CN113521110B - 一种缓释抗逆性益生菌晶球及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种缓释抗逆性益生菌晶球及其制备方法，包括从内至外依次设置的益生菌内芯层、缓释层、抗逆层和保护层；其中，益生菌内芯层为球形结构，缓释层、抗逆层和保护层依次包覆在益生菌内芯层的表面。将所述缓释层的材料、所述抗逆层的材料和所述保护层的材料依次通过锅包衣法对益生菌内芯层进行包裹，得到缓释抗逆性益生菌晶球。本发明制备了一种具有更好抗逆性的益生菌晶球膜材料，该抗逆膜能够更好的保护其内的益生菌，使其在使用时免受消化道中胃酸、胆盐及胰液等的破坏失活，从而发挥出理想的功效。

Description

一种缓释抗逆性益生菌晶球及其制备方法
技术领域
本发明涉及益生菌晶球领域，具体涉及一种缓释抗逆性益生菌晶球及其制备方法。
背景技术
自从1908年诺贝尔医学奖得主俄国微生物学家迈克尼可夫(Elie Metchnikoff)的研究确认乳酸菌的保健效果，越来越多的益生菌功效与研究也随后陆续被发表与证实，口服摄入益生菌来维持肠道菌丛菌相，对人体健康有相当大的正面效果。
然而对于绝大部分的益生菌而言，普遍存在容易受到环境影响，经口服后，易受到消化道中胃酸、胆盐及胰液等的破坏失活，无法有效发挥其理想功效。因此，能够提高益生菌在不良环境中存活率方法或技术是非常重要的，以此来增加最终到达小肠末端及大肠定殖的活性益生菌的数量，保证益生菌进入肠道后益生功能的发挥。
发明内容
为了解决现有技术中存在的益生菌产品易受到消化道中胃酸、胆盐及胰液等的破坏失活，无法有效发挥其理想功效的问题，本发明的目的是提供一种缓释抗逆性益生菌晶球。
本发明的目的采用以下技术方案来实现：
第一方面，本发明提供了一种缓释抗逆性益生菌晶球，包括从内至外依次设置的益生菌内芯层、缓释层、抗逆层和保护层；其中，益生菌内芯层为球形结构，缓释层、抗逆层和保护层依次包覆在益生菌内芯层的表面。
优选地，所述缓释层、所述抗逆层、所述保护层与所述益生菌内芯层的质量比为0.1～1:0.5～1.6:0.2～0.8:10。
优选地，所述益生菌内芯层由益生菌发酵液和溶胀材料复合后经过冷冻干燥而成，其中，益生菌发酵液和溶胀材料的质量比为1～10:1。
优选地，所述益生菌发酵液包括益生菌、益生元和纯净水混合而成，其中，益生菌和益生元的质量比为1:0.2～0.8，益生菌的浓度不小于109CFU/mL。
优选地，所述益生菌的菌种包括芽孢杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌、双歧杆菌、格氏乳杆菌、嗜热链球菌、乳酸乳球菌中的至少一种。
优选地，所述益生元为低聚糖。
优选地，所述益生元包括低聚果糖、异麦芽酮糖、异麦芽酮糖醇、低聚异麦芽糖、低聚乳果糖、低聚半乳糖、低聚木糖中的至少一种。
优选地，所述益生菌的菌种包括芽孢杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌、双歧杆菌，其中，芽孢杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌和双歧杆菌的质量比值为1:0.4～0.8:0.5～1:0.8～1.2。
优选地，所述溶胀材料包括淀粉、纤维素、明胶中的至少一种。
优选地，所述缓释层包括甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、聚甲基丙烯酸酯、乙烯-醋酸乙烯共聚物中的至少一种。
