CN104012839B - 保健品制备用壳聚糖-多肽复合物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了属于保健食品技术领域的一种保健品制备用壳聚糖-多肽复合物及其制备方法。该壳聚糖-多肽复合物是通过将功能性多肽，谷胱甘肽或RoY，通过共价键连接到壳聚糖大分子上而形成。其中，氯化壳聚糖-谷胱甘肽具有良好的抗氧化特性，氯化壳聚糖-RoY具有促进血管形成，改善血液循环的作用。同时这两种复合物都具有调节人体pH值，改变酸性体质，增强调节内分泌，激活荷尔蒙作用；排除体内重金属，排除体内农药毒素，排除体内过剩的营养的功效；可以作为保健品的主要成分。
Description
技术领域
本发明属于保健食品技术领域，具体涉及一种保健品制备用壳聚糖-多肽复合物及其制备方法。
背景技术
氧化是肌肤衰老和器官衰竭的最大威胁，日晒、压力、环境污染等都能让肌肤自由基泛滥，从而产生面色黯淡、缺水等氧化现象。都是身体产生氧化的“罪魁祸首”。补充抗氧化物质有利于运动机体减少自由基的产生或加速其清除，以对抗自由基的副作用，延缓器官的衰老。壳聚糖其分子链上带有大量的氨基、羟基等活性基团，具有良好的生物相容性和降解性能。具有良好的抗氧化性，已经广泛地被人们接受为“第六元素”，它是纯天然最新一代机能性保健食品。但是，其在性条件下溶解性比较差，人体对其吸收性较差，导致功效难以发挥。为此，在壳聚糖分子链上引入特征官能基团，破坏其分子间较强的作用力，增加其溶解性，改善其吸收性能。
人体中，含有巯基的谷胱甘肽(GSH)在抗氧化中其非常关键的作用，不仅参与了细胞抗氧化反应、维持机体的氧化还原平衡,还参与了调节细胞增生、机体免疫应答以及在神经系统中充当神经调质和神经递质的作用。此外，GSH还具有清除体内毒素的作用，也是它是纯天然最新一代机能性保健食品。RoY(多肽序列：YPHIDSLGHWRR)是一种新型的多肽，B.Hardy等(EurJVascEndovascSurg(2010)40,381-388)研究发现RoY能在体内微血管的形成，对血管类疾病的治疗和防止具有重要的作用。RoY能够促进可在氧化应激条件下促进血管的形成，促进血液循环，是抗氧化类保健品的有益补充。
发明内容
本发明的目的在于提供一种保健品制备用壳聚糖-多肽复合物。
本发明的目的还在于提供上述保健品制备用壳聚糖-多肽复合物的制备方法。
本发明是通过下述技术方案实现的：
一种用于制备保健品的壳聚糖-多肽复合物，该复合物由壳聚糖-谷胱甘肽复合物、壳聚糖-RoY复合物单独或者混合组成，混合时两者的质量比为20:80到60:40；所述壳聚糖-谷胱甘肽复合物或壳聚糖-RoY复合物中的壳聚糖为氯化壳聚糖、羧甲基壳聚糖、磺酸化壳聚糖或磷酸化壳聚糖。
所述壳聚糖-谷胱甘肽复合物的取代度为1-45％。
所述壳聚糖-RoY复合物的取代度为1-10％。
上述的壳聚糖-多肽复合物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
a.壳聚糖-谷胱甘肽复合物的制备；
(1)将壳聚糖溶于去离子水中，配制质量浓度为1％的壳聚糖溶液；
(2)将α-马来酰亚胺-ω-琥珀酰亚胺酯基聚乙二醇(MAL-PEG-NHS)溶于PBS溶液中，配置质量浓度为5％的α-马来酰亚胺-ω-琥珀酰亚胺酯基聚乙二醇溶液；
