KR100622275B1 - 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 5 발현의 안티센스 조절 - Google Patents
인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 5 발현의 안티센스 조절 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명의 안티센스 화합물, 조성물 및 방법은 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 5의 발현을 조절함으로써 제공된다. 조성물은 안티센스 화합물, 특히 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 5를 코딩하는 핵산에 표적된 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 5의 발현을 조절하기 위하여, 그리고 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 5의 발현에 관련된 질병의 치료를 위하여 이러한 화합물을 이용한 방법들이 제공된다.
Description
기술 분야
본 발명은 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 5 발현의 조절을 위한 방법과 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로 본 발명은 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 5를 코딩하는 핵산과 특이하게 혼성화할 수 있는 화합물, 특히 올리고뉴클레오티드들에 관한 것이다. 상기 화합물들은 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 5의 발현을 조절하기 위한 것이다.
발명의 배경
인슐린 유사 성장 인자(insulin-like growth factor, 이하 'IGF' 라고 함) 군은 인슐린 유사 성장 인자 타입Ⅰ과 인슐린 유사 성장 인자 타입Ⅱ(이하, 'IGF-Ⅰ' 및 'IGF-Ⅱ' 라고 함)를 포함하는데, 구조적으로 프로-인슐린과 관련되어 있다. 인슐린 유사 성장 인자 군은 체세포의 성장, 세포 증식, 세포 분화를 조절하기 위하여 중요한 미토젠(mitogens)으로서의 작용한다. 이러한 작용은 IGF 수용체와 상호 작용하는 자유 IGF군의 유용성에 의해 결정된다. 하나의 세포 내에서 자유 IGF군의 농도는 IGF의 생성율과 제거율에 의해 조절되며, 또한 그들의 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질(IGFBPs) 및 IGFBP-관련 단백질(IGFBP-rPs)과 상호작용에 의해 조절된다(Wetterau et al., Mol. Genet. Merab., 1999, 68, 161-181).
인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질의 상과(superfamily)는 높은 친화력을 가지고 IGF군에 결합하는 6개의 IGFBPs과 낮은 친화력을 가지고 IGF군에 결합하는 신종형 9개의 IGFBP-관련 단백질들(IGFBP-rPs)의 최근 밝혀진 그룹으로 포함하고 있다. 단백질 분해효소에 의한 IGFBPs의 분할은 또한 자유 IGFs와 IGFBPs의 농도와 작용을 조절한다. IGFBPs은 IGF 작용과 생체 이용도를 조절할 뿐만 아니라, 세포 성장 및 소멸(apoptosis)의 저해와 촉진을 포함하는 IGF-독립적인 작용들을 조절하는 것으로 여겨진다. IGFBPs에 의한 제거의 성장 저해 효과는 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질들이 IGFs와 경쟁적으로 결합하고 IGF 유형Ⅰ과 세포 표면 수용체와의 상호작용을 조절할 때 나타난다(Wetterau et al., Mol. Gent. Metab., 1999, 68, 161-181).
디제너레이트(degenerate) 올리고뉴클레오티드 탐침을 준비하기 위하여, 정제된 쥐 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 5의 아미노 말단 서열을 이용에서(이는 단백질 5 전구체를 결합하는 인슐린 유사 성장 인자 , 단백질 5 결합-IGF, IGFBP5, igfbp-5, 및 IBP5로 알려져 있다), 쥐와 인간 유전자는 각각 쥐 난소와 인간의 태반 cDNA 라이브러리에서 클론된다(Shimasaki et al., J. Biol. Chem., 1999, 266, 10646-10653). 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 5와 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 2에 대한 인간 유전자들은 상동의 쥐 유전자들처럼 물리적으로 연결되어 있는데, 상기 상동의 쥐 유전자들은, 유전자 지도상 2q33-q36에 위치하는 인간 염색체 배열순서를 가진 신터니(synteny) 영역을 쥐 염색체 1에 동일하게 가지고 있음을 알 수 있다(Kou et al., Genomics, 1994, 21, 653-655). 체세포 잡종(hybrids)의 패널을 이용하고, 2q33-q34 위치에 대한 현장 혼성화(in situ hybridization)에서 형광에 의하여 인간 유전자는 염색체 2에 맵핑되었다(Allander et al., J. Biol. Chem., 1994, 269, 10891-10898).
PCT 공개 WO 92/03470 및 WO 92/03471 에서는 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 5를 코딩하는 재조합 DNA 분자와 그 서열, 상기 분자들을 포함하는 미생물들과 세포 라인들 및 단백질과 그에 따른 유도체들에 대한 항체, 정제된 단백질, 그것에서 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 5와 인슐린 유사 성장 인자를 제조하는 방법에 관한 발명이 청구되고 개시되어 있다(Kiefer and Masiarz, 1992; Kiefer et al., 1992).
태아의 조직들은 빠른 성장기간 동안 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 5의 높은 농도를 발현하지만, 성인의 조직에서 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 5의 농도는 다양하다. 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 5는 신장에서 나타나는 주된 IGFBP이며, 이는 연결조직과 뇌 척추액에서 상당한 양으로 발견되고 있다. 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 5의 혈청 농도는 나이가 들면서 감소하는데, 이러한 감소는 사춘기 이후에 시작된다. 나이든 여성에서 나타나는 농도는 10 대들에 비하여 30 %정도에 불과하다(Wetterau et al., Mol. Genet. Merab., 1999, 68, 161-181).
인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 5는 몇 가지 특성을 가지는데 이것은 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 5가 골격에서 IGF 시스템의 핵심 구성성분임을 암시하고 있다. 골격 세포들은 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 5를 다량으로 생산하지만, 이것의 농도는 노화가 진행되는 동안 단백질 분해효소의 활성에 의하여 감소한다. 다른 IGFBPs와 달리, 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 5는 수산화인회석(hydroxyapatite)과 세포질 단백질에 대하여 높고 특성화된 결합 친화력을 가지며, 따라서 이는 골격 내부에서 풍부하게 저장된다. 이것은 골격을 구성하는 성장인자로서 작용하는데, 이는 IGF-Ⅰ에 독립적인 기작을 통하여 골격 구성을 촉진하는 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 5에 대한 특별한 효과일 뿐 다른 IGFBPs에 대한 효과는 아니다. 그것은 단지 상기 IGFBP만이 시험관 내(in vitro)에서 조골세포의 증식을 자극하는 것으로 보이는 것이다. 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 5를 IGF-Ⅰ 넉아웃(knockout) 쥐 머리뼈의 외골막속에 단일 위치로 주입하는 것은 카바리얼(calvarial) 뼈 추출물에서의 알칼라인 인산가수분해효소와 오스테오칼신(osteocalcin) 농도를 증가시켰다. 노화와 관련하여 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 5의 두드러진 감소는 재흡수를 위한 뼈 구성의 결합에 있어서 노화와 관련된 손상에 영향을 미친다(Miyakoshi et al., J. Clin. Invest., 2001, 107, 73-81).
인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 5는 인간 혈청에서 삼성분(ternary) 복합체의 한 구성성분이다. 이 복합체의 다른 두가지 구성성분은 인슐린 유사 성장 인자와 산 불안정성 아단위(acid labile subunit: ALS)로 알려진 당단백질이다. 이 삼성분 복합체의 형성은 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 5의 농도를 안정화시키고 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 5와 IGFs의 순환 저장소를 제공한다고 주장되고 있고, 이곳은 순환과 그것의 생체 이용률을 조절하는 새로운 기작에서의 IGF 전송과 전달의 이전에 인식되지 않은 형태를 의미한다(Twigg and Baxter, J. Biol. Chem., 1998, 273, 6074-6079). 단백질의 기본 카복시-말단부는 ALS 결합에 책임이 있는 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 5에 있어 기본적인 위치이다(Twigg and Baxter, J. Biol. Chem., 1998, 273, 28791-28798).
인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 5에 대항한 특정한 항혈청이 제조되었다. 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 5의 표적 붕괴된 쥐의 조직 뿐만 아니라 배아세포에서도 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 5가 신장, 간, 소화관 내부, 폐의 세막과 간막, 수막, 척색, 근육, 혀와 같은 다양한 조직 내에서 발현됨을 조직화학적으로 확인하기 위하여 사용되었다. mRNA와 단백질 위치(localization)의 차이는 단백질이 분비되고 전송되어짐을 암시한다(van Kleffens et al., Endocrinology, 1999, 140, 5944-5952).
인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 5의 mRNA 농도는 대장염에 걸린 실험용 쥐 세포에서 증가함을 알 수 있다(Zeeh et al., J. Recept. Signal Transdudt. Res., 1998, 18, 265-280).
또한, 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 5는 전립선암의 진행과도 연관되어 있음을 알 수 있고(Miyake et al., Cancer Res., 2000, 60, 3058-3064), 신경계 종양과도 밀접한 관련이 있으며(Wulbrand et al., Eur. J. Clin. Invest., 2000, 30, 729-739), 타모시펜(tamoxifen) 저항 증식을 제거하는데 사용되는 항에스트로겐을 가진 유방암 세포의 치료에 사용된 적도 있음을 알 수 있다.(Huynh et al., Cell Growth differ., 1996, 7, 1501-1506; Parisot et al., Breast Cancer Res. Treat., 1999, 55, 231-242).
인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 5의 활성도 및/또는 발현의 약리적 변형은 질병, 즉 암, 대장염, 뒤센형 근 위축증, 당뇨병, 골다공증, 및 골경화증과 같은 신진대사형 질병들의 진행을 치료목적의 관점에서 적당하게 간섭함을 알 수 있다.
인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질의 저해를 조절하는 안티센스(antisense)는 IGF 신호 전달 경로에서의 미토젠의(mitogenic) 작용을 설명하는 조사용 도구 및 실험용 쥐의 전립선 암 증식에 대한 치료제로서 이용되어져 왔다(Miyake et al., Cancer Res., 2000, 60, 3058-3064).
포스포로티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오티드는 18개의 뉴클레오티드 길이이고 쥐의 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 5 mRNA의 번역 개시 부분에 상보적이며, 이것은 실험용 쥐의 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 5의 발현을 저해하는데 이용되었고, 이것은 일부 삭제된 후 재배열되어 IGF-Ⅰ 활성도를 높이고 안드로젠 독립성에 대한 증식을 촉진한다. 안드로젠-의존성 시오노기 전립선 종양(androgen-dependent Shionogi postate tumors)을 앓고 있는 쥐는 일시적으로 그들의 안드로젠 독립성에 대한 진행이 연기되고 남성 호르몬에 비의존적인 종양으로의 회귀는 이 안티센스 뉴클레오타이드 중합체가 시스템적으로 처리되어졌을 때 저해되어진다(Miyake et al., Cancer Tes., 2000, 60, 3058-3064).
인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 5 cDNA 염기쌍이 약 1.2 킬로 정도 발현 벡터 내에서 말로니 사코마 바이러스(Maloney sacorma virus) 전구체 방향으로 안티센스 내에 클론되었다. 이 구조는 C2 근육모세포에 의한 오토크린(autocrine) 분비에서 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 5의 역할을 조사하는 mRNADP 대한 안티센스 서열 보충물을 생산하는데 사용되어진다. 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 5 안티센스 전사를 발현하는 근육모세포들은 조절 세포들보다 빨리 성숙되고 더욱 광범위하게 분포한다는 점에서 차이점을 나타내며, 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 5는 IGF-촉진 발생을 막는 모델로서 계속 작용한다. 가능한 작용기전은 세포외 기질에서 IGFs의 제거에 참가한다(James et al., J. Cell Biol., 1996, 133, 683-693).
포스포로티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 15개의 뉴클레오티드의 길이로서 시작 코돈을 포위하는 mRNA 위치에 대하여 상보적이며, 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 5의 발현을 저해하는데 사용되어지고 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 5는 뒤센 근육 위축증(DMD) 근육모세포 증식을 낮게 조절하는 IGFs 및/또는 다른 성장인자들을 제거하는 확산 인자로서 작용한다(Melome et al., J, Cell Pysiol., 2000, 185, 143-153).
포스포로티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오티드는 21개의 뉴클레오티드 길이로서 Genbank Accession NM_000599의 뉴클레오티드 813-834에 대하여 상보적이며, 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 5의 발현을 저해하는 두 가지 연구에 사용되었다. 첫 번째 연구에서 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 5의 발현은 항에스트로겐 ICI 182780에 의해 유도되어 지고, 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 5는 MCF-7 유방암 세포들의 증식을 저해하는데 있어서 약제를 도와준다(Huynh et al., Cell Growth Differ., 1996, 7, 1501-1506). 동일한 안티센스 올리고뉴클레오티드는 이후에 비타민 D 유사체 EB1089의 효과를 증명하는데 사용되었는데, 이것은 MCF-7 유방암 세포들의 고사(apoptosis)를 유도하고 증식을 또한 저해하면서, 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 5가 발현되지 않을 때 감소(attenuated)됨을 보여준다(Rozen and Pollak. Int. J. Oncol., 1999, 15, 589-594).
PCT 공개 WO 01/15435 에서는 안티센스 올리고뉴클레오티드 투여에 의하여 인간을 포함한 포유동물들에 있어서 호르몬-조절성 종양들(예컨대, 유방암과 전립선암등)의 치료에 대한 방법이 청구되고 개시되어 있다. 상기 개시된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 뮤린(murine)과 인간 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 5 유전자들을 표적하도록 고안되었다(Gleave, 2001).
최근, 인간의 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 5의 합성을 효과적으로 저해하는 치료제는 알려진 것이 없다. 따라서, 이러한 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 5의 기능을 효과적으로 저해할 수 있는 부가적인 제제에 대한 필요성이 부각되었다.
안티센스 기술은 특정 유전자 생산물들의 발현을 감소시키는 효과적인 수단으로서 등장하였고, 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 5 발현의 조절을 위하여 수많은 치료의, 진단의, 그리고 연구의 응용에 특히 유용한 것으로 입증될 수 있다.
본 발명은 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 5 발현의 조절을 위한 방법과 조성물을 제공한다.
발명의 요약
본 발명은 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 안티센스 올리고뉴클레오티드에 관한 것이며, 이것은 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 5를 코딩하는 핵산을 표적으로 하여, 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 5의 발현을 조절한다. 또한 본 발명은 상기 성분들을 포함하는 제약적 및 그 외 조성물들을 제공한다. 나아가 본 발명은 하나 또는 그 이상의 안티센스 화합물 또는 조성물로 세포 또는 조직을 접촉시키는 것을 포함하는 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 5의 발현을 조절하는 방법을 제공한다. 더 나아가 본 발명은 동물을 치료하는 방법, 보다 구체적으로는 본 발명의 안티센스 화합물 또는 조성물의 하나 또는 그 이상의 치료적으로 또는 예방적으로 효과적인 양을 투여함으로써 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 5의 발현에 관계된 질병을 가지는 것으로 추측되는 인간을 치료하는 방법을 제공한다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 올리고 조성물들, 보다 구체적으로는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 필요로 하는데, 이것은 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 5를 코딩하는 핵산 분자의 기능을 조절하는데 사용되며 보다 궁극적으로는 생산된 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 5의 양을 조절하는데 사용된다. 이것은 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 5를 코딩하는 하나 이상의 핵산으로 특정하게 혼합된 안티센스 조성물을 제공함에 의해 완성된다. 상기에서 언급된 용어인 '표적 핵산' 및 '인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 5를 코딩하는 핵산'은 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 5를 코딩하는 DNA, 그러한 DNA로부터 전사된 RNA 및 그러한 RNA로부터 유도된 cDNA를 모두 포함한다. 표적 핵산을 가진 뉴클레오티드의 특이한 혼성화는 핵산의 일반적 기능을 간섭한다. 특정하게 혼성화된 화합물에 의한 표적 핵산의 기능 변형은 일반적으로 "안티센스"라고 불리운다. DNA의 기능을 복제와 전사를 포함하여 간섭받는다. RNA의 기능은 모든 생리적 기능; (즉, 예컨대 단백질 번역위치로의 RNA의 전위, RNA로부터 단백질의 번역, 하나 이상의 mRNA군으로 RNA의 스프라이싱(splicing) 및 RNA에 이해 활성화되거나 범위가 확장된 촉매적 활성도)을 포함하여 간섭받는다. 표적 핵산에 대한 간섭의 전반적 효과는 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 5의 발현을 조절한다는 것이다. 본 발명과 관련하여 "조절"은 유전자 발현에 있어서 자극을 고무시키거나 저해를 감소시키는 것을 의미한다. 본 발명에서는 저해가 유전자 발현의 바람직한 조절 형식이며, mRNA를 표적으로 하는 것이 바람직하다.
안티센스에 대한 특정 핵산을 표적으로 하는 것이 바람직하다. 본 발명과 관련하여 특정한 핵산에 대한 안티센스 화합물의 "표적화"는 다단계의 반응을 거친다. 그 과정은 대개 조절시키고자 하는 기능을 가진 뉴클레오베이스 서열의 식별단계에서부터 시작된다. 이것은 예컨대, 특정한 질병, 또는 전염성 있는 질병에 감염된 숙주 세포 유전자(또는 유전자로부터 전사된 mRNA) 일 수 있다. 본 발명에서 표적은 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 5를 코딩하는 핵산 분자이다. 표적화 과정은, 원하는 효과(예컨대. 단백질의 검출 또는 발현의 조절)를 발생시키기 위한 안티센스의 상호작용을 위하여 이러한 유전자 내에서의 위치 결정단계를 또한 포함한다. 본 발명과 관련하여서는 유전자 해독 개시 단편을 이루는 번역 개시 또는 종결 코돈을 모두 포함하는 영역이 선택되어진 위치가 된다. 따라서, 종래의 기술에 따라 번역 개시 코돈은 전형적으로 5'-AUG( 5'-ATG인 DNA분자에 대응하여 전사된 mRNA 분자)이고, 번역 개시 코돈은 "AUG코돈", "개시 코돈", 또는 "AUG개시 코돈"으로 명명되어 진다. 소수의 유전자들은 개시 코돈으로서 5'-GUG, 5'-UUG, 5'-AUA, 5'-ACG, 및 5'-CUG를 사용한다. 따라서, 비록 개시 아미노산이 전형적으로 메티오닌(진핵세포 내에서) 또는 포르밀메티오닌(원핵세포 내에서)임에도 불구하고, "번역 개시 코돈" 및 "시작 코돈"은 많은 종류가 포함될 수 있다. 진핵세포와 원핵세포 유전자들은 두 개 이상의 선택적인 시작 코돈을 가진 것으로 알려져 왔는데, 이들 중 어느 것이라도 특정한 세포 유형, 또는 특정한 조건 하에서 번역 개시 코돈으로서 선택적으로 사용될 수 있다. 본 발명과 관련하여, "시작 코돈" 및 "번역 개시 코돈"은 그러한 염기 서열(들)에도 불구하고, 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 5를 코딩하는 유전자로부터 전사된 mRNA 분자의 개시 번역을 시작하는데 사용되는 코돈 또는 코돈들로 명명되어 진다.
종래 기술은 유전자의 번역 종결 코돈(또는 "스탑 코돈")은 세가지 염기 서열, 즉 5'-UAA, 5'-UAG, 및 5'-UGA(DNA 서열인 5'-TAA, 5'-TGA, 5'-TAG에 각각 대응하는) 중 하나를 가지고 있다고 알려져 있다. "시작 코돈 영역" 및 "번역 개시 코돈"이라는 용어는 번역 개시 코돈으로부터 각각의 방향(3' 또는 5')에서 약 25-50개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 유전자 또는 mRNA 중에서 일부분을 의미한다. 이와 유사하게 "스탑 코돈 영역"과 "번역 종결 코돈 영역"이라는 용어는 번역 종결 코돈으로부터 각각의 방향(3' 또는 5')에서 약 25-50개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 유전자 또는 mRNA중에서 일부분을 의미한다.
