CN114891657B - 一种卷曲乳杆菌及其抑菌促生长微囊化复合菌制剂的制备方法和在畜禽养殖中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种卷曲乳杆菌及其抑菌促生长微囊化复合菌制剂的制备方法和在畜禽养殖中的应用，本发明筛选的卷曲乳杆菌DC529具有高效抑制肠炎型沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌和鸡白痢沙门氏菌的能力。本发明囊化复合益生菌制剂一方面显著提高益生菌的抗逆性，以对抗外界不良环境，另一方面，在沙门氏菌的感染的情况下能够显著提高机体对病原菌的抵抗力，提高肠粘膜免疫水平，刺激机体免疫应答的产生，并维持机体较高水平的免疫应答，降低了肉仔鸡死亡率。
Description
技术领域
本发明属于益生菌制剂技术领域，具体涉及一种卷曲乳杆菌及其抑菌促生 长微囊化复合菌制剂的制备方法和在畜禽养殖中的应用。
背景技术
抗生素替代品的成功开发一定程度上依赖于对抗生素促生长作用机制的 理解。该机制作用较为复杂，迄今为止还没有明确的解释。初步理论认为抗生 素促生长的功效与抗菌作用有关，即肠道微生物群总数或多样性发生改变，减 少致病菌对营养物质的竞争和促进微生物对氨基酸、胆汁等产物的分解代谢， 从而更大程度保障动物的营养需求、促进动物生长。因此，理想的替代方案应该具有与抗生素促生长剂相同的效果，能够改善肠道微生物菌群，提高营养利 用率，确保动物最佳的生产性能。
在众多潜在的替代品中，益生菌制剂以其绿色无残留、安全促生长等优点 受到各国研究者的广泛关注，并逐步登上替代抗生素的舞台。近年来，益生菌 在畜禽养殖方面的作用受到各国研究者的广泛关注。一方面，益生菌多用于饲 料发酵，将饲料原料中的多糖、蛋白质、纤维素等大分子物质进行发酵，降解、 分解、转化生成易于消化吸收的小分子物质，能提高饲料利用率和营养水平，改善动物肠道微生物菌群。另一方面，益生菌制剂作为饲料添加剂能够替代部 分抗生素，在维护畜禽机体肠道健康、菌群平衡以及营养生理方面发挥着极其 重要的作用。目前国内外针对可抑制致病菌的益生菌的筛选，主要集中在乳酸菌和芽孢杆菌上。因此，益生菌的抗菌效果有望替代抗生素在畜禽养殖过程中 预防或治疗细菌性疾病的发生发展，同时改善肠道微生物菌群，提高饲料中营养利用率，提高畜禽的生产性能。目前国内已有多种益生菌作为“替抗”饲料 添加剂应用于肉仔鸡养殖，然而益生菌制剂的推广仍受到一些限制。首先是益 生菌本身存在一些问题。饲用益生菌在保存及使用时,往往会受到来自外界环 境与动物体内各种不利条件的影响,包括氧气、高温、胃酸、胆汁盐、抗生素 和其他细菌等。以口服形式进入活体肠道内的益生菌必须经过胃肠环境,胃酸、 胆汁、胃蛋白酶等导致许多益生菌不能活着到达小肠后端,多种乳酸菌在模拟 胃液的处理过程中存活能力不断降低,存活率不足几万甚至几亿分之一。因此，益生特性良好的益生菌菌株往往在家禽活体饲养中并未表现出理想的效果,这 其中很大一部分原因是由于家禽胃肠道生理特性引起益生菌在胃肠道中存活 率过低造成的。此外，可用于抑制致病菌预防或治疗的优良益生菌种严重缺乏， 可用于微生态制剂的菌种更少，相关产品较为单一。机体的动态平衡是多种菌 株共同作用的结果，单一菌种制剂在复杂的养殖环境中很难达到理想的使用效果。复合菌种制剂功能齐全、组成复杂，性能稳定，更能适应复杂的养殖环境。
针对益生菌制剂在临床使用中存在的问题，筛选合适的菌种研发高效复合 益生菌制剂，同时开发新型微生物工程技术，改进发酵生产模式及制备工艺， 增强技术的先进性，生产出更加稳定、高效且耐受性较好的益生菌制剂是解决 以上临床问题的有效手段。微囊化技术具有改变物料存在状态、控制释放、增 强稳定性、掩盖不良风味、降低其挥发性、防止物料间发生反应、延长保质期等优点，现已在乳制品、功能性食品、食用油脂和食品添加剂等食品加工中广 泛应用。
发明内容
卷曲乳杆菌Lactobacillus crispatus DC529、格氏乳球菌Lactococcusgarvieae DC12、乳酸片球菌Pediococcus acidilactici DC413三株益生菌均 保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，卷曲乳杆菌Lactobacillus crispatus DC529，保藏号为GDMCC No： 62094，保藏日期为2021年12月15日；格氏乳球菌LactococcusgarvieaeDC12， 保藏号为GDMCC No：1.2973，保藏日期为2021年12月31日；乳酸片球菌 Pediococcus acidilactici DC413，保藏号为GDMCC No：1.2969，保藏日期 为2021年12月31日。