优选地，所述保护层为人工甜味剂和/或天然甜味剂。
优选地，所述人工甜味剂包括阿斯巴甜、安赛蜜、三氯蔗糖、木糖醇中的至少一种，所述天然甜味剂包括甜叶菊提取物、赤藓糖醇、甘草甜素、甘草酸二钠、甘草酸三钠中的至少一种。
优选地，所述抗逆层由改性壳聚糖材料制备得到。
优选地，所述改性壳聚糖的制备方法为：
M1.称取壳聚糖粉末分散至N,N-二甲基甲酰胺中，得到壳聚糖混液；其中，壳聚糖粉末与N,N-二甲基甲酰胺的质量比为3～6:100；
M2.称取L-丙氨酰-L-酪氨酸溶于N,N-二甲基甲酰胺中，得到L-丙氨酰-L-酪氨酸溶液，其中，L-丙氨酰-L-酪氨酸与N,N-二甲基甲酰胺的质量比为0.25～0.5:10；称取对-苯乙烯磺酰氯溶于四氢呋喃中，得到对-苯乙烯磺酰氯溶液，其中，对-苯乙烯磺酰氯与四氢呋喃的质量比为0.2～0.4:10；
M3.将L-丙氨酰-L-酪氨酸溶液置于冰水浴条件下，先滴加二异丙基乙胺并搅拌处理0.2～0.5h，再滴加对-苯乙烯磺酰氯溶液，在惰性气体的保护下升温至室温，在室温下持续搅拌反应5～8h，之后依次经过萃取、浓缩和干燥，得到磺胺化L-丙氨酰-L-酪氨酸；其中，二异丙基乙胺、L-丙氨酰-L-酪氨酸溶液中的L-丙氨酰-L-酪氨酸与对-苯乙烯磺酰氯溶液中的对-苯乙烯磺酰氯的摩尔比为0.02～0.06:1.05～1.1:1；
M4.将磺胺化L-丙氨酰-L-酪氨酸加入至壳聚糖混液中，充分搅拌后加入催化剂，在惰性气体作为保护气的条件下升温至55～75℃，反应5～8h后，待反应液冷却后，依次经过过滤、洗涤和干燥，得到改性壳聚糖；其中，催化剂、磺胺化L-丙氨酰-L-酪氨酸与壳聚糖混液的质量比为0.08～0.1:2.3～4.6:100。
优选地，所述壳聚糖的分子量为100～300kDa，脱乙酰度为30％～80％。
优选地，所述对-苯乙烯磺酰氯溶液是对-苯乙烯磺酰氯溶于四氢呋喃中得到的浓度为0.2mol/L的溶液。
优选地，步骤M3中，所述萃取是使用纯净水进行萃取，萃取3～5次后收集水相萃取液，所述浓缩是将水相萃取液在旋蒸仪上蒸发至不流动状态，所述干燥是在干燥箱内进行冷冻干燥。
优选地，步骤M4中，催化剂为三氯化钌。
优选地，步骤M4中，所述干燥是在干燥箱内进行冷冻干燥。
第二方面，本发明提供了一种缓释抗逆性益生菌晶球的制备方法，包括以下步骤：
N1.将益生菌发酵液和溶胀材料混合，搅拌均匀后，使用模具或机器压制成球状，置于冷冻干燥箱内干燥，得到所述益生菌内芯层；
N2.将所述缓释层的材料、所述抗逆层的材料和所述保护层的材料依次通过锅包衣法对益生菌内芯层进行包裹，得到缓释抗逆性益生菌晶球。
优选地，所述锅包衣法是通过将需要包覆的材料制备成包衣液，然后将需要被包覆的材料于包衣锅内滚动，经过包衣液均匀包裹后，干燥后得到产品。
本发明的有益效果为：
本发明相比较于现有技术，最大的优势在于制备了一种具有更好抗逆性的益生菌晶球膜材料，该抗逆膜能够更好的保护其内的益生菌，使其在使用时免受消化道中胃酸、胆盐及胰液等的破坏失活，从而发挥出理想的功效。同时，本发明制备的缓释抗逆性益生菌晶球具有更长的产品存储期，能够延缓益生菌的失效时间。
壳聚糖是一种重要的天然高分子化合物，具有独特的生理功能特性，安全、无毒，与生物体有良好的生物相容性，可被生物降解，因此具有较大的开发利用价值。本发明的思路是：基于壳聚糖具有在碱液以及强酸中不溶的特点，将其作为抗逆层用于抵抗消化道中胃酸、胆盐及胰液的作用，使其包覆的益生菌能够最终完全到达肠道，从而作用于肠道。然而由壳聚糖制成的膜伸长率较小，脆性比较大，成膜性差，因此在应用作为包覆材料时受到较大的限制，在壳聚糖的成膜过程中往往需要添加一定的成膜助剂控制成膜条件，才能有助于成膜。
