CN114886010B - 一种猪用微生态制剂的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种猪用微生态制剂的制备方法，包括：制备益生菌菌泥、卡拉胶壁材和混合防护溶液；将益生菌菌泥加入混合防护溶液中，混合均匀，滴加到氯化钙溶液中，离心分离，得到益生菌微胶囊；将益生菌微胶囊浸泡在羧甲基纤维素钠和菊粉的混合溶液中搅拌浸泡，取出清洗，得到外层包覆羧甲基纤维素钠和菊粉的益生菌微胶囊；将益生菌微胶囊转入流化造粒包衣干燥机中干燥，采用包被材料对干燥后的微胶囊进行喷涂，形成包衣，得到猪用微生态制剂。本发明中利用卡拉胶壁材和稳定防护剂与益生菌菌泥进行混合制备益生菌微胶囊，并通过外层包覆羧甲基纤维素钠和菊粉制备得到的益生菌微胶囊制剂具有较好的稳定性和耐胃酸性。

Description

一种猪用微生态制剂的制备方法
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种猪用微生态制剂的制备方法。
背景技术
人和动物的消化道中寄居着大量的微生物(超过99％是细菌)，它们与宿主形成稳定的共生关系，能够帮助宿主分解膳食纤维等宿主自身难以消化的营养素、抵御外来有害菌的侵袭、产生有益于宿主健康的代谢物、促进和维持肠道健康、有助于免疫系统的形成、并直接或间接影响宿主的能量稳态和生理稳定。
仔猪早期阶段生长速度快，是各种器官功能发育的关键阶段、决定了后期的生长和生产性能。在此期间，猪肠道菌的数量和多样性都大幅提升，肠道菌的演替和变化同猪的肠道发育、健康水平、消化和免疫功能具有密切联系。仔猪断奶时，食物类型的转化及其引发的应激反应会引起一定时间内仔猪肠道健康功能下降和肠道菌群组成的明显变化。在这期间，仔猪腹泻率明显升高，生长性能下降，乳酸菌等益生菌的数量和比例大幅度降低，这些都会影响猪的健康和生长。改善和维持肠道健康，促进肠道微生态区系的稳定和平衡是保障仔猪早期快速生长的关键因素之一。为了维持动物的健康并在不使用抗生素的情况下减少断奶造成的不利影响，畜牧生产中经常使用益生菌等添加剂来刺激肠道菌群，使其达到最佳的微生态平衡。
益生菌(乳酸菌、酵母菌等)和益生元(低聚糖、小肽、有机酸等)等是目前常用的饲料添加剂，用于调理肠道菌群、改善肠道健康和功能、促进消化和吸收。但是益生菌的效果受到多种因素的影响，包括菌株来源、理化特性和稳定性、不同益生菌的协同和拮抗作用等。通常，来自非宿主胃肠道益生菌(如土壤、水源、植物)在特定动物胃肠道的定居繁殖机会往往偏少，而同源益生菌极易适应宿主胃肠道环境条件，能快速定植、生长和繁殖。开发动物源的益生菌能够提高益生菌在动物肠道内的留存比例，减少对肠道粘膜和上皮细胞中细胞因子和免疫因子的排斥，促进益生菌的定植和增殖，从而提高益生菌的有益效果。另一方面，由于一般肠道细菌多为厌氧菌或微氧菌，在分离、培养和制备过程中存在大量的丢失和破坏，所以开发专用于用于肠道菌的益生菌微微囊能明显提高和保留肠道菌的存活率和生理特性。现阶段，开发具有益生功能的益生菌微微囊对于养猪生产具有实际的指导意义，但是目前国内外关于猪源益生菌的开发和研究还不够充分，相关的保护技术还比较匮乏。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种猪用微生态制剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、制备益生菌菌泥；
步骤二、将卡拉胶加入超临界CO2反应装置中，通入CO2，在压力为16～18MPa、温度为45～65℃下搅拌浸泡120min，泄压后加入EDTA溶液，再次通入CO2，在压力16～18MPa、温度为45～65℃下搅拌反应120min，然后以一定的速度泄压，沉淀，干燥，得到卡拉胶壁材；
