JP4001443B2 - リン吸収阻害剤及びそれを含む治療剤 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はリン吸収阻害剤及びナトリウムイオン吸収阻害剤並びにその用途に関し、更に詳しくは過剰摂取等されたリン又はナトリウムイオンの消化管内での吸収を阻害することにより、当該リン又はナトリウムイオンの糞中への排泄を促進させる作用に優れたリン吸収阻害剤及びナトリウムイオン吸収阻害剤並びにその医薬又は食品への利用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
血清リン濃度が５．０mg／dl以上となる場合を高リン血症というが、その原因は、▲１▼細胞からのリン遊出の増加、▲２▼体外からのリン負荷の増加、▲３▼腎からのリン排泄の減少に分けられる。
【０００３】
細胞内の主要な陰イオンであるリンは、細胞崩壊（例えば、悪性腫瘍の化学療法の後の溶血、横紋筋壊死など）により血中にリンを遊離し、高リン血症を生じうる。
また、体外からのリン負荷の過剰時も同様である。高リン血症が存在すると低カルシウム血症も生じるため、リン摂取を増加させることは好ましくないが、リンの多い食物として知られる牛乳などの乳製品や魚肉などの練り製品等は、カルシウム含量も多いため、カルシウム補強の観点から大量に摂取されることとなる。また、ビタミンＤの中毒も腸管からのカルシウムとリンの吸収を増し、高カルシウム血症と高リン血症を生じる。
【０００４】
以上の高リン血症は、二次的に低カルシウム血症を招き、二次的な副甲状腺機能亢進が起こり、骨からカルシウムが動員され骨粗鬆症の誘因になる。
【０００５】
また、腎不全などの腎機能に障害がある場合、例えばＧＦＲが正常の３０％以下になると、血清リン濃度が増加してくる。おまけに腎不全ではビタミンＤの産生が障害されるので、低カルシウム血症を生じ、二次的にＰＴＨの分泌が増すものの、次第にＰＴＨのリン排泄作用が減弱し、ＰＴＨの過剰が目立つだけとなる。更に、副甲状腺機能低下症、偽性副甲状腺機能低下症の場合は、ＰＴＨの作用がないため、高リン血症の原因となる。
【０００６】
一方、厚生省発行の国民栄養調査成績によると昭和５０年以降毎年日本人が１日に摂取した食塩は１１．５ｇ以上であり、特に平成５年は１２．８ｇであった。一方、１日の食塩摂取量と高血圧症の発生率との間には相関関係があることから、高血圧症の発生、ひいては脳卒中等の発生を防止すべく、厚生省では１日の食塩摂取量を１０ｇ以下にするよう推奨している。米国においても、日本同様に１日の食塩摂取量を制限しており、米国合同委員会勧告案は、高血圧症患者の１日の食塩摂取量を６ｇ以下にするよう唱えている。
【０００７】
また、食塩摂取量と胃癌による死亡率との間にも相関関係があるといわれており、食塩摂取量の多い地域例えば富山市、弘前市等では、胃癌による死亡率が高く、反対に食塩摂取量の少ない地域例えば別府市、沖縄市等では、胃癌による死亡率が低いというデータも得られている。
【０００８】
アルギン酸塩などの食物繊維がある程度のナトリウムイオン吸着能を有することが報告されているが（日本家政学会誌Vol.39、No.３、ｐ.187〜195(1988))、その吸着能は未だ十分満足できるものではなかった。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
この様にリンや食塩が体内に過剰に存在すると、人体に悪影響を及ぼすことから、リンや食塩の体内への吸収を有効に阻害し、過剰に存在するリンや食塩を体外へ排泄する新しい技術の開発が待ち望まれている。
【００１０】
従って、本発明の目的は、過剰に存在するリンを積極的且つ安全に体外へ排泄させることのできる、リン吸収阻害剤、及び高リン血症又はリン摂取制限を必要とする疾患の予防及び治療剤を提供することにある。
本発明の他の目的は、過剰摂取した食塩を積極的かつ安全に体外へ排泄させることのできる、ナトリウムイオン吸収阻害剤、及び食塩過剰摂取に起因する疾患又は食塩摂取制限を必要とする疾患の予防及び治療剤を提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
そこで本発明者は広く食品素材中から上記作用を有する成分を見出すべく種々検討した結果、分子量が１０，０００より大である紅藻類の水抽出物又は熱水抽出物がリン吸収阻害能及びナトリウムイオン吸収阻害能に優れており、食品及び医薬として利用できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち本発明は、分子量が１０，０００より大である紅藻類の水抽出物又は熱水抽出物を有効成分とし、該水抽出物又は熱水抽出物がガラクタン硫酸であるリン吸収阻害剤、ならびに高リン血症又はリン摂取制限を必要とする、高血圧症、胃癌、脳卒中、腎不全、骨粗鬆症もしくは腎疾患の予防及び治療剤を提供するものである。
【００１３】
あわせて、分子量が１０，０００より大である紅藻類の水抽出物又は熱水抽出物（ただし、λ−カラギーナンを除く）を有効成分とするナトリウムイオン吸収阻害剤、及び食塩過剰摂取に起因する疾患又は食塩摂取制限を必要とする疾患の予防及び治療剤についても記載する。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明に用いられる、分子量が１０，０００より大である紅藻類の水抽出物又は熱水抽出物は、その構造からガラクタン硫酸と考えられる。例えば、フノラン、ポルフィラン、カラギーナン、寒天等が挙げられる。以下、これらの「分子量が１０，０００より大である紅藻類の水抽出物又は熱水抽出物」を単に「紅藻類抽出物」と称することもある。
【００１５】
フノラン(funoran）は、Gloiopelis（フノリ）属のうち、特にフクロフノリ（Gloiopelis furacota）などから得られる粘質多糖類で、アガロースに近い構造をもち、かなりの硫酸基を有する。この多糖類はβ−Ｄ−Ｇａｌと３，６−anhydro−Ｌ−Ｇａｌが交互に連結する構造をもち、前者は１−３結合をし、この６位が硫酸化またはＯ−メチル化されている。後者は１−４結合であり、この２位が部分的に硫酸化またはＯ−メチル化されている。
【００１６】
ポルフィランは、アマノリ(Porphyra)属やウシゲノリ(Bongia）属のうち、特にアサクサノリ（Porphyra tenera）から抽出される多糖類である。基本的には、アガロースに似ているが、より複雑な構造をもつ。即ち、構成糖としてＤ−Ｇａｌ、６−Ｏ−メチル−Ｄ−Ｇａｌ、３，６−anhydro−Ｌ−Ｇａｌ、Ｌ−Ｇａｌ−６−硫酸などからなり、アガロースと同様に、β−（１→４）とα−（１→３）で交互に結合している。
【００１７】
カラギーナン（carrageenan)は、ツノマタ属やスギノリ属などの紅藻〔例えば、スギノリ目(Gigartinaceae) に属するChondrus crispus(irish moss), Gigartina stellata,G.acicularis, G.pistillata, G.radula,あるいは、Fursellaria, Hypnea,Euchema 種等〕から得られる粘着性多糖類であり、ゼリー化剤、化粧品などの安定剤や分散剤などとして広く用いられている。そのうち、熱水抽出液から塩化カリウムでゲル状に沈殿する成分がカッパカラギーナン（κ−カラギーナン）、沈殿しない上澄画分（塩化カリウム溶液に可溶な成分）がλ−カラギーナンであり、本発明におけるリン吸収阻害剤及びそれを含む治療剤及び食品では、λ−カラギーナンが好ましく用いられる。
