KR20160122828A - 생체고분자 유도체를 합성하기 위한 방법, 생체고분자 유도체 및 이의 용도 - Google Patents

생체고분자 유도체를 합성하기 위한 방법, 생체고분자 유도체 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 펩티드 결합의 형성을 포함하는 생체고분자 유도체, 바람직하게는 키토산 유도체의 합성 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 생체고분자 유도체 및 상기 생체고분자 유도체, 바람직하게는 키토산 유도체의 용도에 관한 것이다. 상기 생체고분자 유도체는 산업, 환경보호에 있어서 광범위한 용도를 가지며 약학 및 화장료 조성물에서 사용할 수 있다. 본 발명은 또한 중금속, 특별히 팔라듐, 코발트, 크롬과 금, 특히 니켈로 인한 알레르기의 증상을 예방하기 위한 조성물에 관한 것이다.

Description

생체고분자 유도체를 합성하기 위한 방법, 생체고분자 유도체 및 이의 용도{METHOD FOR SYNTHESIS OF A BIOPOLYMER DERIVATIVE, A BIOPOLYMER DERIVATIVE AND ITS USE}
본 발명은 펩티드 결합의 형성을 포함하는 생체고분자 유도체, 바람직하게는 키토산 유도체를 합성하기 위한 방법, 생체고분자 유도체 및 생체고분자 유도체, 바람직하게는 키토산 유도체의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 새로운 키토산 유도체를 함유하는 화장료 조성물 및 금속에 대한 알레르기의 증상으로부터 보호하는 조성물을 제조하기 위한 상기 유도체 및/또는 키토산의 용도에 관한 것이다.
생물학적 기원의 불용성 고분자, 예를 들면 키토산과 같은 다당류는 펩티드 결합을 형성하기 쉬운 활성 아민 또는 카르복실기를 함유하는 화합물을 포함하고 있다.
키토산은 β-(l-4)-연결된 D-글루코사민과 N-아세틸-D-글루코사민 단위들로 구성된 선형의 다당류이다. 키토산은 동물 또는 진균의 키틴으로부터 제조될 수 있고 예를 들어 화장품 산업과 의학에서 다양한 용도를 갖고 있다.
종래기술에서는 전통적인 고상 펩티드 합성법이 이용되어 왔다. Fmoc/SPPS 프로토콜에 따라 펩티드를 합성하기 위한 수지, 수지에 최초 아미노산을 부착시키고 펩티드 결합을 생성시켜 펩티드를 연장하기 위한 조건들은 종래기술에 공지되어 있다.
CA2126132A1은 키토산 상에서 펩티드를 합성하는 방법을 개시하고 있다. 그러나 전통적인 합성이 이용되고 키토산의 아미노기와 펩티드의 첫 번째 아미노산 사이에는 추가 결합 분자가 사용되고 있다.
종래기술에는 키토산과 같이 완전 생분해성인 생체고분자를 키토산과 개질제 분자 사이에 직접적인 펩티드 결합과 함께 개질제를 부착하기 위한 수지로서 사용하는 것에 대한 개시내용이 없다. 전통적인 펩티드 합성을 위해 적용 가능한 조건에서 반응은 긴 시간이 소요되고 만족할만한 수율을 제공하고 있지 않다.
EP1512773은 생물학적으로 활성인 성분을 금속제 의료 기기의 코팅과 함께 키토산 층(들)에 도입하는 것을 개시하고 있다. 그러나 이 방법에서 생체분자는 특정 공유결합을 형성하는 것 없이 별도의 코팅층으로서 추가된다.
키토산 유도체를 수득하기 위한 전통적인 고상 펩티드 합성법으로부터 유도되는 방법은 많은 애로, 예를 들어 낮은 수율과 긴 반응시간을 수반한다.
종래기술에는 다양한 인자로 인한 피부 자극을 치료하기 위해 키토산을 사용하는 것이 알려져 있다. RU 2357738C2는 백금중독의 예방과 치료를 위해 1% 키토산 염산염을 함유한 피부학적 제제를 사용하는 것을 기재하고 있다. WO 9209636(Al)은 알레르겐 또는 독소와의 접촉으로부터 피부를 보호하는 방법으로서, 피부 접촉 전에 알레르기를 일으키는 물질에 민감한 대상의 피부에 키토산 고분자와 키토산 유도체로부터 선택되는 다당류를 도포하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다. 상기 문헌은 항원으로서 금속을 언급하지도 않고 도포되는 키토산 유도체의 아미노기가 펩티드 결합에 관여할 것이라는 가능성도 언급하고 있지 않다. 또한 EP1512773은 금속제 의료 기기를 키토산으로 코팅하여 생체에 적합하도록 하고 이들 기기로부터 유래되는 금속 이온에 의한 생물체의 자극을 예방하는 것을 개시하고 있다.