步骤三、按重量份，将10～20份卡拉胶壁材和25～35份稳定防护剂加入150～250份水中，搅拌30～45min，然后依次通入臭氧60～90min，通过氮气30～45min；得到混合防护溶液；
步骤四、按重量份，将10～15份益生菌菌泥加入40～150份混合防护溶液中，混合均匀，然后滴加到氯化钙溶液中，离心分离，得到益生菌微胶囊；
步骤五、将益生菌微胶囊浸泡在羧甲基纤维素钠和菊粉的混合溶液中搅拌浸泡5～10min，然后取出并用无菌去离子水中清洗3～5min，得到外层包覆羧甲基纤维素钠和菊粉的益生菌微胶囊；
步骤六、将外层包覆羧甲基纤维素钠和菊粉的益生菌微胶囊转入流化造粒包衣干燥机中干燥，采用包被材料对干燥后的微胶囊进行喷涂，形成包衣，得到猪用微生态制剂。
优选的是，所述步骤一中，将益生菌接种到已灭菌的MRS液体培养基中，于37.0℃下培养18～30h，再按每100mL培养基中接种4～6mL菌种的比例接种于MRS液体培养基中，并在相同条件下活化至第三代，得到菌液；将菌液在10℃、2500r/min下离心25min，弃去上清液，获得益生菌菌泥。
优选的是，所述益生菌为罗伊氏乳酸杆菌、长双歧杆菌、枯草芽孢杆菌、粪肠球菌中的任意一种。
优选的是，所述步骤二中，所述卡拉胶与EDTA溶液中EDTA的质量比为6～8:1；所述EDTA溶液的浓度为10～20mg/mL。
优选的是，所述步骤二中，在加入EDTA溶液的同时加入花青素溶液；所述花青素溶液与EDTA溶液的体积比为1:1.5～2；所述花青素溶液的浓度为5～15mg/mL。
优选的是，所述步骤三中，稳定防护剂包括以下重量份的原料混合组成：10～20份海藻糖、1～5份牛血清白蛋白、0.5～1.5份儿茶素和0.3～0.5份谷氨酰胺；所述臭氧的通气速度为50～80mL/min；所述氮气的通气速度为100～150mL/min。
优选的是，所述步骤四中，氯化钙溶液的浓度为0.1～0.5mol/L；所述滴加的速度为10～30mL/h。
优选的是，所述步骤五中，羧甲基纤维素钠在混合溶液中的浓度为0.5～2.5wt％；菊粉在混合溶液中的浓度为1～3wt％。
优选的是，所述步骤六中，流化造粒包衣干燥机中控制进风温度为45～60℃，控制出风温度为35～45℃，干燥至样品含水量为8～15wt％。
优选的是，所述步骤六中，所述包被材料为聚丙烯酸树脂乳胶液；所述聚丙烯酸树脂乳胶液的质量分数为20～35％；所述包被材料与益生菌微胶囊的质量体积比为1mL:3～6g；所述包被材料的喷涂速度为20～40mL/min。
本发明至少包括以下有益效果：本发明中利用卡拉胶壁材和稳定防护剂与益生菌菌泥进行混合制备益生菌微胶囊，并通过外层包覆羧甲基纤维素钠和菊粉制备得到的益生菌微胶囊制剂具有较好的稳定性和耐胃酸性。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
具体实施方式：
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
本发明中采用的模拟胃液：0.1kg/L氯化氢溶液16.4mL溶解800mL水，10g胃蛋白酶(1000NFU/MG)，pH＝2.0-3.0，定容至1000mL；0.22微米无菌过滤器过滤除菌备用；
模拟肠液：磷酸二氢钾6.8g，加500mL无菌水溶解，用0.1mol/l氢氧化钠溶液调pH至6.8灭菌；取胰蛋白酶(生化级250NFU/MG)10g，加100mL水溶解；两液体混-合摇匀定容至1000mL，0.22微米无菌过滤器过滤除菌；
实施例1：
步骤一、将罗伊氏乳酸杆菌接种到已灭菌的MRS液体培养基中，于37.0℃下培养24h，再按每100mL培养基中接种4mL菌种的比例接种于MRS液体培养基中，并在相同条件下活化至第三代，得到菌液；将菌液在10℃、2500r/min下离心25min，弃去上清液，获得益生菌菌泥；
