JPH04503813A - コレステロール吸収を抑制する薬剤、食物製品及び組成物 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 コア　７．チロール吸収を減少させるための非被吸収性合成硫酸化多糖類の使用 発明の背景 本発明は人の腸におけるコレステロール吸収を減少させるための方法に関し、特 に膵臓のコレステロールエステラーゼが触媒する、天然に存在し、かつ摂取され るコレステロールエステルの加水分解を抑制する非被吸収性合成硫酸多糖類の経 口投与によるコレステロール及び脂肪酸の経腸吸収を抑制又は減少させることに 関する０本発明は（１１コレステロールエステルから誘導された；レスチロール が遊離コレステロールに較べて優先的に吸収されかつ（２）コレステロールエス テラー−ゼが遊離コレステロールの吸収を高めるという我々の驚ろくべき発見に よジ、コレステロールニステラーぜが従来思われていたより総合的′ｌｋ負物コ レステロール吸収に対して寄与する重要なものであるという我々の発見を基礎と する。このようにして、コレステロールエステラーゼ抑制の驚くべき有用性はコ レステロールニステラーぜの強力な（５μＭより小さ−Ｋｉ　）抑制剤に関する 新しい必要性を示した。本発明は我々の発見と、コレステロール及び脂肪酸の経 腸吸収の促進に関与する酵素である、人膵臓コレステロールエステラーゼの強力 な抑制剤である非被吸収性、非減成性硫酸化多糖類を基礎とする。この発明は同 様にそのような薬剤は安定であり、ビスケットのような焼き菓子中に添加する時 腸管に生物適用性であり、従って食品中で投与可能であるという我々の観察にも 基づく。同様にこｏｉａａコレステロールニステラーぜの強力な非被吸収性抑制 剤の他のクラスのものはコレステロールエステラーゼに対する抗体であるという ことを基礎とする。

アテローム性動脈硬化症は米国に２ける主要な死因となっており、かつ高血清コ レステロール温度は致命的なアテローム性動脈硬化症の危険の増大と関連してい る、Ｊ厄払、１９８５年、第２５３巻、第２０９４頁（ＮＴＨＣｏｎ５ｅｎｓｕ ｓ　Ｐａｎｅｌ　Ｒａｐｏｒｔ　）。１９８８年、ＮＩＨで専門家のコンセンサ スパネルは多数の人々の健康にもつとも重要なことはコレステロールの減少であ り、かつ最先端の療法の目標線、より少量のコレステロールを食べることにより 、又はコレステロールレベルを減少するために腸管中で作用する薬剤を使用する ０とにより、コレステロールの経腸吸収を減するべきであると述べている、Ａｒ ｃｈ、　Ｉｎｔ、　Ｍａｄ、　、１９８８年、第１４８巻、第３６頁（Ｃｏｎ５ ｅｎｓｕｓ　Ｆｕｌｌ　Ｒｅｐｏｒｔ　）　。

しかしながら、誰も食物コレステロールエステルが重要であると思わなかったし 、′又コレステロールニステラーぜを抑制することによってコレステロールを減 少させようともしなかったし、こうして腸管からのコレステロール吸収を阻止す る薬剤は現在存在しない。

現在は、腸管内でコレステロールを減少させるために作用する重要な薬剤はコレ ストリアミン（ｃｈｏｌθｓｔｒｙ−ａｍｉｎｓ　）　、担汁酸隔離剤である； “過脂肪血症治療用剤”　、Ｔｈｅ　ＡＭＡＤｒｕｇ　Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎｓ 　ｓ第６改訂版、第９０３ｉ［、この薬剤は腸管内で胆汁塩を結合し、生じ的な コレステロールを使用し、体中でのステロール濃度を効果的に低下させる。胆汁 塩隔離剤はコレステロール低下に効果的であるが、これはめったに１５％より多 くのコレステａ−ルを減少せず、かつ患者にあまり認容性ではない。多量のこの イオン変換樹脂を摂取しなければならず（１５ｇ以上）、このことは味覚的にも 腸機能にも攻撃的である０通常の副作用鉱便秘及び鼓腸である；ＪＭ仏、１９８ ５年、第２５３巻、第２０９５頁。

コレステロールエステラーゼは食事の後膵臓により分泌され、かつ摂取された食 物コレステロールのエステルの加水分解に作用する。遊離コレステロールの吸収 において役割は認められていないが、この酵素はコレステロールエステルから誘 導されるコレステロールの吸収に関しては重要なものとして認められていた。

＃累活性が膵液から除去されれば、コレステロールオレエートからのコレステロ ール吸収は全く生じない。

コレステロールエステラーゼ活性が回復すると、コレステロールの吸収が生じる 、Ｂｏｒｊａ等著、１９６４年、Ａ　Ｍ、　Ｊ、　Ｐｈｙ８１ｏ１、第２０６巻 、第２２３頁、ＶａｈａａｘＩＹ及びＴｒｅａｄｗｅｌｌ著、１９６４年、Ｐｒ ｏｃ、　Ｊ、　ＩＣｘｐ、阻ｏＬ。

及びＭｅ＋ｉ、第１１６巻、第４９６真、吸収される脂肪酸は１部コレステロー ルエステルから来るし、かつ脂肪酸はアテローム性動脈硬化に寄与するので、酵 素コレステロールニステラーぜはアテローム性動脈硬化を２つの方法で増強する のであろう。

この情報及び腸からのコレステロール吸収減少の計略を目標としたＮＩＢの報告 にもかかわらず、人膵臓コレステロールエステラーゼの薬理学的阻止に関する研 究は全く実行されていない、事笑、はんの少こしの研究のみが人酵素に焦点ｆｔ あわせているにすぎず、最も大きな注目は他の哺乳動物の酵素（ラット、豚及び 牛）に向けられた、Ｃａｌａｍ８等著、１９７５年、Ａｒｃｈ。

Ｂｉｏｃｈａｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、、第１６８巻、第５７頁；　Ｖａｎｄｅｎ 　Ｂｏｓｃｈ等著、１９７３年、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔ！ Ｌｘ第２８６巻、第９４頁、Ｍｏｎ５ｅｎ等著、１９７７年、Ｂｉｏｃｈｅｍ、 　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ　、第４８６巻、第１０３頁、Ｇｕｙ等署、１９ ８１！、ＥＣｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　、第１１７巻、第４５７頁、８ ｕｔｔｏｎ等著、１９８６年、Ｂｉｏｃｈｅｎ　。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍ、　、第１３４巻、第３８６頁、及びＢ ｏｒｇｓｔｒｏｍ著、１９８８年、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ。

Ａｃｔａ、第９６２巻、第３０８頁、唯一の研究がコレステロールエステラーゼ 抑制剤が動物におけるコレステロール吸収を減少させることができることを示し た、Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ等著、１９８９年ＳＢｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ 。

Ａｃｔａ、第１００１巻、第２４９頁、しかしながら、この薬剤は水溶性基質を 必要とする他のコレステロールエステラーゼ活性の弱い抑制剤であり（Ｋｉ１０ ０μＭ）、かつ他の報告書はそれがコレステロールニステラーぜを全く抑制しな いということを主張している、−怖汀等著、１９８７年、Ｉｎｔ、　Ｊ、　０ｂ ｅｓｉｔｙ第１１巻、補遺２．２１．更に、この薬剤は３０ｍ吸収されかつ代部 される。このようにして、飲食物からのコレステロールの総合的な吸収への寄与 においてコレステロールエステルの重要性への正しい評価の欠乏がコレステロー ルエステラーゼの抑制剤の開発を妨げ、かつ非被吸収性抑制剤に関するどんな興 味の集中も得られなかった。

−このエステルの優先的な吸収に関する我々の発見及びコレステロールエステラ ーゼが遊離コレステロールの吸収を刺激することができると＾う予期しなかった 観察のために、今や人膵臓コレステロールエステラーゼの抑制剤、特に強力で（ Ｋｉは５μＭより小さい）、非被吸収性で、かつ非減成性である抑制剤を開発す ることが著しく必要とされて込る０種々の硫酸化多糖類の薬理学が調査された。

　Ｃｏｏｋ及びＣａｍｍａｒａｔａ　、　１９６３年、Ａｒｃｈ、　ｒｎｔ、　 Ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎ、第１４４巻、第１頁。

特に硫酸化アミロペクチンは米国特許第４１５０１１０号明細書に２いて抗潰瘍 剤として教示されているが）コレステロールの吸収を減少させる、コレステロ− にエステラーゼ抑制剤としての性質は認められなかった。

