PL235482B1 - Sposób syntezy pochodnej chitozanu, pochodna chitozanu otrzymana tym sposobem, kompozycja kosmetyczna zawierająca pochodną chitozanu i zastosowanie pochodnej chitozanu - Google Patents

Description

Wynalazek dotyczy sposobu syntezy pochodnej chitozanu w strumieniu mikrofal z utworzeniem wiązania peptydowego, pochodnej chitozanu otrzymanej tym sposobem, kompozycji kosmetycznej zawierającej pochodną chitozanu i zastosowanie pochodnej chitozanu jako środka medycznego.

Stan techniki

Naturalne, nierozpuszczalne w wodzie biopolimery, np. polisacharydy takie jak chitozan obejmują związki zawierające aktywne grupy aminowe lub karboksylowe podatne na tworzenie wiązania peptydowego.

Chitozan jest liniowym polisacharydem złożonym z wielu jednostek D-glukozaminy i N-acetylo-D-glukozoaminy związanych w pozycji β-(1-4). Może być otrzymywany z chityny zwierzęcej lub grzybowej i ma wiele zastosowań w przemyśle kosmetycznym oraz w medycynie.

W stanie techniki stosuje się klasyczną syntezę peptydów na nośniku stałym. Znane są żywice do syntezy peptydów metodą Fmoc/SPPS, warunki zaczepiania pierwszego aminokwasu na żywicy oraz elongacji peptydu poprzez generowanie wiązania peptydowego.

W CA2126132A1 przedstawiono sposób syntezy peptydu na chitozanie. Jednakże rozwiązanie to dotyczy syntezy klasycznej oraz ujawnia zastosowanie dodatkowej cząsteczki wiążącej pomiędzy grupą aminową chitozanu a pierwszym aminokwasem peptydu.

W stanie techniki nie opisywano jednak użycia w pełni biodegradowalnego biopolimeru, takiego jak np., chitozan, jako żywicy do kotwiczenia peptydowych modyfikatorów. W warunkach klasycznej syntezy peptydów reakcja trwa długo, a uzyskane wydajności nie są satysfakcjonujące.

W opisie EP1512773 przedstawiono wprowadzanie biologicznie aktywnych składników do warstwy chitozanu naniesionej na urządzenia medyczne z metalu. Jednak w tym sposobie biocząstki nanosi się jako kolejną warstwę na urządzenie, bez tworzenia specyficznych wiązań kowalencyjnych.

Junjie Li i in., w publikacji pt. „A chitosaneglutathione based injectable hydrogel for suppresion of oxidative stress damage in cardiomyocytes”, Biomaterials 34 (2013) 9071e9081 opisali sposób otrzymywania pochodnych chitozanu, w którym obligatoryjne jest przeprowadzenie chitozanu w chlorochitozan. Sposób ten skutkuje obecnością pochodnych chlorowych w ostatecznym produkcie. Takie zanieczyszczenia uznaje się za niekorzystne w szczególności w zastosowaniach kosmetycznych i medycznych produktu.

Wcześniejsza publikacja Kruma Kafedjiiskiego i in. pt. „Synthesis and in Vitro Evaluation of Novel Chitosan-Glutathione Conjugate” w Pharmaceutical Research (wrzesień 2005) tom 22 nr 9, stanowiąca odnośnik i wykorzystana przez Li i in., również dotyczy sposobu otrzymywania pochodnej chitozanu, w którym konieczne jest przeprowadzenie chitozanu w chlorochitozan w celu utworzenia wiązania kowalencyjnego. Cząsteczka zsyntezowana sposobem opisanym w przedstawionym powyżej stanie techniki charakteryzuje się dobrą rozpuszczalnością pochodnej w wodzie.

Publikacje ze stanu techniki wyraźnie wskazują na konieczność wytworzenia chlorowej pochodnej chitozanu. Nie ma natomiast żadnej wzmianki w stanie techniki odnośnie do zastosowania mikrofal do uzyskiwania pochodnej chitozanu.