菌种来源：三株益生菌均分离自盐城市自然保护区野生原鸡粪便。
获得途径：将新鲜原鸡粪便存放于无菌EP管中(内含无菌林格氏厌氧液) 低温运输至实验室，将液体均匀涂布于MRS固体培养基，置于厌氧环境中，37℃ 培养24h。两次划线纯化培养并挑单菌落培养，经过基因测序、抑菌试验、黏 附性实验、体内定植试验等一系列实验室研究确定，分别为格氏乳球菌、乳酸 片球菌、卷曲乳杆菌卷。
作为本发明其中一个方面，本发明提供一种卷曲乳杆菌：所述卷曲乳杆菌 为卷曲乳杆菌DC529，其保藏编号为GDMCC No：62094。
作为本发明的另一个方面，本发明提供一种抑菌促生长微囊化复合菌制剂 的制备方法，其由以下步骤组成，在水中加入微囊化载体、益生元，静置，加 入格氏乳球菌DC12、乳酸片球菌DC413、卷曲乳杆菌DC529，充分混合作为水 相；将所述水相加入油相，搅拌，加入钙盐，反应20～60min，加入水，得到 复合益生菌微胶囊，干燥得到微囊化复合菌制剂，所述微囊化复合菌制剂中， 格氏乳球菌DC12活菌数为107～109CFU/g、乳酸片球菌DC413活菌数为108～ 109CFU/g、卷曲乳杆菌DC529活菌数为108～109CFU/g。
作为本发明所述的抑菌促生长微囊化复合菌制剂的制备方法的一种优选 方案：所述微囊化复合菌制剂中，格氏乳球菌DC12、乳酸片球菌DC413、卷曲 乳杆菌DC529的活菌数量比为1：(0.5～5)：(0.5～10)。
作为本发明所述的抑菌促生长微囊化复合菌制剂的制备方法的一种优选 方案：所述微囊化复合菌制剂中，格氏乳球菌DC12、乳酸片球菌DC413、卷曲 乳杆菌DC529的活菌数量比为1：1：(1～3)。
作为本发明所述的抑菌促生长微囊化复合菌制剂的制备方法的一种优选 方案：所述微囊化载体，包括海藻酸钠，所述海藻酸钠在所述水相中的添加量 为1～5％；所述益生元，包括纤维素粉，所述纤维素粉在所述水相中的添加量为 0.1～0.3％。
作为本发明所述的抑菌促生长微囊化复合菌制剂的制备方法的一种优选 方案：所述油相，包括大豆油，所述水相与所述油相的体积比为(0.5～3):1。
作为本发明所述的抑菌促生长微囊化复合菌制剂的制备方法的一种优选 方案：所述钙盐，包括氯化钙，所述氯化钙的在油相中的添加量为0.5～2％。
作为本发明所述的抑菌促生长微囊化复合菌制剂的制备方法的一种优选 方案：所述油相，包括在大豆油中添加0.1～3％的Span80作为油相，所述搅拌， 为60～100r/min搅拌20～60min。
作为本发明所述的抑菌促生长微囊化复合菌制剂的制备方法的一种优选 方案：所述所述加入氯化钙，为以3～5mL/min的速度逐滴加入。
作为本发明的另一个方面，本发明提供所述的微囊化复合菌制剂在畜禽养 殖中的应用，所述微囊化复合菌制剂能够促生长、抗沙门氏菌、提高畜禽免疫 水平。
本发明的有益效果：本发明筛选的卷曲乳杆菌DC529具有高效抑制肠炎型 沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌和鸡白痢沙门氏菌的能力。本发明囊化复合益生菌 制剂一方面显著提高益生菌的抗逆性，以对抗外界不良环境，另一方面，在沙 门氏菌的感染的情况下能够显著提高机体对病原菌的抵抗力，提高肠粘膜免疫 水平，刺激机体免疫应答的产生，并维持机体较高水平的免疫应答，降低了肉 仔鸡死亡率。本发明囊化复合益生菌制剂能够抑制有害病原菌的定植和繁育，提高有益菌的丰度，减少或避免肠道疾病的发生，提高饲料转化率，促进肉鸡 生长性能可作为预防和治疗动物疾病抗生素促生长剂替代品减少抗生素在饲 料中添加，避免饲用抗生素滥用导致的细菌耐药性、抗生素药物残留和食品安 全等方面的危害。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需 要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的 一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下， 还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