步骤二、将10g卡拉胶加入超临界CO2反应装置中，通入CO2，在压力为17MPa、温度为50℃下搅拌浸泡120min，泄压后加入62.5mL EDTA溶液(20mg/mL)，再次通入CO2，在压力17MPa、温度为50℃下搅拌反应120min，然后以0.5MPa/min的速度泄压，乙醇沉淀，真空干燥，得到卡拉胶壁材；采用超临界CO2中进行卡拉胶与EDTA溶液的混合反应，超临界CO2为绿色溶剂，即可以起到溶胀卡拉胶的作用，使反应顺利实现，又可以避免使用过多的化学试剂；
步骤三、将10g卡拉胶壁材和25g稳定防护剂加入200g水中，在50℃下搅拌30min，然后依次通入臭氧90min，通过氮气45min；得到混合防护溶液；所述臭氧的通气速度为50mL/min；所述氮气的通气速度为100mL/min；所述稳定防护剂包括以下原料混合组成：10g海藻糖、2g牛血清白蛋白、1g儿茶素和0.5g谷氨酰胺；所述臭氧的通气速度为50mL/min；所述氮气的通气速度为100mL/min；
步骤四、将12g益生菌菌泥加入80g混合防护溶液中，混合均匀，然后滴加到0.4mol/L的氯化钙溶液中，离心分离，得到益生菌微胶囊；
步骤五、将益生菌微胶囊浸泡在羧甲基纤维素钠和菊粉的混合溶液中搅拌浸泡8min，然后取出并用无菌去离子水中清洗3～5min，得到外层包覆羧甲基纤维素钠和菊粉的益生菌微胶囊；所述羧甲基纤维素钠在混合溶液中的浓度为1.5wt％；菊粉在混合溶液中的浓度为2wt％；
步骤六、将外层包覆羧甲基纤维素钠和菊粉的益生菌微胶囊转入流化造粒包衣干燥机中，控制进风温度为45℃，控制出风温度为40℃，干燥至样品含水量为8wt％，采用质量分数为30％的聚丙烯酸树脂乳胶液为包被材料对干燥后的微胶囊以25mL/min的速度进行喷涂，形成包衣，得到猪用微生态制剂；所述包被材料与益生菌微胶囊的质量体积比为1mL:4g。
通过活菌计数法计数，检测本发明猪用微生态制剂的活性，其活菌数为4.05×1010CFU/g，在4℃下保存90天，活菌数0.95×1010CFU/g；
模拟胃液试验：将1g猪用微生态制剂加入无菌的模拟胃液中，37℃厌氧培养4h，于0、4h稀释涂布计数，计算存活率为88％。
模拟肠液试验：将模拟胃液中处理4h的菌液在模拟肠液中37℃厌氧培养4h，于0、4h测活菌数，计算存活率为94％。
实施例2：
步骤一、将罗伊氏乳酸杆菌接种到已灭菌的MRS液体培养基中，于37.0℃下培养24h，再按每100mL培养基中接种4mL菌种的比例接种于MRS液体培养基中，并在相同条件下活化至第三代，得到菌液；将菌液在10℃、2500r/min下离心25min，弃去上清液，获得益生菌菌泥；
步骤二、将10g卡拉胶加入超临界CO2反应装置中，通入CO2，在压力为17MPa、温度为50℃下搅拌浸泡120min，泄压后加入62.5mL EDTA溶液(20mg/mL)和93.75mL花青素溶液(15mg/L)，再次通入CO2，在压力17MPa、温度为50℃下搅拌反应120min，然后以0.5MPa/min的速度泄压，乙醇沉淀，真空干燥，得到卡拉胶壁材；
步骤三、将10g卡拉胶壁材和25g稳定防护剂加入200g水中，在50℃下搅拌30min，然后依次通入臭氧90min，通过氮气45min；得到混合防护溶液；所述臭氧的通气速度为50mL/min；所述氮气的通气速度为100mL/min；所述稳定防护剂包括以下原料混合组成：10g海藻糖、2g牛血清白蛋白、1g儿茶素和0.5g谷氨酰胺；所述臭氧的通气速度为50mL/min；所述氮气的通气速度为100mL/min；
步骤四、将12g益生菌菌泥加入80g混合防护溶液中，混合均匀，然后滴加到0.4mol/L的氯化钙溶液中，离心分离，得到益生菌微胶囊；
