CN116898983B - 高稳定性晶球益生菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高稳定性晶球益生菌及其应用,属于益生菌晶球领域。所述高稳定性晶球益生菌包括从内至外依次设置的益生菌内芯层、缓释层和抗逆层;其中所述抗逆层由壳聚糖儿茶素衍生物制备得到。本发明通过对益生菌晶球的常用壁材壳聚糖进行改进,得到了一种壳聚糖儿茶素衍生物,将其用于制备益生菌晶球的抗逆膜层,能够更好地保护其内的益生菌免受消化道中胃酸、胆盐及胰液等的破坏失活,从而发挥出理想的功效。同时,本发明制备的益生菌晶球具有更长的产品存储期,能够延缓益生菌的失效时间。
Description
技术领域
本发明涉及益生菌晶球领域,特别是涉及高稳定性晶球益生菌及其应用。
背景技术
益生菌泛指可在宿主肠道内定殖并改善微生态平衡、有益机体健康的一类微生物。近年来,肠道菌群对于人体健康的关键作用不断得到揭示,高效益生菌递送系统的开发成为研究热点。益生菌产品的生产、储存与运输都会造成活力损失,而在益生菌被摄入之后,仍然需要面对食物组分互作、强酸性pH环境以及各类消化酶的挑战。
为了在到达肠道前为益生菌提供必要的保护,晶球益生菌是当下的最优解。晶球益生菌一般为多层结构,以较常见的晶球益生菌产品为例,最外层一般为耐胃酸高分子材料层,保护产品通过消化道中胃酸和胆汁的侵蚀破坏,同时也具有抗氧化、减少光照破坏,提高产品货架期稳定性等作用;中间层一般是植物性材料保护层,保护益生菌和其他有效成分不被破坏;内层是有效成分缓释层,保证益生菌在肠道合适的位置释放和定植,提高益生菌产品的利用率。根据包被目的不同,也可以选择不同的结构和包被材料,典型的有两层、三层或者其他结构,起到保护内容物、遮掩改善风味以及缓释等作用。
近年来,为确保晶球益生菌的健康益处,改善其对体内消化胁迫的抵抗力,以及调控其在消化道中的控制释放的研究不断涌现。晶球益生菌的壁材是影响其加工、储存与消化稳定性的关键因素,既要满足抵抗胃酸和胆汁侵蚀破坏的作用,又要具备一定的抗氧化性以使产品稳定储存,延长货架期。因此,对晶球益生菌的壁材进行改进,以提高其对体内消化胁迫的抵抗力和抗氧化能力,对提高晶球益生菌的稳定性、延长产品货架期以及提高其产品性能具有用重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种高稳定性晶球益生菌及其应用,以解决上述现有技术存在的问题。本发明通过对益生菌晶球的常用壁材壳聚糖进行改进,得到了一种壳聚糖儿茶素衍生物,能够更好地保护其内的益生菌免受消化道中胃酸、胆盐及胰液等的破坏失活,并能够延缓益生菌的失效时间,使产品更加稳定。
为实现上述目的,本发明提供了如下方案:
本发明提供一种高稳定性晶球益生菌,其以壳聚糖儿茶素衍生物作为抗逆层制备得到。
进一步地,所述壳聚糖儿茶素衍生物的制备方法为:
S1.将壳聚糖溶于醋酸溶液后加入NaOH使壳聚糖沉淀,取所述沉淀保存于甲醇溶液中,得到壳聚糖甲醇悬浊液;所述壳聚糖与所述NaOH的质量比为1:1;
S2.将儿茶素和1-乙基-(3-二甲基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶于甲醇溶液,再加入N-羟基琥珀酰亚胺,冰水浴搅拌,得到反应液;所述儿茶素、所述1-乙基-(3-二甲基丙基)碳二亚胺盐酸盐和所述N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1:1:1;
S3.将所述反应液逐滴加入所述壳聚糖甲醇悬浊液中,经搅拌、离心、过滤和洗涤后进行冷冻干燥,获得所述壳聚糖儿茶素衍生物。
进一步地,在步骤S2中,所述搅拌的时间为60-90min。
进一步地,在步骤S3中,所述搅拌的时间为20-24h。
进一步地,在所述抗逆层的内部还包括从内至外的益生菌内芯层和缓释层。
进一步地,所述益生菌内芯层由益生菌发酵液与抗性淀粉按质量比1~5:1复合后,冷冻干燥制得;所述益生菌发酵液由益生菌种子液与益生元按质量比1~3:1混合制备。