图1为本发明格氏乳球菌DC12、乳酸片球菌DC413、卷曲乳杆菌DC529的 抑菌效果图。
图2为微囊化复合益生菌形态观察。
图3为微囊化复合益生菌抗逆性实验。
图4为微囊化复合益生菌释放实验。
图5为微囊化复合益生菌常温储存耐受性实验。
图6为微囊化复合益生菌对感染沙门氏菌肉仔鸡生存率的影响。
图7为微囊化复合益生菌对感染沙门氏菌肉仔鸡生长性能的影响。
图8为微囊化复合益生菌对感染沙门氏菌肉仔鸡肝脏、脾脏和淋巴结中载 菌量的影响。
图9为微囊化复合益生菌对感染沙门氏菌肉仔鸡血清中IgA、IgG的影响。
图10为微囊化复合益生菌对感染沙门氏菌肉仔鸡血清中TNF-α、IL-6的 影响。
图11为实施例3的实验流程图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实 施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明 还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不 违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例 的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少 一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在 一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施 例互相排斥的实施例。
本发明复合益生菌制剂，由格氏乳球菌DC12、乳酸片球菌DC413、卷曲乳 杆菌DC529、海藻酸钠和0.1～0.3％(w/v g/100mL)纤维素粉组成。格氏乳球 菌DC12活菌数为107～109CFU/g、乳酸片球菌DC413活菌数为108～109CFU/g、 卷曲乳杆菌DC529活菌数为108～109CFU/g。
优选地，格氏乳球菌、乳酸片球菌、卷曲乳杆菌的活菌数量比为1：1：1～3。
微囊化复合益生菌制剂的制备方法由以下步骤组成：
将三株菌株活化：格氏乳球菌DC12、乳酸片球菌DC413、卷曲乳杆菌DC529 分别接种到新鲜的液态MRS培养基中进行培养得到三种细菌悬液作为种子液备 用。
复合益生菌微囊化：将步骤(1)培养完成的菌液按比例将三种益生菌悬液 混合作为备用，每毫升复合益生菌制剂中总活菌数量为5×107～109个，优选 为5×108～109个。
微囊化步骤：向50L种子罐中加入500g海藻酸钠，21L蒸馏水，0.1％-3％ 纤维素粉，混合均匀，室温放置24h使海藻酸钠彻底溶胀。灭菌后加入复合益 生菌种子液(1011～1012CFU)，充分混匀作为水相；在500L发酵罐中，向20L 大豆油中添加0.2％的Span80作为油相，将水相泵入油相，转速85r/min搅 拌30min，然后逐滴加入1％(w/v g/100mL)氯化钙，流速为4mL/min，反应 30min，保持转速，使海藻酸钠中的钠离子与钙离子进行置换反应，形成内部 包被微生物活细胞的海藻酸钙凝胶珠，待海藻酸钠完全固化后，向反应体系中 加入无菌去离子水，使微胶囊缓慢沉降于下层水相中。回收上层油相，无菌水 冲洗微胶囊，冷冻干燥最终得到含有高密度和高活性微生物的生物微胶囊。
给肉仔鸡饮水饲喂微囊化复合益生菌制剂，1～10g/只/天。
实施例1：
微囊化复合益生菌制剂的制备方法由以下步骤组成：
将三株菌株活化：格氏乳球菌DC12、乳酸片球菌DC413、卷曲乳杆菌DC529 分别接种到新鲜的液态MRS培养基中进行培养得到三种细菌悬液作为种子液备 用。
向50L种子罐中加入500g海藻酸钠，21L蒸馏水，0.3％纤维素粉，混 合均匀，室温放置24h使海藻酸钠彻底溶胀，灭菌后加入复合益生菌种子液(格氏乳球菌DC12活菌数为5×1010CFU、乳酸片球菌DC413活菌数为5×1010CFU、 卷曲乳杆菌DC529活菌数为1.5×1011CFU)，充分混匀作为水相；在500L发酵 罐中，向20L大豆油中添加0.2％的Span80作为油相，将水相泵入油相，转速 85r/min搅拌30min，然后逐滴加入1％(w/v)氯化钙，流速为4mL/min，反 应30min，保持转速，海藻酸钠中的钠离子与钙离子进行置换反应，形成内部 包被微生物活细胞的海藻酸钙凝胶珠，待海藻酸钠完全固化后，向反应体系中加入无菌去离子水，使微胶囊缓慢沉降于下层水相中。回收上层油相，无菌水 冲洗微胶囊，冷冻干燥最终得到含有高密度和高活性微生物的生物微胶囊。