低分子量の硫酸化デキストランは過脂肪血症の治療に使用するために、かつ経Ｏ 投与される抗凝結剤として認められている、英国特許第９５３６２６号明細蓄、 腸管からのその強調された吸収特性に関して開発されたこれらの低分子量の（７ ０００〜８０００．７〜８ｋＤａ　）硫酸化デキストランは血流酵素、リポプロ ティンリパーゼを活性化することによって、１８００ｍｇＺ日の投与量で血清コ レステロールレベルを減することを示している。しかしながら、コレステロール エステラーゼを抑制するための、又はコレステロール吸収を抑制するためのその 弱い活性は認められなかった。更に、これらは金品添加物として使用されなかっ た。高分子量デキストランスルフェートはその吸収性の欠失及びそれに伴なう血 清リボプロティンリパーゼ活性化の欠落により発展から除外されていた。低分子 量テキストランスルフェートはその吸収性のゆえに人における血液凝固システム の完全な状態に変化、長期使用において危険な副作用を引き起こす、日本の薬剤 （ｇｔｈｉ−ｃａｌ　Ｄｒｕｇｓ　、第１０改訂版、１９８６年及びＭＤＳＫｒ Ｒ錠剤、Ｋｏｖａ　Ｃｏ、　、名古屋、日本に関する製品挿入書を参照。

本発明は合成非被吸収性及び非減成化合物、及び膵臓コレステロールエステラー ゼを抑制するための有効量で合成非被吸収性硫酸化多糖ＷＡヲ経ロ的に投与する ことにより、又はコレステロールエステラーゼへの抗体を投与することにより、 今や吸収を仲介することにおいて必要とされているキー酵素であることが本発明 によ５Ｒめられている、人膵臓コレステロールエステラーゼ全抑制するＣとによ りコレステロール及び脂肪酸の経腸吸収を減少させるための方法である。

第１図は種々のアルギン酸の硫酸化誘導体の合成を示し、 第２図は種々の硫酸化アルギン酸によるコレステロールエステラーゼの抑制全示 し、 第３図は８１々の、かつ特定の環位で硫酸化されたキトサンの合成を示し、 第４ａ及びｂｒＩ！Ｊはそれぞれエステル化及び遊離コレステロールの細胞吸収 の硫酸セルロースによる抑制を示す。

第５図はコレステロールオレエートを飼料とする兎に対する硫酸セルロースの効 果を示す。

第６＆図はコレステロール及びコレステリルオレエートの食物効果を示す。

第６ｂ図は標識付けしたコレステロールオレエート食物及びコレステロール食物 からのＣ１４−コレステロ−ルの血清回収を示す。

第６ｃ図は標識性はコレステ四−ル食物及びコレステロールからの三重水素含有 コレステロールの血清回収を示す。

第７図はコレステロールエステルを飼料とする兎の血清コレステロールに関する 硫酸セルロースの効果音゛本発明により、我々は血清コレステロールのレベルを 減少させ、アテローム性動脈硬化の発生を減少させるために、腸からのコレステ ロール吸収を抑制する方法に関する確実な発見をした。従来、食物中でのコレス テロールエステルの役割に関する理解の欠除がコレステロールエステラーゼ抑制 剤の開発を妨げた。コレステロールエステルに吸収される全食物コレステロール のわずか１０〜１５チであると考えられていた：Ｄｉｅｔｓｃｈｙ著、Ｉｎｔｅ ｓｔｉｎａｌ　Ｌｉｐｉｄ　Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｐｈｙ−ｓｉｏｏｏ ｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｇａ５ｔｒｏ　１ｎｔｅｓｔｉｎｊＩ　Ｔｒａｃｔ　、第 ２巻、第１１７０頁、１９８１年、Ｒａｖｅｎ　Ｐｒｅｓｓ社−Ｎ、Ｙ、　ａ当 時、コレステロールエステルはあまり重要でないという一般的に受け入れられた 論題のために、コレステロールエステルの腸からの吸収を抑制しよりとする試み はあまりなされなかった。

コレステロールエステラーゼの抑制剤？開発することへの抗しがたい必要性に導 び〈我々の驚ろくべき発見ハコレスチロールエステルの食物寄与が著しく重大で ある、ある食物においては４５チに達する、とｂ５ことである。過去のｒＡ認の 理由は、コレステロールエステルが遊離コレステロールに比べて優先的に、８〇 −を上回って、吸収されるとめうことである。更に、他の実験はコレステロール ニステラーぜが遊離のコレステロールの吸収をも促進するということを示してい る。これら２つの新しい観察はコレステロールエステラーゼが全コレステロール 吸収に著しく寄与してｂるｃ、！：ｔ−示す。この篤ろくべき結論のために、人 膵臓コレステロールエステラーゼの抑制剤全開発する重大な必要性がある。こう して、この従来顧みられなかった薬剤設計の目標は今や重要な研究課題である。

生体内での使用に不適である蛋白質群の非特異的共有結合変更に使用される反応 性化合物、　Ｔ、、ａｍｂ＆ｒｄｏ等著、−１９８２年、Ｂｉｏｃｈｅｍｉ、　 Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａ、ｃｔａ第６７巻、第７４頁とは別に、人膵臓コレステロ ールニステラーぜの抑制剤は全く記載されていない。ラット膵臓コレステロール エステラーゼにより触媒された、コレステロールエステルの加水分解全抑制する ためのテトラヒドロリプスタチｙ　（Ｔａｔｒａｈｙｄｒｏｌｉｐｓｔａｔｉｎ 　）の能力は示されていない。この薬剤は５２　ｋＤａ人膵臓トリグリセリドリ パーゼの強力な抑制剤であり（Ｋｉ　０．１μＶ）、かつこれがコレステロール ニステラーぜ上抑制しないと−うことが報告されている、Ｈｏｇａｎ等署Ｓ　１ ９８７年、Ｉｎｔ、　Ｊ、　０ｂｅｓｉｔｙ　ＩＩ、補遺、第３巻、第３５〜４ ２頁及びＨａｄｖａｒｙ等著、１９８７年、Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｏｂｇｅ−ｓｉｔ ｙｌ、補遺第２巻、第２１頁。他の報告書ｈｃの薬剤がラットからのコレステロ ールエステラーゼの弱い抑制剤である（　Ｋｉ　１００μＭ）ことを報告してい る、ＢＯｒｇ８ｔｒＯｍ、１９８８年、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　 Ａｃｔａ　。

第９６２巻、第３０８頁。しかしながら、この研究に２いて使用されたアッセイ はコレステロールエステルのかわｐに水溶性人工の比色定量用基質を用いて実施 された。これらに非特異的基質であるので、ワーシントン＃素マニュアル、Ｗｏ ｒｔｈｉｎｇｔｏｎ　Ｃｏｒｐ、　Ｌｉ１ｉａｎＤｅｃｋｅｒ出版、１９７７年 、引き出された結果には問題がある。他の研究は同様に水溶性基Ｘを用いる膵臓 エステラーゼの抑制剤に関して報告している、オがワ等著、１９８７年、Ｃｈｅ ｍ、　Ｐｈａｒｍ、　Ｂｕｌｌ、　、第３５巻、第４１３０頁ニオがワ等著、１ ９８６年、Ｃｈｅｍ、Ｐｈａｎｎ。

Ｂｕｌｌ、、第３４巻、第１１１８頁；オがワ等著、１９８７年、Ｃｈｅｍ、　 Ｐｈａｒｍ、　Ｂｕｌｌ、　、第３５巻、第３２７６頁。

どんなアッセイも、コレステロールオレエートの加水分解の抑制が生じると−う ことを示すように行なわれていない。アッセイのエステラーゼ基質、メチルブチ レート、Ｎ−アセチルチロシンエチルエステル及ヒＮ−トシルアルイニンメチル エステルはトリプシン及びトリグリセリドリパーゼをも包含する多数の膵？ａｌ 素によって加水分解される。従って、いずれのデータもコレステロールエステル の加水分解を触媒するコレステロールニステラーぜを抑制する能力を示して匹な −。

これらの薬剤はすべて小さい分子量で、力輔収される、オがワ等著、１９８６年 、Ｃｈｅｍ、　Ｐｈａｒｍ、　Ｂｕｌｌ、　、第３４巻、第１１１８頁、コレス テロールエステラーゼ抑制剤に関する他の報告書も水溶性基質を使用した、５ｕ ｔｔｏｎ等著、１９８６年、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙａ、　Ｒａｇ。