가장 흔한 니켈 알레르기 발현은 Th 림프구 관련 반응(IV형 과민반응)으로 인한 접촉 피부염이다. 니켈은 가장 흔한 알레르겐 중 하나이다. 유럽 선진국(예를 들면 독일, 영국, 이탈리아)의 인구 중 15% 이상이 니켈 알레르기를 겪고 있다. 폴란드에서는 16-17세 여자아이들 중 30%가 니켈 알레르기로 고생하고 있다[Br. J. Dermatol. 2013, 169: 854-858; Contact Dermatitis 2011, 64: 121-125]. 상기 문제의 중요성은 EU 지침 94/27/EC가 보석류와 공용물의 니켈 방출 허용량을 규제하고 있다는 사실에 의해 강조된다.
따라서 금속에 대한 알레르기, 특별히 중금속, 특히 니켈에 대한 알레르기로부터 효과적인 보호책을 개발해야 할 필요가 절실한 실정이다.
본 명세서에 개시되어 있는 발명은 수득한 유도체를 산업적으로 적용하기 위한 충분한 효능을 제공하는 합성방법의 과제를 해결할 뿐 아니라 키토산과 같이 안전하고 비독성이면서 생분해성인 화합물을 기재로 하는 활성 분자를 산업적인 규모로 제공하는 과제를 해결하는 것이다.
본 발명은 펩티드 결합의 형성을 이용하여 개질제 분자에 의해 개질된 반응성 아민 또는 카르복실기 함유 불용성 고분자 유도체를 제공한다. 바람직하게는 상기 고분자는 다당류/올리고당, 바람직하게는 키토산이다. 바람직한 구현예에 있어서, 상기 펩티드 결합은 폴리(2-데옥시-2-아미노글루코오스)의 소단위의 아민기와 개질제 분자의 가용 카르복실기 중 하나 사이에 존재한다. 바람직하게는, 상기 카르복실기 함유 개질제 분자는 카르복시산, 아미노산, 아미노산 유사체, 디펩티드, 트리펩티드, 테트라펩티드, 길이가 긴 펩티드, 펩티드 모방체(peptidomimetic), 단백질과 단백질 모방체로부터 선택되거나 또는 이들의 임의의 혼합물이다.
본 발명의 대상은 또한 반응성 아민 또는 카르복실기를 함유한 생체고분자의 단위의 아민 또는 카르복실기와 부착할 개질제 분자의 가용 카르복실 또는 아민기 사이에 펩티드 결합이 형성되어 있는 불용성 고분자의 유도체를 합성하는 방법이다.
바람직한 구현예에 있어서, 상기 방법은
a) 개질제 분자를 적절한 용매, 바람직하게는 디옥산 중에서 Fmoc-Cl과 반응시키고;
b) 상기 Fmoc-개질제 분자를 용매, 바람직하게는 DMF에 용해시키고 HBTU, HOBt와 DIPEA가 존재하는 상태에서 생체고분자와 반응시키고;
c) 상기 개질제 분자로부터 Fmoc 보호기를 제거하고;
d) 상기 개질제 분자가 부착되어 있는 생체고분자를 증류수에 현탁시키고 동결건조시키는 것을 포함한다.
또 다른 바람직한 구현예에 있어서, 상기 방법은 폴리(2-데옥시-2-아미노글루코오스)의 단위의 아민기 사이에 펩티드 결합을 형성하되 마이크로파 장에서 상기 고분자와 개질제 분자 사이에 펩티드 결합을 형성하는 것을 포함한다.
바람직하게는 Fmoc로 보호된 펩티드 분자를 수득하는 단계는 없어도 된다.
바람직한 구현예에 있어서, 상기 방법은
a) 생체고분자를 적절한 용매에서 마아크로파로 처리하고,
b) 활성제를 첨가하여 상기 생체고분자의 작용기를 활성화하고,
c) 보호되지 않은 개질제 분자를 첨가하고,
d) 상기 반응 혼합물을 마이크로파로 처리하고,
e) 수득한 개질 생체고분자를 세척 및 동결건조하는 것을 포함한다.
바람직한 활성제로서 DCC와 HOPfp 또는 HBTU, HOBT와 DIPEA를 사용한다. 바람직하게는 상기 마이크로파 처리는 1-30분 동안 지속한다. 그러나 훨씬 더 긴 시간 또한 펩티드 결합 형성이 나타나는 한 본 발명에 포함된다.
상기 합성 방법은 생체고분자로서 키토산을 포함하고 상기 개질제 분자는 카르복시산, 아미노산, 아미노산 유사체, 디펩티드, 트리펩티드, 테트라펩티드, 길이가 긴 펩티드, 펩티드 모방체, 단백질 또는 단백질 모방체 중 적어도 하나로부터 선택되고, 상기 트리펩티드 분자는 바람직하게는 글루타티온이다.
본 발명의 대상은 또한 본 발명에 따른 생체고분자 유도체를 함유하는 화장료 또는 약학 조성물이다. 상기 조성물은 연고, 크림, 로션 형태이다. 본 발명에 따른 조성물은 의학, 약품 또는 화장품에서 사용된다.
본 발명의 대상은 또한 중금속, 바람직하게는 팔라듐, 코발트, 크롬과 금, 가장 바람직하게는 니켈로 인한 알레르기의 증상을 예방하는데 사용하기 위한 조성물이다.
바람직하게는 상기 조성물은 추가 생체고분자, 바람직하게는 생체고분자로서 금속 결합 단백질을 함유한다.
