能の存在（したがって修飾は位置選択的でなければならない）、ならびに大きい数の反復単位といったような多くの困難を生じさせる。それにもかかわらず、水中で可溶性であるポリ陽イオン性キトサンを提供するので、ＴＭＣの合成は多くの学者の論文の対象となってきた。確かにＴＭＣの生成は正電荷を導入し、したがって、部分的に四級化される場合でさえ、広範なｐＨ範囲で水溶性物質を提供する。したがって、高四級化度を有するＴＭＣを生成するのが望ましい。

さらに、３０〜４０％より以上に四級化度を増大する試みは、Ｏ−置換度（Ｏ−ＤＳ）として言及される程度に、位置３および／または位置６でのＯＨ基の酸素原子のメチル化を生じる、ということが報告されている。親水性−ＯＨ基はより疎水性の−ＯＣＨ_３基に置き換えられるので、高Ｏ−置換度は水中でのＴＭＣ可溶性を減少させる。したがって、低Ｏ−置換度を有するＴＭＣを生成するのが望ましい。

キトサンにおける高四級化度（ＤＱ）を有するキトサンは、ヨードメタンおよび水酸化ナトリウムを用いて、３つのメチル化ステップを包含する工程で得られる（９０．５％のＤＱ）；しかしながら、これらの条件は、それぞれ８２．８および９８．５％である特に位置３および位置６での高Ｏ−置換度（Ｏ−３およびＯ−６メチル化）ももたらす（Ｐｏｌｎｏｋ Ａ．， ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｉｏｐｈａｒｍ．， ２００４， ５７， ７７−８３）。アルコール基の置換によるメチルエーテルの生成（Ｏ−メチル化）は、望ましくないことに、キトサン誘導体の可溶性を減少させ、そしておそらくは水不溶性物質にする（（Ｃｕｒｔｉ Ｅ．， Ｂｒｉｔｔｏ Ｄ．， Ｃａｍｐａｎａ−Ｆｉｌｈｏ Ｓ．Ｐ．， Ｍａｃｒｏｍｏｌ． Ｂｉｏｓｃｉ．， ２００３， ３， ５７１−５７６， Ｐｏｌｎｏｋ Ａ．， ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｉｏｐｈａｒｍ．，５７， ７７−８３， ａｎｄ Ｓｎｙｍａｎ Ｄ．， Ｈａｍｍａｎ Ｊ．Ｈ．， Ｋｏｔｚｅ Ｊ．Ｓ．， Ｒｏｌｌｉｎｇｓ Ｊ．Ｅ．， Ｋｏｔｚｅ Ａ．Ｆ．， Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ． Ｐｏｌｙｍ．， ２００２， ５０， １４５−１５０）。

さらに、水酸化ナトリウムまたは強アルカリ性環境の使用は、ポリマーの分子量を減少させる。Ｏ−メチル化を防止する実験環境を用いて、低四級化度が一般的に得られている（Ｐｏｌｎｏｋ Ａ．， ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｉｏｐｈａｒｍ．， ２００４， ５７， ７７−８３）。

代替的には、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジンが、キトサンの分解を回避するために水酸化ナトリウムの代わりの塩基として用いられた場合、低ＤＱ（７．３〜９．６％）が得られた（Ｈａｍｍａｎ Ｊ．Ｈ．， Ｋｏｔｚｅ Ａ．Ｆ．， Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ． Ｉｎｄ． Ｐｈａｒｍ．， ２００１， ２７， ３７３−３８０）。

ＴＭＣは、さらにまた、メチル化剤としてジメチルスルフェートを用いて合成されてきた（Ｂｒｉｔｔｏ Ｄ．， Ｆｏｒａｔｏ Ｌ．Ａ．， Ａｓｓｉｓ Ｏ．Ｂ．Ｇ．， Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ． Ｐｏｌｙｍ．， ２００８， ７４， ８６−９１， Ｂｒｉｔｔｏ Ｄ．， Ａｓｓｉｓ Ｂ．Ｇ．Ｏ．， Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ． Ｐｏｌｙｍ．， ２００７， ６９， ３０５， ａｎｄ Ｂｒｉｔｔｏ Ｄ．， Ａｓｓｉｓ Ｂ．Ｇ．Ｏ．， Ｉｎｔｌ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｍａｃｒｏｍｏｌ．， ２００７， ４１，１９８）。

キトサンは、さらにまた、ホルムアルデヒドとの、その後、水素化ホウ素ナトリウムとの反応によりＮ−過メチル化されている。Ｎ−過メチル化キトサンは、ヨードメタンと反応して、ＴＭＣを生成する。その結果生じたＴＭＣヨウ化物は６０％という高Ｏ置換度を有し、抗生物質活性を示すが、しかし水に不溶性である（Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉ Ｒ．Ａ．Ａ．， Ｔａｎｆａｎｉ Ｆ．， Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ． Ｐｏｌｙｍ．， １９８５， ５， ２９７）。

混合Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリアルキルキトサン誘導体の調製も、異なるアルキルヨウ化物を用いて報告されている（Ａｖａｄｉ Ｍ．Ｒ．， Ｚｏｈｕｒｉａａｎ−Ｍｅｈｒ Ｍ．Ｊ．， Ｙｏｕｎｅｓｓｉ Ｐ．， Ａｍｉｎｉ Ｍ．， Ｒａｆｉｅｅ Ｔｅｈｒａｎｉ Ｍ．， Ｓｈａｆｉｅｅ Ａ．， Ｊ． Ｂｉｏａｃｔ． Ｃｏｍｐａｔ． Ｐｏｌｙｍ．， ２００３， １８， ４６９ ａｎｄ Ｂａｙａｔ Ａ．， Ｓａｄｅｇｈｉ Ａ．Ｍ．Ｍ．， Ａｖａｄｉ Ｍ．Ｒ．， Ａｍｉｎｉ Ｍ．， Ｒａｆｉｅｅ−Ｔｅｈｒａｎｉ Ｍ．， Ｓｈａｆｉｅｅ Ａ．， Ｍａｊｌｅｓｉ Ｒ．， Ｊｕｎｇｉｎｇｅｒ Ｈ．Ｅ．， Ｊ． Ｂｉｏａｃｔ． Ｃｏｍｐａｔ． Ｐｏｌｙｍ．， ２００６， ２１， ４３３）。

ＴＭＣは、その多目的使用のため、関心を集めている。ＴＭＣの既知の使用としては、例えば以下のものが挙げられる：
粘膜を通した（例えば、腸壁を通した）分子の吸収の増大、
遺伝子およびタンパク質を含めた種々の物質の制御放出、ならびに
抗菌剤としての使用。

Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルキトサンは、（キトサンと比較して）正電荷の密度増大を有し、そして上皮細胞の密な接合を開放することが示されている。したがって、生理学的ｐＨにおける親水性および高分子薬剤のための強力な腸吸収増強剤であることが立証されている（Ｔｈａｎｏｕ Ｍ．， Ｆｌｏｒｅａ Ｂ．Ｉ．， Ｌａｎｇｅｍｅｙｅｒ Ｍ．Ｗ．Ｅ．， Ｖｅｒｈｏｅｆ Ｊ．Ｃ．， Ｊｕｎｇｉｎｇｅｒ Ｈ．Ｅ．， Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓ．， ２０００， １７， ２７； Ｔｈａｎｏｕ Ｍ．， Ｖｅｒｈｏｅｆ Ｊ．Ｃ．， Ｖｅｒｈｅｉｊｄｅｎ Ｊ．Ｈ．Ｍ．， Ｊｕｎｇｉｎｇｅｒ Ｈ．Ｅ．， Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓ．， ２００１， １８， ８２３； Ｔｈａｎｏｕ Ｍ．， Ｋｏｔｚｅ Ａ．Ｆ．， Ｓｃｈａｒｒｉｎｇｈａｕｓｅｎ Ｔ．， Ｌｅｕｂｅｎ Ｈ．Ｌ．， Ｄｅ Ｂｏｅｒ Ａ．Ｇ．， Ｖｅｒｈｏｅｆ Ｊ．Ｃ．， Ｊｕｎｇｉｎｇｅｒ Ｈ．Ｅ．， Ｊ． Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ， ２０００，１５； Ｔｈａｎｏｕ Ｍ．， Ｖｅｒｈｏｅｆ Ｊ．Ｃ．， Ｊｕｎｇｉｎｇｅｒ Ｈ．Ｅ．， Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．， ２００１， ５２， １１７； ａｎｄ Ｆｌｏｒｅａ Ｂ．Ｉ．， Ｔｈａｎｏｕ Ｍ．， Ｊｕｎｇｉｎｇｅｒ Ｈ．Ｅ．， Ｂｏｒｃｈａｒｄ Ｇ．， Ｊ． Ｃｏｎｔｒｏｌ． Ｒｅｌｅａｓｅ， ２００６， １１０， ３５３）。正電荷の密度は、薬剤吸収増強特性に及ぼす重要な作用を有することが既知である（Ｋｏｔｚｅ Ａ．Ｆ．， ＬｕｅβＥｎＬ．， Ｌｅｅｕｗ Ｂ．Ｊ．， Ｂｏｅｒ Ｂ．Ｇ．， Ｖｅｒｈｏｅｆ Ｊ．Ｃ．， Ｊｕｎｇｉｎｇｅｒ Ｈ．Ｅ．， Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １９９７， １４， １１９７； ａｎｄ Ｋｏｔｚｅ Ａ．Ｆ．， Ｔｈａｎｏｕ Ｍ．， Ｌｕｅｂｅｎ Ｈ．Ｌ．， ｄｅ Ｂｏｅｒ Ａ．Ｇ．， Ｖｅｒｈｏｅｆ Ｊ．Ｃ．， Ｊｕｎｇｉｎｇｅｒ Ｈ．Ｅ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｉｏｐｈａｒｍ．， １９９９， ４７， ２６９）。四級化度が高いほど、吸収の増大は大きい、ということが報告されている。

Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ．， ２００８， ９７（５）， １６５２−１６８０によれば、経上皮浸透を増大するポリマーは、ポリカチオン（キトサン、ポリ−Ｌ−アルギニン（ポリ−Ｌ−Ａｒｇ）、アミン化ゼラチン）、ポリアニオン（Ｎ−カルボキシメチルキトサン、ポリ（アクリル酸））およびチオール化ポリマー（カルボキシメチルシステイン−セルロース、ポリカルボフィル（ＰＣＰ）−システイン、キトサン−チオブチルアミジン、キトサン−チオグリコール酸、キトサン−グルタチオン結合体）である。

ＴＭＣは、その他のある用途に、例えば遺伝子送達に、結腸薬剤送達に、および抗菌剤として用いられてきた（Ｒｕｎａｒｓｓｏｎ Ｏ．Ｖ．， ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｐｏｌｙｍ． Ｊ．， ２００７， ４３， ２６６０−２６７１； Ｂｏｒｃｈａｒｄ Ｇ．， Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．， ２００１， ５２， １４５； Ｄｏｄｏｕ Ｄ．， Ｂｒｅｅｄｖｅｌｄ Ｐ．， Ｗｉｅｒｉｎｇａ Ｐ．Ａ．， Ｅｕｒｏ． Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｉｏｐｈａｒｍ．，６０， １； Ｋｉｍ Ｃ．Ｈ．， Ｃｈｏｉ Ｊ．Ｗ．， Ｃｈｕｎ Ｈ．Ｊ．， Ｃｈｏｉ Ｋ．Ｓ．， Ｐｏｌｙｍ． Ｂｕｌｌ．， １９９７， ３８， ３８７； Ｋｅａｎ Ｔ．， Ｒｏｔｈ Ｓ．， Ｔｈａｎｏｕ Ｍ．， Ｊ． Ｃｏｎｔｒｏｌ． Ｒｅｌｅａｓｅ， ２００５， １０３， ６４３； ａｎｄ Ｊｉａ Ｚ．， Ｓｈｅｎ Ｄ．， Ｘｕ Ｗ．， Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ． Ｒｅｓ．， ２００１， ３３３， １）。構造−活性関係試験は、キトサンにおける、およびキトオリゴマーにおけるＮ−四級化が、ｐＨ７．２での黄色ブドウ球菌Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓに対する抗菌活性に関与していた、ということを明示している（Ｒｕｎａｒｓｓｏｎ Ｏ．Ｖ．， ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｐｏｌｙｍ． Ｊ．， ２００７， ４３， ２６６０−２６７１）。

陽イオン性ポリマー、例えばプロトン化キトサンは、抗菌特性を保有することが既知である（Ｌｉｍ， Ｓ．Ｈ． ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｍａｃｒｏｍｏｌ． Ｓｃｉ．−Ｐｏｌｙｍ． Ｒｅｖ．， ２００３， Ｃ４３， ２２３）。ポリマーの抗菌活性に影響を及ぼす因子は、一般的に、構造、分子量、対イオンの性質、および疎水性である（Ｋｅｎａｗｙ， Ｅ． ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ， ２００７， ８， １３５９−１３８４）。死滅時間は、キトサンに関しては３０分という低さであり得る（Ｅｌ−Ｓｈａｒｉｆ， Ａ．Ａ． ｅｔａｌ． Ｃｕｒｒ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ２０１１， ６２， ７３９−７４５）。

付加的には、親水性生体ポリマーは一般的に、軟化作用を有することが既知である。

したがって、高四級化度および低異種原子置換度を有するＮ，Ｎ，Ｎ−トリアルキルアミノポリマー、特にＮ，Ｎ，Ｎ−トリアルキルアミノ多糖を生成する改良された方法が依然として必要とされている。特に、高四級化度および低Ｏ−置換度を有するＮ，Ｎ，Ｎ−トリアルキルキトサンの改良された生成方法が必要とされている。

本発明は、Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリアルキルキトサンの新規の且つ改良された調製方法を意図している。当該方法は、高四級化度および低Ｏ−置換度を有するＮ，Ｎ，Ｎ−トリアルキルキトサンを生じさせる。本発明の方法により生成されるＮ，Ｎ，Ｎ−トリアルキルキトサンは、種々の用途を有する。本発明による方法は、Ｎとは異なる他の異種原子を有するＮ，Ｎ，Ｎ−トリアルキルアミノポリマーの調製に適用され得る。さらに具体的には、本発明による方法は、Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリアルキルアミノ多糖に適用され得る。

一実施形態において、当該方法は、高Ｎ−置換度を有するＮ，Ｎ−ジアルキルアミノポリマーを生成するためにアミノポリマーをアルキル化する（この場合、Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリアルキルアミノポリマーの生成を伴わない）という第一ステップを包含する。本方法は、Ｎ，Ｎ−ジアミノポリマーをアルキル化して、Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリアルキルアミノポリマーを生成するというその後のステップも包含する。さらに具体的には、Ｎ，Ｎ−ジアルキルアミノポリマーは、アルデヒドおよび蟻酸の使用を伴う還元的アミノ化反応（エシュバイラー・クラーク反応）により得られる。その後のステップにおけるＮ，Ｎ−ジアルキルアミノポリマーは、アルキル化剤および塩基の使用を伴う。

Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルキトサンの生成のための本発明による方法の一実施形態では、２．０のＮ−置換度（Ｎ−ＤＳ）を有するキトサンが用いられる。

