PL234156B1 - Pochodna polioligosacharydu, chitation i kompozycja farmaceutyczna zawierająca chitation do zastosowania do zapobiegania alergii wywołanej metalami ciężkimi - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Wynalazek dotyczy nowej pochodnej glutationowej chitozanu, chitationu, sposobów syntezy chemicznej tej nowej pochodnej chitozanu oraz kompozycji kosmetycznych zawierających nową pochodną chitozanu, chitationu, i zastosowania tej pochodnej i/lub w połączeniu z chitozanem do wytwarzania środków chroniących przed alergią na metale.

Stan techniki

Chitozan jest liniowym polisacharydem złożonym z losowo rozmieszczonych jednostek D-glukozaminy i N-acetylo-D-glukozoaminy związanych w pozycji β-(1-4). Może być otrzymywany z chityny zwierzęcej lub grzybowej i ma wiele zastosowań w przemyśle kosmetycznym oraz w medycynie.

W stanie techniki opisano zastosowanie chitozanu do leczenia podrażnień skóry wywołanych różnymi czynnikami.

W RU 2357738C2 opisano zastosowanie preparatu dermatologicznego zawierającego 1% chlorowodorek chitozanu do zapobiegania i leczenia platynozy.

W zgłoszeniu WO9209636 (A1) ujawniono sposób ochrony skóry przed kontaktem z alergenem lub toksyną obejmujący uprzednie zastosowanie na skórę aminopolisacharyd wybrany spośród polimerów chitozanowych i pochodnych chitozanu. Jednakże w opisie tym nie ma żadnej wzmianki dotyczącej antygenu będącego metalem, ani też o możliwości zastosowania pochodnych chitozanu, w których grupa aminowa byłaby związana wiązaniem peptydowym.

Ponadto z opisu EP1512773 znane jest także powlekanie chitozanem metalowych urządzeń medycznych w celu uczynienia ich biokompatybilnymi i zapobiegania podrażnień organizmu jonami metalu pochodzącego z tych urządzeń.

Alergia na nikiel objawia się najczęściej kontaktowym zapaleniem skóry wywołanym odpowiedzią związaną z limfocytami Th (nadwrażliwość typu IV). Nikiel jest jednym z najczęściej występujących alergenów. Na alergię niklową cierpi ponad 15% populacji wielu krajów Unii Europejskiej (np. Niemiec, Wielkiej Brytanii, Włoch), a w Polsce około 30% dziewcząt w wieku 16-17 lat [Br. J. Dermatol. 2013, 169: 854-858; Contact Dermatitis 2011, 64: 121-125]. Wagę problemu podkreśla również fakt, że ilość niklu uwalniana z biżuterii i narzędzi codziennego użytku jest regulowana dyrektywą EU, Directive 94/27/EC.

Istnieje zatem olbrzymia potrzeba opracowania skutecznego środka przeciwko alergiom na metale, zwłaszcza metale ciężkie w tym szczególnie nikiel.

Istota wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest pochodna chitozanu, chitation, w którym chitozan jest zmodyfikowany glutationem, który jest związany z chitozanem wiązaniem peptydowym.

Przedmiotem wynalazku jest również pochodna chitozanu określona powyżej do zastosowania do zapobiegania objawom alergii wywołanej metalami ciężkimi, korzystnie do zastosowania do zapobiegania objawom alergii skórnej wywołanej kontaktem z metalami ciężkimi, korzystnie niklem.

W kolejnej odmianie, przedmiotem wynalazku jest ponadto kompozycja kosmetyczna zawierająca pochodną chitozanu, chitation i ewentualnie chitozan w połączeniu z podłożem kosmetycznym. Kompozycja korzystnie jest w postaci maści, kremu, lotionu, mleczka. Zgodnie z wynalazkiem kompozycja ma zastosowanie w zapobieganiu objawom alergii wywołanej metalami ciężkimi korzystnie palladem, kobaltem, chromem i złotem, w szczególności do zapobiegania objawom alergii wywołanej niklem.