Klasyczna synteza peptydów na nośniku stałym wiąże się z szeregiem niedogodności, z których najważniejsze są bardzo mała wydajność i bardzo długie czasy prowadzenia reakcji.

Przedstawione w opisie rozwiązania rozwiązują problem sposobu syntezy zapewniającej odpowiednią wydajność, która umożliwiałaby przemysłowe zastosowanie uzyskanych pochodnych oraz problem dostarczenia na skalę przemysłową cząsteczek aktywnych opartych na bezpiecznych, nietoksycznych, ulegających biodegradacji nośnikach, takich jak na przykład chitozan.

Istota wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób syntezy pochodnej chitozanu, charakteryzujący się tym, że prowadzi się w strumieniu mikrofal reakcję wiązania pomiędzy grupą aminową każdego meru w chitozanie a jedną z dostępnych grup karboksylowych glutationu, do utworzenia wiązania peptydowego, w którym to sposobie:

a. prowadzi się reakcję Fmoc-Cl glutationu, w odpowiednim rozpuszczalniku, korzystnie dioksanie do uzyskania Fmoc-tripeptydu,

b. poddaje się Fmoc-glutation w rozpuszczalniku, korzystnie DMF, reakcji z chitozanem, opcjonalnie w obecności HBTU, HOBt i DIPEA, w strumieniu mikrofal,

c. usuwa się grupę zabezpieczającą Fmoc z glutationu, po czym

PL 235 482 B1

d. zawiesza się w destylowanej wodzie i liofilizuje biopolimer z zakotwiczonym wiązaniem kowalencyjnym na powierzchni tripeptydem.

Korzystnie w sposobie syntezy według wynalazku reakcję tworzenia wiązania peptydowego prowadzi się jedynie w strumieniu mikrofal i uzyskuje się produkt wolny od aktywatorów. Korzystnie działanie mikrofal stosuje się przez 1 do 30 minut. W korzystnym rozwiązaniu reakcję prowadzi się w temperaturze w zakresie od poniżej 50 do 75°C.

Przedmiotem wynalazku jest pochodna chitozanu, który jest zmodyfikowany glutationem związanym z cząsteczką chitozanu wiązaniem peptydowym oraz otrzymana sposobem według wynalazku. Korzystnie pochodna chitozanu jest ponadto wolna od aktywatorów.

Przedmiotem wynalazku jest kompozycja kosmetyczna zawierająca pochodną chitozanu według wynalazku, korzystnie w postaci maści, kremu, lotionu, mleczka.

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie pochodnej chitozanu otrzymanej sposobem według wynalazku do wytwarzania środka medycznego.

Szczegółowy opis wynalazku

Ogólnie, w opisie przedstawia się pochodną nierozpuszczalnego biopolimeru zawierającego reaktywne grupy aminowe lub karboksylowe zmodyfikowana za pomocą molekuły modyfikatora z wykorzystaniem tworzenia wiązania peptydowego. Biopolimerem może być polioligosacharyd, zwłaszcza chitozan. Wiązanie peptydowe jest obecne pomiędzy grupą aminową każdego meru poli(2-deoksy-2-aminoglukozy), a jedną z dostępnych grup karboksylowych modyfikatora peptydowego. Grupa zawierająca resztę aminokwasową może być wybrana spośród: aminokwasów, analogów aminokwasów, dipeptydów, tripeptydów, tetrapeptydów oraz dłuższych peptydów i białek i mimetyków białek.

W niniejszym ujawnieniu sposób syntezy pochodnej nierozpuszczalnego biopolimeru polega na wytwarzaniu wiązania peptydowego pomiędzy grupą aminową każdego meru w biopolimerze zawierającego reaktywne grupy aminowe lub karboksylowe, a jedną z dostępnych grup karboksylowych lub aminowych przyłączanej cząsteczki modyfikatora.