したがって、本発明は、以下のものを提供する：
１．Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリアルキルアミノポリマーの調製方法であって、以下の：
ａ）窒素原子と異なる１つ以上の非置換異種原子を有するアミノポリマーを提供すること；
ｂ）Ｎ，Ｎ−ジアルキルアミノポリマーを生成するためにアミノポリマーをアルキル化すること（この場合、実質的にＮ，Ｎ，Ｎ−トリアルキルアミノポリマーは生成されない）；そして
ｃ）Ｎ，Ｎ−ジアミノポリマーをアルキル化して、Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリアルキルアミノポリマーを生成すること
を包含する方法であり、低パーセンテージの非置換異種原子のみがアルキル化される方法。
２．Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリアルキルアミノ多糖の調製方法であって、以下の：
ａ）窒素原子と異なる１つ以上の非置換異種原子を有するアミノ多糖を提供すること；
ｂ）Ｎ，Ｎ−ジアルキルアミノ多糖を生成するためにアミノ多糖をアルキル化すること（この場合、実質的にＮ，Ｎ，Ｎ−トリアルキルアミノ多糖は生成されない）；そして
ｃ）Ｎ，Ｎ−ジアミノ多糖をアルキル化して、Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリアルキルアミノ多糖を生成すること
を包含する方法であり、低パーセンテージの非置換異種原子のみがアルキル化される方法。
３．各アルキル基が、独立して、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル基、好ましくはＣ_１〜Ｃ_３アルキル基である（これは、飽和または不飽和の分枝鎖または非分枝鎖で、任意に異種原子を有する）であり、さらに好ましくはアルキル基が、独立して、メチル基またはプロピル基である項目１または２記載の方法。
４．各非置換異種原子が独立して酸素またはイオウ原子である項目１〜３のいずれか一項に記載の方法。
５．ステップｂ）がアルデヒドおよび蟻酸を用いて実施される項目１〜４のいずれか一項に記載の方法。
６．ステップｂ）が還元的アミノ化反応である項目１〜４のいずれか一項に記載の方法。
７．前記アルデヒドがＣ_１〜Ｃ_６アルデヒド、好ましくはＣ_１〜Ｃ_３アルデヒド（これは、飽和または不飽和の分枝鎖または非分枝鎖で、任意に異種原子を有する）であり、さらに好ましくはアルデヒドがホルムアルデヒドまたはプロパナールである項目５記載の方法。
８．ステップｃ）が、有機溶媒、水および／またはアルコールを含む反応溶媒中で、アルキル化剤、例えばアルキルハロゲン化物またはジアルキル炭酸塩を用いて実施される項目１〜７のいずれか一項に記載の方法。
９．ＨＣｌ、ＨＢｒまたはＨＩを付加して、塩化物、臭化物またはヨウ化物対イオンを有するＮ，Ｎ，Ｎ−トリアルキルアミノポリマーを生成するステップをさらに包含する項目１記載の方法。
１０．ＨＣｌ、ＨＢｒまたはＨＩを付加して、塩化物、臭化物またはヨウ化物対イオンを有するＮ，Ｎ，Ｎ−トリアルキルアミノ多糖を生成するステップをさらに包含する項目２記載の方法。
１１．Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリアルキルキトサンの調製方法であって、以下の：
ａ）キトサンを提供すること；
ｂ）Ｎ，Ｎ−ジアルキルキトサンを生成するためにキトサンをアルキル化すること（この場合、実質的にＮ，Ｎ，Ｎ−トリアルキルキトサンは生成されない）；そして
ｃ）Ｎ，Ｎ−ジアルキルキトサンをアルキル化して、Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリアルキルキトサンを生成すること
を包含する方法であり、低パーセンテージの非置換異種原子のみがアルキル化される方法。
１２．各アルキル基が、独立して、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル基、好ましくはＣ_１〜Ｃ_３アルキル基である（これは、飽和または不飽和の分枝鎖または非分枝鎖で、任意に異種原子を有する）であり、さらに好ましくはアルキル基が、独立して、メチル基またはプロピル基である項目１１記載の方法。
１３．前記Ｎ，Ｎ−ジアルキルキトサンが約２．０のＮ置換度（Ｎ−ＤＳ）を有する項目１１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
１４．キトサンが、約１００％、約９５％以上、約９０％以上、約８５％以上、約８０％以上、約７５％以上、約７０％以上、約６５％以上または約６０％以上の脱アセチル化度（ＤＤ）を有する項目１１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
１５．ステップｂ）がアルデヒドおよび蟻酸を用いて実施される項目１１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
１６．前記アルデヒドがＣ_１〜Ｃ_６アルデヒド、好ましくはＣ_１〜Ｃ_３アルデヒドである（これは、飽和または不飽和の分枝鎖または非分枝鎖で、任意に異種原子を有する）であり、さらに好ましくはアルデヒドがホルムアルデヒドまたはプロパナールである項目１５記載の方法。
１７．ステップｂ）が還元的アミノ化反応である項目１１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
１８．ステップｃ）が、反応溶媒中でアルキル化剤および塩基を用いて実施される項目１１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
１９．前記アルキル化剤中のアルキル基がＣ_１〜Ｃ_６アルキル基、好ましくはＣ_１〜Ｃ_３アルキル基である（これは、飽和または不飽和の分枝鎖または非分枝鎖で、任意に異種原子を有する）であり、さらに好ましくはアルキル化剤中のアルキル基がメチル基またはプロピル基である項目１８記載の方法。
２０．前記アルキル化剤がハロアルカンまたはジアルキルカルボネートであり、好ましくは前記アルキル化剤がヨードメタン、ヨードプロパンまたはジメチルカルボネートである項目１８または１９記載の方法。
２１．前記塩基が水酸化物塩またはアルカリ性炭酸塩または重炭酸塩である項目１８〜２０のいずれか一項に記載の方法。
２２．前記塩基が水酸化ナトリウムまたは炭酸ナトリウムである項目１８〜２１のいずれか一項に記載の方法。
２３．前記反応溶媒がＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、水、アルコール、ＤＭＦと水の混合物、ＤＭＦとアルコールの混合物またはアルコールの混合物である項目１８記載の方法。
２４．ステップｂ）およびステップｃ）のうちの少なくとも一方がマイクロ波を用いて実施される項目１１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
２５．ＨＣｌ、ＨＢｒまたはＨＩを付加して、塩化物、臭化物またはヨウ化物対イオンを有するＮ，Ｎ，Ｎ−トリアルキルキトサンを生成するステップをさらに包含する項目１１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
２６．項目１〜２５のいずれか一項に記載の方法により生成されるＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルキトサン。
２７．炭酸塩、ハロゲン化物、臭化物、ヨウ化物または水酸化物対イオンと関連して項目１〜２５のいずれか一項に記載の方法により生成されるＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルキトサン。
２８．約３０％以上の第四級化度および約９５％以下のＯ−置換度を有する項目１〜２５のいずれか一項に記載の方法により生成されるＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルキトサン。
２９．約３０％以上の第四級化度および約９５％以下のＯ−置換度を有するＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルキトサン。
３０．約３５％以上、約４０％以上、約４５％以上、約４６％以上、約５０％以上、約５５％以上、約６０％以上、約６５％以上、約７０％以上、約７５％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９８％以上または約１００％の第四級化度を有する項目１〜２５のいずれか一項に記載の方法により生成されるＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルキトサン。
３１．約３５％以上、約４０％以上、約４５％以上、約４６％以上、約５０％以上、約５５％以上、約６０％以上、約６５％以上、約７０％以上、約７５％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９８％以上または約１００％の第四級化度を有するＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルキトサン。
３２．約９０％以下、約８５％以下、約８０％以下、約７５％以下、約７０％以下、約６５％以下、約６０％以下、約４５％以下、約４０％以下、約３５％以下、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下、約５％以下、約２％以下または約０％のＯ−置換度を有する項目１〜２５のいずれか一項に記載の方法により生成されるＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルキトサン。
３３．約９０％以下、約８５％以下、約８０％以下、約７５％以下、約７０％以下、約６５％以下、約６０％以下、約４５％以下、約４０％以下、約３５％以下、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下、約５％以下、約２％以下または約０％のＯ−置換度を有するＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルキトサン。
３４．約１００％、約９５％以上、約９０％以上、約８５％以上、約８０％以上、約７５％以上、約７０％以上、約６５％以上または約６０％以上の脱アセチル化度を有する項目１〜２５のいずれか一項に記載の方法により生成されるＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルキトサン。
３５．約１００％、約９５％以上、約９０％以上、約８５％以上、約８０％以上、約７５％以上、約７０％以上、約６５％以上または約６０％以上の脱アセチル化度を有するＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルキトサン。
３６．項目２６〜３５のいずれか一項に記載のＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルキトサンおよび製薬上許容可能な担体を含む薬学的組成物。
３７．項目２６〜３５のいずれか一項に記載のＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルキトサンまたは項目３６記載の薬学的組成物を、それを必要とする被験体に投与することを包含する高コレステロール血症の処置方法。
３８．創傷の治癒を促進する方法であって、項目２６〜３５のいずれか一項に記載のＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルキトサンを含む皮膚ケア製品を創傷に局所的に適用することを包含する方法。
３９．粘膜による分子の吸収を増大する方法であって、項目２６〜３５のいずれか一項に記載のＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルキトサンまたは項目３６記載の薬学的組成物と一緒に、当該分子を被験体に投与することを包含する方法。
４０．分子の制御放出の実施方法であって、項目２６〜３５のいずれか一項に記載のＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルキトサンまたは項目３６記載の薬学的組成物と一緒に、当該分子を被験体に投与することを包含する方法。
４１．被験体における高コレステロール血症を処置するための項目２６〜３５のいずれか一項に記載のＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルキトサンまたは項目３６記載の薬学的組成物の使用。
４２．被験体における創傷の治癒を促進するための項目２６〜３５のいずれか一項に記載のＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルキトサンまたは項目３６記載の薬学的組成物の使用。
４３．粘膜を通した分子の吸収を増大するための項目２６〜３５のいずれか一項に記載のＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルキトサンまたは項目３６記載の薬学的組成物の使用。
４４．分子の制御放出のための項目２６〜３５のいずれか一項に記載のＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルキトサンまたは項目３６記載の薬学的組成物の使用。
４５．ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害薬またはコレステロール吸収阻害薬であるコレステロール低下薬と組合せた項目２６〜３５のいずれか一項に記載のＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルキトサンまたは項目３６記載の薬学的組成物の使用。
４６．コレステロール低下薬としての項目２６〜３５のいずれか一項に記載のＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルキトサンの使用。
４７．ポリクォーターニウムとしての項目２６〜３５のいずれか一項に記載のＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルキトサンの使用。
４８．皮膚軟化薬としての項目２６〜３５のいずれか一項に記載のＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルキトサンの使用。
４９．抗菌薬としての項目２６〜３５のいずれか一項に記載のＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルキトサンの使用。
５０．高コレステロール血症の処置のための項目２６〜３５のいずれか一項に記載のＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルキトサンまたは項目３６記載の薬学的組成物。
５１．創傷治癒の促進のための項目２６〜３５のいずれか一項に記載のＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルキトサンまたは項目３６記載の薬学的組成物。
５２．ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害薬またはコレステロール吸収阻害薬であるコレステロール低下薬と組合せた投与のための項目２６〜３５のいずれか一項に記載のＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルキトサンまたは項目３６記載の薬学的組成物。
５３．項目２６〜３５のいずれか一項に記載のＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルキトサンを含む天然健康製品。
５４．項目２６〜３５のいずれか一項に記載のＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルキトサンを含む栄養医薬品。
５５．項目２６〜３５のいずれか一項に記載のＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルキトサンを含む個別看護製品。
５６．前記個別看護製品がヘアケア製品またはスキンケア製品である項目５５記載の個別看護製品。
５７．創傷治癒の促進のための項目５５または５６記載の個別看護製品。
５８．項目２６〜３５のいずれか一項に記載のＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルキトサンを含む眼用製品。
５９．項目２６〜３５のいずれか一項に記載のＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルキトサンを含む美容医薬品。
６０．創傷治癒の促進のための項目５９記載の美容医薬品。
６１．項目２６〜３５のいずれか一項に記載のＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルキトサンを含む化粧品。
６２．被験体における高コレステロール血症を処置するための医薬品の調製における項目２６〜３５のいずれか一項に記載のＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルキトサンの使用。
６３．被験体における創傷の治癒を促進するための医薬品の調製における項目２６〜３５のいずれか一項に記載のＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルキトサンの使用。
６４．粘膜を通した分子の救急を増大するための医薬品の調製における項目２６〜３５のいずれか一項に記載のＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルキトサンの使用。
６５．分子の制御放出のための医薬品の調製における項目２６〜３５のいずれか一項に記載のＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルキトサンの使用。
６６．項目１記載の方法により生成されるＮ，Ｎ，Ｎ−トリアルキルアミノポリマー。
６７．項目２記載の方法により生成されるＮ，Ｎ，Ｎ−トリアルキルアミノ多糖。
６８．項目１〜２５のいずれか一項に記載の方法により生成されるＮ，Ｎ，Ｎ−トリプロピルキトサン。

添付の図面において：
Ｄ_２Ｏ中のＤＭＣ・ＨＣｌのＮＭＲスペクトルである。 Ａ)キトサン、Ｂ）ＤＭＣ、およびＣ）ＴＭＣのＩＲスペクトルである。 ＴＭＣによるＮａＧＣの収着等温線である。 セルロース（四角）、ＴＭＣ（菱形）およびコレスチラミン（三角）による４週間の処置中の体重の変化を示す。 セルロース（四角）、ＴＭＣ（菱形）およびコレスチラミン（三角）による４週間の処置中の総コレステロール（黒色記号）および血漿非ＨＤＬ（ＶＬＤＬ、ＬＤＬおよびＭＤＬ −灰色記号）を示す。 セルロース（四角）、ＴＭＣ（菱形）およびコレスチラミン（三角）による４週間の処置中のＨＤＬの変化を示す； セルロース（四角）、ＴＭＣ（菱形）およびコレスチラミン（三角）による４週間の処置中のＨＤＬ／非ＨＤＬ比を示す。 セルロース（四角）、ＴＭＣ（菱形）およびコレスチラミン（三角）による４週間の処置におけるトリグリセリドを示す。 ＴＭＣ濃度に基づいたグラム陰性細菌である大腸菌および緑膿菌に関する成長進化および増殖速度を示す。 ＴＭＣ濃度に基づいたグラム陽性細菌である黄色ブドウ球菌および腸球菌（エンテロコッカス・フェカリス）に関する成長進化および増殖速度を示す。 ＴＭＣ濃度に基づいたグラム陽性細菌である恥垢菌（マイコバクテリウム・スマグマチス）およびβ溶血性連鎖球菌に関する成長進化および増殖速度を示す。

本発明の詳細な説明

本発明は、一態様によれば、Ｎと異なる他の非置換異種原子を有するＮ，Ｎ，Ｎ−トリアルキルアミノポリマー、特にＮ，Ｎ，Ｎ−トリアルキル多糖を提供する。実施形態において、アルキル基は、各々独立して、Ｃ_１〜Ｃ_６、好ましくはＣ_１〜Ｃ_３アルキル基である（これは、飽和または不飽和の分枝鎖または非分枝鎖である）。さらに好ましくは、アルキル基は、メチル基またはプロピル基である。存在する他の異種原子は、ＯまたはＳであり得る。低パーセンテージの他の異種原子のみが、本発明による調製方法中にアルキル化される。

本発明の実施形態では、Ｎ，Ｎ−ジアルキルアミノポリマーおよびＮ，Ｎ−ジアルキルアミノ多糖は、それぞれＮ，Ｎ−ジメチルアミノポリマーおよびＮ，Ｎ−ジメチルアミノ多糖である。これらの実施形態では、Ｎ，Ｎ−ジアルキルアミノポリマーおよびＮ，Ｎ−ジアルキルアミノ多糖の調製は、アルデヒド、例えばホルムアルデヒドまたはプロパナールおよび蟻酸の使用を伴う還元的アミノ化（エシュバイラー・クラーク反応）により実施される。アルキル基がメチルでない本発明の実施形態では、適切なアルキル化反応が実施され、これは二重Ｎアルキル化で停止する、と当業者は理解する。

Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノポリマーおよびＮ，Ｎ−ジメチルアミノ多糖は、その後、アルキル化剤および塩基の使用を伴うアルキル化反応に付される。アルキル化反応は、有機溶媒を含むこともある適切な溶媒中で実施される。適切な反応溶媒は、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、水および／またはアルコールであり得る。アルキル化剤は、アルキルハリドまたはジアルキルカルボネートであり得る。

本発明は、別の態様によれば、Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルキトサン（ＴＭＣ）の調製方法をさらに提供する。Ｎ，Ｎ−ジメチルキトサンの調製は、ホルムアルデヒドおよび蟻酸の使用を伴う還元的アミノ化（エシュバイラー・クラーク反応）により実施される。Ｎ，Ｎ−ジメチルキトサンは、その後、ＤＭＦ、水、アルコール、ＤＭＦと水の混合物、ＤＭＦとアルコールの混合物またはアルコールの混合物である反応溶媒中で実施される。アルキル化反応に用いられる適切な塩基は、水酸化ナトリウムまたは炭酸ナトリウムである。本発明の実施形態では、アルキル化反応は、マイクロ波中で実施される。本発明による方法で用いられるキトサンは、約２．０のＮ置換度（Ｎ−ＤＳ）を有する。非置換であるＯ原子の低パーセンテージのみが、調製方法中にメチル化される。

一態様において、本発明は、約３０％以上の第四級化度および約９５％以下のＯ−置換度（Ｏ−ＤＳ）を有するＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルキトサン（ＴＭＣ）を提供する。

Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルキトサン（ＴＭＣ）の第四級化度（ＤＱ）は、３つのメチル基を保有するＴＭＣの窒素原子の数対ＴＭＣの窒素原子の総数の比である。第四級化度は、比として、またはパーセンテージとして表され得る。

実施形態において、ＴＭＣは、約３５％以上、約４０％以上、約４５％以上、約４６％以上、約５０％以上、約５５％以上、約６０％以上、約６５％以上、約７０％以上、約７５％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９８％以上または約１００％の第四級化度を有する。

本明細書において、Ｏ−置換度（Ｏ−ＤＳ）は、メチル基を保有するＴＭＣの３および６位置出の酸素原子数対ＴＭＣの３および６位置での酸素原子の総数の比である。Ｏ−置換度（Ｏ−ＤＳ）は、比として、またはパーセンテージとして表され得る。Ｏ−置換度は低い。さらにまた、窒素原子と異なる他の異種原子が酸素原子でない本発明によるＮ，Ｎ，Ｎ−トリアルキルアミノポリマーおよびＮ，Ｎ，Ｎ−トリアルキルアミノ多糖において、このような異種原子の置換度は低い。本明細書中で用いる場合、窒素原子と異なる異種原子、例えば酸素原子の「低置換度」は、約９０％以下、約８５％以下、約８０％以下、約７５％以下、約７０％以下、約６５％以下、約６０％以下、約４５％以下、約４０％以下、約３５％以下、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下、約５％以下、約２％以下または約０％の置換度を意味する。

実施形態において、ＴＭＣは、約９０％以下、約８５％以下、約８０％以下、約７５％以下、約７０％以下、約６５％以下、約６０％以下、約４５％以下、約４０％以下、約３５％以下、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下、約５％以下、約２％以下または約０％のＯ−置換度を有する。