(3)将步骤(1)和步骤(2)获得的溶液按照体积比1:0.1-1混合搅拌，室温反应2-4小时；将混合溶液超滤后，用PBS复溶，形成质量浓度为1-1.5％的反应混合物溶液，备用；
(4)将谷胱甘肽溶于去离子水形成质量浓度为1％-3％的谷胱甘肽溶液；
(5)将步骤(4)获得的溶液加入步骤(3)制备的溶液中，两者的体积比为1-5：10，混合搅拌12-24h后，将混合液体装入透析袋中透析48-96小时，冷冻干燥获得壳聚糖-谷胱甘肽复合物；
b.壳聚糖-RoY复合物的制备：
(1)将壳聚糖溶于去离子水，配制质量浓度为1％的壳聚糖溶液；
(2)将RoY多肽溶于去离子水中配制质量浓度为0.3-1％的RoY溶液；
(3)将羟基琥珀酰亚胺加入步骤(2)制备的溶液中，其中羟基琥珀酰亚胺与壳聚糖的物质量之比为1:1，静置；
(4)将步骤(3)获得的混合液与步骤(1)配制的溶液按体积比6-3:1混合，搅拌；
(5)将碳化二亚胺加入步骤(4)获得的混合液中，搅拌；其中碳化二亚胺与壳聚糖的质量比为10-4:1；pH控制在5；搅拌6-10小时后，将混合液透析48-96小时，冷冻干燥获得壳聚糖-RoY复合物；
c.混合物的制备：将制备的壳聚糖-谷胱甘肽复合物和壳聚糖-RoY复合物按照质量比为20:80到60:40混合得到可用于制备保健品的壳聚糖-多肽复合物。
所述壳聚糖的平均分子量为20万，脱乙酰度大于85％。
步骤a的(2)中所述PBS溶液的pH值为8.0。
步骤a的(3)中所述PBS溶液的pH值为7.0。
上述的壳聚糖-多肽复合物在制备保健品中的应用。
本发明的有益效果
本发明的壳聚糖-多肽复合物具有可调节人体pH值，改变酸性体质，增强调节内分泌，激活荷尔蒙作用；排除体内重金属，排除体内农药毒素，排除体内过剩的营养的保健功效；在CSCl上引入GSH，提高了CSCl的抗氧化性能，克服了单独使用GSH时其热稳定性差，提高GSH使用效率；CSCl-GSH复合物相比于氯化壳聚糖具有更强的抗氧化性能，抗氧化性能可提高10-30％，可有效清除多种氧自由基，如羟自由基、超氧自由基、有机氧自由基。利于运动机体减少自由基的产生或加速其清除，以对抗自由基的副作用，延缓运动性疲劳发生和加快体能恢复。RoY修饰的氯化壳聚糖(CSCl-RoY)具有在氧化应激条件下，促进血管内皮细胞形成官腔的能力。氯化壳聚糖-RoY复合物具有促进缺损或处于亚健康状态区域的组织或器官周围血管的形成进一步促进血液循环，减少疾病发生。上述壳聚糖-多肽复合物可以作为保健品的主要成分。
附图说明
图1为壳聚糖-谷胱甘肽复合物对羟自由基(A)、超氧自由基(B)、有机氧DPPH自由基(C)的清除能力；CSCl为氯化壳聚糖；CSCl-GSH2取代度为10％，CSCl-GSH4取代度为20％，CSCl-GSH6取代度为30％。
图2为氯化壳聚糖-RoY复合物在低氧条件下促进血管内皮形成管腔；(A)氯化壳聚糖处理，(B)氯化壳聚糖-RoY复合物处理(取代度2.5％)。
具体实施方式
以下实施例中的氯化壳聚糖(CSCl，分子量20万，脱乙酰度大于85％)购自浙江金壳有限公司，谷胱甘肽(GSH)购自Sigma公司，RoY由上海强耀生物有限公司合成，其余试剂无特殊说明均为市售。
实施例1取代度为10％的氯化壳聚糖-谷胱甘肽复合物制备
(1)称取0.5g氯化壳聚糖，溶于100ml去离子水中，备用。
(2)称取0.78gMAL-PEG-NHS溶于10mlPBS(pH＝8.0)中，并将其滴加到步骤(1)配制的溶液中，室温搅拌2h。