本发明最终制备得到的改性壳聚糖相比较于未改性的壳聚糖具有更好的成膜性，可能的原因是壳聚糖在改性后平均分子量增大，聚合物的分子排列更加紧密，高分子链间的作用加强，分子间的氢键作用也得到了加强，从而使成膜性得到增强。同时，在本发明的检测中，改性壳聚糖在抵抗消化道中胃酸、胆盐及胰液的作用中表现优异。
改性壳聚糖的制备过程为：本发明使用丙酪二肽(L-丙氨酰-L-酪氨酸)与磺酰氯化合物(对-苯乙烯磺酰氯)发生反应，得到含有双键结构的磺胺类化合物单体(磺胺化L-丙氨酰-L-酪氨酸)，然后将双键结构的磺胺类化合物单体与壳聚糖结合，双键结构在壳聚糖的表面聚合接枝形成聚合物，即得到含有肽键以及磺胺基团的聚合物接枝的壳聚糖，即改性壳聚糖。
具体实施方式
为了更清楚的说明本发明，对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现对本发明的技术方案进行以下详细说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。
本发明所使用的L-丙氨酰-L-酪氨酸的结构式如下：
Figure BDA0003158975060000041
本发明所使用的对-苯乙烯磺酰氯的结构式如下：
Figure BDA0003158975060000042
在本发明L-丙氨酰-L-酪氨酸与对-苯乙烯磺酰氯反应的过程中，在二异丙基乙胺作为缚酸剂的条件下，对-苯乙烯磺酰氯上的磺酰氯基团(-SO2Cl)上的氯进攻L-丙氨酰-L-酪氨酸上的胺基(-NH2)，从而形成磺胺基团，为了保护酰胺基团(-NHCO)不被破坏，本发明使用了稍过量的L-丙氨酰-L-酪氨酸，最终形成的单体磺胺化L-丙氨酰-L-酪氨酸的结构式为：
Figure BDA0003158975060000051
下面结合以下实施例对本发明作进一步描述。
实施例1
一种缓释抗逆性益生菌晶球，包括从内至外依次设置的益生菌内芯层、缓释层、抗逆层和保护层；其中，益生菌内芯层为球形结构，缓释层、抗逆层和保护层依次包覆在益生菌内芯层的表面，其中，缓释层、抗逆层、保护层与益生菌内芯层的质量比为0.6:1.2:0.5:10。
益生菌内芯层由益生菌发酵液和淀粉复合后经过冷冻干燥而成，其中，益生菌发酵液和淀粉的质量比为6:1。
益生菌发酵液包括益生菌、益生元和纯净水混合而成，其中，益生菌和益生元的质量比为1:0.5，益生菌的浓度为1×109CFU/mL。
益生元包括低聚果糖、异麦芽酮糖、异麦芽酮糖醇，其中，低聚果糖、异麦芽酮糖和异麦芽酮糖醇的质量比值为1:0.2:0.6。
益生菌的菌种包括芽孢杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌、双歧杆菌，其中，芽孢杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌和双歧杆菌的质量比值为1:0.6:0.8:1。
缓释层包括甲基纤维素、羟丙基纤维素、羧甲基纤维素钠，其中，甲基纤维素、羟丙基纤维素、羧甲基纤维素钠的质量比为1:1:0.5。
保护层包括质量比值为1:0.2:0.6:0.5的阿斯巴甜、安赛蜜、三氯蔗糖和木糖醇。
抗逆层由改性壳聚糖材料制备得到，改性壳聚糖的制备方法为：