给肉仔鸡饮水饲喂微囊化复合益生菌制剂，1g/只/天。
益生菌及复合益生菌体外抑菌效果评价：
格氏乳球菌、乳酸片球菌、卷曲乳杆菌，分别挑单菌落于MRS培养基中37℃ 培养24h(厌氧环境)，OD＝1.5时按1％(v/v)接种于新鲜培养基中37℃培养 24h(厌氧环境)，将培养好的菌液放置4℃冰箱备用。鸡白痢沙门氏菌 (ATCC19945)、鼠伤寒沙门氏菌(CVCC542)、肠炎沙门氏菌(ATCC19585)作 为指示菌(1×106CFU/板)分别涂布于LB培养基。每个牛津杯中加入200μL 益生菌培养液(1×109CFU/mL)，先4℃预扩散4h，然后37℃孵育12h，每个试 验做3个平行，测量抑菌圈直径，直径取3个平行的平均值(图1)。结果显示 三株益生菌对鸡白痢沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌均具有突出的 抑菌效果，尤其卷曲乳杆菌DC529抑制鼠伤寒沙门氏菌的直径范围高达26.5 ±0.3mm。说明三株益生菌具有作为抗生素替代品抑制沙门氏菌的潜力。
实施例2：
未微囊化复合益生菌及微囊化复合益生菌体外效果评价：胃肠液耐受实验： ①模拟胃液的配制：取9.5％盐酸16.4mL，加蒸馏水稀释，使pH值达到3.0， 按照每100mL加1.0g胃蛋白酶，混匀，0.22μm无菌滤膜过滤，现配现用。 分别取益生菌微胶囊(1g，5×109CFU)(图2)和未微囊化复合益生菌(5×109CFU) (即将三种益生菌按照同样配比复配，但未制备成微囊化复合益生菌)两种样 品，转移到预热的装有9mL模拟胃液试管中，37℃80r/min处理0、30min、 90min和180min。益生菌微胶囊需加入破囊液中和pH再进行梯度稀释，对 未胶囊化复合益生菌与益生菌微胶囊进行倾注法活菌计数(图3A)。②模拟肠 液的配制：取KH2PO46.8 g，加入500mL蒸馏水溶解，用4g/L NaOH溶液调 p H至6.8，蒸馏水定容至1L，加胆盐0.3％，按照100mL加1g胰蛋白酶， 混匀，0.22μm无菌滤膜过滤，现配现用。分别取益生菌微胶囊和未胶囊化益生菌样品各1g，转移到装有9mL模拟肠液试管中，37℃80r/min处理0、30min、90min和180min。益生菌微胶囊需加入破囊液再进行梯度稀释，对 未胶囊化益生菌与益生菌微胶囊进行倾注法活菌计数(图3B)。结果显示在模拟胃、肠液中作用180min复合益生菌微囊化后的存活率显著高于未微囊化复 合益生菌。
微囊化益生菌在模拟胃肠液中的释放情况：分别称取1g微囊化益生菌样 品转移到预热装有9mL模拟胃液的试管中，37℃80r/min震荡孵育3h后， 再转移至人工肠液中进行处理1h，每隔15min取样，同时补加等温等体积的释放介质，进行活菌计数。以释放时间为横坐标，活菌数为纵坐标，绘制微 囊化益生菌的释放曲线(图4)。结果显示微囊化益生菌在经过模拟胃、肠液处 理后微胶囊中的益生菌持续释放，在45min后释放加速，60min后微胶囊中的 益生菌释放完全。
微囊化益生菌常温储存耐受性实验：取适量的复合益生菌和微囊化益生菌 样品放置常温阴暗处储藏五个月，每隔1个月时间通过测定活菌数变化情况 来评价其贮存性能(图5)。结果显示益生菌微囊化能显著提高常温储存的耐受 性。
实施例3：
复合益生菌体内实验效果评价：
实验分组如下表所示：
生存率统计：灌胃攻菌后，每天观察鸡只死亡情况并记录。结果如图6所 示，饲喂微囊化复合益生菌(Ⅶ)后能显著提高肉仔鸡的存活率。
生长性能：每日同一时间称重，按公式计算试验期平均周增重。平均日增 重＝(试验末重－试验初重)/试验天数。自试验开始后每天详细记录每组重复 肉鸡的饲喂量及每日的剩料量，按公式计算平均日采食量和料重比。平均日采 食量＝试验期总采食量/试验天数；料重比＝试验日总采食量/试验日总增重。结果如图7所示，饲喂微囊化复合益生菌(Ⅶ)后能显著提高肉鸡平均日增重及 平均日采食量。
肝脏、脾脏和淋巴结中载菌量：每组选10只，在无菌环境取出肉鸡肝脏、 脾脏和肠系膜淋巴结，各剪取1g研磨，取适量组织液涂板计数。结果如图8 所示，饲喂微囊化复合益生菌(Ⅶ)后肉鸡肝脏、脾脏和肠系膜淋巴结中的载 菌量显著下降，说明微囊化复合益生菌能有效阻止病原菌的易位。