进一步地,所述益生菌包括植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌和鼠李糖乳杆菌;所述益生元包括低聚果糖、低聚异麦芽糖、大豆低聚糖和菊糖。
进一步地,所述缓释层由酪蛋白、乳糖和麦芽糊精按质量比1:1:1制备。
本发明还提供所述的高稳定性晶球益生菌的制备方法,包括以下步骤:
T1.将益生菌发酵液和抗性淀粉混合,搅拌均匀后,干燥,得到所述益生菌内芯层;
T2.将所述缓释层的材料和所述抗逆层的材料依次对所述益生菌内芯层进行包裹,得到所述高稳定性晶球益生菌。
本发明还提供所述的高稳定性晶球益生菌在制备含有益生菌的药物中的应用。
本发明公开了以下技术效果:
本发明通过对益生菌晶球的常用壁材壳聚糖进行改进,得到了一种壳聚糖儿茶素衍生物,将其用于制备益生菌晶球的抗逆膜层,能够更好地保护其内的益生菌免受消化道中胃酸、胆盐及胰液等的破坏失活,从而发挥出理想的功效。同时,本发明制备的益生菌晶球具有更长的产品存储期,能够延缓益生菌的失效时间。
儿茶素分子中的苯环作为氢键受体,干扰了壳聚糖分子内和分子间的氢键网状结构,使聚合物网酪的孔径减小,从而减少了H+与少部分消化酶在抗逆膜层的通过量,进而增强了益生菌晶球对消化道中胃酸、胆盐以及胰液的抗逆性。同时,由于儿茶素分子结构中的羧酸基团可以和壳聚糖的羟基和氨基基团发生亲核反应,而儿茶素苯环上三羟基基团具有较高的还原能力和较低的O-H键断裂焓,从而使二者易于结合并形成一种抗氧化性更强的衍生物。由于衍生物的抗氧化性提高,因此能够更好地保护晶球中的益生菌不受存储环境中光照、O2含量以及温湿度等因素的影响,进而提高益生菌晶球产品的稳定性,有效延长其货架期。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式,该详细说明不应认为是对本发明的限制,而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式,并非用于限制本发明。另外,对于本发明中的数值范围,应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值,以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明,否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料,但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入,用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时,以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下,可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化,这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等,均为开放性的用语,即意指包含但不限于。
本发明选择的植物乳杆菌为植物乳杆菌CQPC02,保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心,保藏编号为CGMCC NO.14491,公开在专利文献CN110699271B中;嗜酸乳杆菌为嗜酸乳杆菌LA-10A,保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO:M2019012,公开在专利文献CN111118106B中;鼠李糖乳杆菌为鼠李糖乳杆菌NJ551,保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO:M2016157,公开在专利文献CN112029676B中。
本发明实施例中用到的材料与试剂:
壳聚糖粉末,脱乙酰度90%(CAS NO:9012-76-4,货号:C916461);没食子酸(CASNO:149-91-7,货号:G823163);儿茶素(CAS NO:154-23-4,货号:C823329);低聚果糖(CAS NO:308066-66-2,货号:F861451);菊糖(CAS NO:9005-80-5,货号:9005-80-5);大豆低聚糖(货号:S909324);1-乙基-(3-二甲基丙基)碳二亚胺盐酸盐(CAS NO:25952-53-8,货号:N808856);N-羟基琥珀酰亚胺(CAS NO:6066-82-6,货号:N811124),以上材料均购自上海麦克林生化科技股份有限公司。
低聚异麦芽糖购自山东思扬生物科技有限公司,货号:3130830。
实施例1
一种高稳定性晶球益生菌,包括从内至外依次设置的益生菌内芯层、缓释层和抗逆层,制备方法如下:
(1)制备内芯层
将低聚果糖、低聚异麦芽糖、大豆低聚糖和菊糖按照质量比1:0.5:0.6:0.2混合作为益生元备用;
植物乳杆菌CQPC02经活化培养后,取种子液与益生元按质量比3:1混合制备发酵液,其中,植物乳杆菌CQPC02的种子液浓度为1×108CFU/mL;
取发酵液与抗性淀粉按照质量比5:1复合后,经冷冻干燥制备成益生菌内芯层。
(2)制备缓释层
将酪蛋白、乳糖和麦芽糊精按质量比1:1:1加入纯水至完全溶解,制备成包衣液,将益生菌内芯层于包衣锅内滚动,经过包衣液均匀包裹,干燥后备用。
(3)制备抗逆层
将壳聚糖粉末溶于体积分数为0.5%的醋酸溶液中,制备成质量浓度为10%的壳聚糖酸性溶液;再加入与壳聚糖粉末等量的NaOH使壳聚糖沉淀,反复洗涤至中性后,保存在甲醇溶液中,得到壳聚糖甲醇悬浊液。
将儿茶素和1-乙基-(3-二甲基丙基)碳二亚胺盐酸盐按摩尔比1:1溶于甲醇溶液,再加入等摩尔量的N-羟基琥珀酰亚胺,冰水浴搅拌90min,得到反应液。
将反应液逐滴加入壳聚糖甲醇悬浊液中,持续搅拌24h,将最终得到的反应液7000rpm离心10min,经过滤、洗涤,之后在干燥箱内进行冷冻干燥,得到壳聚糖儿茶素衍生物。
将得到的壳聚糖儿茶素衍生物制备成包衣液,将包裹了缓释层的内芯层于包衣锅内滚动,经过包衣液均匀包裹,待干燥后,得到高稳定性晶球益生菌。
实施例2
一种高稳定性晶球益生菌,包括从内至外依次设置的益生菌内芯层、缓释层和抗逆层,制备方法如下:
(1)制备内芯层
将低聚果糖、低聚异麦芽糖、大豆低聚糖和菊糖按照质量比1.2:0.4:0.3:0.4混合作为益生元备用;
嗜酸乳杆菌LA-10A经活化培养后,取种子液与益生元按质量比1:1混合制备发酵液,其中,嗜酸乳杆菌LA-10A的种子液浓度为1×1010CFU/mL;
取发酵液与抗性淀粉按照质量比1:1复合后,经冷冻干燥制备成益生菌内芯层。
(2)制备缓释层
将酪蛋白、乳糖和麦芽糊精按质量比1:1:2加入纯水至完全溶解,制备成包衣液,将益生菌内芯层于包衣锅内滚动,经过包衣液均匀包裹,干燥后备用。
(3)制备抗逆层
将壳聚糖粉末溶于体积分数为0.5%的醋酸溶液中,制备成质量浓度为10%的壳聚糖酸性溶液;再加入与壳聚糖粉末等量的NaOH使壳聚糖沉淀,反复洗涤至中性后,保存在甲醇溶液中,得到壳聚糖甲醇悬浊液。
将儿茶素和1-乙基-(3-二甲基丙基)碳二亚胺盐酸盐按摩尔比1:1溶于甲醇溶液,再加入等摩尔量的N-羟基琥珀酰亚胺,冰水浴搅拌60min,得到反应液。
将反应液逐滴加入壳聚糖甲醇悬浊液中,持续搅拌22h,将最终得到的反应液7000rpm离心10min,经过滤、洗涤,之后在干燥箱内进行冷冻干燥,得到壳聚糖儿茶素衍生物。
将得到的壳聚糖儿茶素衍生物制备成包衣液,将包裹了缓释层的内芯层于包衣锅内滚动,经过包衣液均匀包裹,待干燥后,得到高稳定性晶球益生菌。
实施例3
一种高稳定性晶球益生菌,包括从内至外依次设置的益生菌内芯层、缓释层和抗逆层,制备方法如下:
(1)制备内芯层
将低聚果糖、低聚异麦芽糖、大豆低聚糖和菊糖按照质量比1.5:0.3:0.8:0.6混合作为益生元备用;