本発明のＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルキトサンはポリカチオンであり、したがって少なくとも固体形態で、対イオンと関連して存在する。任意の適切な対イオンが用いられ得る。ＴＭＣの最終目的によって、この対イオンを当業者は選択する。実施形態において、対イオンは炭酸塩イオン（ＣＯ_３ ^２−）、ハロゲン化物イオン、例えば塩化物イオン（Ｃｌ−）またはヨウ化物イオン（Ｉ−）、あるいは水酸化物イオン（ＯＨ−）である。

本発明のＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルキトサンは、Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルキトサンが作られるキトサンのＤＤによって決まる脱アセチル化度（ＤＤ）も有する。本明細書において、ＴＭＣまたはキトサンの脱アセチル化度は、アセチル基を保有しないＴＭＣまたはキトサンの窒素原子数対ＴＭＣまたはキトサンの窒素原子の総数の比である。脱アセチル化度は、比として、またはパーセンテージとして表され得る。

アセチル基を保有しないキトサンの窒素原子は３つのメチル器を保有し得る、ということに留意すべきである。したがって、所定のＴＭＣに関して得られ得る最高ＤＱは、その製造のために用いられるキトサンのＤＤによって決まる。例えば、８５％のＤＤを有するキトサンは、第四級化されるために利用可能なその窒素原子の８５％のみを有する。

実施形態において、ＴＭＣ（ならびにそれが調製されたキトサン）は、約１００％、約９５％以上、約９０％以上、約８５％以上、約８０％以上、約７５％以上、約７０％以上、約６５％以上または約６０％以上のＤＤを有する。

当業者に明らかであるように、生分解性であるキトサンの誘導体である本発明のＴＭＣは、生分解性であると予期される。

対イオンによって、本発明のＴＭＣは、水に可溶性であるかまたは不溶性であり得る。例えば、ＴＭＣ炭酸塩は水に不溶性であるが、一方、ＴＭＣ塩化物はこの溶媒中で可溶性である、ということを本発明人は観察している。これは、不溶性が一般的に過剰量のＯ−メチル化の、または硫酸塩印イオンの存在のためであるという従来技術とは異なる。
合成

ＴＭＣの調製方法が提供される。従来の報告で教示されたようなアルキル化剤および塩基を用いて、キトサンから直接ＴＭＣを生成することを本発明人は先ず試みたが、しかし低ＤＱを有するＴＭＣだけが得られた。例えば、水：ＤＭＦ混合物中で、ＤＱは約２９％であり、５９％ジメチル化単位および２％モノメチル化単位であった。種々の新規のアルキル化剤および塩基を用いたさらなる試みは、同様に不首尾に終わった。例えば、ジメチルスルフェートを用いるメチル化は、不溶性生成物を生じる。

本明細書中に記載される試験に従って、改良されたＴＭＣの調製方法を本発明人は意図し、開発した。

本発明による方法では、Ｎ，Ｎ−ジメチルキトサン（ＤＭＣ）は、本質的に、置換されるすべての窒素原子を有する（約２．０のＮ−置換度）。

先ず、本発明による方法は、Ｎ，Ｎ−ジメチルキトサンの調製を包含する。当該方法のこの第一パートは、以下の：
キトサンを提供すること；そして
蟻酸およびホルムアルデヒドを用いるエシュバイラー・クラーク反応によりキトサンをメチル化すること
を包含する。当該方法は、二重メチル化される窒素原子すべてを本質的に有する（すなわち、約２．０のＮ置換度）ＤＭＣの生成を可能にする。当該方法は、良好な収率および純度でのＤＭＣの生成も可能にする。

出発物質として用いられるキトサンは、約９５〜９６％のＤＤおよび１５０ｃｐｓの粘度を有し得る（１％酢酸水溶液）（これは低経費で入手可能である商業用等級キトサンに対応する）、ということは有益である。キトサンは、種々の分子量で利用可能であり、これは、相応して、種々の分子量のＤＭＣ（そして結局はＴＭＣ）を得るのを可能にする。本発明の実施形態では、キトサンは、約１００％、約９５％以上、約９０％以上、約８５％以上、約８０％以上、約７５％以上、約７０％以上、約６５％以上または約６０％以上、約５５％以上または約５０％以上のＤＤを有する。

エシュバイラー・クラーク反応は、水中で、低減量の反応体、特に蟻酸を用いて、実施され得る、というのが有益である。エシュバイラー・クラーク反応またはエシュバイラー・クラークメチル化は、それにより第一級（または第二級）アミンが過剰量の蟻酸およびホルムアルデヒドを用いてメチル化される化学反応である。この還元的アミノ化反応は、第四級アンモニウム塩を生じないが、しかし代わりに第三級アミン段階で停止する。

エシュバイラー・クラーク反応の機序を、以下に示す：

アミンの第一のメチル化は、ホルムアルデヒドを用いたイミン生成で開始する。蟻酸は、水素化物の供給源として作用し、イミンを第二級アミンに還元する。駆動力は、二酸化炭素ガスの生成である。第三級アミンの生成も同様である。この機序から、第三級アミンは別のイミンまたはイミニウムイオンを生成できないため、第四級アンモニウム塩が生成されないことは明らかである。

第二に、本発明による方法は、ＴＭＣの調製を包含する。当該方法のこの第二パートは、以下の：
二重メチル化される窒素すべてを本質的に有するＮ，Ｎ−ジメチルキトサン（すなわち２．０のＮ−置換度）を提供すること、そして
アルキル化剤および塩基を用いてＮ，Ｎ−ジメチルキトサンをメチル化すること
を包含する。

実施形態において、アルキル化剤はヨードメタンである。

実施形態において、メチル化ステップは、有機溶媒、例えばＤＭＦ中で実行される。

実施形態において、メチル化ステップは、ＤＭＦ：Ｈ_２Ｏ混合物中で、例えば５０：５０（ｖ／ｖ）混合物中で実行される。このような混合物では、水は約１５％以上のパーセンテージで存在し得る。

他の実施形態では、メチル化ステップは水中で実行される。

他の実施形態では、メチル化ステップは、水混和性有機溶媒と混合される水中で実行される。この水混和性有機溶媒の目的は、反応媒質中のヨードメタンの混和性を増大することである。溶媒の非限定例としては、メタノールおよびエタノールが挙げられる。それらは、反応媒質中に用いられる的確な反応体の溶解度によって、約０％〜約５０％の量で、ことによってはそれ以上の量で存在し得る。実施形態において、溶媒は水−メタノール混合物、例えば９０：１０（ｖ／ｖ）混合物である。

ＴＭＣを生成するためにキトサンをメチル化するための通常溶媒であるＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）の回避は、水酸化ナトリウムのような強塩基が用いられる場合に起こり得るテトラメチルアンモニウムの副生成を排除する。それが生成される場合、テトラメチルアンモニウムは、例えば限外濾過により、ＴＭＣの精製中に排除されるべきものである。

実施形態において、塩基は、アルカリ性炭酸塩または重炭酸塩、例えば重炭酸ナトリウムまたは炭酸ナトリウムである。この塩基の使用は、位置３および６でのアルコール基のメチル化を低減する。この塩基の使用の別の利点は、ＴＭＣ炭酸塩が水に不溶性であり、これは、水が有機溶媒と一緒に反応溶媒として用いられる場合、ＴＭＣの精製を容易にする（これはその場合、単純濾過により実行され得る）、という点である。

他の実施形態では、塩基は水酸化ナトリウムである。

一実施形態では、アルキル化剤はヨードメタンであり、メチル化ステップは水中で実行され、塩基は重炭酸ナトリウムである。この実施形態を、ＤＭＣの生成と一緒に以下のスキームに例示する。

これは、不純物を生じることを回避し、Ｏ−メチル化を低減するかまたは排除する。これは、経費を低減し、限外濾過の必要性を排除し得る。このように生成されるＴＭＣ炭酸塩は、ＨＣｌの簡単な付加によりＴＭＣ塩化物に転換され得る。それは、ＨＣｌを含有する胃の中でＴＭＣ塩化物におそらくは転換される。このようなＴＭＣ塩化物は、水に可溶性であり、優れた純度（以下の実施例を参照）、高ＤＱで得られたものであって、そして最後にＯ−アルキル化は観察されなかった。

実施形態において、ＮａＩまたはＮａＣｌのような塩は、アルキル化剤および塩基を用いてＮ，Ｎ−ジメチルキトサンをメチル化する場合に付加的に用いられる。実施形態において、この塩はＮａＩである。

ＴＭＣは、上記の方法を用いて１０ｇスケールで首尾よく合成されている。

ＴＭＣを製造する上記の方法は、以下のいくつかの利点を有する：
それは、反応の変化および用いられる反応体の量によりＤＱ（０％〜１００％）に関する良好な制御を提供し、
それはＴＭＣの分子量およびＤＤに関する良好な制御を提供し（反応中に有意に加水分解されないので、出発物質として用いられるキトサンの選択による）、
ＴＭＣは低Ｏ−ＤＳを有し（位置３および６での酸素原子におけるメチル化）、
ＴＭＣは、良好な収率で且つ良好な純度で提供される。

さらにまた、従来技術と比較して、メチル化ステップは、高ＤＱを得るために数回反復されなければならないというわけではない。反応が電子レンジ中で実施される場合、過剰量のヨードメタンが用いられるが、しかし再循環され、再使用され得る。

実施形態において、ＤＭＣおよびＴＭＣを製造するための本発明の方法は、いくつかの一般に安全と認められる（ＧＲＡＳ）反応体を用い、アルコールを除く有機溶媒を用いない。

本発明による方法は、ポリ−Ｌ−アルギニンならびにその他のアミノポリマーの第四級化のために用いられ得るということは、当業者には明らかである。
用途

概してＴＭＣは、特に本発明の化合物は、いくつかの用途を有する。それらは、粘膜を通した分子の吸収を増大するために用いられ得るが、これはワクチンおよびある種の薬剤の製造に有用であり得る。それらは、遺伝子およびタンパク質を含めた種々の物質の制御放出のためにも用いられ得る。
コレステロール低下薬

高コレステロール血症は、一般集団の４％より多くを（糖尿病に関する２％と比較）、そしていくつかの国では、４５〜５０年に亘って２０〜３０％の人々を冒している。高コレステロール血症は、心臓血管性疾患に関する主要危険因子であり、これは西欧社会における主要死因である（１９９７年の全死亡の３７％）。

高コレステロール血症に関する最前線処置は、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害薬（スタチン、例えばロバスタチン（メバコール、アルトプレブ）、プラバスタチン（プラバコール）、シムバスタチン（ゾコール）、フルバスタチン（レスコール）、アトルバスタチン（リピトール）、ロスバスタチン（クレストール）、ニバスタチン、メバスタチン、メビノリン、カルシウムアトルバスタチン＆ピタバスタチン）の投与である。しかしながら、スタチン単一療法における患者の２７〜６０％が低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）のそれらの目標レベルに達していない、と概算されている。さらに、スタチンは、筋障害のような副作用を有する。

その他の方法も、血中コレステロールレベルを低減するために用いられる。これらの例としては、コレステロール吸収阻害薬（エゼチミベ）および胆汁酸封鎖剤（ＢＡＳ）、例えばコレスチラミン（クエストラン）、コレスチポール（コレスチド）、セベラマーＨＣｌ（Ｒｅｎａｇｅｌ ｄｅ Ｇｅｎｚｙｍｅ Ｃｏｒｐ．）およびコバレサム（ウェルコール）（これらは合成樹脂である）の使用が挙げられる。ＢＡＳは、正荷電され、胆汁酸塩上の負電荷と強力に相互作用する。ＢＡＳは、収着または沈澱により胆汁酸塩を排除し、これが糞便中のそれらの排除を生じ、したがって小腸におけるそれらの吸収を防止する。必要量の胆汁酸塩を保持するために、肝臓はコレステロールを用いて胆汁酸を生成し、それによりコレステロールレベルを低減する。

処方箋なしで入手可能な天然ＢＡＳ：コレストール（商標）も存在する。それは４０ｋＤａのキトサンオリゴ糖である。コレストール（商標）は、全ｐＨで水不溶性である。

概してＴＭＣは、特に本発明の化合物は、コレステロール低下薬としても用いられ得る。確かに、以下の実施例で示されるように、本発明のＴＭＣは、胆汁酸封鎖剤である。四級化キトサン（正荷電）と胆汁酸塩（負荷電）との間の静電相互作用は、後者の封鎖を促進する。その高分子量のため、本発明の化合物は身体に吸収されない。したがって、胆汁酸と結合することにより、本発明の化合物はそれらの腸肝臓再吸収を防止し、糞便によるそれらの排除を引き起こす。これは、肝臓による胆汁酸の産生増大をもたらす。肝臓は、コレステロールを用いて胆汁酸を産生し、これが血漿コレステロールレベルの減少を生じる。

本発明の化合物は、したがって、高コレステロール血症、特に軽度〜中等度の高コレステロール血症の処置のために有用である。以下の実施例において、本発明の化合物はコレストール（商標）より良好な胆汁酸封鎖剤（グリココール酸ナトリウムおよびタウロコール酸ナトリウム）であり、コレスチラミンとほぼ同じく有効である、ということを試験が示している。本発明のＴＭＣの溶解度は小腸における胆汁酸の取込みに関して不溶性物質よりそれを利用可能にする、と考えられる。

このようなものとして、本発明の化合物は、現行処置の天然代替物として働く。したがって、それは、薬学的組成物、天然健康製品、栄養医薬製品または食品の一部であり得る。

本発明の化合物は、以下の実施例で示されるように、ＨＤＬ／非ＨＤＬコレステロール比を増大するためにも用いられ得る。

以下の実施例で報告される結果に、従来技術のＴＭＣに関する文献に、そしてＴＭＣが天然非毒性物質であるキトサンに由来するという事実に基づいて、ＴＭＣは有意の毒性を示さない、と予測される。実際、本発明の化合物は、コレスチラミンおよびコレストール（商標）とは違って、小腸ｐＨで親水性および水溶性である。したがって、ＴＭＣの親水性は、コレスチラミンおよびコレストール（商標）の投与に関連づけられ得る胃痛、便秘および／または下痢を低減する、と予測される。

本発明の化合物は、現存コレステロール低下薬、例えばＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害薬および／またはコレステロール吸収阻害薬と組合せても用いられ得る。
ポリクォーターニウムおよび皮膚軟化薬

「ポリクォーターニウム」は、個別看護産業で用いられるいくつかのポリカチオン性ポリマーに関する化粧品成分国際命名法（ＩＮＣＩ）の呼称である。ポリクォーターニウムは、ポリマー中の第四級アンモニウム中心の存在を強調するために用いられる新造語である。ＩＮＣＩは、ポリクォーターニウムという呼称の下で少なくとも３７の異なるポリマーを承認している。異なるポリマーは、「ポリクォーターニウム」という語の後の数値により区別される。

ポリクォーターニウム（ＰＱ）は、シャンプー、コンディショナー、ヘアフォーム、ヘアスプレー、毛染め剤およびヘアゲル、液体石鹸およびローション、手および身体用クリームならびにコンタクトレンズ溶液に用いられる。それらは正荷電されるため、それらはほとんどのシャンプーおよび毛髪タンパク質の負電荷を中和し、毛髪が平坦になるよう手助けする。それらの正電荷は、それらを毛髪および皮膚とイオン結合させる。抗菌特性を有するものもある。

市販のＰＱは、一般的に、張力活性剤とイオン錯体を形成する多数の第四級アミンを有する正荷電型水溶性ポリマーである（ＥＰ １２５０１１８ Ｂ１）。これらの物理化学的特性（錯体形成および粘性）は、身体看護製品を処方する場合に求められる。商業用ＰＱのデータＣとは、種々の分子量、第四級化度および疎水性を有する同一分子のいくつかの誘導体を示す（例えば、Ｄｏｗ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ＣｏｍｐａｎｙによるＳｏｆｔＣＡＴ（商標）製品を参照）。これにより、その必要性に対応する特定の誘導体を処方者は選択できる。

シャンプーの最新処方物は、毛髪を単に清浄にするよりはるかに多くのことを為すことを目指している。それらはしばしば、毛髪を状態調節し、毛髪表面を平滑にし、調髪を容易にし、そしてクリーミーな外観を有することも目指す。ＰＱは、これらの目標を達成するのに重要な役割を果たす。シャンプーは、目下、多機能性であり（２ ｉｎ １および３ ｉｎ １）、広範な種々の成分（ビタミン、シリコーン、タンパク質誘導体・・・）を混入する。

包含される多量の製品ならびに環境的および消費者の健康問題を考えると、美容医薬産業は、より自然の且つ生分解性の製品に向かいつつある。しかしながら、一般的ＰＱは、合成起源のものであり、または合成部分が占める割合が大きい。

ＰＱは、細胞膜およびタンパク質のような負荷電表面と結合するため、化粧品に用いられる。さらに、それらの高分子性のため、ＰＱは（約０．５％の比率で）、製品、特に皮膚用クリームの粘度を増大する。１１のＰＱの毒性の研究は、毒性用量（ＥＣ_５０）がそれらのうちの１０に関しては＜０．１〜１０ｍｇ／Ｌである（但し、ポリクォーターニウム−１０は低電荷密度を有する）、ということを示した（Ｃｕｍｍｉｎｇ Ｊ．Ｌ．， Ｈａｗｋｅｒ Ｄ．Ｗ．， Ｎｕｇｅｎｔ Ｋ．Ｗ．， Ｃｈａｐｍａｎ Ｈ．Ｆ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｐａｒｔ Ａ， ２００８， ４３， １１３）。