步骤五、将益生菌微胶囊浸泡在羧甲基纤维素钠和菊粉的混合溶液中搅拌浸泡8min，然后取出并用无菌去离子水中清洗3～5min，得到外层包覆羧甲基纤维素钠和菊粉的益生菌微胶囊；所述羧甲基纤维素钠在混合溶液中的浓度为1.5wt％；菊粉在混合溶液中的浓度为2wt％；
步骤六、将外层包覆羧甲基纤维素钠和菊粉的益生菌微胶囊转入流化造粒包衣干燥机中，控制进风温度为45℃，控制出风温度为40℃，干燥至样品含水量为8wt％，采用质量分数为30％的聚丙烯酸树脂乳胶液为包被材料对干燥后的微胶囊以25mL/min的速度进行喷涂，形成包衣，得到猪用微生态制剂；所述包被材料与益生菌微胶囊的质量体积比为1mL:4g。
通过活菌计数法计数，检测本发明猪用微生态制剂的活性，其活菌数为4.12×1010CFU/g，在4℃下保存90天，活菌数1.12×1010CFU/g；
模拟胃液试验：将1g猪用微生态制剂加入无菌的模拟胃液中，37℃厌氧培养4h，于0、4h稀释涂布计数，计算存活率为91％。
模拟肠液试验：将模拟胃液中处理4h的菌液在模拟肠液中37℃厌氧培养4h，于0、4h测活菌数，计算存活率为96％。
实施例3：
步骤一、将长双歧杆菌接种到已灭菌的MRS液体培养基中，于37.0℃下培养25h，再按每100mL培养基中接种5mL菌种的比例接种于MRS液体培养基中，并在相同条件下活化至第三代，得到菌液；将菌液在10℃、2500r/min下离心25min，弃去上清液，获得益生菌菌泥；
步骤二、将10g卡拉胶加入超临界CO2反应装置中，通入CO2，在压力为17MPa、温度为50℃下搅拌浸泡120min，泄压后加入62.5mL EDTA溶液(20mg/mL)，再次通入CO2，在压力17MPa、温度为50℃下搅拌反应120min，然后以0.5MPa/min的速度泄压，乙醇沉淀，真空干燥，得到卡拉胶壁材；
步骤三、将10g卡拉胶壁材和25g稳定防护剂加入200g水中，在50℃下搅拌30min，然后依次通入臭氧90min，通过氮气45min；得到混合防护溶液；所述臭氧的通气速度为50mL/min；所述氮气的通气速度为100mL/min；所述稳定防护剂包括以下原料混合组成：10g海藻糖、2g牛血清白蛋白、1g儿茶素和0.5g谷氨酰胺；所述臭氧的通气速度为50mL/min；所述氮气的通气速度为100mL/min；
步骤四、将15g益生菌菌泥加入120g混合防护溶液中，混合均匀，然后滴加到0.4mol/L的氯化钙溶液中，离心分离，得到益生菌微胶囊；
步骤五、将益生菌微胶囊浸泡在羧甲基纤维素钠和菊粉的混合溶液中搅拌浸泡8min，然后取出并用无菌去离子水中清洗3～5min，得到外层包覆羧甲基纤维素钠和菊粉的益生菌微胶囊；所述羧甲基纤维素钠在混合溶液中的浓度为1.5wt％；菊粉在混合溶液中的浓度为2wt％；
步骤六、将外层包覆羧甲基纤维素钠和菊粉的益生菌微胶囊转入流化造粒包衣干燥机中，控制进风温度为45℃，控制出风温度为40℃，干燥至样品含水量为8wt％，采用质量分数为30％的聚丙烯酸树脂乳胶液为包被材料对干燥后的微胶囊以25mL/min的速度进行喷涂，形成包衣，得到猪用微生态制剂；所述包被材料与益生菌微胶囊的质量体积比为1mL:4g。
通过活菌计数法计数，检测本发明猪用微生态制剂的活性，其活菌数为4.42×1010CFU/g，在4℃下保存90天，活菌数0.93×1010CFU/g；
模拟胃液试验：将1g猪用微生态制剂加入无菌的模拟胃液中，37℃厌氧培养4h，于0、4h稀释涂布计数，计算存活率为89％。
模拟肠液试验：将模拟胃液中处理4h的菌液在模拟肠液中37℃厌氧培养4h，于0、4h测活菌数，计算存活率为93％。
实施例4：
步骤一、将长双歧杆菌接种到已灭菌的MRS液体培养基中，于37.0℃下培养25h，再按每100mL培养基中接种5mL菌种的比例接种于MRS液体培养基中，并在相同条件下活化至第三代，得到菌液；将菌液在10℃、2500r/min下离心25min，弃去上清液，获得益生菌菌泥；