【００１８】
λ−カラギーナンは、κ−分画に見られるような３，６−アンヒドロ誘導体の存在がなく、構成単糖Ｄ−Ｇａｌを主とするガラクタン硫酸、特にβ−（１→４）とα−（１→３）結合で交互に結合したガラクタン硫酸である。λ−カラギーナンは市販もされており、容易に入手できる。
【００１９】
寒天(agar）は、テングサ属、オゴノリ属、エゴノリ属など諸種紅藻類より抽出される。構造的には、アガロースとアガロペクチンの２種に大別され、アガロースはＤ−ガラクトース（Ｄ−Ｇａｌ）、３，６−anhydro−Ｌ−Ｇａｌがβ（１→４）とα（１→３）結合で交互に反復結合した直鎖構造をもつ。一方、アガロペクチンは基本的にはアガロースと同様の構造をもつと考えられるが、硫酸基、Ｄ−グルクロン酸またはピルビン酸残基を含む酸性多糖である。
【００２０】
本発明では、上記分子量が１０，０００より大である紅藻類の水抽出物を用いることが好ましい。この紅藻類の水抽出物は、硫酸基を有し、硫酸基のほとんどがナトリウム塩になっているが、例えばナトリウムをカルシウム等の他の金属に置換したものも良好に使用できる。置換できる金属としては、例えば、アルカリ金属（但しナトリウムイオン吸収阻害剤の場合にはナトリウムを除く）、アルカリ土類金属等の金属を全て用いることができる。中でもカリウム、カルシウム、マグネシウム、鉄が好ましい。
【００２１】
本発明の分子量が１０，０００以上の紅藻類の水抽出物又は熱水抽出物（紅藻類抽出物）は、上記紅藻から水抽出の場合は、例えば室温水〜４０℃、好ましくは室温水〜２５℃の水を用いて３０分〜３時間、好ましくは１時間程度抽出することにより得ることができる。熱水抽出の場合は、例えば４０℃〜１００℃、好ましくは８０℃〜９０℃の熱水を用いて３０分〜３時間、好ましくは１時間程度抽出することにより得ることができる。
【００２２】
水抽出物は主にナトリウム塩となっているが、このナトリウム塩を他の金属塩とする場合は、上記水抽出物又は熱水抽出物を冷却し、塩化カルシウム等の金属ハロゲン化物を投入し、攪拌し、完全に溶解させた後、透析により低分子量物質を除去し、一定時間、通常２時間〜２４時間放置することにより得ることができる。
【００２３】
上記の如くして得られた紅藻類の水抽出物又は熱水抽出物の代わりに市販のポルフィラン、カラギーナン、寒天等の当該紅藻類抽出物相当のものを用いてもよい。
【００２４】
得られた紅藻類抽出物はそのまま使用してもよいが、必要に応じて、アルコール沈殿、イオン交換樹脂クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーなどにより、更に精製して用いてもよい。
【００２５】
得られた紅藻類抽出物の好ましい物性は以下の通りである。
（１）重量平均分子量 １０，０００〜２，０００，０００
（２）中性糖含量 ５８〜９１％
（３）イオウ含量 ４〜１５％
【００２６】
本発明の紅藻類抽出物（λ−カラギーナンを含む）は、リン吸収阻害能を有し、特に経口で服用した場合に消化管中に存在するリンの吸収を阻害し、その排泄を促進する作用を有する。
【００２７】
また、本発明の紅藻類抽出物（ただし、λ−カラギーナンを除く）は、ナトリウムイオン吸収阻害能を有し、特に経口で服用した場合に消化管中でのナトリウムイオンの吸収を阻害し、その排泄を促進する作用を有する。
【００２８】
従って、本発明の上記紅藻類抽出物は、リン吸収阻害剤又はナトリウムイオン吸収阻害剤として有効であり、種々の食品等に含有させることができる。特に、リンや食塩の過剰摂取等に起因する種々の疾患、例えば高血圧症、胃癌、脳卒中、腎不全、骨粗鬆症の患者の食塩制限の緩和を図ることができ、その予防及び治療用の医薬として有用である。また、糞便中に多量にリン又はナトリウムイオンを排泄することから、腎疾患等の腎機能が低下した患者のリン又はナトリウムイオンの排泄に特に有効である。
【００２９】
本発明の紅藻類抽出物を含有するリン吸収阻害剤、ナトリウムイオン吸収阻害剤及び医薬は、上記の方法で得た紅藻類からの水抽出物又は熱水抽出物を通常の方法により各種の形態に加工することで製造できる。例えば固体状物、液状物、乳化状物、ぺ−スト状物等である。
【００３０】
本発明のリン吸収阻害剤及びナトリウムイオン吸収阻害剤は、食品に有効に適用できる。これらのリン吸収阻害剤やナトリウムイオン吸収阻害剤を含有する食品には、そのまま直ちに喫食できるもの、調理等を行って喫食するもの、食品製造用のプレミックスされた材料などのいずれもが含まれる。固体状のものとしては、粉末状、顆粒状、固形状のいずれのものでもよく、例えばビスケット、クッキー、ケーキ、スナック、せんべいなどの各種菓子類、パン、粉末飲料（粉末コーヒー、ココアなど）が含まれる。また液状、乳化状、ペースト状物の例としては、ジュース、炭酸飲料、乳酸菌飲料などの各種飲料が含まれる。
【００３１】
本発明の医薬としては、錠剤、散剤、顆粒、細粒、液剤等が挙げられ、これらの製剤は、本発明の熱水抽出物を薬学的に許容される担体とともに常法に従って製剤化することにより製造できる。
【００３２】
本発明の紅藻類抽出物またはその金属塩は、約１ｇでリン約２０ｍｇを排泄吸収する能力を有する。また、約１０ｇで食塩約１ｇ（ナトリウムイオン約４００mg）を排泄吸収する能力を有する。よって、これを目安とし、上記紅藻類抽出物（フノラン、ポルフィラン、カラギーナン等）又はその金属塩に換算し１日約１０〜５０ｇ程度摂取するのがよい。
【００３３】
【実施例】
以下本発明を更に詳しく説明するために本発明の紅藻類抽出物又はその金属塩並びにそれを含有する医薬品及び食品の製造方法を実施例としてあげ、実施例で得た紅藻類抽出物を用いた試験例をあげるが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３４】
実施例１
（１）フノランの抽出
原藻フノリの例として素干しフノリ（カネリョウ海藻株式会社）を使用した。乾燥フノリ２０ｇを水２０００mlに１〜２時間浸漬し、膨潤させた後、ワーニング・ブレンダーにより細断した。この溶液を９０℃で１時間保持し、熱水抽出処理を行った。溶液を室温まで放冷し、遠心分離（１５０００Ｇ、１０min）により水不溶分（海藻残査）を取り除いた。上澄み液をセルロース製透析チューブに入れて、イオン交換水に対して透析を行った後再び遠心分離（１５０００Ｇ、１０min）し、不溶部を完全に取り除いた。上澄み液を凍結乾燥することで、フノリの熱水抽出物（フノラン）１０ｇを得た。
【００３５】
（２）フノランのカルシウム化
蒸留水５００mlの入った１リットル容ビーカーに上記抽出方法により得たフノリの熱水抽出物２．０ｇを入れ、攪拌子により攪拌し、完全に溶解させた。その後、塩化カルシウム・２水和物（片山化学社製）を１０．０ｇ投入し、攪拌し、完全に溶解させた。この状態で２時間放置することにより、フノリ熱水抽出物のカルシウム化反応は終了した。その後、この溶液中の塩をセルロース透析膜（三共製薬社、径３．５cm）を用いて除去し、凍結乾燥することにより、カルシウム化フノリ熱水抽出物１．９２ｇを得た。
【００３６】
（３）λ−カラギーナンのカルシウム化