ｃｏｍｍ、　、第１３４巻、第３８６頁。我々の笑験室における研究は報告され たざロン酸（Ｂｏｒｏｎｉｃ　ａｃｉｄ　）誘導体力コレステロールエステラー ゼが触媒するコレステロールエステルの加水分解を抑制しないということを示し た。トリグリセリドリパーゼは水溶性基質の加水分解のために分離した活性位を 有し、これ岐すビド加水分解位とは遠イ、Ｗｉｎｋｌｅｒ等著、１９９０年、Ｎ ａｔｕｒｅ　、第３４３巻、第７７１頁、という最近の発見を考慮すると、水溶 性基質の抑制剤がコレステロールエステル加水分解の抑制に関して教示するとい うことは理解できなり、エステラスチンはコレステロールニステラーぜ、リソン ーム酸ニステラーぜの細胞内形成を抑制するが、この酵素は分泌された膵臓酵素 と同じではなく、かつエステラスキンは膵臓コレステロールエステラーゼの抑制 剤としては認められていなかった、Ｍａｒｉｎ等、１９８９年、Ｂｉｏｃｈｅｍ 、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａｑ第１００４巻、第１３９頁、経口投与によっ て達成されなか高漬度（１００μＭ）でのテトラヒドロリグスクチンの胃内注入 線、コレステロールの源がコレステｏ　−ｋ　、ｔ　Ｖエートである場合ラット 中へのコレステロール吸収を明らかに抑制することができる。しかしながら、こ れらの研究者は、この薬剤の濃度がリパーゼ抑制に関するＫｌｔ−１０００倍を 越えてもトリグリセリドリパーゼの抑制を観察しなかった。この薬剤は同様に３ 〇−吸収され、かつ代まされ、Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ等著、１９８９年尋者ｉｏｃ ｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ　、第１００１巻、第２４９頁、潜在的 毒性に導ひく、結局、この結果はイン・ピッ）　（ｉｎ　Ｖｉｔｏ　）における 前記コレステロールエステル加水分解の抑制の欠乏と矛盾し、こうしてこの薬剤 は酵素抑制とは異なる機構によジ働匹ていると思われる。

コレステロールエステラーゼはヘパリンによって刷子縁膜上の結合位から移され る、Ｂｏａｎａｒ等著、１９尋者年、ｐＮＡｓ、８５巻、第７４５８頁、従来技 術においては、アテロイドのような天然に生じるヘパリン様化合物の経口投与４ 未知の機構によって血清コレステロールを減少させることを教示している、５ｅ ｅｔｈａｎａｔｈａｎ等著、１９７５年、Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｃｈｅ ｍ、第８巻、第１７７頁。１００００〜２００００で変化する低分子量のヘパリ ンは被吸収性薬剤としても教示されている、Ｆｏｌｋｍａｎ等著、１９８尋者年 、５ｃｉｅｎｃｅ　、第２２１巻、第７１９頁。硫酸ヘパのような天然に生じる ヘパリンは高価であり、１ゆあた９１０，０００ドルであり、コレステロールエ ステラーゼとの結合相互作用線わずかに１０−’Ｍである。他の硫酸化多糖類で ある、天然に生じる硫酸コンドロイタンはコレステロールエステラーゼと相互作 用しない、Ｂｏａｎｅｒ等著、１９尋者年、ＰＮＡＥＩ　８５．７４３８．ヘパ リンのコレステロールエステラーゼとの相互作用の能力の欠乏線、これが高価で あり吸収され、副作用を伴なうので慢性疾患に関して人への使用が制限される。

本発明は、我々が定義する構造上の特徴を有する合成多糖類が（１）へパリのよ うな酵素を抑制する、我々が発見した天然に生じる化合物より明らかに強力であ る、非常に強力なコレステロールニステラーぜの抑制剤（米国特許小組［１６８ ４２４号明細書、１９８８年３月１５日提出）であり、（２）腸から非被吸収で あり、（３）安価（約１００ドル／に９）であり、かつ＋４１　（１）及び（２ ）の効力において腸内酵素とのより連続して接触する、ということを示すことに より従来技術を越える特記すべき改良を教示する。

本発明によれば、我々は人膵臓コレステロールエステラーゼの、非常に大きな硫 酸化多糖類抑制剤（分子ｔ（１０００００よｐ大）の構造特徴に関する発見をし 、我々はこれをアッセイとしてコレステロールオレエート加水分解活性を用いて 均質に精製した。これ拡サブナノモル抑制定数を有する高い特異性の誘導体を供 給する硫酸化多糖類の合成及び特性に関しての発明をも包含する。これらの薬剤 の多くは非喘乳動物及び非バクテリア多Ｓ類から製造され、これ拡その大きなサ イズにより多糖類を非吸収性及び非減成性とし、こうしてより少ない副作用を伴 なう。より小さｂサイズの薬剤に関しては、重合するか、又は不活性ポリマーに 結合し、より有効なものにすることができる。これらの薬剤はコレステロールエ ステラーゼ（１００ｋＤＡ人膵臓酵素）により触媒される、天然に生じるコレス テロールエステル、例エバコレステロールオレエート、パルミテート、リル−ト 、ステアレート及びアラキトネートの加水分解を抑制するためにも特異的である 。

これらの薬剤は人膵臓トリグリセリドリバーＪｅ（５２ｋＤａ　）　ｋ阻害しな い。これらの薬剤は人膵臓コレステロールニステラーぜをその刷子縁膜上の結合 位から追放するコトもでき−るす、Ｂｏｇｎｅｒ等著１１尋者８年）ＰＮ入Ｓ１ 第８５巻、第７４５８頁、こうして、これらの硫酸化多糖類は少なくとも２つの 機構−コレスチロールエステルの酵素的分解の抑制及び酵素を腸管細胞上のその 結合位から追放によって、コレステロールエステラーゼが促進するコレステロー ルの吸収を減少させるように働ら（、更に、これらの薬剤は、テトラヒドロリプ スタチンと異なり、動物に投与される有効量にンいて脂肪便症を引き起こさない 。

更ニ、我々のコレステロールエステラーゼの抑制剤はトリグリセリドリパーゼの 抑制剤と共に投与することができる。多量の脂肪酸吸収がトリグリセリドリバー ぜの作用を介して生じるので、その抑制は箸るしい脂肪便症に導ひくであろう。

低い度合のりパーゼ抑制ハコレスチロールエステラーゼ抑制剤の投与とｍｈ＋わ せて脂肪酸吸収、アテローム性動脈硬化症の発生を減少させることができる。こ うして副作用を最少にすることができる。

該分野の専門家線種々のトリグリセリドリバーぜ抑制剤、例えばアテローム動脈 硬化症を減少させるために本発明の硫酸化多糖類抑制剤と組入合わせることので きる、例えばテトラヒドロリプスタチンｔｇ識している。

低分子量硫酸化デキストラン（ＭＤ８−　Ｔ　）は日本において血清コレステロ ールレベル金減少させるために使用サレテイル、ｚｌ　ａ−尋者、１９８７年、 Ｊ、　Ｃｈｉｎ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｎｕｔｒ、　、第２巻、第５５〜７０頁、このバクテリアデ キストランの分子量は７〜８ｋＤａの間である。この低分子量は炭素−１４標識 付は研究により示されるように、硫酸デキストランが腸において吸収されること を許す、（製品挿入書、ＭＤＳコーワ、コーワ社、名古屋、日本からの注射及び 錠剤（Ｅｔｈｉｃａｌ　Ｄｒｖｇ；ｓ。

第１０改訂版、１９８６年）参照）、請求項において示したように腸管吸収のこ の特性に関しては、この薬剤の静脈内投与により血清リビドにおけるより迅速な 減少が血漿リポプロティンリパーゼの活性化による脂肪血症の一掃と共に獲得さ れうるということが明らかになった。明らかに投与のこのルートは腸管中のコレ ステロールエステラーゼ抑制に関する効果に導ひかない、　ＭＤ８の吸収は種々 の副作用、特に、注意されなければならない抗凝集効果に導ひくことがある。該 調剤はコレステロールエステラーゼを抑制するＣとに関しては知られていないし 、かつそれは任意に、かつ種々の環位で硫酸化されている。

著しく増大する抑制活性は多糖類の増大する分子量及び特定の位置でのｆＲ醗化 から実現化される：増大する効果及び減少する副作用拡抑制剤の減少する吸収に おいて達せられる。コレステロールエステラーゼの刷子縁膜上の結合位からの増 大する追放も同様に達せられる、Ｂｏｇｎｅｒ等著、１９尋者年、ＰＮＡＥｉ　 、第８５巻、ｇ７４３８［。従って、本発明はコレステロールエステラーゼの活 性全抑制するのに使用するための２００００（２０ｋＤａ　）より大きな分子量 金有する非被吸収性硫酸化多糖類を包含する１本発明は制御された方法で３位で 硫酸化された硫酸化多糖類でもある。

我々の研究は、天然に存在する稿々の多糖類ポリマーを硫酸化し、人膵臓コレス テロールエステラーゼの強力な水溶性抑制剤ｔ−ａ造することができるというこ とを示した。こうして、我々は種々の豊富で、かつ安いが、水に不溶性の非被吸 収性多糖類、例えばアルｌン醗（海草から、分子量２４００００）、ペクチン（ 野菜及びフルーツから、分子量２０００００）、キチン及びキトサン（軟体動物 から分子量３０００００）、セルロース（植物及び木から、分子量５０００００ ）及び高分子量デキストラン（バクテリアから、分子量５０００００）ｔ−制御 された方法で反応させて、すべて分子量が１０００００より大きい硫酸化誘導体 を製造した。これらの誘導体はすべて腸管から非被吸収性である。これらは同様 に人によって非減成性である。