步骤二、将10g卡拉胶加入超临界CO2反应装置中，通入CO2，在压力为17MPa、温度为50℃下搅拌浸泡120min，泄压后加入62.5mL EDTA溶液(20mg/mL)和93.75mL花青素溶液(15mg/L)，再次通入CO2，在压力17MPa、温度为50℃下搅拌反应120min，然后以0.5MPa/min的速度泄压，乙醇沉淀，真空干燥，得到卡拉胶壁材；
步骤三、将10g卡拉胶壁材和25g稳定防护剂加入200g水中，在50℃下搅拌30min，然后依次通入臭氧90min，通过氮气45min；得到混合防护溶液；所述臭氧的通气速度为50mL/min；所述氮气的通气速度为100mL/min；所述稳定防护剂包括以下原料混合组成：10g海藻糖、2g牛血清白蛋白、1g儿茶素和0.5g谷氨酰胺；所述臭氧的通气速度为50mL/min；所述氮气的通气速度为100mL/min；
步骤四、将15g益生菌菌泥加入120g混合防护溶液中，混合均匀，然后滴加到0.4mol/L的氯化钙溶液中，离心分离，得到益生菌微胶囊；
步骤五、将益生菌微胶囊浸泡在羧甲基纤维素钠和菊粉的混合溶液中搅拌浸泡8min，然后取出并用无菌去离子水中清洗3～5min，得到外层包覆羧甲基纤维素钠和菊粉的益生菌微胶囊；所述羧甲基纤维素钠在混合溶液中的浓度为1.5wt％；菊粉在混合溶液中的浓度为2wt％；
步骤六、将外层包覆羧甲基纤维素钠和菊粉的益生菌微胶囊转入流化造粒包衣干燥机中，控制进风温度为45℃，控制出风温度为40℃，干燥至样品含水量为8wt％，采用质量分数为30％的聚丙烯酸树脂乳胶液为包被材料对干燥后的微胶囊以25mL/min的速度进行喷涂，形成包衣，得到猪用微生态制剂；所述包被材料与益生菌微胶囊的质量体积比为1mL:4g。
通过活菌计数法计数，检测本发明猪用微生态制剂的活性，其活菌数为4.51×1010CFU/g，在4℃下保存90天，活菌数1.1×1010CFU/g；
模拟胃液试验：将1g猪用微生态制剂加入无菌的模拟胃液中，37℃厌氧培养4h，于0、4h稀释涂布计数，计算存活率为92％。
模拟肠液试验：将模拟胃液中处理4h的菌液在模拟肠液中37℃厌氧培养4h，于0、4h测活菌数，计算存活率为96％。
对比例1：
步骤一、将罗伊氏乳酸杆菌接种到已灭菌的MRS液体培养基中，于37.0℃下培养24h，再按每100mL培养基中接种4mL菌种的比例接种于MRS液体培养基中，并在相同条件下活化至第三代，得到菌液；将菌液在10℃、2500r/min下离心25min，弃去上清液，获得益生菌菌泥；
步骤二、将10g卡拉胶和25g稳定防护剂加入200g水中，在50℃下搅拌30min，然后依次通入臭氧90min，通过氮气45min；得到混合防护溶液；所述臭氧的通气速度为50mL/min；所述氮气的通气速度为100mL/min；所述稳定防护剂包括以下原料混合组成：10g海藻糖、2g牛血清白蛋白、1g儿茶素和0.5g谷氨酰胺；所述臭氧的通气速度为50mL/min；所述氮气的通气速度为100mL/min；
步骤三、将12g益生菌菌泥加入80g混合防护溶液中，混合均匀，然后滴加到0.4mol/L的氯化钙溶液中，离心分离，得到益生菌微胶囊；
步骤四、将益生菌微胶囊浸泡在羧甲基纤维素钠和菊粉的混合溶液中搅拌浸泡8min，然后取出并用无菌去离子水中清洗3～5min，得到外层包覆羧甲基纤维素钠和菊粉的益生菌微胶囊；所述羧甲基纤维素钠在混合溶液中的浓度为1.5wt％；菊粉在混合溶液中的浓度为2wt％；
步骤五、将外层包覆羧甲基纤维素钠和菊粉的益生菌微胶囊转入流化造粒包衣干燥机中，控制进风温度为45℃，控制出风温度为40℃，干燥至样品含水量为8wt％，采用质量分数为30％的聚丙烯酸树脂乳胶液为包被材料对干燥后的微胶囊以25mL/min的速度进行喷涂，形成包衣，得到猪用微生态制剂；所述包被材料与益生菌微胶囊的质量体积比为1mL:4g。