외래 전사 해독 프레임(ORF) 또는 "코딩 영역"은 종래 번역 개시 코돈과 번역 종결 코돈 사이의 영역을 의미하였는데, 이는 또한 효과적으로 표적화될 수 있는 영역을 의미한다. 다른 표적 영역들은 5'말단에 있는 미번역 영역(5'UTR)을 포함하는데, 이는 종래 번역 개시 코돈으로부터 5'방향에 있는 mRNA의 부분을 의미하였으며, 따라서 이것은 5'캡 위치와 mRNA 번역 개시 코돈 사이에 있는 뉴클레오티드들 또는 유전자에 상보적인 뉴클레오티드들을 포함한다. 또한 다른 표적영역들은 3'말단에 있는 미번역 영역(3'UTR)을 포함하는데, 이는 종래 종결 개시 코돈으로부터 3'방향에 있는 mRNA의 일부분을 의미하였으며, 따라서 이것은 번역 종결 코돈과 mRNA의 3'말단 사이에 있는 뉴클레오티드들 또는 유전자에 상보적인 뉴클레오티드들을 포함한다. mRNA의 5'캡은 5'-5' 3개의 인산염 결합을 매개로 하여mRNA의 5'말단에 있는 대부분의 잔기와 결합한 N7-메틸화된 구아노신 잔기를 포함한다. mRNA 의 5'캡 영역은 캡에 인접한 첫 번째 50개의 뉴클레오티드들과 마찬가지로 5'캡 구조를 포함하는 것으로 간주되고 있다. 5'캡 영역은 또한 표적 선택된 영역이 될 수 있다.
비록 어떤 진핵 세포 mRNA 전사가, "인트론"으로 알려진 영역을 하나 이상 포함하며 직접적으로 번역되는 반면, 대부분의 진핵세포 전사에서는 번역되기 전에 전사로부터 제거되어진다고 알려진 "인트론" 영역을 하나 이상 포함하고 있다. 따라서 "엑손"이라고 알려진 번역된 영역들이 연속적인 mRNA 서열을 형성하기 위하여 함께 스플라이싱 된다. mRNA 스플라이스 위치들, 예컨대, 인트론-엑손 정션(juntion)들은 표적 영역들로 바람직하며, 특히 질병과 관련된 변종 스플라이싱이 일어나는 위치, 또는 질병과 관련된 특별한 mRNA 스플라이싱의 과생산이 일어나는 위치에 유용하게 적용될 수 있다. 재배열과 결손에 기인한 변종 융합 정션(junction)이 또한 바람직한 표적이다. 인트론이 또한 효과적일 수 있음이 밝혀졌고, 따라서 표적된 안티센스 화합물, 예컨대 DNA, 또는 전구체-RNA에 대한 표적 부분이 인트론인 것이 바람직하다.
일단 하나 이상의 표적 위치가 식별되어진 경우, 올리고뉴클레오티드는 표적에 대하여 충분하게 필요한 만큼이 선택되어지는데, 예를 들어 원하는 효과를 달성하기 위하여 충분한 특이성을 가지고 충분하게 잘 혼성화 된다.
본 발명과 관련하여, "혼성화(hybridization)"은 상보적 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 베이스(base) 사이의 수소 결합을 의미하는데, 이것은 왓슨-크릭, 후그스틴, 또는 역전된 후그스틴 수소 결합일 수 있다. 예를 들어, 아데닌과 티민은 필요한 뉴클레오베이스들인데, 이들 베이스 쌍은 수소 결합을 통해 형성된다. 본 발명에 사용된 "상보적(complementary)"은 두 뉴클레오티드들 사이에서 정확하게 염기 쌍을 이루는 수용 능력을 의미한다. 예를 들어, 만약 뉴클레오티드 중에 있는 어떤 위치의 한 뉴클레오티드가 DNA 또는 RNA분자의 동일 위치에 있는 뉴클레오티 드와 수소결합을 할 수 있는 능력을 가진 경우, 그 뉴클레오티드 및 그 DNA 또는 RNA는 다른 위치에 있는 각각에 대하여 상보적인 것으로 간주된다. 그 뉴클레오티드 및 그 DNA 또는 RNA는 각 분자 내에 상보적인 위치의 충분한 양이 서로 수소결합을 할 수 있을 만큼 충분하게 있는 경우 각각 다른 것에 대하여 상보적이다. 따라서, "특이적으로 혼성화 가능한" 및 "상보적인" 의 용어는 안정적이고 특이적인 결합이 뉴클레오티드 및 DNA 또는 RNA표적 사이에서 발생하게 하기 위하여 필요한 상보적 염기쌍의 개수와 정확한 결합정도를 의미한다. 그것은 안티센스 화합물의 염기서열이 그것의 표적핵산으로 특이적으로 혼성화 가능한 염기서열과 100% 상보적일 것을 의미하는 것은 아니다. 안티센스 조성물은 그 표적 DNA 또는 RNA분자에 대한 조성물의 결합이 유용성의 손실을 야기시키기 위하여 표적 DNA 또는 RNA의 일반적 기능을 간섭할 때, 그리고, 특이적 결합을 원하는 상황 하에서, 예컨대, 생체외 실험 또는 치료요법에서 생리적 상황 하이거나 생체 내 실험이 진행되는 상황 하에서, 비-표적 염기서열에 대한 안티센스 조성물의 비-특이적 결합을 피할 수 있을 정도의 상보성의 정도가 충분한 경우에 특이적으로 혼성화될 수 있다.
표적에 혼성화하고 표적의 발현을 저해하는 본 발명의 안티센스와 다른 조성물들은 실험을 통해 식별되어 지고, 이러한 조성물들의 염기서열은 하기에서 발명의 구체적인 예로서 식별되어진다. 선택된 염기서열에 상보적인 표적 위치들은 "활성화 위치"로서 일컬어지고, 따라서 표적화하기 위한 바람직한 위치가 된다. 따라서, 본 발명의 다른 구체화된 모습은 이러한 활성화 위치들에 혼성화된 조성물을 포함한다.
안티센스 조성물은 일반적으로 시약 및 진단을 위한 연구목적으로 사용되어진다. 예를 들어, 특이성을 가지고 유전자의 발현을 저해할 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오티드들은 특정한 유전자들의 기능을 제거하는 일반적 기술의 연구 등에 종종 이용되는 것이다. 또한, 안티센스 조성물은 예를 들어, 생리적 경로를 가진 다양한 개체들의 기능을 구별하는데 이용되어지기도 한다. 따라서, 안티센스 조절은 연구목적을 위해 주로 사용되는 것을 알 수 있다.
연구 및 진단목적을 위한 본 발명인 안티센스 조성물의 사용은 단독으로 사용되거나, 다른 안티센스 조성물이나 치료제 등과 더불어 사용되는데, 이러한 사용은 세포와 조직 내에서 발현되는 유전자들의 전체적인 완성 또는 그 일부분의 발현양상을 제거하기 위한 분석방법의 도구로서 사용되어 진다.
하나 이상의 안티센스 조성물이 처치된 세포 또는 조직 내에서의 발현 양상은 안티센스 조성물이 처치되지 않은 세포 또는 조직과 비교되어지는데, 발현되는 이러한 양상은 그 세포 등이 원래 유지하고 있었던 유전자 발현 양상 예를 들어, 실험된 유전자들의 질병관련, 신호 전달 경로, 세포의 위치, 발현 정도, 크기, 구조, 또는 기능에 있어서 차이점이 있음을 분석할 수 있다. 이러한 분석은 발현 양상에 영향을 미치는 다른 조성물의 존재 또는 부재 속에서 자극되거나 자극되어지지 않은 세포 내에서 진행된다.
종래 기술에서 유전자 발현 분석의 방법에 관한 예들은 DNA 배열 또는 미량 배열을 포함하고 있다(Brazma and Vilo, FEBS Lett., 2000, 480. 17-24; Celis, et al., FEBS Lett., 2000. 480, 2-16), SAGE(serial analysis of gene expression) (Madden, et al., Drug Discov. Today, 2000, 5, 415-425), READS(restriction enzyme amplification of digested cDNAs) (Prashar and Weissman, Methods Enzymol., 1999, 303. 258-72), TOGA (total gene expression analyses) (Sutcliffe, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2000, 97, 1976-81), 단백질 배열과 단백질학(Celis, et al., FEBS Lett., 2000, 480, 2-16; Jungbout, et al., Electrophoresis, 1999, 20, 2100-10), 발현된 태그 배열(EST) 배열(Celis, et al., FEBS Lett., 2000, 480, 2-16; Larsson, et al., J. Biotechnol., 2000, 80, 143-57), 서브트랙티브 RNA 지문법(SuRF) (Fuchs, et al., Anal. Biochem., 2000, 286, 91-98; Larson, et al., Cytometry, 2000, 41, 203-208), 서브트랙티브 클로닝, 디퍼렌셜 디스플레이(DD) (Jurecic and Belmont, Curr. Opin. Microbiol., 2000, 3, 316-21), 상대적 게놈 혼성화(comparative genomic hybridization) (Carulli. et al., J. Cell Biochem. Suppl., 1998, 31, 286-96), FISH(fluorescent in situ hybridization) 기법(Going and Gusterson, Eur. J. Cancer, 1999, 35, 1895-904) 및 질량 분석법(reviewed in (To. Comb. Chem. High Thrughput Screen, 2000, 3, 235-41).
안티센스의 특이성과 민감도는 또한 치료목적의 사용에 대한 기술로서 이용되어진다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 동물과 인간의 질병 상태를 치료하기 위한 치료요법으로서 작용하게 되었다. 리보자임을 포함한 안티센스 올리고뉴클레오티드 시약은 안전하고 효과적으로 인간에게 적용되어 수많은 임상실험이 현재 진행되고 있다. 따라서, 뉴클레오티드가 세포, 조직, 그리고 동물, 특히 인간의 치료 에 대하여 유용한 치료적 조절에 사용될 수 있다는 사실이 확립되었다.
본 발명과 관련하여서, "뉴클레오티드"라는 용어는 RNA 또는 DNA 또는 이와 유사한 것을 의미한다. 이러한 용어는 자연적으로-발생한 뉴클레오베이스, 당 및 공유 상호 뉴클레오티드(주력)간의 연결고리뿐만 아니라 이와 유사한 기능을 가지고 비-자연발생적으로-발생한 부분을 가진 뉴클레오티드를 포함한다. 그러한 변형되고 대체된 뉴클레오티드들은 종종 원상태보다 선호되는데, 이것은 이들이 가진 바람직한 성질, 예컨대, 세포적 활성도의 증가, 핵산 표적에 대한 친화력의 증가, 그리고 핵산 가수분해효소의 존재 하에서의 안정성 때문이다.
안티센스 올리고뉴클레오티드들이 선택된 안티센스 조성물의 바람직한 형태인 반면, 본 발명은 하기에서 설명하는 것과 같은 유사한 뉴클레오티드들을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 본 발명에 따른 안티센스 조성물들은 약 8개에서 50개의 뉴클레오베이스들을 포함하는 것이 바람직하다(예컨대, 약 8개에서 50개의 연결된 뉴클레오시드들). 더욱 바람직한 안티센스 화합물은 안티센스 올리고뉴클레오티드들이고, 특히 바람직하게는 안티센스 화합물들은 약 12개에서 30개의 뉴클레오베이스들을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드이다. 안티센스 화합물은 리보자임, 외부 안내 서열(EGS) 뉴클레오티드(oligozymes), 및 표적 핵산에 대하여 혼성화하고 발현을 조절하는 다른 짧은 촉매성 RNA들 또는 촉매성 뉴클레오티드를 포함한다.
종래 알려진 바에 의하면, 뉴클레오시드는 염기-당의 조합을 의미한다. 뉴클레오시드에서 염기부분은 일반적으로 헤테로 고리식(heterocyclic) 화합물을 의미 한다. 그러한 헤테로 고리식 화합물의 두 가지 대표적인 군들은 퓨린계와 피리미딘계이다. 뉴클레오티드는 뉴클레오시들의 당 부분에 공유 결합된 인산기를 더 포함하는 뉴클레오시드를 의미한다. 펜토퓨라노실 당을 포함하는 뉴클레오시드들에서, 인산기는 당의 2', 3', 또는 5'에 위치한 수산기 중에서 하나와 결합될 수 있다. 뉴클레오티드들의 형성에 있어서, 인산기는 선형 중합성 화합물을 형성하기 위하여 인접한 뉴클레오시드와 공유결합한다. 이러한 선형중합 구조의 각 말단에는 환상의 구조를 형성하기 위하여 더 결합될 수 있다. 그러나, 오픈된 선형의 구조가 일반적으로 바람직하다. 뉴클레오티드 구조에 있어서, 인산기는 일반적으로 뉴클레오티드의 상호 뉴클레오시드 백본(backbone)을 형성하는 것으로서 알려져 있다. RNA와 DNA의 백본 또는 일반적인 결합은 3'과 5'의 포스포디에스테르 결합이다.
이 발명에서 유용한 선택된 안티센스 화합물의 바람직한 특이한 예는 변형된 백본 또는 비자연적인 뉴클레오시드간 결합을 포함하는 뉴클레오티드를 포함한다. 이러한 특이성에서 정의되어진 바처럼, 변형된 백본을 가진 뉴클레오티드는 백본 내에 인 원자를 유지하고 있는 것과 인원자를 가지지 않은 것을 모두 포함한다. 이러한 특이성의 목적은 때때로 종래 기술에서 알려진 바대로, 그들의 뉴클레오시드간 백본 내에 인 원자를 가지지 않은 변형된 뉴클레오티드는 뉴클레오시드로서 또한 간주된다.
바람직한 변형 뉴클레오티드 백본은 예를 들어, 포스포로티오에이트, 키랄 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 아미노알킬포스포트리에스테르, 3'-알킬렌 포스포네이트와 5'-알킬렌포스포네이트와 키랄 포스포네이트를 포함하는 메틸 그리고 알킬 포스포네이트, 포스피네이트, 3'-아미노 포스포아미데이트와 아미노알킬포스포아미데이트를 포함하는 포스포아미데이트, 티아노포스포아미데이트, 티아노알킬포스포네이트, 티아노알킬포스포트리에스테르, 셀레노포스페이트 그리고 노말 3'-5'결합을 가지거나 이와 유사한 2'-5'결합을 가진 보라노포스페이트, 및 하나 이상의 뉴클레오티드간 결합이 3'-3', 5'-5', 2'-2' 결합인 전화된 극성을 가진 것들을 포함한다. 전화된 극성을 가진 선택된 뉴클레오티드 들은 3'- 최대의 뉴클레오티드간 결합, 예컨대, 어배직(abasic) 할 가능성이 있는 단일의 전화된 뉴클레오시드 잔기(뉴클레오베이스는 결손되거나 수산기를 가진다)에서 단일의 3'-3'결합을 포함한다. 다양한 염들, 혼합된 염들, 및 자유산 형태 또한 포함되어 진다.
대표적인 미국 특허는 상기 인을 포함한 결합의 제조방법을 보여주고 있으며, 이는 미국 특허에 한정되는 것은 아니다. 미국 특허: 3,687,808; 4,469,863; 4,476,301; 5,023,243; 5,177,196; 5,188,897; 5,264,423; 5,276,019; 5,278,302; 5,286,717; 5,321,131; 5,399,676; 5,405,939; 5,453,496; 5,455,233; 5,466,677; 5,476,925; 5,519,126; 5,536,821; 5,541,306; 5,550,111; 5,563,253; 5,571,799; 5,587,361; 5,194,599; 5,550,555; 5,527,899; 5,721,218; 5,672,697 및 5,625,050 중에서 어떤 것은 일반적으로 이러한 출원자체에서 가지고 있으며, 또 어떤 것은 다른 참고자료에 의해 병합되기도 한다.
내부에 인 원자를 포함하고 있지 않은 선택된 변형 뉴클레오티드 백본들은 짧은 사슬의 알킬 또는 시클로알킬 뉴클레오시드간 결합, 혼합된 이종의 원자 및 알킬 또는 시클로알킬 뉴클레오시드간 결합, 또는 하나 이상의 짧은 사슬 이종의 원자성 또는 이종의 원형 뉴클레오시드간 결합을 형성하는 백본을 가지고 있다. 이러한 결합들은 다음과 같은 형태의 결합 유형(뉴클레오시드의 당부분으로부터 형성된); 실록산 백본; 설파이드; 설폭사이드 및 설폰 백본; 포름아세틸 및 티오포름아세틸 백본; 리보아세틸 백본; 알켄을 포함하는 백본; 설파메이트 백본; 메틸렌이미노 및 메틸렌하이드라지노 백본; 설포네이트 및 설폰아미드 백본; 아마이드 백본; 및 N, O, S 및 CH₂성분이 혼합된 것들을 가지는 것들을 포함한다.
상기 뉴클레오티드의 제조가 개시된 대표적인 미국 특허는 다음과 같으나, 이러한 범위에 한정되는 것은 아니다. 미국특허: 5,034,506; 5,166,315; 5,185,444; 5,214,134; 5,216,141; 5,235,033; 5,264,562; 5,264,564; 5,405,938; 5,434,257; 5,466,677; 5,470,967; 5,489,677; 5,541,307; 5,561,225; 5,596,086; 5,602,240; 5,610,289; 5,602,240; 5,608,046; 5,610,289; 5,618,704; 5,623,070; 5,663,312; 5,633,360; 5,677,437; 5,792,608; 5,646,269 및 5,677,439 중에서 어떤 것은 일반적으로 상기 출원자체에서 가지고 있으며, 상기 각각은 본 발명에서 참조되었다.
다른 선택된 유사한 뉴클레오티드들은 당과 상보적 결합 모두, 예컨대, 백본, 뉴클레오티드 단위들은 새로운 그룹들로 대체 가능하다. 염기 단위들은 적당한 핵산 표적 화합물과 함께 혼성화를 유지하고 있다. 하나의 그러한 , 즉 우수한 혼성화 성향을 보여주는 유사 뉴클레오티드는 펩타이드 핵산(PNA)으로서 알려져 있다. PNA 화합물에서, 뉴클레오티드의 당-백본은 특정한 아미노에틸글리신 백본에서 아마이드를 포함한 백본으로 대체되어 진다. 뉴클레오베이스들은 여전히 남아있으 며, 백본의 아마이드 비율에서 아자(aza)질소 원자들에 의해 직, 간접적으로 영향을 받는다.
PNA 화합물의 제조방법이 개시된 대표적인 미국 특허는 다음과 같으며, 다만 이러한 특허에만 그 범위가 한정되는 것은 아니다: 5,539,082; 5,714,331; 및 5,719,262, 상기에 있는 각각은 본 발명에서 참조되었다. PNA 화합물에 대한 개시는 Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500.에서 더 발견되어 질 수 있다.
본 발명의 가장 바람직한 구체예는 포스포로티오에이트 백본을 가진 뉴클레오티드와 이종원자 백본을 가진 뉴클레오시드, 및 다음과 같은: -CH₂-NH-O-CH₂-, -CH₂-N(CH₃)-O-CH₂-[ 메틸렌 또는 MMI 백본으로 알려져있다], -CH₂-O-N(CH₃)-CH₂-, -CH₂-N(CH₃)-N(CH₃)-CH₂-, 상기 미국특허 제5,489,677호에서 언급된 -O-N(CH₃)-CH₂-CH₂ [원래의 포스포디에스테르 백본은 -O-P-O-CH₂-로서 나타내어진다.]이다. 특정한 백본을 가진 뉴클레오시드들인데 이는 상기 언급된 미국 특허 제5,602,240호에서 알 수 있다. 그리고 아미드 백본은 상기 언급된 미국 특허 제5,034,506호에서 알 수 있다.
변형된 뉴클레오티드들은 또한 하나 이상의 대체된 당 부분을 포함하고 있다. 선택된 뉴클레오티드들은 2'위치에 다음에 열거하는 작용기 중의 하나를 포함하고 있다: OH; F; O-, S-, 또는 N-알킬기; O-, S-, 또는 O-알킬-O-알킬, 알킬 내에, 알케닐과 알키닐은 C₁에서 C10 알킬 또는 C₂에서 C10 알케닌과 알키닐로 대체되어질 수도 있고 대체되지 않을 수도 있다. 특히 바람직하게는, O[(CH2)nO]mCH3, O(CH2)nOCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2, O(CH2)nONH2, 및 O(CH2)nON[(CH2)nCH3] 이며, 상기 n과 m은 1에서 10사이이다. 다른 선택된 뉴클레오티드는 2'위치에 다음에 열거하는 작용기 중의 하나를 포함한다: C1 에서 C10 사이에 있는 저급 알킬기, 대체된 저급 알킬기, 알케닐기, 알키닐기, 알카릴기, 알라킬기, O-알카릴기, 또는 O-아르알킬, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, 헤테로사이클로알킬, 헤테로사이클로 알카릴, 아미노알킬아미노, 폴리알킬아미노, 차환된 시릴, RNA 제거 그룹, 리포터 그룹, 인터칼레이터(intercalator), 뉴클레오티드의 약물 동력학적 성향을 증가시키는 그룹, 또는 뉴클레오티드의 약력학적 성향을 증가시키는 그룹, 및 이와 유사한 성향을 가지는 다른 대체물. 바람직한 변형물은 2'-메톡시에톡시(2'-O-CH2CH2OCH3, 2'-O-(2-메톡시에틸) 또는 2'-MOE) (Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 468-504) 예컨대, 알콕시알콕시 그룹을 포함한다. 더 나아가 선택된 변형은 2'-디메틸아미노옥시에톡시, 예컨대, O(CH2)ON(CH3)2 그룹, 2'-DMAOE로 알려져 있고 하기 실시예에서 설명되며, 2'-디메틸아미노에톡시에톡시(이 분야에서 디메틸아미노에톡시에틸 또는 2'-DMAEOE로 알려져 있다), 예컨대 2'-O-CH2-O-CH2-N(CH2)2 등을 포함한다.