W pochodnej glutationowej chitozanu wiązanie peptydowe występuje pomiędzy grupą aminową każdego meru poli(2-deoksy-2-aminoglukozy), a jedną z dostępnych grup karboksylowych cząsteczki glutationu.

Chitation, będący pochodną według wynalazku można otrzymać sposobem obejmującym etapy, w których:

a) prowadzi się reakcję Fmoc-Cl tripeptydu, w odpowiednim rozpuszczalniku, korzystnie dioksanie do uzyskania Fmoc-tripeptydu,

b) poddaje się Fmoc-tripeptyd w rozpuszczalniku, korzystnie DMF, reakcji z chitozanem w obecności HBTU, HOBt i DIPEA,

c) usuwa się grupę zabezpieczającą Fmoc z glutationu, po czym

d) zawiesza się w destylowanej wodzie i liofilizuje biopolimer z zakotwiczonym na powierzchni glutationem.

PL 234 156 B1

Wiązanie peptydowe pomiędzy polioligosacharydem, a peptydowym modyfikatorem tworzy się w strumieniu mikrofal. W sposobie otrzymywania chitationu, jako tripeptyd stosuje się glutation.

Kotwiczenie glutationu na chitozanie można prowadzić w strumieniu mikrofal z użyciem aktywatorów, z pominięciem etapu uzyskiwania Fmoc-tripeptydu.

Synteza może obejmować etapy, w których:

a) chitozan poddaje się działaniu mikrofal w odpowiednim rozpuszczalniku,

b) dodaje się aktywatory do zaktywowania grupy funkcyjnej chitozanu i poddaje się działaniu mikrofal,

c) dodaje się niezabezpieczony glutation i mieszaninę reakcyjną poddaje się działaniu mikrofal,

d) przemywa się i liofilizuje uzyskany chitation.

Jako aktywatory mogą być stosowane HBTU, HOBT i DIPEA albo DCC i HOPfp. Działanie mikrofal stosuje się przez 1 do 20 minut.

Szczegółowy opis wynalazku

W sposobie syntezy modyfikowanego glutationem chitozanu według wynalazku stosuje się komercyjnie dostępny chitozan lub inny nierozpuszczalny biopolimer cechujący się obecnością reaktywnych grup aminowych lub karboksylowych oraz peptydowy modyfikator.

W sposobie syntezy modyfikowanego glutationem chitozanu według wynalazku tworzy się wiązania peptydowe pomiędzy grupą aminową każdego meru cząsteczki poli(2-deoksy-2-aminoglukozy) będącej monomerem tworzącym strukturę chitozanu, a jedną z dostępnych grup karboksylowych cząsteczki glutationu według strategii syntezy opracowanej na potrzeby wynalazku i w zoptymalizowanych warunkach. W reakcji używany jest Fmoc-glutation z zabezpieczoną, według procedury opisanej w przykładzie 1, aminową grupą funkcyjną. Stosowaną w reakcji tworzenia wiązania peptydowego procedurę opisuje przykład 2.

W sposobie syntezy nowej pochodnej została zastosowana reakcja sprzęgania w strumieniu mikrofal. Mikrofale dodatkowo aktywują grupy aminowe biopolimeru oraz wpływając na jego strukturę ułatwiają małym molekułom modyfikatora dostęp do odpowiednich grup funkcyjnych biopolimeru.

W sposobie tworzenia wiązania peptydowego istotna jest rola mikrofal. Generowanie wiązania peptydowego w strumieniu mikrofal znacznie zwiększa wydajność reakcji oraz istotnie skraca czas jej trwania. Umożliwia także pominięcie trudnego i kosztownego etapu zabezpieczania grupy aminowej peptydowego modyfikatora.

