CN109734900A - 一种可酶降解型多肽基聚酯氨及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种可酶降解型多肽基聚酯氨及其制备方法和应用，包括：(1)将多肽、酸酐、二碳酸二叔丁酯酸酐保护的醇胺小分子、活化剂和催化剂混合反应，得到多肽基二胺；(2)将对硝基苯酚、二酰氯和催化剂混合反应，得到对二硝基苯活性酯；(3)将多肽基二胺与对二硝基苯活性酯进行溶液聚合，得到可酶降解型多肽基聚酯氨，用于伤口抗菌、抑制细菌生物膜或伤口修复生物医用领域。该生产过程安全、无毒，成本低。
Description
技术领域
本发明属于生物医用材料技术领域，特别涉及一种可酶降解型多肽基聚酯氨及其制备方法和应用。
背景技术
可降解的聚合物因其广泛的应用而受到关注，特别是在生物医学领域，如控制药物释放，基因转移，和组织工程。生物降解的脂肪族聚酯和聚碳酸酯由于其良好的生物相容性和美国食品和药物管理局(FDA)，批准用于生物医学设备行政已成为最重要的合成生物材料。在实践中，这些经典的生物医学聚合物由于其高疏水性，降解速率不可控，力学性能不足等缺点，不能满足特定应用的要求。
聚酯氨已经被提出作为一类新的生物材料，其骨架中包含酯和酰胺键，应用于各种生物医学领域。聚酯氨有两类，一类是由非氨基酸衍生而来，例如脂肪族二胺。另一类由氨基酸衍生而来，例如L-苯丙氨酸，L-亮氨酸和L-赖氨酸。氨基酸基聚酯氨分子链中具有酰胺键和酯键，赋予其聚合物既具有聚氨酯的特性，又有蛋白质特性，即酶催化的表面侵蚀生物降解和所需的机械，物理和生物相容性结合到单个实体中。在过去的几十年中，基于α-氨基酸的聚(酯酰胺)(PEAs)具有聚酯和多肽的有利特性，例如酶降解性和生物活性，已被开发为通用的一类生物可降解聚合物。
氨基酸基聚酯氨具有材料特性的多样性、良好的加工性能，优良的机械性能，还表现出良好的生物相容性和低炎症反应，并且可能潜在地增强细胞-物质相互作，其对水解和水解的敏感性酶促降解，可生物降解，它们的降解产物具有低毒性源，氨基酸可被蛋白水解酶，被人体所吸收。但是，氨基酸基聚酯氨功能比较单一，要赋予其多功能性，需在分子链中进行修饰，这就使得其智能应用在特定领域。
多肽是人体必需的生命活性物质，影响着生物体内许多重要的生理功能，它具有多功能性，拥有蛋白质和非蛋白质特征，可以通过设计氨基酸种类及序列，合成多肽以模仿蛋白质的特性。人体很多活性物质都是以肽的形式存在，多肽是人体中的组成部分和营养物质，它控制人体的生长、发育、新陈代谢，同时具有防病、治病，调节人体生理机能的功效。短肽具有其分子量小，作用机理独特、不产生耐药性、多功能性等特点，是理想的替代品，它能够模仿更复杂的蛋白质。可以通过设计氨基酸种类及序列，设计肽链的物理化学、自组装、和刺激性等特性，以模仿蛋白质的特性，应用于诸多生物医用领域，如治疗，生物催化剂，药物递送，生物传感、智能生物材料领域等。
新奥尔良路易斯安那州立大学健康科学中心神经科学卓越中心的BhagwatV.Alapure，发表在STEM CELLS AND DEVELOPMENT杂志上的“Accelerate Healing ofSevere Burn Wounds by Mouse Bone Marrow Mesenchymal Stem Cell-SeededBiodegradable Hydrogel Scaffold Synthesized from Arginine-Based Poly(esteramide)and Chitosan”的文章，公开了由不饱和的Arg-PEA(UArg-PEA)和壳聚糖衍生物合成一种可生物降解的混合水凝胶，用作MSC输送的支架或载体以燃烧伤口以及覆盖和填充坏死的皮肤去除烧伤。但是，此类聚酯氨材料必须是含精氨酸的，只有利用精氨酸的端氨基才能进行修饰使用，比如制成复合物水凝胶，满足其在生物医药上的应用。但是水凝胶的降解速率很慢，周期长，尤其是在慢性伤口上用时，需要定期更换材料，在装载药物是可能存在结构不稳定，载药率低，药物会爆释，不能长久使用等问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种可酶降解型多肽基聚酯氨及其制备方法和应用，克服了现有聚酯氨材料在生物医用方面上需依赖于精氨酸，经修饰后才能使用，形成的复合物降解速率很慢，周期长，尤其是在慢性伤口上用时，需要定期更换材料，在装载药物是可能存在结构不稳定，载药率低，药物会爆释，不能长久使用等缺陷。
本发明的一种可酶降解型多肽基聚酯氨，化学结构式为：