다른 바람직한 변형은 잠긴 핵산(LANs)를 포함하는데, 이것은 2'-수산화 그룹이 당 고리에 있는 3' 또는 4' 탄소 원자와 결합되어 있으며 따라서 바이사이클릭 당부분을 형성한다. 결합은 완벽하게 메틸렌(-CH2-)n그룹과 2'위치에 있는 산소 원자 및 n값이 1이거나 2인 경우 4'탄소 원자를 연결한다. LNAs와 그것의 제조방법은 국제 공개 WO 98/39352 및 WO 99/14226에서 상세히 개시되고 있다.
다른 바람직한 변형은 2'-메톡시 (2'-O-CH3), 2'-아미노프록폭시 (2'-OCH2CH2CH2NH2) 및 2'-알릴 (2'-CH2-CH=CH2), ,2'-O-알릴 (2'-O-CH2-CH=CH2), 및 2'-플르오르 (2'-F)이다. 2'-변형은 아라비노(arabino) 상승 위치일수도 있고, 리보(ribo) 다운 위치일 수도 있다. 선택된 2'-아라비노 변형은 2'-F이다. 유사한 변형이 또한 뉴클레오티드 상에 있는 다른 위치에서 생성될 수 있으며, 특히 3'말단 뉴클레오티드 또는 2'-5'에 연결된 뉴클레오티드 상의 3' 당 위치 및 5' 말단 뉴클레오티드의 5'위치 븐에서 행해진다. 뉴클레오티드는 또한 펜토프라노실 당의 위치에 있는 사이클로부틸 분자들과 같은 유사당을 가질 수도 있다. 그러한 변형된 당 구조를 포함하는 제조방법에 관해서는 다음에 열거하는 미국 특허에서 대표적으로 개시되어 있으나, 이러한 미국 특허에 한정적인 사항은 아님을 밝혀둔다. 미국 특허: 4,981,957; 5,118,800; 5,319,080; 5,359,044; 5,393,878; 5,446,137; 5,466,786; 5,514,785; 5,519,134; 5,567,811; 5,576,427; 5,591,722; 5,597,909; 5,610,300; 5,627,053; 5,639,873; 5,646,265; 5,658,873; 5,670,633; 5,792,747; 및 5,700, 920. 이들 중 어떤 것은 직접적으로 출원 자체에 일반적으로 그 방법을 가지고 있으며, 상기 각각은 본 발명에서 전체적으로 참조되었다.
뉴클레오티드는 또한 뉴클레오베이스(종종 이것을 단순히 "베이스"라고만 불리기도 한다.) 변형 또는 대체물을 포함한다. 상기에 언급된, "변형되지 않은" 또는 "자연적인" 뉴클레오베이스는 아데닌(A)과 구아닌(G)과 같은 퓨린계 염기를 포함하며, 티민(T), 시토신(C), 과 우라실(U)과 같은 피리미딘계 염기도 포함한다. 변형된 뉴클레오베이스들은 다른 합성되거나 자연상태의 뉴클레오베이스들: 5-메틸시토신(5-me-C), 5-하이드록시 메틸 시토신, 잔틴, 하이포잔틴, 2-아미노아데닌, 6-메틸 및 아데닌과 구아닌의 다른 알킬기 유도체, 2-티오우라실, 2-티오티민과 2-티오시토신, 5-할로우라실과 시토신, 5-프로피닐(-C≡C-CH3) 우라실과 시토신과 피리미딘 염기들의 알키닐기 유도체, 6-아조 우라실, 시토신과 티민, 5-우라실(유사우라실), 4-티오우라실, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-하이드록실 및 다른 8-대체된 아데닌들과 구아닌들, 5-할로 부분적으로 5-브로모, 5-트리플르오로메틸과 다른 5-대체된 우라실과 시토신들, 7-메틸구아닌과 7-메틸아데닌, 2-F-아데닌, 2-아미노-아데닌, 8-아자구아닌과 8-아자아데닌, 7-디아자구아닌과 7-디아자아데닌과 3-디아자구아닌과 3-디아자아데닌을 포함한다. 더 나아가 변형된 뉴클레오베이스들은 트리사이클릭 피리미딘계 염기들: 페녹사신 사이티딘(1H-pyrimido[5,4-b] benzoxazin-2(3H)-one),페녹시아진사이티딘(1H- pyrimido[5,4-b]benzothiazin-2(3H)-one), 9-(2-아미노에톡시)-H-피리미도[5,4-b][1,4]benzoxazin-2(3H)-one을 포함하는 대체된 페녹사진 시티딘과 같은 G-클램프(clamps), 카바졸 시티딘(H-pyrido[4,5-b]indol-2-one), 피리도인돌 시토신(H-pyrido[3', 2' : 4, 5]pyrrolo[2, 3-d]pyrimidin-2-one)을 포함한다. 변형된 뉴클레오베이스들은 또한 다른 사이클로사이클로 대체된 퓨린과 피리미딘계 염기들: 예컨대, 7-디아자-아데닌, 7-디아자구아노신, 2-아미노피리딘과 2-피리돈을 포함한다.더 나아가 뉴클레오베이스는 미국 특허 제3,687,808호에서 개시된 것, The Concise Encyclopedia of Polymer Science And Engineering, page 858-859에서 개시되어 있는 것, Kroschwitz, J. I., ed. John Wiley & Sons, 1990, Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613 및 Sanghvi, Y. S., Chater 15, Antisense Research and Applications, pages 289-302, Crooke, S. T. and Lebleu, B. ed., CRD Press, 1993등의 기록에서 개시되어 있는 것들을 포함한다. 이들 뉴클레오베이스들 중 어떤 것은 발명의 중합에 화합물의 결합 친화력을 증가시키는데 특히 유용하다. 이것은 5-치환된 피리미딘계 염기들, 6-아자피리미딘과 N-2, N-6과 O-6 대체된 퓨린계 염기들: 2-아미노프로필아데닌, 5-프로필우라실 과 5-프로피닐사이토신을 포함한다. 5-메틸시토신 대체물은 0.6-1.2 ℃에서 두 배의 안정성으로 핵산을 증가시킴을 나타낸다. (Sanghvi, Y. S., Crooke, S. T. and Lebleu, Blk eds., Antisense Research and App;ications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278) 그리고 현재 선택된 염기 대체물들은 2'-메톡시에틸 당 변형물과 함께 합성되어 질 때 특히 그러하다.
다른 변형된 뉴클레오베이스들과 마찬가지로 상기에 언급한 변형된 뉴클레오베이스들의 어떤 것들의 제조방법은 다음과 같은 미국 특허에서 상세하게 개시되어 있다. 다만, 하기에 언급한 것에 한정되는 것은 아니다. 미국 특허번호: 3,687,808; 4,845,205; 5,130,302; 5,134,066; 5,175,273; 5,376,066; 5,432,272; 5,457,187; 5,459,255; 5,484,908; 5,502,177; 5,525,711; 5,552,540; 5,587,469; 5,594,121; 5,596,091; 5,614,617; 5,645,985; 5,830,653; 5,763,588; 6,005,096; 및 5,681,941. 이들 중에서 어떤 것들은 일반적으로 출원 자체에 포함되어 있으며, 어떤 것은 미국 특허 제5,750,692호와 같이 보충해서 합성되어 지는 것들도 있다.
본 발명의 또 다른 올리고뉴클레오티드의 변형은 하나 이상의 뉴클레오티드 일부 또는 컨쥬게이트에 대한 화학적 결합에 관여하는데, 이들은 활성도, 세포적 분배 또는 올리고뉴클레오티드의 세포적 흡수을 향상시킨다. 본 발명의 조성물은 첫 번째나 두 번째 수산기와 같은 작용기에 공유 결합된 컨쥬게이트(conjugate) 그룹을 포함할 수 있다. 본 발명의 컨쥬게이트 그룹은 인터컬레이터, 리포터 분자, 폴리아민, 폴리아미드, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리에테르, 올리고머들의 약력적 성질을 증가시키는 그룹, 및 올리고머들의 약동적 성질을 증가시키는 그룹을 포함한다. 전형적인 컨쥬게이트 그룹은 콜레스테롤, 지방, 인지질, 바이오틴, 페나진, 폴레이트, 페난스리딘, 안스라귀논, 아크리딘, 플루오르에세인, 로드아민, 쿠마린, 및 다이를 포함한다. 본 발명과 관련하여 약력적 성질을 증가시키는 그룹은 올리고머들의 흡수를 향상시키고, 쇠퇴에 대한 저항을 증가시키고 그리고/또는 RNA의 특정 염기 서열의 혼성화를 강화시키는 그룹을 포함한다. 본 발명과 관련하여 약동적 성질을 증가시키는 그룹은 올리고머들의 흡수, 분배, 물질대사, 분비작용을 향상시키는 그룹을 포함한다. 대표적인 컨쥬게이트 그룹은 국제 특허 출원 PCT/US92/09196 (1992,10, 23 출원)에서 개시되고 있으며, 다른 참증자료와 함께 개시되고 있다. 컨쥬게이트 부분은 콜레스테롤(Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86 , 6553-6556), 콜릭 산(Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem.:et., 1994, 4, 1053-1060), 티오에테르, 예를 들어, hexyl-S-tritylthiol(Manoharan et al., Ann, N.Y. Acad. Sci., 1992, 660, 306-309; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765-2770), 티오콜레스테롤(Oberhauser et al., aanycik, Acuds Res,m 1992, 20, 533-538), 알리페틱 사슬, 예를 들어, 도데칸디올 또는 언데실 잔기(Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10, 1111-1118; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259, 327-330; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75, 49-54), 인지질, 예를 들어, 디-헥사데실-락-글리세롤(di-hexadecyl-rac-glycerol) 또는 트리에틸-암모늄1(triethyl-ammonium1), 2-디-O-헥사에실-락-글리세로-3-H-포스포네이트(2-di-O-hexadecyl-rac-glycero-3-H-phosphonate) (Maniharan et al., Tetahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654; Shea et al., Nuco. Acids Res., 1990, 18, 3777-3783), 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글라이콜 사슬(Maniharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969-973) , 또는 아다만탄(adamantane) 아세트산(Maniharan et al., Tetahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654), 팔미틸 분자(Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229-237), 또는 옥타데실아민 또는 헥실아미노-카보닐-옥시콜레스테르(hexylamino-carbonyl-oxycholester) 분자(Crooke et al., H. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277, 923-937)와 같은 지질 부분을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 또한 활성화된 약리 물질, 예를 들면: 아스피린, 월파린, 페닐부타존, 이부프로펜, 수프로펜, 펜부펜, 케토프로펜, (S)-(+)-프라노프로펜, 카프로펜, 덴실사코신, 2, 3, 5-트리오도벤조산, 콜로티아자이드, 디아제핀, 인도메티신, 바비투레이트, 세파로 스포린, 설파제, 안티디아베틱, 항균성, 항생물질에 컨쥬게이트될 수 있다. 올리고뉴클레오티드-약제의 컨쥬게이트와 그것의 제조방법은 미국 특허출원 제09/334,130호(1999, 6, 15 출원)에서 상세하게 개시되어 있으며, 이것은 다른 참증자료에 의해 보충되어질 수 있다.
이러한 올리고뉴클레오티드의 컨쥬게이트에 대한 제조방법은 하기에 서술하는 미국 특허에서 알 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 미국 특허번호: 4,828,979; 4,948,882; 5,218,105; 5,525,465; 5,541,313; 5,545,730; 5,552,538; 5,578,717; 5,580,731; 5,580,731; 5,591,584; 5,109,124; 5,118,802; 5,138,045; 5,414,077; 5,486,603; 5,512,439; 5,578,718; 5,608,046; 4,587,044; 4,605,735; 4,667,025; 4,762,779; 4,789,737; 4,824,941; 4,835,263; 4,876,335; 4,904,582; 4,958,013; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,245,022; 5,254,469; 5,258,506; 5,262,563; 5,272,250; 5,292,873; 5,317,098; 5,371,241; 5,391,723; 5,416,203; 5,451,463; 5,510,475; 5,512,667; 5,514,785; 5,565,552; 5,567,810; 5,574,142; 5,585,481; 5,587,371; 5,595,726; 5,597,696; 5,599,923; 5,599,928 및 5,688,941중에서 어떤 것은 일반적으로 발명 자체에 개시되어 있으며, 그 각각은 본 발명에서 참조되었다.
주어진 화합물에 있어서 모든 위치에서 일정한 변형형태를 필요로 하는 것은 아니며, 실제적으로는 상기 언급한 변형 중에서 하나 이상이 뉴클레오티드 내에 있는 단일 뉴클레오시드 또는 단일한 화합물에서 작용되어진다. 본 발명은 또한 키메릭 화합물인 안티센스 화합물을 포함한다. 본 발명과 관련하여 "키메릭(Chimeric)" 안티센스 화합물 또는 "키메라스(chimeras)"는 안티센스 화합물로서, 특히 두 개 이상의 화학적으로 구별되는 영역을 포함하고 있으며, 특히 둘 또는 그 이상의 화학적으로 먼 부위를 포함하는 올리고뉴클레오티드이며, 그 각각은 적어도 하나 이상의 모노머 단위로 이루어지고, 그 모노머는 예를 들면 올리고뉴클레오티드 화합물의 경우에는 하나의 뉴클레오티드이다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 적어도 하나 이상의 영역을 포함하고 있는 바, 이 영역에서 올리고뉴클레오티드는 핵산 가수분해에 대한 저항을 증가하며, 세포 내 흡수를 촉진하고/또는, 표적 핵산에 대한 결합 친화력을 증가시킨다. 올리고뉴클레오티드의 또 다른 영역은 RNA: DNA 또는 RNA: RNA 혼성화를 제거할 수 있는 효소에 대한 기질로서 작용될 수 있다. 예를 들면, RNA 가수분해 효소 H(RNase H)는 RNA: DNA 이중나선에서 RNA 나선을 제거하는 세포 내 핵산가수분해효소이다. 따라서, RNase H의 활성도는 RNA 표적을 제거하고, 그럼으로써, 유전자 발현을 저해하는 올리고뉴클레오티드의 효율성을 증가시키는 결과를 초래한다. 결과적으로 공통적인 결과를 얻을 수 있는데, 이것은 동일한 표적 영역에 대하여 혼성화 된 포스포로티오에이트 디옥시뉴클레오티드 를 사용했을 때 보다 키메릭 올리고뉴클레오티드를 사용했을 때 보다 짧은 올리고뉴클레오티드를 얻을 수 있다는 것이다. RNA 표적의 제거는 겔 전기영동 장치에서 일반적으로 탐지할 수 있으며, 필요한 경우에 있어서 관련된 핵산 혼성화 기술이 공지되어 있다.
본 발명에 있어서 키메릭 안티센스 화합물은 두 가지 이상의 올리고뉴클레오티드, 변형된 올리고뉴클레오티드 및/또는 상기 서술한 올리고뉴클레오티드 유사 물질의 혼합된 형태로 구성되어 있다. 또한 이러한 화합물은 혼성화 또는 갭머(gapmer)에 대한 공지된 기술에서 참조할 수 있다. 이렇게 혼성화 된 구조는 다음에 나열하는 대표적인 미국 특허에서 포함되고 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 또한 아니다. 미국 특허번호: 5,013,830; 5,149,797; 5,220,007; 5,256,775; 5,366,878; 5,403,711; 5,491,133; 5,565,350; 5,623,065; 5,652,355; 5,652,356; 및 5,700,922 중에서 어떤 것은 출원 발명 자체에 일반적으로 그 전체내용이 개시되어 있으며, 그 각각은 본 발명에서 참조되었다.
본 발명에 따라 사용된 안티센스 화합물은 공지된 고형상의 합성방법을 통하여 정해진 순서에 따라 편리하게 만들어 질 수 있다. 이러한 합성을 위한 장치는 Applied Biosystems(Foster City, CA)등에서 상업적으로 판매되어 지고 있다. 이러한 합성을 위한 공지된 다른 방법이 부가적이며, 선택적으로 제공되어 질 수 있다. 또한, 포스포로티오에이트와 알킬레이트 유도체들과 같은 뉴클레오티드를 제조하는 방법 역시 유사한 기술을 사용하는 것으로 공지되어 있다.
본 발명에 따른 안티센스 화합물은 세포 내에서 합성되며, 안티센스 분자의 세포 외 합성을 유도하기 위해 고안된 유전자 벡터 구조나 생물학적 기원의 안티센스 조성물은 포함하지 아니한다. 또한 본 발명의 화합물은 흡수, 분배 및/또는 흡착을 도와주기 위하여 혼합되고, 캡슐화되고, 컨쥬게이트되거나 또는 다른 분자들, 화합물들의 분자 구조 또는 화합물과 연관되며, 화합물의 예로는 리포솜, 표적이 된 분자의 수용체, 구강, 직장, 국부 또는 다른 형태가 있다. 이러한 흡수, 분배 및/또는 흡착을 도와주는 본 발명의 과정에 대해서는 다음에 열거하는 미국특허에 서 개시되어 있으나 이는 대표적인 예에 불과할 뿐 반드시 이에 국한되는 것은 아니다. 미국 특허번호: 5,108,921; 5,354,844; 5,416,016; 5,459,127; 5,521,291; 5,543,158; 5,547,932; 5,583,020; 5,591,721; 4,426,330; 4,534,899; 5,013,556; 5,108,921; 5,213,804; 5,227,170; 5,264,221; 5,356,633; 5,395,619; 5,416,016; 5,417,978; 5,462,854; 5,469,854; 5,512,295; 5,527,528; 5,534,259; 5,543,152; 5,556,948; 5,580,575; 및 5,595,756. 상기의 각각은 본 발명에서 참조되었다.
본 발명의 안티센스 화합물은 제학적으로 수용 가능한 염들과, 에스테르, 또는 그러한 에스테르의 염, 또는 인간을 포함한 동물에 적용할 수 있는 어떤 다른 화합물들을 모두 포함하는데, 이것은 직, 간접적으로 생물학적 활성화된 물질대사산물 또는 그에 따른 잔기를 생산할 수 있는 것을 의미한다. 이러한 물질, 즉 본 발명에 따른 화합물의 약리성을 수용할 수 있는 염들과 전구약제, 및 다른 유사한 물질들에 관하여서도 이미 공지되어 있다.
"프로드러그(prodrug)"라는 용어는 활성화되지 않은 형태로 제공되는 치료제를 의미하는데, 이것은 생체나 세포내에서 세포 내 효소 및/또는 다른 화학적 조건 하에서 활성화된 형태로 바뀌어진다. 특히, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드에서 프로드러그의 의미는 1993, 12, 9 에 출판된 Gosselin et al.에 대한 WO 93/24510 또는 Imbach et al.에 대한 WO 94/26764 및 미국 특허 5,770,713 에 개시된 방법에 따른 SATE [(S-acetyl-2-thioethyl)phosphate] 유도체로서 제공되어 진다.
"제약적으로 수용 가능한"이라는 용어는 본 발명에 따른 화합물의 염이 생리 적으로, 약리성을 수용할 수 있는 염이라는 것을 의미한다. 예를 들면, 원하는 생리적 활성을 유지하면서 원하지 않는 독성 효과는 밖으로 배출하는 그러한 염을 의미하는 것이다.