蒸留水５００mlの入った１リットル容ビーカーにλ−カラギーナン（ハーキュリーズ・ジャパン社製）２．０ｇを入れ、攪拌子により攪拌し、完全に溶解させた。その後、塩化カルシウム・２水和物（片山化学社製）を１０．０ｇ投入、攪拌し、完全に溶解させた。この状態で２時間放置することにより、カラギーナンのカルシウム化反応は終了した。その後、この溶液中の塩をセルロース透析膜（山共製薬社製、径３．５cm）を用いて除去し、凍結乾燥することにより、カルシウム化カラギーナン１．８５ｇを得た。
【００３７】
上記の熱水抽出フノリ、カルシウム化熱水抽出フノリ、λ−カラギーナン及びカルシウム化λ−カラギーナンにおける官能基のイオン型（mg／kg）を以下に示す。有効にカルシウム化されていることが判る。
【００３８】
【表１】
【００３９】
（４）ポルフィランの抽出
原藻としてクビレオゴノリ（株式会社トロピカルテクノセンター）を使用した。
乾燥クビレオゴノリ２０ｇを水２．０リットルに１〜２時間浸漬し、膨潤させた後、ワーニングブレンダーにより細断した。この溶液を９０℃で１時間保持し、熱水抽出処理を行った。溶液を５０℃に冷却した時点でＮａＯＨ２．０ｇを溶解し、その溶液を３５℃に保持したまま遠心分離（１５０００Ｇ、１０min）し、不溶物（海藻残査）を完全に取り除いた。上澄み液をセルロース製透析チューブに入れて、イオン交換水に対して透析を行った後、再び遠心分離（１５０００Ｇ、１０min）し、不溶物を完全に取り除いた。上澄み液を凍結乾燥することでクビレオゴノリの熱水抽出物（ポルフィラン）５．５ｇを得た。
【００４０】
（５）ポルフィランのカルシウム化
蒸留水５００mlの入った１リットル容ビーカーに上記抽出方法により得たクビレオゴノリの熱水抽出物２．０ｇを入れ、攪拌子により攪拌し、完全に溶解させた。その後、塩化カルシウム・２水和物（片山化学社製）を１０．０ｇ投入し、攪拌し、完全に溶解させた。この状態で２時間放置することにより、クビレオゴノリ熱水抽出物のカルシウム化反応は終了した。その後、この溶液中の塩をセルロース透析膜（三共製薬社、径３．５cm）を用いて除去し、凍結乾燥することにより、カルシウム化オゴノリ熱水抽出物１．９２ｇを得た。
【００４１】
（６）分子量の測定
液体クロマトグラフポンプ（CCCP、(株)東ソー製）、ゲル濾過カラム（TSK gel GM-PWXL、（株）東ソー製）、カラムオーブン（CO-8020、（株）東ソー製）、示差屈折計（RI-410、（株）Waters製）、デガッサ(SD-8022、（株）東ソー製）を使用した。測定温度４０℃、移動相として０．１Ｍ塩化ナトリウム水溶液を使用し、流量０．８ml／分で測定を行った。保持時間を標準ブルランサンプル（（株）昭和電工製）と比較し、クロマトグラフインテグレータ（クロマトコーダー21、（株）東ソー製）を使用し、重量平均分子量を算出した。
この方法で測定した上記の熱水抽出物（フノラン）の重量平均分子量は１０，０００〜２，０００，０００であり、λ−カラギーナンの重量平均分子量は１０，０００〜１，０００，０００であり、熱水抽出物（ポルフィラン）の重量平均分子量は１０，０００〜２，０００，０００であった。
【００４２】
（７）中性糖含量の測定
試薬として（ａ）濃硫酸（試薬特級グレード）、（ｂ）５％のフェノール水溶液（黄色見を呈さない、新しいもの）を使用した。ガラクトース（試薬グレード特級品）を正確にそれぞれ、２０μｇ〜６００μｇ／mlの濃度になるように蒸留水に溶かした。この範囲内から濃度の異なる溶液を５点選んだ。各溶液０．５mlを試験管に取り、上記（ｂ）を０．５ml加え、十分に攪拌した。更に、上記（ａ）を２．５ml加え攪拌し、室温で１５分間放置した後、吸光度分析計で４８０nmの吸光度を測定した。中性糖濃度と４８０nm吸光度の検量線グラフを作成した。続いて、上記の実施例１で得た熱水抽出物（フノラン）、λ−カラギーナン及びオゴノリ熱水抽出物（ポルフィラン）をそれぞれ正確に１５０μｇ秤量し、純水１０mlに溶解した。その溶液０．５mlを試験管に取り、（ｂ）を０．５ml加え、十分に攪拌した。更に、（ａ）を２．５ml加え攪拌し、室温で１５分間放置した後、吸光度分析計で４８０nmの吸光度を測定した。先に作製した検量線から、中性糖濃度を算出した。一方、中性糖含量の測定に用いるサンプルは赤外線水分分析計で含水率を算出し、重量補正を行った上で中性糖含量を分析した。
上記の方法で測定した熱水抽出物（フノラン）、λ−カラギーナン及びオゴノリ熱水抽出物（ポルフィラン）の中性糖含量は５８〜９１％であった。
【００４３】
（８）硫黄含量の測定
実施例１で得た熱水抽出物（フノラン）、λ−カラギーナン及びオゴノリ熱水抽出物（ポルフィラン）中に含まれる硫黄分の分析はサンプルを酸素中で燃焼酸化させ、発生する硫黄酸化物を沈殿滴定法により定量する方法で行った。方法はＪｌＳ Ｋ−０１０３を準用した。硫黄含有量は（硫黄重量／サンプル重量）×１００で定義される。
上記の方法で測定した熱水抽出物（フノラン）、λ−カラギーナン及びオゴノリ熱水抽出物（ポルフィラン）の硫黄含有量は４〜１５％の範囲であった。
【００４４】
実施例２
（細粒剤の製造）
実施例１で得た本発明のフノリ熱水抽出物（フノラン）又はλ−カラギーナン７０重量部、乳糖２０重量部及びトウモロコシデンプン１０重量部の混合物を、ヒドロキシプロピルメチルセルロースの５％水溶液で流動層造粒し、それぞれ細粒剤を得た。
【００４５】
実施例３
（ビスケットの製造）
以下の例中「部」とは重量部を指す。
ショートニング８部と砂糖１８部を混合し、次に薄力小麦粉４２部、実施例１で得た本発明のフノリ熱水抽出物（フノラン）７．５部、べ−キングパウダー０．８部、卵１６部、ブドウ糖１部及び水２５部を加えて攪拌し生地を作る。この生地を５mm厚に圧延して１枚が１６〜１７ｇになるよう型抜きして９０度のオーブンで３２〜３６分焼成する。その結果１枚約１２ｇのビスケットを得た。１２ｇのビスケット中に１ｇのフノリ熱水抽出物（フノラン）を含有する計算となる。すなわち、本ビスケット１枚を食べることで、約４０mgのナトリウムイオン（食塩で約１００mg）を吸着できる。
【００４６】
実施例４
（飲料の製造）
グラニュウ糖１２．５ｇ、クエン酸結晶０．２ｇ及び実施例１で得た本発明のフノリ熱水抽出物（フノラン）１ｇをイオン交換水にて１００mlとし、ビン詰め後、８０度、１０分間殺菌することによりフノリ熱水抽出物（フノラン）入り飲料を得た。
【００４７】
試験例１
（１）調製塩溶液作成方法
小腸液のナトリウム、カリウム、カルシウム濃度はそれぞれナトリウム＝１１９、カリウム＝４．２、カルシウム＝４（ｍＥｑ／Ｌ）である。また、日本人のそれぞれのイオン一日平均摂取量は、ナトリウム＝５０７２、カリウム＝２７００、カルシウム＝５４１（mg）である。一食分の摂取量は３で除すことにより、ナトリウム＝１６９１、カリウム＝９００、カルシウム＝１８０．３（mg）となる。
摂食後の胃、十二指腸内の水分量をそれぞれ０．７５Ｌ、０．５Ｌとすると、それぞれの塩濃度は、ナトリウム＝５８．８、カリウム＝１８．５、カルシウム＝７．２となる。これらの値に上述の小腸液の塩濃度を加えると、最終的な小腸塩溶液濃度は、ナトリウム＝８９、カリウム＝１１．４、カルシウム＝５．６mMとなる。
【００４８】
（２）ナトリウムイオン結合度の測定
上記（１）の調製塩溶液５０mlに濃厚塩酸水数滴を添加し、ｐＨを１．２とした。この溶液にフノリ熱水抽出物（フノラン）あるいはカルシウム化フノリ熱水抽出物１ｇを溶解させた。攪拌下に６０分、室温で放置した。溶液に濃厚水酸化ナトリウム水溶液数滴を添加し、ｐＨを８．０とした。攪拌下に６０分、室温で放置した。その後、イオン交換樹脂をカットオフ分子量５，０００の限外濾過膜で濾別し、濾液中のイオン濃度を原子吸光分析により定量した。