Ogólnie, sposób obejmuje etapy, w których

a) cząsteczkę modyfikatora poddaje się reakcji Fmoc-Cl w odpowiednim rozpuszczalniku, korzystnie dioksanie;

b) Fmoc-cząsteczkę modyfikatora rozpuszczona w rozpuszczalniku, korzystnie DMF, poddaje się reakcji z biopolimerem w obecności HBTU, HOBt i DIPEA;

c) usuwa się grupę zabezpieczającą Fmoc z cząsteczki modyfikatora oraz

d) biopolimer z zakotwiczoną na powierzchni cząsteczką modyfikatora zawiesza się w destylowanej wodzie i liofilizuje.

Ujawniono także sposób, w którym wytwarza się wiązanie peptydowe pomiędzy grupą aminową każdego meru poli(2-deoksy-2-aminoglukozy), w którym wiązanie peptydowe pomiędzy biozgodnym polimerem, a modyfikatorem wytwarza się w strumieniu mikrofal.

Etap uzyskiwania cząsteczki peptydu zabezpieczonej Fmoc może być pominięty.

Sposób może również obejmować etapy, w których

a) poddaje się działaniu mikrofal biopolimer w odpowiednim rozpuszczalniku,

b) dodaje się aktywatory do zaktywowania grupy funkcyjnej biopolimeru,

c) dodaje się niezabezpieczoną cząsteczkę modyfikatora i

d) mieszaninę reakcyjną poddaje się działaniu mikrofal,

e) uzyskany modyfikowany biopolimer przemywa się i liofilizuje.

W sposobie syntezy według wynalazku biopolimerem jest chitosan, a cząsteczką modyfikatora jest glutation. Jednak możliwa jest sytuacja, czy cząsteczką modyfikatora jest cząsteczka aminokwasowa, analogu aminokwasu, dipeptydu, tripeptydu, tetrapeptydu oraz dłuższych peptydów i białek, a także mimetyków białek, korzystnie cząsteczką tripeptydu jest glutation.

Opisano tu także kompozycję kosmetyczną lub farmaceutyczną zawierającą pochodną biopolimeru. Kompozycja może być w postaci maści, kremu, lotionu, mleczka. Kompozycja według wynalazku ma zastosowanie w medycynie, w środkach medycznych lub kosmetycznych.

Pochodna może być również stosowana jako matryca do kotwiczenia peptydowych modyfikatorów zawierająca pochodną biopolimeru według wynalazku, a nawet do oczyszczania odpadów przemysłowych i komunalnych albo do odzyskiwania metali.

Termin „nierozpuszczalny biopolimer” oznacza wszystkie związki chemiczne składające się z jednostek - merów, związki te zawierają aktywne grupy aminowe lub karboksylowe podatne na tworzenie

PL 235 482 B1 wiązania peptydowego. Związki te są zasadniczo nierozpuszczalne w wodzie. Przykładem nierozpuszczalnego biopolimeru jest celuloza lub chitozan.

Chitozan jest praktycznie nierozpuszczalny w wodzie oraz rozpuszczalnikach organicznych do syntezy peptydów, jest natomiast reaktywny chemicznie, co umożliwia jego wykorzystanie jako nośnika do kotwiczenia peptydów.

Przedmiotem wynalazku jest modyfikacja chitozanu związkami peptydowymi peptydami, peptydomimetykami lub molekułami zawierającymi aktywne dla tworzenia wiązania peptydowego grupy karboksylowe w klasycznych warunkach tworzenia wiązania peptydowego oraz w strumieniu mikrofal.

Przez dobór odpowiedniego peptydowego modyfikatora można uzyskiwać pożądane właściwości poddanego modyfikacji biopolimeru. Na przykład poprzez zakotwiczenie cząsteczki glutationu - tripeptydu tworzącego kompleksy ze srebrem, na każdej jednostce momomerycznej budującej polimer, możliwe jest znaczne zwiększenie zdolności chitozanu do chelatacji srebra. Dobór odpowiednich modyfikatorów może wpływać na szereg cech biopolimeru, począwszy od rozpuszczalności, czy wartości pH po zawieszeniu w wodzie, aż po właściwości grzybobójcze i bakteriobójcze.

W sposobie syntezy modyfikowanego glutationem chitozanu według wynalazku stosuje się komercyjnie dostępny chitozan lub inny nierozpuszczalny biopolimer cechujący się obecnością reaktywnych grup aminowych lub karboksylowych oraz peptydowy modyfikator.