硫酸化はこれらの多糖類を水溶性で、酵素に到達可能で、かつこうしてコレステ ロールエステラーゼの重要な抑制剤にし、この際出発材料はあまり水溶性でなく 、かつ抑制作用を有していないか、又はあまり抑制作用金有していない。更に、 ｗ雪化アミロペクチンはコレステロールニステラーぜの効果的な抑制剤であり、 新規な使用は米国特許第４１５０１１０号及び同第４０６６８２９号明細中に記 載された薬剤としてのその使用の中では教示されていない。薬剤としての硫酸デ キストラフ（Ｄ使用はｍ、　Ｊ、　Ｓｕｒｇｅｒｙ著、１９６７年、第１３巻、 第２７頁中に論議されている。これらの開示は引例ｅ＃照されたい。

更に、藻類から抽出及び硫酸化の後、寒天は人膵臓コレステロールエステラーゼ の著しく強力な抑制剤である。寒天は又替するＤ−がラクトース及び６，６−ア ンヒドロ−Ｌ−がラクトース単位からなる線状多糖類である。市販のがムアが− （ｇｕｎ　ａｇａｒ　）の処理は水に可溶性であるビルになる。この水溶液は人 膵臓コレステロールエステラーゼを３．３　Ｘ　１Ｑ−１１Ｍ　（ＭＷ冨３００ ０００）のＩＣ５０で抑制する。これとは反対に、天然の寒天扛非常に弱いコレ ステロールエステラーゼの抑制剤であり、３　Ｘ　１０−８ＭのＩＣ５０ｔ−有 する。この抑制はほとんどの市販用の寒天調剤の微量不純物である寒天の硫酸化 型であるアがロペクチンの存在によるものであろう。

すべての硫酸化多糖類がコレステロールエステラーゼを抑制するわけではない。

相当数の構造特徴が抑制の度合を変えることができるので、３−スルフェートの 存在が著しく抑制を強めるということ、及びすべての多糖類がコレステロールエ ステラーゼを抑制するわけではないということは予期されない、例えば３位がす でにグリコシド結合に占められている硫酸コンドロイチン、糖の環上の３−スル フェートの存在は人膵臓コレステロールエステラーゼに対する稽々の多糖類にお ける抑制活性を生産するために必要かつ十分である。

しかしながら、２−スルフェートの存在は抑制を減少し、−万６−スルフェート は不必要である。

硫酸化多糖類のコレステロール吸収を低げることの効果は、腸管からの多糖類の 吸収金工げ、こうしてその酵素との接触を長くすることにより増大する。高分子 量硫酸化多糖類は非被吸収性であり、従ってコレステロールの吸収を抑制するた めに心安かつ十分でちる。

増大する分子量は同様に多糖類の阻害活性を増大し、硫酸化は溶解性全増し、か つ酵素に接近し、より大きな抑制を生産する。例えば分子量５０００　（５ｋＤ ａ　）の硫酸デキストランは２０ｎｌＪのｒｃｓｏで抑制し、一方分子量５００ ，０００　（５００ｋＤａ）の硫酸デキストランのＩＣ５０はＱ、Ｑ　’ｌ　ｎ Ｍであった。

従って、本発明は分子量２０　ｋＤａより大の一般式：〔式中、Ｒ１はＣＯＣＨ ３又は−８０３Ｎａ　ｆ表わす〕の化合物、分子量２　Ｑ　ｋＤａより大の 又は分子量、２Ｑ　ｋＤａより大の 全包含する。

本質的に、我々の発見はしばしば不要なものとして認められる天然に生じる多糖 類ポリ２−を、少量で十分に認容性の量でｉ５Ｔ＃性薬剤として投与することの できる、一連の著しく強力で、安価で、非被吸収性で、かつ非毒性及び非減成性 の、コレステロール及び脂肪酸の抑制剤に変換する実用的な方法に導び〈。該分 野の専門家はコレステロールエステラーゼとの接触全増大させるために抑制剤全 腸管中で分散及び／又は強化又は延長するための方法がコレステロールの吸収を 更に増大するということ’ｔ！！ａめて＾る。

これらの硫酸化多糖類は同様に動柳膵膿コレステロールエステラーゼの抑制剤で もある０例えば、硫酸セルロースは酵素の由来が牛（Ｋｉ　Ｏ，Ｉ　ＡＭ　）　 、豚、ラット又は兎の膵臓である場合、コレステロールエステラーゼで触媒され るコレステロールオレエートの加水分解を抑制する。コレステロールオレエート を飼料とする兎へ硫酸セルロースを投与すると、コレステロール吸収が７０チを うわまわって抑制し、−万遊離コレスチロールの減少も同様に減少する。

ｃれらの抑制剤ｌ−ｊ　ＡＣＡ’ｒ　、脂肪アシルコレステロール０−アシルト ランスフェラーゼの抑制剤と組合わせて投与することもできる。これらの化合物 は低級コレステロールであるが、吸収され、かつ不活性で嫁ないので多くの毒性 副作用を有する。ａ作用はその投与量を減らし、かつ吸収されないコレステロー ルエステラーゼ抑制剤とＭＡ合わせて効果を保持することにより低くすることが できる。

該分野における専門家昧、例えばＨｅｌｄｅｒ等著、１９８３年、Ｊ、　Ｌｉｐ ｉｄ　Ｒｅｓ、、第２４巻、第１１２７Ｋに記載されているような種々のＡＣＡ Ｔ抑制剤をコレステロールの血清レベルを減少するために本発明の硫酸化多糖類 と組合わせる仁とができることを認める。

これらのコレステロールニステラーぜの硫酸化多糖類抑制剤社錠剤、カプセル、 液剤及び粉末のような医薬投与剤形で投与することができる。同様に、これら扛 ｃスケットやクツキーのような食物友品に堰ｐ入れることもできる０本質的には 、硫酸化多糖類金コレステロール及び脂肪酸吸収を１特に予期できない程大きな 利点が得られるであろうコレステロールエステル豊富な食物から減少させるため に食物追加物として使用することができる０食物及び医薬の分野の専門家は硫酸 化多糖類を投与するための広く変化に富んだ形及び手段を認める。Ｖ利に、硫酸 化多ｍＩ！ｉｌは食物と共に、又はほば食物摂取の時間に、かつ特にコレステロ ールエステルが豊富２な食物と共に投与される。

更に、これらのコレステロールエステラーゼの硫酸化多糖類抑制剤はコレステロ ール合成遮断剤と組合わせて投与することもできる。コレステロール合成遮断剤 の治療を受ける患者は種々の毒性副作用を経験する。

この毒性は患者に投与するコレステロール合成遮断剤の投与量を減少させること によ夕減少させることができる。従って、腸管において吸収され、内生的なコレ ステロール合成ヲ辿断する薬剤と組合わせて、本発明の硫酸化多糖ａｔ−投与す ると、同じ最終的結果を得るためにコレステロール合成遮断剤の投与量の減少が 許される。コレステロール合成遮断剤′と関連する毒性を効果的に減少すること ができ、一方血清コレスチロールレベルは減少したままである。

該分野の専門家は、コレステロールの血清レベルを減少させるために本発明の硫 酸化多糖類と組合わせることのできる穐々のコレステロール合成遮断剤、例えば ロバスタチ７　（１ｏｖａｓｔａｔｉｎ　）　′ｆｃ承知している。

コレステロールエステラーゼの硫酸化非被吸収性抑制剤の関連した群は硫酸化イ オン交換樹脂のグループであり、これらはモノ−Ｓ（ファルマシア社）、セファ デックス−８Ｐ（シグマ社）及びＳ−セファロース（ファルマシア社）のような 不溶性のものである。これらの薬剤はすべてコレステロールエステラーゼと密に 結合し、その機能を抑制する。

コレステロールエステラーゼの非被吸収性抑制剤の他の許嫁酵素に対して生じた 、経口的に投与される抗体である。これらの抗体は胃の−で、及びコレステロー ルニステラーぜへの結合に訃いて安定であり、彼ら伐酵素を抑制することにより 吸収されるコレステロールの量を減少させる。該分野の専門家は乳やモノクｑ産 法が存在することを認める。更に、そのような抗体の種々の調剤が腸内でのコレ ステロールニステラーぜとのその接触を強化するために製造されうる。