免疫水平检测：每组选10只，检测肉鸡血清中IgA、IgG含量。结果如图 9所示，饲喂微囊化复合益生菌(Ⅶ)后肉鸡血清中IgA、IgG含量显著升高， 说明微囊化复合益生菌能提高宿主免疫力，抵抗病原菌侵袭。检测肉鸡血清中 TNF-α、IL-6含量结果如图10所示，饲喂微囊化复合益生菌(Ⅶ)后肉鸡血 清中TNF-α、IL-6含量显著下降，说明微囊化复合益生菌能抑制机体过度炎 症反应。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参 照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可 以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精 神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (9)
1.一种抑菌促生长微囊化复合菌制剂的制备方法，其特征在于：由以下步骤组成，
在水中加入微囊化载体、益生元，静置，加入格氏乳球菌（Lactocolvhuccus garvieae）DC12、乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）DC413、卷曲乳杆菌（Lactobacillus crispatus）DC529，充分混合作为水相；其中，所述格氏乳球菌（Lactococcus garvieae）DC12的保藏编号为GDMCC No：1.2973，所述乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）DC413的保藏编号为 GDMCC No：1.2969，所述卷曲乳杆菌（Lactobacillus crispatus）DC529的保藏编号为GDMCC No：62094；
将所述水相加入油相，搅拌，加入钙盐，反应20~60 min，加入水，得到复合益生菌微胶囊，干燥得到微囊化复合菌制剂；
所述微囊化复合菌制剂中，格氏乳球菌DC12活菌数为107～109CFU/g、乳酸片球菌DC413活菌数为108～109CFU/g、卷曲乳杆菌DC529活菌数为108～109CFU/g。
2.根据权利要求1所述的抑菌促生长微囊化复合菌制剂的制备方法，其特征在于：所述微囊化复合菌制剂中，格氏乳球菌DC12、乳酸片球菌DC413、卷曲乳杆菌DC529的活菌数量比为1：（0.5~5）：（0.5~10）。
3.根据权利要求1或2所述的抑菌促生长微囊化复合菌制剂的制备方法，其特征在于：所述微囊化复合菌制剂中，格氏乳球菌DC12、乳酸片球菌DC413、卷曲乳杆菌DC529的活菌数量比为1：1：（1~3）。
4.根据权利要求1或2所述的抑菌促生长微囊化复合菌制剂的制备方法，其特征在于：所述微囊化载体，包括海藻酸钠，所述海藻酸钠在所述水相中的添加量为1~5%；所述益生元，包括纤维素粉，所述纤维素粉在所述水相中的添加量为0.1~0.3%。
5.根据权利要求1或2所述的抑菌促生长微囊化复合菌制剂的制备方法，其特征在于：所述油相，包括大豆油，所述水相与所述油相的体积比为（0.5~3）：1。
6.根据权利要求1或2所述的抑菌促生长微囊化复合菌制剂的制备方法，其特征在于：所述钙盐，包括氯化钙，所述氯化钙的在油相中的添加量为0.5~2%。
7. 根据权利要求1或2所述的抑菌促生长微囊化复合菌制剂的制备方法，其特征在于：所述油相，包括在大豆油中添加0.1~3%的Span80作为油相，所述搅拌，为60~100 r/min 搅拌20~60 min。
8. 根据权利要求6所述的抑菌促生长微囊化复合菌制剂的制备方法，其特征在于：所述氯化钙以3~5 mL/min的速度逐滴加入。
9.权利要求1所述的方法得到的微囊化复合菌制剂在制备畜禽养殖饲料中的应用，其特征在于：所述微囊化复合菌制剂能够促生长、抗沙门氏菌、提高畜禽免疫水平。
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| 魏衎.鸡源乳酸乳球菌的筛选及其微囊化后对肉仔鸡生长性能的影响.动物营养学报.2011,第23卷(第4期),631-639. * |
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