陽イオン性ポリマー、例えばＰＱは、界面活性剤と複合体を形成し（コアセルベーション）、したがって毛髪上でのこの複合体の沈着のためコンディショナーとして、ならびに毛髪または皮膚のための水性化粧品組成物のための構造化剤として作用する。イオン性界面活性剤のモル比がポリクォーターニウム（ＰＱ）の正電荷のモル比と等しい場合、溶液の粘土は有意に低減され、二次相を形成する（Ｇｒｕｂｅｒ Ｊ．Ｖ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｓｍｅｔｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２００９， ６０， ３８５）。ＰＱの溶液の粘度および濁度は、界面活性剤の構造およびモル比により影響を及ぼされる。

ポリクォーターニウム−１０は、第四級アミンを保有するポリエチレングリコールがグラフトされたセルロースの主鎖からなる。それは、コンタクトレンズ用の溶液中の抗菌剤として用いられる。

概してＴＭＣは、特に本発明のＴＭＣの化合物は、個別看護用製品、特に毛髪および皮膚用製品、例えばシャンプー、コンディショナー、ヘアフォーム、ヘアスプレー、毛染め剤、ヘアゲル、液体石鹸およびローション、手および／または身体用クリーム等におけるポリクォーターニウム（ＰＱ）および／または軟化剤として用いられ得る。

本発明の化合物は、商業用ＰＱのものと類似する第四級アミンを伴う構造を有する。それらと同様に、それは天然および合成界面活性剤（例えば、胆汁酸塩およびドデシル硫酸ナトリウム）とイオン性複合体を形成し、したがって類似の特性を有する。さらに、本発明の化合物の四級化度（ＤＱ）および分子量は、商業用ＰＱに関する場合と同様に制御され、したがって最終生成物の所望の特質によって、その特性の最適化を可能にする。したがって、本発明の化合物は、商業用ＰＱに取って替わり得る。

本発明の化合物は、（ａ）非毒性であることが既知のキトサンの誘導体であり、そして（ｂ）本明細書中で記載されるｉｎ ｖｉｖｏ試験中に如何なる毒性も示さない。したがって、本発明の化合物は、皮膚および／または頭皮と接触することになる処方物中で許容可能である。
抗菌または静菌剤

本発明のＴＭＣは、種々の製品中で、例えば個別看護用品、化粧品、医薬品または美容医薬品（これらに限定されない）中で、ならびに創傷処置のための製品中で、抗菌または静菌剤としても用いられ得る。

クリームおよびゲルの処方物は、典型的には、例えば化粧品および皮膚科学的製品、例えば創傷の治癒を促すことを予定された製品中で抗菌剤としての合成パラベンの付加を要する。これは、一定期間の間に（単一容器から）繰り返し使用するためである製品について特に言えることである。本発明の化合物は、このような製品中の天然静菌剤（抗菌剤）として用いられ得る。

さらに、環境的調節がより限定的になる場合、当該産業は環境に及ぼす影響が少ない抗菌防腐剤を用いなければならない。本発明の化合物は、その状況において非常に有益である。

さらに、本発明の化合物は、親水性生体ポリマーであって、軟化剤として作用するが、これは多くの製品において望ましい特性である。特に、これは、処置創傷湿性を保持させ、したがって治癒過程を促進させる。

慢性創傷におけるマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）超過は、細胞外マトリックスタンパク質の分解ならびに組織再構築に関連した成長因子の不活性化を生じる。非四級化アミン基の一定の制御化比率で、本発明の化合物は、別の状況では配位による治癒進行を中断するＭＭＰの活性を調節する。

したがって、本発明の化合物は、種々の製品における、特に慢性創傷の処置のための製品における抗菌剤（または静菌剤）としてそれを非常に魅力のあるものにする三重作用を有する。

本発明のその他の目的、利点および特徴は、添付の図面を参照しながら、例としてではあるが、その特定の実施形態についての以下の非限定的説明を読めば、さらに明らかになる。
例証的実施形態の説明

本発明を、以下の非限定例によりさらに詳細に例証する。
実施例１−ＴＭＣの合成および特性化

本実施例では、エシュバイラー・クラーク法を用いてＮ，Ｎ−ジメチルキトサン（ＤＭＣ）を調製する方法を記載する。これは、蟻酸およびホルムアルデヒドを用いるメチル化反応である。以下で示すように、このメチル化手法は、イミン基のin situ還元によりアミン基を専らメチル化するという利点を保有する。エシュバイラー・クラーク法は、従来技術のヨードメタンの第一および第二供与体への取替えを可能にする。

その場合、ＤＭＣは、ＤＭＦ／水混合物中でヨードメタンおよび重炭酸ナトリウムを用いて、０．４６のＤＱを有するＴＭＣに選択的にＮ−メチル化されている。実施例２に示すように、このＴＭＣは、最も広範に用いられる胆汁酸封鎖剤であるコレスチラミンに匹敵する胆汁酸塩の収着効率を示す。
実験の節

概説．９５．９％の脱アセチル化度および１５７ｃｐｓの粘度（１％酢酸水溶液）を有するホッコクアカエビ（Ｐａｎｄａｌｕｓ ｂｏｒｅａｌｉｓ）外殻からの高分子量キトサンを、Ｍａｒｉｎａｒｄ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ． （Ｇａｓｐｅ， Ｃａｎａｄａ）から購入した。キトサンを、利用前に機械的に０．６ｍｍに粉砕した。ナノピュア・ダイヤモンド・システム（モデルＤ１１９３１、Ｂａｒｎｅｓｔｅａｄ）で水を脱イオン化した。グリココール酸ナトリウム（ＮａＧＣ）、タウロコール酸ナトリウム（ＮａＴＣ）、コレスチラミン、一塩基性リン酸カリウム無水物（分析等級）、塩化ナトリウム（ＳｉｇｍａＵｌｔｒａ等級）および４−ヒドロキシベンゼンスルホン酸ナトリウムを、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手した。Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから購入した撹拌セル中で３０，０００ＮＭＷＬのカットオフを有する再生セルロース濾過膜（Ａｍｉｃｏｎ ＹＭ）で、限外濾過を実現した。ＩＲおよびＮＭＲスペクトルを、それぞれＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒモデル１６００シリーズＩＲ分光計（ＫＢｒ法）およびＢｒｕｋｅｒ ７００ＭＨｚ ＮＭＲ分光計から記録した。キトサン誘導体のＨｅｒｔｚ．元素分析をＣｏｓｔｅｃｈ４１０元素分析器で実施して結合定数を得て、置換度を決定した。Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＨＰＬＣシステム（モデル１０Ａ ＤＶＰ）で、キトサン誘導体結合能力を調べた。

実施例１ａ−Ｎ，Ｎ−ジメチルキトサン（ＤＭＣ）の調製．２５０ｍＬ丸底フラスコ中で、８８％蟻酸（１００ｍＬ）中のキトサン（２．０１ｇ、１２．５ｍｍｏｌのグルコピラノシル単位）の溶液を調製した。粘性黄色溶液を３７％ホルムアルデヒド溶液（１６．６ｍＬ、０．１６６ｍｏｌ）で処理し、２３時間の間９０℃で加熱した。注：加熱速度によって、二酸化炭素が勢いよく放出されるのが観察され得る。その結果生じた溶液を、減圧下で蒸発乾燥させた。固体を水（１００ｍＬ）中に溶解し、５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を付加してこの溶液のｐＨを８〜９に調整した。沈殿物を濾過し、水（５０ｍＬ）、エタノール（５０ｍＬ）およびジエチルエーテル（５０ｍＬ）で洗浄した。固体を最終的に一晩真空乾燥した。オフホワイト色固体を収率７３％（１．７１ｇ）で得た。ＩＲ（ｃｍ−１） ３４４９ （ＯＨ）， ２９２７および２８８１ （ＣＨ）， １６５８， １４８１， １０００− １２００ （Ｃ−Ｏ）， ８５１．ＨＣｌでプロトン化されたＤＭＣのＤ２Ｏ中の１Ｈ ＮＭＲ：δ５．０６ （ｄ， １Ｈ， １Ｊ１，２＝６．５， Ｈ１）， ４．２０ （ｔ， １Ｈ， Ｊ＝８．７， Ｈ３）， ４．０８ （ｔ， １Ｈ， Ｊ＝〜７， Ｈ４）， ３．９２ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝１０．４， Ｈ６）， ３．８０ （広， １Ｈ， Ｈ５）， ３．７３ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝８．６， Ｈ６），（ｔ， Ｊ＝〜７， Ｈ２）， ３．０３ （ｓ， ６Ｈ， ＣＨ３） ｐｐｍ． ＨＣｌでプロトン化されたＤＭＣのＤ２Ｏ中の１３Ｃ ＮＭＲ：δ９５．０５ （Ｃ１）， ７５．５０ （Ｃ４）， ７４．５３ （Ｃ５）， ６８．１６ （Ｃ３）， ６７．３１ （Ｃ６）， ６０．３５ （Ｃ２）， ４１．８８ （ＣＨ３） ｐｐｍ。

実施例１ｂ−プロトン化形態で４６％のＤＱを有するＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルキトサン（ＴＭＣ）ヨウ化物の調製．１００ｍＬのＤＭＦ／水（９０／１０ｖ／ｖ）中のＤＭＣ（０．４００ｇ、２．１１ｍｍｏｌのグルコピラノシル単位）、重炭酸ナトリウム（０．５３２ｇ、６．３３ｍｍｏｌ）およびヨウ化ナトリウム（０．８２５ｇ、５．５０ｍｍｏｌ）の懸濁液を、ヨードメタン（０．８０ｍＬ、１２．８ｍｍｏｌ）で処理し、７５℃Ｃで８時間加熱した。２、４および６時間後に、ヨードメタン（０．８０ｍＬ、１２．８ｍｍｏｌ）および重炭酸ナトリウム（０．５３２ｇ、６．３３ｍｍｏｌ）の連続付加を実施した。溶液を蒸発させて、その結果生じた固体を水（７５ｍＬ）中に溶解した。溶液を限外濾過して容積を１０ｍＬとして、水（６５ｍＬ）で２回洗浄した。高分子溶液を蒸発により濃縮（２〜３ｍＬ）した後、アセトン（４０ｍＬ）およびジエチルエーテル（２５ｍＬ）混合物で沈澱させた。固体を濾過し、ジエチルエーテル（５０ｍＬ）で洗浄して、真空下で一晩乾燥した。オフホワイト色固体を収率１００％で得た（０．４４２ｇ）。ＩＲ（ｃｍ^−１） ３３８５ （ＯＨ）， ２９３６および２８７９ （ＣＨ）， １６５４， １４７３， ９００−１２００ （Ｃ−Ｏ）． Ｄ２Ｏ中の１Ｈ ＮＭＲ：δ５．０−５．７ （Ｃ１）， ３．６−４．６ （グルコピラノシル水素）， ３．３ （ＣＨ_３）， ３．０４ （ＣＨ_３）， ２．０５ （アセチル） ｐｐｍ。

実施例１ｃ−Ｎ，Ｎ−ジメチルキトサン（ＤＭキトサン）の合成． キトサン（１２ｇ、脱アセチル化度 ９０％）を、２８ｍＬの蟻酸（８８％）を含有する水溶液 ６００ｍＬ中に溶解した。ホルムアルデヒド（２１ｍＬ、３７％）を反応混合物に付加し、次いで溶液を７０℃で１２時間、加熱マントルで加熱した。溶液を室温に冷まさせて、撹拌溶液を約３００ｍＬの水酸化ナトリウム（５Ｎ）で処理して、ｐＨを１１〜１２とした。その結果生じた懸濁液を濾過し、濾液のｐＨが７になるまで蒸留水で洗浄した。固体をエタノール（２５ｍＬ）で、その後、エチルエーテル（２５ｍＬ）で洗浄した。白色固体を風乾した。Ｎ，Ｎ−ジメチルキトサンのＮ−ＤＳは、２．０である。

実施例１ｄ − 電子レンジを用いたＤＭＣの合成． キトサン０．１９ｇ、脱アセチル化度 ９０％）を、９．２ｍＬの水および０．４５ｍＬの蟻酸（８８％）中に溶解した。ホルムアルデヒド（０．３４ｍＬ、３７％）を反応混合物に付加した。ＭａｒｓＸｐｒｅｓｓ（商標）密閉容器（ＣＥＭ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いるＭａｒｓマイクロ波システム中で、溶液を５分間１３０℃に加熱して、４８０Ｗの最大電力で１０分間、温度を１３０℃に保持した。次に溶液を室温に冷まさせた。水酸化ナトリウム（５Ｎ）を付加して、ｐＨを７〜１２に調整した。その結果生じた懸濁液を濾過し、水で洗浄した。固体を、エタノールで、その後エチルエーテルで洗浄した。白色固体を風乾した。収率９５％。Ｎ，Ｎ−ジメチルキトサンのＮ−ＤＳは、２．０である。

実施例１ｅ−電子レンジを用いたＴＭＣの合成（ＤＭカルボネート）． ７ｍＬのメタノール／水混合物（１：９）中に０．３０ｇのＮ，Ｎ−ジメチルキトサン、０．５９ｇの炭酸ナトリウムおよび３．０ｍＬのジメチルカルボネートを含有する懸濁液を調製した。ＭａｒｓＸｐｒｅｓｓ（商標）密閉容器（ＣＥＭ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いるＭａｒｓマイクロ波システム中で、懸濁液を５分間１４０℃に加熱して、１６００Ｗの最大電力で１０分間、温度を１４０℃に保持した。次に溶液を室温に冷まさせた。必要な場合、炭酸ナトリウムを付加して、ｐＨを７〜１２に調整した。固体を水で洗浄した。白色固体を風乾した。ＩＲスペクトルは、１４８０ｃｍ−１で強い帯域を示す。

実施例１ｆ − 電子レンジを用いたＴＭＣの合成（ヨードメタン）． ７ｍＬのメタノール／水混合物（１：９）中に０．３０ｇのＮ，Ｎ−ジメチルキトサン、０．９０ｇの炭酸ナトリウムおよびアルキル化剤（３．０ｍＬのヨードメタン）を含有する懸濁液を調製した。ＭａｒｓＸｐｒｅｓｓ（商標）密閉容器（ＣＥＭ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いるＭａｒｓマイクロ波システム中で、懸濁液を５分間７５℃に加熱して、１６００Ｗの最大電力で１５分間、温度を７５℃に保持した。次に溶液を室温に冷まさせた。炭酸ナトリウムを付加して、ｐＨを７〜１２に調整した。固体を濾過し、水で洗浄した。白色固体を風乾した。マイクロ波法を用いた場合、定量的収率、反復単位のＤＱ＝８３％、ＴＭＣの分子量は高い。アルキル化剤としてジクロロメタンを用いたＮ，Ｎ−ジメチルキトサンのアルキル化は、異なるアルキルハリドが用いられ得ることを実証する。

実施例１ｇ−電子レンジを用いたＴＭＣの合成（ＤＭカルボネート）． ０．３０ｇのＮ，Ｎ−ジメチルキトサンおよび３．０ｍＬのジメチルカルボネートを含有する懸濁液を調製した。ＭａｒｓＸｐｒｅｓｓ（商標）密閉容器（ＣＥＭ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いるＭａｒｓマイクロ波システム中で、懸濁液を５分間１４０℃に加熱して、１６００Ｗの最大電力で１０分間、温度を１４０℃に保持した。次に溶液を室温に冷まさせた。必要な場合、炭酸ナトリウムを付加して、ｐＨを７〜１２に調整した。固体を水で洗浄した。白色固体を風乾した。定量的収率、ＩＲスペクトルは、１４８０ｃｍ−１で強い帯域を示す。

実施例１ｈ−圧力容器を用いるＴＭＣの合成． ０．３０ｇのＮ，Ｎ−ジメチルキトサン、０．５９ｇのＮａＣＯ３、０．７２ｇのＮａＩ、３．０ｍＬのジメチルカルボネート、３０ｍＬの水／メタノール混合物（９：１）を含有する懸濁液を圧力容器中で調製した。磁気棒を容器中に加えた後、容器を閉じた。１００ＰＳＩの窒素圧を容器に加えた。懸濁液を含有する圧力容器を、撹拌しながら１６時間１５０℃Ｃに加熱した。次に溶液を室温に冷まさせた。その結果生じた懸濁液を濾過し、固体を水で洗浄した。固体を、エタノール（２５ｍＬ）で、その後エチルエーテル（２５ｍＬ）で洗浄した。固体を風乾した。ＩＲスペクトルは、１４８０ｃｍ−１で帯域を示す。

実施例１ｉ−粘度測定．スピンドルＬＶ１〜ＬＶ３を１２ｒｐｍで用いて、ブルックフィールド粘度計モデルＤＶ−ＩＩ＋Ｐｒｏで粘度を測定した。２５℃で水中での０．５０％（ｗ／ｖ）ＴＭＣ塩化物の粘度は、４．３７ｃＰであり、０．１％のドデシル硫酸ナトリウムを付加すると、粘度は６．８７ｃＰであった。ＴＭＣ水溶液にドデシル硫酸ナトリウムを付加すると、ハンドローションの質感を有する白色不透明懸濁液が生じた。