W pierwszym etapie reakcji to biopolimer jest silnie aktywowany w strumieniu mikrofal, co czyni jego grupy funkcyjne znacznie bardziej aktywnymi od grup funkcyjnych peptydowego modyfikatora. Następuje sprzęganie cząsteczek glutationu z odpowiednimi grupami funkcyjnymi biopolimeru i osadzanie modyfikatora na nośniku. Możliwą reakcją uboczną jest tworzenie di-, tri-, a nawet polimerów zbudowanych z cząstek niezablokowanego peptydowego modyfikatora. Reakcja ta została ograniczona poprzez wcześniejszą aktywację biopolimeru i uprzywilejowanie reakcji biopolimer - peptydowy modyfikator. Możliwość rezygnacji z zabezpieczania grupy aminowej peptydowego modyfikatora chlorkiem fluorenylometoksykarbonylu umożliwia ominięcie dwóch etapów reakcji: zabezpieczenia grupy aminowej oraz zdjęcia zabezpieczenia po reakcji sprzęgania. Stanowi to podstawę dla znacznej redukcji kosztów reakcji oraz wyraźny krok w stronę zielonej chemii. Szkodliwy dla środowiska naturalnego chlorek fluorenylometoksykarbonylu nie jest używany w żadnym etapie reakcji, która jest prowadzona z użyciem biozgodnego polimeru, biodegradowalnych peptydowych modyfikatorów, popularnych aktywatorów oraz lotnych rozpuszczalników.

Wyselekcjonowany bioorganiczny polimer - chitozan otrzymuje się poprzez izolację z materiału zwierzęcego lub grzybowego, co czyni go łatwo dostępnym i tanim. Jest to związek całkowicie nietoksyczny, zatem jego użycie, nawet w skali przemysłowej, nie spowoduje zanieczyszczenia środowiska. Istotną cechą polimeru jest biozgodność. Kolejne zalety to wysoka adhezyjność i pojemność sorpcyjna, duża reaktywność chemiczna oraz zdolność do chelatacji metali, ze względu na obecność licznych grup kotwiczących na powierzchni. W środowisku wodnym oddziałuje on z jonami metali tworząc wiązania wodorowe. Ze względu na możliwość przyjmowania wielu konformacji przestrzennych, polimer może także zamykać jony metali wewnątrz swojej struktury. W przypadku srebra powoduje jego częściową redukcję do metalicznego srebra, co ułatwia odzysk metalu z roztworu. Niewątpliwą korzyścią jest również znalezienie matrycy do kotwiczenia peptydowych modyfikatorów, która jest całkowicie nietoksyczna i przyjazna dla środowiska naturalnego. Dostępne komercyjnie polimery wiążące srebro, na przykład Amberlite GT73 zbudowany na bazie styrenu-diwinylobenzenu, nie są biodegradowalne w glebie, ani wodzie oraz wymagają specjalnego składowania i utylizacji odpadów.

PL 234 156 B1

Manipulacja właściwościami biopolimeru, a szczególnie właściwościami dotyczącymi zwiększania siły wiązania metali lub nadawania selektywności wiązaniu otwiera szerokie horyzonty dla różnych zastosowań modyfikowanych biopolimerów, między innymi w kosmetyce, farmacji oraz ochronie środowiska.

Krótki opis rysunku

Wynalazek w przykładach realizacji został bardziej szczegółowo objaśniony w oparciu o rysunek, na którym:

fig. 1 przedstawia schemat reakcji modyfikacji chitozanu peptydowym modyfikatorem w warunkach tworzenia wiązania peptydowego.

fig. 2 przedstawia widmo ESI-MS produktu reakcji otrzymywania 9-fluorenylometoksykarbonylo-glutationu.

fig. 3 przedstawia porównanie zachowania komercyjnego chitozanu (A) oraz modyfikowanego glutationem (A[GSH]) chitozanu w kontakcie z 50 mM roztworem chlorku niklu(II). Na fig. 3 widoczny jest brunatny osad w probówce oznaczonej (A) oraz zielony osad w probówce oznaczonej (A[GSH]). Niklowe kompleksy z niezmodyfikowanym chitozanem mają zieloną barwę, niklowe kompleksy z modyfikowanym glutationem chitozanem mają barwę brunatną.

fig. 4 przedstawia wykres ilustrujący porównanie siły wiązania niklu przez komercyjny chitozan (A) oraz modyfikowany glutationem produkt reakcji (A[GSH]).