나아가 본 발명의 대상은 금속, 바람직하게는 중금속, 가장 바람직하게는 니켈과의 접촉으로 인한 피부 알레르기의 증상을 예방하는데 사용하기 위한 키토산 유도체이다.
본 발명의 대상은 또한 본 발명에 따른 생체고분자 유도체를 함유하는 개질제 분자 부착용 기질이다.
본 발명은 또한 중금속으로 인한 알레르기의 증상을 예방, 바람직하게는 니켈로 인한 알레르기의 증상을 예방하기 위한 키토산 유도체 및/또는 키토산의 용도를 개시한다. 바람직하게는 상기 조성물은 추가 생체고분자, 바람직하게는 생체고분자로서 금속 결합 단백질을 함유한다.
또한 본 발명의 대상은 산업 및 생활 폐기물을 정제하기 위한 방법으로서, 본 발명에 따른 생체고분자 유도체를 상기 폐기물에 접촉시켜 오염물질을 봉입하고 오염물질이 봉입된 상기 생체고분자 유도체를 분해하는 방법이다. 본 발명은 또한 금속을 회수하기 위한 방법으로서, 금속 이온을 함유한 물질을 본 발명에 따른 생체고분자 유도체와 접촉시키는 방법을 개시한다. 이에 따라 본 발명은 산업 및 생활 폐기물 정제 및/또는 금속 회수를 위한 본 발명에 따른 생체고분자 유도체의 용도를 개시한다.
용어 "불용성 생체고분자(insoluble biopolymer)"는 단위(mers)로 이루어지고 펩티드 결합을 형성하기 쉬운 활성 아민 또는 카르복실기를 함유한 생물학적 기원의 모든 화합물을 의미한다. 이들 화합물은 주로 불수용성이다. 셀룰로오스와 키토산은 불용성 생체고분자의 예이다.
용어 "개질제 분자(modifier molecule)"는 카르복실 또는 아민기를 가진 키토산 또는 다른 생체고분자 분자와 펩티드 결합을 형성할 수 있는 분자에 대한 것이다.
용어 "펩티드 모방체(peptidomimetics)" 또는 "단백질 모방체(protein mimetics)"는 선형 펩티드 또는 단백질의 개질 또는 고리화에 대한 것이다. 펩티드 모방체의 예는 아미드 결합 대체물(surrogate), 펩티도술폰아미드, 포스포노펩티드, 올리고우레아, 뎁시드, 뎁시펩티드와 펩티도이드를 포함한다.
키토산은 물과 펩티드 합성에 적합한 유기 용매에 실제로 불용성이지만 화학적으로 활성이므로 유기분자, 예를 들면 펩티드를 부착하기 위한 기질로서 사용이 가능하다.
본 발명의 대상은 전통적인 펩티드 결합 형성 조건과 마이크로파 장에서 펩티드 결합 형성을 위해 적합한 카르복실기 함유 분자를 이용한 키토산 개질이다. 이러한 분자의 예로는 카르복시산, 아미노산, 아미노산 유사체, 디펩티드, 트리펩티드, 테트라펩티드, 길이가 긴 펩티드, 펩티드 모방체, 단백질 또는 단백질 모방체 또는 이들의 임의의 혼합물이다.
적절한 개질제 분자의 선택에 의해서 개질할 생체고분자의 원하는 특성을 얻을 수 있다. 예를 들면, 금속 이온과 착물을 형성하는 트리펩티드인 글루타티온의 분자를 고분자의 단량체 단위에 부착함으로써 금속 이온을 킬레이트화하는 키토산의 능력을 현저히 증가시킬 수 있다. 적절한 개질제의 선택은 용해도, 수중 현탁 후 pH 값뿐 아니라 살진균 및 살박테리아 특성과 같은 생체고분자의 많은 특성에 영향을 줄 수 있다.
본 발명에 따른 글루타티온으로 개질시킨 키토산의 합성 방법은 반응성 아민 또는 카르복실기의 존재를 특징으로 하는 시판 키토산 또는 또 다른 불용성 생체고분자와 개질제 분자, 예를 들면 펩티드를 이용한다.
본 발명에 따른 글루타티온으로 개질시킨 키토산의 합성 방법에서, 본 발명의 목적을 위해 설계한 합성 전략에 따라 또한 최적화된 조건에서 2-데옥시-2-아미노글루코오스가 키토산의 구조를 형성하는 단량체인 폴리(2-데옥시-2-아미노글루코오스) 분자의 아민기와 글루타티온의 가용 카르복실기 중 하나 사이에 펩티드 결합을 형성한다. 실시예 1에 기재되어 있는 과정에 따라 보호된 아민 작용기와의 반응에서 Fmoc-글루타티온을 사용한다. 상기 펩티드 결합 형성을 위해 적용된 과정은 실시예 2에 기재되어 있다.
본 발명에 따른 방법에서는 마이크로파 장에서의 결합 반응을 이용하여 새로운 유도체를 합성하였다. 마이크로파는 생체고분자의 아민기를 추가로 활성화시키고 또한 그의 구조에 영향을 주어 고분자의 작용기에 대한 개질제 분자의 접근을 용이하게 한다.