W sposobie syntezy modyfikowanego glutationem chitozanu według wynalazku tworzy się wiązania peptydowe pomiędzy grupą aminową cząsteczki poli(2-deoksy-2-aminoglukozy), gdzie 2-deoksy-2-aminoglukoza jest monomerem tworzącym strukturę chitozanu, a jedną z dostępnych grup karboksylowych cząsteczki glutationu według strategii syntezy opracowanej na potrzeby wynalazku i w zoptymalizowanych warunkach. W reakcji używany jest Fmoc-glutation z zabezpieczoną, według procedury opisanej w przykładzie 1, aminową grupą funkcyjną. Stosowaną w reakcji tworzenia wiązania peptydowego procedurę opisuje przykład 2.

W sposobie według wynalazku do syntezy nowych pochodnych została zastosowana reakcja sprzęgania w strumieniu mikrofal. Mikrofale dodatkowo aktywują grupy aminowe biopolimeru oraz wpływając na jego strukturę ułatwiają małym molekułom modyfikatora dostęp do odpowiednich grup funkcyjnych biopolimeru.

W sposobie tworzenia wiązania peptydowego według wynalazku istotna jest rola mikrofal. Generowanie wiązania peptydowego w strumieniu mikrofal znacznie zwiększa wydajność reakcji (10-krotnie, wzrost od 0,3% do 30%) oraz istotnie skraca czas jej trwania (3x2,5h=7,5h=450 minut skrócone do 20 minut). Umożliwia także pominięcie trudnego i kosztownego etapu zabezpieczania grupy aminowej peptydowego modyfikatora.

W pierwszym etapie reakcji biopolimer jest silnie aktywowany w strumieniu mikrofal, co czyni jego grupy funkcyjne znacznie bardziej aktywnymi od grup funkcyjnych peptydowego modyfikatora. Następnie zachodzi sprzęganie molekuł modyfikatora z odpowiednimi grupami funkcyjnymi biopolimeru i osadzanie modyfikatora na nośniku. Możliwą reakcją uboczną jest tworzenie di-, tri-, a nawet polimerów zbudowanych z cząstek niezablokowanego peptydowego modyfikatora. Reakcja ta została ograniczona poprzez wcześniejszą aktywację biopolimeru i uprzywilejowanie reakcji biopolimer - peptydowy modyfikator. Możliwość rezygnacji z zabezpieczania grupy aminowej peptydowego modyfikatora chlorkiem fluorenylometoksykarbonylu umożliwia ominięcie dwóch etapów reakcji: zabezpieczenia grupy aminowej oraz zdjęcia zabezpieczenia po reakcji sprzęgania. Stanowi to podstawę dla znacznej redukcji kosztów reakcji oraz wyraźny krok w stronę zielonej chemii. Szkodliwy dla środowisk a naturalnego chlorek fluorenylometoksykarbonylu nie jest używany w żadnym etapie reakcji, która jest prowadzona z użyciem biozgodnego polimeru, biodegradowalnych peptydowych modyfikatorów, popularnych aktywatorów oraz lotnych rozpuszczalników.

Wyselekcjonowany bioorganiczny polimer - chitozan otrzymuje się poprzez izolację z materiału zwierzęcego lub grzybowego, co czyni go łatwo dostępnym i tanim. Jest to związek całkowicie nietoksyczny, zatem jego użycie, nawet w skali przemysłowej, nie spowoduje zanieczyszczenia środowiska. Istotną cechą polimeru jest biozgodność. Kolejne zalety to wysoka adhezyjność i pojemność sorpcyjna, duża reaktywność chemiczna oraz zdolność do chelatacji metali, ze względu na obecność licznych grup kotwiczących na powierzchni. W środowisku wodnym oddziałuje on z jonami metali tworząc wiązania koordynacyjne. Ze względu na możliwość przyjmowania wielu konformacji przestrzennych, polimer może także zamykać jony metali wewnątrz swojej struktury. W przypadku srebra powoduje jego częściową redukcję do metalicznego srebra, co ułatwia odzysk metalu z roztworu. Niewątpliwą korzyścią