약리성을 수용할 수 있는 염기 부가 염들은 알카리 또는 알카라인과 같은 금속류 또는 유기 아민과 같은 아민류와 함께 형성된다. 양이온으로 사용되는 금속의 예는 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 등등이다. 바람직한 아민류의 예는 N, N'-디벤질에틸렌디아민, 클로로프로카인, 콜린, 디에탄올아민, 디시클로헥실아민, 에틸렌디아민, N-메닐클루카민, 및 프로카인 (Berge et al., "Pharmaceutical Salts" J. of Pharma Sci., 1997, 66, 1-19)등이다. 상기 산 화합물의 염기 부가 염들은, 재래식 방법으로 염을 생산하기 위하여 필요한 충분한 양의 염기와 자유 산(free acid) 형태와의 접촉에 의해서 생성된다. 자유 산 형태는 산을 가진 염과의 접촉과 재래의 방법에 의한 자유 산의 분리에 의하여 재생산되어질 수 있다. 자유 산 형태는 극성 용매에서의 용해도와 같은 물리적 성질 면에서 그들 각각의 염 형태와 다르지만, 본 발명의 목적을 위한 면에서 볼 때는 동일하다. 상기에서 사용되어진 "제약적 부가 염"은 발명의 조성물의 구성성분 중의 하나인 약리성에 대한 수용능력이 있는 산 형태의 염을 포함한다. 이것은 아민의 유기 또는 무기산 염을 포함한다. 선택된 산 염들은 하이드로클로라이드, 아세테이트, 살리실레이트, 니트레이트, 및 포스페이트이다. 또 다른 바람직한 약리성에 대한 수용능력 있는 염들은 종래 기술에서 알려져 있으며, 다양한 종류의 무기, 유기산: 예를 들면, 무기산의 예로는 하이드로클로릭 에시드, 하이드로브로믹 에시드, 설파릭 에시드, 또는 포스포 릭 에시드; 유기 카르복실릭, 설포닉, 설포 또는 포스포릭 에시드 또는 N-대체된 설파믹 산, 아세트산, 프로피온산, 글리콜리산, 수시닐산, 말레익산, 하이드로말레익산, 메틸말레익산, 퓨마릭산, 말릭산, 타르타릭산, 젖산, 오살릭산, 글루코닉산, 글루카릭산, 글루쿠로닉산, 시트르산, 벤조산, 시나미산, 만데리산, 살리실릭산, 4-아미노살리실릭산, 2-페녹시벤조산, 2-아세톡시벤조산, 엠보니산, 니코틴산, 또는 이소니코틴산; 아미노산들, 자연계에서 단백질의 합성에 참가하는 20개의 알파-아미노산, 예를 들어, 글루탐산, 아스페릭 에시드, 페닐아세틱 에시드, 메탄설포닉 에시드, 에탄설포닉 에시드, 2-하이드록시에탄설포닉 에시드, 에탄-1,2 -디설포닉 에시드, 벤젠설포닉 에시드, 나프탈렌-1,5-디설포닉 에시드, 2-,또는 3-포스포글리세레이트, 글루코스-6-포스페이트, N-사이클로설파믹 에시드(환형태의), 또는 아스코르브산과 같은 다른 산 유기 화합물 기본적인 염들을 포함한다. 조성물의 약리성을 수용할 수 있는 염들은 약리성을 수용할 수 있는 양이온으로 또한 제조되어 질 수 있다. 바람직한 약리성을 수용할 수 있는 양이온들로는 알카린, 알카라인 토금속, 암모니움, 및 4가의 암모니아 양이온 등이 종래 알려져 있다. 카보네이트 또는 하이드젠 카보네이트도 또한 가능하다.
올리고뉴클레오티드에 대하여, 바람직한 약리성을 수용할 수 있는 염들은 (a)나트륨, 칼륨, 암모니움, 마그네슘, 칼슘, 스페르민과 스페르미딘과 같은 폴리아민류 ; (b) 무기산으로 형성된 산 부가 염들, 예를 들면, 인산, 니트르산; (c) 유기산으로 형성된 산 부가 염들, 예를 들면, 아세트산, 옥살산, 타타르산, 숙신산, 말산, 푸마르산, 글루콘산, 시트르산, 말레익산, 아스코르브산, 벤조산, 탄닌 산, 팔미르산, 아르기닌산, 폴리글루탐산, 나프탈렌설폰산, 메탄설폰산, p-톨루엔설폰산, 나프탈렌디설폰산, 폴리갈락투론산, 등등 (d) 염소, 브롬, 요오드와 같은 기본적인 음이온으로부터 형성된 염들을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 안티센스 화합물은 진단, 치료, 예방 및 연구목적의 시약으로서 이용되어 질 수 있다. 질병을 가진 동물, 특히 인간에 대한 치료제로서의 기능은 본 발명에 따른 안티센스 화합물을 투여함에 의하여 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 5의 발현을 조절함으로써 치료되어질 수 있다. 본 발명의 화합물은 바람직하게 약리성을 수용할 수 있는 희석제나 매개물에 효과적인 양의 안티센스 화합물을 첨가함으로써 약리적 조성물로서 이용되어 질 수 있다. 또한, 본 발명에 있어 안티센스 화합물과 그 제조방법의 사용은 감염 등과 종양의 형성을 예방하거나 늦출 수 있는 기능을 할 수 있다.
본 발명에 따른 안티센스 화합물은 연구와 진단 목적으로 사용되어 진다. 왜냐하면, 이러한 화합물 등은 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 5를 코딩하는 핵산에 쉽게 혼성화하기 때문이다. 본 발명에 따라 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 5를 코딩하는 핵산은 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 혼성화는 종래 기술에서 공지된 바에 의한 방법에 의하여 탐지될 수 있다. 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 5의 농도를 탐지하기 위하여 그러한 탐침 수단을 사용한 키트들이 또한 제공되어 질 수 있다.
또한 본 발명은 안티센스 화합물을 포함하는 약리적 조성물과 형태를 포함한다. 본 발명의 약리적 조성물은, 지엽적이나 체계적인 치료가 요구되거나 되어야 하는 부위에 의존하는 수많은 방법으로 투여되어 질 수 있다. 투약은 원칙적으로(시신경과 점막, 질과 직장 전달계를 포함한다) 흡입 또는 분말 또는 에어로졸의 살포에 의하여 (내부기관, 코, 표피, 및 피부에 분부하는 것을 포함한다) 폐 등등에 경구투여 하거나 비경구적으로 투여 가능하다. 비경구적 투여는 정맥주사, 내부기관에 주사, 피하주사, 복강주사, 근육주사, 관장, 주입; 또는 두개골 주사 등등의 투여를 포함한다. 적어도 하나의 2'-O-메톡시에틸 변형물을 가진 올리고뉴클레오티드는 특히 경구 투여에 유용하다고 알려져 있다.
원칙적인 투여에 관한 약리적 조성물과 그 형태는 피부에 붙이는 파스형태, 연고, 로션, 크림, 겔타입, 좌약, 물방울, 스프레이, 액체 및 분말 형태를 포함한다. 전형적인 약제의 전달 매개체인 수용체, 분말 또는 오일리 염기, 농축기 등이 요구된다. 코팅된 콘돔, 장갑 등이 또한 사용된다. 선택된 원칙적인 형태는 지질, 리포좀, 지방산, 지방산 에스테르, 스테로이드, 킬레이트화제, 계면활성화제와 같은 전형적인 전달제로 혼합된 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 선택된 지질과 리포솜들은 중성(디올레오일포스파티딜 DOPC 에탄올아민, 디미리스토일포스파티딜 콜린 DMPC, 디스테레오리포스파티딜 콜린) 인 것도 있으며, 음성(디미리스토일포스파티딜 글리세롤 DMPG), 양성(디올레오일테트라메틸아미노프로필 DOTPA 및 디올오일포스파티딜 에탄올아민 DOTMA)인 것을 모두 포함한다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 리포솜 내에 캡슐화될 수 있을 수 있으며, 특히 양이온화 된 리포솜 내에서 복합체 형태로 있을 수 있다. 선택적으로, 올리고뉴클레오티드는 지질, 특히 양이온화 된 지질과 혼합되어질 수 있다. 선택된 지방산과 에스테르로는 아르키돈산, 올 레산, 에이코산산, 로리산, 카프릴산, 카프리산, 리놀렌산, 리놀산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 디카프레이트, 트리카프레이트, 모놀레인, 디로린, 글리세릴 1-모노카프레이트, 1-도데실아자사이클로헵탄-2-원, 아크릴카르니틴, 아크릴콜린, 또는 C1-10 알킬 에스테르 (예를 들면, 이소프로필미리스테이트 IPM), 모노글리세라이드, 디글리세라이드, 또는 약리성을 수용할 수 있는 염을 들수 있다. 원칙적인 형태에 대한 상세한 사항은 미국 특허출원 제09/315,298호 (1999, 5, 20 출원)에서 개시되어 있으며, 상기의 발명을 참조로 본 발명에 적용할 수 있다.
경구 투여에 대한 조성물과 형태는 분말, 환약, 또는 미세입자, 초미세입자, 현탁액 또는 수용성 용액, 불용성 매개체, 캡슐, 겔타입의 캡슐, 향주머니, 알약, 미니알약의 형태를 모두 포함한다. 농축제, 향 첨가제, 희석제, 현탁제, 확산제용 산 또는 결합제가 바람직하다. 선택된 경구용 형태는 하나 이사의 침투 강화제, 계면활성제와 킬레이트화제의 조합으로 투여되어진다. 선택된 계면활성제는 지방산 및/또는 에스테르 또는 그에 따른 염들, 빌산(bile acid) 및/또는 그에 따른 염들을 포함한다. 선택된 빌산/염들은 케노디옥시콜린산 (CDCA), 우르소디옥시케노디옥시콜린산 (UDCA), 콜린산, 디하이드로콜린산, 디옥시콜린산, 글루콜린산, 글라이콜린산, 글라이코디옥시콜린산, 타로콜린산, 소디움 타로-24, 25-디하이드로-푸시데이트, 소디움 글라이코디하이드로푸시데이트를 포함한다. 선택된 지방산들은 아르키돈산, 언디칸산, 올레산, 로린산, 카프리산, 카프릴산, 에이코산산, 로리산, 카프릴산, 카프리산, 리놀렌산, 리놀산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 디카프 레이트, 트리카프레이트, 모놀레인, 디로린, 글리세릴 1-모노카프레이트, 1-도데실아자사이클로헵탄-2-one, 아크릴카르니틴, 아크릴콜린, 모노글리세라이드, 디글리세라이드, 또는 약리성을 수용할 수 있는 염(예를 들면, 나트륨)을 포함한다. 또한 침투 강화제의 조합으로는 빌산/염들의 조합에 있는 지방산/염들이 선호되어 진다. 특히 바람직한 조합은 로리산의 나트륨염, UDPA 및 키프리산이다. 더 나아가 침투 강화제는 폴리옥시에틸렌-9-로릴 에테르, 폴리옥시에틸렌-20-세틸 에테르를 포함한다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 분사되어 건조된 입자를 포함하거나, 미세 또는 초미세 입자 형태로 혼합된 환약 형태로 하여 경구적으로 전달되어 진다. 시약이 혼합된 올리고뉴클레오티드는 폴리-아미노산; 폴리이민; 폴리아크릴레이트; 폴리알킬아크릴레이트; 폴리오젠탄, 폴리알킬시아노아크릴레이트; 양이온화된 젤라틴, 알부민, 전분, 아크릴레이트, 폴리에틸렌글라이콜 (PEG)와 전분; 폴리알킬시아노아크릴레이트; DEAE-유도된 폴리이민, 폴루란, 셀룰로오즈와 전분들을 포함한다. 특히 선택된 합성 시약은 키토산, N-트리메틸키토산, 포리-L-리신, 폴리히스티딘, 폴리오르니틴, 폴리스페르민, 폴리아민, 폴리비닐피리딘, 폴리티오디에틸아미노-메틸에틸렌 P (TDAE), 폴리아미노스티렌 (예를 들면, p-아미노), 폴리(메틸시아노아크릴레이트), 폴리(에틸시아노아크릴레이트), 폴리(부틸시아노아크릴레이트), 폴리(이소부틸시아노아크릴레이트), 폴리(이소헥실시아노아크릴레이트), DEAE-메타크릴레이트, DEAE-헥실아크릴레이트, DEAE-아클릴아마이드, DEAE-알부민 과 DEAE-덱스트린, 폴리메틸아크릴레이트, 폴리 헥실아크릴레이트, 폴리(D, L-젖산), 폴리(DL- lactic-co-glycolic acid (PLGA), 아르기네이트, 및 폴리에틸렌글라이콜 (PEG))를 포함한다. 올리고뉴클레오티드와 그들의 제조방법에 대한 경구적 투여 형태는 미국 특허출원 제08/886,829호(1997, 6. 1 출원), 제09/108,673호(1998, 6, 1 출원), 제09/256,515호(1999, 2, 23 출원), 제09/082,624호(1998, 5, 21 출원), 제09/315,298호(1999, 5, 20 출원)에 상세히 기재되어 있으며, 상기 각각은 본 발명에서 전체로서 참조되었다.
비경구, 수막강내, 심실내 투여를 위한 조성물들과 제제들은 버퍼, 희석제 및 다른 적절한 첨가제를 함유하는 멸균된 수용액들을 포함할 수 있고, 이들은 침투 향상제, 운반체 화합물 및 다른 제약적으로 수용 가능한 운반체 또는 첨가제들과 같은 것이 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 따른 제약적인 조성물은 용액, 에멀젼, 및 리포좀-함유 제제들을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 상기 조성물들은 다양한 구성성분에서 발생될 수 있고, 이들은 수행된 용액(performed liquids), 자기-에멀젼화하는 고체 및 자기-에멀젼화하는 반고체들을 포함하나 이에 한정되지는 않는다.
본 발명의 제약적 제제들은, 편리하게 단위 투약 형태로 존재할 수도 있고, 제약 산업에서 잘 알려진 통상적인 기술에 따라 준비될 수도 있다. 그러한 기술들은 활성 성분들과 제약적인 운반체 또는 첨가제를 공동으로 하여 만들어내는 단계를 포함한다. 일반적으로 제제들은 활성 인자들을 액체 운반체 또는 미세하게 쪼개진 고체 운반체 또는 둘 다와 공동으로 균일하게 그리고 직접적으로 만들어지고, 그 다음 필수적이라면 생산물의 형체를 만듦으로써 제조된다.
본 발명의 조성물들은 알약, 캡슐, 겔 캡슐, 액체 시럽, 소프트 겔. 좌약, 관장제와 같은 많은 가능한 투약 형태로 제조될 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다. 본 발명의 조성물들은 또한, 수용성, 비수용성 또는 혼합된 용매에서에서 현탁액으로 제조될 수 있다. 수용성 현탁액들은 상기 현탁액의 점성을 증가시키는 물질들을 더 포함할 수 있는데, 예를 들면 소듐 카복시메틸셀룰로스, 솔비톨 및/또는 덱스트란이 있다. 현탁액은 또한 안정제들도 함유할 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서 제약적 조성물들은 포말로서 제제되고 사용될 수 있다. 제약적 포말들은 에멀젼, 마이크로에멀젼, 크림, 젤리 및 리포좀들과 같은 제제들을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 상기 제제들은 기본적으로 그 성질에서 유사하지만, 구성요소와 최종 생산물의 일관성에서는 다양하다. 그러한 조성물들과 제제들의 제조는 제약과 제제의 기술의 당업자에게 일반적으로 알려져 있고, 본 발명의 조성물의 제제에 적용될 수 있다.
에멀젼
본 발명의 조성물들은 에멀젼으로 준비되고 제제될 수 있다. 에멀젼들은 일반적으로 하나의 용액이 반지름이 보통 0.1 ㎛를 초과하는 미세방울의 형태로 다른 용액에 분산되어 있는 이질적 계이다(Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Volumn 1, p. 199; Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Volumn 1, p. 245; Block in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Volumn 2, p. 335; Higuchi et al., in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1985, p. 301). 에멀젼들은 종종 두 개의 혼합할 수 없는 액체 상들이 직접적으로 혼합되고 분산되어 구성되는 이상성 계이다. 일반적으로, 에멀젼들은 water-in-oil(w/o) 또는 oil-in-water(o/w) 일 수 있다. 수용성 상이 벌크 오일 상에 정교하게 분리되고 미세한 방울들로 분산될 때, 그 결과 조성물은 water-in-oil(w/o) 에멀젼으로 불린다. 선택적으로, 기름상이 최종적으로 배분되고 미세한 벌크 수용상으로서 분산될 때, 결과적인 조성물은 물 속에 있는 오일 에멀젼으로 불리운다. 에멀젼은 분산된 상에 부가된 구성성분과 수용상, 기름상에 있는 용액 또는 분리된 상으로서 그 자체로 나타나는 활성화된 약제을 함유할 수 있다. 유화제, 안정화제, 염료, 및 항 산화제와 같은 제약적 첨가제가 또한 에멀젼에서 필요할 수 있다. 제약적 에멀젼은 oil-in-water-in-oil (o/w/o) 와 water-in-oil-in-water (w/o/w) 에멀젼의 경우 등에 있어서 많은 요소로 이루어진 에멀젼일 수 있다. 그러한 복합 제제는 종종 단순한 이원적 에멀젼이 가지지 못한 이점을 제공한다. 많은 요소로 이루어진 에멀젼에서는 o/w 에멀젼상에서 개개의 기름 방울이 w/o/w를 구성하는 작은 물방울로 캡슐화된다. 기름 연속상에서 안정화된 물 소구체에 둘러싸인 기름 방울체계는 o/w/o 에멀젼이다.
에멀젼은 어떠한 열역학적 안정성에 의해서 특성화되지 않는다. 종종 분산되거나 불연속적인 에멀젼의 상은 유화제와 성분의 점성도를 이용하여 외부로 잘 분산되거나 연속적인 상으로 되며, 이러한 형태를 유지한다. 에멀젼의 상은 에멀젼 형태의 연고 기재와 크림의 경우에, 반고체 또는 고체일 수 있다. 에멀젼을 안정화시키는 다른 수단은 에멀젼의 상을 결속시키는 유화제의 사용을 들 수 있다. 유화제는 넓게 4가지 카테고리로 분류되어진다: 합성 계면활성제, 자연적으로 발생한 유화제, 흡수 염기, 및 분산된 고체 (Idson in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marc다 Dekker, Inc., New York, N. Y., volume 1, p. 199).
합성 계면활성제는, 또한 표면 활성제로서 알려져 있는데, 이것은 에멀젼의 형성에 넓게 적용됨이 많은 문헌을 통해 알 수 있다. (Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Ridger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N. Y., volume 1, p. 285; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, volume 1, p. 199). 계면활성제들은 일반적으로 친수성과 소수성 부분을 포함하는 양친성이다. 계면활성제의 소수성 성질에 대한 친수성의 비율은 친수성/친유성 균형(HLB)으로 불리어지고, 제조법의 작성에서 계면활성제를 분류하고 선택하는데 있어서 중요한 수단이 된다. 계면활성제는 친수성 그룹의 성질에 기초하여 다른 등급으로 분류된다: 비이온, 음이온, 양이온 및 양쪽성(Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Volume 1, p. 285).
에멀젼에 사용되는 자연적으로 발생하는 유화제는 라놀린, 밀랍, 인지질, 레시틴 및 아라비아고무를 포함한다. 흡수기제는 친수성 특징을 가지므로 물을 흡수 하여 반고체 경도를 유지하는 w/o 에멀젼, 예를 들면 무수성 라놀린과 친수성 페트롤레이텀과 같은 에멀젼을 형성한다. 미세하게 분할된 고체는 또한 계면활성제와의 혼합에서, 그리고 점성의 제조에서 특히 고급 유화제로 사용되었다. 이러한 것들은 중금속 수산화물, 벤토나이트 같은 넌스웰링(nonswelling) 점토, 어타풀자이트, 헥토리트, 카올린, 몬트모릴로나이트, 콜로이드성 알루미늄 실리케이느 및 콜로이드성 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 색소 및 비극성 고체(탄소 또는 글리세릴 트리스테아레이트 같은)와 같은 극성 무기 고체를 포함한다.
많은 양의 비-유화성 금속은 에멀젼 제조에 포함되고 에멀젼의 특성에 기여한다. 이러한 것들은 유지, 기름, 왁스, 지방산, 지방성 알콜, 지방성 에스테르, 휴멕턴트, 친수성 콜로이드, 방부제 및 항산화제를 포함한다(Block, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker(Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199).
친수성 콜로이드 또는 수성 콜로이드는 자연적으로 발생하는 고무질(gum)과 다당류(예를 들면, 아라비아고무, 아가, 알긴산, 카라기닌, 구아 검(guar gum), 카라야 검, 및 트래거캔스 고무)와 같은 합성 폴리머, 셀룰로오스 유도체(예를 들면, 카복시메틸셀룰로오스 및 카복시프로필셀룰로오스), 및 합성 폴리머(예를 들면, 카보머, 셀룰로오스 에테르, 및 카복시비닐 폴리머)를 포함한다. 이러한 것들은 물에서 분산하거나 또는 팽창하여 분산된 상 방울 주위로 강한 계면 막을 형성함으로써, 그리고 외부 막의 점성을 증가시킴으로써 에멀젼을 안정화시키는 콜로이드성 용액을 형성한다.