마이크로파는 본 발명에 따른 펩티드 결합 형성 방법에서 필수적인 역할을 한다. 마이크로파 장에서 펩티드 결합의 생성은 반응 수율을 유의적으로 증가시켰고(0.3% 내지 30%로 100배) 동시에 반응시간을 줄였다(450분에서 20분으로). 또한 어렵고 비용이 많이 드는 개질제 분자의 아민기 보호 단계를 피하는데 도움이 된다.
반응의 제1단계에서는 상기 생체고분자를 마이크로파 장에서 크게 활성화시켜 생체고분자의 작용기를 개질제의 작용기보다 훨씬 더 활성이 되게 한다. 다음, 상기 개질제 분자를 생체고분자의 적절한 작용기와 결합시키고 상기 개질제 분자를 기질에 부착시킨다. 보호되지 않은 개질제의 분자로 구성된 이량체, 삼량체 또는 더 나아가 다량체 생성물의 형성은 있을 수 있는 부반응이다. 이러한 반응은 생체고분자를 미리 활성화하여 방지하였는데, 이는 개질제 분자와 생체고분자의 반응을 우선적으로 이루어지도록 하였다. 이러한 활성화는 개질제 분자의 아민기가 플루오레닐메톡시카르보닐 클로라이드로 보호되는 것을 방지하여 아민기를 보호하고 커플링 반응 후 보호기를 제거하는 2개의 반응단계를 배제하였다. 이는 반응비용을 크게 감소시키고 또한 본 발명에 녹색 화학 양상을 제공한다. 생체 적합한 고분자, 생분해성 개질제, 일반적인 활성제와 휘발성 용매를 사용하여 실시하는 상기 반응에서는 환경적으로 유해한 플루오레닐메톡시카르보닐 클로라이드를 더 이상 사용하지 않는다.
상기 생체고분자인 키토산은 비독성 화합물이므로 이를 사용하면 산업적 규모에서도 환경오염을 일으키지 않는다. 생체적합성은 상기 고분자의 중요한 특성이다. 상기 고분자의 다른 장점은 그의 단위(mers) 각각에 아민기가 존재함으로 인하여 접착성과 흡수성이 높고 화학적 반응성과 금속 이온을 킬레이트화하는 능력이 높다는 점이다. 수성 환경에서 상기 고분자는 금속이온과 상호작용하여 배위 결합을 형성한다. 상기 고분자는 많은 공간 형태(spatial conformation)를 취하는 능력으로 인해 구조 내에 금속이온을 둘러쌀 수도 있다. 또한 키토산의 분명한 장점은 개질제 분자를 부착하기 위한 비독성이면서 환경친화적인 기질 역할을 하는 특성이다.
생체고분자의 특성 조절, 특히 금속 결합 강도 및/또는 선택성 증가에 관한 특성 조절은 예를 들면 화장품 산업, 약학과 환경보호에 있어서 개질 생체고분자의 광범위한 다양한 용도를 가능하게 한다.
본 발명의 일 구현예는 키토산에 글루타티온을 부착하는 것이다. 바람직한 구현예에 있어서, 상기 합성은 마이크로파 장을 이용하여 실시한다. 이를 위해 적절한 반응 용기와 마이크로파 반응기를 이용할 수 있다. 고분자의 작용기를 활성화하기에 충분한 기간, 바람직하게는 1-30분 동안 25-100℃와 전력 P=10-50 W에서 키토산을 마이크로파로 처리한다.
바람직한 구현예에 있어서, DCC와 HOPfp로 키토산의 작용기를 활성화한다. 또 다른 바람직한 구현예에 있어서, 작용기의 활성화 후 키토산을 Fmoc에 의해 보호되지 않은 글루타티온과 접촉시키고 얻어진 반응 혼합물을 다시 적절한 온도에서 필요한 시간 동안 마이크로파로 처리한다. 바람직한 구현예에 있어서, 키토산을 적어도 2회 마이크로파로 처리한다. 바람직하게는, 마이크로파 노출은 1-20분 동안 지속하고 전력은 10-25 W 범위이며 반응은 20-70℃에서 일어난다. 원심분리와 동결건조와 같은 표준 과정에 따라 생성물을 회수한다.
또 다른 바람직한 구현예에 있어서, 마이크로파 장에서 HBTU, HOBT와 DIPEA를 사용하여 키토산에 글루타티온을 부착시킨다. 키토산 작용기를 활성화하도록 노출 시간, 전력과 온도를 선택한다.
바람직한 구현예에 있어서, 현탁액 형태로 존재하는 생성물을 원심분리하고 상청액은 기울여서 버린다. 얻어진 개질 생체고분자를 새로운 분량의 DMF로 적어도 1회, 바람직하게는 2회 또는 3회 세척하고 원심분리한다. 바람직하게는 이 과정을 메틸렌 클로라이드를 사용하여 반복한다.
본 발명의 다른 바람직한 구현예에 있어서, 마이크로파 장에서 HBTU, HOBT와 DIPEA를 사용하여 키토산에 바시트라신 또는 티카르실린을 부착시킨다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 개질 키토산은 금속이온, 바람직하게는 니켈 또는 다른 중금속 이온을 포획한다.