M1.称取分子量为200kDa、脱乙酰度为65％的壳聚糖粉末分散至N,N-二甲基甲酰胺中，得到壳聚糖混液；其中，壳聚糖粉末与N,N-二甲基甲酰胺的质量比为4.5:100；
M2.称取L-丙氨酰-L-酪氨酸溶于N,N-二甲基甲酰胺中，得到L-丙氨酰-L-酪氨酸溶液，其中，L-丙氨酰-L-酪氨酸与N,N-二甲基甲酰胺的质量比为0.4:10；称取对-苯乙烯磺酰氯溶于四氢呋喃中，得到对-苯乙烯磺酰氯溶液，其中，对-苯乙烯磺酰氯与四氢呋喃的质量比为0.3:10；
M3.将L-丙氨酰-L-酪氨酸溶液置于冰水浴条件下，先滴加二异丙基乙胺并搅拌处理0.2～0.5h，再滴加0.2mol/L的对-苯乙烯磺酰氯的四氢呋喃溶液，在惰性气体的保护下升温至室温，在室温下持续搅拌反应5～8h，之后依次经过纯净水萃取3～5次后收集水相萃取液，之后在旋蒸仪上蒸发至不流动状态后置于干燥箱内进行冷冻干燥，得到磺胺化L-丙氨酰-L-酪氨酸；其中，二异丙基乙胺、L-丙氨酰-L-酪氨酸溶液中的L-丙氨酰-L-酪氨酸与对-苯乙烯磺酰氯溶液中的对-苯乙烯磺酰氯的摩尔比为0.04:1.08:1；
M4.将磺胺化L-丙氨酰-L-酪氨酸加入至壳聚糖混液中，充分搅拌后加入三氯化钌，在惰性气体作为保护气的条件下升温至55～75℃，反应5～8h后，待反应液冷却后，依次经过过滤、洗涤，之后在干燥箱内进行冷冻干燥，得到改性壳聚糖；其中，催化剂、磺胺化L-丙氨酰-L-酪氨酸与壳聚糖混液的质量比为0.09:3.5:100。
上述缓释抗逆性益生菌晶球的制备方法，包括以下步骤：
N1.将益生菌发酵液和淀粉混合，搅拌均匀后，使用模具或机器压制成球状，置于冷冻干燥箱内干燥，得到益生菌内芯层；
N2.先将缓释层的材料制备成包衣液，将益生菌内芯层于包衣锅内滚动，经过包衣液均匀包裹，待干燥后，再将抗逆层的材料制备成包衣液，将包裹了缓释层的内芯层于包衣锅内滚动，经过包衣液均匀包裹，待干燥后，再将保护层的材料制备成包衣液，将包裹了缓释层的内芯层于包衣锅内滚动，经过包衣液均匀包裹，待干燥后，得到缓释抗逆性益生菌晶球。
实施例2
一种缓释抗逆性益生菌晶球，包括从内至外依次设置的益生菌内芯层、缓释层、抗逆层和保护层；其中，益生菌内芯层为球形结构，缓释层、抗逆层和保护层依次包覆在益生菌内芯层的表面，缓释层、抗逆层、保护层与益生菌内芯层的质量比为0.1:0.5:0.2:10。
益生菌内芯层由益生菌发酵液和纤维素复合后经过冷冻干燥而成，其中，益生菌发酵液和纤维素的质量比为1:1。
益生菌发酵液包括益生菌、益生元和纯净水混合而成，其中，益生菌和益生元的质量比为1:0.2，益生菌的浓度为5×109CFU/mL。
益生菌的菌种包括芽孢杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌和双歧杆菌，其中，芽孢杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌和双歧杆菌的质量比值为1:0.4:0.5:0.8。
益生元包括低聚果糖、异麦芽酮糖、低聚乳果糖、低聚半乳糖，其中，低聚果糖、异麦芽酮糖、低聚乳果糖、低聚半乳糖的质量比为1:0.3:0.5:0.2。
缓释层包括乙基纤维素、羟丙基纤维素、聚甲基丙烯酸酯、乙烯-醋酸乙烯共聚物，其中，乙基纤维素、羟丙基纤维素、聚甲基丙烯酸酯、乙烯-醋酸乙烯共聚物的质量比为0.2:0.3:0.5:0.6。
保护层包括甜叶菊提取物、赤藓糖醇、甘草甜素，甜叶菊提取物、赤藓糖醇、甘草甜素的质量比为0.4:0.7:1。