更に、次の実施例につき、本発明を説明するが、これらは、本発明の範囲及び思 想をそこに記載の特定の方法に限定することを意図しているものではない。

例１ マクロシステイス・ピリ７エラ（ＭａｃｒｏｃｙｓｔｉｓＰｙｒｉｆｅｒａ　（ Ｋｅｌｐ））からのアルギン酸を、１１Ｉ９／−の濃度で水中に溶かした。この 貯蔵溶液を、１０−５ダ／−まで低下する種々の多糖類濃縮物の製造のために使 用シタ。ヒト勝臓コレステクールエステラーゼをボスネル（ＢＯ８ｎｅｒ　）等 のＰｒｏｃ、　Ｎａｔ’　Ｉ　Ａｃａｄ、　８ｃｉ、　８５゜７４３８（１９８ ８）Ｋ記載の方法で精製した。アルギン酸によるコレステロールエステラーゼ阻 害を測定するために、コレステリンニステラー１”（１０μμ）５０μｌｓ’ｔ ’ス７アチジルコリンペシクルス（コレステリル１４ｃ−オレ二一）　１　ｍＭ ／　２０００　ＣＰＭ／　ｎ　モルを含有）７５μ７１１００ｍＭタクｏコレー ）　２５　ｐｌ　％１５０　ｍＭ　トリス（ｐ）１７．５）１２０μ／及び試験 アルイン票溶液３０μｌを３７℃で１５分間恒温保持した。

反応容器を４℃の水浴中に配置し、０．３Ｎ　ＮａＯＨＯ，６ｄ及びベンゼン／ クロロホルム／メタノール（０，１／１．２１０．５　）　３１Ｊの添加により 、この検定を静止させた（ｑｕｅｎｃｈｅｄ）　、この静止された反応物を３０ 秒間渦動させ、３０００．！ｉ＋で１５分間遠心し、上部水相の１−を６　ＮＨ ｃｉ　０．０２５−を有するアクアソｋ　（Ａｑｕａｓｏｌ）−２（ＤｕＰｏｎ ｔ　）　７−に添加した。この混合物を１分間渦動させ　１４ｃｍオレエートを 計測した。この計測を、コレステロールエステラーゼを含有するがアルギン酸を 含有しない試料と比較して、阻害率を測定した。

この検定法に従って、アルイン酸を１Ｏ−１ａＦ／Ｉｆ−／〜１０−’１１５１ ／ｍｌ／の阻害に関して試験した。第１表に記載のように１この多糖類は、４μ ｍ／／Ｍｌ又は２０　ｎＭ（分子量２４０　ｋＤａと仮定）のＩＣ５ｏ含有した 。

例２ アルイン酸の硫酸化は、種々の硫酸化（５ｕｌｆａ’ｔｓｄ　）誘導体の製造（ 第１図）及びそのコレステロールエステラーゼ阻害剤としての試験によル示され ているように、著るしくその阻害能力を高める。

アルギン酸ナトリウム（１５０ＩＩｑ）を、室温で、氷酢酸（５ｃｃ　）で２時 間処理し、濾過しかつＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（５−）中に再懸濁させた 。この攪拌溶液に、室温で３０分間にわたって三酸化硫黄−ピリジン複合体（１ ，５＃）を添加し、生じた混合物を１晩（１６時間）攪拌した０次いで無水ピリ ジン（５ｄ）を添加し、硫酸化アルギン酸をア竜トン−メタノール（９：１’） 混合物１００−で沈殿させた。この沈殿をＨ，Ｏ（５０ａｆｆ　）中に港かし、 この溶液のβ値を１Ｎ　ＮａＯＨでｐ）１８に調節した。アセトン−メタノール （９：１）混合物（〜２００ゴ）での再沈殿によル、硫酸化アルイン酸のナトリ ウム塩が得られた。この化合物を、前Ｐのように、コレステロールエステ２−ゼ 阻害に関して試験すると、これは、０，２５μｆｉ／Ｍｌ又は１．０龍の工Ｃ５ ｏを有した（第１表及び第２図）。

化合物５ アルイン酸ナトリウム（１１）を脱イオン水１０〇−中に溶かし、０．１Ｍ臭素 溶液６０１１１を、攪拌しながら添加した。混合物を室温で２４時間攪拌し、引 続き、この溶液のβ値を、１ＮＮａＯＨで８．０に調節した。分子量３５００の カット・オフ膜（ｃｕｔ−ｏｆｆ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　）を用いて、４８時間、 水（６１Ｘ４　）に対する透析の稜に１溶液を凍結乾燥させると、酸化生成物（ 第１表の化合物３）８１０１Ｉ９が得られた。

水中の化合物３　５７５ＩＩ９に、酢酸アンモニウム８Ｉ及びシアノホク水素化 ナトリクム８Ｉを、攪拌しながら添加した。この混合物の一値を０．Ｉ　ＮＨＣ Ｊ　Ｋよ〕６、ＯＫ調節し１．４０℃で４８時間攪拌を続けた。混合物を室温ま で冷却の後に、この溶液のβ値をＩＮＨ（Ｊを用いて４．０に調節し、室温で更 に２時間攪拌を続けた。この還元的アミン化生成物を無水エチルアルコールの添 加によ）沈殿させた。この沈殿を水（２００ｃｃ　）中に溶かし、２ＮＮａＯＨ ＠液を用いてβ値を９に調節した。エチルアルコール−７七トン（１：１）５０ ０　ｃｃでのこの溶液の処理により、ゼラチン様物質が得られたので、これを遠 心によシ集めた。生じた混合物を無水アルコール及びアセトンで数回洗浄し、凍 結乾燥させると、還元生成物（第１表の化合物４）５３２岬が得られた。

化合物４の硫酸化を、前記の方法（化合物２参照）で、三酸化硫黄−ピリジン複 合体を用いて行なった。

この硫酸化アルギン酸（第１表の化合物５）を、コレステロールエステラーゼ阻 害に関して試験すると、これは０．０２５　μｍ１　／ｍｌ又は０．１０　ｎＭ の工Ｃ５ｏを有した（第１表及び第２図）。

化合物６ 酸化されたアルギン酸（５００１Ｉ９、化合物５）を、氷酢酸（２５１Ｌ／）で ２時間処理し、残分を、ＤＭＦ　（２５１）中に懸濁させ、三酸化硫黄−ビリジ ン複合体５ｙを３０分かかつて添加し、その間Ｄ）Ｊ溶液を４℃で攪拌した。反 応混合物を放置して室温まで昇温させ、これを、更に２４時間攪拌した。この反 応混合物にピリジン（２５１１１ｊ）を加え、硫酸化生成物を、この溶剤混合物 （５００ｃｃ　）への７七トン：メタノール（９：１）の添加Ｋｊシ沈殿させた 。残分を水６ＯＫｌ中に溶かし、これを、Ｉ　Ｎ　ＮａＯＨ溶液を用いてこの溶 液の一値を８に調節することにより、ナトリウム塩に変えた。

この溶液を、分子量３５００のカット・オフ膜を用い、水（４ＪＸ６）に対して ４８時間にわたって透析させ、凍結乾燥させると、硫酸化アルギン酸（第１表及 び第２図の化合物６）５２０ＪＩＦが得られた。この化合物は、０．０６μｍ１ ／−Ｉｌｌ又は０．０２５　ｎＭのＩＣ５ｏでコレステロ−ルエステラーゼを阻 害した。

化合物７ 文献（Ｌａｒｍ、　Ｏ，Ｌａｒｓｓｏｎ、、　８ｃｈｏｌａｎｄｅｒ、　Ｅ。

Ａｎｄｅｒｓｏｑ　Ｌ、Ｇ、、　Ｈｏｌｍｅｓ、　Ｔ！、、及びＳｏｎｄｅｒｓ ｔｒｏｍ、　Ｇ、。

１９７９　＋　Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔ、ｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　７３　ｐ　３ ３２　）の記載に従って、硫酸化アルイン酸（第１表の化合物７）を製造した。

この化合物は、０．１０μｇ／−又は０．４２　ｎＭのＩＣ，ｏで、コレステロ ールエステ５−セラ阻害した。

アルギン酸のこの全ての硫酸化誘導体は、この天然の多糖類と比べて、優れた阻 害剤である。これらの結果を、次表に挙げ、硫酸化が、阻害を２０〜２００倍高 めることを示す。

第　１　表 アルギン酸　２０．０　１．０ 他合物　２　１，０　２０．０ 他合物　５　０．１０　２００．０ 他合物　６　０．２５　８０．０ 他合物　７　０．４２　４８．０ 他の通常の多糖類も、硫酸化されると、コレステロースエステラーゼの有効な阻 害剤である。

ペクチン（２１１＞を氷酢酸で処理し、この多糖類をＮ、Ｎ−ジメチルホルムア ミ）’（２５１１／）中に再懸濁させ、攪拌懸濁液を水浴で０℃に冷却するとと Ｋよシ、硫酸化ペクチンを製造した。三酸化硫黄−ビリジン複合体（１０１、＊ ｘａｒｔｃｈ　）を添加し、溶液ｏｉｉ度ｔ、室温に達成させた。更に３時間攪 拌の後に１ピリジン（２０ｍ）を加え、９５−エチルアルコール（〜３００Ｗ７ ）で、との硫酸化多糖類を沈殿させた。この沈殿を水中に溶かし、ＩＮ水酸化ナ トリウムでβ値を７．５に調節した。９５−エタノールでの再沈殿によシ、硫酸 ペクチンのナトリウム塩１．８ｇが得られた（測定値：Ｃ３４，５３；Ｈ４，５ ４；０４７．２１；５Ｏ０７７；ＮＩ！１８．３１　）　。