鼠李糖乳杆菌NJ551经活化培养后,取种子液与益生元按质量比2:1混合制备发酵液,其中,鼠李糖乳杆菌NJ551的种子液浓度为1×109CFU/mL;
取发酵液与抗性淀粉按照质量比3:1复合后,经冷冻干燥制备成益生菌内芯层。
(2)制备缓释层
将酪蛋白、乳糖和麦芽糊精按质量比2:1:1加入纯水至完全溶解,制备成包衣液,将益生菌内芯层于包衣锅内滚动,经过包衣液均匀包裹,干燥后备用。
(3)制备抗逆层
将壳聚糖粉末溶于体积分数为0.5%的醋酸溶液中,制备成质量浓度为10%的壳聚糖酸性溶液;再加入与壳聚糖粉末等量的NaOH使壳聚糖沉淀,反复洗涤至中性后,保存在甲醇溶液中,得到壳聚糖甲醇悬浊液。
将儿茶素和1-乙基-(3-二甲基丙基)碳二亚胺盐酸盐按摩尔比1:1溶于甲醇溶液,再加入等摩尔量的N-羟基琥珀酰亚胺,冰水浴搅拌70min,得到反应液。
将反应液逐滴加入壳聚糖甲醇悬浊液中,持续搅拌20h,将最终得到的反应液7000rpm离心10min,经过滤、洗涤,之后在干燥箱内进行冷冻干燥,得到壳聚糖儿茶素衍生物。
将得到的壳聚糖儿茶素衍生物制备成包衣液,将包裹了缓释层的内芯层于包衣锅内滚动,经过包衣液均匀包裹,待干燥后,得到高稳定性晶球益生菌。
对比例1
与实施例1相比,区别在于,在步骤(3)中,将壳聚糖粉末溶于体积分数为0.5%的醋酸溶液中,制备成质量浓度为10%的壳聚糖酸性溶液;再加入与壳聚糖粉末等量的NaOH使壳聚糖沉淀,反复洗涤至中性后,保存在甲醇溶液中,得到壳聚糖甲醇悬浊液。
将没食子酸和1-乙基-(3-二甲基丙基)碳二亚胺盐酸盐按摩尔比1:1溶于甲醇溶液,再加入等摩尔量的N-羟基琥珀酰亚胺,冰水浴搅拌90min,得到反应液。
将反应液逐滴加入壳聚糖甲醇悬浊液中,持续搅拌24h,将最终得到的反应液7000rpm离心10min,经过滤、洗涤,之后在干燥箱内进行冷冻干燥,得到壳聚糖没食子酸衍生物。
将得到的壳聚糖没食子酸衍生物制备成包衣液,将包裹了缓释层的内芯层于包衣锅内滚动,经过包衣液均匀包裹,待干燥后,得到晶球益生菌。
对比例2
将壳聚糖粉末溶于体积分数为0.5%的醋酸溶液中,制备成质量浓度为10%的壳聚糖酸性溶液;再加入与壳聚糖粉末等量的NaOH使壳聚糖沉淀,反复洗涤至中性后,保存在甲醇溶液中,得到壳聚糖甲醇悬浊液。
将儿茶素和N-羟基琥珀酰亚胺按摩尔比1:1溶于甲醇溶液,再加入等摩尔量的1-乙基-(3-二甲基丙基)碳二亚胺盐酸盐,冰水浴搅拌90min,得到反应液。
将反应液逐滴加入壳聚糖甲醇悬浊液中,持续搅拌24h,将最终得到的反应液7000rpm离心10min,经过滤、洗涤,之后在干燥箱内进行冷冻干燥,得到壳聚糖儿茶素衍生物。
将得到的壳聚糖儿茶素衍生物制备成包衣液,将包裹了缓释层的内芯层于包衣锅内滚动,经过包衣液均匀包裹,待干燥后,得到晶球益生菌。
对比例3
与实施例1相比,区别在于,在步骤(3)中,将壳聚糖粉末制备成包衣液,将包裹了缓释层的内芯层于包衣锅内滚动,经过包衣液均匀包裹,待干燥后,得到晶球益生菌。
试验例
为验证本发明实施例制备的晶球益生菌的抗逆性以及稳定性,分别配置人工胃液和人工肠液,对晶球益生菌在体外模拟胃肠环境中的消化数据进行检测。
人工胃液配置:
称取胃蛋白酶10g、质量分数为10%的盐酸16.4mL、氯化钠粉末2g加入至1L纯净水中,混合均匀后,等量分成4份,并使用1mol/L的盐酸将4份溶液滴定至pH分别为1.5,2.5,3.5,4.5,过0.22μm滤膜后,即完成配置。
人工肠液配置:
称取磷酸二氢钾固体6.8g加入至0.5L纯净水中,完全溶解后,使用0.1mol/L的氢氧化钠溶液滴定至pH为6.5~6.7,之后加入溶有10g胰蛋白酶的100mL水,混合均匀后,加水定容至1L,即完成配置。
分别取1g本发明实施例1-3以及对照例1-3制得的晶球益生菌,其分散于9mL的人工胃液和人工肠液中,于37℃恒温贮藏,分别于0、1和2h后取出1管,用0.9%生理盐水冲洗,加入配制好的崩解液(柠檬酸三钠)中进行崩解,并加玻璃珠摇床振摇30min,其中崩解液的体积为9mL,崩解完成后从中移取1mL进行梯度稀释,采用MRS琼脂培养基进行活菌计数。结果如表1-2所示。