抗逆层由改性壳聚糖材料制备得到，改性壳聚糖的制备方法为：
M1.称取分子量为100kDa、脱乙酰度为30％的壳聚糖粉末分散至N,N-二甲基甲酰胺中，得到壳聚糖混液；其中，壳聚糖粉末与N,N-二甲基甲酰胺的质量比为3:100；
M2.称取L-丙氨酰-L-酪氨酸溶于N,N-二甲基甲酰胺中，得到L-丙氨酰-L-酪氨酸溶液，其中，L-丙氨酰-L-酪氨酸与N,N-二甲基甲酰胺的质量比为0.25:10；称取对-苯乙烯磺酰氯溶于四氢呋喃中，得到对-苯乙烯磺酰氯溶液，其中，对-苯乙烯磺酰氯与四氢呋喃的质量比为0.2:10；
M3.将L-丙氨酰-L-酪氨酸溶液置于冰水浴条件下，先滴加二异丙基乙胺并搅拌处理0.2～0.5h，再滴加0.2mol/L的对-苯乙烯磺酰氯的四氢呋喃溶液，在惰性气体的保护下升温至室温，在室温下持续搅拌反应5～8h，之后依次经过纯净水萃取3～5次后收集水相萃取液，之后在旋蒸仪上蒸发至不流动状态后置于干燥箱内进行冷冻干燥，得到磺胺化L-丙氨酰-L-酪氨酸；其中，二异丙基乙胺、L-丙氨酰-L-酪氨酸溶液中的L-丙氨酰-L-酪氨酸与对-苯乙烯磺酰氯溶液中的对-苯乙烯磺酰氯的摩尔比为0.02:1.05:1；
M4.将磺胺化L-丙氨酰-L-酪氨酸加入至壳聚糖混液中，充分搅拌后加入三氯化钌，在惰性气体作为保护气的条件下升温至55～75℃，反应5～8h后，待反应液冷却后，依次经过过滤、洗涤，之后在干燥箱内进行冷冻干燥，得到改性壳聚糖；其中，催化剂、磺胺化L-丙氨酰-L-酪氨酸与壳聚糖混液的质量比为0.08:2.3:100。
上述缓释抗逆性益生菌晶球的制备方法，包括以下步骤：
N1.将益生菌发酵液和淀粉混合，搅拌均匀后，使用模具或机器压制成球状，置于冷冻干燥箱内干燥，得到益生菌内芯层；
N2.先将缓释层的材料制备成包衣液，将益生菌内芯层于包衣锅内滚动，经过包衣液均匀包裹，待干燥后，再将抗逆层的材料制备成包衣液，将包裹了缓释层的内芯层于包衣锅内滚动，经过包衣液均匀包裹，待干燥后，再将保护层的材料制备成包衣液，将包裹了缓释层的内芯层于包衣锅内滚动，经过包衣液均匀包裹，待干燥后，得到缓释抗逆性益生菌晶球。
实施例3
一种缓释抗逆性益生菌晶球，包括从内至外依次设置的益生菌内芯层、缓释层、抗逆层和保护层；其中，益生菌内芯层为球形结构，缓释层、抗逆层和保护层依次包覆在益生菌内芯层的表面，缓释层、抗逆层、保护层与益生菌内芯层的质量比为1:1.6:0.8:10。
益生菌内芯层由益生菌发酵液和明胶复合后经过冷冻干燥而成，其中，益生菌发酵液和明胶的质量比为10:1。
益生菌发酵液包括益生菌、益生元和纯净水混合而成，其中，益生菌和益生元的质量比为1:0.8，益生菌的浓度为8×109CFU/mL。
益生菌的菌种包括芽孢杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌、双歧杆菌，其中，芽孢杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌和双歧杆菌的质量比值为1:0.8:1:1.2。
益生元包括低聚果糖、异麦芽酮糖、低聚半乳糖、低聚木糖，其中，低聚果糖、异麦芽酮糖、低聚半乳糖、低聚木糖的质量比为1:0.5:0.6:0.2。
缓释层包括甲基纤维素、乙基纤维素、聚甲基丙烯酸酯、乙烯-醋酸乙烯共聚物，其中，甲基纤维素、乙基纤维素、聚甲基丙烯酸酯、乙烯-醋酸乙烯共聚物的质量比为0.5:0.3:0.2:0.6。
保护层包括三氯蔗糖、木糖醇、甘草酸二钠、甘草酸三钠,其中，三氯蔗糖、木糖醇、甘草酸二钠、甘草酸三钠的质量比为1.2:0.6:0.2:0.3。