この化合物をコレステロールエステラーゼ阻害に関して試験すると、これは、０ ．６μ９／Ｌｌ又は３．ＯｎＭの硫黄化されていないペクチンは、コレステロー スエステラーゼを阻害せず、有効な阻害を得るためＫは硫黄化が重要であること を示している。

生米のペクチンは、天然には、（１→４）結合Ｄ−ポリガ２クツロネート配列の 部分メチルエステルとして生じる。このメチルエステルを、ペクチンエステ２− ゼでの処理によシ遊離駿に変えた。詳細には、ペクチン１１ｉを０−１Ｍ　Ｎａ Ｃｊ　ｉ　Ｑ　Ｑ　ｍｌ中に溶かした。Ｐ＆（を７．５に調節し、ペクチンエス テラーゼ（１，４＃、２５０単位、シグマ）を添加した。０．１Ｎ水酸化ナトリ クム溶液を用いて、この反応混合物のβ値を７．５に保持した。もはや−値が変 化しなくなったら（約２時間）、溶液を透析管に移し、水（４７Ｘ７ｔ）に対し て１晩透析させた。この透析された溶液の凍結乾燥によシ、加水分解されたペク チン８２０ｊｌ！７が得られた。メチルエステル分解生成物を、天然ペクチンに 関する前記と同様な方法で硫酸化した。この硫酸化されたペクチンは、コレステ ロールニステラーｆを、０．０４μ、９／１ＱｄＯ，２ｎＭのＩＣ５ｏで阻害し た。

キチン（他の天然出来多糖類）も、硫酸化のための潜在部位を有する。従って、 キチン３００ＩＩ９を、室温で氷酢酸５肩！で処理し、不溶のキチンを集め、Ｄ ＭＦＩＱｄ中に再懸濁させた。三酸化硫黄−ビリシン複合体（３Ｉ）を室温で添 加し、この反応混合物を攪拌した。８０時間後にピリジン５ｄを添加し、溶液を 更に３０分間攪拌した。硫酸化キチンを９５チエチルアルコール（１００３１７ ）の添加によシ沈殿させ、固体を水１０００ｃ中に懸濁させ、この溶液のβ値を 、７．５に調節した。次いで、このキチン溶液を水に対して４８時間透析させた 。この溶液を濾過し、澄明な濾液を凍結乾燥させると、硫酸化キチン４８ｍ９が 得られた。硫酸キチンハ、ヒトコレステロールエステラーゼｔ、０．３鹿のＩＣ ＋ｏ　（分子量３００　ｋＤａと仮定）で阻害した。

キチンは、不溶であるので、キトサンを出発物質として用いて、硫酸化された物 質の量を増大させた。キトサン（１１１）を、室温で、木酢１１！２　Ｑｍで２ 時間処理し、残分をＮ、Ｎ−ジメチルホルムアンド２５−中に懸濁させた。この 攪拌溶液に１三酸化硫貢−ビリジン複合体（１０，９）を室温で添加した。生じ た混合物を２時間攪拌し、室温で７２時間保持した。ピリジン（２０１＋１１１ ４）を添加し、硫酸化キトサンをアセトン−メタノール（９：１）で沈殿させた 、次いで、これを水２００ｄ中に溶かし、この溶液のβ値を２Ｎ水酸化ナトリウ ム溶液で７．５に調節した。９５チエチルアルコールでの再沈殿によシ、硫酸キ トサンのナトリウム塩を生じるから、これを水２０〇−中に再溶解させ丸。

この多糖類溶液を水Ｃ６１Ｘ４）に対して４８時間透析させ、次いで凍結させる と、硫酸キトサンのナトリウム塩１．１２＃が得られた。コレステロールエステ ラーゼの阻害剤として試験する際に、これは、Ｑ、３ｎＭのＩＣ５ｏを示した。

他の市場で入手しうる硫酸化多糖類も阻害能力に関して試験した。従って、硫酸 セルロース（分子量約５００　ｋＤａ　）は、０．０２　ｎＭのＩＣ５ｏを有し 、硫酸デキスト２ン（分子量５０００００）も０．０２　ｎＭのＩＣ５゜を有し た。低分子量の硫酸デキストラン（分子量５０００）は、著るしく弱い２０ｎＭ ＯＫｉを有した。

これらの全ての硫酸化化合物に関するＩＣ，。を次の第２宍中にまとめる： 第２表 硫酸ペクチン　３．０ 硫酸ペクチン（加水分解された）０．２硫酸キチン　０．１６ 硫酸キトサン　０・１６ 硫酸セルロース　０．０２ 硫酸デキストラン（ａ）　ｒＪ−０２ （ａ）　分子量５０ＣＩＣ１［ｌＣ１の硫酸デキストラン（ｂ）　分子量５００ ０の硫酸デキストラン更に、以下の記載のようにして装造された硫酸アミロペク チンは、コレステロールエステラーゼの阻害剤としての作用をする。

機械的攪拌のための装置を備え、軟化（脱イオンされ、蒸溜された又は水道水も 使用できる）１１００部を含有するジャケット付き反応容器中に、ジャガイモデ ンプンから分別され九アミロペクチン２７５部を、攪拌しながら添加した。３０ 分の攪拌の後ＩＣ，２５（Ｗ）−Ｎａ　ＯＨ水少量宛で、−値を約１０．５〜１ １．０に調節した。温度は８０’Ｆであった。

トリメチルアミン−三醗化硫黄複合体６２０部を１．５時間にわたってゆつくシ 添加した。同時に、−値を１１．０に保持するように設計された７°ログラム添 加装置によＦ）　２５　％　ＮａＯＨ溶液を更に導入した。このプログラム添加 を全反応にわたって保持した。

全てのトリメチルアミン−三駿化硫黄付加生成物の添加の後に、この容器を閉じ 、反応の間に形成されたいくらかのトリメチルアミンの除去を開始するために１ ｚ′水柱の真空を施こした。同時Ｋ、１．５時間にわたって連続的に苛性アルカ リの連続的プログラム添加によシ、温度を徐々に１２２”Ｆｔで高めた。−１１ ，０を保持するようにプログラムされた苛性アルカリ添加を伴なう１２２＠Ｆで ０１１時間後に反応は完結した。

次いで、真空を２７“水銀柱まで高め、２５％Ｎａ　ＯＨ溶液のプログラム添加 によシーを１１に保持しながら、ストリッピングによシトリメチルアミンを除去 した。

大体のトリメチルアミンが除去された後に１−を約１１に保持しながら、水１１ ５０部を用いて水ストリッピングを開始した。

遊離のトリメチルアミン含分が１　ｏ　ｏ　ｐｐｍ以下まで減少した後に、真空 を解除し、固体を２５　（Ｗ）−の濃度に１−を１０．８〜１１．０に調節した 。次いで、生じた溶液を、連続的に、膜としてのパーチメントを用いて水に対し て透析させて、デンプン固体に対して５ｅｓのＮａ２８０４の塩含分にした。

この段階での両値は、約８でおった。次いで、生成物を、入口温度４５０’Ｆ、 出口温度２１０’Ｆを用いてスプレー乾燥させた。

生じたスプレー乾燥された硫酸アミロペクチンは白色粉末状であり、未反応のト リメチルアミンの痕跡残分の存在から生じる臭い又は味がまったくなかった。

例４ とζに記載の硫酸化多糖類も、と）　１００　ｋＤａコレステロールエステラー ゼによるトリオレインの加水分解を阻害する（第１部に記載と同じ検定法を用い たが、フレステアリルオレエートの代りにトリオレインを使用した）０次の表に 示されているように、）リオレイン加水分解の阻害に関するＩＣ５ｏは、コレス テリルオレエート加水分解に関するそれとほぼ近似している。