에멀젼은 미생물의 성장을 유지할 수 있는 탄수화물, 단백질, 스테롤 및 인지질과 같은 많은 성분들을 함유하기 때문에, 이의 제조법들은 방부제를 포함시킨다. 에멀젼 제조에 일반적으로 사용되는 방부제는 메틸 파라벤, 프로필 파라벤, 4기 암모늄 염, 벤잘코늄 클로라이드, p-하이드록시벤조익 산 및 붕산을 포함한다. 항산화제는 또한 제제(formulation)의 악화를 방지하기 위하여 에멀젼 제조에 일반적으로 첨가된다. 사용되는 항산화제는 토코페롤, 알킬 갈레이트, 부틸화하이드록시아니솔, 부틸화하이드록시톨루엔, 또는 아스코르브산과 소듐 메타미설피트, 그리고 시트릭 산, 타타릭산, 환원제(렉시틴과 같은 항산화 시너지스트(synergist)와 같은)와 같은 자유 라디칼 스캐빈져이다.
피부의, 구강의 그리고 비경구적인 경로에 의하는 에멀젼 제조의 적용과 그들의 제조를 위한 방법은 문헌(Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199)에서 검토되었다. 구강 전달을 위한 에멀젼 제조법은 제조가 용이하다는 이유, 흡수의 용이함, 및 생체 이용률 견지에서 매우 널리 사용된다(Rosoff, in Pharmaceutical /Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, P. 245; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New Yokr, N.Y., volume 1, p. 199). 미네랄-오일 기재 완하제, 지용성 비타민과 고지방 영양의 조제물(preparations)은 일반적으로 o/w 에멀젼으로서 구강으로 투여되는 물질 중에 있다.
본 발명의 하나의 구체예에서는 올리고뉴클레오티드와 핵산의 조성물은 마이크로에멀젼으로 제조된다. 마이크로에멀젼은 물, 기름 및 하나의 광학적 등방성이고, 열역학적으로 안정한 액체 용액인 양쪽성 계로서 정의될 수 있다(Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker. Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245). 일반적으로 마이크로에멀젼은 먼저 수성 계면활성액에 기름을 분산시키고, 보통 투명계(transparent system)를 형성하기 위한 중간 사슬 길이 알콜인 네 번째 구성성분의 충분량을 첨가함으로써 제조된다. 따라서, 마이크로에멀젼은 또한 표면 활성 분자의 계면 막에 의해 안정화된 두 혼합할 수 없는 액체의 열역학적으로 안정하고 등방성적으로(isotropically) 분명한 분산으로 묘사되었다(Leung and Shah, in: Controlled Release of Drugs: Polymers and Aggregate Systems, Rosoff, M., Ed., 1989, VCH Publishers, New York, pages 185-215). 마이크로에멀젼은 일반적으로 기름, 물, 계면활성제, 공계면활성제 및 전해질을 포함하는 3 내지 5개의 구성성분의 혼합을 통하여 제조된다. 마이크로에멀젼이 w/o 또는 o/w 인 것은 사용되는 기름과 계면활성제의 특성과, 극성 헤드의 구조와 기하학적 패킹 및 계면활성 분자의 탄화수소 꼬리에 의존한다(Schott, in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1985, p. 271).
상평형 그림을 이용하는 현상학적 접근은 광범위하게 연구되었고, 당업자에게 마이크로에멀젼을 어떻게 제조하는가에 대한 포괄적인 지식을 가져왔다(Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245; Block, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 335). 종래의 에멀젼에 비교하여 마이크로에멀젼은 자발적으로 형성되는 열역학적으로 안정한 미세방울에서 불용성 약제를 용해시키는 장점을 제공한다.
마이크로에멀젼의 제조에서 사용되는 계면활성제는 이온성 게면활성제, 비이온성 계면활성제, Brij 96, 폴리옥시에틸렌 올레일 에테르, 폴리글리세롤 지방산 에스테르, 테트라글리세롤 모노라우레이트(ML310), 테트라글리세롤 모노올레이트(MO310), 헥사글레세롤 모노올레이트(PO310), 헥사글레세롤 펜타올레이트(PO500), 데카글레세롤 모노카프레이트(MCA750), 데카글레세롤 모노올레이트(MO750), 데카글리세롤 세퀴올레이트(SO750), 데카글리세롤 데카올레이트(DAO750)를 단독 또는 공계면활성제(cosurfactant)와 혼합한 것을 포함하지만 이에 한정되지는 않고, 대체로 에탄올, 프로판올, 및 1-부탄올과 같은 단쇄 알콜은 계면활성막에 침투하고, 결과적으로 계면활성 분자 사이에 발생되는 넓은 공간으로 인한 무질성한 막을 생산함으로써 계면 유동성을 증가시키게 된다. 그러나, 공계면활성제와 무알콜 자기-에멀젼화 마이크로에멀젼계을 사용하지 않고 제조된 마이크에멀젼들은 이 분야에서 알려져있다. 상기 수성상은 일반적으로 물, 약제의 수용액, 글리세롤, PEG300, PEG400, 폴리글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 에틸렌 글리콜의 유도체가 있지만, 이들에 한정되지는 않는다. 상기 기름상은 Captex 300, Captex 355, Capmul MCM, 지방산 에스테르, 중쇄(C8-C12) 모노, 디, 및 트리-글리세라이드, 폴리옥시에틸레이 티드 글리세라이드 지방산 에스테르, 지방산 알콜, 폴리글리콜라이즈드 글리세라이드, 포화 폴리글리콜라이즈드 C8-C10 글리세라이드, 식물성 기름 및 실리콘 기름을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다.
마이크로에멀젼은 약제 용해성과 약제의 항상된 흡수의 관점에서 특히 중요하다. 마이크로에멀젼(o/w 및 w/o)에 기초한 액체는 펩타이드를 포함한 약제의 구강 생체 이용성을 향상시키기 위하여 제안되었다(Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385-1390; Ritschel, Meth. Find. Exp. Clin. Pharmacol., 1993, 13, 205). 마이크로에멀젼은 향상된 약제 용해성, 효소적 가수분해로부터 약제의 보호, 막유동성에서 계면활성-유도 변화로 인하여 약제 흡수의 가능한 향상, 투과성, 제조의 용이성, 고체 약제 형채에서 구강 투여의 용이성, 향상된 임상 효과 및 감소된 독성의 장점을 가질 수 있다(Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385; Ho et al., J. Pharm. Sci., 1996, 85, 138-143). 종종 마이크로에멀젼은 그 성분들이 대기 온도에서 모일 때 자발적으로 형성될 수도 있다. 이것은 특히 열 불안정성 약제, 펩타이드 또는 올리고튜클레오티드를 제조할 때 유리할 수 있다. 마이크로에멀젼은 또한 화장품과 약제의 적용에서 활성 인자의 피부를 통한 전달에 있어서 효과적이다. 본 발명의 마이크로에멀젼 조성물과 제조는 위장관, 질, 구강 및 투여의 다른 부분 내에 올리고튜클레오티드와 핵산의 부분적 세포의 흡수를 향상시킬 뿐만 아니라 위장관으로부터 올리고뉴클레오티드와 핵산의 향상된 조직적 흡수를 촉진시킬 것이다.
본 발명의 마이크로에멀젼들은 또한 본 발명의 올리고뉴클레오티드와 핵산의 흡수를 향상시키고 제조 특성을 향상시키기 위하여 솔비탄 모노스테이레이트(Grill 3), 라브라솔, 및 침투촉진제와 같은 부가적인 성분과 첨가제를 함유한다. 본 발명의 마이크로에멀젼에서 사용되는 침투촉진제는 5개의 넓은 카테고리-계면활성제, 지방산, 담즘, 킬레이트제, 및 비-킬레이트 비-계면활성제-의 하나에 속하는 것으로 분류될 수 있다(Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92). 이러한 분류의 각각은 위에서 논의되었다.
리포좀
약제의 제조에 연구되고 사용된 마이크로에멀젼 주위의 많은 조직화된 계면활성제 구조가 있다. 이러한 것은 단층, 마이셀, 이중층 및 소낭들을 포함한다. 리포좀과 같은 소낭들은 그들의 특이성과 약제 전달의 관점에서 제공하는 활성의 지속성으로 인해 큰 관심을 끌었다. 본 발명에서 사용된 "리포좀"은 구형의 이중층 또는 이중층들에 정열된 양쪽성 지방으로 구성된 소낭을 의미한다.
리포좀들은 친유성 물질로부터 형성된 막과 수용성 내부를 가진 단층 또는 다층의 소낭이다. 수용성 부분은 전달되기 위한 조성을 가진다. 양이온 리포좀은 세포벽에 융합할 수 있는 장점을 가진다. 비양이온 리포좀은 세포벽에 효과적으로 융합할 수 없지만 생체 내에서 대식세포에 의해서 흡수된다.
손상되지 않은 포유류 피부를 가로지르기 위하여 지질 소낭들은 연속되는 미세한 구멍들을 통과해야만 하고, 각각의 구멍들은 적절한 피부를 통한 변화도의 영향 하에서 50 ㎚ 이하의 반지름을 가진다. 따라서, 고도로 변형가능하고 상기 미세 한 구멍을 통과할 수 있는 리포좀을 사용하는 것이 바람직하다.
게다가 리포좀의 장점을 이하의 것들을 포함한다; 자연적 인지질로부터 획득된 리포좀은 생체 친화적이고 생체 분해성이다; 리포좀은 넓은 범위의 물과 약제 가용성 지질을 포함할 수 있다; 리포좀은 그들의 내부에 있는 캡슐화된 약제를 신진대사와 분해로부터 보호할 수 있다(Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245). 리포좀 제조의 준비에서 중요한 고려사항은 지질 표면 전하, 소낭 크기 및 리포좀의 수성 부피이다.
리포좀은 활성 부위로 활성 인자의 이동과 전달에 유용하다. 리포좀 막은 생물적 막과 구조적으로 유사하므로, 리포좀이 조직에 적용되었을 때 리포좀은 세포막에 융합하기 시작한다. 리포좀과 세포의 융합이 진행되면서 리포좀의 내용물들은 활성제가 활성화될 수 있는 세포 내로 이동된다.
리포좀의 제조는 많은 약제를 위한 전달의 형태로서 넓은 연구의 초점이 되었다. 리포좀이 다른 제조 이상으로 몇 가지 장점이 있다는 국부적 투여에 대한 증거들이 증가하고 있다. 상기 장점들은 투여된 약제의 전신 흡수와 연관된 감소된 부작용, 원하는 표적에 투여된 약제의 증가된 축적, 그리고 친수성 및 소수성의 다양한 약제를 피부로 투여할 수 있는 능력을 포함한다.
몇몇의 보고들은 고분자량의 DNA를 포함한 제제를 피부에 전달하는 리포좀의 능력을 상술하였다. 마취제, 항체, 호르몬 및 고분자량의 DNA를 포함하는 화합물들은 피부를 통하여 투여된다. 대부분의 적용들은 상면 표피에 표적된다.
리포좀은 두가지의 큰 부류로 나누어진다. 양이온 리포좀은 안정한 복합체를 형성하기 위하여 음전하를 띄는 DNA 분자와 반응하는 양전하 리포좀이다. 양전하를 띄는 DNA/리포좀 복합체는 음전하를 띄는 세포 표면에 결합하여 엔도좀으로 흡수된다. 엔도좀 내의 산성 pH 때문에, 리포좀은 파열되고, 그들의 내용물을 세포질로 배출한다(Wang et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1987, 147, 980-985).
pH-민감성 리포좀 또는 음전하 리포좀은 DNA와 복합체를 형성하기보다는 DNA를 잡는다. DNA와 지질은 유사한 전하를 띄기 때문에 복합체 형성보다는 반발작용이 일어난다. 그럼에도 불구하고, 일부 DNA는 상기 리포좀의 수용성 내부에 잡힌다. pH-민감성 리포좀은 티미딘 카이네이즈 유전자를 코딩하는 DNA를 배양액의 단층 세포에 운반하기 위하여 이용되었다. 외인성 유전자의 발현은 표적 세포에서 감지되었다(Zhou et al., Journal of Controlled Release, 1992, 19, 269-274).
리포좀 조성의 한가지 중요한 형태는 자연적으로 유도된 포스펫티딜콜린 이외도 인지질들을 포함한다. 중성 리포좀 조성들은, 예를 들면, 디미리스토일 포스팻티딜콜린(DMPC) 또는 디팔미노일 포스팻티딜콜린(DPPC). 비이온 리포좀 조성물들은 일반적으로 디미리스토일 포스팻티딜글리세롤로부터 형성되는 반면, 비이온 퓨소제닉(fusogenic) 리포좀은 우선적으로 디올레일 포스팻티딜에탄올라민(DOPE) 으로부터 형성된다. 리포좀 조성물의 또다른 형태는, 예를 들면 대두 PC, 계란 PC와 같은 포스팻티딜콜린(PC) 으로부터 형성된다. 또다른 형태는 인지질 및/또는 포스팻티딜콜린 및/도는 콜레스테롤의 혼합물로부터 형성된다.
몇 가지 연구는 리포좀 약 조제의 피부를 통한 국부적 전달을 평가하였다. 인터페론을 함유한 리포좀을 기니아 피그 피부에 적용한 결과, 다른 수단(예를 들면, 용액으로서 또는 에멀젼으로서) 에 의한 인터페론의 전달이 비효율적인데 반하여, 피부 포진 종기의 감소를 초래하였다(Weiner et al., Journal of Drug Targeting, 1992, 2, 405-410). 또한, 다른 연구는 리포좀 제제의 부분으로서 투여된 인터페론의 효율을 수성계를 이용한 인터페론의 투여에 대하여 검사하고, 리포좀 제제가 수성 투여에 비하여 우수하다는 결론을 내렸다(de Plessis et al., Antiviral Research, 1992, 18, 259-265).
비이온 리포좀계는 또한 피부에 대한 약제의 전달에 있어서, 비이온 계면활성제와 콜레스테롤을 포함하는 특별한 계에서 그 유용성을 결정하기 위하여 검사되었다. NovasomeTM Ⅰ(글리세릴 디라우레이트/콜레스테롤/폴리옥시에틸렌-10-스테아릴 에테르) 및 NovasomeTM Ⅱ(글리세릴 디스테아레이트/콜레스테롤/폴리옥시에틸렌-10-스테아릴 에테르)를 포함하는 비이온 리포좀 제제는 사이클로스포린-A를 마우스 피부의 진피로 전달하기 위하여 사용되었다. 그 결과는 상기 비이온 리포좀계가 사이클로스포린-A의 피부 다른 층에 대한 침적을 촉진시키는데 효율적임을 가리켰다(Hu et al. S.T.P.Pharma. Sci., 1994, 4, 6, 466).
리포좀은 "입체적으로 안정된" 리포좀을 포함하고, 여기에서 사용된 그 용어는 하나 또는 그 이상의 특수한 지질을 함유하는 리포좀을 언급하며, 리포좀에 병합되었을 때 그러한 특수한 지질이 없는 리포좀에 비하여 증가된 순환수명을 초래한다. 입체적으로 안정된 리포좀들의 예는 리포좀의 소낭-형태 지질 부분의 일부가 (A) 모노시알로강글리오사이드 (monosialoganglioside) GM1과 같은 하나 또는 그 이상의 당지질을 포함하거나, (B) 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 일부와 같은 하나 또는 그 이상의 친수성 폴리머의 유도체에 있다. 특별한 이론에 의하여 속박되기를 바라지는 않지만, 이 분야에서는, 적어도 강글리오사이드, 스핑고미엘린, 또는 PEG-유도된 지질을 포함하는 입체적으로 안정된 리포좀에 있어서, 상기 입체적으로 안정된 리포좀의 증가된 순환 반감기는 세망내피계(RES) 의 세포에서 감소된 흡수에서 유래한다고 생각된다(Allen et al., FEBS Letters, 1987, 223, 42; Wu et al.,
Cancer Research, 1993, 53, 3765).
하나 또는 그 이상의 당단백질을 함유하는 다양한 리포좀은 이 기술의 분야에서 알려져 있다. Papahadjopoulos et al.(Ann. N.Y. Acad. Sci., 1987, 507, 64) 는 모노시알로강글리오사이드 GM1, 갈락토세레브로시드 설페이트 및 포스팻티딜이노시톨이 리포좀의 혈액 반감기를 향상시키는 능력을 보고하였다. 상기 발견들은 Gabizon et al.(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1988, 85, 6949) 에 의해서 상세히 설명되었다. 미국 특허 제4,837,028호 및 WO 88/04924는 모두, Allen et al.에서 (1) 스핑고미엘린과 (2) 강글리오사이드 GM1 또는 갈락토세레브로시드 설페이트 에스테르를 포함하는 리포좀을 개시하였다. 미국 특허 제5,543,152호(Webb et al.) 는 스핑고미엘린을 함유하는 리포좀을 개시하였다. 1,2-sn-디미스토일포스팻티딜콜린은 WO 97/13499 (Lim et al.)에서 개시되었다.
하나 또는 그 이상의 친수성 폴리머에서 유도된 지질을 포함하는 많은 리포 좀, 및 그 제조 방법은 이 기술의 분야에서 알려져 있다. Sunamoto et al.(Bull. Chem. Soc. Jpn., 1980, 53, 2778)은 PEG 일부를 포함하는 비이온 세제, 즉 2C1215G를 포함하는 리포좀을 기술하였다. Illum et al. (FEBS Lett., 1984, 167, 79)은 폴리스티렌 입자를 폴리메릭 글리콜로 친수성 코팅을 하는 것은 두드러지게 향상된 혈액 반감기를 초래한다는 것을 지적했다. 폴리아킬렌 글리콜(예를 들면, PEG) 의 카복시 그룹의 부착에 의하여 변형된 합성 인지질은 Sears(미국 특허 제4,426,330호 및 제4,534,899호) 에 의하여 기술되었다. Klivanov et al.(FEBS Lett., 1990, 268, 235) 는 PEG 또는 PEG 스테아레이트에서 유도된 포스팻티딜에탄올라민(PE)를 포함하는 리포좀은 혈액 순환 반감기에서 상당한 증가를 가진다는 것을 증명한 실험을 기술하였다. Blume et al.(Biochemica et Biophysica Acta, 1990, 1029, 91)은 그러한 관찰을 다른 PEG-유도 인지질, 예를 들면 디스티아롤포스팻티딜에탄올라민(DSPE) 및 PEG을 혼합하여 형성된 DSPE-PEG, 에 까지 확장하였다. 그 외부 표면에 공유적으로 결합한 PEG 부위를 가지는 리포좀은 유럽 특허 제0 445 131 B1호 및 WO 90/04384에 피셔 (Fisher) 로 기술되었다. PEG에서 유도된 PE의 1-20 몰%를 함유한 리포좀 조성물들, 및 그 사용방법들은 Woodle et al.(미국 특허 제5,013,556호 및 제5,356,633) 및 Martin et al.(미국 특허 제5,213,804호 및 유럽 특허 제0 496 813 B1호)에 의하여 기술되었다. 많은 다른 지질-폴리머 컨쥬게이트를 함유하는 리포좀들은 WO 91/05545와 미국 특허 제5,225,212호(둘다 Martin et al.), 그리고 WO 94/20073 (Zalipsky et al.)에서 개시되었다. PEG-변형 된 세라미드 지질을 포함하는 리포좀들은 WO 96/10391(Choi et al.)에서 기술되었다. 미국 특허 제5,540,935 (Miyazaki et al.) 및 제5,556,948호(Tagawa et al.)는 그들의 표면상에 기능적 부위에서 더 유도될 수 있는 PEG-함유 리포좀을 기술하였다.
핵산을 포함하는 제한된 수의 리포좀들은 이 기술의 분야에서 알려져있다. Thierry et al. 에 대한 WO 96/40062는 고분자량 핵산을 리포좀 내에 캡슐화하는 방법을 개시한다. Tagawa et al. 에 대한 미국 특허 제5,264,221호는 단백질-결합 리포좀을 개시하고, 상기 리포좀들의 내용물은 안티센스 RNA를 포함할 것이라고 주장했다. Rahman et al. 에 대한 미국 특허 제5,665,710호는 올리고데옥시뉴클레오티드를 리포좀 내에 캡슐화하는 방법에 대하여 기술하였다. Love et al. 에 대한 WO 97/04787은 raf 유전자에 표적된 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함하는 리포좀들을 개시하였다.