Poniżej przedstawiono przykłady wykonania wynalazku. Należy wskazać, że poniższe przykłady nie stanowią ograniczenia wynalazku, lecz przedstawiają jego najkorzystniejszą realizację.

P r z y k ł a d I

Otrzymywanie 9-fluorenylometoksykarbonylo-glutationu.

g glutationu (10 mmoli) rozpuszczono w mieszaninie 26 ml dioksanu i 68 ml 10% NaCOs w 200 ml kolbie trójszyjnej w warunkach beztlenowych. Kolbę zaopatrzoną we wkraplacz, element mieszający, balon z argonem i bubler zamontowano nad mieszadłem magnetycznym. 2,71 g Fmoc-Cl (10,5 mmola) rozpuszczono w 26 ml dioksanu i wkraplano powoli przez 15 minut. Podczas wkraplania utrzymywano reakcję w kąpieli lodowej. Po zakończeniu wkraplania łaźnię lodową usunięto. Reakcję prowadzono w atmosferze argonu przez 10 godzin, monitorując postęp reakcji za pomocą techniki ESI MS. Następnie roztwór zakwaszono do pH=3. Wytrącony osad odsączono na lejku Schotta. Pozostały roztwór odparowywano, aż do wytrącenia znacznej ilości osadu. Osad odsączono na lejku Schotta i przemyto wodą destylowaną. Otrzymano Fmoc-glutation o masie molowej 529,17 g/mol.

P r z y k ł a d II

Kotwiczenie glutationu na chitozanie.

0,68 g chitozanu umieszczono w naczyniu reakcyjnym do syntezy peptydów na nośniku stałym. 3 g Fmoc-glutationu (3 eq) rozpuszczono w 20 ml DMF, do rozpuszczonego peptydu dodano 2,14 g (3 eq) HBTU, 1,29 g (3 eq) HOBt oraz 1,98 ml (6 eq) DIPEA. Reagenty wymieszano i przeniesiono do naczynia reakcyjnego zawierającego chitozan. Pozostawiono na 2,5 godziny, mieszając na wytrząsarce laboratoryjnej. Procedurę powtórzono 3-krotnie. Następnie roztwór odsączono, a biopolimer przemyto 3-krotnie DMF. W celu zdjęcia grupy zabezpieczającej Fmoc z glutationu, do naczynia reakcyjnego z biopolimerem 2-krotnie dodawano 20% roztwór piperydyny w DMF i wytrząsano 20 minut. Po zdjęciu grupy zabezpieczającej Fmoc, biopolimer przemyto 3-krotnie DMF. Roztwór DMF odessano, a biopolimer z zakotwiczonym na powierzchni glutationem zawieszono w destylowanej wodzie i zliofilizowano.

P r z y k ł a d III

Kotwiczenie glutationu na chitozanie w strumieniu mikrofal metodą I z użyciem DCC oraz HOPfp.