(3)将步骤(2)所得的产物用超滤管超滤(Ultra-15，截留分子量10KDa)，并将其产物溶于100mlPBS(pH＝7.0)中。
(4)称取0.093g谷胱甘肽溶于10ml去离子水中，并将其滴加到步骤(3)所得的溶液中。
(5)室温搅拌24小时后，将混合液体装入透析袋中透析48小时。冷冻干燥获得氯化壳聚糖-谷胱甘肽复合物(CSCl-GSH2)。
实施例2取代度为20％的氯化壳聚糖-谷胱甘肽复合物制备
(1)称取0.5g氯化壳聚糖，溶于100ml去离子水中，备用。
(2)称取0.156gMAL-PEG-NHS溶于10mlPBS(pH＝8.0)中，并将其滴加到步骤(1)配制的溶液中，室温搅拌2h。
(3)将步骤(2)所得的产物用超滤管超滤(Ultra-15，截留分子量10KDa)，并将其产物溶于100mlPBS(pH＝7.0)中。
(4)称取0.186g谷胱甘肽溶于10ml去离子水中，并将其滴加到步骤(3)所得的溶液中。
(5)室温搅拌24小时后，将混合液体装入透析袋中透析48小时。冷冻干燥获得氯化壳聚糖-谷胱甘肽复合物(CSCl-GSH4)。
实施例3取代度为30％的氯化壳聚糖-谷胱甘肽复合物制备
(1)称取0.5g氯化壳聚糖，溶于100ml去离子水中，备用。
(2)称取2.36gMAL-PEG-NHS溶于10mlPBS(pH＝8.0)中，并将其滴加到步骤(1)配制的溶液中，室温搅拌2h。
(3)将步骤(2)所得的产物用超滤管超滤(Ultra-15，截留分子量10KDa)，并将其产物溶于100mlPBS(pH＝7.0)中。
(4)称取0.278g谷胱甘肽溶于10ml去离子水中，并将其滴加到步骤(3)所得的溶液中。
(5)室温搅拌24小时后，将混合液体装入透析袋中透析48小时。冷冻干燥获得氯化壳聚糖-谷胱甘肽复合物(CSCl-GSH6)。
实施例4取代度为1％的氯化壳聚糖-谷胱甘肽复合物制备
(1)称取5g氯化壳聚糖，溶于1000ml去离子水中，备用。
(2)称取0.78gMAL-PEG-NHS溶于10mlPBS(pH＝8.0)中，并将其滴加到步骤(1)配制的溶液中，室温搅拌2h。
(3)将步骤(2)所得的产物用超滤管超滤(Ultra-15，截留分子量10KDa)，并将其产物溶于100mlPBS(pH＝7.0)中。
(4)称取0.092g谷胱甘肽溶于10ml去离子水中，并将其滴加到步骤(3)所得的溶液中。
(5)室温搅拌24小时后，将混合液体装入透析袋中透析48小时。冷冻干燥获得氯化壳聚糖-谷胱甘肽复合物。
实施例5取代度为45％的氯化壳聚糖-谷胱甘肽复合物制备
(1)称取0.5g氯化壳聚糖，溶于100ml去离子水中，备用。
(2)称取3.51gMAL-PEG-NHS溶于10mlPBS(pH＝8.0)中，并将其滴加到步骤(1)配制的溶液中，室温搅拌2h。
(3)将步骤(2)所得的产物用超滤管超滤(Ultra-15，截留分子量10KDa)，并将其产物溶于100mlPBS(pH＝7.0)中。
(4)称取0.418g谷胱甘肽溶于10ml去离子水中，并将其滴加到步骤(3)所得的溶液中。
(5)室温搅拌24小时后，将混合液体装入透析袋中透析48小时。冷冻干燥获得氯化壳聚糖-谷胱甘肽复合物。
实施例6氯化壳聚糖-谷胱甘肽复合物的抗氧化能力检测
(1)对超氧自由基的清除能力