트랜스퍼좀(transfersome)은 리포좀의 또다른 형태이고, 약제 전달 운반체의 유력한 후보자로서 고도로 변형 가능한 지질 집합체이다. 트랜스퍼좀들은 미세 방울보다 더 작은 구멍을 통과하여 쉽게 침투할 수 있는 고도로 변형 가능한 지질 미세 방울로 기술될 수 있다. 트랜스퍼좀들은 그들이 이용된 환경에 적응할 수 있으며, 예를 들면 그들은 자기-최적화(피붸 있는 구멍의 모양에 적응하는), 자기-복구, 분해되지 않고도 그 표적에 자주 도달하고, 그리고 종종 자기-적재를 한다. 트랜스퍼좀을 만들기 위하여 표면 가장자리-활성제(surface edge-activators), 일반적으로 계면활성제를 표준 리포좀 조성물에 첨가하는 것은 가능하다. 트랜스퍼좀들 은 혈청 알부민을 피부에 전달하기 위하여 사용되었다. 혈청 알부민의 트랜스퍼좀-중개된 전달은 혈청 알부민을 함유한 용액의 피하주사만큼 효과적인 것으로 보인다.
계면활성제는 에멀젼(마이크로에멀젼을 포함하여) 및 리포좀과 같은 제조에서 넓게 응용될 수 있는 것으로 발견되었다. 많은 다른 계면활성제, 자연 또는 합성 계면활성제 모두를, 분류하고 평가하는 가장 일반적인 방법은 친수성/친유성 밸런스(HLB)를 이용하는 것이다. 친수성 그룹("head"로 알려진) 의 성질은 제조에 사용되는 다른 계면활성제를 분류하기 위한 가장 유용한 수단을 제공한다(Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, NY, 1988, p. 285).
계면활성제 분자가 이온화되지 않았다면, 그것은 비이온 계면활성제로서 분류된다. 비이온 계면활성제는 제약적으로, 그리고 화장품 분야에서 넓게 응용되는 것이 발견되었고, 넓은 pH 값에서 이용 가능하다. 일반적으로 그들의 HLB 값은 그들의 구조에 따라서 2 내지 18의 범위를 가진다. 비이온 계면활성제는 에틸렌 글리콜 에스테르, 프로필렌 글리콜 에스테르, 글리세릴 에스테르, 폴리글리세릴 에스테르, 솔비탄 에스테르, 수크로스 에스테르, 및 에톡실레이트 에스테르와 같은 비이온 에스테르를 포함한다. 지방 알콜 에톡시레이트, 프로폭시레이트 알콜, 및 에톡실레이트/프로폭시레이티드 블록 폴리머와 같은 비이온 알칸올아미드와 에테르는 또한 이 부류에 포함된다. 폴리옥시에틸렌 계면활성제는 비이온 계면활성제 부류의 가장 일반적인 일원이다.
계면활성제 분자가 물에 용해되거나 분산될 때 음전하를 운반한다면, 상기 계면활성제는 음이온으로 분류된다. 음이온 계면활성제는 비누, 아실 락틸레이트, 아미노산의 아실 이미드, 알킬 설페이트와 에톡실레이트 알킬 설페이트와 같은 설퍼릭 에시드의 에스테르,알킬 벤젠 설포네이트와 같은 설포네이트, 아실 이세티오네이트, 아실 타우레이트 및 설포숙시네이트, 및 포스페이트와 같은카복실레이트를 포함한다. 음이온 계면활성제 분류의 가장 중요한 구성원은 알킬 설페이트와 비누이다.
계면활성제 분자가 물에 용해되거나 분산되었을 때 양전하를 운반한다면, 계면활성제는 양이온으로 분류된다. 양이온 계면활성제는 4기 암모늄염과 에톡실레이티드 아민이을 포함한다. 4기 암모늄염이 이 부류에서 가장자주 이용되는 구성원이다.
계면활성제 분자가 양전하 또는 음전하를 운반하는 능력을 가진다면, 계면활성제는 양쪽성으로 분류된다. 양쪽성 계면활성제는 아크릴 산 유도체, 치환된 알킬아미드, N-알킬벤타이네스 및 포스팻티드를 포함한다.
약제 생산, 제제 및 에멀젼에서 계면활성제의 사용은 재검토되었다(Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, NY, 1988, p. 285).
침투 향상제
하나의 구체예에서, 본 발명은 핵산, 특히 올리고뉴클레오티드의 동물 피부 에 대한 효과적인 전달을 달성하기 위하여 다양한 침투 향상제를 이용한다. 대부분의 약제들은 이온화된 형태와 이온화되지 않은 형태로 용액 내에서 존재한다. 그러나 일반적으로 지질 용액 또는 친유성 약제만이 세포막을 쉽게 가로지른다. 가로지를 막이 침투 향상제로 처리된다면 심지어 친유성이 아닌 약제조차도 세포막을 가로지를 수 있다는 것이 밝혀졌다. 또한, 세포막을 가로질러 친유성이 아닌 약제가 확산되는 것을 돕기 위하여 침투 향상제는 친유성 약제의 침투력을 향상시킨다.
침투 향상제는 다섯 개의 넓은 카테고리, 즉 계면활성제, 지방산, 답즙, 킬레이트제, 비-킬레이트 비-계면활성제(Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Crug Carrier Systems, 1991, p. 92)의 하나에 속한다. 침투 향상제의 상기 언급된 부류의 각각은 이하에서 더 상세히 설명한다.
계면활성제: 본 발명과의 관계에서, 계면활성제(표면-활성제)는 수용성 용액에 용해될 때 용액의 표면장력 또는 수용액과 다른 액체사이의 경계면장력을 감소시킴으로써 점막을 통한 올리고뉴클레오티드의 흡수가 향상되는 결과를 가져오는 화학적 실체이다. 담즙과 지방산 뿐만 아니라, 이러한 침투 향상제는, 예를 들면 소듐 라우릴 설페이트, 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르 및 폴리옥시에틸렌-20-세틸 에티르(Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92); 그리고 FC-43 (Takahashi et al., J. Pharm. Pharmacol., 1988, 40, 252)과 같은 펄플루오로케미칼(perfluorochemical) 에멀젼을 포함한다.
지방산: 침투 향상제로 작용하는 다양한 지방산과 그들의 유도체들은, 예를 들면 올레인 산, 라우르 산, 카프르 산(n-데카노 산), 미리스트 산, 팔미트 산, 스테아르 산, 리놀렌 산, 리놀레닌 산, 디카프레이트, 트리카프레이트, 모노올레인(1-모노올레일-rac-글리세롤), 디라우린, 카프릴 산, 아라키돈 산, 글리세롤 1-모노카프레이트, 1-도데실라자시클로헵탄-2-원, 아실카르니틴, 아실콜린, 이들의 C1-10 알킬 에스테르(예를 들면, 메틸, 이소프로필 및 t-부틸), 및 이들의 모노- 및 디-글리세리드(예를 들면, 올레이트, 라우리에트, 카프레이트, 미리스테이트, 팔미테이트, 스테레이트, 리놀레이트, 등)를 포함한다(Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; E1 Hariri et al., J. Pharm. Pharmcol., 1992, 44, 651-654).
담즙: 담즙의 생리적 역할은 지질과 지용성 비타민의 분산과 흡수의 촉진을 포함한다(Brunton, Chapter 38 in: Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9th Ed., Hardman et al. Eds., McGraw-Hill, New York, 1996, pp. 934-935). 다양한 자연적 담즙, 그리고 그들의 합성 유도체들은 침투 향상제로 작용한다. 그래서 "담즙"이라는 용어는 그들의 합성 유도체 뿐만 아니라 담즙의 자연적으로 발생하는 구성요소의 어떤 것도 포함한다. 본 발명의 담즙은, 예를 들면 콜린 산(또는 그것의 제학적으로 수용 가능한 소듐 염, 소듐 콜레이트), 디하이드로콜린 산(소듐 디하이드로콜리에느), 데옥시콜린 산(소듐 글리코데옥시콜레이트), 글루콜린 산(소듐 클루콜레이트), 글리콜린 산(소듐 글리콜레이트), 글리코데옥시콜린 산(소듐 글리코데옥시콜레이트), 타우로콜린 산(소듐 타우로콜레이트), 타우로데옥시콜린 산(소듐 타우로데옥시콜레이트), 체노데옥시콜린 산(소듐 체노데옥시콜레이트), 얼소데옥시콜린 산(UDCA), 소듐 타우로-24, 25-디히드로-퓨시데이트(STDHF), 소듐 글리코디하이드로퓨시데이트 및 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르(POE)를 포함한다(Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92; Swinyard, Chapter 39 In: Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Gennaro, ed., Mack Publishing co., Easton, PA, 1990, pages 782-783; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Yamamoto et al., J. Pharm. Exp. Ther., 1992, 263, 25; Yamashita et al., J. Pharm. Sci., 1990, 79, 579-583).
킬레이트제: 본 발명과의 관계에서 사용되는 킬레이트제는 금속이온과 복합물을 형성하여 용액에서 금속이온을 제거함으로써, 점막을 통하여올리고뉴클레오티드의 흡수가 향상되는 결과를 가져오는 화합물로서 정의될 수 있다. 본 발명에서 침투 향상제로서 그들의 사용에 관하여, 킬레이트제는 또한 DNA 분해효소의 저해제로 작용하는 추가된 장점이 있고, DNA 분해효소는 촉매작용을 위하여 2가의 금속이온을 요구하고, 그래서 킬레이트제에 의해 저해되는 두드러진 특성을 가진다(Jarrett, J. Chromatogr., 1993, 618, 315-339). 본 발명의 킬레이트제는 디소듐 에틸렌디아민테트라아세테이트 (EDTA), 시트르 산, 살리실레이트(예를 들면, 소듐 살리실레이트, 5-메톡시살리실레이트 및 호모바닐레이트), 콜라겐의 N-아실 유도체, 라우레스-9 및 베타-디케톤의 N-아미노 아실 유도체(에나민스)(Lee et al., Critical Review in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Buur et al., J. Control Rel., 1990, 14, 43-51)를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.
비-킬레이트 비 계면활성제: 여기에 사용된 비-킬레이트 비-계면활성제 침투 촉진 화합물들은 킬레이트제 또는 계면활성제로서는 중요하지 않은 활성을 보여주지만, 그럼에도 불구하고 소화 점막을 통한 올리고뉴클레오티드의 흡수를 촉진시킨다(Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33). 이러한 종류의 침투 향상제들은, 예를 들면 불포화 시클릭 유레아, 1-알킬- 및 1-알케닐라자시클로-알카논 유도체(Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, pages 92); 및 디클로펜악 소듐, 인도메탁신 및 페닐부타존과 같은 비-스테로이드성 항-염증제를 포함한다(Yamashita et al., J. Pharm. Pharmacol., 1987, 39, 621-626).
세포적 레벨에서 올리고뉴클레오티드의 흡수를 향상시키는 제제들은 제약적으로, 그리고 본 발명의 다른 조성물에 부가될 수 있다. 예를 들면, 리포펙틴(Junichi et al., 미국 특허 제5,705,188호), 양이온 글리세롤 유도체와 같은 양이온 지질, 및 폴리라이신(Lollo et al., PCT 출원 WO 97/30731)과 같은 다양이온 분 자들은 올리고뉴클레오티드의 세포적 흡수를 향상시키는 것으로 알려져 있다.
에틸렌 글리콜 및 프로필렌 글리콜과 같은 글리콜, 2-피롤, 아존과 같은 피롤, 그리고 리모넨 및 메톤과 같은 털핀을 포함하는 다른 제제들도 투여된 핵산의 침투를 향상시키기 위하여 사용될 수 있다.
운반체
본 발명의 어떤 조성물들은 또한 제제에서 운반체 화합물을 첨가한다. 여기에 사용된 "운반체 화합물" 또는 "운반체"는 핵산, 비활성의 핵산 유사 물질(예를 들면, 그 자체로 생물적 활성을 가지지 않는)을 지시하기도 하지만, 생물 활성을 가지는 핵산의 생체 조건 하에서 생체이용률을 감소시키는 경과에 의하여 핵산으로 인지되며, 예를 들면, 생물적 활성 핵산을 분해하거나 순환하는 핵산의 제거를 촉진한다. 핵산과 운반체 화합물의 공동투여는, 일반적으로 운반체 화합물의 초과량으로, 간, 신장 또는 다른 순환계 외의 저장고에서 회수된 핵산량의 상당한 감소를 초래할 수 있고, 추측컨대 보통 수용기에 대한 운반체 화합물과 핵산 사이의 경쟁 때문일 것이다. 예를 들면, 간장 조직에서 부분적으로 포스포로티오에티트 올리고뉴클레오티드는 폴리이노신 산, 덱스트란 설페이트, 폴리시티딘 산 또는 4-아세타미도-4'이소티오시아노-스틸벤-2,2'-디설폰 산과 공동 투여될 때 감소될 수 있다(Miyao et al., Antisense & Nucl. Acid Drug Dev., 1996, 6, 177-183).
첨가제
운반체 화합물과는 상반되게, "제약적 운반체" 또는 "첨가제"는 제약적으로 수용 가능한 용매, 즉 동물에 대하여 하나 또는 그 이상의 핵산을 전달하기 위한 현탁화제 또는 다른 약리학적으로 비활성인 운반체이다. 첨가제는 액체 또는 고체이고, 핵산이 주어진 다른 제약적 조성의 다른 구성요소와 혼합될 때, 원하는 부피, 밀도 등을 제공하기 위하여 계획된 투여방법으로 선택된다. 일반적으로 제약적 운반체는 결합제(예를 들면, 프리겔라티나이즈드 마이즈 스타치, 폴리비닐피롤리돈 또는 하이드록시프로필 메틸셀룰로스, 등); 필러(예를 들면, 락토스와 다른 당, 마이크로크리스탈린 셀룰로스, 펙틴, 겔라틴, 칼슘 설페이트, 에틸 셀룰로스, 폴리아크릴레이트 또는 칼슘 하이드로젠 포스페이트, 등); 루브리칸트(예를 들면, 마그네슘 스테아레이트, 탈크, 실리카, 콜로이달 실리콘 디옥사이드, 스테아르 산, 메탈릭 스테아레이트, 경화된 식물성 기름, 옥수수 전분, 폴리에틸렌 글리콜, 소듐 벤조네이트, 소듐 아세테이트, 등); 붕괴제(예를 들면, 전분, 소듐 스타치 글리코레이트, 등); 및 습윤제(예를 들면, 소듐 라우릴 설페이트, 등)를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.
핵산과 유독한 반응을 하지 않는 경구 투여에 적합한 제약적으로 수용 가능한 유기적 또는 무기적 첨가제는, 또한 본 발명의 조성물을 제조하기 위하여 이용된다. 제약적으로 수용 가능한 운반체로서 적합한 것은 물, 염용액, 알콜, 폴리에틸렌 글리콜, 겔라틴, 락토스, 아밀로스, 마그네슘 스테아레이트, 탈크, 실릭산, 점성 파라핀, 하이드록시메틸셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈 및 그 유사 물질을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.
핵산의 국소적 투여를 위한 조성물은 살균과 비-살균 수용액, 알콜과 같은 일반 용매에서 비-살균 용액, 또는 용액 또는 고체 기름 기재에서 핵산의 용액들을 포함할 수 있다. 용액들은 또한 버퍼들, 희석제 및 다른 적절한 첨가제들을 함유할 수 있다. 핵산과 유독하게 반응하지 않는 경구 투여에 적합한 제약적으로 수용 가능한 유기 또는 무기 첨가제들이 사용될 수 있다.
제약적으로 수용 가능한 첨가제로 적합한 것은, 물, 염용액, 알콜, 폴리에틸렌 글리콜, 겔라틴, 락토스, 아밀로스, 마그네슘 스테아레이트, 탈크, 실릭 산, 점성 파라핀, 하이드록시메틸셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈 및 그 유사 물질을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.
다른 구성성분들
본 발명의 조성물들은 제약적 조성물에서 일반적으로 발견되는 다른 보조 성분들을 그 기술에서 확립된 수준으로 부가적으로 함유할 수 있다. 그러므로, 예를 들면 조성물들은 추가적으로, 양립할 수 있는, 제약적으로-활성인 물질, 예를 들면 항소양제, 수렴제, 국소 마취제 또는 항염증제, 또는 본 발명의 조성물의 물리적으로 제조하는 다양한 투약 형태에서 유용한 부가적인 물질을 포함할 수 있고, 부가적인 물질로는 염색제, 향표제, 보존제, 항산화제, 불투면화제, 농축제 및 안정화제와 같은 것들이 있다. 그러나, 그러한 물질들이 부가될 때 본 발명의 조성물의 구성 요소의 생물적 활성을 과도하게 방해하지 않아야 한다. 제제는 살균될 수 있고, 원한다면 보조제와 혼합되며, 그 예로서 루브리칸트, 보존제, 안정화제, 습윤 제, 에멀젼화제, 삼투압에 영향을 주는 염, 버퍼, 착색제, 향료 및/또는 방향 물질 및 제조에서 핵산과 유독하게 반응하지 않는 유사물질이 있다.
수용성 현탁물들은 함유하고 있는 현탁물의 점성을 증가시키는 물질, 예를 들면 소듐 카복시메틸셀룰로스, 솔비놀 및/또는 덱스트란을 함유하고 있다. 현탁물은 또한 안정화제도 함유하고 있을 수 있다.
본 발명의 몇몇 구체예에서는 (a) 하나 또는 그 이상의 안티센스 화합물과 (b) 비-안티센스 기작에 의하여 기능하는 하나 또는 그 이상의 다른 화학요법제를 포함하는 제약적 조성물들을 제공한다. 그러한 화학요법제의 예로서, 다우노루미신, 다우노마이신, 닥티노마이신, 독소루비신, 에피루비신, 이다루비신, 에소루비신, 블레오마이신, 미포스파미드, 이포스파미드, 시토신 아라비노사이드, 비스클로로에틸니트로스유레아, 부설판, 미토마이신 C, 악티오마이신 D, 미쓰라마이신, 프레드니손, 하이드록시포로게스테론, 테스토스테론, 타목시펜, 다카보진, 프로카보진, 헥사메틸멜아민, 펜타메틸멜아민, 미토잔트론, 암사크린, 클로람부실, 메틸시클로헥실니트로스유레아, 니트로젠 무스타드, 멜팔란, 시클로포스파미드, 6-멀캅토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라민, 5-아자시티딘, 하이드록시유레아, 데옥시코포마이신, 4-하이드록시페록시시클로포스포라이드, 5-플루오로우라실 (5-FU), 5-플로오로데옥시유리딘 (5-FUdR), 메톡트렉세이트 (MTX), 콜치신, 탁솔, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포사이드 (VP-16), 트리메트렉세이트, 이리노테칸, 토포테칸, 겜시타빈, 테니포사이드, 시스플라틴 및 디에틸스틸베스트롤 (DES)을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 전체적으로, The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 15th Ed. 1987, pp. 1206-1228, Berknow et al., eds., Rahway, N.J. 참조. 본 발명의 화합물로 사용될 때, 그러한 화학 요법제들은 개별적으로 (예를 들면, 5-FU 및 올리고뉴클레오티드), 순서대로 (일정시간 동안 5-FU와 올리고뉴클레오티드, 그 다음에 MTX와 올리고뉴클레오티드), 또는 그러한 화학요법제 이외의 하나 또는 다른 물질과 혼합하여 (예를 들면, 5-FU, MTX와 올리고뉴클레오티드, 또는 5-FU, 방사선요법과 올리고뉴클레오티드) 사용될 수 있다. 항염증제들은 비스테로이드성 항염증제와 코티코스테로이드, 항바이러스제를 포함하지만 이에 한정되지는 않고, 항바이러스제는 리비비린, 비다라빈, 아시클로비르 및 간시클로비르를 포함하지만 이에 한정되지는 않으며, 이들은 또한 본 발명의 조성물에 혼합될 수 있다. 전체적으로, The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 15th Ed., Berknow et al., eds., 1987, Rahway, N.J., 각각 pages 2499-2506 및 46-49 참조. 다른 비-안티센스 화학요법제들은 또한 본 발명의 범위 내에 있다. 두 개 또는 그 이상의 혼합된 화합물들이 함께 또는 순서대로 사용될 수 있다.
또 다른 관련된 구체화에서, 본 발명의 조성물들은 하나 또는 그 이상의 안티센스 화합물을 함유하고, 특히 두 번째 핵산 타겟에 표적된 하나 또는 그 이상의 부가적인 안티센스 화합물와 첫 번째 핵산에 표적된 올리고뉴클레오티드를 함유한다. 두 개 또는 그 이상의 혼합된 화합물들은 함께 또는 순서대로 사용될 수 있다.