実施例１ｉ − 電子レンジを用いたＮ，Ｎ−ジプロピルキトサンの合成． キトサン（０．１９ｇ、脱アセチル化度 ９０％）を、９．２ｍＬの水および０．４５ｍＬの蟻酸（８８％）中に溶解した。０．３０ｍＬのプロパナール（プロピオンアルデヒド）を反応混合物に付加した。ＭａｒｓＸｐｒｅｓｓ（商標）密閉容器（ＣＥＭ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いるＭａｒｓマイクロ波システム中で、溶液を５分間１３０℃に加熱して、１６００Ｗの最大電力で１５分間、温度を１３０℃に保持した。次に溶液を室温に冷まさせた。水酸化ナトリウム（５Ｎ）を付加して、ｐＨを７〜１２に調整した。その結果生じた懸濁液を濾過し、水で洗浄した。固体を、エタノールで、その後エチルエーテルで洗浄した。白色固体を風乾した。
結果
合成および特性化

Ｎ，Ｎ−ジメチルキトサン（ＤＭＣ）． ヨードメタンおよび塩基によるキトサンの従来技術のアルキル化は、非置換、モノ−、ジ−およびトリ−メチルアミンの混合物を生成する。エシュバイラー・クラーク法は、キトサンが可溶性で、アルコール基をアルキル化しない水性酸性媒質中で実行され得る、ということが示されている。しかしながら、エシュバイラー・クラーク反応は、第三級アミンで停止する。ＴＭＣが所望される場合、別のアルキル化反応が実行されなければならない。

蟻酸溶液中でのホルムアルデヒドとの反応により、ＤＭＣを迅速に、良好な収率およびＮ−置換度（Ｎ−ＤＳ）で得た。

６つのプロトンの積分に対応する３．１ｐｐｍでの一重項は、４１．８８ｐｐｍでのピークにより^１３Ｃ ＮＭＲにおいても確証される２．０という優れたＤＳを有するメチル基の存在を示す。ＤＭＣのピラノシル領域（３．３〜５．３ｐｐｍ）では、図１に示されているように^１Ｈ ＮＭＲにおいて７つのピークが観察される。積分から、これらのピークの各々は、一水素原子に対応する。これらの観察は、ＮＨ（ＣＨ_３）_２＋および６−ヒドロキシル基間の水素結合により説明され得るＣ−６位置での２つの水素原子に関する異なる化学的環境により説明され得る。ＤＭＣのＩＲスペクトル（図２）は、キトサンと比較した場合の３３００ｃｍ^−１での狭いヒドロキシル帯域ならびにそれぞれ不斉Ｃ−Ｈ伸縮および不斉ＣＨ_３変形に起因する２８０１および１４８１ｃｍ^−１での帯域の存在を示す。ＤＭＣは、酸性水溶液中で可溶性であり、そしてそれはＤＭＳＯ、エタノールおよび水中で不溶性である。
弱塩基：重炭酸ナトリウムを用いる第四級化の反応

キトサンのＮ−ジアルキル化は、窒素原子の求核性を増大し、低刺激性反応条件で達成され得る包括的Ｎ−メチル化を助長する。ＤＭＣの選択的Ｎ−メチル化は、重炭酸ナトリウム、炭酸ナトリウムのような弱塩基を用いて、または多量の水（すなわち５０％）を含有する溶媒混合物中の水酸化ナトリウムで実施され得る。第四級化の反応中の強塩基の利用は、ヒドロキシル基の部分的脱プロトン化のため、Ｏ−メチル化を容易にする。

重炭酸ナトリウムを用いて合成されるプロトン化ＴＭＣのプロトンＮＭＲは、ＴＭＣおよびＤＭＣのメチル基にそれぞれ起因する３．３および３．０ｐｐｍでの２つのメチルピークを明示する。０．４６というＤＱを、８時間後に得た（９５％ＤＤ）。３．３ｐｐｍでのメチルピークおよびピラノシル水素原子の積分比から、ＤＱを決定した。ＴＭＣのＩＲスペクトル（図２）は、高Ｎ−メチル化キトサン塩およびＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム塩に特徴的である不斉ＣＨ_３変形に対応する１４８０ｃｍ^−１で強帯域を示す。その点に関しては、以下を参照：Ｋｉｍ Ｃ．Ｈ．， Ｃｈｏｉ Ｊ．Ｗ．， Ｃｈｕｎ Ｈ．Ｊ．， Ｃｈｏｉ Ｋ．Ｓ．， Ｐｏｌｙｍ． Ｂｕｌｌ．， １９９７， ３８， ３８７； Ｂｒｉｔｔｏ Ｄ．， Ｆｏｒａｔｏ Ｌ．Ａ．， Ａｓｓｉｓ Ｏ．Ｂ．Ｇ．， Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ． Ｐｏｌｙｍ．， ２００８， ７４， ８６−９１； Ｂｒｉｔｔｏ Ｄ．， Ａｓｓｉｓ Ｂ．Ｇ．Ｏ．， Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ． Ｐｏｌｙｍ．， ２００７， ６９， ３０５； Ｂｒｉｔｔｏ Ｄ．， Ａｓｓｉｓ Ｂ．Ｇ．Ｏ．， Ｉｎｔｌ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｍａｃｒｏｍｏｌ．， ２００７， ４１， １９８； ａｎｄ Ｂｒｉｔｔｏ Ｄ．， Ｃａｍｐａｎａ−Ｆｉｌｈｏ Ｓ．Ｐ．， Ｐｏｌｙｍ． Ｄｅｇｒａｄ． Ｓｔａｂ．， ２００４， ８４， ３５３。

ＴＭＣヨウ化物（ＤＱ：４６％）は水に可溶性であり、メタノール、エタノール、アセトンおよびジエチルエーテルに不溶性である。
強塩基：水酸化ナトリウムを用いる第四級化の反応

反応中のアミン基のプロトン化を回避するために、重炭酸ナトリウムを、強塩基である水酸化ナトリウムに取り替えた。ＤＭＦ／水混合物中でのこの塩基の使用は、より完全なＮ−アルキル化に達するために用いられ得る。しかしながら、この塩基はＯ−メチル化反応を容易にするが、しかし５０％の水を含有する溶媒混合物の利用はこの望ましくない反応を防止した（その点に関しては、Ｐｏｌｎｏｋ Ａ．， Ｂｏｒｃｈａｒｄ， Ｖｅｒｈｏｅｆ Ｊ．Ｃ．， Ｓａｒｉｓｕｔａ Ｎ．， Ｊｕｎｇｉｎｇｅｒ Ｈ．Ｅ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｉｏｐｈａｒｍ．， ２００４， ５７， ７７−８３を参照）。

しかしながら、ジメチルアミンのアルキル化のために副産物として生成されるヨウ化テトラメチルアンモニウムは、アルカリ性媒質中でのＤＭＦ分解から生じる。ヨウ化テトラメチルアンモニウムは、３０１２、１４８３、１４０３、１３９６および９４４ｃｍ^−１で強ＩＲ帯域を示すが、限外濾過により排除された。

水酸化ナトリウム水溶液の存在下で合成されるＴＭＣのＩＲスペクトルは、より高いＤＱを示す重炭酸ナトリウムを用いる反応と比較して、１４８３ｃｍ^−１でより強い帯域を示す。

弱ＩＲ帯域は、キトサンに関してＮＨ変形と重ね合わされる１６５８ｃｍ−１で観察された；それは、Ｎ−アセチルグルコピラノシル単位のカルボニル伸縮に起因する。
結論

エシュバイラー・クラーク法を用いてＤＭＣを得た。エシュバイラー・クラーク法は、良好な収率で簡単なステップでのキトサンのＮ，Ｎ−ジメチル化の生成を可能にする。ＤＭＣのＮＭＲスペクトルは、グルコピラノシル水素原子と磁気的非等価のＣ−６位置での水素原子との間の結合定数を示す。ＤＭＣはＴＭＣ合成のための有用な試薬である、ということを我々は実証した。弱塩基の存在下での選択的Ｎ−アルキル化は、ジメチルアミン基の４６％の第四級化を可能にした。４６％までのＤＱを有する水溶性ＴＭＣは、ＤＭＦ／水混合物中のヨードメタンを用いた選択的Ｎ−メチル化により確かに合成された。
実施例２− 胆汁酸とのｉｎ ｖｉｔｒｏ結合

実施例１のＴＭＣを用いた。
実験の節

用いた試薬は、上記の実施例１におけるものと同一である。

胆汁酸塩の結合． ２５ｍＬのエルレンマイヤーフラスコ中で、０．２μｍフィルター上で濾過された１５ｍＭの塩化ナトリウム水溶液および基質（１０ｍｇ）を含有する混合物を、３７℃で４０分間インキュベートした。ＮａＧＣ（１００ｍＭ）またはＮａＴＣ（１００ｍＭ）の水溶液を、次に付加し、１０ｍＬの混合物を回転式振盪器（Ｔｈｅｒｍｏｆｏｒｍａ， モデル４２０）上で、３７℃で１時間、１７０ｒｐｍで撹拌した。１ｍＬのアリコートを０．２μｍフィルターを通して濾過し、溶液内容物をＨＰＬＣにより分析した。

胆汁酸塩のＨＰＬＣ定量． Ａｇｉｌｅｎｔ Ｃ−１８ Ｓｏｒｂａｘ ＯＳＤカラム（４．６×２５０ｍｍ、５μｍ）を、ＨＰＬＣによる胆汁酸塩の低量のために用いた。移動相は、２５℃の温度で、０．７ｍＬ／分の流量での、０．２μｍフィルター上で濾過された０．０４Ｍリン酸水素カリウム水溶液とアセトニトリルの混合物（６２／３８ｖ／ｖ）であった。ＵＶ可視検出の波長を、２００ｎｍに設定した。４−ヒドロキシベンゼンスルホン酸ナトリウムを、内部標準として用いた。注入用積は２０μＬであった。
結果

キトサン誘導体を付加してＨＰＬＣにおける濃度の変動により、胆汁酸と修飾キトサンの結合を確定した。結合実験条件は、他のキトサン誘導体に関して報告された方法から適合される。その点に関しては、Ｊ．Ｋ．， Ｋｉｍ Ｓ．Ｕ．， Ｋｉｍ Ｊ．Ｈ．， Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １９９９， ６３， ８３３ ａｎｄ Ｌｅｅ Ｊ．Ｋ．， Ｋｉｍ Ｓ．Ｙ．， Ｋｉｍ Ｓ．Ｕ．， Ｋｉｍ Ｊ．Ｈ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ２００２， ３５， １８１を参照。キトサンのＮ，Ｎ−ジメチル化は、親キトサンと比較して、結合胆汁酸塩の量をわずかに増大する。

コレスチラミン収着は、急速に飽和する（例えば、１０分以内）。Ｌｅｅ Ｊ．Ｋ．， Ｋｉｍ Ｓ．Ｕ．， Ｋｉｍ Ｊ．Ｈ．， Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １９９９， ６３， ８３３ ａｎｄ Ｌｅｅ Ｊ．Ｋ．， Ｋｉｍ Ｓ．Ｙ．， Ｋｉｍ Ｓ．Ｕ．， Ｋｉｍ Ｊ．Ｈ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ２００２， ３５，１８１参照。

ＴＭＣヨウ化物の場合、ＮａＧＣおよびＴＭＣ水溶液を一緒に混合するとほぼ即時に、白色沈澱が現われる。図３は、ＴＭＣの収着等温線を示す。収着は９ｍｍｏｌで飽和し、最大２．８９ｍｍｏｌのコール酸塩を結合したが、それに比して、コレストールおよびコレスチラミン収着はそれぞれ１．４１ｍｍｏｌおよび３．１６ｍｍｏｌで飽和する（表１）。４６％のＤＱを有するプロトン化ＴＭＣ１ｍｇ当たりの結合ＮａＧＣの量は、グルコピラノシル単位当たり０．９１分子のＮａＧＣに対応する。

以下の実施例３におけるＴＭＣ＃１１５参照
結論

ＴＭＣは、静電相互作用および水中のその溶解性のため、迅速且つ有効な胆汁酸封鎖剤であることが判明した。実際、ＴＭＣヨウ化物は、プロトン化合成樹脂であるコレスチラミンと同様の効力でＮａＧＣを結合する。
実施例３−より高いＤＱを有するＴＭＣの合成

実施例１は、特に、優れた収率でＮ，Ｎ−ジメチルキトサン（ＤＭＣ）を合成するための便利で且つ効率的手法を報告している。この手法は、蟻酸／水混合物中でのエシュバイラー・クラーク反応を用いたキトサンのＮ−アルキル化を包含する。

本実施例は、種々の条件におけるこのＤＭＣの選択的且つ有効な第四級化を記載する。
７５％のＤＱを有するＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルキトサン（ＴＭＣ）ヨウ化物の調製（１４０）

１００ｍＬの水／メタノール（９０／１０ ｖ／ｖ）中のＤＭＣ（０．６００ｇ、３．１７ｍｍｏｌのグルコピラノシル単位）およびヨウ化ナトリウム（１．２３ｇ、８．２０ｍｍｏｌ）の懸濁液を、ヨードメタン（１．２０ｍＬ、１９．３ｍｍｏｌ）および水酸化ナトリウム溶液（０．３８８ｇ、９．７ｍｍｏｌ）で処理して、５５〜６０℃で２４時間、７０〜７５℃で４８時間、加熱した。ヨードメタン（１．２０ｍＬ、１９．３ｍｍｏｌ）の連続付加を、２、４、６、２２、２４、２６および２８時間後に実行した。溶液を限外濾過して容積を１０ｍＬとして、水（９０ｍＬ）で２回洗浄した。蒸発により高分子溶液を濃縮（２〜３ｍＬ）後、アセトン（４０ｍＬ）およびジエチルエーテル（２５ｍＬ）混合物で沈澱させた。固体を濾過し、ジエチルエーテル（５０ｍＬ）で洗浄して、真空下で一晩乾燥した。オフホワイト色固体を得た（０．４４２ｇ）。ＩＲ（ｃｍ^−１）３３８５ （ＯＨ）， ２９３６ および２８７９ （ＣＨ）， １６５４， １４７３， ９００−１２００ （Ｃ−Ｏ）。Ｄ_２Ｏ中での^１Ｈ ＮＭＲ：δ５．０−５．７ （Ｃ１）， ３．６−４．６ （グルコピラノシル水素）， ３．３ （ＣＨ_３）， ３．０４ （ＣＨ_３）， ２．０５ （アセチル） ｐｐｍ。
９５％のＤＱを有するＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルキトサン（ＴＭＣ）ヨウ化物の調製（１４６）

１００ｍＬの水／メタノール（９０／１０ ｖ／ｖ）中のＤＭＣ（０．６００ｇ、３．１７ｍｍｏｌのグルコピラノシル単位）およびヨウ化ナトリウム（１．２３ｇ、８．２０ｍｍｏｌ）の懸濁液を、ヨードメタン（１．２０ｍＬ、１９．３ｍｍｏｌ）および炭酸ナトリウム（１．０１ｇ、９．５１ｍｍｏｌ）で処理して、７０℃で４６時間加熱した。ヨードメタン（１．２０ｍＬ、１９．３ｍｍｏｌ）の連続付加を、２、４、６、２２、２４、２６および２８時間後に実行した。懸濁液を濾過して、固体を水（５０ｍＬ）で洗浄し、水（９０ｍＬ）中に懸濁し、限外濾過（３×７５ｍＬ）して、３０分間、ＨＣｌ（１Ｍ）で酸性にして、ＮａＯＨ（１０Ｍ）でｐＨを８〜９とし、蒸発により濃縮して、最簿にエタノール（７５ｍＬ）で沈澱させた。固体を濾過し、ジエチルエーテル（５０ｍＬ）で洗浄して、真空下で一晩乾燥した。明黄色固体を得た（０．４４２ｇ）。ＩＲ（ｃｍ^−１）３３８５ （ＯＨ）， ２９３６および２８７９ （ＣＨ）， １６５４， １４７３， ９００−１２００ （Ｃ−Ｏ）。Ｄ２Ｏ中での^１Ｈ ＮＭＲ：δ５．０−５．７ （Ｃ１）， ３．６−４．６ （グルコピラノシル水素）， ３．３ （ＣＨ_３）， ３．０４ （ＣＨ_３）， ２．０５ （アセチル） ｐｐｍ。
９０％のＤＱを有するＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルキトサン（ＴＭＣ）ヨウ化物の調製（１４９ａ〜ｆ）