其中多肽为二肽～八肽，也可以是具有抗菌性能多肽，且该多肽序列中必须含有一定比例的亲水及疏水的氨基酸片段；m＝2～8表示二碳酸二叔丁酯酸酐保护的醇胺中碳原子个数，k＝2～12表示酸酐的碳原子个数，x＝2～8表示酰氯中碳原子的个数，n＝15～35。
本发明还提供了上述可酶降解型多肽基聚酯氨的制备方法，包括：
(1)将多肽、酸酐和催化剂溶于有机溶剂中反应，加入二碳酸二叔丁酯酸酐保护的醇胺小分子、活化剂和催化剂继续反应，然后三氟乙酸洗脱，经过滤，旋蒸，沉淀，抽滤，干燥，得到两端为氨基的多肽基二胺，密封0℃以下保存；
(2)将对硝基苯酚溶于有机溶剂中，加入催化剂，逐滴滴加二酰氯，搅拌反应，然后室温继续搅拌过夜，经沉淀，过滤，洗涤，干燥，重结晶，得到对二硝基苯活性酯，密封干燥保存；
(3)将步骤(1)得到的多肽基二胺与步骤(2)得到的对二硝基苯活性酯溶于有机溶剂中，加入催化剂，进行溶液聚合，经沉淀，过滤，提纯，得到多肽基聚酯氨，密封干燥保存。
所述步骤(1)中的多肽是采用固相合成法合成。
所述步骤(1)中的酸酐的碳原子个数为2～12个，选自丁二酸酐或苯酐。
所述步骤(1)中的有机溶剂为DMF、DMAC、THF或CHCl3。
所述步骤(1)中的活化剂为活化羧基的活化剂，选自DCC、EDC或NHS。
所述步骤(1)中的催化剂为碱性催化剂，选自DMAP，DIEA，ET3N、吡啶中的一种或几种。
所述步骤(1)中的二碳酸二叔丁酯酸酐保护的醇胺小分子的碳原子个数为2～8个，碳链一端为氨基，一端为醇羟基，选自乙醇胺，异丙醇胺或异丁醇胺。
所述步骤(1)制得的多肽基二胺的结构式为：
其中多肽为二肽～八肽，也可以是具有抗菌性能多肽，且该多肽序列中必须含有一定比例的亲水及疏水的氨基酸片段；m＝2～8表示二碳酸二叔丁酯酸酐保护的醇胺中碳原子个数，k＝2～12表示酸酐的碳原子个数，x＝2～8表示酰氯中碳原子的个数，n＝2～10。
所述步骤(1)中反应的工艺参数为：反应温度为常温，反应时间为1～5h。
所述步骤(1)中继续反应的工艺参数为：反应温度为-10～0℃，反应时间为18～24h。
所述步骤(1)中洗脱的工艺条件为：采用浓度为0.25-5.0wt％的三氟乙酸洗脱3-5次。目的是脱去二碳酸二叔丁酯酸酐保护基和切落树脂。
所述步骤(1)中沉淀的工艺条件为：采用冷乙醚沉淀产物。
所述步骤(2)中的有机溶剂为丙酮、DMF、DMAC、THF、CHCl3中的一种或几种。
所述步骤(2)中的催化剂为碱性催化剂，选自DMAP，DIEA，ET3N、吡啶中的一种或几种。
所述步骤(2)中的二酰氯为脂肪二酰氯，选自丁二酰氯、戊二酰氯、己二酰氯或癸二酰氯。
所述步骤(2)中搅拌反应的工艺参数为：搅拌为机械搅拌，搅拌反应温度为-90～-30℃，搅拌反应时间为1～3h。
所述步骤(2)中沉淀的工艺条件为：采用蒸馏水沉淀产物。
所述步骤(2)中重结晶的工艺条件为：采用乙酸乙酯重结晶纯化3次。
所述步骤(3)中的有机溶剂为DMF、DMAC或DMSO。
所述步骤(3)中的催化剂为碱性催化剂，选自DMAP，DIEA，ET3N、吡啶中的一种或几种。
所述步骤(3)中溶液聚合的工艺参数为：聚合温度为60～100℃，反应时间为6～24h。
所述步骤(3)中的沉淀的工艺条件为：采用冷乙酸乙酯沉淀产物。
本发明的可酶降解型多肽基聚酯氨在酶的作用下可降解组装形成纳米粒子，可预载抗菌剂、生长因子、S-亚硝基化谷胱甘肽等物质，赋予其多功能性，拓宽了聚酯氨类高分子化合物在生物医药领域中的应用，可用于伤口抗菌、抑制细菌生物膜或伤口修复生物医用领域。
本发明的多肽基聚酯氨是相对新一代的合成可生物降解生物材料，多肽小分子的存在，使它具有蛋白质和非蛋白质特征，可模拟蛋白质的某些特征；分子链中大部分为酯和酰胺基团，提供了化学功能化的反应位点。除此之外，最独特的方面是它的生物学特性，由于多肽是由的亲疏水氨基酸构成的2-8肽，通过设计氨基酸种类及序列，合成多肽以模仿蛋白质的特性能，经降解后是小分子的氨基酸，对环境和人体无毒无害，因此聚合物良好的生物相容性，不会因异物而引起炎症反应。
本发明所涉及的是可由酶引发降解的多肽基聚酯氨，不仅仅局限于精氨酸，可以自己设计序列，酸酐的引入，使得分子链中含有羧基，可被修饰，可形成线状大分子。另外分子链中还有大量的酯键和酰胺键，而酰胺键和酯键又是多种酶的降解位点，因此降解速率快，周期短，可经静电纺成膜后，应用在伤口处；另外，可发现聚合物再经酶降解，其在降解过程中包覆药物，药物被牢牢锁在纳米粒子里面，同时纳米结构会随着浓度的变化而变化，稳定性可控，载药率明显提升，可长久使用。另外此纳米粒子，可传输各种药物，大大拓宽了聚酯氨材料的应用领域。
有益效果
(1)本发明的生产过程安全、无毒，成本低。