【００４９】
試験例２
カルシウム化フノリ熱水抽出物及びカルシウム化λ−カラギーナンのリン吸収阻害効果を正常ラットを用いて比較検討した。
【００５０】
（１）材料と方法
実験動物は５週齢のウィスター（Ｗistar）系雄性ラット（日本チャールスリバー社）を使用した。市販固形飼料（ＣＲＦ１、オリエンタル酵母（株））にて５日間予備飼育した後、個別代謝ゲージに移し、粉末飼料ＣＲＦ１にて３日間粉餌への馴化を行った。その後、体重を測定し、得られた測定値と予備飼育期間の摂餌量を指標にして３群（ｎ＝５）に群分けした。各群の動物には、セルロース（オリエンタル酵母工業株式会社）、カルシウム化フノリ熱水抽出物及びカルシウム化λ−カラギーナンをそれぞれ含有した試験食を１週間与えた。試験食組成は、カゼイン２０％、αコーンスターチ５９．５％、シュークロース５％、ＡＩＮ−７６ミネラル混合３．５％、ＡＩＮ−７６ビタミン混合１％、大豆油５％（以上オリエンタル酵母工業株式会社）、食塩１％（和光純薬工業株式会社）及び試験物質５％（セルロース、カルシウム化フノリ熱水抽出物又はカルシウム化λ−カラギーナン）とした。
【００５１】
試験食摂取開始の３日目より、２４時間毎に摂餌量の記録と糞と尿の採取を４日間行った。得られた資料は重量を測定した後、リン（尿：モリブデン法、糞：酵素法）の測定に供した。
得られた測定値は、分散分析後、Tukey-Kramer法を用いて有意差の検定を行い、有意水準はｐ＜０．０１とした。
【００５２】
（２）結果
各試験薬剤群の一日当たりのリン出納と一日当たりの摂取リンに対する体内へ吸収されたリンの割合（以下吸収率）を測定した。
摂取リン量は、各群同値レベルにあった。糞便へのリン排泄量は、カルシウム化フノリ熱水抽出物群で４５．１ｍｇ／ｄａｙ、カルシウム化λ−カラギーナン群で４８．４ｍｇ／ｄａｙであり、セルロース群の２７．４ｍｇ／ｄａｙに比し、有意に高値であった。尿中へのリン排泄量は、セルロース群の３４．２ｍｇ／ｄａｙに対し、カルシウム化フノリ熱水抽出物群は２４．１ｍｇ／ｄａｙ及びカルシウム化λ−カラギーナン群は２０．１ｍｇ／ｄａｙであり、明らかに低値であった。
【００５３】
リンの体内への吸収率は、カルシウム化フノリ熱水抽出物群で平均６２％、カルシウム化λ−カラギーナン群で６０％あり、それぞれセルロース群の平均７７％に比し、有意に低値を示した。
また、体内への保持リン量はカルシウム化フノリ熱水抽出物群及びカルシウム化λ−カラギーナン群は同レベルにあった。
【００５４】
このように、カルシウム化フノリ熱水抽出物群又はカルシウム化λ−カラギーナンを経口摂取することによって、飼料中のリンの体内への吸収が阻害されることが示された。
【００５５】
試験例３
試験例１での実験結果（in vitro）で高いナトリウム吸着能が認められた、カルシウム化フノリ熱水抽出物のナトリウム吸収阻害効果を正常ラットを用いて比較検討した。
【００５６】
（１）材料と方法
上記試験例２において、カルシウム化フノリ熱水抽出物を試験物質として用いた場合と全く同様にして、試験食を摂取させ、試験薬剤含有飼料摂取開始３日目より、２４時間毎に４日間糞及び尿を採取し重量を測定した後、ナトリウムの測定に供した（尿：イオン電極法、糞：原子吸光法）。
各群の測定値は、分散分析後、Tukey-Kramer法を用いて検定し、ｐ＜０．０１を有意差とした。
【００５７】
（２）結果
各試験薬剤群の一日当たりのナトリウム出納と一日当たりの摂取ナトリウムに対する体内へ吸収されたナトリウムの割合（以下吸収率）を測定した。
摂取ナトリウム量では各群間に有意な差は認められなかったが、糞便中ナトリウム排泄量は、カルシウム化フノリ熱水抽出物群で２４．１ｍｇ／ｄａｙであり、セルロース群の０．４ｍｇ／ｄａｙに比べて有意に高値を示した。尿中へのナトリウム排泄量は、セルロース群の８９．７ｍｇ／ｄａｙに対し、カルシウム化フノリ熱水抽出物群では６６．９ｍｇ／ｄａｙであり、有意に低値であった。
【００５８】
ナトリウムの体内への吸収率は、カルシウム化フノリ熱水抽出物群で平均８０％であり、セルロース群の平均１００％に比し、有意に低値を示した。
また、体内保持ナトリウム量では各群間に差はみられず、いずれも群の体内へのナトリウム貯留は同程度であった。
【００５９】
このように、カルシウム化フノリ熱水抽出物群を経口摂取することによって、飼料中のナトリウムの体内への吸収が阻害されることが示された。
【００６０】
試験例４
カルシウム化オゴノリ抽出物のナトリウム吸収阻害効果を正常ラットを用いて比較検討した。
【００６１】
（１）材料と方法
実験動物は１２週齢のＷistar系雄性ラット（日本チャールスリバー社）を用いた。動物を、個別代謝ケージ内に移し、３日間セルロース食を用いて制限給餌下（２０ｇ／ｄａｙ／ｒａｔ）に紛餌への馴化を行った。その後、体重を測定し、得られた測定値と予備飼育期間の摂餌量を指標に３群に群分けした（ｎ＝５）。自由飲水下に一夜絶食を行った後、各群の動物には、下記のようにセルロース５％（オリエンタル酵母工業株式会社）、カルシウム化オゴノリ抽出物２％とセルロース３％、又はカルシウム化オゴノリ抽出物５％をそれぞれ含有した試験食を２日間与えた。試験食組成はカゼイン２０％、αコーンスターチ５９．５％、シュークロース５％、ＡＩＮ−７６ミネラル混合３．５％、ＡＩＮ−７６ビタミン混合１％、大豆油５％（以上オリエンタル酵母工業株式会社）、食塩１％（和光純薬工業株式会社）及び試験物質５％（セルロース及び／又はカルシウム化オゴノリ抽出物）とした。試験食摂取開始の２日目には、２４時間の糞の採取を行った。得られた試料は重量を測定した後、ナトリウム（糞：原子吸光法）の測定に供した。
【００６２】
（２）結果
糞便へ排泄されたナトリウム量はカルシウム化オゴノリ抽出物２％及び５％群でそれぞれ１．９９±０．６１ｍｇ（平均値±標準偏差）、７．５１±２．１８ｍｇであり、セルロース群の０．２０±０．１０ｍｇに比べて明らかに高値であった。
【００６３】
（３）まとめ
以上の結果から、カルシウム化オゴノリ抽出物を経口摂取させることによって、飼料中のナトリウムが糞便へ有効に排泄されることが示された。
【００６４】
【発明の効果】
本発明の紅藻類抽出物は、消化管中でのリンやナトリウムイオンの吸収を阻害し、体内への吸収率を低下させるとともに、特に当該リンやナトリウムイオンの糞中への排泄作用に優れているので、これを有効量含有させることにより、優れたリン吸収阻害剤又はナトリウムイオン吸収阻害剤、あるいはリン排泄促進剤又はナトリウムイオン排泄促進剤として、種々の食品等に含有させることができる。
【００６５】
また、これらの紅藻類抽出物を有効量含有させることにより、高リン血症やリン摂取制限を必要とする疾患の予防及び治療剤に、更に食塩過剰摂取に起因する疾患又は食塩摂取制限を必要とする疾患の予防及び治療剤となる。
特に、本発明の紅藻類抽出物は、糞便中へのリンやナトリウム排泄量が高いため、腎不全等の腎機能が低下した患者に極めて有効である。
【発明の属する技術分野】