PL 235 482 B1 jest również znalezienie matrycy do kotwiczenia peptydowych modyfikatorów, która jest całkowicie nietoksyczna i przyjazna dla środowiska naturalnego. Dostępne komercyjnie polimery wiążące srebro, na przykład Amberlite GT73 zbudowany na bazie styrenu-diwinylobenzenu, nie są biodegradowalne w glebie, ani wodzie oraz wymagają specjalnego składowania i utylizacji odpadów.

Manipulacja właściwościami biopolimeru, a szczególnie właściwościami dotyczącymi zwiększania siły wiązania metali lub nadawania selektywności wiązaniu otwiera szerokie horyzonty dla różnych zastosowań modyfikowanych biopolimerów, między innymi w kosmetyce, farmacji oraz ochronie środowiska.

Krótki opis rysunku:

Sposób według wynalazku w przykładzie realizacji jest bliżej objaśniony w oparciu o rysunki, na których:

Fig. 1 przedstawia schemat reakcji modyfikacji chitozanu peptydowym modyfikatorem w warunkach tworzenia wiązania peptydowego.

Fig. 2 przedstawia widmo ESI-MS produktu reakcji otrzymywania 9-Fluorenylometoksykarbonylo-glutationu.

Fig. 3 przedstawia porównanie zachowania komercyjnego chitozanu (A) oraz modyfikowanego glutationem chitozanu (A[GSH]) w kontakcie z 50 mM roztworem chlorku niklu(II). Na fig. 3 widoczny jest brunatny osad w probówce oznaczonej (A) oraz zielony osad w probówce oznaczonej (A[GSH]). Niklowe kompleksy z niezmodyfikowanym chitozanem mają zieloną barwę, niklowe kompleksy z modyfikowanym glutationem chitozanem mają barwę brunatną.

Fig. 4 przedstawia wykres ilustrujący porównanie siły wiązania niklu przez komercyjny chitozan (A) oraz modyfikowany glutationem produkt reakcji (A[GSH]).

Poniżej przedstawiono przykłady wykonania wynalazku. Przykłady stanowią jedynie ilustrację wynalazku, lecz nie ograniczają jego zakresu, który został zdefiniowany w zastrzeżeniach.

P r z y k ł a d I

Otrzymywanie 9-fluorenyIometoksykarbonylo-glutationu g glutationu (10 mmoli) rozpuszczono w mieszaninie 26 ml dioksanu i 68 ml 10% NaCOs w 200 ml kolbie trójszyjnej w warunkach beztlenowych. Kolbę zaopatrzoną we wkraplacz, element mieszający, balon z argonem i bubler zamontowano nad mieszadłem magnetycznym. 2,71 g Fmoc-Cl (10,5 mmola) rozpuszczono w 26 ml dioksanu i wkraplano powoli przez 15 minut. Podczas wkraplania utrzymywano reakcję w kąpieli lodowej. Po zakończeniu wkraplania łaźnię lodową usunięto. Reakcję prowadzono w atmosferze argonu przez 10 godzin, monitorując postęp reakcji za pomocą techniki ESI MS. Następnie roztwór zakwaszono do pH®3. Wytrącony osad odsączono na lejku Schotta. Pozostały roztwór odparowywano, aż do wytrącenia znacznej ilości osadu. Osad odsączono na lejku Schotta i przemyto wodą destylowaną. Otrzymano Fmoc-glutation o masie molowej 529,17 g/mol (Fig. 2).