７０Ｌの水／メタノール（９０／１０ ｖ／ｖ）中のＤＭＣ（１０．０ｇ、５２．９ｍｍｏｌのグルコピラノシル単位）およびヨウ化ナトリウム（２０．５ｇ、１３６．５ｍｍｏｌ）の懸濁液を、ヨードメタン（１９．８ｍＬ、３１７ｍｍｏｌ）および炭酸ナトリウム（１６．８ｇ、１５９ｍｍｏｌ）で処理して、５５℃で４６時間加熱した。ヨードメタン（１９．８ｍＬ、３１７ｍｍｏｌ）の連続付加を、２、４、６、２２、２４、２６および２８時間後に実行し、２当量の炭酸ナトリウムを６時間後に、そして１当量を２８時間後に徐々に付加した。懸濁液を濾過して、固体を水（２００ｍＬ）で洗浄した。固体を１．７ＬのＨＣｌ（０．５Ｍ）に注ぎ入れて、１．４Ｌの水を付加し、１５分間、７０〜８０℃に加熱した。ゲルが得られるまで、溶液を蒸発により濃縮した。ゲルをエタノール（１．５Ｌ）で沈澱させて、固体を濾過し、エタノールで洗浄した。固体をジエチルエーテル（１Ｌ）中で撹拌し、濾過して、真空下で一晩乾燥した。明黄色固体を収率９０％（１０．８ｇ）で得た。ＩＲ（ｃｍ^−１）３３８５ （ＯＨ）， ２９３６および２８７９ （ＣＨ）， １６５４， １４７３， ９００−１２００ （Ｃ−Ｏ）。Ｄ２Ｏ中での^１Ｈ ＮＭＲ：δ５．０−５．７ （Ｃ１）， ３．６−４．６ （グルコピラノシル水素）， ３．３ （ＣＨ_３）， ３．０４ （ＣＨ_３）， ２．０５ （アセチル） ｐｐｍ。

以下の表は、実験条件ならびにこれらのおよびその他のＴＭＣの特性化を要約する。

別記しない限り、出発物質はＤＭＣであり、反応体はヨードメタンであった、ということに留意されたい。この表において、「ＤＱ」は第四級化度であり、「ＤＭＣの％」はジメチル化単位のパーセンテージであり、「Ｏ−ＤＳ−３」は位置３での置換度であり、「Ｏ−ＤＳ−６」は位置６での置換度であり、そして「ＤＡ」はアセチル化度である。報告された値は、^１Ｈ ＮＭＲにおけるピラノシル水素の場合と比較したそれぞれのピークの積分から決定する。

ＤＱ＋ＤＭＣの％＋ＤＡの和は１００％であるべきである、ということに留意すべきである。固有の実験誤差のため、それは性格に１００％であるというわけではない。したがって、ＤＱは、１００％−ＤＡ−％ＤＭＣを用いて概算され得る。例えば、１４６から、２＋２．６＝４．６％の単位のみがジメチル化またはアセチル化されるため、ＤＱは非常に高いと思われ、これは、当該単位の９５％がトリメチル化されることを意味する。

１ ＤＭＣではなくキトサン１００％（ＤＤ）に関して、第四級化反応を実行した。（３でなく）１４．４当量のＮａＨＣＯ_３を用いた。ＣＨ_３Ｉ（１０．３当量）の３回の付加を、反応中に実行した。
２ １０５ａに関して、３当量のＮａＨＣＯ_３および６当量のＣＨ_３Ｉを、反応の２時間後に付加した。１０５ｂに関しては、３当量のＮａＨＣＯ_３および６当量のＣＨ_３Ｉを、反応の２、４および６時間後に付加した。
３ ３当量のＮａＨＣＯ_３および６当量のＣＨ_３Ｉを、反応の２時間後に付加した。次いで、反応の４時間後に６当量のＣＨ_３Ｉを付加した。
４ ６当量のＣＨ_３Ｉを、反応の２、４、６、２３、２５、２７および２９時間後に付加した。ＮａＯＨを必要に応じて付加して、溶液のｐＨを７．０より高く保持した。「ｑＵＦ」は、生成物が限外濾過により精製されたことを意味する。
５ ＮａＩは用いなかった。６当量のＣＨ_３Ｉを、反応の２、４、６、２３、２５、２７および２９時間後に付加した。ＮａＯＨを必要に応じて付加して、溶液のｐＨを７．０より高く保持した。
６ ６当量のＣＨ_３Ｉを、反応の２、４、６、２２．５、２４．５、２６．５および２８．５時間後に付加した。ＮａＯＨを必要に応じて付加して、溶液のｐＨを７．０より高く保持した。
７ １４６ａに関しては、６当量のＣＨ_３Ｉを、反応の２、４および６時間後に付加した。１４６に関しては、反応の２２、２４、２６および２８時間後に、さらなる付加を行なった。Ｎａ_２ＣＯ_３は、反応の６時間後にのみ付加して、最初の夜間にｐＨが７より低くならないことを保証した。反応後、生成物（１４６ａおよび１４６）は水に不溶性であった。しかしながら、ＨＣｌまたはＮａＯＨを水に付加すると、それらは溶解した。ＮＭＲ分析に送った試料を酸性にして、ＣＯ_３ ^２−を排除した。次いで、ＮａＯＨを付加して、ｐＨを９に近づけた。
８ ６当量のＣＨ_３Ｉを、反応の２、４、６、２２、２４、２６および２８時間後に付加した。Ｎａ_２ＣＯ_３を必要に応じて付加して、溶液のｐＨを７．０より高く保持した。「１４７ａ」は、１４７（固体）を水中に溶解し、ＣＨ_３ＣＯＯＮａ（１０〜１５当量）の存在下で終末の間撹拌したものである。
９ ＮａＯＨを反応の開始時に付加しなかった。それは、必要に応じて付加して、溶液のｐＨを７．０より高く保持した。６当量のＣＨ_３Ｉを、反応の２、４、６、２２、２４、２６、２８、４６．５、４８．５、５０．５および５２．５時間後に付加した。生成物１４８は水に不溶性であり、酸性にして、１４８ｈを得た。それを酸性にするために、生成物１４８を水中に入れて、生成物が可溶化されるまでＨＣｌ（１２Ｍ）を付加した。次に真空下で蒸発させることにより水を除去し、メタノールを用いて生成物１４８ｈを沈澱させた。
１０ １４９ａ〜ｆに関して、各々６当量のヨードメタンを７回付加した。２当量のＮａ_２ＣＯ_３を当該日の最終ヨードメタン付加と一緒に付加し、１当量のＮａ_２ＣＯ_３を第２日の最終ヨードメタン付加とともに付加した。ＨＣｌを用いてＣＯ_３ ^２−を除去した。ＮａＯＨを用いてｐＨを約９に戻して、精製を難しくするＮａＣｌの生成を回避した。

出発条件を以下に示す：
５５： キトサン（１００％）（０．３００ｇ、１．８６ｍｍｏｌ）＋ＮａＨＣＯ_３（２．２５０ｇ、２６．７６ｍｍｏｌ）＋ＣＨ_３Ｉ（５．０１ｇ、３６ｍｍｏｌ）。
１０５ａおよびｂ： ＤＭＣ（０．４０１ｇ、２．１１ｍｍｏｌ）＋ＮａＨＣＯ_３（０．５３２ｇ、６．３３ｍｍｏｌ）＋ＮａＩ（０．８２５ｇ、５．５ｍｏｌ）＋ＣＨ_３Ｉ（１．８２ｇ、１２．８ｍｍｏｌ）。
１１５： ＤＭＣ（０．４０１ｇ、２．１１ｍｍｏｌ）＋ＮａＨＣＯ_３（０．５３２ｇ、６．３３ｍｍｏｌ）＋ＮａＩ（０．８２５ｇ、５．５ｍｏｌ）＋ＣＨ_３Ｉ（４．７９ｇ、３３．７ｍｍｏｌ）。
１２８： ＤＭＣ（０．３０１ｇ、１．５９ｍｍｏｌ）＋ＮａＯＨ（０．１９３ｇ、４．８２ｍｍｏｌ）＋ＮａＩ（０．６１８ｇ、４．１２ｍｏｌ）＋ＣＨ_３Ｉ（１．３７ｇ、９．６３ｍｍｏｌ）。
１４０： ＤＭＣ（０．６００ｇ、３．１７ｍｍｏｌ）＋ＮａＯＨ（０．３８８ｇ、９．７０ｍｍｏｌ）＋ＮａＩ（１．２３ｇ、８．２０ｍｏｌ）＋ＣＨ_３Ｉ（２．７３ｇ、１９．３ｍｍｏｌ）。
１４６ａおよび１４６： ＤＭＣ（０．６００ｇ、３．１７ｍｍｏｌ）＋Ｎａ_２ＣＯ_３（１．０１ｇ、９．５１ｍｍｏｌ）＋ＮａＩ（１．２３ｇ、８．２０ｍｏｌ）＋ＣＨ_３Ｉ（２．７３ｇ、１９．３ｍｍｏｌ）。
１４７： ＤＭＣ（０．６００ｇ、３．１７ｍｍｏｌ）＋Ｎａ_２ＣＯ_３（１．０１ｇ、９．５１ｍｍｏｌ）＋ＮａＩ（１．２３ｇ、８．２０ｍｏｌ）＋ＣＨ_３Ｉ（２．７３ｇ、１９．３ｍｍｏｌ）。
１４７ａｎ： ＤＭＣ（０．６００ｇ、３．１７ｍｍｏｌ）＋Ｎａ_２ＣＯ_３（１．０１ｇ、９．５１ｍｍｏｌ）＋ＮａＩ（１．２３ｇ、８．２０ｍｏｌ）＋ＣＨ_３Ｉ（２．７３ｇ、１９．３ｍｍｏｌ）。
実施例４−胆汁酸封鎖剤（ＢＡＳ）としてのＴＭＣのｉｎ ｖｉｖｏ効力

すべて、四級化ＴＭＣ塩化物を用いた。このＴＭＣは、ＤＤ９０％のキトサンから出発して、これをエシュバイラー・クラーク反応を用いてジメチル化して生成した。次に、上記の＃１４９を生成した場合と同様にして、第四級化を実行した。ＤＱは約８９％であったが、すなわち、利用可能な脱アセチル化単位はすべて、トリメチル化された。
１．背景

この試験の目的は、脂質障害の動物モデルを用いて、コレステロール低下剤としてのＴＭＣの効力を試験することであった。用いたモデルは、飽和脂肪およびコレステロール（０．１８％）が豊富な餌を与えたゴールデンシリアンハムスターであった。４週間に亘って、この高栄養価餌により、高コレステロール血症を先ず誘導した。この期間の終了時に、血漿総コレステロール、ＨＤＬおよびトリグリセリドの分析、ならびに体重測定を実施した。これらの測定値を用いて、ハムスターの３つの均一群を形成した。これら３群の形成後、４週間の期間に亘って処置を施した。３つの別個の処置を以下に示す：陰性対照処置（セルロース）、コレステロール低下基線処置（コレスチラミン）およびＴＭＣによる処置。これらの処置を、その食餌（１％）により動物に施した。４週間の処置の終了時に、血漿総コレステロール、ＨＤＬおよびトリグリセリドの分析を実施して、ＴＭＣのコレステロール低下能力を確定した。
２．方法
２．１ 動物

１２０〜１４０ｇの雄シリアンゴールデンハムスター（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒｓ， Ｓｔ−Ｃｏｎｓｔａｎｔ， ＱＣ）２４匹を、この試験のために用いた。到着時に動物を確認した。各動物に関して、全身査定を実施した。各動物の体重は、到着時および試験中１週間置きに計量した。試験開始前に１４日間、動物をその環境に馴化させた。
２．２収容設備

高コレステロール血症の発症期間中、ケージ当たり２匹でハムスターを収容した。高コレステロール血症の第３週から、全ハムスターを個別に収容した。試験中、ケージをポリスルホンフィルターで覆った。水の配給は、随時、手動で提供した。脂質分析前の絶食期間中以外は、食餌も随時提供した。群別のカラーコードを付けて、試験数、群、ならびに動物の数および性別も示すカラーコードを付けた箱を用いて、ケージを明瞭に同定した。

部屋は一般的に、２２±２℃の周囲温度および４０±２０％の相対湿度に保持した。部屋の温度および湿度は、毎日測定し、記録した。自動制御システムにより１２時間の明暗周期を提供し、換気システムにより１時間に８〜１０回の空気の入れ替えを行なった。

処置開始後４週間の間、動物を一定間隔で計量し、毎日身体検査して、動物の健康福利を保証した。悪症候は観察されなかった。ＴＭＣ処置群において体重減少が１例認められたので、以下の結果の節で報告する。
２．３食餌および処置

馴化期間中、標準粗挽き穀物餌を動物に与えた。その後、８週間の全期間中、顆粒形態の高栄養餌を全動物に随時与えた。この餌を用いて、ハムスターに高コレステロール血症を生じさせた。熱量摂取（ｋｃａｌ／餌１ｇ）に関しては、熱量の２３％がタンパク質から、３６％が炭水化物から、そして４１％が脂肪からであった。タンパク質は、植物（ダイズ）由来であった。飽和脂肪は、主にヤシ油および動物脂肪からで、次いで、ベニバナ油からであったが、一方、多価不飽和脂肪は主にオリーブ油およびベニバナ油からであった。ビオチン（２ｍｇ／ｋｇ）、葉酸（１０ｍｇ／ｋｇ）、ナイアシン（３７ｍｇ／ｋｇ）およびパントテン酸（４０ｍｇ／ｋｇ）の含量を、ハムスターに関する食餌推奨量と比較して、全動物に関して食餌中で増大させた。この予防策をとったのは、ＴＭＣを摂取している動物におけるビタミン不足の危険を低減するためであった。ＴＭＣはこれらの負荷電水溶性ビタミンに関する潜在的親和性を有し、したがって吸収不良の危険を増大する。

高栄養餌で４週間後、高コレステロール血症の発症後、餌に処置を組入れた。これを実行するために、フードプロセッサーを用いて餌を粉末にして、種々の処置 − 微晶質セルロース（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃａｎａｄａ Ｌｔｄ．， Ｏ，ａｋｖｉｌｌｅ， ＯＮ）、コレスチラミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃａｎａｄａ Ｌｔｄ．）およびＴＭＣ − を１％のレベルで食餌に組入れた。ＴＭＣで処置される動物に関するヨウ素の１日摂取量である一定含量のヨウ化物（０．００５％）を有するＴＭＣは、１日当たり１２ｇの食餌を消費した動物に関する０．０４ｍｇ／ｋｇでわずかに高かった。
２．４コレステロールおよびトリグリセリド分析

馴化期間（−４週目）後、および高栄養餌の開始（０週目）の４週間後、総コレステロール、ＨＤＬおよびトリグリセリドの分析を実施した。第一に、食餌が高コレステロール血症を生じたか否かを確立するために、第二に、これらのパラメーターに関して３つの均一群を形成させるために、これらの試験を実施した。その後、これらの試験を、処置開始の２および４週間後に反復した。動物を１２時間絶食させた後、コレステロールおよびトリグリセリドを測定するために必要な血液試料を収集した。これらの血液試料の採取は、イソフルランを用いた全身麻酔下での静脈内穿刺により実施した。血漿調製後、分析するまで試料を−８０℃で保存した。

血漿脂質を分析するために用いた方法（Ｌｅｍｉｅｕｘ Ｃ， Ｇｅｌｉｎａｓ Ｙ， Ｌａｌｏｎｄｅ Ｊ， Ｌａｂｒｉｅ Ｆ， Ｃｉａｎｆｌｏｎｅ Ｋ， Ｄｅｓｈａｉｅｓ Ｙ． ２００５． Ｈｙｐｏｌｉｐｉｄｅｍｉｃ ａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＳＥＲＭ ａｃｏｌｂｉｆｅｎｅ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｌｉｖｅｒ ＭＴＰ ａｎｄ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ＳＲ−ＢＩ ａｎｄ ＬＤＬ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ． Ｊ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ ４６： １２８５−９４）は、分光分析を用いてマイクロプレートを読み取るのを可能にするために適合されてきた。市販のキット（ＴＧ＃１１８７７７７１２１６＆ＣＨＯＬ＃１４９１４５８；Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて、トリグリセリドおよびコレステロールの確定を実施した。これらのキットの各々に関して、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓは、０．０５〜１１．３ｍｍｏｌ／Ｌの値に関する血漿中のトリグリセリドの測定の、ならびに０．０８〜２０．７０ｍｍｏｌ／Ｌの値に関するコレステロールの測定のための直線性を保証する。凍結乾燥ヒト血清（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、＃１２０１６６３０１２２）からの標準曲線を、各脂質分析のために、トリグリセリドおよびコレステロールの両方に関して実施した。Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓにより供給され、高濃度のトリグリセリド（３．８０ｍｍｏｌ／Ｌ：３．２３〜４．３７の信頼区間を有する）およびコレステロール（７．５６ｍｍｏｌ／Ｌ：６．４２〜８．７０の信頼区間を有する）を含有した参照「病理学」（ＰｒｅｃｉｐａｔＬ（登録商標）、＃１１２８５８７４−１２２）で、我々は標準曲線を実証した。血清脂質において相対的に高いこの病理学対照は、高脂肪含量を有する試料に関する分析の信頼性も確証する。
２．５血清生化学分析

計画の終了時に、カナダ動物管理協会（ＣＣＡＣ）が推奨しているように、イソフルランによる全身麻酔下での心臓穿刺により、末端血液試料を収集した。血液をエッペンドルフ管に移し、次いで室温で３０〜６０分間放置して、凝固させた。管を、４℃で１０分間、１５００の相対遠心分離力（ｒｃｆ）で遠心分離した。次に、各血液試料の血清部分を、その後の実験室分析のためにエッペンドルフ管に移した。試料収集後４時間以内に、血清生化学分析を実施した。
統計学的分析