2,27 g chitozanu zawieszonego w 5 ml roztworu (2:1 DMF : H2O) umieszczono w naczyniu reakcyjnym do syntezy mikrofalowej i poddano działaniu mikrofal (t=5 minut, P=25 W, T=75°C). 0,613 g HOPfp oraz 0,687 g DCC rozpuszczono w 5 ml roztworu (2:1 DMF : H2O) i dodano do naczynka reakcyjnego. Chitozan wraz z aktywatorami poddano działaniu mikrofal (t=5 minut, P=25 W, T=75°C). W ten sposób aktywowano grupy funkcyjne biopolimeru. Następnie do naczynka dodano 0,568 g niezabezpieczonego grupą Fmoc glutationu w 5 ml DMF i poddano dwukrotnie działaniu mikrofal (t=5 minut, P=12 W, T<50°C). Zawiesinę przeniesiono do naczynia odpowiedniego do wirowania i zwirowano. Supernatant zlano znad osadu. Trzykrotnie zawieszano uzyskany modyfikowany biopolimer w nowej porcji DMF, a następnie zwirowywano i zlewano supernatant. Czynność powtórzono dla chlorku metylenu. Po trzykrotnym przemyciu chlorkiem metylenu osad zamrożono w ciekłym azocie i poddano liofilizacji. Zliofilizowany osad przemyto trzykrotnie wodą destylowaną i ponownie zliofilizowano.

PL 234 156 Β1

Przykład IV

Kotwiczenie glutationu na chitozanie w strumieniu mikrofal metodą II z użyciem HBTU, HOBT oraz DIPEA.

2,27 g chitozanu zawieszonego w 5 ml DMF umieszczono w naczyniu reakcyjnym do syntezy mikrofalowej i poddano działaniu mikrofal (t=5 minut, P=25 W, T=75°C). 2,14 g HBTU oraz 1,29 g HOBT oraz 1,98 ml DIPEA w 5 ml roztworu dodano do naczynka reakcyjnego. Chitozan wraz z aktywatorami poddano działaniu mikrofal (t=5 minut, P=25 W, T=75°C). W ten sposób aktywowano grupy funkcyjne biopolimeru. Następnie do naczynka dodano 0,568 g niezabezpieczonego grupą Fmoc glutationu w 5 ml DMF i poddano dwukrotnie działaniu mikrofal (t=5 minut, P=12 W, T<50°C). Zawiesinę przeniesiono do naczynia odpowiedniego do wirowania i żwirowano. Supernatant zlano znad osadu. Trzykrotnie zawieszano uzyskany modyfikowany biopolimer w nowej porcji DMF, a następnie zwirowywano i zlewano supernatant. Czynność powtórzono dla chlorku metylenu. Po trzykrotnym przemyciu chlorkiem metylenu osad zamrożono w ciekłym azocie i poddano liofilizacji. Zliofilizowany osad przemyto trzykrotnie wodą destylowaną i ponownie zliofilizowano.

Przykład V

Porównanie zdolności wiązania niklu(ll) przez substrat oraz produkt reakcji za pomocą detekcji UV-Vis.

Przygotowano roztwór wzorcowy chlorku niklu(ll) o znanym stężeniu 50 mM. Do 2 probówek odważono kolejno 35 mg niezmodyfikowanego komercyjnie dostępnego chitozanu oraz 35 mg produktu reakcji według wynalazku modyfikowanego glutationem chitozanu, a następnie dodano 1 ml 50 mM roztworu chlorku niklu(ll). Zaobserwowano odbarwienie jasnozielonego roztworu chlorku niklu(ll) oraz zmianę barwy polimeru, w przypadku niezmodyfikowanego chitozanu na zieloną, natomiast w przypadku produktu reakcji na brunatną (Fig. 3). Osad opada grawitacyjnie na dno probówki, a nad nim widoczny jest klarowny, bezbarwny supernatant. Zawartość niklu w supernatancie oznaczono spektrofotometrycznie z użyciem barwnych kompleksów tego metalu z DTT. Zmiany stężenia metalu w roztworze ilustruje wykres (Fig. 4).

Przykład VI

Wykazanie działania barierowego dla jonów metali, a w szczególności jonów niklu.