(2)本发明的多肽基聚酯氨材料中大量的酰胺键和酯键可以作为酶降解位点，能够被多种酶降解，酯键和酰胺键的降解速率可以通过一种或多种酶催化降解，聚酯氨聚合物在酶溶液里降解，分子链中的亲水片段和疏水片段，组装而成，最终获得纳米颗粒，通过调节酶的种类、浓度及降解时间得到不同粒径的纳米粒子，其降解成球的特性，更是拓宽了其应用。
(3)本发明的多肽基聚酯氨材料能降解成纳米颗粒，可预载药物，包括S-亚硝基谷胱甘肽、抗菌剂、生长因子等物质，具有优异的生物相容性，可泛用于伤口抗菌、抑制生物膜、伤口修复等生物医用领域。
附图说明
图1为本发明实施例1制得的可酶降解型多肽基聚酯氨降解形成的纳米颗粒扫描电镜图。
图2为本发明实施例1制得的可酶降解型多肽基聚酯氨降解形成的纳米颗粒粒径分布图。
图3为本发明实施例3制得的不含抗菌剂的可酶降解型多肽基聚酯氨降解形成的纳米颗粒处理的大肠杆菌扫描电镜图。
图4为本发明实施例3制得的含抗菌剂的可酶降解型多肽基聚酯氨降解形成的纳米颗粒处理的大肠杆菌扫描电镜图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
1.多肽基二胺的制备
(1)三肽的制备：
使用标准FMOC固相肽合成(SPPS)技术，反应所涉及到的物质配比如下：2-氯三苯甲基氯树脂为2g，1.6mmol FMOC-Lys(Boc)-OH为3.78g，6.4mmol FMOC-Phe-OH为2.48g，6.4mmol FMOC-Leu-OH为2.26g，6.4mmol HBTU为2.42g，6.4mmol HOBt为0.87g，6.4mmolDIEA为3ml，哌啶5ml。步骤如下：
将树脂加入至多肽合成装置中，加入干燥的DMF浸泡半小时，使之充分溶胀，最后排出溶剂DMF。
将氨基酸用DMF溶解，然后将该溶液转入到上步含有处理过的树脂的多肽合成装置中，再加入催化剂DIEA，在室温下反应1.5h，使其充分固定在树脂上，用DMF洗涤树脂。
将哌啶/DMF溶液加入到上一步树脂中反应半小时，脱保护，用DMF洗涤树脂，用茚三酮检验保护是否完全。
将氨基酸、HBTU、HOBt溶于DMF中，将该溶液转入到上步含有处理过的树脂的多肽合成装置中，再加入催化剂DIEA，在室温下反应1.5h，用DMF洗涤树脂，用茚三酮检验氨基是否反应完全，若无色，则表明缩合反应可进行下一步操作；若显蓝色，则再缩合至检验为无色方可进行下一步操作。
重复以上步骤，直至用茚三酮检验为无色，说明氨基反应完全，得到三肽。
(2)二碳酸二叔丁酯酸酐保护的乙醇胺的制备：
在-10℃下向乙醇胺(10.0ml，165mmol)在无水CH2Cl2(500mL)中的溶液中加入三乙胺(24.5ml，250mmol)，然后加入二碳酸二叔丁酯酸酐(36g，165mmol)。将溶液在25℃下搅拌20小时，然后用饱和NHCl4溶液(100ml)淬灭。用乙酸乙酯(3×200ml)萃取水层。然后将合并的有机层用盐水洗涤，用MgSO4干燥并减压浓缩，得到二碳酸二叔丁酯酸酐保护的乙醇胺，为无色油状物。
(3)三肽与丁二酸酐、二碳酸二叔丁酯酸酐保护的乙醇胺的反应：
在上述得到的三肽DMF溶液中，加入丁二酸酐(0.64g，6.4mmol)，DIEA(3ml)，ET3N(0.65g，6.4mmol)，常温反应5小时。然后，将二碳酸二叔丁酯酸酐保护的乙醇胺(1.03g，4mmol)，DCC(1.32g，6.4mmol)，DMAP(0.78g，6.4mmol)溶解在DMF中，并在0℃下加入，反应24小时。排出DMF溶液后，使用浓度为5wt％的三氟乙酸，进行肽的切割和除去受保护的二碳酸二叔丁酯酸酐基团。在室温下振荡2小时后，收集混合物。通过旋转蒸发将合并的溶液浓缩成粘稠溶液。加入冷乙醚以沉淀产物，将沉淀物溶于蒸馏水中，然后在真空下冷冻干燥，得到白色产物多肽基二胺，密封0℃以下保存。
2.对二硝基苯活性酯的制备
在室温下，三乙胺(0.0804mol)和对硝基苯酚(0.0804mol)在100ml丙酮中的溶液，并将该溶液用干冰和丙酮保持在-78℃。然后将在80ml丙酮中的丁二酰氯(0.04mol)滴加到冷却的溶液中，在-78℃下搅拌2小时，然后在室温下搅拌过夜。之后，将混合物倒入1000ml蒸馏水中以沉淀产物，将其过滤，用蒸馏水彻底洗涤，在50℃下真空干燥，最后通过用乙酸乙酯重结晶3次纯化，得到针状灰白色固体对二硝基苯活性酯，密封干燥保存。
3.可酶降解型多肽基聚酯氨的制备
将多肽基二胺(1.0mmol)和对二硝基苯活性酯(1mmol)溶解在1.5ml无水DMAC中，在搅拌下将溶液加热至60℃直至单体完全溶解。将ET3N(2.2mmol)逐滴滴加到溶液中，反应在80℃保持16小时以进行聚合反应。将所得溶液用冷乙酸乙酯沉淀，过滤，在索氏提取器中用乙酸乙酯萃取48小时，最后在50℃下真空干燥，得到白色固体多肽基聚酯氨，密封干燥保存。