表1晶球益生菌经人工胃液测试后的活菌存活情况
表2晶球益生菌经人工肠液测试后的活菌存活情况
由表1-2可以看出,经人工胃液消化后,实施例1-3的晶球益生菌存活率与对比例1-3相比,明显较高,说明实施例1-3的晶球益生菌经人工胃液消化后,基本无崩解,具有更好的抗逆性和稳定性;在人工肠液测试中,消化1h后,所有晶球益生菌中活菌数已明显降低,证明多数晶球发生崩解破裂,但实施例1-3的晶球益生菌中活菌存活率比对例1-3更低,说明实施例1-3的晶球益生菌在肠液中的崩解速度更快;经肠液消化2h后,实施例1-3的晶球益生菌能够崩解完全。
为了比较益生菌晶球的存储期限,将实施例1-3和对比例1-3制备的益生菌晶球置于同一条件(常温)下储存,检测不同存储时间下益生菌晶球中的活菌数,结果如表3。
表3不同存储时间下益生菌晶球中的活菌数
由表3可知,经过180天常温存储,实施例1-3的益生菌晶球中益生菌的存活率接近90%,而对比例1-3的益生菌晶球中益生菌的存活率大概仅为50%。说明本发明实施例1-3制备的益生菌晶球具有更加稳定的储存性能。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述,并非对本发明的范围进行限定,在不脱离本发明设计精神的前提下,本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进,均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (6)
1.一种高稳定性晶球益生菌,其特征在于,以壳聚糖儿茶素衍生物作为抗逆层制备得到;在所述抗逆层的内部还包括从内至外的益生菌内芯层和缓释层;
所述益生菌内芯层由益生菌发酵液与抗性淀粉按质量比1~5:1复合后,冷冻干燥制得;所述益生菌发酵液由益生菌种子液与益生元按质量比1~3:1混合制备;
所述缓释层由酪蛋白、乳糖和麦芽糊精按质量比1:1:1制备;
所述壳聚糖儿茶素衍生物的制备方法为:
S1.将壳聚糖溶于醋酸溶液后加入NaOH使壳聚糖沉淀,取所述沉淀保存于甲醇溶液中,得到壳聚糖甲醇悬浊液;所述壳聚糖与所述NaOH的质量比为1:1;
S2.将儿茶素和1-乙基-(3-二甲基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶于甲醇溶液,再加入N-羟基琥珀酰亚胺,冰水浴搅拌,得到反应液;所述儿茶素、所述1-乙基-(3-二甲基丙基)碳二亚胺盐酸盐和所述N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1:1:1;
S3.将所述反应液逐滴加入所述壳聚糖甲醇悬浊液中,经搅拌、离心、过滤和洗涤后进行冷冻干燥,获得所述壳聚糖儿茶素衍生物。
2.根据权利要求1所述的高稳定性晶球益生菌,其特征在于,在步骤S2中,所述搅拌的时间为60-90min。
3.根据权利要求1所述的高稳定性晶球益生菌,其特征在于,在步骤S3中,所述搅拌的时间为20-24h。
4.根据权利要求1所述的高稳定性晶球益生菌,其特征在于,所述益生菌包括植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌和鼠李糖乳杆菌;所述益生元包括低聚果糖、低聚异麦芽糖、大豆低聚糖和菊糖。
5.如权利要求1-4任一项所述的高稳定性晶球益生菌的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
T1.将益生菌发酵液和抗性淀粉混合,搅拌均匀后,干燥,得到所述益生菌内芯层;
T2.将所述缓释层的材料和所述抗逆层的材料依次对所述益生菌内芯层进行包裹,得到所述高稳定性晶球益生菌。
6.如权利要求1-4任一项所述的高稳定性晶球益生菌在制备含有益生菌的药物中的应用。
Priority Applications (1)
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