도면상의 구체적인 구현예를 토대로 본 발명의 방법을 더욱 상세하게 설명한다:
도 1은 펩티드 결합 형성 조건에서 개질제 분자에 의한 키토산 개질의 반응도를 보여주고 있다.
도 2는 Fmoc-Cl과 글루타티온의 결합 반응에서 얻어지는 9-플루오레닐메톡시카르보닐-글루타티온의 ESI-MS 스펙트럼을 보여주고 있다.
도 3은 50 mM 염화니켈(II) 용액과 접촉해 있는 시판 키토산(A)과 글루타티온-개질 키토산(A[GSH])의 거동을 비교하여 보여주고 있다. (A)로 표시된 시험관 내 침전물은 갈색이고 (A[GSH])로 표시된 시험관 내 침전물은 녹색이다. 비개질 키토산과의 니켈 착물은 녹색인 반면에, 글루타티온-개질 키토산과의 니켈 착물은 갈색이다.
도 4는 시판 키토산(A)과 글루타티온-개질 키토산(A[GSH])의 니켈 결합능을 비교하여 나타낸 그래프를 보여주고 있다.
실시예
이하 실시예를 제공한다. 그러나 개시 및 청구하고 있는 발명은 그의 적용에 있어서 특정 실험, 결과와 실험 과정에 한정되지 않는 것으로 이해되어야 한다. 오히려 실시예는 다양한 구현예 중 하나로서 제공될 뿐 포괄적이지 않고 예시적인 것으로 의도된다.
실시예 1
9- 플루오레닐메톡시카르보닐 -글루타티온의 합성
200 ml 3구 플라스크 내 26 ml의 디옥산과 68 ml의 10% NaC03의 혼합물에 3 g의 글루타티온(10 mmoles)을 혐기성 조건에서 용해하였다. 적하 깔때기, 교반 자석, 아르곤 풍선과 버블러가 구비된 플라스크를 자기 교반기 위에 설치하였다. 2.71 g의 Fmoc-Cl(10.5 mmoles)을 26 ml의 디옥산에 용해하고 15분에 걸쳐 서서히 적가하였다. 첨가하는 동안 얼음조에서 반응을 유지하였다. 다음, 얼음조를 제거하였다. 반응을 10시간 동안 아르곤 하에서 진행시키는 동안 ESI-MS에 의해 그 진행을 관찰하였다. 다음, 용액을 pH
Figure pct00001
3으로 산성화하였다. 형성된 침전물을 Schott 깔때기 상에서 분리하였다. 남아있는 용액을 상당량의 침전물이 형성될 때까지 증발시켰다. 이 침전물을 Schott 깔때기 상에서 분리하고 증류수로 세척하였다. 분자량이 529.17 g/몰인 Fmoc-글루타티온을 얻었다(도 2).
실시예 2
키토산에 글루타티온의 부착
0.68 g의 키토산을 고상 펩티드 합성용 반응기에 넣었다. 3 g의 Fmoc-글루타티온(3몰 당량)을 20 ml의 DMF에 용해하였다. 이 용액에 2.14 g(3몰 당량)의 HBTU, 1.29 g(3몰 당량)의 HOBt와 1.98 ml(6몰 당량)의 DIPEA를 첨가하였다. 시약들을 혼합하고 키토산을 함유한 반응기에 첨가하였다. 혼합물을 2.5시간 동안 실험실용 진탕기에서 반응시켰다. 이 과정을 3회 반복하였다. 다음, 용액을 여과하고 잔류 생체고분자를 DMF로 3회 세척하였다. 글루타티온으로부터 Fmoc 보호기를 제거하기 위해서 DMF 중 20% 피페리딘 용액을 2회 첨가한 후, 20분 동안 진탕하였다. Fmoc기를 제거한 후, 생체고분자를 DMF로 3회 세척하였다. DMF 용액을 흡인하고 글루타티온을 가진 생체고분자를 증류수에 현탁하여 동결건조하였다. 원소분석에 의해 측정한 반응 수율 Y는 <0.3%이었다.
실시예 3
방법 1에 따라 DCC와 HOPfp를 사용하여 마이크로파 장에서 키토산에 글루타티온의 부착
고상 펩티드 합성용 반응기에 5 ml의 2:1 DMF:H2O 혼합물 내 현탁시킨 2.27 g의 키토산을 첨가하고 마이크로파로 처리하였다(t=5분, P=25 W, T=75℃). 0.613 g의 HOPfp와 0.687 g의 DCC를 5 ml의 2:1 DMF:H2O 혼합물에 용해시키고 반응기에 첨가하였다. 얻어진 키토산과 활성제의 혼합물을 마이크로파의 작동에 의해 처리하여(t=5분, P=25 W, T=75℃) 고분자의 작용기를 활성화하였다. 다음, 5 ml의 DMF 중 0.568 g의 글루타티온(유리 분자, Fmoc로 보호되지 않음)을 용기에 첨가하고 마이크로파로 2회 처리하였다(t=5분, P=12 W, T<50℃). 현탁액을 원심분리 용기에 첨가하여 원심분리하였다. 상청액은 기울여서 버렸다. 얻어진 개질 생체고분자를 새로운 분량의 DMF에 3회 현탁한 다음, 원심분리하고 기울여서 버렸다. 이 과정을 메틸렌 클로라이드를 사용하여 반복하였다. 메틸렌 클로라이드로 3회 세척한 후, 침전물을 액체질소에서 동결시켜 동결건조하였다. 동결건조한 침전물을 증류수로 3회 세척하고 재차 동결건조하였다. 원소분석 결과 황이 존재하고 이에 따라 고분자에 글루타티온이 부착하여 존재한다는 것을 알 수 있었다. 원소분석에 의해 측정한 반응 수율 Y는 23%이었다.