９５％の信頼区間を有するスチューデント検定を用いて、血漿総コレステロール、ＨＤＬ、非ＨＤＬ、ＨＤＬ／非ＨＤＬ比およびトリグリセリドに及ぼす食餌の作用を査定した（Ｐｒｉｓｍソフトウェア）。９５％の信頼区間を有する２つの判定基準（時間および処置）での分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて、処置群（ＴＭＣおよびコレスチラミン）と対照群（セルロース）との間の総コレステロール、ＨＤＬ、非ＨＤＬ、ＨＤＬ／非ＨＤＬ比およびトリグリセリドの血漿レベルを比較した。この試験に用いられた事後解析は、ボンフェローニ多重比較である。
３．結果
３．１高コレステロール血症の発症

表１は、高栄養餌の開始前および高栄養餌消費の４週間後に得られた脂質分析の結果を要約する。

数字はすべて平均±標準誤差である
Ｐ＜０．０５：スチューデント検定による高栄養餌の前（−４週目）および後（０週目）になされた測定間の有意差。

これらの結果は、総コレステロール、ＨＤＬ、非ＨＤＬ、ＨＤＬ／非ＨＤＬ比およびトリグリセリドの血漿レベルが、飽和脂肪が豊富な且つ０．１８％コレステロールを含有する食餌の消費の４週間後に倍加した、ということを実証している。さらに、ＨＤＬ／非ＨＤＬコレステロールの比は平均１．３から１．０１に上昇し、これはＨＤＬと比較した場合の非ＨＤＬの取込みが大きいことを反映している。

高栄養餌の摂取の４週間の終了時に実施されたこれらの血漿試験結果から、３つの高コレステロール血症群を得るために動物の分配がなされ、平均および標準誤差は、これらのパラメーターの各々に関して比較可能であった（表２）。

数字はすべて平均±標準誤差である
３．２ＴＭＣおよびコレスチラミンの作用

試験全体を通して、体重を毎週測定し、食物消費を各ハムスターに関して同一頻度で概算した。これらの結果を図４に示す。図４は、セルロース（四角）、ＴＭＣ（菱形）またはコレスチラミン（三角）を用いた４週間の処置の間の体重の変化を示す。この図において、＊はＰ＜０．０５：分類のＡＮＯＶＡ２判定基準による、時間に関係ない、処置群および対照群間の有意差を意味する。

ＴＭＣによる処置の第１週に、平均で４．２５ｇの体重損失がこの処置を受けているハムスターで観察された（図４）。これに対比して、セルロースまたはコレスチラミンを摂取した群は、同一期間中、それぞれ１．５０および１．７５ｇの体重損失を示した。平均で４．７５ｇのさらなる体重損失が、処置第２週の間、ＴＭＣを摂取しているハムスターで観察された（図４）。しかしながら、他の２群のハムスターにおける体重はかなり安定していた。ＴＭＣを摂取しているハムスターにおける体重の損失は個体によって大きく変わり、最初の２週間以内に最も体重を損失したハムスターの場合は１９ｇで、最も少なかったのは１ｇという両極端であった、ということは言及されるべきことである。次の２週間の間、ＴＭＣ摂取ハムスターの体重は安定していた。各群の食餌消費のモニタリングは、ＴＭＣ処置群と対照群との間に有意差は認められない、ということを示唆している。ＴＭＣ処置群における食餌消費の低減は、この処置に関連した体重損失を説明するとは思われない。

コレスチラミン処置群と対照群の体重間の有意差（図４）は、主に、これら２群の間の９．２５ｇという初期差によるものである。この差は、群の形成において有意でなかったが、しかし、４週間の処置全体を通してギャップは一定のままであったため、ＡＮＯＶＡは有意レベルに達していた。群間の体重増分を統計学的に解析した場合、コレスチラミン処置群と対照群との間に明らかな有意差は認められない。

血漿総コレステロールならびに非ＨＤＬおよびＨＤＬに関する試験結果を、それぞれ図５および６に示す。

セルロース（四角）、ＴＭＣ（菱形）またはコレスチラミン（三角）での処置の４週間の間の総コレステロール（黒色記号）、ならびに血漿非ＨＤＬ（ＶＬＤＬ、ＬＤＬおよびＭＤＬ − 灰色記号）を、図５に示す。この図において、＊はＰ＜０．０５：ボンフェローニの事後解析により示される週での処置群および対照群間の有意差を意味する。この図は、総コレステロールおよび非ＨＤＬが全処置に関して同一傾向にあることを示している。

セルロース（四角）、ＴＭＣ（菱形）またはコレスチラミン（三角）での処置の４週間の間のＨＤＬにおける変化を、図６に示す。この図において、＊はＰ＜０．０５：ボンフェローニの事後解析による、処置の２週間におけるＴＭＣ処置群および対照群間の、次いで、処置４週間でのコレスチラミン処置群および対照群間の有意差を意味する。

ＴＭＣは、セルロースを摂取している対照群と比較して、総コレステロールを有意に低減した（図５）。４週間の処置終了時に、ＴＭＣによる血漿非ＨＤＬの低減は１９％で（図５）、ＨＤＬの低減は７％であった（図６）。したがって、有意レベルには到達しなかったが、しかし４週間の処置後、ＴＭＣは、ＨＤＬ／非ＨＤＬの比を１３％改善した（図７）。

コレスチラミンは、血漿総コレステロール、非ＨＤＬ（図５）およびＨＤＬ（図６）を有意に低減した。非ＨＤＬ（３８％、図５）の方がＨＤＬ（２６％、図６）におけるより低減作用が大きかったことを考えると、コレスチラミンはＨＤＬ／非ＨＤＬ比における改善を生じたが、しかし有意ではなかった。

図７は、セルロース（四角）、ＴＭＣ（菱形）またはコレスチラミン（三角）での処置の４週間の間のＨＤＬ／非ＨＤＬ比を示す。

４週間の処置で、ＴＭＣは、セルロースを摂取している対照群と比較して、血漿トリグリセリドにおける非有意の１３％減を生じた（図８）。比較において、コレスチラミンは、対照群と比較して、血漿トリグリセリドにおける３８％の有意の減少を生じた（図８）。

図８は、セルロース（四角）、ＴＭＣ（菱形）またはコレスチラミン（三角）での４週間処置におけるトリグリセリドを示す。この図において、＊は、ボンフェローニの事後解析による、処置４週間でのコレスチラミン処置群および対照群間のＰ＜０．０５を意味する。

この試験の目的は、脂質障害の動物モデルを用いて、コレステロール低下剤としてのＴＭＣの効力を試験することであった。ＴＭＣは胆汁酸封鎖剤で、これは糞便中でのそれらの排除を引き起こす。胆汁酸を結合することにより、それはその腸肝臓再吸収を防止する。胆汁酸の主な前駆体はコレステロールであって、その多くが、普通は、胆汁酸が小腸で再吸収されると回収されて、循環を介して肝臓に戻される。胆汁酸結合樹脂、例えばコレスチラミンも、胆汁酸の再吸収を抑制する。その場合、胆汁酸塩の排出は１０倍に増大される。これは、肝臓による胆汁酸の産生増大をもたらして、コレステロールの損失を生じる。これは、ＬＤＬ受容体活性を増大するという作用を有する。正味結果は、約１０〜３５％の血漿ＬＤＬの減少である。これらの胆汁酸結合剤は吸収されないため、有意の全身作用はそれらと関連しない。

ＴＭＣの考え得る副作用の１つは、ビタミン欠乏である。これは、ある負荷電水溶性ビタミンに関するＴＭＣの親和性と関連する。このような副作用を防止しながら、ＴＭＣのコレステロール低下作用を調べるために、高栄養餌中のある種のビタミンのレベルを増大させた（２．３節）。過剰量のこれらのビタミンは健康および血漿コレステロールに影響を及ぼし得るため（Ｌｕｒｉａ ＭＨ． １９８８． Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｌｏｗ−ｄｏｓｅ ｎｉａｃｉｎ ｏｎ ｈｉｇｈ−ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ａｎｄ ｔｏｔａｌ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ／ｈｉｇｈ−ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ｒａｔｉｏ． Ａｒｃｈ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ １４８： ２４９３−５ ａｎｄ Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ Ｊ， Ｃａｒｌｓｏｎ ＬＡ． １９９０ Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ ａｃｉｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｎ ｈｉｇｈ ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｓｉｚｅ ｓｕｂｃｌａｓｓ ｌｅｖｅｌｓ ｉｎ ｈｙｐｅｒｌｉｐｉｄａｅｍｉｃ ｓｕｂｊｅｃｔｓ． Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ８３： ２０７−１６参照）、ビタミン補充は副作用を回避するために制限された。さらに、３群間の偏りを回避するために、高レベルのビタミンを含有するこの食餌を全動物が摂取した。

高コレステロール血症食餌中に含入される栄養素も、徹底的スクリーニング工程に付した。当該モデルがヒトにおいて見出される状態をほぼ再現し得るということを考慮しながら、ハムスターにおける脂質障害のモデルを開発することを目指した食餌を確立する必要があった。開発された脂質障害の動物モデルに最初にさせたことは、その主要タンパク質がカゼインである食餌の消費であった。カゼインは、ダイズタンパク質と比較して、血漿コレステロールのより重度の増大に関与し、幾人かの著者によれば、動物タンパク質より植物タンパク質の含量が、ステロールの排除低減、リポタンパク質代謝に関与するある種の受容体の発現の変更等に関与している（Ｂｅｙｎｅｎ ＡＣ， Ｗｅｓｔ ＣＥ， Ｖａｎ Ｒａａｉｊ ＪＭ， Ｋａｔａｎ ＭＢ． １９８４． Ｄｉｅｔａｒｙ ｓｏｙｂｅａｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｓｅｒｕｍ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ． Ａｍ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｎｕｔｒ ３９： ８４０−１； Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ ＭＬ， Ｗｉｌｓｏｎ ＴＡ， Ｃｏｎｄｅ Ｋ， Ｖｅｒｇａｒａ−Ｊｉｍｅｎｅｚ Ｍ， Ｎｉｃｏｌｏｓｉ ＲＪ． １９９９． Ｈａｍｓｔｅｒｓ ａｎｄ ｇｕｉｎｅａ ｐｉｇｓ ｄｉｆｆｅｒ ｉｎ ｔｈｅｉｒ ｐｌａｓｍａ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｗｈｅｎ ｆｅｄ ｄｉｅｔｓ ｖａｒｙｉｎｇ ｉｎ ａｎｉｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ， ｓｏｌｕｂｌｅ ｆｉｂｅｒ， ｏｒ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ｃｏｎｔｅｎｔ． Ｊ Ｎｕｔｒ １２９： １３２３−３２； Ｔｅｒｐｓｔｒａ ＡＨ， Ｈｏｌｍｅｓ ＪＣ， Ｎｉｃｏｌｏｓｉ ＲＪ． １９９１． Ｔｈｅ ｈｙｐｏｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉｃ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｄｉｅｔａｒｙ ｓｏｙｂｅａｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｖｓ． ｃａｓｅｉｎ ｉｎ ｈａｍｓｔｅｒｓ ｆｅｄ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ−ｆｒｅｅ ｏｒ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ−ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｓｅｍｉｐｕｒｉｆｉｅｄ ｄｉｅｔｓ． Ｊ Ｎｕｔｒ １２１： ９４４−７；およびＢｅｙｎｅｎ ＡＣ． １９９０． Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｐｒｏｐｏｓｅｄ ｔｏ ｅｘｐｌａｉｎ ｔｈｅ ｈｙｐｏｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉｃ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｓｏｙｂｅａｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｖｅｒｓｕｓ ｃａｓｅｉｎ ｉｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｎｉｍａｌｓ． Ｊ ＮｕｔｒＳｃｉ Ｖｉｔａｍｉｎｏｌ （Ｔｏｋｙｏ） ３６ Ｓｕｐｐｌ ２： Ｓ８７−９３参照）。

植物タンパク質とコレステロールの組合せにより観察されるものと比較した場合の、動物タンパク質とコレステロールの組合せにより引き起こされる高個体間変動（Ｔｅｒｐｓｔｒａ ＡＨ， Ｈｏｌｍｅｓ ＪＣ， Ｎｉｃｏｌｏｓｉ ＲＪ． １９９１． Ｔｈｅ ｈｙｐｏｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉｃ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｄｉｅｔａｒｙ ｓｏｙｂｅａｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｖｓ． ｃａｓｅｉｎ ｉｎ ｈａｍｓｔｅｒｓ ｆｅｄ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ−ｆｒｅｅ ｏｒ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ−ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｓｅｍｉｐｕｒｉｆｉｅｄ ｄｉｅｔｓ． Ｊ Ｎｕｔｒ １２１： ９４４−７）は、この二番目の代替物を選択するよう促した。さらに、陽性対照としてコレスチラミンを用いたハムスターにおける試験を、ダイズタンパク質源を含有する食餌を用いて実施した（Ｗｉｌｓｏｎ ＴＡ， Ｎｉｃｏｌｏｓｉ ＲＪ， Ｒｏｇｅｒｓ ＥＪ， Ｓａｃｃｈｉｅｒｏ Ｒ， Ｇｏｌｄｂｅｒｇ ＤＪ． １９９８． Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ａｎｄ ｂｉｌｅ ａｃｉｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ， ａｎｄ ｅａｒｌｙ ａｔｈｅｒｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｈａｍｓｔｅｒｓ ｆｅｄ ＧＴ１６−２３９， ａ ｎｏｖｅｌ ｂｉｌｅ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｓｔｒａｎｔ （ＢＡＳ）． Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ １４０： ３１５−２４ ａｎｄ Ｄａｇｇｙ ＢＰ， Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ ＮＣ， Ｊｅｒｄａｃｋ ＧＲ， Ｓｔｉｎｓｏｎ ＢＡ， Ｓｅｔｃｈｅｌｌ ＫＤ． １９９７． Ａｄｄｉｔｉｖｅ ｈｙｐｏｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉｃ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｐｓｙｌｌｉｕｍ ａｎｄ ｃｈｏｌｅｓｔｙｒａｍｉｎｅ ｉｎ ｔｈｅ ｈａｍｓｔｅｒ： ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｎ ｆｅｃａｌ ｓｔｅｒｏｌ ａｎｄ ｂｉｌｅ ａｃｉｄ ｐｒｏｆｉｌｅｓ． Ｊ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ ３８： ４９１−５０２参照）。ハムスターの通常餌中に存在するコレステロールの量に関しては、そのレベルは約１００〜３００ｍｇ／消費１０００ｋｃａｌである。最新プロジェクトのために調製される食餌中のコレステロール含量のレベルは、４０６ｍｇ／消費１０００ｋｃａｌであった。脂肪における食餌の含量と同様に、それは重量（ｇ）で２０％、または熱量摂取に関しては４１％で（２．３節）、脂肪は炭水化物またはタンパク質よりも高い熱量摂取（ｋｃａｌ／ｇ）を有する。選択される高栄養餌中に含有される飽和脂肪の主な供給源は、ヤシ油および動物脂肪で、次いでベニバナ油であったが、一方、不飽和脂肪はオリーブ油およびベニバナ油からであった。高コレステロール血症食餌中の飽和脂肪およびコレステロールの組合せは、ヒト集団が消費する高栄養食を非常に良く再現しており、血漿コレステロールレベルがこの食餌を供給されたハムスターにおいて有意に増大する、ということを保証した（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ ＭＬ， Ｗｉｌｓｏｎ ＴＡ， Ｃｏｎｄｅ Ｋ， Ｖｅｒｇａｒａ−Ｊｉｍｅｎｅｚ Ｍ， Ｎｉｃｏｌｏｓｉ ＲＪ． １９９９． Ｈａｍｓｔｅｒｓ ａｎｄ ｇｕｉｎｅａ ｐｉｇｓ ｄｉｆｆｅｒ ｉｎ ｔｈｅｉｒ ｐｌａｓｍａ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｗｈｅｎ ｆｅｄ ｄｉｅｔｓ ｖａｒｙｉｎｇ ｉｎ ａｎｉｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ， ｓｏｌｕｂｌｅ ｆｉｂｅｒ， ｏｒ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ｃｏｎｔｅｎｔ． Ｊ Ｎｕｔｒ １２９：１３２３−３２）。

４週間の食餌中に１％のレベルで投与されるＴＭＣは、総コレステロールレベルに及ぼすコレステロール低下作用を示した。ＨＤＬはＴＭＣ処置によりわずかに（７％）減少したが、一方、非ＨＤＬコレステロールはより有意に低減され（１９％）、これはより良好なＨＤＬ／非ＨＤＬ比を促す作用を有した。コレステロール低下療法後に求められた最大の作用は、ＨＤＬに影響を及ぼすことなく非ＨＤＬコレステロールを低下させることである。したがって、ＴＭＣが、ＨＤＬと比較して非ＨＤＬのより大きな低減を生じたという事実は疑問の余地がない。ＴＭＣは、トリグリセリドの血漿レベルに影響を及ぼすとは思われない。