抗逆层由改性壳聚糖材料制备得到，改性壳聚糖的制备方法为：
M1.称取分子量为200kDa、脱乙酰度为65％的壳聚糖粉末分散至N,N-二甲基甲酰胺中，得到壳聚糖混液；其中，壳聚糖粉末与N,N-二甲基甲酰胺的质量比为6:100；
M2.称取L-丙氨酰-L-酪氨酸溶于N,N-二甲基甲酰胺中，得到L-丙氨酰-L-酪氨酸溶液，其中，L-丙氨酰-L-酪氨酸与N,N-二甲基甲酰胺的质量比为0.5:10；称取对-苯乙烯磺酰氯溶于四氢呋喃中，得到对-苯乙烯磺酰氯溶液，其中，对-苯乙烯磺酰氯与四氢呋喃的质量比为0.4:10；
M3.将L-丙氨酰-L-酪氨酸溶液置于冰水浴条件下，先滴加二异丙基乙胺并搅拌处理0.2～0.5h，再滴加0.2mol/L的对-苯乙烯磺酰氯的四氢呋喃溶液，在惰性气体的保护下升温至室温，在室温下持续搅拌反应5～8h，之后依次经过纯净水萃取3～5次后收集水相萃取液，之后在旋蒸仪上蒸发至不流动状态后置于干燥箱内进行冷冻干燥，得到磺胺化L-丙氨酰-L-酪氨酸；其中，二异丙基乙胺、L-丙氨酰-L-酪氨酸溶液中的L-丙氨酰-L-酪氨酸与对-苯乙烯磺酰氯溶液中的对-苯乙烯磺酰氯的摩尔比为0.02:1.1:1；
M4.将磺胺化L-丙氨酰-L-酪氨酸加入至壳聚糖混液中，充分搅拌后加入三氯化钌，在惰性气体作为保护气的条件下升温至55～75℃，反应5～8h后，待反应液冷却后，依次经过过滤、洗涤，之后在干燥箱内进行冷冻干燥，得到改性壳聚糖；其中，催化剂、磺胺化L-丙氨酰-L-酪氨酸与壳聚糖混液的质量比为0.1:4.6:100。
上述缓释抗逆性益生菌晶球的制备方法，包括以下步骤：
N1.将益生菌发酵液和淀粉混合，搅拌均匀后，使用模具或机器压制成球状，置于冷冻干燥箱内干燥，得到益生菌内芯层；
N2.先将缓释层的材料制备成包衣液，将益生菌内芯层于包衣锅内滚动，经过包衣液均匀包裹，待干燥后，再将抗逆层的材料制备成包衣液，将包裹了缓释层的内芯层于包衣锅内滚动，经过包衣液均匀包裹，待干燥后，再将保护层的材料制备成包衣液，将包裹了缓释层的内芯层于包衣锅内滚动，经过包衣液均匀包裹，待干燥后，得到缓释抗逆性益生菌晶球。
对照例
一种缓释抗逆性益生菌晶球，包括从内至外依次设置的益生菌内芯层、缓释层、抗逆层和保护层；其中，益生菌内芯层为球形结构，缓释层、抗逆层和保护层依次包覆在益生菌内芯层的表面，其中，缓释层、抗逆层、保护层与益生菌内芯层的质量比为0.6:1.2:0.5:10。
益生菌内芯层由益生菌发酵液和淀粉复合后经过冷冻干燥而成，其中，益生菌发酵液和淀粉的质量比为6:1。
益生菌发酵液包括益生菌、益生元和纯净水混合而成，其中，益生菌和益生元的质量比为1:0.5，益生菌的浓度为1×109CFU/mL。
益生元包括低聚果糖、异麦芽酮糖、异麦芽酮糖醇，其中，低聚果糖、异麦芽酮糖和异麦芽酮糖醇的质量比值为1:0.2:0.6。
益生菌的菌种包括芽孢杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌、双歧杆菌，其中，芽孢杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌和双歧杆菌的质量比值为1:0.6:0.8:1。
缓释层包括甲基纤维素、羟丙基纤维素、羧甲基纤维素钠，其中，甲基纤维素、羟丙基纤维素、羧甲基纤维素钠的质量比为1:1:0.5。
保护层包括质量比值为1:0.2:0.6:0.5的阿斯巴甜、安赛蜜、三氯蔗糖和木糖醇。