실시예 4
방법 2에 따라 HBTU , HOBT와 DIPEA를 사용하여 마이크로파 장에서 키토산에 글루타티온의 부착
고상 펩티드 합성용 반응기에 5 ml의 DMF 내 현탁시킨 2.27 g의 키토산을 첨가하고 마이크로파의 작동에 의해 처리하였다(t=5분, P=25 W, T=75℃). 5 ml의 DMF 중 2.14 g의 HBTU, 1.29 g의 HOBT와 1.98 ml의 DIPEA을 반응 용기에 첨가하였다. 얻어진 키토산과 활성제의 혼합물을 마이크로파의 작동에 의해 처리하여(t=5분, P=25 W, T=75℃) 고분자의 작용기를 활성화하였다. 다음, 5 ml의 DMF 중 0.568 g의 글루타티온(유리 분자, Fmoc로 보호되지 않음)을 용기에 첨가하고 마이크로파의 작동에 의해 2회 처리하였다(t=5분, P=12 W, T<50℃). 현탁액을 원심분리 용기에 첨가하여 원심분리하였다. 상청액은 기울여서 버렸다. 얻어진 개질 생체고분자를 새로운 분량의 DMF에 3회 현탁한 다음, 원심분리하고 기울여서 버렸다. 이 과정을 메틸렌 클로라이드를 사용하여 반복하였다. 메틸렌 클로라이드로 3회 세척한 후, 침전물을 액체질소에서 동결시켜 동결건조하였다. 동결건조한 침전물을 증류수로 3회 세척하고 재차 동결건조하였다. 원소분석에 의해 측정한 반응 수율 Y는 30%이었다.
실시예 5
방법 2에 따라 HBTU , HOBT와 DIPEA를 사용하여 마이크로파 장에서 키토산에 바시트라신의 부착
5 ml의 DMF에 현탁시킨 2.27 g의 키토산을 고상 펩티드 합성용 반응 용기에 넣고 마이크로파의 작동에 의해 처리하였다(t=5 분, P=25 W, T=75℃). 5 ml의 DMF 중 2.14 g의 HBTU, 1.29 g의 HOBT와 1.98 ml의 DIPEA를 반응 용기에 첨가하였다. 얻어진 키토산과 활성제의 혼합물을 마이크로파로 처리하여(t=5분, P=25 W, T=75℃) 고분자의 작용기를 활성화하였다. 다음, 5 ml의 1:1 DMF:H20 혼합물에 용해시킨 2.630 g의 바시트라신을 용기에 첨가하고 마이크로파의 작동에 의해 2회 처리하였다(t=5분, P=12 W, T<50℃). 현탁액을 원심분리 용기로 옮겨 원심분리하였다. 상청액은 기울여서 버렸다. 얻어진 개질 생체고분자를 새로운 분량의 DMF에 3회 현탁한 다음, 원심분리하고 기울여서 버렸다. 이 과정을 메틸렌 클로라이드를 사용하여 반복하였다. 메틸렌 클로라이드로 3회 세척한 후, 침전물을 액체질소에서 동결시켜 동결건조하였다. 동결건조한 침전물을 증류수로 3회 세척하고 재차 동결건조하였다. 원소분석에 의해 측정한 반응 수율 Y는 44%이었다.
실시예 6
방법 2에 따라 HBTU , HOBT와 DIPEA를 사용하여 마이크로파 장에서 키토산에 티카르실린의 부착
5 ml의 DMF에 현탁시킨 2.27 g의 키토산을 고상 펩티드 합성용 반응 용기에 넣고 마이크로파의 작동에 의해 처리하였다(t=5 분, P=25 W, T=75℃). 5 ml의 DMF 중 2.14 g의 HBTU, 1.29 g의 HOBT와 1.98 ml의 DIPEA를 반응 용기에 첨가하였다. 얻어진 키토산과 활성제의 혼합물을 마이크로파로 처리하여(t=5분, P=25 W, T=75℃) 고분자의 작용기를 활성화하였다. 다음, 5 ml의 1:1 DMF:H20 혼합물에 용해시킨 0.792 g의 티카르실린을 용기에 첨가하고 마이크로파의 작동에 의해 2회 처리하였다(t=5분, P=12 W, T<50℃). 현탁액을 원심분리 용기로 옮겨 원심분리하였다. 상청액은 기울여서 버렸다. 얻어진 개질 생체고분자를 새로운 분량의 DMF에 3회 현탁한 다음, 원심분리하고 기울여서 버렸다. 이 과정을 메틸렌 클로라이드를 사용하여 반복하였다. 메틸렌 클로라이드로 3회 세척한 후, 침전물을 액체질소에서 동결시켜 동결건조하였다. 동결건조한 침전물을 증류수로 3회 세척하고 재차 동결건조하였다. 원소분석에 의해 측정한 반응 수율 Y는 18%이었다.