コレスチラミン（既に市販されているコレステロール低下薬）は、この試験において陽性対照として役立つ。それは、血漿総コレステロール、非ＨＤＬおよびＨＤＬにおける有意の低減を生じた。それは、ＨＤＬのレベル（２６％）よりはるかに大きく非ＨＤＬのレベル（３８％）を低減し、したがって、ＴＭＣに匹敵するほど、ＨＤＬ／非ＨＤＬ比を改善した。総コレステロールの低減は、ＴＭＣを用いた場合よりコレスチラミンを用いた場合の方が高かった。さらに、血漿トリグリセリドのレベルは、コレスチラミンにより有意に低減された。ハムスターにおいてコレスチラミンを用いて我々が得た結果は、他の著者により報告された結果を裏付けている（Ｗｉｌｓｏｎ ＴＡ， Ｎｉｃｏｌｏｓｉ ＲＪ， Ｒｏｇｅｒｓ ＥＪ， Ｓａｃｃｈｉｅｒｏ Ｒ， Ｇｏｌｄｂｅｒｇ ＤＪ． １９９８． Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ａｎｄ ｂｉｌｅ ａｃｉｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ， ａｎｄ ｅａｒｌｙ ａｔｈｅｒｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｈａｍｓｔｅｒｓ ｆｅｄ ＧＴ１６−２３９， ａ ｎｏｖｅｌ ｂｉｌｅ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｓｔｒａｎｔ （ＢＡＳ）． Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ １４０： ３１５−２４ ａｎｄ Ｎｉｃｏｌｏｓｉ ＲＪ， Ｗｉｌｓｏｎ ＴＡ， Ｋｒａｕｓｅ ＢＲ． １９９８． Ｔｈｅ ＡＣＡＴ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ， ＣＩ−１０１１ ｉｓ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｏｒｔｉｃ ｆａｔｔｙ ｓｔｒｅａｋ ａｒｅａ ｉｎ ｈａｍｓｔｅｒｓ． Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ １３７： ７７−８５）。

ｉｎ ｖｉｖｏ実験の終了時に、ハムスター（ＴＭＣ処置および陰性対照）において血液試験を実施した。これらの試験は、アルブミン、ＡＬＴ（ＳＧＰＴ）、ＡＬＴ（ＳＧＯＴ）、総ビリルビン、ＣＫ、クレアチニン、ガンマ−ＧＴ（ＧＧＴ）、グルコース、総タンパク質、Ａ／Ｇ比、尿窒素（ＢＵＮ）およびグロブリンにおける濃度を包含する。ハムスターのこれら２つの群の間の結果は、同様であった。
実施例５ − ＴＭＣ抗菌作用

ＴＭＣの抗菌作用を、グラム陰性細菌である大腸菌および緑膿菌、ならびにグラム陽性細菌である腸球菌（エンテロコッカス・フェカリス）、黄色ブドウ球菌、β溶血性連鎖球菌および恥垢菌（マイコバクテリウム・スマグマチス）に関して、６つの異なる濃度（０．５μｇ、５μｇ、５０μｇ、５００μｇ、５ｍｇおよび５０ｍｇ／ｍＬ）で査定した。６００ｎｍの吸光度での分光分析により、実験をモニタリングした。図９〜１１は、得られた結果を概説する。
実験条件

ＴＭＣ溶液の調製： ６ｍＬの生理学的水中に０．３００６ｇのＴＭＣを溶解して、ストック溶液（５０ｍｇ／ｍＬ）を得た。次に、ストック溶液を１０分の１希釈して、５ｍｇ／ｍＬ溶液を得た（６００μＬのストック溶液＋５．４ｍＬの生理学的水）。５ｍｇ／ｍＬ溶液をさらに１０分の１希釈した。０．５μｇ／ｍＬ溶液が得られるまで、当該過程を反復した。

使用される異なる細菌株の調製： 各菌株を、予めオートクレーブ処理した栄養ブロスル・リア・ベルターニ（ＬＢ）中に移植した。移植は、以下のように実施した：１０ｍＬのＬＢ中の１００μＬの菌株、３５℃で１２〜２４時間、オーブン中でインキュベーション、６００ｎｍの吸光度で光学密度（ＯＤ）の測定。

ミクロファージにおける実験： 成長相での新鮮な菌株に関して作業するために、各菌株を先ずＬＢ中に移植する。６００ｎｍの吸光度で、ＯＤ測定を実施する。得られたＯＤを基礎にして、１．０に近い最終ＯＤを得るために、溶液をＸ分の１希釈する（作業溶液）。

各ウェル中の総容積：Ｖ＝２００μＬ
ブランク：１８０μのＬＢ＋２０μＬの生理学的水
対照：１６０μのＬＢ＋２０μＬの菌株＋２０μＬの生理学的水
［ＴＭＣ］：各濃度に関して：１６０μのＬＢ＋２０μＬの菌株＋２０μＬのＴＭＣ溶液
対照：２００μＬのＬＢ

実験開始時（Ｔ０）にＯＤを実施し、次いで、全実験系を、オーブン中で３５℃でインキュベートする。定常期に達するまで、ＯＤを毎時測定する。各測定前に、実験培地を均質化する（７５０ｒｐｍマイクロプレート使用）。各測定を３回実施する。

各菌株に関して、結果をグラフとして示す。このグラフは、各ＴＭＣ濃度に関するＯＤ進展対インキュベーション時間を示す：ＯＤ＝Ｆ（ｔ）。その後、以下の方程式を用いて、成長速度を算定する：μ＝（ｌｏｇＮｔ−ｌｏｇＮ０）／（０．３０１＊ｔ）。
結果

結果を、図９〜１１に略述する。図９で示したように、ＴＭＣの作用は、全菌株に関して同様である。大腸菌および緑膿菌の成長率は、依然として高いが、しかしＴＭＣ濃度が増大するとわずかに減少する。最大成長（２つの最高ＴＭＣ濃度（５および５０ｍｇ／ｍＬ）に関して到達された）は、対照に関する値より有意に低い。これらの結果は、ＴＭＣが静菌作用を有する、すなわち５ｍｇ／ｍＬ以上のＴＭＣ濃度は細菌増加を制限する、ということを示唆している。同様の活性は、５００μｇ／ｍＬの濃度のＴＭＣに関して認められる。最大成長は、確かに、対照に関する値より有意に低い。しかしながら、この濃度でのＴＭＣ静菌作用は、より高い濃度（５および５０ｍｇ／ｍＬ）でのＴＭＣに関する作用より有意に低い。５００μｇ／ｍＬより低いＴＭＣ濃度に関しては、２つの菌株の成長に及ぼす関連作用は観察されない、ということが注目される。

図１０および１１は、グラム陽性細菌に関して得られた結果を示す。黄色ブドウ球菌および腸球菌（エンテロコッカス・フェカリス）に関して得られた結果（図１０）は、高濃度でのＴＭＣに関する殺菌作用を示唆している。黄色ブドウ球菌に関しては５ｍｇ／ｍＬ以上のＴＭＣ濃度、そして腸球菌（エンテロコッカス・フェカリス）に関しては５０ｍｇ／ｍＬより高いＴＭＣ濃度に関して、成長速度は確かに低く、成長は依然として０．１より低い。

恥垢菌（マイコバクテリウム・スマグマチス）の成長に及ぼすＴＭＣ作用（図１１）は、２つのグラム陰性菌株である大腸菌および緑膿菌に及ぼす作用と同様である。陽性成長にもかかわらず、２つの最高濃度（５および５０ｍｇ／ｍＬ）に関して到達される最大成長は、対照に関するよりも、そして他の濃度に関するよりも有意に低く、これも、これら２つの濃度でのＴＭＣに関する静菌作用を示唆している。

溶血性連鎖球菌株に関しては、５０ｍｇ／ｍＬの濃度で対照とのわずかな差異が認められるにもかかわらず、ＴＭＣはこの菌株の成長に及ぼす如何なる作用も有さないと思われる。

上記の結果に基づいて、ＴＭＣは、（ｉ）５ｍｇ／ｍＬ以上の濃度で、試験した菌株のほとんどの成長に及ぼす静菌作用（作用限定）、ならびに（ｉｉ）５ｍｇ／ｍＬ以上の濃度で、ある種の菌株に及ぼす殺菌作用を有すると思われる。

その具体的実施形態により本発明を本明細書中において上記で説明してきたが、添付の特許請求の範囲で定義されるような本発明の精神および性質を逸脱しない限り、本発明は修正がなされ得る。

参考文献

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・Ｓａｈｎｉ Ｓ．， Ｃｈｏｐｒａ Ｓ．， Ａｈｍａｄ Ｆ．Ｊ．， Ｋｈａｒ Ｒ．Ｋ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ， ２００８， ６０， １ １ １ １ ．
・Ｓｉｅｖａｌ Ａ．Ｂ．， Ｔｈａｎｏｕ Ｍ．， Ｋｏｔｚｅ Ａ． Ｆ．， Ｖｅｒｈｏｅｆ Ｊ．Ｃ．， Ｂｒｕｓｓｅｅ Ｊ．， Ｊｕｎｇｉｎｇｅｒ Ｈ．Ｅ．， Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ． Ｐｏｌｙｍ．， １９９８， ３６， １５７−１６５．
・Ｓｎｙｍａｎ Ｄ．， Ｈａｍｍａｎ Ｊ． Ｈ．， Ｋｏｔｚｅ Ｊ．Ｓ．， Ｒｏｌｌｉｎｇｓ Ｊ．Ｅ．， Ｋｏｔｚｅ Ａ．Ｆ．， Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ． Ｐｏｌｙｍ．， ２００２， ５０， １４５− １５０．
・Ｓｙｎｍａｎ Ｄ．， Ｈａｍｍａｎ Ｊ．Ｈ．， Ｋｏｔｚｅ Ａ．Ｆ．， Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ． Ｉｎｄ． Ｐｈａｒｍ．， ２００３， ２９， ６１．
・Ｔｅｒｐｓｔｒａ ＡＨ， Ｈｏｌｍｅｓ ＪＣ， Ｎｉｃｏｌｏｓｉ ＲＪ． １９９１． Ｔｈｅ ｈｙｐｏｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉｃ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｄｉｅｔａｒｙ ｓｏｙｂｅａｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｖｓ． ｃａｓｅｉｎ ｉｎ ｈａｍｓｔｅｒｓ ｆｅｄ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ−ｆｒｅｅ ｏｒ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ−ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｓｅｍｉｐｕｒｉｆｉｅｄ ｄｉｅｔｓ． Ｊ Ｎｕｔｒ １２１ ： ９４４−７
・Ｔｈａｎｏｕ Ｍ．， Ｆｌｏｒｅａ Ｂ．Ｉ ．， Ｌａｎｇｅｍｅｙｅｒ Ｍ．Ｗ．Ｅ．， Ｖｅｒｈｏｅｆ Ｊ． Ｃ， Ｊｕｎｇｉｎｇｅｒ Ｈ．Ｅ．， Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓ．， ２０００， １７， ２７．
・Ｔｈａｎｏｕ Ｍ．， Ｋｏｔｚｅ Ａ． Ｆ．， Ｓｃｈａｒｒｉｎｇｈａｕｓｅｎ Ｔ．， Ｌｅｕｂｅｎ Ｈ． Ｌ， Ｄｅ Ｂｏｅｒ Ａ．Ｇ．， Ｖｅｒｈｏｅｆ Ｊ． Ｃ， Ｊｕｎｇｉｎｇｅｒ Ｈ．Ｅ．， Ｊ． Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ， ２０００， ６４， １５．
・Ｔｈａｎｏｕ Ｍ．， Ｖｅｒｈｏｅｆ Ｊ． Ｃ， Ｊｕｎｇｉｎｇｅｒ Ｈ．Ｅ．， Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．， ２００１ ， ５２， １ １７．
・Ｔｈａｎｏｕ Ｍ．， Ｖｅｒｈｏｅｆ Ｊ． Ｃ， Ｖｅｒｈｅｉｊｄｅｎ Ｊ．Ｈ．Ｍ．， Ｊｕｎｇｉｎｇｅｒ Ｈ． Ｅ．， Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓ．， ２００１ ， １８， ８２３．
・Ｔｈａｎｏｕ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． “Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｎ−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ ｃｈｉｔｏｓａｎ ｃｈｌｏｒｉｄｅ， ａ ｎｏｖｅｌ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｅｎｈａｎｃｅｒ， ｏｎ ｃａｃｏ−２ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉａ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｉｌｉａｒｙ ｂｅａｔ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｏｆ ｃｈｉｃｋｅｎ ｅｍｂｒｙｏ ｔｒａｃｈｅａ，” Ｉｎｔ． Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ａｕｇ． ５， １９９９； １８５（１ ）：７３−８２．
・Ｔｈａｎｏｕ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． “Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｏｆ ｏｃｔｒｅｏｔｉｄｅ： Ｎ−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ ｃｈｉｔｏｓａｎ ｃｈｌｏｒｉｄｅ （ＴＭＣ） ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ ｔｈｅ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ ａｎａｌｏｇｕｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ，” Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ． Ｊｕｌ． ２０００；８９（７）：９５１ −７．
・Ｕｅｎｏ， Ｈ． Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ． Ｒｅｖ．， ２００１ ， ５２， １０５−１ １５．
・Ｖｅｒｈｅｕｌ， Ｒ．Ｊ．， Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ， ２００８， ２９， ３６４２−３６４９
・Ｗｉｌｓｏｎ ＴＡ， Ｎｉｃｏｌｏｓｉ ＲＪ， Ｒｏｇｅｒｓ ＥＪ， Ｓａｃｃｈｉｅｒｏ Ｒ， Ｇｏｌｄｂｅｒｇ ＤＪ． １９９８． Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ａｎｄ ｂｉｌｅ ａｃｉｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ， ａｎｄ ｅａｒｌｙ ａｔｈｅｒｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｈａｍｓｔｅｒｓ ｆｅｄ ＧＴ１６−２３９， ａ ｎｏｖｅｌ ｂｉｌｅ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｓｔｒａｎｔ （ＢＡＳ）． Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ １４０： ３１５−２４
・ＣＡ ２５０７８４６．
・ＣＡ ２５０７８７０．
・ＣＡ ２５８０４６０．
・ＣＡ ２６２３４７５．
・ＣＡ ２６３１８９１ ．
・ＥＰ １２５０１ １８ Ｂ１ ．
・ＵＳ５７４４１６６．
・ＵＳ６２０７１９７．
・ＵＳ６３２８９６７．
・ＵＳ６４１００４６．
・ＵＳ６７２６９２０．
・ＵＳ７２８２１９４．
・ＵＳ７２９１５９８．
・ＵＳ７３８１７１６．
・ＵＳ７３９３６６６．
・ＵＳ７４０７９４３．
・ＵＳ７４２７４７０．
・ＵＳ７４５５８３０．

Claims (21)

1. Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルキトサンの調製方法であって、
   ａ）キトサンを提供することと、
   ｂ）ホルムアルデヒドおよび蟻酸を用いた還元的アミノ化反応によりキトサンをメチル化してＮ，Ｎ−ジメチルキトサンを生成することと、
   ｃ）水、または水混和性溶媒と混合した水から選択される反応溶媒中で、メチル化剤とアルカリ性の炭酸塩から選択される塩基とを用いて、Ｎ，Ｎ−ジメチルキトサンをメチル化してＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルキトサンを生成することと、
   を含み、
   生成したＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルキトサンが、^１Ｈ ＮＭＲ分光法によってプロトン化形態で測定された場合に５０％以上の第四級化度を有し、且つ、４０％以下のＯ−置換度を有する、方法。
2. Ｎ，Ｎ−ジメチルキトサンが２．０のＮ置換度（Ｎ−ＤＳ）を有する、請求項１に記載の方法。
3. キトサンが、６０％以上の脱アセチル化度（ＤＤ）を有する、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記メチル化剤が、ハロゲン化メチルまたは炭酸ジメチルである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. 前記メチル化剤がヨードメタンである、請求項４に記載の方法。
6. 前記塩基が炭酸ナトリウムである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
7. 前記反応溶媒が、水、または水とアルコールの混合物である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
8. 前記反応溶媒が、水と最大で５０％のアルコールである、請求項７に記載の方法。
9. 前記反応溶媒が、水と１０％のアルコールである、請求項８に記載の方法。
10. 前記アルコールがメタノールである、請求項７〜９のいずれか１項に記載の方法。
11. ステップｂ)およびステップｃ)のうちの少なくとも一方がマイクロ波を用いて実施される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
12. ＨＣｌ、ＨＢｒまたはＨＩを付加して、塩化物、臭化物またはヨウ素対イオンを有するＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルキトサンを生成するステップをさらに含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
13. ^１Ｈ ＮＭＲ分光法によってプロトン化形態で測定された場合に５０％以上の第四級化度を有し、および、
    ４０％以下のＯ−置換度を有する、
    Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルキトサン。
14. ^１Ｈ ＮＭＲ分光法によってプロトン化形態で測定された場合に５５％以上の第四級化度を有する、請求項１３に記載のＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルキトサン。
15. ^１Ｈ ＮＭＲ分光法によってプロトン化形態で測定された場合に６０％以上の第四級化度を有する、請求項１４に記載のＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルキトサン。
16. ^１Ｈ ＮＭＲ分光法によってプロトン化形態で測定された場合に６５％以上の第四級化度を有する、請求項１５に記載のＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルキトサン。
17. ^１Ｈ ＮＭＲ分光法によってプロトン化形態で測定された場合に７５％以上の第四級化度を有する、請求項１６に記載のＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルキトサン。
18. ２０％以下のＯ−置換度を有する、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載のＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルキトサン。
19. １０％以下のＯ−置換度を有する、請求項１８に記載のＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルキトサン。
20. ０％のＯ−置換度を有する、請求項１９に記載のＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルキトサン。
21. 対象において高コレステロール血症を治療するための医薬品の調製における、請求項１３〜２０のいずれか１項に記載のＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルキトサンの使用。

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