通过活菌计数法计数，检测本发明猪用微生态制剂的活性，其活菌数为3.93×1010CFU/g，在4℃下保存90天，活菌数2.5×109CFU/g；
模拟胃液试验：将1g猪用微生态制剂加入无菌的模拟胃液中，37℃厌氧培养4h，于0、4h稀释涂布计数，计算存活率为86％。
模拟肠液试验：将模拟胃液中处理4h的菌液在模拟肠液中37℃厌氧培养4h，于0、4h测活菌数，计算存活率为88％。
对比例2：
步骤一、将长双歧杆菌接种到已灭菌的MRS液体培养基中，于37.0℃下培养25h，再按每100mL培养基中接种5mL菌种的比例接种于MRS液体培养基中，并在相同条件下活化至第三代，得到菌液；将菌液在10℃、2500r/min下离心25min，弃去上清液，获得益生菌菌泥；
步骤二、将10g卡拉胶和25g稳定防护剂加入200g水中，在50℃下搅拌30min，然后依次通入臭氧90min，通过氮气45min；得到混合防护溶液；所述臭氧的通气速度为50mL/min；所述氮气的通气速度为100mL/min；所述稳定防护剂包括以下原料混合组成：10g海藻糖、2g牛血清白蛋白、1g儿茶素和0.5g谷氨酰胺；所述臭氧的通气速度为50mL/min；所述氮气的通气速度为100mL/min；
步骤三、将15g益生菌菌泥加入120g混合防护溶液中，混合均匀，然后滴加到0.4mol/L的氯化钙溶液中，离心分离，得到益生菌微胶囊；
步骤四、将益生菌微胶囊浸泡在羧甲基纤维素钠和菊粉的混合溶液中搅拌浸泡8min，然后取出并用无菌去离子水中清洗3～5min，得到外层包覆羧甲基纤维素钠和菊粉的益生菌微胶囊；所述羧甲基纤维素钠在混合溶液中的浓度为1.5wt％；菊粉在混合溶液中的浓度为2wt％；
步骤五、将外层包覆羧甲基纤维素钠和菊粉的益生菌微胶囊转入流化造粒包衣干燥机中，控制进风温度为45℃，控制出风温度为40℃，干燥至样品含水量为8wt％，采用质量分数为30％的聚丙烯酸树脂乳胶液为包被材料对干燥后的微胶囊以25mL/min的速度进行喷涂，形成包衣，得到猪用微生态制剂；所述包被材料与益生菌微胶囊的质量体积比为1mL:4g。
通过活菌计数法计数，检测本发明猪用微生态制剂的活性，其活菌数为3.91×1010CFU/g，在4℃下保存90天，活菌数2.1×109CFU/g；
模拟胃液试验：将1g猪用微生态制剂加入无菌的模拟胃液中，37℃厌氧培养4h，于0、4h稀释涂布计数，计算存活率为85％。
模拟肠液试验：将模拟胃液中处理4h的菌液在模拟肠液中37℃厌氧培养4h，于0、4h测活菌数，计算存活率为87％。
对比例3：
步骤一、将罗伊氏乳酸杆菌接种到已灭菌的MRS液体培养基中，于37.0℃下培养24h，再按每100mL培养基中接种4mL菌种的比例接种于MRS液体培养基中，并在相同条件下活化至第三代，得到菌液；将菌液在10℃、2500r/min下离心25min，弃去上清液，获得益生菌菌泥；
步骤二、将10g卡拉胶加入超临界CO2反应装置中，通入CO2，在压力为17MPa、温度为50℃下搅拌浸泡120min，泄压后加入62.5mL EDTA溶液(20mg/mL)，再次通入CO2，在压力17MPa、温度为50℃下搅拌反应120min，然后以0.5MPa/min的速度泄压，乙醇沉淀，真空干燥，得到卡拉胶壁材；
步骤三、将10g卡拉胶壁材加入200g水中，在50℃下搅拌30min，然后依次通入臭氧90min，通过氮气45min；得到混合防护溶液；所述臭氧的通气速度为50mL/min；所述氮气的通气速度为100mL/min；
步骤四、将12g益生菌菌泥加入80g混合防护溶液中，混合均匀，然后滴加到0.4mol/L的氯化钙溶液中，离心分离，得到益生菌微胶囊；