取0.05M(pH＝8.2)Tris-HCl缓冲液4.5ml于试管中,置于25℃水浴中预热25min,分别加入1ml浓度的5.0mg/mlCSCl和CSCl-GSH2(取代度：10％)，CSCl-GSH2(取代度：20％)，CSCl-GSH2(取代度：30％)的试样液，3mM邻苯三酚0.4ml,以蒸馏水为空白,混匀混合,于25℃水浴中准确反应4min,立即向其中加入8MHCl2滴终止反应,并在299nm处测其光密度值。按照下列公式计算复合物对超氧自由基的清除能力。结果如图1(A)所示，低取代度的CSCl-GSH与CSCl清除超氧自由基的能力无明显差异，但是取代度为30％的CSCl-GSH复合物清除超氧自由基的清除能力得到明显提升。
(2)对羟自由基的清除能力
配制浓度为5.0mg/ml的CSCl和不同取代度的CSCl-GSH复合物样品溶液；取500μl样品溶液并在其中依次加入去离子水500μl、2mMFeSO4溶液500μl、360μg/ml番红花溶液500μl，均匀混合静置10min后加入6wt％双氧水溶液800μl，并将其55℃加热反应30min。在测定过程中以500μl去离子水代替样品溶液作为对照组，以500μl去离子水和800μl去离子水分别代替样品溶液和双氧水溶液。取200μl反应液置于96孔板中，波长492nm处测定其吸光度值，按照下列公式计算CSCl-GSH复合物对羟自由基的清除能力。结果发现GSH的引入可以明显提高其对羟自由基的清除能力，但是不同取代度的复合物之间对羟自由基的清除能力没有显著性差异，(如图1(B)所示)。
(3)对有机氧DPPH自由基的清除能力
称取一定量的DPPH溶于95％的乙醇中，配制浓度为0.1mM的工作液；配制质量浓度为3.0mg/ml的CSCl和不同取代度的CSCl-GSH复合物样品溶液；将50μlDPPH工作液加入到150μl样品溶液中剧烈摇晃30min,波长492nm处测定其吸光度值，按照下列公式计算CSCl-GSH复合物对有机氧自由基DPPH的清除能力。结果发现高取代度的CSCl-GSH具有更强的清除DPPH自由的能力(如图1(C)所示)。
实施例7取代度为5％的氯化壳聚糖-RoY复合物制备
(1)称取0.5g氯化壳聚糖，溶于30ml去离子水中，备用。
(2)称取0.232gRoY溶于10ml去离子水中，备用。
(3)称0.0055g的NHS，加入步骤(2)制备的溶液中，静置半小时。
(4)将步骤(3)获得的混合液加入步骤(1)配制的溶液中，机械搅拌，半小时以上。
(5)称取0.048gEDC，溶于10ml去离子水中，然后将其加入在步骤(4)获得的混合液中，pH控制在5左右；机械搅拌。
(6)搅拌6小时后，将混合液体装入透析袋中透析48小时。冷冻干燥获得取代度为5％氯化壳聚糖-RoY复合物(CSCl-RoY)。
实施例8取代度为1％的氯化壳聚糖-RoY复合物制备
(1)称取0.5g氯化壳聚糖，溶于30ml去离子水中，备用。
(2)称取0.046gRoY溶于10ml去离子水中，备用。
(3)称0.0035g的NHS，加入步骤(2)制备的溶液中，静置半小时。
(4)将步骤(3)获得的混合液加入步骤(1)配制的溶液中，机械搅拌，半小时以上。
(5)称取0.014gEDC，溶于10ml去离子水中，然后将其加入在步骤(4)获得的混合液中，pH控制在5左右；机械搅拌。
(6)搅拌6小时后，将混合液体装入透析袋中透析48小时。冷冻干燥获得取代度为1％氯化壳聚糖-RoY复合物(CSCl-RoY)。