P r z y k ł a d II

Kotwiczenie glutationu na chitozanie

0,68 g chitozanu umieszczono w naczyniu reakcyjnym do syntezy peptydów na nośniku stałym. 3 g Fmoc-glutationu (3 eq) rozpuszczono w 20 ml DMF, do rozpuszczonego peptydu dodano 2,14 g (3 eq) HBTU, 1,29 g (3 eq) HOBt oraz 1,98 ml (6 eq) DIPEA. Reagenty wymieszano i przeniesiono do naczynia reakcyjnego zawierającego chitozan. Pozostawiono na 2,5 godziny, mieszając na wytrząsarce laboratoryjnej. Procedurę powtórzono 3-krotnie. Następnie roztwór odsączono, a biopolimer przemyto 3-krotnie DMF. W celu zdjęcia grupy zabezpieczającej Fmoc z glutationu, do naczynia reakcyjnego z biopolimerem 2-krotnie dodawano 20% roztwór piperydyny w DMF i wytrząsano 20 minut. Po zdjęciu grupy zabezpieczającej Fmoc, biopolimer przemyto 3-krotnie DMF. Roztwór DMF odessano, a biopolimer z zakotwiczonym na powierzchni glutationem zawieszono w destylowanej wodzie i zliofilizowano. Wydajność reakcji oznaczona za pomocą analizy elementarnej W < 0,3%.

P r z y k ł a d III

Kotwiczenie glutationu na chitozanie w strumieniu mikrofal metodą I z użyciem DCC oraz HOPfp

2,27 g chitozanu zawieszonego w 5 ml roztworu (2:1 DMF : H2O) umieszczono w naczyniu reakcyjnym do syntezy mikrofalowej i poddano działaniu mikrofal (t=5 minut, P=25 W, T=75°C). 0,613 g HOPfp oraz 0,687 g DCC rozpuszczono w 5 ml roztworu (2:1 DMF : H2O) i dodano do naczynka reakcyjnego. Chitozan wraz z aktywatorami poddano działaniu mikrofal (t=5 minut, P=25

PL 235 482 B1

W, T=75°C). W ten sposób aktywowano grupy funkcyjne biopolimeru. Następnie do naczyn ka dodano 0,568 g niezabezpieczonego grupą Fmoc glutationu w 5 ml DMF i poddano dwukrotnie działaniu mikrofal (t=5 minut, P=12 W, T<50°C). Zawiesinę przeniesiono do naczynia odpowiedniego do wirowania i żwirowano. Supernatant zlano znad osadu. Trzykrotnie zawieszano uzyskany modyfikowany biopolimer w nowej porcji DMF, a następnie zwirowywano i zlewano supernatant. Czynność powtórzono dla chlorku metylenu. Po trzykrotnym przemyciu chlorkiem metylenu osad zamrożono w ciekłym azocie i poddano liofilizacji. Zliofilizowany osad przemyto trzykrotnie wodą destylowaną i ponownie zliofilizowano. Za pomocą techniki analizy elementarnej wykryto obecność siarki, a zatem molekuł glutationu zakotwiczonych na powierzchni polimeru. Wydajność reakcji oznaczona za pomocą analizy elementarnej wynosi 23%.

P r z y k ł a d IV

Kotwiczenie glutationu na chitozanie w strumieniu mikrofal metodą II z użyciem HBTU, HOBT oraz DIPEA.

2,27 g chitozanu zawieszonego w 5 ml DMF umieszczono w naczyniu reakcyjnym do syntezy mikrofalowej i poddano działaniu mikrofal (t=5 minut, P=25 W, T=75°C). 2,14 g HBTU oraz 1,29 g HOBT oraz 1,98 ml DIPEA w 5 ml roztworu dodano do naczynka reakcyjnego. Chitozan wraz z aktywatorami poddano działaniu mikrofal (t=5 minut, P=25 W, T=75°C). W ten sposób aktywowano grupy funkcyjne biopolimeru. Następnie do naczynka dodano 0,568 g niezabezpieczonego grupą Fmoc glutationu w 5 ml DMF i poddano dwukrotnie działaniu mikrofal (t=5 minut, P=12 W, T<50°C). Zawiesinę przeniesiono do naczynia odpowiedniego do wirowania i zwirowano. Supernatant zlano znad osadu. Trzykrotnie zawieszano uzyskany modyfikowany biopolimer w nowej porcji DMF, a następnie zwirowywano i zlewano supernatant. Czynność powtórzono dla chlorku metylenu. Po trzykrotnym przemyciu chlorkiem metylenu osad zamrożono w ciekłym azocie i poddano liofilizacji. Zliofilizowany osad przemyto trzykrotnie wodą destylowaną i ponownie zliofilizowano. Wydajność reakcji oznaczona za pomocą analizy elementarnej wynosi 30%.