将本实施例制得的可酶降解型多肽基聚酯氨溶解在DMF中形成质量分数为30％的聚合物溶液，去除溶剂形成膜，将所得薄膜置于脂肪酶浓度为0.15mg/ml的PBS溶液中，37℃水浴摇床中一定摇动速度降解聚合物，可得到纳米粒子，扫描电镜图如图1所示，可以看出颗粒呈球形，无明显的团聚现象，具有稳定结构；粒径分布图如图2所示，可以看出纳米粒子的粒径保持在200nm左右，粒径分布均匀。
实施例2
1.多肽基二胺的制备
(1)四肽的制备：
使用标准FMOC固相肽合成(SPPS)技术，反应所涉及到的物质配比如下：2-氯三苯甲基氯树脂为2g，1.6mmol FMOC-Lys(Boc)-OH为3.78g，6.4mmol FMOC-Phe-OH为2.48g，6.4mmol FMOC-Leu-OH为2.26g，6.4mmol HBTU为2.42g，6.4mmol HOBt为0.87g，6.4mmolDIEA为3ml，哌啶5ml。步骤如下：
将树脂加入至多肽合成装置中，加入干燥的DMF浸泡半小时，使之充分溶胀，最后排出溶剂DMF。
将氨基酸用DMF溶解，然后将该溶液转入到上步含有处理过的树脂的多肽合成装置中，再加入催化剂DIEA，在室温下反应1.5h，使其充分固定在树脂上，用DMF洗涤树脂。
将哌啶/DMF溶液加入到上一步树脂中反应半小时，脱保护，用DMF洗涤树脂，用茚三酮检验保护是否完全。
将氨基酸、HBTU、HOBt溶于DMF中，将该溶液转入到上步含有处理过的树脂的多肽合成装置中，再加入催化剂DIEA，在室温下反应1.5h，用DMF洗涤树脂，用茚三酮检验氨基是否反应完全，若无色，则表明缩合反应可进行下一步操作；若显蓝色，则再缩合至检验为无色方可进行下一步操作。
重复以上步骤，直至用茚三酮检验为无色，说明氨基反应完全，得到四肽。
(2)二碳酸二叔丁酯酸酐保护的乙醇胺的制备：
在-10℃下向乙醇胺(10.0ml，165mmol)在无水CH2Cl2(500mL)中的溶液中加入三乙胺(24.5ml，250mmol)，然后加入二碳酸二叔丁酯酸酐(36g，165mmol)。将溶液在25℃下搅拌20小时，然后用饱和NHCl4溶液(100ml)淬灭。用乙酸乙酯(3×200ml)萃取水层。然后将合并的有机层用盐水洗涤，用MgSO4干燥并减压浓缩，得到二碳酸二叔丁酯酸酐保护的乙醇胺，为无色油状物。
(3)四肽与丁二酸酐、二碳酸二叔丁酯酸酐保护的乙醇胺的反应：
在上述得到的四肽DMF溶液中，加入丁二酸酐(0.64g，6.4mmol)，DIEA(3ml)，ET3N(0.65g，6.4mmol)，常温反应5小时。然后，将二碳酸二叔丁酯酸酐保护的乙醇胺(1.03g，4mmol)，DCC(1.32g，6.4mmol)，DMAP(0.78g，6.4mmol)溶解在DMF中，并在0℃下加入，反应24小时。排出DMF溶液后，使用浓度为5wt％的三氟乙酸，进行肽的切割和除去受保护的二碳酸二叔丁酯酸酐基团。在室温下振荡2小时后，收集混合物。通过旋转蒸发将合并的溶液浓缩成粘稠溶液。加入冷乙醚以沉淀产物，将沉淀物溶于蒸馏水中，然后在真空下冷冻干燥，得到白色产物多肽基二胺，密封0℃以下保存。
2.对二硝基苯活性酯的制备
在室温下，三乙胺(0.0804mol)和对硝基苯酚(0.0804mol)在100ml丙酮中的溶液，并将该溶液用干冰和丙酮保持在-78℃。然后将在80ml丙酮中的丁二酰氯(0.04mol)滴加到冷却的溶液中，在-78℃下搅拌2小时，然后在室温下搅拌过夜。之后，将混合物倒入1000ml蒸馏水中以沉淀产物，将其过滤，用蒸馏水彻底洗涤，在50℃下真空干燥，最后通过用乙酸乙酯重结晶3次纯化，得到针状灰白色固体对二硝基苯活性酯，密封干燥保存。
3.可酶降解型多肽基聚酯氨的制备
将多肽基二胺(1.0mmol)和对二硝基苯活性酯(1mmol)溶解在1.5ml无水DMAC中，在搅拌下将溶液加热至60℃直至单体完全溶解。将ET3N(2.2mmol)逐滴滴加到溶液中，反应在80℃保持16小时以进行聚合反应。将所得溶液用冷乙酸乙酯沉淀，过滤，在索氏提取器中用乙酸乙酯萃取48小时，最后在50℃下真空干燥，得到白色固体多肽基聚酯氨，密封干燥保存。
将本实施例制得的多肽基聚酯氨溶解在DMF中形成质量分数为30％的聚合物溶液，去除溶剂形成膜，将所得薄膜置于胰蛋白酶浓度为1.0mg/ml的PBS溶液中，其中PBS溶液中含有抗生素类药物左氧氟沙星浓度为1.5ml，37℃水浴摇床中一定摇动速度降解聚合物，得到载药纳米粒子，呈球形，无明显的团聚现象，具有稳定结构；且粒径分布均匀，粒径保持在200～300nm左右。