实施例9取代度为10％的氯化壳聚糖-RoY复合物制备
(1)称取0.5g氯化壳聚糖，溶于30ml去离子水中，备用。
(2)称取0.460gRoY溶于10ml去离子水中，备用。
(3)称0.0110g的NHS，加入步骤(2)制备的溶液中，静置半小时。
(4)将步骤(3)获得的混合液加入步骤(1)配制的溶液中，机械搅拌，半小时以上。
(5)称取0.096gEDC，溶于10ml去离子水中，然后将其加入在步骤(4)获得的混合液中，pH控制在5左右；机械搅拌。
(6)搅拌6小时后，将混合液体装入透析袋中透析48小时。冷冻干燥获得取代度为10％氯化壳聚糖-RoY复合物(CSCl-RoY)。
实施例10取代度为2.5％的氯化壳聚糖-RoY复合物制备
(1)称取0.5g氯化壳聚糖，溶于30ml去离子水中，备用。
(2)称取0.115gRoY溶于10ml去离子水中，备用。
(3)称0.0055g的NHS，加入步骤(2)制备的溶液中，静置半小时。
(4)将步骤(3)获得的混合液加入步骤(1)配制的溶液中，机械搅拌，半小时以上。
(5)称取0.024gEDC，溶于10ml去离子水中，然后将其加入在步骤(4)获得的混合液中，pH控制在5左右；机械搅拌。
(6)搅拌6小时后，将混合液体装入透析袋中透析48小时。冷冻干燥获得取代度为1％氯化壳聚糖-RoY复合物(CSCl-RoY)。
实施例11CSCl-RoY对血管内皮细胞形成官腔能力的影响
(1)称取一定量的CSCl或CSCl-RoY(取代度2.5％)氯化壳聚糖分别溶于去离子水，形成质量浓度为2％的溶液，高温高压灭菌，备用。
(2)称取一定量的磷酸甘油钠溶于去离子水中，形成质量浓度为10％的磷酸甘油钠溶液，过滤灭菌，备用。
(3)在超净工作台中，将步骤(1)和步骤(2)制备的溶液按照体积比为5:1的比例混合，并加入24孔培养板中，置于细胞培养箱中孵育30min以上，备用。
(4)在步骤(3)制备的覆盖有材料的24孔培养板孔内加入含有6×104血管内皮细胞的培养基500μl，不扰动细胞，培养4天。用显微镜观察其形成官腔的能力。结果发现，种植在CSCl-RoY表面的血管内皮细胞具有更好的形成官腔的能力(如图2所示)。
实施例12壳聚糖-谷胱甘肽复合物和壳聚糖-RoY复合物混合物的制备
将实施例3制备的壳聚糖-谷胱甘肽复合物和实施例7制备的壳聚糖-RoY复合物按照质量比为20:80混合得到可用于制备保健品的壳聚糖-多肽复合物。
Claims (6)
1.一种用于制备保健品的壳聚糖-多肽复合物，其特征在于该复合物由壳聚糖-谷胱甘肽复合物、壳聚糖-RoY复合物单独或者混合组成，混合时两者的质量比为20:80到60:40；所述壳聚糖-谷胱甘肽复合物或壳聚糖-RoY复合物中的壳聚糖为氯化壳聚糖、羧甲基壳聚糖、磺酸化壳聚糖或磷酸化壳聚糖；
所述壳聚糖-谷胱甘肽复合物按下述方法制备：
(1)将壳聚糖溶于去离子水中，配制质量浓度为1％的壳聚糖溶液；
(2)将α-马来酰亚胺-ω-琥珀酰亚胺酯基聚乙二醇溶于PBS溶液中，配置质量浓度为5％的α-马来酰亚胺-ω-琥珀酰亚胺酯基聚乙二醇溶液；
(3)将步骤(1)和步骤(2)获得的溶液按照体积比1:0.1-1混合搅拌，室温反应2-4小时；将混合溶液超滤后，用PBS复溶，形成质量浓度为1-1.5％的反应混合物溶液，备用；
(4)将谷胱甘肽溶于去离子水形成质量浓度为1％-3％的谷胱甘肽溶液；