抗逆层由分子量为200kDa、脱乙酰度为65％的壳聚糖粉末材料制备得到。
上述缓释抗逆性益生菌晶球的制备方法，包括以下步骤：
N1.将益生菌发酵液和淀粉混合，搅拌均匀后，使用模具或机器压制成球状，置于冷冻干燥箱内干燥，得到益生菌内芯层；
N2.先将缓释层的材料制备成包衣液，将益生菌内芯层于包衣锅内滚动，经过包衣液均匀包裹，待干燥后，再将抗逆层的材料制备成包衣液，将包裹了缓释层的内芯层于包衣锅内滚动，经过包衣液均匀包裹，待干燥后，再将保护层的材料制备成包衣液，将包裹了缓释层的内芯层于包衣锅内滚动，经过包衣液均匀包裹，待干燥后，得到缓释抗逆性益生菌晶球。
为了更加清楚的对本发明的内容进行说明，本发明还做了以下相关实验：
1.人工胃液配置：
称取胃蛋白酶10g、质量分数为10％的的盐酸16.4mL、氯化钠粉末2g加入至1L纯净水中，混合均匀后，等量分成4份，并使用1mol/L的盐酸将4份溶液滴定至pH分别为1.5，2.5，3.5,4.5，过0.22μm滤膜后，即完成配置。
人工肠液配置：
称取磷酸二氢钾固体6.8g加入至0.5L纯净水中，完全溶解后，使用0.1mol/L的氢氧化钠溶液滴定至pH为6.5～6.7，之后加入溶有10g胰蛋白酶的100mL水，混合均匀后，加水定容至1L，级完成配置。
相关实验：
将本发明实施例1以及对照例制得的缓释抗逆性益生菌晶球放入人工胃液中，每隔1h检测人工胃液中益生菌的数量，结果如表1所示。
将本发明实施例1以及对照例制得的缓释抗逆性益生菌晶球放入人工肠液中，每隔1h检测人工肠液中益生菌的数量，结果如表1所示。
表1益生菌的抗逆性表现
Figure BDA0003158975060000101
由上述表1可以看出，在人工胃液中，本发明实施例1所溶出的益生菌数目与对照例中的均不超过103数量级，说明本发明实施例1与对照例制备的缓释抗逆性益生菌晶球在胃液中均具有更好的抗逆性，且实施例1的抗逆性更好；在人工肠液中，本发明实施例1所溶出的益生菌数目与对照例均逐渐增大，但是对照例增大却非常显著，在第3h时达到104数量级，远远高于实施例1的结果，说明实施例1所制备的缓释抗逆性益生菌晶球的抗逆性是高于对比例的。而在人工肠液中益生菌数量多于人工胃液，有可能的原因是肠液更加适合益生菌的生存，而人工胃液因为酸性过高，益生菌较难生存。
2.本发明还将实施例1与对照例中制备的缓释抗逆性益生菌晶球分别置于浓度为0.01g/L的壳聚糖酶溶液中，控制溶液的pH为6.8～7.5,每过1个小时检测益生菌数量的变化，结果如表2所示：
表2益生菌的溶出结果
Figure BDA0003158975060000111
由上述表2可知，本发明实施例1与对照例中的益生菌溶出的结果基本上没有很大差别，说明本发明所制备的缓释抗逆性益生菌晶球能够具有较好的溶出效果。
3.本发明还检测了实施例1和对照例所制备的缓释抗逆性益生菌晶球的存储期限，将两者置于同一条件(常温)下储存，检测到存储前两者的益生菌含量约为0.9×109CFU/g，在存储180天后，再次检测两者的益生菌含量：实施例1约为0.7×109CFU/g，对照例降到了约0.3×109CFU/g，说明本发明实施例1制备的缓释抗逆性益生菌晶球具有更久的存储性能。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (4)

1.一种缓释抗逆性益生菌晶球，其特征在于，包括从内至外依次设置的益生菌内芯层、缓释层、抗逆层和保护层；其中，益生菌内芯层为球形结构，缓释层、抗逆层和保护层依次包覆在益生菌内芯层的表面；其中，抗逆层由改性壳聚糖材料制备得到；