本発明はリン吸収阻害剤及びナトリウムイオン吸収阻害剤並びにその用途に関し、更に詳しくは過剰摂取等されたリン又はナトリウムイオンの消化管内での吸収を阻害することにより、当該リン又はナトリウムイオンの糞中への排泄を促進させる作用に優れたリン吸収阻害剤及びナトリウムイオン吸収阻害剤並びにその医薬又は食品への利用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
血清リン濃度が５．０mg／dl以上となる場合を高リン血症というが、その原因は、▲１▼細胞からのリン遊出の増加、▲２▼体外からのリン負荷の増加、▲３▼腎からのリン排泄の減少に分けられる。
【０００３】
細胞内の主要な陰イオンであるリンは、細胞崩壊（例えば、悪性腫瘍の化学療法の後の溶血、横紋筋壊死など）により血中にリンを遊離し、高リン血症を生じうる。
また、体外からのリン負荷の過剰時も同様である。高リン血症が存在すると低カルシウム血症も生じるため、リン摂取を増加させることは好ましくないが、リンの多い食物として知られる牛乳などの乳製品や魚肉などの練り製品等は、カルシウム含量も多いため、カルシウム補強の観点から大量に摂取されることとなる。また、ビタミンＤの中毒も腸管からのカルシウムとリンの吸収を増し、高カルシウム血症と高リン血症を生じる。
【０００４】
以上の高リン血症は、二次的に低カルシウム血症を招き、二次的な副甲状腺機能亢進が起こり、骨からカルシウムが動員され骨粗鬆症の誘因になる。
【０００５】
また、腎不全などの腎機能に障害がある場合、例えばＧＦＲが正常の３０％以下になると、血清リン濃度が増加してくる。おまけに腎不全ではビタミンＤの産生が障害されるので、低カルシウム血症を生じ、二次的にＰＴＨの分泌が増すものの、次第にＰＴＨのリン排泄作用が減弱し、ＰＴＨの過剰が目立つだけとなる。更に、副甲状腺機能低下症、偽性副甲状腺機能低下症の場合は、ＰＴＨの作用がないため、高リン血症の原因となる。
【０００６】
一方、厚生省発行の国民栄養調査成績によると昭和５０年以降毎年日本人が１日に摂取した食塩は１１．５ｇ以上であり、特に平成５年は１２．８ｇであった。一方、１日の食塩摂取量と高血圧症の発生率との間には相関関係があることから、高血圧症の発生、ひいては脳卒中等の発生を防止すべく、厚生省では１日の食塩摂取量を１０ｇ以下にするよう推奨している。米国においても、日本同様に１日の食塩摂取量を制限しており、米国合同委員会勧告案は、高血圧症患者の１日の食塩摂取量を６ｇ以下にするよう唱えている。
【０００７】
また、食塩摂取量と胃癌による死亡率との間にも相関関係があるといわれており、食塩摂取量の多い地域例えば富山市、弘前市等では、胃癌による死亡率が高く、反対に食塩摂取量の少ない地域例えば別府市、沖縄市等では、胃癌による死亡率が低いというデータも得られている。
【０００８】
アルギン酸塩などの食物繊維がある程度のナトリウムイオン吸着能を有することが報告されているが（日本家政学会誌Vol.39、No.３、ｐ.187〜195(1988))、その吸着能は未だ十分満足できるものではなかった。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
この様にリンや食塩が体内に過剰に存在すると、人体に悪影響を及ぼすことから、リンや食塩の体内への吸収を有効に阻害し、過剰に存在するリンや食塩を体外へ排泄する新しい技術の開発が待ち望まれている。
【００１０】
従って、本発明の目的は、過剰に存在するリンを積極的且つ安全に体外へ排泄させることのできる、リン吸収阻害剤、及び高リン血症又はリン摂取制限を必要とする疾患の予防及び治療剤を提供することにある。
本発明の他の目的は、過剰摂取した食塩を積極的かつ安全に体外へ排泄させることのできる、ナトリウムイオン吸収阻害剤、及び食塩過剰摂取に起因する疾患又は食塩摂取制限を必要とする疾患の予防及び治療剤を提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
そこで本発明者は広く食品素材中から上記作用を有する成分を見出すべく種々検討した結果、分子量が１０，０００より大である紅藻類の水抽出物又は熱水抽出物がリン吸収阻害能及びナトリウムイオン吸収阻害能に優れており、食品及び医薬として利用できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち本発明は、分子量が１０，０００より大である紅藻類の水抽出物又は熱水抽出物を有効成分とし、該水抽出物又は熱水抽出物がガラクタン硫酸であるリン吸収阻害剤、ならびに高リン血症又はリン摂取制限を必要とする、高血圧症、胃癌、脳卒中、腎不全、骨粗鬆症もしくは腎疾患の予防及び治療剤を提供するものである。
【００１３】
あわせて、分子量が１０，０００より大である紅藻類の水抽出物又は熱水抽出物（ただし、λ−カラギーナンを除く）を有効成分とするナトリウムイオン吸収阻害剤、及び食塩過剰摂取に起因する疾患又は食塩摂取制限を必要とする疾患の予防及び治療剤についても記載する。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明に用いられる、分子量が１０，０００より大である紅藻類の水抽出物又は熱水抽出物は、その構造からガラクタン硫酸と考えられる。例えば、フノラン、ポルフィラン、カラギーナン、寒天等が挙げられる。以下、これらの「分子量が１０，０００より大である紅藻類の水抽出物又は熱水抽出物」を単に「紅藻類抽出物」と称することもある。
【００１５】
フノラン(funoran）は、Gloiopelis（フノリ）属のうち、特にフクロフノリ（Gloiopelis furacota）などから得られる粘質多糖類で、アガロースに近い構造をもち、かなりの硫酸基を有する。この多糖類はβ−Ｄ−Ｇａｌと３，６−anhydro−Ｌ−Ｇａｌが交互に連結する構造をもち、前者は１−３結合をし、この６位が硫酸化またはＯ−メチル化されている。後者は１−４結合であり、この２位が部分的に硫酸化またはＯ−メチル化されている。
【００１６】
ポルフィランは、アマノリ(Porphyra)属やウシゲノリ(Bongia）属のうち、特にアサクサノリ（Porphyra tenera）から抽出される多糖類である。基本的には、アガロースに似ているが、より複雑な構造をもつ。即ち、構成糖としてＤ−Ｇａｌ、６−Ｏ−メチル−Ｄ−Ｇａｌ、３，６−anhydro−Ｌ−Ｇａｌ、Ｌ−Ｇａｌ−６−硫酸などからなり、アガロースと同様に、β−（１→４）とα−（１→３）で交互に結合している。
【００１７】
カラギーナン（carrageenan)は、ツノマタ属やスギノリ属などの紅藻〔例えば、スギノリ目(Gigartinaceae) に属するChondrus crispus(irish moss), Gigartina stellata,G.acicularis, G.pistillata, G.radula,あるいは、Fursellaria, Hypnea,Euchema 種等〕から得られる粘着性多糖類であり、ゼリー化剤、化粧品などの安定剤や分散剤などとして広く用いられている。そのうち、熱水抽出液から塩化カリウムでゲル状に沈殿する成分がカッパカラギーナン（κ−カラギーナン）、沈殿しない上澄画分（塩化カリウム溶液に可溶な成分）がλ−カラギーナンであり、本発明におけるリン吸収阻害剤及びそれを含む治療剤及び食品では、λ−カラギーナンが好ましく用いられる。
【００１８】
λ−カラギーナンは、κ−分画に見られるような３，６−アンヒドロ誘導体の存在がなく、構成単糖Ｄ−Ｇａｌを主とするガラクタン硫酸、特にβ−（１→４）とα−（１→３）結合で交互に結合したガラクタン硫酸である。λ−カラギーナンは市販もされており、容易に入手できる。