실시예 7
니켈(II) 이온에 결합하는 키토산과 글루타티온 개질 키토산의 능력 비교
비개질 시판 키토산의 양 35 mg과 본 발명에 따라 얻은 글루타티온 개질 키토산의 양 35 mg을 2개의 시험관에 분리하여 분배한 후 1 ml의 50 mM 염화니켈(II) 용액을 첨가하였다. 비개질 키토산의 경우에 고분자가 녹색으로 변하고 글루타티온 개질 키토산의 경우에는 갈색으로 변하는 변색과 함께 염화니켈(II) 용액이 담록색으로 변하는 것이 관찰되었다(도 3). 시험관의 바닥에는 침전물이 가라앉아 위에는 투명한 무색 상청액이 남았다. 상청액 내 Ni(II) 함량은 그의 유색 DTT 착물을 이용하여 분광 광도법에 의해 측정하였다. 용액 내 Ni(II)의 농도 변화는 도 4에 나타나 있다.
실시예 8
금속이온, 특히 니켈(II) 이온에 대한 글루타티온 개질 키토산의 차단 활성
본 실험을 위해 설계하고 3D 프린터를 이용하여 제작한 3개의 원소로 구성된 용기에 2층의 투석막을 설치하였다. 상기 용기를 10 ml의 탈이온수와 자기 교반기를 함유한 25 ml 비이커에 넣었다. 상기 장치를 자기 교반기 위에 위치시키고 대조 실험으로서 이용하였다. 2개의 동일한 추가 용기 안에 81 mg의 시판 키토산 또는 본 발명에 따른 글루타티온 개질 키토산 81 mg을 투석막 층 사이에 위치시켰다. 0.5 ml의 100 mM 염화니켈(II) 용액을 각 용기의 내부 실린더 안에 위치시키고 용기는 각각 10 ml의 탈이온수를 함유한 25 ml 비커에 위치시켰다. 모든 장치를 24시간 동안 교반하여 Ni2 + 이온을 투석막과 상기 막 사이에 존재하는 키토산 또는 개질 키토산의 층을 통해 확산시켰다. 다음, 각각의 비커 내 수용액에 존재하는 Ni2 + 농도를 측정하였다. 2개의 고분자는 대조군보다 거의 8배 낮은 금속이온 농도가 검출되어 차단작용을 입증하였다. 결과를 도 1에 나타내었다. 표 1의 마지막 단의 결과는 실시예 4에 주어진 반응 수율(Y) 30%를 기준으로 계산하였다.
표 1: 용액 중 Ni 2 + 이온의 농도에 대한 분광 광도 분석 결과
시험 번호 465 nm에서 흡수 용액 중 Ni2 + 농도[mM] 용액 대 대조군 내 Ni2+ 고분자 단위 당 Ni2+ [몰/몰]
대조군
 1 0.62 4.8 100% 0
2 0.62 4.8 100% 0
생체고분자
(0.455 mmol)		 1 0.03 0.6 13% 0.092
2 0.03 0.6 13% 0.092
개질 생체고분자
(0.306 mmol)		 1 0.07 0.8 17% 0.131
2 0.07 0.8 17% 0.131
바탕 1 0.00 0.00 0% 0
상기 표 1은 키토산 유도체의 존재가 용액으로의 Ni2 + 이온의 확산을 현저히 감소시키고 키토산 유도체가 Ni2 + 포획에 있어서 키토산 자체보다 40% 넘게 더 강력하다는 것을 명확하게 보여주고 있다. 본 발명에 따른 키토산 유도체를 유효 성분으로서 함유하는 화장료 조성물은 유사한 특성을 가져 조성물을 피부 위에 올려놓은 후 감응 이온의 접근을 제한한다.
본 발명의 산업적 용도예
새로운 물질(글루타티온 개질 키토산)의 사용은 수용액으로부터 금속 회수를 효과적이면서 단순화한다. 키토산의 임의의 원하는 개질제 분자의 사용은 생체고분자의 생체적합성과 비독성을 유지하면서 생체고분자의 금속 킬레이트화 특성 제어를 위한 기회를 제공한다.
피부염 치료에 사용되는 항생제와 같이 개질제 분자를 부착하기 쉬운 키토산 또는 다른 생체 적합한 생체고분자의 사용은 피부학적 용도의 새로운 물질을 얻기 위한 기반을 제공한다.
항미생물제, 창상 치유와 청소년 여드름 방지를 돕는 락토비온산과 UVB광으로부터 보호하기 위해 사용되는 p-아미노벤조산으로서 화장품 산업에서 광범위하게 사용되고 있는 펩티드 LL-37은 이러한 개질제 리스트에 포함시킬 수 있다.