所述改性壳聚糖的制备方法为：
M1.称取壳聚糖粉末分散至N,N-二甲基甲酰胺中，得到壳聚糖混液；其中，壳聚糖粉末与N,N-二甲基甲酰胺的质量比为3~6:100；
M2.称取L-丙氨酰-L-酪氨酸溶于N,N-二甲基甲酰胺中，得到L-丙氨酰-L-酪氨酸溶液，其中，L-丙氨酰-L-酪氨酸与N,N-二甲基甲酰胺的质量比为0.25~0.5:10；称取对-苯乙烯磺酰氯溶于四氢呋喃中，得到对-苯乙烯磺酰氯溶液，其中，对-苯乙烯磺酰氯与四氢呋喃的质量比为0.2~0.4:10；
M3.将L-丙氨酰-L-酪氨酸溶液置于冰水浴条件下，先滴加二异丙基乙胺并搅拌处理0.2~0.5h，再滴加对-苯乙烯磺酰氯溶液，在惰性气体的保护下升温至室温，在室温下持续搅拌反应5~8h，之后依次经过萃取、浓缩和干燥，得到磺胺化L-丙氨酰-L-酪氨酸；其中，二异丙基乙胺、L-丙氨酰-L-酪氨酸溶液中的L-丙氨酰-L-酪氨酸与对-苯乙烯磺酰氯溶液中的对-苯乙烯磺酰氯的摩尔比为0.02~0.06:1.05~1.1:1；
M4.将磺胺化L-丙氨酰-L-酪氨酸加入至壳聚糖混液中，充分搅拌后加入催化剂，在惰性气体作为保护气的条件下升温至55~75℃，反应5~8h后，待反应液冷却后，依次经过过滤、洗涤和干燥，得到改性壳聚糖；其中，催化剂、磺胺化L-丙氨酰-L-酪氨酸与壳聚糖混液的质量比为0.08~0.1:2.3~4.6:100；
所述缓释层、所述抗逆层、所述保护层与所述益生菌内芯层的质量比为0.1~1:0.5~1.6:0.2~0.8:10；
所述缓释层包括甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、聚甲基丙烯酸酯、乙烯-醋酸乙烯共聚物中的至少一种；
所述保护层为人工甜味剂和/或天然甜味剂；
所述益生菌内芯层由益生菌发酵液和溶胀材料复合后经过冷冻干燥而成，其中，益生菌发酵液和溶胀材料的质量比为1~10:1；
所述益生菌发酵液包括益生菌、益生元和纯净水混合而成，其中，益生菌和益生元的质量比为1:0.2~0.8，益生菌的浓度不小于109 cfu/mL；
所述溶胀材料包括淀粉、纤维素、明胶中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的一种缓释抗逆性益生菌晶球，其特征在于，所述益生菌的菌种包括芽孢杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌、双歧杆菌、格氏乳杆菌、嗜热链球菌、乳酸乳球菌中的至少一种；所述益生元为低聚糖。
3.根据权利要求1所述的一种缓释抗逆性益生菌晶球，其特征在于，所述人工甜味剂包括阿斯巴甜、安赛蜜、三氯蔗糖、木糖醇中的至少一种，所述天然甜味剂包括甜叶菊提取物、赤藓糖醇、甘草甜素、甘草酸二钠、甘草酸三钠中的至少一种。
4.权利要求1至3任意一项所述的一种缓释抗逆性益生菌晶球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
N1.将益生菌发酵液和溶胀材料混合，搅拌均匀后，使用模具或机器压制成球状，置于冷冻干燥箱内干燥，得到所述益生菌内芯层；
N2.将所述缓释层的材料、所述抗逆层的材料和所述保护层的材料依次通过锅包衣法对益生菌内芯层进行包裹，得到缓释抗逆性益生菌晶球。
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