P r z y k ł a d V

Kotwiczenie bacytracyny na chitozanie w strumieniu mikrofal metodą II z użyciem HBTU, HOBT oraz DIPEA.

2,27 g chitozanu zawieszonego w 5 ml DMF umieszczono w naczyniu reakcyjnym do syntezy mikrofalowej i poddano działaniu mikrofal (t=5 minut, P=25 W, T=75°C). 2,14 g HBTU oraz 1,29 g HOBT oraz 1,98 ml DIPEA w 5 ml roztworu dodano do naczynka reakcyjnego. Chitozan wraz z aktywatorami poddano działaniu mikrofal (t=5 minut, P=25 W, T=75°C). W ten sposób aktywowano grupy funkcyjne biopolimeru. Następnie do naczynka dodano 2,630 g bacytracyny rozpuszczonej w 5 ml DMF:H2O w stosunku 1:1 i poddano dwukrotnie działaniu mikrofal (t=5 minut, P=12 W, T<50°C). Zawiesinę przeniesiono do naczynia odpowiedniego do wirowania i zwirowano. Supernatant zlano znad osadu. Trzykrotnie zawieszano uzyskany modyfikowany biopolimer w nowej porcji DMF, a następnie zwirowywano i zlewano supernatant. Czynność powtórzono dla chlorku metylenu. Po trzykrotnym przemyciu chlorkiem metylenu osad zamrożono w ciekłym azocie i poddano liofilizacji. Zliofilizowany osad przemyto trzykrotnie wodą destylowaną i ponownie zliofilizowano. Wydajność reakcji oznaczona za pomocą analizy elementarnej wynosi 44%.

P r z y k ł a d VI

Kotwiczenie tykarcykliny na chitozanie w strumieniu mikrofal metodą II z użyciem HBTU, HOBT oraz DIPEA.

2,27 g chitozanu zawieszonego w 5 ml DMF umieszczono w naczyniu reakcyjnym do syntezy mikrofalowej i poddano działaniu mikrofal (t=5 minut, P=25 W, T=75°C). 2,14 g HBTU oraz 1,29 g HOBT oraz 1,98 ml DIPEA w 5 ml roztworu dodano do naczynka reakcyjnego. Chitozan wraz z aktywatorami poddano działaniu mikrofal (t=5 minut, P=25 W, T=75°C). W ten sposób aktywowano grupy funkcyjne biopolimeru. Następnie do naczynka dodano 0,792 g tykarcykliny rozpuszczonej w 5 ml DMF:H2O w stosunku 1:1 i poddano dwukrotnie działaniu mikrofal (t=5 minut, P=12 W, T<50°C). Zawiesinę przeniesiono do naczynia odpowiedniego do wirowania i zwirowano. Supernatant zlano znad osadu. Trzykrotnie zawieszano uzyskany modyfikowany biopolimer w nowej porcji DMF, a następnie zwirowywano i zlewano supernatant. Czynność powtórzono dla chlorku metylenu. Po trzykrotnym przemyciu chlorkiem metylenu osad zamrożono w ciekłym azocie i poddano liofilizacji. Zliofilizowany osad przemyto trzykrotnie wodą destylowaną i ponownie zliofilizowano. Wydajność reakcji oznaczona za pomocą analizy elementarnej wynosi 18%.