本实施例制得的多肽基聚酯氨降解形成的预载抗生素的纳米颗粒的载药性能可通过载药率来表征，其中载药率＝载入药物/(载入药物+载体质量)，另外结合红外、质朴、核磁和紫外等分子方法，可得经检测载药率为40％。将纳米颗粒作用于大肠杆菌，通过扫描电镜图观察细菌的形态，大肠杆菌的细胞壁已出现毁损，结构被破坏，形态是扁平状的，已经死亡，可直观看出该纳米颗粒具有抗菌作用。
实施例3
1.多肽基二胺的制备
(1)四肽的制备：采用实施例2中四肽的制备方法制备四肽。
(2)二碳酸二叔丁酯酸酐保护的乙醇胺的制备：在-10℃下向乙醇胺(10.0ml，165mmol)在无水CH2Cl2(500mL)中的溶液中加入三乙胺(24.5ml，250mmol)，然后加入二碳酸二叔丁酯酸酐(36g，165mmol)。将溶液在25℃下搅拌20小时，然后用饱和NHCl4溶液(100ml)淬灭。用乙酸乙酯(3×200ml)萃取水层。然后将合并的有机层用盐水洗涤，用MgSO4干燥并减压浓缩，得到二碳酸二叔丁酯酸酐保护的乙醇胺，为无色油状物。
(3)四肽与苯酐、二碳酸二叔丁酯酸酐保护的乙醇胺的反应：在上述得到的四肽DMF溶液中，加入苯酐(0.89g，6.4mmol)，DIEA(3ml)，ET3N(0.65g，6.4mmol)，常温反应5小时。然后，将二碳酸二叔丁酯酸酐保护的乙醇胺(1.03g，4mmol)，DCC(1.32g，6.4mmol)，DMAP(0.78g，6.4mmol)溶解在DMF中，并在0℃下加入，反应24小时。排出DMF溶液后，使用浓度为5wt％的三氟乙酸，进行肽的切割和除去受保护的二碳酸二叔丁酯酸酐基团。在室温下振荡2小时后，收集混合物。通过旋转蒸发将合并的溶液浓缩成粘稠溶液。加入冷乙醚以沉淀产物，将沉淀物溶于蒸馏水中，然后在真空下冷冻干燥，得到白色产物多肽基二胺，密封0℃以下保存。
2.对二硝基苯活性酯的制备
在室温下，三乙胺(0.0804mol)和对硝基苯酚(0.0804mol)在100ml丙酮中的溶液，并将该溶液用干冰和丙酮保持在-78℃。然后将在80ml丙酮中的戊二酰氯(0.04mol)滴加到冷却的溶液中，在-78℃下搅拌2小时，然后在室温下搅拌过夜。之后，将混合物倒入1000ml蒸馏水中以沉淀产物，将其过滤，用蒸馏水彻底洗涤，在50℃下真空干燥，最后通过用乙酸乙酯重结晶3次纯化，得到针状灰白色固体对二硝基苯活性酯，密封干燥保存。
3.可酶降解型多肽基聚酯氨的制备
将多肽基二胺(1.0mmol)和对二硝基苯活性酯(1mmol)溶解在1.5ml无水DMAC中，在搅拌下将溶液加热至60℃直至单体完全溶解。将ET3N(2.2mmol)逐滴滴加到溶液中，反应在80℃保持16小时以进行聚合反应。将所得溶液用冷乙酸乙酯沉淀，过滤，在索氏提取器中用乙酸乙酯萃取48小时，最后在50℃下真空干燥，得到白色固体多肽基聚酯氨，密封干燥保存。
将本实施例制得的多肽基聚酯氨溶解在DMF中形成质量分数为30％的聚合物溶液，去除溶剂形成膜，将所得薄膜置于胰蛋白酶浓度为1.5mg/ml的PBS溶液中，37℃水浴摇床中一定摇动速度降解聚合物，得到不含抗菌剂的纳米颗粒，呈球形，无明显的团聚现象，具有稳定结构；且粒径分布均匀，粒径保持在200～300nm左右。将其用于处理大肠杆菌，扫描电镜图如3所示，可知大肠杆菌在此条件下，细胞壁连续，未出现破损，其结构完整，能维持良好的棒状形态。
将多肽基聚酯氨溶解在DMF中形成质量分数为30％的聚合物溶液，去除溶剂形成膜，将所得薄膜置于胰蛋白酶浓度为1.5mg/ml的PBS溶液中，其中PBS溶液中含有抗生素类药物左氧氟沙星浓度为1.2ml，37℃水浴摇床中一定摇动速度降解聚合物，得到含抗菌剂的纳米颗粒，呈球形，无明显的团聚现象，具有稳定结构；且粒径分布均匀，粒径保持在200～300nm左右。其载药性能可通过载药率来表征，其中载药率＝载入药物/(载入药物+载体质量)，另外结合红外、质朴、核磁和紫外等分子方法，可得经检测载药率为60％，将其用于处理大肠杆菌，扫描电镜图如4所示，可知大肠杆菌的细胞壁已出现毁损，结构被破坏，形态是扁平状的，已经死亡，说明该纳米粒子具有抗菌作用。
实施例4
1.多肽基二胺的制备
(1)四肽的制备：采用实施例2中四肽的制备方法制备四肽。
(2)二碳酸二叔丁酯酸酐保护的异丙醇胺的制备：在-10℃下向异丙醇胺(12.5ml，165mmol)在无水CH2Cl2(500mL)中的溶液中加入三乙胺(24.5ml，250mmol)，然后加入二碳酸二叔丁酯酸酐(36g，165mmol)。将溶液在25℃下搅拌20小时，然后用饱和NHCl4溶液(100ml)淬灭。用乙酸乙酯(3×200ml)萃取水层。然后将合并的有机层用盐水洗涤，用MgSO4干燥并减压浓缩，得到二碳酸二叔丁酯酸酐保护的异丙醇胺，为无色油状物。