도면 번역
도 1에서
Modifier compound: 개질제 화합물
도 4에서
Nickel(II) solution: 니켈(II) 용액

Claims (25)

  1. 반응성 아민 또는 카르복실기를 함유한 불용성 생체고분자의 유도체로서, 상기 유도체가 펩티드 결합 형성과 함께 개질제 분자에 의해 개질되어 있는 것을 특징으로 하는 유도체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 생체고분자가 다당류/올리고당, 바람직하게는 키토산인 유도체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 펩티드 결합이 폴리(2-데옥시-2-아미노글루코오스)의 단위의 아민기와 개질제 분자의 가용 카르복실기 사이에 존재하는 유도체.
  4. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 카르복실기 함유 개질제 분자가 카르복시산, 아미노산, 아미노산 유사체, 디펩티드, 트리펩티드, 테트라펩티드, 길이가 긴 펩티드, 펩티드 모방체, 단백질과 단백질 모방체로부터 선택되거나 또는 이들의 임의의 혼합물인 유도체.
  5. 반응성 아민 또는 카르복실기를 함유한 생체고분자 내 단위의 아민 또는 카르복실기와 부착할 개질제 분자의 가용 카르복실 또는 아민기 중 하나 사이에 펩티드 결합을 형성하는 것을 포함하는 불용성 생체고분자 유도체를 합성하기 위한 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    a) 개질제 분자를 적절한 용매, 바람직하게는 디옥산 중에서 Fmoc-Cl과 반응시키고;
    b) 상기 Fmoc-개질제 분자를 용매, 바람직하게는 DMF에 용해시키고 HBTU, HOBt와 DIPEA가 존재하는 상태에서 Fmoc-개질제 분자를 생체고분자와 반응시키고;
    c) Fmoc기를 제거하여 상기 개질제 분자를 탈보호하고
    d) 상기 개질제 분자가 부착되어 있는 생체고분자를 증류수에 현탁시키고 동결건조시키는 것을 포함하는 방법.
  7. 제5항에 있어서, 마이크로파 장을 이용하여 폴리(2-데옥시-2-아미노글루코오스)의 단위의 아민기와 개질제 분자 사이에 펩티드 결합을 형성하는 것을 포함하는 방법.
  8. 제5항에 있어서, 상기 Fmoc 보호된 분자를 수득하는 단계를 생략할 수 있는 방법.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서,
    a) 생체고분자를 적절한 용매에서 마아크로파로 처리하고,
    b) 활성제를 첨가하여 상기 생체고분자의 작용기를 활성화하고,
    c) 보호되지 않은 개질제 분자를 첨가하고,
    d) 상기 반응 혼합물을 마이크로파로 처리하고,
    e) 수득한 개질 생체고분자를 세척 및 동결건조하는 것을 포함하는 방법.
  10. 제7항 내지 제9항에 있어서, 상기 활성제가 DCC와 HOPfp이거나 HBTU, HOBT와 DIPEA인 방법.
  11. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 마이크로파 처리를 1-30분 동안 계속하는 방법.
  12. 제5항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생체고분자가 키토산이고/또는 상기 개질제 분자가 카르복시산, 아미노산, 아미노산 유사체, 디펩티드, 트리펩티드, 테트라펩티드, 길이가 긴 펩티드, 펩티드 모방체, 단백질 또는 단백질 모방체 중 적어도 하나이거나 이들의 혼합물이고, 상기 트리펩티드 분자가 글루타티온인 방법.
  13. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 생체고분자 유도체를 함유하는 화장료 또는 약학 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 연고, 크림 또는 로션 형태인 조성물.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 의학용인 조성물.
  16. 제13항 내지 제15항에 있어서, 중금속, 바람직하게는 팔라듐, 코발트, 크롬, 금과 니켈로 인한, 특히 니켈과의 피부 접촉으로 인한 알레르기의 증상을 예방하는데 사용하기 위한 조성물.
  17. 제13항 내지 제16항에 있어서, 상기 조성물이 추가 생체고분자, 바람직하게는 생체고분자로서 금속 결합 단백질을 함유하는 조성물.
  18. 제1항 내지 제4항에 있어서, 금속, 특별히 중금속, 특히 니켈과의 접촉으로 인한 피부 알레르기의 증상을 예방하는데 사용하기 위한 키토산 유도체.
  19. 의약품 또는 화장품에서 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 생체고분자 유도체의 용도.
  20. 중금속 알레르기의 증상을 예방 또는 완화하기 위한 제1항 또는 제2항의 키토산 유도체 및/또는 키토산의 용도.
  21. 제20항에 있어서, 니켈 알레르기의 증상을 예방 또는 완화하기 위한 용도.
  22. 제18항 내지 제21항에 있어서, 상기 조성물이 추가 생체고분자, 바람직하게는 생체고분자로서 금속 결합 단백질을 함유하는 용도.
  23. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 생체고분자 유도체를 함유하는 개질제 분자 부착용 기질.
  24. 산업 및 생활 폐기물을 정제하기 위한 방법으로서, 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 생체고분자 유도체를 상기 폐기물에 접촉시켜 오염물질을 봉입하고 오염물질이 봉입된 상기 생체고분자 유도체를 분해하는 방법.
  25. 금속을 회수하기 위한 방법으로서, 금속 이온을 함유한 물질을 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 생체고분자 유도체와 접촉시키는 방법.
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