これらのデータは、これらの化合物が、脂肪の吸収を遮断する有用な薬剤である ことを示してお）、同様にコレステロールの吸収に関しても第３表に挙げる。

第　３　表 アルイン酸　４２．０　２０．０ 化合物２　５．５　１．０ 化合物５　０．２５　０．１０ 化合物６　０．８３　０．２５ 化合物７　０．４２　０．４２ 硫ＷＲ−１！クチン　２．５　３．０ ペクチン（加水分解された備酸塩）　０．２５　０．２硫駿キチン　０．３５　 ０．３ 硫酸キトサン　０．８５　０．３ 硫醗セルロース　０．０６　０．０２ ＊分子量　５０００００ ここに記載の硫酸化多糖類は、高められた温度で、その阻害作用を長時間保持す る。仁の特性は、それらを、焼成条件下で安定にし、その適用のだめの有利なベ ヒクルを提供する１例えば、（ｊｉ散セルロース１０９タヲコーン・マフイン・ ミックス（Ｇｏｌｄ　Ｍｅｄａｌ　）１９８、！ｉ’（７ｏｚ）に添加し、固体 成分を充分く混合した。卵１個及びカップ％　のミルクの添加の後に、この７フ インミツクスを１５回攪拌した。この混合物を９個のマイン容器中に入れ、４０ σのオープン中で１５分分間−た８次の日に、１個のマフインを粉砕し、水１０ ０−を加え、１５分間放胃した。この混合物を遠心し、澄明上澄みをコレステロ ールエステラーゼ阻害の有無に関して検定した。この溶液のＩＣ，。は、この溶 液を１０３〜１０４倍稀釈の際に達成された。これらのデータは、この阻害剤が 焼成条件下で安定であ〕、焼成された物質から溶液中に放出されうろことを示し まず、市販の寒天２９を、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミｒ（２５１１１７）中に 懸濁させ、水浴を用いて攪拌懸濁液を０℃に冷却する仁とによ勺、市販寒天から 硫酸化寒天を製造した。三酸化硫黄−ビリジン複合体（１０Ｊｉｉ、　Ａｌｄｒ ｉｃｈ　）を添加し、放置して、この溶液の温度を室温に達成せしめた。更に３ 時間攪拌の後に、ピリジン（２０ｉｄ）を添加し、この硫酸化多糖類を９５チエ チルアルコール（〜６０ｄ）で、沈殿させた。この沈殿物を水中に溶かし、１Ｎ 水酸化す）リクムでβ値を７．５に調節した。９５％エチルアルコールを用いる 再沈殿によル、硫酸化寒天が得られた。

ボスネ／Ｉ／　（Ｂｏｓｎｅｒ　）等のＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　 ８ｃ１゜８５．７４３８（１９８８）Ｆｌ）記載に従って、ヒト脛臓コレステロ ールエステラーゼを精製した。硫酸化寒天による勝臓コレステロールエステラー ゼ阻害を測定するために、％臓コレステロールエステラーゼ（１０μｇ／ｄ）５ ０μ１１コレステリル１４Ｃ−オレエート（１ｍＭ、２００００ＰＭ／ｎモル） を含有するホスファチジルコリン　ベシクル（ｖｅｇｌｃｌｅｓ　）　７５μ１ ％１００ｍシタウロコレート２５μ！、１５０ｍＭトリス（ｐ）１７．５）１２ ０μ！及び試験硫酸化寒天溶液３０μノを３７℃で１５分間恒瀉保持した。反応 容器を４℃水浴中に配置し、Ｑ、３　Ｎ　ＮａＯＨＯ−６Ｍ！及びベンゼン／ク ロロホルム／メタノール（１，０／　１．２１０．５　）　３−の添加によシ、 仁の検定を静止させた。静止された反応物を３０秒間滴動きせ、３０００＃で１ ５分間遠心し、上部水相１ｍｌを、エクアンル（ムｑｕａｓｏｌ　）　−２（Ｄ ｕＰａｎｔ　）　７　ｍに、６　Ｎ　ｐｃｔ　Ｏ，０２５ｄと共に添加した。

この混合物を１分ＩＶＩ渦動させ、１４Ｃ−オレエートに関して計測した。この 計測値を、コレステロールエステラーゼを含有す゛るが硫酸化寒天を含有しない 試料と比較して、阻害率を測定した。

この検定法に従って、硫酸化寒天は、ヒト胛臓コレステロールエステラーゼに対 する３、３　Ｘ　１０−１１　Ｍ又は肌０３３　ｎＭ　（分子量３００　ｋＤａ に対して）のＩＣ５ｏを有することが測定された。

とのｒｃ５ｏは天然（非硫酸化）寒天に関しては３ｘ１０−”Ｍ又は３０ｎＭで あることが測定された。仁の阻害は、寒天のアガロペクチンによる僅かな（＜　 ０．１％）汚染に依るらしく、寒天の硫酸化された形は、大、抵の寒天の市販製 品中に認められた。

キトサンによシ提示されたヒト葬臓コレステロールエステラーゼの潜在阻害（０ ，３ｎＭ、例１）に関する構造的基本を、多糖類環上の種々の位置で硫酸化され た多数のキトサン誘導体の製造によシ測定した（第３図）、第４表に記載の要素 を用いて５種の化合物を合成し、それらの阻害活性を、前記の例６に記載の検定 により測定した。５種の硫酸化された多糖類に関する構造活性関係を次Ｋまとめ た。

データが示しているように、３−スルフェートの存在は、ヒト陣臓コレステロー ルエステラーゼに対する、これら多糖類による阻害活性を得るために必要かつ充 分である。しかしながら、２−位の硫酸化は、活性を低下し２．６−硫酸化は不 必要である。

第４表 例８ 結腸腺癌（Ｃｏ１ｏｎｉｃ　ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ　）細胞（ＣａＣ。

−２、ＡＴＣＣ）を、リボ蛋白質欠乏血清１０（ｖ／Ｖ）％を含有するデュルベ ツ；・モディファイド・イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅ ｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ　）中の２５寵カバースリツプ上で、２Ｘ１ ０’細胞の密度に生長させた。このカバースリップを燐酸緩衝食塩水（ＰＢＳ　 ）で洗浄し、ＰＢＳ　１−０１１！　、タウロコレート２ｍＭ及び牛血清アルゾ ミン１チを含有する３５寵クエルに移した。次いでとの細胞を３７℃で　３Ｈコ レステロール０．０１　ｕＣｌ　及ヒ１４ｃｍコレステリルオレエ−）　Ｑ、Ｑ 　１ｕｃｉ　（これらは、ホス７アチジルコリンベシクル中に埋封された）と共 に恒温保持した。対照ウエルハ、コレステロールエステラーゼを収容せず、実験 セットは、牛７２ｋＤａコレステロールエステ９−ゼを収容した。１、種々の恒 温保持時間で、カバースリップを取）出し、ＰＢＳで３回洗浄し、細胞をスクレ ーピングによシ集め、５ＤＳ０．１チを含有する２　５０　ｍＭ　）リスグリク ン緩衝液（…８．８）で洗浄する。ｍ胞を遠心によ）集め、ベレットを１００℃ で５分間加熱し、次いで１０分間音波処理をした。遊離ステロールから又ハコレ スチリルオレエートからのコレステロールの吸収を　３Ｈ又ｕ”Ｃに関するシン チレーション計測によシ測定した。第４図に示されているように１コレステロー ルエステラーゼは、コレステロルオｖ　ｘ　−）カラ誘導されたコレステロール の吸収に触媒作用をしく第４ａ図）、これは、遊離コレステロールの吸収ニも触 媒作用をした（第４ｂ図）。双方の場合に１硫酸セルロースは、著るシ〈細！１ ｊｉによるコレステロール吸収を阻害する（第４ａ図及び第４ｂ図、口）。

例９ 硫酸セルロースを用いて、遊離コレステロールから又ハコレスチリルオレエート からのコレステロール吸収の阻害を生体内で試験し九、６週間コレステリルオレ エートを与えたウサギを１２時間絶食させ、その胃内に経鼻胃腸管を挿入した。

トリス緩衝液中の硫酸セルロース溶液（１００Ｍ９／ｄ）５−を添加し、引続き ホス７アチジルコリンベシクル中に混入された３Ｈコレステロール２０　ｕＣｌ 　１０ｍ及び１４Ｃコレステリルオレエートの２Ｑ　ｕＣｌ　１０−を添加した ０次に、この経鼻胃腸管に付加的な硫酸セルロース溶液（１００■／１ｄ）５１ Ｌｔを流した。この管を取シ除いた後に耳静脈から採血し、時間及び血漿１００ μｌの関数として、１４ｃ及び３Ｈに関して計測した。図から明らかなようＫ。

硫酸セルロースは、遊離コレステロール又紘コレステリルオレエートから誘導さ れたコレステロールの双方の吸収を８５％阻害する（第５図）。

例１０ ９匹のニューシイランｒ白ウサギ（２〜２．５　ｋｌｉｌ　）を、通常のウサギ 飼料で保持し、＃素的比色法（Ｗａｋ。

Ｐｕｒｅ　Ｃｈｅｍｔｃａｌ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｌｉｍ１ｔｅｄ　）を用 いて測定する際に、それらの血清コレステロールａ２１から６６１１９／ｄｌＫ 変動することが判明した１次いで、これらのウサギを、各３匹ずつの３群に分け た。１群に通常飼料を与え、第２群にコレステロール飼料（５ｇ／に９．ステロ ール中０．５　％　＞を与え、第３群にコレステリルオレエート調料（８，６６ ＃　／に９、ステロール中０．５チ）を与えた。１週間間隔で、耳静脈から採血 しく１．０〜ｉ、ｓ　ｍ　）、１０μ！試料中の血清コレステロールを２回測定 した。第６ａ図に示されているようＫ。