PL 235 482 B1

P r z y k ł a d VII

Porównanie zdolności wiązania niklu(II) przez substrat oraz produkt reakcji z detekcją UV-Vis

Przygotowano roztwór wzorcowy chlorku niklu(II) o znanym stężeniu 50 mM. Do 2 probówek odważono kolejno 35 mg niezmodyfikowanego komercyjnie dostępnego chitozanu oraz 35 mg produktu reakcji według wynalazku modyfikowanego glutationem chitozanu, a następnie dodano 1 ml 50 mM roztworu chlorku niklu(II). Zaobserwowano odbarwienie jasnozielonego roztworu chlorku niklu(Il) oraz zmianę barwy polimeru, w przypadku niemodyfikowanego chitozanu na zieloną, natomiast w przypadku produktu reakcji na brunatną (Fig. 3). Osad opada grawitacyjnie na dno probówki, a nad nim widoczny jest klarowny, bezbarwny supernatant. Zawartość niklu w supernatancie oznaczono spektrofotometrycznie z użyciem barwnych kompleksów tego metalu z DTT. Zmiany stężenia metalu w roztworze ilustruje wykres (Fig. 4).

Przykłady przemysłowego zastosowania wynalazku:

Zastosowanie nowego odczynnika (modyfikowanego glutationem chitozanu) pozwala na efektywne i proste odzyskiwanie srebra z roztworów wodnych. Użycie dowolnego peptydowego modyfikatora chitozanu umożliwia sterowanie właściwościami chelatacji metali przez biopolimer z zachowaniem jego całkowitej biozgodności i nietoksyczności.

Zastosowanie chitozanu lub innego biozgodnego, podatnego na kotwiczenie na powierzchni peptydowych modyfikatorów biopolimeru, poddanego modyfikacji znanymi antybiotykami używanymi w leczeniu zapalenia skóry może być podstawą do stworzenia nowych materiałów stosowanych w dermatologii.

Jako peptydowe modyfikatory można również wskazać LL-37, peptyd szeroko stosowany w kosmetyce jako przeciwdrobnoustrojowy, kwas laktobionowy pomocny w łagodzeniu trądziku młodzieńczego i gojeniu się ran, a nawet kwas p-aminobenzoesowy stosowany w fotoprotekcji UV(B).

Claims (9)

1. Sposób syntezy pochodnej chitozanu, znamienny tym, że prowadzi się w strumieniu mikrofal reakcję wiązania pomiędzy grupą aminową każdego meru w chitozanie a jedną z dostępnych grup karboksylowych glutationu, do utworzenia wiązania peptydowego, w którym to sposobie: a. prowadzi się reakcję Fmoc-Cl glutationu, w rozpuszczalniku, korzystnie dioksanie do uzyskania Fmoc-tripeptydu,

b. poddaje się Fmoc-glutation w rozpuszczalniku, korzystnie DMF, reakcji z chitozanem, opcjonalnie w obecności HBTU, HOBt i DIPEA, w strumieniu mikrofal,

c. usuwa się grupę zabezpieczającą Fmoc z glutationu, po czym

d. zawiesza się w destylowanej wodzie i liofilizuje biopolimer z zakotwiczonym wiązaniem kowalencyjnym na powierzchni tripeptydem.

2. Sposób syntezy według zastrz. 1, w którym reakcję tworzenia wiązania peptydowego prowadzi się jedynie w strumieniu mikrofal i uzyskuje się produkt wolny od aktywatorów.

3. Sposób syntezy według zastrz. 1 albo 2 znamienny tym, że działanie mikrofal stosuje się przez 1 do 30 minut.

4. Sposób syntezy według zastrz. 1-3, w którym reakcję prowadzi się w temperaturze w zakresie od poniżej 50 do 75°C.

5. Pochodna chitozanu znamienna tym, że cząsteczka chitozanu jest zmodyfikowana glutationem związanym z cząsteczką chitozanu wiązaniem peptydowym oraz jest otrzymana sposobem określonym w zastrz. 1-3.

6. Pochodna chitozanu według zastrz. 5, znamienna tym, że jest ponadto wolna od aktywatorów.

7. Kompozycja kosmetyczna zawierająca pochodną chitozanu określoną w zastrz. 1-3.

8. Kompozycja według zastrz. 7, znamienna tym, że jest w postaci maści, kremu, lotionu, mleczka.

9. Zastosowanie pochodnej chitozanu otrzymanej sposobem określonym w zastrz. 1-3 do wytwarzania środka medycznego.