치료 조성물의 제제와 그에 수반하는 투여는 이 분야의 기술 내에 있는 것으로 생각된다. 몇 일에서 몇 달 동안 지속되는 치료의 과정으로, 또는 회복되거나 질병 상태의 감소가 이루어질 때까지, 투약은 치료할 질병 상태의 심각성 및 반응 성에 의존한다. 최적의 투약 계획은 환자의 신체 내에 약제 축적의 측정으로부터 계산될 수 있다. 보통의 기술을 가진 사람들은 최적의 투약량, 방법론 및 반복률을 용이하게 결정할 수 있다. 최적 투여량은 각 올리고뉴클레오티드의 상대적 효능에 의존하여 다양화될 수 있고, 일반적으로 생체 외 및 생체 내에서 효과적인 것으로 발견된 EC50s에 기초하여 측정될 수 있다. 일반적으로, 투여량은 체중의 kg 당 0.01 ug 내지 100 g 이고, 일, 주, 월, 또는 년에 한번 또는 그 이상, 또는 매 2 년 내지 20 년에 한번 투여될 수 있다. 이 분야에서 보통의 기술을 가진 자들은 체액 또는 조직 내에서 측정된 체제 시간과 약제의 농도에 기초하여 투여를 위한 반복률을 용이하게 측정할 수 있다. 성공적 치료 후에 환자가 질병 상태의 재발을 방지하기 위하여 유지 치료를 받는 것을 바람직하고, 이 때 올리고뉴클레오티드는 체중 kg 당 0.01 ug 내지 100 g의 범위에서 하루에 한번 또는 그 이상 내지 매 20년에 한번의 유지 투여량으로 투여된다..
본 발명은 바람직한 구체예에 따라 상세히 기술되지만, 다음의 예들은 본 발명을 예시하는 것일 뿐 이에 한정되는 것이 아니다.
실시예
실시예 1
올리고뉴클레오티드 합성을 위한 뉴클레오시드 포스포라미디트 (Nucleoside Phosphoramidites) 데옥시 및 2'-알콕시 아미디트 (2'-alkoxy amidites)
2'-데옥시 및 2'-메톡시 베타-시아노에틸디이소프로실 포스포라미디트는 일반적 공급처(예를 들면, Chemgenes, Needham MA 또는 Glen Research, Inc. Sterling VA)로부터 구매하였다. 다른 2'-O-알콕시 치환된 뉴클레오시드 아미디트는 본 발명에서 참조된 미국 특허 제5,506,351호에서 기술된 것에 따라 제조되었다. 2'-알콕시 아미디트를 이용하여 합성된 올리고뉴클레오티드들에 대하여, 테트라졸과 베이스의 펄스 전달 후 대기 단계 이외가 360 초로 증가된 것을 제외하고는 변형되지 않은 올리고뉴클레오티드들에 대한 표준 사이클이 이용되었다.
5-메틸-2'-데옥시시티딘(5-Me-C) 뉴클레오티드들을 포함하는 올리고뉴클레오티드들은 통상적으로 이용 가능한 포스포라미디트(Glen Research, Sterling VA 또는 ChemGenes, Needham MA)를 이용하여 공지된 방법 [Sanghvi, et al., Nucleic Acids Research, 1993, 21, 3197-3203] 들에 따라 합성된다.
2'-플루오로 이미디트
2'-플루오로데옥시아데노신 아미디트
2'-플루오로 올리고뉴클레오티드들은 이전에 기술된 [Kawasaki, et al., J. Med. Chem., 1993, 36, 831-841]과 본 발명에서 참조된 미국 특허 제5,670,633호에 따라 합성되었다. 간단하게, 보호된 뉴클레오시드 N6-벤조일-2'-데옥시-2'-플루오로아데노신은 통상적으로 이용 가능한 9-베타-D-아라비노푸라노실아데닌을 출발물 질로 이용하고, 2'-알파-플루오로 원자가 2'-베타-트리틸 그룹의 SN2-치환에 의하여 도입되도록 하는 문헌 절차를 수정하여 합성하였다. 그러므로 N6-벤조일-9-베타-D-아라비노푸라노실아데닌은 선택적으로 프로텍트되어 3',5'-디테트라히드로피라닐(THP) 중간체의 적당한 수율을 나타내었다. THP 및 N6-벤조일그룹의 디프로텍션은 표준 방법론에 의해 수행되었고, 표준 방법들은 5'-디메톡시트리틸-(DMT) 및 5'-DMT-3'-포스포라미디트 중간체를 획득하기 위하여 사용되었다.
2'-플루오로데옥시구아노신
2'-데옥시-2'-플루오로구아노신의 합성은 테트라이소프로실디실록자닐(TPDS) 프로텍트 된 9-베타-D-아라비노푸라노실구아닌을 출발물질로서 사용하여 중간체인 디이소부티릴-아라비노푸라노실구아노신으로 전환되도록 하였다. 디이소부티릴 디-THP 프로텍트된 아라비노푸라노실구아닌을 만들기 위하여 하이드록시 그룹을 THP로 프로텍션한 후, TPDS 그룹의 디프로텍션을 하였다. 플루오리드로 크루드 프로덕트를 처리하고, THP 그룹의 디프로텍션한 후 선택적인 O-디아실레이션과 트리플라션이 행해졌다.
2'-플루오로유리딘
2'-데옥시-2'-플로오로유리딘의 합성은 2,2'-안하이드로-1-베타-D-아라비노푸라노실우라실이 70% 하이드로겐 플루오리드-피리딘으로 처리되는 문헌 절차의 수 정에 의하여 수행되었다. 표준 절차들은 5'DMT 및 5'-DMT-3' 포스포라미디트를 획득하기 위하여 이용되었다.
2'-플루오로데옥시시티딘
2'-데옥시-2'-플루오로시티딘은 2'-데옥시-2'-플루오로유리딘의 아미노화에 의하여 합성한 후, 선택적 프로텍션으로 N4-벤조일-2'-데옥시-2'-플루오로시티딘을 제조하였다. 표준 절자들은 5'-DMT 및 5'-DMT-3' 포스포라미디트를 획득하기 위하여 이용되었다.
2'-O-(2-메톡시에틸) 변형된 아미디트
2'-O-메톡시에틸-치환된 뉴클레오시드 아미디트들은 다음과 같이, Martin, P., Helvetica Chimica Acta, 1995, 78, 486-504 또는 대체방법에 의해 제조되었다.
2,2'-안하이드로[1-(베타-D-아라비노푸라노실)-5-메틸유리딘]
5-메틸유리딘(리보실티민, 통상적으로 일본 초시의 야마사를 통하여 이용가능)(72.0 g, 0.279 M), 디페닐-카보네이트(90.0 g, 0.420 M) 및 소듐 비카보테이트(2.0 g, 0.024 M) 는 DMF(300 mL)에 부가되었다. 혼합물은 교반하면서 환류하도록 가열하여, 발생된 이산화탄소 가스가 통제된 방식으로 방출되도록 하였다. 1 시간 후, 약간 색이 어두어진 용액은 저압력 하에서 농축되었다. 그 결과 발생된 시럽은 디에틸에테르(2.5 L) 에 교반하면서 부었다. 그 생산물은 고무를 형성하였다. 에테르는 가만히 따르고 그 잔유물은 최소량의 메탄올(ca. 400 mL) 에 용해시켰다. 그 용액은 새로운 에테르(2.5 L)에 부어 단단한 고무를 제조하였다. 에테르는 가만히 따르고 고무는 진공 오븐(24 시간 동안 1 mm Hg, 60℃)에서 건조하여 고체를 제공하여, 이는 연갈색 파우더 (57 g, 85 % 크루드 일드)로 분쇄되었다. NMR 스펙트럼은 그것의 소듐염 (ca. 5%) 으로서 페놀로 혼성된 구조와 일치하였다. 물질은 그 이상의 반응을 위한 것으로 사용되었다(또는 그것은 흰 고체, mp 222-4 ℃를 얻기 위하여 에틸 아세테이트(10-25 %)에서 메탄올의 구배를 이용하는 컬럼 크로마토그래시에 의하여 더 정제될 수 있다).
2'-O-메톡시에틸-5-메틸유리딘
2,2'-안하이드로-5-메틸유리딘(195 g, 0.81 M), 트리스(2-메톡시에틸)보레이트(231 g, 0.98 M) 및 2-메톡시에탄올(1.2 L) 은 2 L 스테인레스 스틸 압력 용기에 가해지고 160 ℃에서 예열된 오일 배스에 두었다. 155-160 ℃에서 48 시간 동안 가열한 후에, 용기는 열리고 용액은 증발하여 건조되며, MeOH(200 mL) 으로 분말화되었다. 잔여물은 뜨거운 아세톤(1 L) 에 부유되었다. 불용성 염들은 여과되고, 아세톤(150 mL) 으로 세척되며, 여과액은 증발되었다. 그 잔여물(280 g) 은 CH3CN(600 mL)에서 용해되고 증발되었다. 실리카 겔 컬럼(3 kg) 은 0.5 % Et3NH를 포함하는 CH2Cl2/acetone/MeOH (20:5:3)로 채워졌다. 잔여물은 컬럼에 로딩되기 전에 CH
2Cl2
(250 mL)에 용해되었고 실리카(150 g) 에 흡수되었다. 생산물은 충전 용매로 용출되어 160 g(63 %) 의 생산물을 제공하였다. 불순물이 함유된 부분을 재 작업함으로써 부가적인 물질이 획득되었다.
2'-O-메톡시에틸-5'-O-디메톡시트리틸-5-메틸유리딘
2'-O-메톡시에틸-5-메틸유리딘(160 g, 0.506 M)은 피리딘(250 mL) 과 함께 증발되고, 건조된 잔여물은 피리딘(1.3 L) 에 용해되었다. 디메톡시트리틸 클로라이드의 첫 번째 분취량(94.3 g, 0.278 M) 이 가해지고 그 혼합물은 실내 온도에서 한 시간 동안 교반되었다. 디메톡시트리틸 클로라이드의 두 번째 분취량(94.3 g, 0.278 M) 이 가해지고 반응이 그 다음 한 시간동안 일어났다. 메탄올(170 mL) 은 그 반응을 중지하기 위하여 가해졌다. HPLC는 대략 70 % 생산물의 존재를 보여주었다. 용매는 증발되었고 CH3CN(200 mL) 으로 분말화되었다. 잔여물은 CHCl3(1.5 L) 에 용해되었고, 2×500 mL의 포화된 NaHCO3 및 2×500 mL의 포화된 NaCl 로 추출되었다. 유기상은 Na2SO4로 건조되었고, 여과되고 증발되었다. 275 g의 잔여물이 수득되었다. 상기 잔여물은 3.5 kg의 실리카 겔 컬럼에서 정제되었고, 상기 컬럼은 충진되었고, 0.5 % Et3NH를 함유하는 EtOAc/hexane/acetone(5:5:1) 으로 용출되었다. 순수한 부분은 증발되어 164 g의 생산물을 제공하였다. 불순한 부분으로부터 대략 20 g가 수득되어 총 183 g(57 %) 을 제공하였다.
3'-O-아세틸-2'-O-메톡시에틸-5'-O-디메톡시트리틸-5-메틸유리딘
2'-O-메톡시에틸-5'-O-디메톡시트리틸-5-메틸유리딘(106 g, 0.167 M), DMF/피리딘(562 mL의 DMF 및 188 mL의 피리딘으로부터 제조된 3:1 혼합물의 750 mL) 및 아세틱 안하이드라이드(24.38 mL, 0.258 M) 은 혼합되었고 실내 온도에서 24 시간 동안 교반되었다. 그 반응은 MeOH의 첨가로 TLC 샘플을 첫 번째 소광함으로써 TLC에 의하여 조절된다. 반응이 완료된 후 곧, TLC에 의해 평가되고, MeOH(50 mL) 은 첨가되고 그 혼합물은 35 ℃에서 증발되었다. 잔여물은 CHCl3(800 mL) 에서 용해되었고, 2×200 mL의 포화된 소듐 바이카보네이트 및 2×200 mL 의 포화된 NaCl 로 추출되었다. 수성층은 200 mL의 CHCl3로 역추출되었다. 혼합된 유기물들은 소듐 설페이트로 건조되었고 증발되어 122 g의 잔여물(약 90 % 생산물) 을 제공하였다. 상기 잔여물은 3.5 kg의 실리카 겔 컬럼에서 정제되었고, EtOAc/hexane (4:1)을 사용하여 용출되었다. 순수한 부분은 증발되어 96 g(84 %) 을 산출하였다. 추후의 부분으로부터 추가적으로 1.5 g 을 회수하였다.
3'-O-아세틸-2'-O-메톡시에틸-5'-O-디메톡시트리틸-5-메틸-4-트리아졸유리딘
첫 번째 용액은 3'-O-아세틸-2'-O-메톡시에틸-5'-O-디메톡시트리틸-5-메틸유리딘(96 g, 0.144 M)을 CH3CN(700 mL)에 용해시키고 놓아둠으로써 제조되었다. 트리에틸아민(189 mL, 1.44 M)은 CH3CN(1 L) 내의 트리아졸(90 g, 1.3 M)의 용액에 가해졌고, -5 ℃으로 냉각되고 오버헤드 교반기를 이용하여 0.5 시간 동안 교반되었다. POCl3은 0-10 ℃에서 유지된 교반된 용액에 30분 이상 동안 한 방울씩 가해졌고, 그 혼합물은 추가적으로 2 시간 동안 교반되었다. 첫 번째 용액은 상기 용액에 45 분 이상 동안 한 방울씩 가해졌다. 그 반응 혼합물은 밤새 냉각실에 두었다. 염들은 반응 혼합물로부터 여과되었고, 용액은 증발되었다. 잔여물은 EtOAc(1 L) 에 용해되었고, 불용성 고체는 여과에 의해 제거되었다. 여과액은 1×300 mL의 NaHCO3 및 2×300 mL의 포화된 NaCl로 세척되었고, 소듐 설페이트로 건조되고 증발되었다. 잔여물은 EtOAc으로 분말화되어 표제 화합물을 제공하였다.
2'-O-메톡시에틸-5'-O-디메톡시트리틸-5-메틸시티딘
디옥산(500 mL) 및 NH4OH(30 mL) 내의 3'-O-아세틸-2'-O-메톡시에틸-5'-O-디메톡시-트리틸-5-메틸-4-트리아졸유리딘(103 g, 0.141 M)의 용액은 실내 온도에서 2 시간 동안 교반되었다. 디옥산 용액은 증발되었고, 그 잔여물은 MeOH(2×200 mL)과 함께 공비화합물이 되었다. 잔여물은 MeOH(300 mL)에서 용해되었고, 2 리터의 스테인레스 스틸 압력 용기에 옮겨졌다. NH3 가스로 포화된 MeOH(400 mL)가 가해지고, 용기는 100 ℃에서 2 시간 동안 가열되었다(TLC가 완전한 전환을 보여주었다). 용기 내용물은 건조를 위해 증발되었고, 잔여물은 EtOAc(500 mL)에서 용해되어 포화된 NaCl(200 mL)로 한번 세척되었다. 유기물들은 소듐 설페이트로 건조되었고, 및 용매는 증발되어 표제 화합물 85 g(95 %) 을 제공하였다.
N4-벤조일-2'-O-메톡시에틸-5'-O-디메톡시트리틸-5-메틸-시티딘
2'-O-메톡시에틸-5'-O-디메톡시트리틸-5-메틸시티딘(85 g, 0.134 M)은 DMF(800 mL)에서 용해되고, 교반하면서 벤조익 안하이드리드(37.2 g, 0.165 M)를 첨가하였다. 3 시간 교반 후, TLC는 반응이 약 95 % 완성되었음을 보여주었다. 용매는 증발되고 잔여물은 MeOH(200 mL)과 함께 공비화합물이 되었다. 잔여물은 CHCl3(700 mL)에 용해되고, 포화된 NaHCO3(2×300 mL) 및 포화된 NaCl(2×300 mL)으로 추출되고, MgSO4으로 건조되며 증발되어 잔여물(96 g)을 제공한다. 잔여물은 0.5 % Et3NH를 함유하는 EtOAc/hexane(1:1)을 용출제로 사용하는 1.5 kg의 실리카 컬럼에서 크로마토그래프법으로 분석되었다. 순수한 생산물 부분은 증발되어 표제 화합물 90 g(90 %) 을 제공하였다.
N4-벤조일-2'-O-메톡시에틸-5'-O-디메톡시트리틸-5-메틸-시티딘-3'-아미디트
N4-벤조일-2'-O-메톡시에틸-5'-O-디메톡시트리틸-5-메틸-시티딘(74 g, 0.10 M)은 CH2Cl2(1 L)에서 용해되었다. 테트라졸 디이소프로실아민(7.1 g) 및 2-시아노에톡시-테트라(이소프로필)-포스파이트(40.5 mL, 0.123 M) 이 질소 가스 하에서 교반하면서 첨가되었다. 그 혼합물은 실내 온도에서 20 시간 동안 교반되었다(TLC가 반응이 95 % 완료되었음을 보여주었다). 반응 혼합물은 포화된 NaHCO3(1×300 mL) 및 포화된 NaCl(3×300 mL)로 추출되었다. 수용성 침전물은 CH2Cl2(300 mL)으로 역 추출되었고, 추출물들은 혼합되고, MgSO4으로 건조되고 농축되었다. 수득된 잔여물은 EtOAc/hexane (3:1)을 용출제로 사용하는 1.5 kg 실리카 컬럼에서 크로마토그래프법으로 분석되었다. 순수한 분획들은 혼합되어 표제 화합물의 90.6 g(87 %)을 제공하였다.
2'-O-(아미노옥시에틸) 뉴클레오시드 마이디트 및 2'-O-(디메틸아미노옥시에틸) 뉴클레오시드 아미디트
2'-(디메틸아미노옥시에톡시) 뉴클레오시드 아미디트
2'-(디메틸아미노옥시에톡시) 뉴클레오시드 아미디트 [또한, 본 기술분야에서 2'-O-(디메틸아미노옥시에틸) 뉴클레오시드 아미디트로도 알려진] 는 다음 단락에서 기술된 대로 제조되었다. 아데노신, 시티딘 및 구아노신 뉴클레오시드 아미디트는, 아데노신과 시티딘의 경우에는 엑소시클릭 아민이 벤조일 일부로 프로텍트되고, 구아노신의 경우에는 이소부티릴로 프로텍트되는 것을 제외하고는 티미딘(5-메틸유리딘)과 유사하게 제조되었다.
5'-O-tert-부틸디페닐시릴-O
2
-2'-안하이드로-5-메틸유리딘
O2-2'-안하이드로-5-메틸유리딘(Pro. Bio. Sint., Varese, Italy, 100.0 g, 0.416 mmol), 디메틸아미노피리딘(0.66 g, 0.013 eq, 0.0054 mmol)은 기계적 교반 과 함께 아르곤 기체 하 대기 온도에서 건조 피리딘(500 mL)에 용해되었다. tert-부틸디페닐클로로실란(125.8 g, 119.0 mL, 1.1 eq, 0.458 mmol)은 일부에 첨가되었다. 반응은 대기 온도에서 16 시간 동안 교반되었다. TLC(Rf 0.22, 에틸 아세테이트)는 완결된 반응을 나타내었다. 용액은 감소된 압력 하에서 두꺼운 기름으로 농축되었다. 이것은 디클로로메탄(1 L), 포화된 소듐 바이카보네이트(2×1 L) 및 소금물(brine)(1 L)으로 분리되었다. 유기층은 소듐 설페이트로 건조되었고 감소된 압력 하에서 두꺼운 기름으로 농축되었다. 기름은 에틸 아세테이트 및 에틸 에테르(600 mL)의 1:1 혼합물에서 용해되었고, 그 용액은 -10 ℃로 냉각되었다. 그 결과 결정질 생산물이 여과에 의하여 수집되었고, 에틸 에테르(3×200 mL) 로 세척되었고, 149 g(74.8 %)의 백색 고체로 건조(40 ℃, 1mm Hg, 24 h) 되었다. TLC 및 NMR은 순수한 생산물와 일치하였다.