通常飼料のウサギは、５週間の試験期間にわたって血清コレステロールの変化を 示さなかった。他方、コレステリル角料を与えたウサギは、同じ期間にわたって 、その血清コレステロール値は３５倍の増加を経験した。この増加は、コレステ リルオレエートを与えたクサヤではよシ顕著であった（７０倍）。これらのデー タ祉、コレステリルエステルから誘導されたコレステロールが、遊離コレステロ ールよ）も優先的に吸収されることを示している（第６ａ図）。

この優先的吸収を第２の方法で開示した。前記の３群の各々からの１匹のウサギ を１２時間絶食させた。

この試験りｔ＝Ｐに経鼻胃腸管を挿入し、ホス７アチジルコリンベシクル中に混 入された３Ｈ−コレステロール２０μＣ１の懸濁液を含有するトリス緩衝液１０ ｄを添加した。これに引続き直ちに、同様な方法で１４０−コレステリルエステ ル）　２０　ｕＣｉの１０ｍ１／を添加した。

次いで耳静脈から採血し、血漿１００μｌを１４ｃ及び’ＨＫ関して計測し丸。

図から明らかなように、放射能ラベルされたコレステリルオレエート（第６ｂ図 ）又は放射能ラベルされたコレステロール（第６Ｃ図）は、コレステリルオレエ ートダイエツトで保持されたウサギにおいて、優先的に吸収されている。

例１１ ニューシイランド白ウサギ１匹を通常ウサギ飼料で保持した。実験開始の２日前 に、動物に１硫酸セルロースを最終濃度０．５チを示すように添加した飼料を与 えた。次いで通常飼料で１２時間後に、前記のように１４０−コレステリルオレ エートを適用して実験を開始した。次いで、常法で通常飼料を飲食させた。耳静 脈から採血し、放射能ラベルされたコレステロールを、シンチレーション計測に より測定した。第７図に示されているように、この実験過程にわたシ、血清コレ ステロールの濃度は、対照ウサギのそれと比軟する際に硫酸セルロースを与えた ウサギにおいては５０チ低下した。更に、このラベルの適用後４時間までは、実 験動物の血清中にコレステロール扛現われなかった。これとは対照的に１対照動 物においては、その適用後僅かに２時間でラベルが現われる。

１０　ｍＭ　ＮａＣノ、ｌＱｍＭ）リス（ＰＨ７，２’）中の市販の牛陣臓コレ ステロールエステラーゼを、同じ緩衝液で平衡化されたヘパリン−セファロース （１，ｓｘｌ。

ｃｘ　）　Ｋ施与した。更に、この樹脂を、１００ｍＭ）リス（４７，２）で洗 浄することによシ展開させると、全ての適用された蛋白質が実質的に溶離されて も、これら優先的工程のいずれにおいても活性祉殆んど又は全く認められなかっ た一２８０ｎｍにおける吸収がＯＫなったら、この樹脂を、先の緩衝液と同じ導 電率を与えるＯＫ充分な塩化ナトリウムを含有する２０ｍＭタウロコール酸ナト リウムで洗浄した。この全活性を数７ラククヨン中に溶離させた。この１精製工 程で、典型的に５０〜１０〇−倍の精製度で６０〜８０％の収率を提供し、ＳＤ Ｓ　−ＦＡＩ上で、（５７ｋＤａで単一バンドを与える。

この均一な６７　ｋＤａ蛋白質５００μｙを、７０インドの完全アジュバント中 で乳化させ、二ニーシイランド白つサイに皮下注射した。２１日後に、１０ｍν 燐酸ナトリウム、１５０　ｍＭＮａｃＪ　（ｐｉ（７，１）の１ｄ中に溶かした 蛋白質２５０μｙの腹腔内注射で追加免疫させた。１０日後に、このウサギから 採血し、オクテルロニイプレート上で抗−コレステリルエｇＧの存在全測定した 。

この抗体の存在下に、クシ７２　ｋＤａコレステロールエステラーゼを検定した 。典型的な検定において、コレスチリル（１４ｃ）−オレ二−トベククル７５μ ！１種釈された抗体２５μｌ、１［１［］ｍＭタウロコレート２５μ／、１５０ ！１１Ｍトリヌ（ｐｉ（７，５）１７５μノを試験管内で混合し、この反応混合 物に、３７℃で酵素２５μｌを添加することによシ加水分解を開始させた。５分 後に、０．５　Ｎ　ＮａＯＨ６００ｔｔｌ及びベンゼン／メタノール／クロロホ ルム（１／１．２１０．５　）　３ｍの添加によシ、この反応を静止させた。混 合の後に１この試料を、遠心し、澄明水相１ｄを取シ出し、放射能を計測した。

対照活性は、添加抗体の不在下で測定した。

この報告によれば、６７　ｋＤａ、コレステロールエステラーゼに対する抗体を 含有する血清は、ウシ７２ｋＤａ酵素の潜在阻害剤であることが判明した。従っ て、この血清の１０６倍稀釈は、５０チ阻害を生じた。

前記のことから、説明の目的で、本発明の特定の態様がここに記載されているが 、本発明の思想及び範囲を逸脱することなく、種々の変更が可能である。従って 、本発明は、請求の範囲による以外は限定されるものではない。

手続補正書 平成３年１２月２０日

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. １．非被吸収性コレステロールエステラーゼ抑制剤を経口投与することを特徴と するコレステロールの腸管吸収を抑制するための方法。
2. ２．■臓コレステロールエステラーゼを抑制するための非被吸収性合成硫酸化多 糖類の有効量を経口的に投与することよりなるコレステロールの吸収を減少させ るための請求項１記載の方法。
3. ３．非被吸収性多糖類が３−硫酸化非被吸収性多糖類である請求項２記載の方法 。
4. ４．３−硫酸化非吸収性多糖類が３−硫酸化アルギン酸、ペクチン、アミロペク チン、キチン、デキストラン、セルロース、寒天又はキトサンである請求項３記 載の方法。
5. ５．硫酸化したセルロース、寒天、アミロペクチン、キチン、キトサン、ペクチ ン又はアルギン酸の有効量を経口的に投与することを特徴とするコレステロール 吸収を減少させる方法。
6. ６．硫酸デキストラン（分子量２０００００より大）の有効量を経口投与するこ とを特徴とするコレステロール吸収を減少させる方法。
7. ７．■臓コレステロールエステラーゼを分子量が２０ｋＤａより大きい合成非被 吸収性硫酸化多糖類の有効抑制量と接触させることを特徴とする■臓コレステロ ールエステラーゼの抑制法。
8. ８．非複吸収性合成コレステロールエステラーゼ抑制剤の有効量を含有すること を特徴とする摂取可能な食物製品。
9. ９．消化管中で■臓コレステロールエステラーゼを抑制するために２０ｋＤａよ り大きい分子量を有する合成非被吸収性３−硫酸化多糖類の有効量を含有する請 求項８記載の摂取可能な食物製品。
10. １０．合成３−硫酸化非被吸収性多糖類が３−硫酸化アルギン酸、ペクチン、ア ミロペクチン、キチン、デキストラン、セルロース、寒天又はキトサンである請 求項８記載の摂取可能な食物製品。
11. １１．請求項９記載の食品を摂取することを特徴とするコレステロール吸収を低 下させる方法。
12. １２．消化管中で■臓コレステロールエステラーゼを抑制するために有効量の硫 酸化セルロース、ペクチン、アルギン酸、寒天、キチン、キトサン、アミロペク チン又はデキストランを含有することを特徴とする摂取可能な食物製品。
13. １３．有効量の合成非被吸収性硫酸化多糖類を有効量の被吸収性コレステロール 合成遮断剤と組合わせて投与することを特徴とする血清コレステロールレベルを 低下させる方法。
14. １４．有効量の合成非被吸収性硫酸化多糖類を有効量のトリグリセリドリパーゼ 抑制剤と組合わせて投与することを特徴とする血清コレステロールレベルを低下 させる方法。
15. １５．有効量の合成非被吸収性硫酸化多糖類を有効量の脂肪アシルコレステロー ル０−アシルトランスフエテーゼ抑制剤と組合わせて投与することを特徴とする 血清コレステロールレベルを低下させる方法。
16. １６．コレステロールエステラーゼに対する抗体の有効量を経口投与することよ りなるコレステロールの吸収を減少させる請求項１記載の方法。
17. １７．硫酸化イオン交換樹脂の有効量を軽口投与することよりなるコレステロー ルの吸収を減少させる請求項１記載の方法。
18. １８．硫酸化セルロース、寒天、アミロペクチン、キチン、キトサン、ペクチン 又はアルギン酸の有効量を経口投与することを特徴とする脂肪酸吸収を減少させ る方法。