W specjalnie zaprojektowanym na potrzeby wynalazku trójelementowym naczyniu wydrukowanym na drukarce 3D, założono dwie warstwy folii dializacyjnej. Naczynko umieszczono w 25 ml zlewce zawierającej 10 ml dejonizowanej wody oraz element mieszający. Zestaw ustawiono na mieszadle magnetycznym i potraktowano jako kontrolę eksperymentu. W dwóch kolejnych identycznych zestawach pomiędzy warstwami folii umieszczono 81 mg komercyjnie dostępnego chitozanu (B) oraz 81 mg modyfikowanego glutationem chitozanu (MB). Do wewnętrznego cylindra każdego z naczynek naniesiono po 0,5 ml 100 mM roztworu chlorku niklu(ll) i pozostawiono 24 godziny na mieszadle magnetycznym pozwalając na dyfuzję przez błony dializacyjne oraz błony dializacyjne i warstwę chitozanu lub modyfikowanego chitozanu umieszczoną pomiędzy błonami. Następnie przeprowadzono oznaczanie poziomu niklu obecnego w roztworach wodnych w zlewkach w poszczególnych układach. W obu przypadkach zaobserwowano barierowe działanie biopolimerów i wyznaczono prawie 8 razy mniejsze stężenie metalu, niż w kontroli. Wyniki oznaczenia przedstawiono w Tabeli 1.

Tabela 1

Wyniki oznaczania spektrofotometrycznego stężenia jonów niklu(ll) w roztworze

	Powtórzenie	Absorpcja 465 nm	Stężenie molowe jonów niklu obecnych w roztworze [mM]	Procent jonów niklu obecnych w roztworze, względem kontroli
Kontrola	I.	0,62		100%

PL 234 156 Β1

	II.	0,62	4,8	100%
Biopolimer ;	I.	0.03	0,6	13%
H.	0,03	0,6	13%
Modyfi- kowany biopolimer	I.	0,07	O.8 ........................	17%
II.	0,07	0,8	17%
Blank/ Ślepa próba	I.	0,00	0,00	0%

Powyższa tabela jasno wykazuje, że obecność pochodnej chitozanu prowadzi do znaczącego ograniczenia dyfuzji jonów niklowych do roztworu. Analogiczne działanie ma kompozycja kosmetyczna zawierająca jako składnik aktywny opisaną tu pochodną chitozanu, ograniczając dostęp uczulających jonów po naniesieniu kompozycji na skórę.

Claims (7)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Pochodna chitozanu, znamienna tym, że stanowi chitation, w którym chitozan jest zmodyfikowany glutationem, który jest związany z chitozanem wiązaniem peptydowym.
2. 2. Pochodna chitozanu określona w zastrz. 1 do zastosowania do zapobiegania objawom alergii wywołanej metalami ciężkimi.
3. 3. Pochodna chitozanu określona w zastrz. 1, według zastrz. 2 do zastosowania do zapobiegania objawom alergii skórnej wywołanej kontaktem z metalami ciężkimi, korzystnie niklem.
4. 4. Kompozycja kosmetyczna zawierająca chitation określony w zastrz. 1 i ewentualnie chitozan, w połączeniu z podłożem kosmetycznym.
5. 5. Kompozycja według zastrz. 4, znamienna tym, że jest w postaci maści, kremu, lotionu, mleczka.
6. 6. Kompozycja zawierająca chitation określony w zastrz. 1, określona w zastrz. 4 albo 5 do zastosowania w zapobieganiu objawom alergii wywołanej metalami ciężkimi korzystnie palladem, kobaltem, chromem i złotem.
7. 7. Kompozycja zawierająca chitation określony w zastrz. 1 według zastrz. 6, do zastosowania w zapobieganiu objawom alergii wywołanej niklem.

   PL 234 156 Β1

   Rysunki

   Figi

   HBTU, HOBt, DIPEA peptydowy modyfikator

   Fig 2

   11:46:06

   13-Apr-2O12

   PL 234 156 B1

   Fig 3

   Fig 4

   Cm [mM]