步骤五、将益生菌微胶囊浸泡在羧甲基纤维素钠和菊粉的混合溶液中搅拌浸泡8min，然后取出并用无菌去离子水中清洗3～5min，得到外层包覆羧甲基纤维素钠和菊粉的益生菌微胶囊；所述羧甲基纤维素钠在混合溶液中的浓度为1.5wt％；菊粉在混合溶液中的浓度为2wt％；
步骤六、将外层包覆羧甲基纤维素钠和菊粉的益生菌微胶囊转入流化造粒包衣干燥机中，控制进风温度为45℃，控制出风温度为40℃，干燥至样品含水量为8wt％，采用质量分数为30％的聚丙烯酸树脂乳胶液为包被材料对干燥后的微胶囊以25mL/min的速度进行喷涂，形成包衣，得到猪用微生态制剂；所述包被材料与益生菌微胶囊的质量体积比为1mL:4g。
通过活菌计数法计数，检测本发明猪用微生态制剂的活性，其活菌数为3.85×1010CFU/g，在4℃下保存90天，活菌数8.5×107CFU/g；
模拟胃液试验：将1g猪用微生态制剂加入无菌的模拟胃液中，37℃厌氧培养4h，于0、4h稀释涂布计数，计算存活率为81％。
模拟肠液试验：将模拟胃液中处理4h的菌液在模拟肠液中37℃厌氧培养4h，于0、4h测活菌数，计算存活率为83％。
对比例4：
步骤一、将长双歧杆菌接种到已灭菌的MRS液体培养基中，于37.0℃下培养25h，再按每100mL培养基中接种5mL菌种的比例接种于MRS液体培养基中，并在相同条件下活化至第三代，得到菌液；将菌液在10℃、2500r/min下离心25min，弃去上清液，获得益生菌菌泥；
步骤二、将10g卡拉胶加入超临界CO2反应装置中，通入CO2，在压力为17MPa、温度为50℃下搅拌浸泡120min，泄压后加入62.5mL EDTA溶液(20mg/mL)，再次通入CO2，在压力17MPa、温度为50℃下搅拌反应120min，然后以0.5MPa/min的速度泄压，乙醇沉淀，真空干燥，得到卡拉胶壁材；
步骤三、将10g卡拉胶壁材加入200g水中，在50℃下搅拌30min，然后依次通入臭氧90min，通过氮气45min；得到混合防护溶液；所述臭氧的通气速度为50mL/min；所述氮气的通气速度为100mL/min；
步骤四、将15g益生菌菌泥加入120g混合防护溶液中，混合均匀，然后滴加到0.4mol/L的氯化钙溶液中，离心分离，得到益生菌微胶囊；
步骤五、将益生菌微胶囊浸泡在羧甲基纤维素钠和菊粉的混合溶液中搅拌浸泡8min，然后取出并用无菌去离子水中清洗3～5min，得到外层包覆羧甲基纤维素钠和菊粉的益生菌微胶囊；所述羧甲基纤维素钠在混合溶液中的浓度为1.5wt％；菊粉在混合溶液中的浓度为2wt％；
步骤六、将外层包覆羧甲基纤维素钠和菊粉的益生菌微胶囊转入流化造粒包衣干燥机中，控制进风温度为45℃，控制出风温度为40℃，干燥至样品含水量为8wt％，采用质量分数为30％的聚丙烯酸树脂乳胶液为包被材料对干燥后的微胶囊以25mL/min的速度进行喷涂，形成包衣，得到猪用微生态制剂；所述包被材料与益生菌微胶囊的质量体积比为1mL:4g。
通过活菌计数法计数，检测本发明猪用微生态制剂的活性，其活菌数为3.88×1010CFU/g，在4℃下保存90天，活菌数7.9×107CFU/g；
模拟胃液试验：将1g猪用微生态制剂加入无菌的模拟胃液中，37℃厌氧培养4h，于0、4h稀释涂布计数，计算存活率为78％。
模拟肠液试验：将模拟胃液中处理4h的菌液在模拟肠液中37℃厌氧培养4h，于0、4h测活菌数，计算存活率为82％。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实例。

Claims (9)

1.一种猪用微生态制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、制备益生菌菌泥；
步骤二、将卡拉胶加入超临界CO2反应装置中，通入CO2，在压力为16~18MPa、温度为45~65℃下搅拌浸泡120min，泄压后加入EDTA溶液，再次通入CO2，在压力16~18MPa、温度为45~65℃下搅拌反应120min，然后以一定的速度泄压，沉淀，干燥，得到卡拉胶壁材；