(3)四肽与丁二酸酐、二碳酸二叔丁酯酸酐保护的异丙醇胺的反应：在上述得到的四肽DMF溶液中，加入丁二酸酐(0.64g，6.4mmol)，DIEA(3ml)，ET3N(0.65g，6.4mmol)，常温反应5小时。然后，将二碳酸二叔丁酯酸酐保护的异丙醇胺(0.75g，4mmol)，DCC(1.32g，6.4mmol)，DMAP(0.78g，6.4mmol)溶解在DMF中，并在0℃下加入，反应24小时。排出DMF溶液后，使用浓度为4.5wt％的三氟乙酸，进行肽的切割和除去受保护的二碳酸二叔丁酯酸酐基团。在室温下振荡2小时后，收集混合物。通过旋转蒸发将合并的溶液浓缩成粘稠溶液。加入冷乙醚以沉淀产物，将沉淀物溶于蒸馏水中，然后在真空下冷冻干燥，得到白色产物多肽基二胺，密封0℃以下保存。
2.对二硝基苯活性酯的制备
在室温下，三乙胺(0.0804mol)和对硝基苯酚(0.0804mol)在100ml丙酮中的溶液，并将该溶液用干冰和丙酮保持在-78℃。然后将在80ml丙酮中的丁二酰氯(0.04mol)滴加到冷却的溶液中，在-78℃下搅拌2小时，然后在室温下搅拌过夜。之后，将混合物倒入1000ml蒸馏水中以沉淀产物，将其过滤，用蒸馏水彻底洗涤，在50℃下真空干燥，最后通过用乙酸乙酯重结晶3次纯化，得到针状灰白色固体对二硝基苯活性酯，密封干燥保存。
3.可酶降解型多肽基聚酯氨的制备
将多肽基二胺(1.0mmol)和对二硝基苯活性酯(1mmol)溶解在1.5ml无水DMAC中，在搅拌下将溶液加热至60℃直至单体完全溶解。将ET3N(2.2mmol)逐滴滴加到溶液中，反应在80℃保持16小时以进行聚合反应。将所得溶液用冷乙酸乙酯沉淀，过滤，在索氏提取器中用乙酸乙酯萃取48小时，最后在50℃下真空干燥，得到白色固体多肽基聚酯氨，密封干燥保存。
将本实施例制得的多肽基聚酯氨溶解在DMF中形成质量分数为30％的聚合物溶液，去除溶剂形成膜，将所得薄膜置于胰蛋白酶浓度为2mg/ml的PBS溶液中，其中PBS溶液中含有成纤维细胞生长因子(VEGF)0.5mg/ml，37℃水浴摇床中一定摇动速度降解聚合物，得到载药纳米粒子，呈球形，无明显的团聚现象，具有稳定结构；且粒径分布均匀，粒径保持在200～400nm左右。
本实施例制得的多肽基聚酯氨降解形成的预载生长因子的纳米颗粒的载药性能可通过载药率来表征，其中载药率＝载入药物/(载入药物+载体质量)，另外结合红外、质朴、核磁和紫外等分子方法，可得经检测载药率为55％，将预载药的纳米颗粒与人成纤维细胞，放置于含5％CO2，37℃恒温培养箱中培育，一定时间，在电镜下观察细胞的形态和数量，可知细胞的数量明显增多，以此验证其具有促进细胞增殖的作用。
实施例5
1.多肽基二胺的制备
(1)三肽的制备：采用实施例1中三肽的制备方法制备四肽。
(2)二碳酸二叔丁酯酸酐保护的乙醇胺的制备：
在-10℃下向乙醇胺(10.0ml，165mmol)在无水CH2Cl2(500mL)中的溶液中加入三乙胺(24.5ml，250mmol)，然后加入二碳酸二叔丁酯酸酐(36g，165mmol)。将溶液在25℃下搅拌20小时，然后用饱和NHCl4溶液(100ml)淬灭。用乙酸乙酯(3×200ml)萃取水层。然后将合并的有机层用盐水洗涤，用MgSO4干燥并减压浓缩，得到二碳酸二叔丁酯酸酐保护的乙醇胺，为无色油状物。
(3)三肽与丁二酸酐、二碳酸二叔丁酯酸酐保护的乙醇胺的反应：
在上述得到的三肽DMF溶液中，加入丁二酸酐(0.64g，6.4mmol)，DIEA(3ml)，ET3N(0.65g，6.4mmol)，常温反应5小时。然后，将二碳酸二叔丁酯酸酐保护的乙醇胺(1.03g，4mmol)，DCC(1.32g，6.4mmol)，DMAP(0.78g，6.4mmol)溶解在DMF中，并在0℃下加入，反应24小时。排出DMF溶液后，使用浓度为5wt％的三氟乙酸，进行肽的切割和除去受保护的二碳酸二叔丁酯酸酐基团。在室温下振荡2小时后，收集混合物。通过旋转蒸发将合并的溶液浓缩成粘稠溶液。加入冷乙醚以沉淀产物，将沉淀物溶于蒸馏水中，然后在真空下冷冻干燥，得到白色产物多肽基二胺，密封0℃以下保存。
2.对二硝基苯活性酯的制备
在室温下，三乙胺(0.0804mol)和对硝基苯酚(0.0804mol)在100ml丙酮中的溶液，并将该溶液用干冰和丙酮保持在-78℃。然后将在80ml丙酮中的戊二酰氯(0.04mol)滴加到冷却的溶液中，在-78℃下搅拌2小时，然后在室温下搅拌过夜。之后，将混合物倒入1000ml蒸馏水中以沉淀产物，将其过滤，用蒸馏水彻底洗涤，在50℃下真空干燥，最后通过用乙酸乙酯重结晶3次纯化，得到针状灰白色固体对二硝基苯活性酯，密封干燥保存。