【００１９】
寒天(agar）は、テングサ属、オゴノリ属、エゴノリ属など諸種紅藻類より抽出される。構造的には、アガロースとアガロペクチンの２種に大別され、アガロースはＤ−ガラクトース（Ｄ−Ｇａｌ）、３，６−anhydro−Ｌ−Ｇａｌがβ（１→４）とα（１→３）結合で交互に反復結合した直鎖構造をもつ。一方、アガロペクチンは基本的にはアガロースと同様の構造をもつと考えられるが、硫酸基、Ｄ−グルクロン酸またはピルビン酸残基を含む酸性多糖である。
【００２０】
本発明では、上記分子量が１０，０００より大である紅藻類の水抽出物を用いることが好ましい。この紅藻類の水抽出物は、硫酸基を有し、硫酸基のほとんどがナトリウム塩になっているが、例えばナトリウムをカルシウム等の他の金属に置換したものも良好に使用できる。置換できる金属としては、例えば、アルカリ金属（但しナトリウムイオン吸収阻害剤の場合にはナトリウムを除く）、アルカリ土類金属等の金属を全て用いることができる。中でもカリウム、カルシウム、マグネシウム、鉄が好ましい。
【００２１】
本発明の分子量が１０，０００以上の紅藻類の水抽出物又は熱水抽出物（紅藻類抽出物）は、上記紅藻から水抽出の場合は、例えば室温水〜４０℃、好ましくは室温水〜２５℃の水を用いて３０分〜３時間、好ましくは１時間程度抽出することにより得ることができる。熱水抽出の場合は、例えば４０℃〜１００℃、好ましくは８０℃〜９０℃の熱水を用いて３０分〜３時間、好ましくは１時間程度抽出することにより得ることができる。
【００２２】
水抽出物は主にナトリウム塩となっているが、このナトリウム塩を他の金属塩とする場合は、上記水抽出物又は熱水抽出物を冷却し、塩化カルシウム等の金属ハロゲン化物を投入し、攪拌し、完全に溶解させた後、透析により低分子量物質を除去し、一定時間、通常２時間〜２４時間放置することにより得ることができる。
【００２３】
上記の如くして得られた紅藻類の水抽出物又は熱水抽出物の代わりに市販のポルフィラン、カラギーナン、寒天等の当該紅藻類抽出物相当のものを用いてもよい。
【００２４】
得られた紅藻類抽出物はそのまま使用してもよいが、必要に応じて、アルコール沈殿、イオン交換樹脂クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーなどにより、更に精製して用いてもよい。
【００２５】
得られた紅藻類抽出物の好ましい物性は以下の通りである。
（１）重量平均分子量 １０，０００〜２，０００，０００
（２）中性糖含量 ５８〜９１％
（３）イオウ含量 ４〜１５％
【００２６】
本発明の紅藻類抽出物（λ−カラギーナンを含む）は、リン吸収阻害能を有し、特に経口で服用した場合に消化管中に存在するリンの吸収を阻害し、その排泄を促進する作用を有する。
【００２７】
また、本発明の紅藻類抽出物（ただし、λ−カラギーナンを除く）は、ナトリウムイオン吸収阻害能を有し、特に経口で服用した場合に消化管中でのナトリウムイオンの吸収を阻害し、その排泄を促進する作用を有する。
【００２８】
従って、本発明の上記紅藻類抽出物は、リン吸収阻害剤又はナトリウムイオン吸収阻害剤として有効であり、種々の食品等に含有させることができる。特に、リンや食塩の過剰摂取等に起因する種々の疾患、例えば高血圧症、胃癌、脳卒中、腎不全、骨粗鬆症の患者の食塩制限の緩和を図ることができ、その予防及び治療用の医薬として有用である。また、糞便中に多量にリン又はナトリウムイオンを排泄することから、腎疾患等の腎機能が低下した患者のリン又はナトリウムイオンの排泄に特に有効である。
【００２９】
本発明の紅藻類抽出物を含有するリン吸収阻害剤、ナトリウムイオン吸収阻害剤及び医薬は、上記の方法で得た紅藻類からの水抽出物又は熱水抽出物を通常の方法により各種の形態に加工することで製造できる。例えば固体状物、液状物、乳化状物、ぺ−スト状物等である。
【００３０】
本発明のリン吸収阻害剤及びナトリウムイオン吸収阻害剤は、食品に有効に適用できる。これらのリン吸収阻害剤やナトリウムイオン吸収阻害剤を含有する食品には、そのまま直ちに喫食できるもの、調理等を行って喫食するもの、食品製造用のプレミックスされた材料などのいずれもが含まれる。固体状のものとしては、粉末状、顆粒状、固形状のいずれのものでもよく、例えばビスケット、クッキー、ケーキ、スナック、せんべいなどの各種菓子類、パン、粉末飲料（粉末コーヒー、ココアなど）が含まれる。また液状、乳化状、ペースト状物の例としては、ジュース、炭酸飲料、乳酸菌飲料などの各種飲料が含まれる。
【００３１】
本発明の医薬としては、錠剤、散剤、顆粒、細粒、液剤等が挙げられ、これらの製剤は、本発明の熱水抽出物を薬学的に許容される担体とともに常法に従って製剤化することにより製造できる。
【００３２】
本発明の紅藻類抽出物またはその金属塩は、約１ｇでリン約２０ｍｇを排泄吸収する能力を有する。また、約１０ｇで食塩約１ｇ（ナトリウムイオン約４００mg）を排泄吸収する能力を有する。よって、これを目安とし、上記紅藻類抽出物（フノラン、ポルフィラン、カラギーナン等）又はその金属塩に換算し１日約１０〜５０ｇ程度摂取するのがよい。
【００３３】
【実施例】
以下本発明を更に詳しく説明するために本発明の紅藻類抽出物又はその金属塩並びにそれを含有する医薬品及び食品の製造方法を実施例としてあげ、実施例で得た紅藻類抽出物を用いた試験例をあげるが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３４】
実施例１
（１）フノランの抽出
原藻フノリの例として素干しフノリ（カネリョウ海藻株式会社）を使用した。乾燥フノリ２０ｇを水２０００mlに１〜２時間浸漬し、膨潤させた後、ワーニング・ブレンダーにより細断した。この溶液を９０℃で１時間保持し、熱水抽出処理を行った。溶液を室温まで放冷し、遠心分離（１５０００Ｇ、１０min）により水不溶分（海藻残査）を取り除いた。上澄み液をセルロース製透析チューブに入れて、イオン交換水に対して透析を行った後再び遠心分離（１５０００Ｇ、１０min）し、不溶部を完全に取り除いた。上澄み液を凍結乾燥することで、フノリの熱水抽出物（フノラン）１０ｇを得た。
【００３５】
（２）フノランのカルシウム化
蒸留水５００mlの入った１リットル容ビーカーに上記抽出方法により得たフノリの熱水抽出物２．０ｇを入れ、攪拌子により攪拌し、完全に溶解させた。その後、塩化カルシウム・２水和物（片山化学社製）を１０．０ｇ投入し、攪拌し、完全に溶解させた。この状態で２時間放置することにより、フノリ熱水抽出物のカルシウム化反応は終了した。その後、この溶液中の塩をセルロース透析膜（三共製薬社、径３．５cm）を用いて除去し、凍結乾燥することにより、カルシウム化フノリ熱水抽出物１．９２ｇを得た。
【００３６】
（３）λ−カラギーナンのカルシウム化
蒸留水５００mlの入った１リットル容ビーカーにλ−カラギーナン（ハーキュリーズ・ジャパン社製）２．０ｇを入れ、攪拌子により攪拌し、完全に溶解させた。その後、塩化カルシウム・２水和物（片山化学社製）を１０．０ｇ投入、攪拌し、完全に溶解させた。この状態で２時間放置することにより、カラギーナンのカルシウム化反応は終了した。その後、この溶液中の塩をセルロース透析膜（山共製薬社製、径３．５cm）を用いて除去し、凍結乾燥することにより、カルシウム化カラギーナン１．８５ｇを得た。