(5)将步骤(4)获得的溶液加入步骤(3)制备的溶液中，两者的体积比为1-5：10，混合搅拌12-24h后，将混合液体装入透析袋中透析48-96小时，冷冻干燥获得壳聚糖-谷胱甘肽复合物；
所述壳聚糖-RoY复合物按下述方法制备：
(1)将壳聚糖溶于去离子水，配制质量浓度为1％的壳聚糖溶液；
(2)将RoY多肽溶于去离子水中配制质量浓度为0.3-1％的RoY溶液；
(3)将羟基琥珀酰亚胺加入步骤(2)制备的溶液中，其中羟基琥珀酰亚胺与壳聚糖的物质量之比为1:1，静置；
(4)将步骤(3)获得的混合液与步骤(1)配制的溶液中按体积比6-3:1混合，搅拌；
(5)将碳化二亚胺加入步骤(4)获得的混合液中，搅拌；其中碳化二亚胺与壳聚糖的质量比为10-4:1；pH控制在5；搅拌6-10小时后，将混合液透析48-96小时，冷冻干燥获得壳聚糖-RoY复合物；
所述壳聚糖-谷胱甘肽复合物的取代度为1-45％；
所述壳聚糖-RoY复合物的取代度为1-10％。
2.权利要求1所述的壳聚糖-多肽复合物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
a.壳聚糖-谷胱甘肽复合物的制备：
(1)将壳聚糖溶于去离子水中，配制质量浓度为1％的壳聚糖溶液；
(2)将α-马来酰亚胺-ω-琥珀酰亚胺酯基聚乙二醇溶于PBS溶液中，配置质量浓度为5％的α-马来酰亚胺-ω-琥珀酰亚胺酯基聚乙二醇溶液；
(3)将步骤(1)和步骤(2)获得的溶液按照体积比1:0.1-1混合搅拌，室温反应2-4小时；将混合溶液超滤后，用PBS复溶，形成质量浓度为1-1.5％的反应混合物溶液，备用；
(4)将谷胱甘肽溶于去离子水形成质量浓度为1％-3％的谷胱甘肽溶液；
(5)将步骤(4)获得的溶液加入步骤(3)制备的溶液中，两者的体积比为1-5：10，混合搅拌12-24h后，将混合液体装入透析袋中透析48-96小时，冷冻干燥获得壳聚糖-谷胱甘肽复合物；
b.壳聚糖-RoY复合物的制备：
(1)将壳聚糖溶于去离子水，配制质量浓度为1％的壳聚糖溶液；
(2)将RoY多肽溶于去离子水中配制质量浓度为0.3-1％的RoY溶液；
(3)将羟基琥珀酰亚胺加入步骤(2)制备的溶液中，其中羟基琥珀酰亚胺与壳聚糖的物质量之比为1:1，静置；
(4)将步骤(3)获得的混合液与步骤(1)配制的溶液中按体积比6-3:1混合，搅拌；
(5)将碳化二亚胺加入步骤(4)获得的混合液中，搅拌；其中碳化二亚胺与壳聚糖的质量比为10-4:1；pH控制在5；搅拌6-10小时后，将混合液透析48-96小时，冷冻干燥获得壳聚糖-RoY复合物。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述壳聚糖的平均分子量为20万，脱乙酰度大于85％。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤a的(2)中所述PBS溶液的pH值为8.0。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤a的(3)中所述PBS溶液的pH值为7.0。
6.权利要求1所述的壳聚糖-多肽复合物在制备保健品中的应用。
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