3.可酶降解型多肽基聚酯氨的制备
将多肽基二胺(1.0mmol)和对二硝基苯活性酯(1mmol)溶解在1.5ml无水DMAC中，在搅拌下将溶液加热至60℃直至单体完全溶解。将ET3N(2.2mmol)逐滴滴加到溶液中，反应在80℃保持16小时以进行聚合反应。将所得溶液用冷乙酸乙酯沉淀，过滤，在索氏提取器中用乙酸乙酯萃取48小时，最后在50℃下真空干燥，得到白色固体多肽基聚酯氨，密封干燥保存。
将本实施例制得的多肽基聚酯氨溶解在DMF中形成质量分数为30％的聚合物溶液，去除溶剂形成膜，将所得薄膜置于糜蛋白酶浓度为0.5mg/ml的PBS溶液中，其中PBS溶液中含有成纤维细胞生长因子(VEGF)0.3mg/ml，37℃水浴摇床中一定摇动速度降解聚合物，得到载药纳米粒子，呈球形，无明显的团聚现象，具有稳定结构；且粒径分布均匀，粒径保持在200～400nm左右。
本实施例制得的多肽基聚酯氨降解形成的预载生长因子的纳米颗粒载药性能可通过载药率来表征，其中载药率＝载入药物/(载入药物+载体质量)，另外结合红外、质朴、核磁和紫外等分子方法，可得经检测载药率为55％，将预载药的纳米颗粒与人成纤维细胞，放置于含5％CO2，37℃恒温培养箱中培育，一定时间，在电镜下观察细胞的形态和数量，可知细胞的数量明显增多，以此验证其具有促进细胞增殖的作用。
实施例6
1.多肽基二胺的制备
(1)五肽的制备：
使用标准FMOC固相肽合成(SPPS)技术，反应所涉及到的物质配比如下：2-氯三苯甲基氯树脂为2g，1.6mmol FMOC-Lys(Boc)-OH为3.78g，6.4mmol FMOC-Phe-OH为2.48g，6.4mmol FMOC-Leu-OH为2.26g，6.4mmol HBTU为2.42g，6.4mmol HOBt为0.87g，6.4mmolDIEA为3ml，哌啶5ml。步骤如下：
将树脂加入至多肽合成装置中，加入干燥的DMF浸泡半小时，使之充分溶胀，最后排出溶剂DMF。
将氨基酸用DMF溶解，然后将该溶液转入到上步含有处理过的树脂的多肽合成装置中，再加入催化剂DIEA，在室温下反应1.5h，使其充分固定在树脂上，用DMF洗涤树脂。
将哌啶/DMF溶液加入到上一步树脂中反应半小时，脱保护，用DMF洗涤树脂，用茚三酮检验保护是否完全。
将氨基酸、HBTU、HOBt溶于DMF中，将该溶液转入到上步含有处理过的树脂的多肽合成装置中，再加入催化剂DIEA，在室温下反应1.5h，用DMF洗涤树脂，用茚三酮检验氨基是否反应完全，若无色，则表明缩合反应可进行下一步操作；若显蓝色，则再缩合至检验为无色方可进行下一步操作。
重复以上步骤，直至用茚三酮检验为无色，说明氨基反应完全，得到五肽。
(2)二碳酸二叔丁酯酸酐保护的乙醇胺的制备：
在-10℃下向乙醇胺(10.0ml，165mmol)在无水CH2Cl2(500mL)中的溶液中加入三乙胺(24.5ml，250mmol)，然后加入二碳酸二叔丁酯酸酐(36g，165mmol)。将溶液在25℃下搅拌20小时，然后用饱和NHCl4溶液(100ml)淬灭。用乙酸乙酯(3×200ml)萃取水层。然后将合并的有机层用盐水洗涤，用MgSO4干燥并减压浓缩，得到二碳酸二叔丁酯酸酐保护的乙醇胺，为无色油状物。
(3)五肽与丁二酸酐、二碳酸二叔丁酯酸酐保护的乙醇胺的反应：
在上述得到的五肽DMF溶液中，加入丁二酸酐(0.64g，6.4mmol)，DIEA(3ml)，ET3N(0.65g，6.4mmol)，常温反应5小时。然后，将二碳酸二叔丁酯酸酐保护的乙醇胺(1.03g，4mmol)，DCC(1.32g，6.4mmol)，DMAP(0.78g，6.4mmol)溶解在DMF中，并在0℃下加入，反应24小时。排出DMF溶液后，使用浓度为5wt％的三氟乙酸，进行肽的切割和除去受保护的二碳酸二叔丁酯酸酐基团。在室温下振荡2小时后，收集混合物。通过旋转蒸发将合并的溶液浓缩成粘稠溶液。加入冷乙醚以沉淀产物，将沉淀物溶于蒸馏水中，然后在真空下冷冻干燥，得到白色产物多肽基二胺，密封0℃以下保存。
2.对二硝基苯活性酯的制备
在室温下，三乙胺(0.0804mol)和对硝基苯酚(0.0804mol)在100ml丙酮中的溶液，并将该溶液用干冰和丙酮保持在-78℃。然后将在80ml丙酮中的癸二酰氯(0.04mol)滴加到冷却的溶液中，在-78℃下搅拌2小时，然后在室温下搅拌过夜。之后，将混合物倒入1000ml蒸馏水中以沉淀产物，将其过滤，用蒸馏水彻底洗涤，在50℃下真空干燥，最后通过用乙酸乙酯重结晶3次纯化，得到针状灰白色固体对二硝基苯活性酯，密封干燥保存。
3.可酶降解型多肽基聚酯氨的制备