步骤三、按重量份，将10~20份卡拉胶壁材和25~35份稳定防护剂加入150~250份水中，搅拌30~45min，然后依次通入臭氧60~90min，通入氮气30~45min；得到混合防护溶液；
步骤四、按重量份，将10~15份益生菌菌泥加入40~150份混合防护溶液中，混合均匀，然后滴加到氯化钙溶液中，离心分离，得到益生菌微胶囊；
步骤五、将益生菌微胶囊浸泡在羧甲基纤维素钠和菊粉的混合溶液中搅拌浸泡5~10min，然后取出并用无菌去离子水清洗3~5min，得到外层包覆羧甲基纤维素钠和菊粉的益生菌微胶囊；
步骤六、将外层包覆羧甲基纤维素钠和菊粉的益生菌微胶囊转入流化造粒包衣干燥机中干燥，采用包被材料对干燥后的微胶囊进行喷涂，形成包衣，得到猪用微生态制剂；
所述步骤三中，稳定防护剂包括以下重量份的原料混合组成：10~20份海藻糖、1~5份牛血清白蛋白、0.5~1.5份儿茶素和0.3~0.5份谷氨酰胺；所述臭氧的通气速度为50~80mL/min；所述氮气的通气速度为100~150mL/min；
所述步骤六中，所述包被材料为聚丙烯酸树脂乳胶液。
2.如权利要求1所述的猪用微生态制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤一中，将益生菌接种到已灭菌的MRS液体培养基中，于37.0℃下培养18~30h，再按每100mL培养基中接种4~6mL菌种的比例接种于MRS液体培养基中，并在相同条件下活化至第三代，得到菌液；将菌液在10℃、2500r/min下离心25min，弃去上清液，获得益生菌菌泥。
3.如权利要求2所述的猪用微生态制剂的制备方法，其特征在于，所述益生菌为罗伊氏乳酸杆菌、长双歧杆菌、枯草芽孢杆菌、粪肠球菌中的任意一种。
4.如权利要求1所述的猪用微生态制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤二中，所述卡拉胶与EDTA溶液中EDTA的质量比为6~8:1；所述EDTA溶液的浓度为10~20mg/mL。
5.如权利要求4所述的猪用微生态制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤二中，在加入EDTA溶液的同时加入花青素溶液；所述花青素溶液与EDTA溶液的体积比为1:1.5~2；所述花青素溶液的浓度为5~15mg/mL。
6.如权利要求1所述的猪用微生态制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤四中，氯化钙溶液的浓度为0.1~0.5mol/L；所述滴加的速度为10~30mL/h。
7.如权利要求1所述的猪用微生态制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤五中，羧甲基纤维素钠在混合溶液中的浓度为0.5~2.5wt%；菊粉在混合溶液中的浓度为1~3wt%。
8.如权利要求1所述的猪用微生态制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤六中，流化造粒包衣干燥机中控制进风温度为45~60℃，控制出风温度为35~45℃，干燥至样品含水量为8~15wt％。
9.如权利要求1所述的猪用微生态制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤六中，所述聚丙烯酸树脂乳胶液的质量分数为20~35%；所述包被材料与益生菌微胶囊的质量体积比为1mL:3~6g；所述包被材料的喷涂速度为20~40mL/min。
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