【００３７】
上記の熱水抽出フノリ、カルシウム化熱水抽出フノリ、λ−カラギーナン及びカルシウム化λ−カラギーナンにおける官能基のイオン型（mg／kg）を以下に示す。有効にカルシウム化されていることが判る。
【００３８】
【表１】
（４）ポルフィランの抽出
原藻としてクビレオゴノリ（株式会社トロピカルテクノセンター）を使用した。
乾燥クビレオゴノリ２０ｇを水２．０リットルに１〜２時間浸漬し、膨潤させた後、ワーニングブレンダーにより細断した。この溶液を９０℃で１時間保持し、熱水抽出処理を行った。溶液を５０℃に冷却した時点でＮａＯＨ２．０ｇを溶解し、その溶液を３５℃に保持したまま遠心分離（１５０００Ｇ、１０min）し、不溶物（海藻残査）を完全に取り除いた。上澄み液をセルロース製透析チューブに入れて、イオン交換水に対して透析を行った後、再び遠心分離（１５０００Ｇ、１０min）し、不溶物を完全に取り除いた。上澄み液を凍結乾燥することでクビレオゴノリの熱水抽出物（ポルフィラン）５．５ｇを得た。
【００４０】
（５）ポルフィランのカルシウム化
蒸留水５００mlの入った１リットル容ビーカーに上記抽出方法により得たクビレオゴノリの熱水抽出物２．０ｇを入れ、攪拌子により攪拌し、完全に溶解させた。その後、塩化カルシウム・２水和物（片山化学社製）を１０．０ｇ投入し、攪拌し、完全に溶解させた。この状態で２時間放置することにより、クビレオゴノリ熱水抽出物のカルシウム化反応は終了した。その後、この溶液中の塩をセルロース透析膜（三共製薬社、径３．５cm）を用いて除去し、凍結乾燥することにより、カルシウム化オゴノリ熱水抽出物１．９２ｇを得た。
【００４１】
（６）分子量の測定
液体クロマトグラフポンプ（CCCP、(株)東ソー製）、ゲル濾過カラム（TSK gel GM-PWXL、（株）東ソー製）、カラムオーブン（CO-8020、（株）東ソー製）、示差屈折計（RI-410、（株）Waters製）、デガッサ(SD-8022、（株）東ソー製）を使用した。測定温度４０℃、移動相として０．１Ｍ塩化ナトリウム水溶液を使用し、流量０．８ml／分で測定を行った。保持時間を標準ブルランサンプル（（株）昭和電工製）と比較し、クロマトグラフインテグレータ（クロマトコーダー21、（株）東ソー製）を使用し、重量平均分子量を算出した。
この方法で測定した上記の熱水抽出物（フノラン）の重量平均分子量は１０，０００〜２，０００，０００であり、λ−カラギーナンの重量平均分子量は１０，０００〜１，０００，０００であり、熱水抽出物（ポルフィラン）の重量平均分子量は１０，０００〜２，０００，０００であった。
【００４２】
（７）中性糖含量の測定
試薬として（ａ）濃硫酸（試薬特級グレード）、（ｂ）５％のフェノール水溶液（黄色見を呈さない、新しいもの）を使用した。ガラクトース（試薬グレード特級品）を正確にそれぞれ、２０μｇ〜６００μｇ／mlの濃度になるように蒸留水に溶かした。この範囲内から濃度の異なる溶液を５点選んだ。各溶液０．５mlを試験管に取り、上記（ｂ）を０．５ml加え、十分に攪拌した。更に、上記（ａ）を２．５ml加え攪拌し、室温で１５分間放置した後、吸光度分析計で４８０nmの吸光度を測定した。中性糖濃度と４８０nm吸光度の検量線グラフを作成した。続いて、上記の実施例１で得た熱水抽出物（フノラン）、λ−カラギーナン及びオゴノリ熱水抽出物（ポルフィラン）をそれぞれ正確に１５０μｇ秤量し、純水１０mlに溶解した。その溶液０．５mlを試験管に取り、（ｂ）を０．５ml加え、十分に攪拌した。更に、（ａ）を２．５ml加え攪拌し、室温で１５分間放置した後、吸光度分析計で４８０nmの吸光度を測定した。先に作製した検量線から、中性糖濃度を算出した。一方、中性糖含量の測定に用いるサンプルは赤外線水分分析計で含水率を算出し、重量補正を行った上で中性糖含量を分析した。
上記の方法で測定した熱水抽出物（フノラン）、λ−カラギーナン及びオゴノリ熱水抽出物（ポルフィラン）の中性糖含量は５８〜９１％であった。
【００４３】
（８）硫黄含量の測定
実施例１で得た熱水抽出物（フノラン）、λ−カラギーナン及びオゴノリ熱水抽出物（ポルフィラン）中に含まれる硫黄分の分析はサンプルを酸素中で燃焼酸化させ、発生する硫黄酸化物を沈殿滴定法により定量する方法で行った。方法はＪｌＳ Ｋ−０１０３を準用した。硫黄含有量は（硫黄重量／サンプル重量）×１００で定義される。
上記の方法で測定した熱水抽出物（フノラン）、λ−カラギーナン及びオゴノリ熱水抽出物（ポルフィラン）の硫黄含有量は４〜１５％の範囲であった。
【００４４】
実施例２
（細粒剤の製造）
実施例１で得た本発明のフノリ熱水抽出物（フノラン）又はλ−カラギーナン７０重量部、乳糖２０重量部及びトウモロコシデンプン１０重量部の混合物を、ヒドロキシプロピルメチルセルロースの５％水溶液で流動層造粒し、それぞれ細粒剤を得た。
【００４５】
実施例３
（ビスケットの製造）
以下の例中「部」とは重量部を指す。
ショートニング８部と砂糖１８部を混合し、次に薄力小麦粉４２部、実施例１で得た本発明のフノリ熱水抽出物（フノラン）７．５部、べ−キングパウダー０．８部、卵１６部、ブドウ糖１部及び水２５部を加えて攪拌し生地を作る。この生地を５mm厚に圧延して１枚が１６〜１７ｇになるよう型抜きして９０度のオーブンで３２〜３６分焼成する。その結果１枚約１２ｇのビスケットを得た。１２ｇのビスケット中に１ｇのフノリ熱水抽出物（フノラン）を含有する計算となる。すなわち、本ビスケット１枚を食べることで、約４０mgのナトリウムイオン（食塩で約１００mg）を吸着できる。
【００４６】
実施例４
（飲料の製造）
グラニュウ糖１２．５ｇ、クエン酸結晶０．２ｇ及び実施例１で得た本発明のフノリ熱水抽出物（フノラン）１ｇをイオン交換水にて１００mlとし、ビン詰め後、８０度、１０分間殺菌することによりフノリ熱水抽出物（フノラン）入り飲料を得た。
【００４７】
試験例１
（１）調製塩溶液作成方法
小腸液のナトリウム、カリウム、カルシウム濃度はそれぞれナトリウム＝１１９、カリウム＝４．２、カルシウム＝４（ｍＥｑ／Ｌ）である。また、日本人のそれぞれのイオン一日平均摂取量は、ナトリウム＝５０７２、カリウム＝２７００、カルシウム＝５４１（mg）である。一食分の摂取量は３で除すことにより、ナトリウム＝１６９１、カリウム＝９００、カルシウム＝１８０．３（mg）となる。
摂食後の胃、十二指腸内の水分量をそれぞれ０．７５Ｌ、０．５Ｌとすると、それぞれの塩濃度は、ナトリウム＝５８．８、カリウム＝１８．５、カルシウム＝７．２となる。これらの値に上述の小腸液の塩濃度を加えると、最終的な小腸塩溶液濃度は、ナトリウム＝８９、カリウム＝１１．４、カルシウム＝５．６mMとなる。
【００４８】
（２）ナトリウムイオン結合度の測定
上記（１）の調製塩溶液５０mlに濃厚塩酸水数滴を添加し、ｐＨを１．２とした。この溶液にフノリ熱水抽出物（フノラン）あるいはカルシウム化フノリ熱水抽出物１ｇを溶解させた。攪拌下に６０分、室温で放置した。溶液に濃厚水酸化ナトリウム水溶液数滴を添加し、ｐＨを８．０とした。攪拌下に６０分、室温で放置した。その後、イオン交換樹脂をカットオフ分子量５，０００の限外濾過膜で濾別し、濾液中のイオン濃度を原子吸光分析により定量した。
【００４９】
試験例２
カルシウム化フノリ熱水抽出物及びカルシウム化λ−カラギーナンのリン吸収阻害効果を正常ラットを用いて比較検討した。
【００５０】
（１）材料と方法