将多肽基二胺(1.0mmol)和对二硝基苯活性酯(1mmol)溶解在1.5ml无水DMAC中，在搅拌下将溶液加热至60℃直至单体完全溶解。将ET3N(2.2mmol)逐滴滴加到溶液中，反应在80℃保持16小时以进行聚合反应。将所得溶液用冷乙酸乙酯沉淀，过滤，在索氏提取器中用乙酸乙酯萃取48小时，最后在50℃下真空干燥，得到白色固体多肽基聚酯氨，密封干燥保存。
将本实施例制得的多肽基聚酯氨溶解在DMF中形成质量分数为30％的聚合物溶液，去除溶剂形成膜，将所得薄膜置于胰蛋白酶浓度为0.15mg/ml的PBS溶液中，其中PBS溶液中含有成纤维细胞生长因子(VEGF)0.2mg/ml，37℃水浴摇床中一定摇动速度降解聚合物，得到载药纳米粒子，呈球形，无明显的团聚现象，具有稳定结构；且粒径分布均匀，粒径保持在200nm左右。
本实施例制得的多肽基聚酯氨降解形成的预载生长因子的载药性能可通过载药率来表征，其中载药率＝载入药物/(载入药物+载体质量)，另外结合红外、质朴、核磁和紫外等分子方法，可得经检测载药率为55％，将预载药的纳米颗粒与人成纤维细胞，放置于含5％CO2，37℃恒温培养箱中培育，一定时间，在电镜下观察细胞的形态和数量，可知细胞的数量明显增多，以此验证其具有促进细胞增殖的作用。
Claims (10)
1.一种可酶降解型多肽基聚酯氨，化学结构式为：
其中多肽为二肽～八肽，m＝2～8，k＝2～12，x＝2～8，n＝15～35。
2.一种如权利要求1所述的可酶降解型多肽基聚酯氨的制备方法，包括：
(1)将多肽、酸酐和催化剂溶于有机溶剂中反应，加入二碳酸二叔丁酯酸酐保护的醇胺小分子、活化剂和催化剂继续反应，然后三氟乙酸洗脱，经过滤，旋蒸，沉淀，抽滤，干燥，得到两端为氨基的多肽基二胺，密封0℃以下保存；
(2)将对硝基苯酚溶于有机溶剂中，加入催化剂，逐滴滴加二酰氯，搅拌反应，然后室温继续搅拌过夜，经沉淀，过滤，洗涤，干燥，重结晶，得到对二硝基苯活性酯，密封干燥保存；
(3)将步骤(1)得到的多肽基二胺与步骤(2)得到的对二硝基苯活性酯溶于有机溶剂中，加入催化剂，进行溶液聚合，经沉淀，过滤，提纯，得到可酶降解型多肽基聚酯氨，密封干燥保存。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中的酸酐的碳原子个数为2～12个；有机溶剂为DMF、DMAC、THF或CHCl3；活化剂为DCC、EDC或NHS；二碳酸二叔丁酯酸酐保护的醇胺小分子的碳原子个数为2～8个，选自乙醇胺，异丙醇胺或异丁醇胺。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中的有机溶剂为丙酮、DMF、DMAC、THF、CHCl3中的一种或几种；二酰氯为脂肪二酰氯，选自丁二酰氯、戊二酰氯、己二酰氯或癸二酰氯。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中的有机溶剂为DMF、DMAC或DMSO。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)、(2)和(3)中的催化剂均为碱性催化剂，选自DMAP，DIEA，ET3N、吡啶中的一种或几种。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中反应的工艺参数为：反应温度为常温，反应时间为1～5h；继续反应的工艺参数为：反应温度为-10～0℃，反应时间为18～24h；洗脱的工艺条件为：采用浓度为0.25-5.0wt％的三氟乙酸洗脱3-5次；沉淀的工艺条件为：采用冷乙醚沉淀产物。
8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中搅拌反应的工艺参数为：搅拌为机械搅拌，搅拌反应温度为-90～-30℃，搅拌反应时间为1～3h；沉淀的工艺条件为：采用蒸馏水沉淀产物；重结晶的工艺条件为：采用乙酸乙酯重结晶纯化3次。
9.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中溶液聚合的工艺参数为：聚合温度为60～100℃，反应时间为6～24h；沉淀的工艺条件为：采用冷乙酸乙酯沉淀产物。
10.权利要求1所述的可酶降解型多肽基聚酯氨在伤口抗菌、抑制细菌生物膜或伤口修复生物医用领域中的应用。
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| GR01 | Patent grant | ||
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