実験動物は５週齢のウィスター（Ｗistar）系雄性ラット（日本チャールスリバー社）を使用した。市販固形飼料（ＣＲＦ１、オリエンタル酵母（株））にて５日間予備飼育した後、個別代謝ゲージに移し、粉末飼料ＣＲＦ１にて３日間粉餌への馴化を行った。その後、体重を測定し、得られた測定値と予備飼育期間の摂餌量を指標にして３群（ｎ＝５）に群分けした。各群の動物には、セルロース（オリエンタル酵母工業株式会社）、カルシウム化フノリ熱水抽出物及びカルシウム化λ−カラギーナンをそれぞれ含有した試験食を１週間与えた。試験食組成は、カゼイン２０％、αコーンスターチ５９．５％、シュークロース５％、ＡＩＮ−７６ミネラル混合３．５％、ＡＩＮ−７６ビタミン混合１％、大豆油５％（以上オリエンタル酵母工業株式会社）、食塩１％（和光純薬工業株式会社）及び試験物質５％（セルロース、カルシウム化フノリ熱水抽出物又はカルシウム化λ−カラギーナン）とした。
【００５１】
試験食摂取開始の３日目より、２４時間毎に摂餌量の記録と糞と尿の採取を４日間行った。得られた資料は重量を測定した後、リン（尿：モリブデン法、糞：酵素法）の測定に供した。
得られた測定値は、分散分析後、Tukey-Kramer法を用いて有意差の検定を行い、有意水準はｐ＜０．０１とした。
【００５２】
（２）結果
各試験薬剤群の一日当たりのリン出納と一日当たりの摂取リンに対する体内へ吸収されたリンの割合（以下吸収率）を測定した。
摂取リン量は、各群同値レベルにあった。糞便へのリン排泄量は、カルシウム化フノリ熱水抽出物群で４５．１ｍｇ／ｄａｙ、カルシウム化λ−カラギーナン群で４８．４ｍｇ／ｄａｙであり、セルロース群の２７．４ｍｇ／ｄａｙに比し、有意に高値であった。尿中へのリン排泄量は、セルロース群の３４．２ｍｇ／ｄａｙに対し、カルシウム化フノリ熱水抽出物群は２４．１ｍｇ／ｄａｙ及びカルシウム化λ−カラギーナン群は２０．１ｍｇ／ｄａｙであり、明らかに低値であった。
【００５３】
リンの体内への吸収率は、カルシウム化フノリ熱水抽出物群で平均６２％、カルシウム化λ−カラギーナン群で６０％あり、それぞれセルロース群の平均７７％に比し、有意に低値を示した。
また、体内への保持リン量はカルシウム化フノリ熱水抽出物群及びカルシウム化λ−カラギーナン群は同レベルにあった。
【００５４】
このように、カルシウム化フノリ熱水抽出物群又はカルシウム化λ−カラギーナンを経口摂取することによって、飼料中のリンの体内への吸収が阻害されることが示された。
【００５５】
試験例３
試験例１での実験結果（in vitro）で高いナトリウム吸着能が認められた、カルシウム化フノリ熱水抽出物のナトリウム吸収阻害効果を正常ラットを用いて比較検討した。
【００５６】
（１）材料と方法
上記試験例２において、カルシウム化フノリ熱水抽出物を試験物質として用いた場合と全く同様にして、試験食を摂取させ、試験薬剤含有飼料摂取開始３日目より、２４時間毎に４日間糞及び尿を採取し重量を測定した後、ナトリウムの測定に供した（尿：イオン電極法、糞：原子吸光法）。
各群の測定値は、分散分析後、Tukey-Kramer法を用いて検定し、ｐ＜０．０１を有意差とした。
【００５７】
（２）結果
各試験薬剤群の一日当たりのナトリウム出納と一日当たりの摂取ナトリウムに対する体内へ吸収されたナトリウムの割合（以下吸収率）を測定した。
摂取ナトリウム量では各群間に有意な差は認められなかったが、糞便中ナトリウム排泄量は、カルシウム化フノリ熱水抽出物群で２４．１ｍｇ／ｄａｙであり、セルロース群の０．４ｍｇ／ｄａｙに比べて有意に高値を示した。尿中へのナトリウム排泄量は、セルロース群の８９．７ｍｇ／ｄａｙに対し、カルシウム化フノリ熱水抽出物群では６６．９ｍｇ／ｄａｙであり、有意に低値であった。
【００５８】
ナトリウムの体内への吸収率は、カルシウム化フノリ熱水抽出物群で平均８０％であり、セルロース群の平均１００％に比し、有意に低値を示した。
また、体内保持ナトリウム量では各群間に差はみられず、いずれも群の体内へのナトリウム貯留は同程度であった。
【００５９】
このように、カルシウム化フノリ熱水抽出物群を経口摂取することによって、飼料中のナトリウムの体内への吸収が阻害されることが示された。
【００６０】
試験例４
カルシウム化オゴノリ抽出物のナトリウム吸収阻害効果を正常ラットを用いて比較検討した。
【００６１】
（１）材料と方法
実験動物は１２週齢のＷistar系雄性ラット（日本チャールスリバー社）を用いた。動物を、個別代謝ケージ内に移し、３日間セルロース食を用いて制限給餌下（２０ｇ／ｄａｙ／ｒａｔ）に紛餌への馴化を行った。その後、体重を測定し、得られた測定値と予備飼育期間の摂餌量を指標に３群に群分けした（ｎ＝５）。自由飲水下に一夜絶食を行った後、各群の動物には、下記のようにセルロース５％（オリエンタル酵母工業株式会社）、カルシウム化オゴノリ抽出物２％とセルロース３％、又はカルシウム化オゴノリ抽出物５％をそれぞれ含有した試験食を２日間与えた。試験食組成はカゼイン２０％、αコーンスターチ５９．５％、シュークロース５％、ＡＩＮ−７６ミネラル混合３．５％、ＡＩＮ−７６ビタミン混合１％、大豆油５％（以上オリエンタル酵母工業株式会社）、食塩１％（和光純薬工業株式会社）及び試験物質５％（セルロース及び／又はカルシウム化オゴノリ抽出物）とした。試験食摂取開始の２日目には、２４時間の糞の採取を行った。得られた試料は重量を測定した後、ナトリウム（糞：原子吸光法）の測定に供した。
【００６２】
（２）結果
糞便へ排泄されたナトリウム量はカルシウム化オゴノリ抽出物２％及び５％群でそれぞれ１．９９±０．６１ｍｇ（平均値±標準偏差）、７．５１±２．１８ｍｇであり、セルロース群の０．２０±０．１０ｍｇに比べて明らかに高値であった。
【００６３】
（３）まとめ
以上の結果から、カルシウム化オゴノリ抽出物を経口摂取させることによって、飼料中のナトリウムが糞便へ有効に排泄されることが示された。
【００６４】
【発明の効果】
本発明の紅藻類抽出物は、消化管中でのリンやナトリウムイオンの吸収を阻害し、体内への吸収率を低下させるとともに、特に当該リンやナトリウムイオンの糞中への排泄作用に優れているので、これを有効量含有させることにより、優れたリン吸収阻害剤又はナトリウムイオン吸収阻害剤、あるいはリン排泄促進剤又はナトリウムイオン排泄促進剤として、種々の食品等に含有させることができる。
【００６５】
また、これらの紅藻類抽出物を有効量含有させることにより、高リン血症やリン摂取制限を必要とする疾患の予防及び治療剤に、更に食塩過剰摂取に起因する疾患又は食塩摂取制限を必要とする疾患の予防及び治療剤となる。
特に、本発明の紅藻類抽出物は、糞便中へのリンやナトリウム排泄量が高いため、腎不全等の腎機能が低下した患者に極めて有効である。
Claims (3)
- 分子量が１０，０００より大である紅藻類の水抽出物又は熱水抽出物を有効成分とし、該水抽出物又は熱水抽出物がガラクタン硫酸であることを特徴とするリン吸収阻害剤。
- 紅藻類の水抽出物又は熱水抽出物が、フノラン、カラギーナン又はポルフィランである請求項１記載のリン吸収阻害剤。
- 請求項１又は２記載の紅藻類の水抽出物又は熱水抽出物を有効成分とすることを特徴とする、高リン血症ならびにリン摂取制限を必要とする、高血圧症、胃癌、脳卒中、腎不全、骨粗鬆症又は腎疾患の予防及び治療剤。
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