5'-O-tert-부틸디페닐시릴-2'-O-(2-하이드록시에틸)-5-메틸유리딘
2 L의 스테일레스 스틸에서, 교반되지 않는 압력 반응기에 테트라하이드로퓨란(1.0 M, 2.0 eq, 622 mL) 존재 하에서 보란이 첨가되었다. 메뉴얼의 스터링을 하면서 퓸(fume) 후드에서, 에틸렌 글리콜(350 mL, 초과량) 는 처음에 수소가스의 발생이 가라앉을 때까지 조심스럽게 첨가되었다. 5'-O-tert-부틸디페닐시릴-O2-2'-안하이드로-5-메틸유리딘(149 g, 0.311 mol) 및 소듐 바이카보네이트(0.074 g, 0.003 eq)는 메뉴얼 스터링을 하면서 첨가되었다. 반응기는 밀폐되고 오일 배쓰에서 내부 온도가 160 ℃에 이를 때까지 가열하고, 16 시간 동안(압력 < 100 psig) 유지되었다. 반응 용기를 대기 온도로 냉각하고 열었다. TLC(바람직한 생산물을 위한 Rf 0.67 및 ara-T 부산물을 위하여 Rf 0.82, 에틸 아세테이트)는 생산물로 약 70 % 전환되었음을 나타내었다. 부가적인 부산물의 생산을 방지하기 위하여 반응은 중단되었고, 에틸렌 글리콜을 제거하기 위하여 사용된 극도의 조건으로 따뜻한 워터 배쓰(40-100 ℃) 에서 감압(10 에서 1mm Hg) 하에서 농축되었다. [다른 방법으로, 낮은 온도에서 끓는 용매가 휘발되면 잔여용액은 에틸 아세테이트와 물로 분리될 수 있다. 생산물은 유기상이 될 것이다.] 잔류물은 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제되었다(2 kg 실리카 겔, 에틸 아세테이트-헥산 구배는 1:1 내지 4:1). 적당한 단편들이 혼합되고, 제거되고 백색의 물결이 이는 포말(84 g, 50 %) 생산물로 건조되었고, 출발 물질과 재사용 가능한 순수한 출발물질 20 g 이 혼성되었다(17.4 g). 덜 순수한 출발 물질에 기초한 수득률은 58 % 이었다. TCR 및 NMR은 99 % 순도 생산물에 일치하였다.
2'-O-([2-프탈이미독시]에틸)-5'-t-부틸디페닐시릴-5-메틸유리딘
5'-O-tert-부틸디페닐시릴-2'-O-(2-하이드록시에틸)-5-메틸유리딘(20 g, 36.98 mmol)은 트리페닐포스핀 (11.63 g, 44.36 mmol) 및 N-하이드록시프탈이미드(7.24 g, 44.36 mmol)로 혼합되었다. 그 다음 이틀 동안 40 ℃, 고진공 하에서 P2O5로 건조되었다. 반응 혼합물이 아르곤과 함께 쏟아져 나오고, 건조 THF(369.8 mL,Aldrich, sure seal bottle)는 맑은 용액을 얻기 위하여 첨가되었다. 디에틸-아조디카복실레이트(6.98 mL, 44.36 mmol)는 반응 혼합물에 한 방울씩 가해졌다. 첨가 속도는 유지되어, 진한 적색이 마지막 방울을 첨가하기 전에 나타나도록 하였다. 첨가가 완료된 후, 반응물은 4 시간 동안 교반되었다. 그 때 TLC는 반응의 완료를 나타내었다(에틸아세테이트:헥산, 60:40). 용매는 진공 하에서 증발되었다. 수득된 잔류물은 플래쉬 컬럼에 위치되고 에틸 아세테이트:헥산(60:40)으로 용출되어 백색 포말로 2'-O-[(2-프탈이미독시)에틸)-5'-t-부틸디페닐시릴-5-메틸유리딘(21.819 g, 86 %) 을 수득하였다.
5'-O-tert-부틸디페닐시릴-2'-O-[(2-포름아독시미노옥시)에틸]-5-메틸유리딘
2'-O-[(2-프탈이미독시)에틸]-5'-O-t-부틸디페닐시릴-5-메틸유리딘(3.1 g, 4.5 mmol)은 건조 CH2Cl2(4.5 mL)에 용해되고 메틸하이드라진(300 mL, 4.64 mmol)은 -10 ℃ 내지 0 ℃에서 한 방울씩 첨가되었다. 1 시간 후 혼합물은 여과되었고, 여과액은 차가운(ice cold) CH2Cl2 으로 세척되었고 혼합된 유기상은 물, 함수로 세척되었고, 무수 Na2SO4로 건조되었다. 용액은 농축되어 2'-O-(아미노옥시에틸) 티미딘이 수득되었고, 이는 MeOH(67.5 mL)에서 용해되었다. 여기에 포름알데하이드(20 % 수용액, w/w, 1.1 eq.) 가 가해지고, 그 혼합물은 1 시간 동안 교반되었다. 용배는 진공 하에서 제거되고; 잔류물은 크로마토그래프를 통하여 백색 포말(1.95 g, 78 %)로서 5'-O-tert-부틸디페닐시릴-2'-O-[(2-포름아독시미노옥시) 에틸]-5-메틸유리 딘을 수득되엇다.
5'-O-tert-부틸디페닐시릴-2'-O-[N,N-디메틸아미노옥시에틸]-5-메틸유리딘
5'-O-tert-부틸디페닐시릴-2'-O-[(2-포름아독시미노옥시)에틸]-5-메틸유리딘(1.77 g, 3.12 mmol) 은 건조 MeOH(30.6 mL)에 1M 피리디니움 p-톨루엔설포네이트(PPTS) 용액에서 용해되었다. 소듐 시아노보로하이드라이드(0.39 g, 6.13 mmol)는 비활성 대기 하, 10 ℃에서 상기 용액에 첨가되었다. 반응 혼합물은 10 분 동안 10 ℃ 에서 교반되었다. 반응 용기를 아이스 배쓰에서 꺼내어 2 시간 동안 실내 온도에서 교반한 후, 반응물은 TLC(5 % MeOH in CH2Cl2) 에 의해 측정되었다. 수용성 NaHCO3 용액 (5 %, 10 mL) 이 첨가되고 에틸 아세테이트(2×20 mL) 로 추출되었다. 에틸 아세테이트 상은 무수 Na2SO4로 말리고, 증발되어 건조되었다. 잔류물은 MeOH(30.6 mL) 내에서 1 M PPTS의 용액에서 용해되었다. 포름알데하이드(20 % w/w, 30mL, 3.37 mmol) 는 첨가되었고, 반응 혼합물은 10 분 동안 실내 온도에서 교반되었다. 반응 혼합물은 아이스 배쓰에서 10 ℃까지 냉각되고, 소듐 시아노보로하이드라이드(0.39 g, 6.13 mmol) 는 첨가되고 그 반응 혼합물은 10 분 동안 10 ℃ 에서 교반되었다. 10분 후, 반응 혼합물은 아이스 배쓰에서 꺼내어 2 시간 동안 실내 온도에서 교반하였다. 이 반응 혼합물에 5 % NaHCO3 (25mL) 용액이 가해지고 에틸 아세테이트(2×25 mL) 로 추출되었다. 에틸 아세테이트 층은 무수 Na2SO4 로 말리고 증발되어 건조되었다. 수득된 잔류물은 플래쉬 컬럼 크로마토그래시로 정제되고, CH2Cl2에서 5 % MeOH로 용출되어 백색 포말(14.6 g, 80 %) 로서 5'-O-tert-부틸디페닐시릴-2'-O-[N,N-디메틸아미노옥시에틸]-5-메틸유리딘을 수득하였다.
2'-O-(디메틸아미노옥시에틸)-5-메틸유리딘
트리에틸아민 트리아리드로플루오라이드(3.91 mL, 24.0 mmol) 은 건조 THF 및 트리에틸아민(1.67 mL, 12 mmol, 건조, KOH 하에서 보관) 에서 용해되었다. 트리에틸아민-2HF의 상기 혼합물은 5'-O-tert-부틸디페닐시릴-2'-O-[N,N-디메틸아미노옥시에틸]-5-메틸유리딘(1.40 g, 2.4 mmol) 에 가해졌고, 24 시간 동안 실내 온도에서 교반되었다. 반응은 TLC (5 % MeOH in CH2Cl2)에 의해서 측정되었다. 용매는 진공 하에서 제거되었고, 잔류물은 플래쉬 컬럼에 위치시키고 CH2Cl2의 10 % MeOH으로 용출되어 2'-O-(디메틸아미노옥시에틸)-5-메틸유리딘(766 mg, 92.5 %) 이 수득되엇다.
5'-O-DMT -2'-O-(디메틸아미노옥시에틸)-5-메틸유리딘
2'-O-(디메틸아미노옥시에틸)-5-메틸유리딘(750 mg, 2.17 mmol)은 40 ℃에서 밤새도록 고진공 하에서 P2O5로 건조되었다. 그것은 무수 피리미딘 (20 mL)과 함께 공동-증발되었다. 수득된 잔유물은 아르곤 기체 하에서 피리미딘 (11 mL) 에 용해되었다. 4-디메틸아미노피리딘(26.5 mg, 2.60 mmol), 4,4'-디메톡시트리틸 클로라이드(880 mg, 2.60 mmol) 은 상기 혼합물에 첨가되고 그 반응 혼합물은 출발물질이 모두 없어질 때 까지 실내온도에서 교반되었다. 피리딘은 진공 하에서 제거되었고 그 잔류물은 크로마토그래프 되고, CH2Cl2 에 10 % MeOH(피리딘 몇 방울을 포함한) 로 용출되어 5'-O-DMT-2'-O-(디메틸아미노-옥시에틸)-5-메틸유리딘 (1.13 g, 80 %) 을 수득하였다.
5'-O-DMT-2'-O-(2-N,N-디메틸아미노옥시에틸)-5-메틸유리딘-3'-[(2-시아노에틸)-N,N-디이소프로실포스포라미디트]
5'-O-DMT-2'-O-(디메틸아미노옥시에틸)-5-메틸유리딘(1.08 g, 1.67 mmol) 은 톨루엔(20 mL) 와 함께 공동-증발되었다. 상기 잔여물에 N,N-디이소프로필아민 테트라조나이드(0.29 g, 1.67 mmol) 이 가해지고, 고진공 하에서 밤새도록 40 ℃에서 P2O5 로 건조되었다. 그 다음 반응 혼합물은 무수 아세토니트릴(8.4 mL) 에서 용해되고, 2-시아노에틸-N,N,N1,N1-테트라이소프로실포스포라미디트(2.12 mL, 6.08 mmol)가 가해졌다. 반응 혼합물은 비활성 대기 하에서 4 시간동안 대기온도에서 교반되었다. 상기 반응의 진행은 TLC(헥산:에틸 아세테이트 1:1)로 측정되었다. 용매는 증발된 후, 그 잔류물은 에틸 아세테이트(70 mL) 에서 용해되었고 5 % 수용성 NaHCO2(40 mL) 으로 세척되었다. 에틸 아세테이트 층은 무수 Na2SO4로 건조되고 농축되었다. 수득된 잔류물은 크로마토그래프(용출액으로 에틸 아세테이트) 되어 포말(1.04 g, 74.9 %)로서 5'-O-DMT-2'-O-(2-N,N-디메틸아미노옥시에틸)-5-메틸유리딘-3'-[(2-시아노에틸)-N,N-디이소프로필포스포라미디트]이 수득되었다.
2'-(아미노옥시에톡시) 뉴클레오시드 아미디트
2'-(아니모옥시에톡시) 뉴클레오시드 아미디트 [또한 이 기술 분야에서는 2'-O-(아미노옥시에틸) 뉴클레오시드 아미디트] 는 다음 단락에서 기술된대로 제조된다. 아데노신, 시티딘 및 티미딘 뉴클레오시드 아미디트들은 유사하게 제조된다.
N2-이소부티릴-6-O-디페닐카바모일-2'-O-(2-에틸아세틸)-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)구아노신-3'-[(2-시아노에틸)-N,N-디이소프로필포스포라미디트]
2'-O-아미노옥시에틸 구아노신 유사체는 디아미노퓨린 리보시드의 선택적 2'-O-알킬레이션에 의해 수득된다. 2'-O-(2-에틸아세틸)다이미노퓨린 리보시드를 최소량의 3'-O-아이조머와 함께 제공하기 위하여 Schering AG (Berlin) 으로부터 디아미노퓨린 리보시드 수 그램의 양을 구매하였다. 2'-O-(2-에틸아세틸) 디아미노퓨린 리보시드는 분해되고, 아데노신 탈아미노효소의 처리에 의해 2'-O-(2-에틸아세틸)구아노신으로 변환되었다(McGee, D. P. C., Cook, P. D., Guinosso, C. J., WO 94/02501 A1 940203).
표준 트로텍션 과정은 2-N-이소부틸릴-6-O-디페닐카바모일-2'-O-(2-하이드록시에틸)-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)구아노신을 제공하기 위하여 감소될 수 있는 2'-O-(2-에틸아세틸)-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)구아노신 및 2-N-이소부티릴-6-O-디페닐카바모일-2'-O-(2-에틸아세틸)-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)구아노신을 제공해야 한다. 이전에 하이드록시 그룹이 미트수노부 반응 (Mitsunobu reaction)을 통 하여 N-하이드록시프탈이미드으로 치환되는 것과 같이, 프로텍트된 뉴클레오시드는 보통 2-N-이소부티릴-6-O-디페닐카바모일-2'-O-([2-프탈미독시]에틸)-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)구아노신-3'-[(2-시아노에틸)-N,N-디이소프로실포스포라미디트] 를 생산하기 위하여 포스피틸레이트(phosphitylate) 될 수 있다.
2'-디메틸아미노에톡시에톡시 (2'-DMAEOE) 뉴클레오시드 아미디트
2'-디메틸아미노에톡시에톡시 뉴클레오시드 아미디트(또한 본 기술 분야에서는 2'-O-디메틸아미노에톡시에틸, 예를 들면, 2'-O-CH2-O-CH2-N(CH2)2, 또는 2'-DMAEOE 뉴클레오시드 아미디트) 은 다음과 같이 제조된다. 다른 뉴클레오시드 아미디트들은 유사하게 제조된다.
2'-O-[2(2-N,N-디메틸아미노에톡시)에틸]-5-메틸 유리딘
2[2-(디메틸아미노)에톡시]에탄올(Aldrich, 6.66 g, 50 mmol)은 100 mL 봄베 내에서 교반하면서, 테트라하이드로퓨란(1 M, 10 mL, 10 mmol) 내의 보란 용액에 서서히 첨가된다. 수소 가스는 고체 용해물에서 발생한다. O2-,2'-안하이드로-5-메틸유리단(1.2 g, 5 mmol), 및 소듐 바이카보네이트(2.5 mg)이 가해지고, 봄베는 밀폐된 후, 오일 배쓰에 위치되어 26 시간 동안 155 ℃ 까지 가열된다. 상기 봄베는 실내온도로 냉각되고 열린다. 크루드 용액은 농축되고 그 잔여물은 물(200 mL) 과 헥산(200 mL) 으로 구획된다. 초과 페놀은 헥산 층으로 추출된다. 수성 층은 에틸 아세테이트(3×200 mL) 로 추출되고, 혼합된 유기층은 우선 물로 세척되고, 무수 소듐 설페이트로 건조되고 농축된다. 잔류물은 메탄올/메틸렌 클로라이드 1:20(2 % 트리에틸아민을 가짐)을 용출제로 사용하는 실리카 겔 상에서 컬럼된다. 컬럼 분류물들은 무색 고체 형태로 농축되고, 이들은 수집되어 백색 고체의 표제 화합물을 제공한다.
5'-O-디메톡시트리틸-2'-O-[2(2-N,N-디메틸아미노에톡시)에틸]-5-메틸 유리딘
무수 피리딘(8 mL) 내의 0.5 g(1.3 mmol) 의 2'-O-[2(2-n,n-디메틸아미노-에톡시)에틸]-5-메틸 유리딘에 대하여, 트리에틸아민(0.36 mL) 및 디메톡시트리틸 클로라이드 (DMT-Cl, 0.87 g, 2 eq.) 이 가해지고 1 시간 동안 교반되었다. 반응 혼합물은 물(200 mL) 에 붓고, CH2Cl2 (2×200 mL)로 추출된다. 혼합된 CH2
Cl2 층은 포화된 NaHCO3 용액으로 세척된 후, 포화된 NaCl 용액으로 세척되고 무수 소듐 설페이트로 건조된다. 용매의 증발 후, MeOH:CH2Cl2:Et3N(20:1, v/v, 1 % 트리에틸아민과 함께)을 이용하는 실리카 겔 크로마토그래피를 함으로써 표제 화합물을 제공한다.
5'-O-디메톡시트리틸-2'-O-[2(2-n,n-디메틸아미노에톡시)-에틸]-5-메틸 유리딘-3'-O-(시아노에틸-N,N-디이소프로필)포스포라미디트
디이소프로실아미노테트라졸이드(0.6 g) 및 2-시아노에톡시-N,N-디이소프로필 포스포라미디트(1.1 mL, 2 eq.)은 아르곤 기체 하에서 CH2Cl2(20 mL)에 용해된 5'-O-디메톡시트리틸-2'-O-[2(2-N,N-디메틸아미노-에톡시)에틸]-5-메틸유리딘(2.17 g, 3 mmol)에 첨가된다. 반응 혼합물은 밤새도록 교반되고 용매는 증발된다. 잔류물은 에틸 아세테이트를 용출제로 하는 실리카 겔 플래쉬 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제되어 표제 화합물을 제공한다.
실시예 2
올리고뉴클레오티드 합성
비치환 및 치환된 포스포다이에스트(P=0) 올리고뉴클레오티드들은 자동화된 DNA 합성기에서(Applies Biosystem model 380B) 요오드에 의해 산화된 표준 포스포라미디트 케미스트리를 이용하여 합성된다.
표준 산화 병을 제외한 포스포다이에스터 올리고튜클레오티드에 대하여포스 합성된 포스포로티오에이트(P=S) 는 아인산염 연결(phosphite linkage)의 순차적 티에이션(thiation)을 위하여 아세토니트릴에서 3H-1,2-벤조디티올-3-원 1,1-디옥사이드의 0.2 M 용액에 의하여 대체되었다. 티에이션 대기 단계는 68초로 연장된 후, 캡핑 단계로 진행되었다. CPG 컬럼으로부터 분열과 55 ℃(18 시간) 에서 농축된 암모늄 하이드록사이드에서 디블록킹 후에, 올리곤뉴클레오티드들은 0.5 M의 NaCl 용액으로부터 2.5 부피의 에탄올로 2 회 침전시킴으로써 정제되었다. 포스피네이트 올리고뉴클레오티드들은 본 발명에서 참조된 미국 특허 제5,508,270호에 따라 제조된다.
알킬 포스포네이트 올리고뉴클레오티드들은 본 발명에서 참조된 미국 특허 4,469,863호에 따라 제조되었다.
3'-데옥시-3'-메틸렌 포스포네이트 올리고뉴클레오티드들은 본 발명에서 참조된 미국 특허 제5,610,289호 또는 5,625,050호에 따라 제조되었다.
포스포라미디트 올리고뉴클레오티드들은 본 발명에서 참조된 미국 특허 제5,256,775호 또는 미국 특허 제5,366,878호에 따라 제조되었다.
알킬포스포노티오에이트 올리고뉴클레오티드들은 본 발명에 참조된 PCT 출원 PCT/US94/00902 및 PCT/US93/06976 (WO 94/17093 및 WO 94/02499 로 공개된) 에 따라 제조되었다.
3'-데옥시-3'-아미노 포스포라미데이트 올리고뉴클레오티드들은 본 발명에서 참조된 미국 특허 제5,476,925호에 따라 제조되었다.
포스포트리에스터 올리고뉴클레오티드들은 본 발명에서 참조된 미국 특허 제5,023,243호에 따라 제조되었다.
보라노 포스페이트 올리고뉴클레오티드들은 본 발명에서 참조된 미국 특허 제5,130,302호 및 제5,177,198호에 따라 제조되었다.
실시예 3
올리고뉴클레오시드 합성
메틸렌메틸이미노 연계된 올리고뉴클레오시드들은 MMI 연계된 올리고뉴클레오시드과 동일하다고 확인되었고, 메틸렌디메틸-하이드라조 연계된 올리고뉴클레오시드들은 MDH 연계된 올리고뉴클레오시드와 동일한 것으로 확인되었으며, 메틸렌카 보닐아미노 연계된 올리고뉴클레오시드들은 아미드-3 연계된 올리고뉴클레오시드들과 동일한 것으로 확인되었고 메틸렌아미노카보닐 연계된 올리고뉴클레오시드들은 본 발명에서 참조된 미국 특허 제5,378,825호, 제5,386,023호, 제5,489,677호, 제5,602,240호, 및 제5,610,289호에 따라 제조된 MMI와 P=O, 또는 P=S 결합 중 선택된 하나를 가지는 혼합된 백본 화합물 뿐만 아니라 아미드-4 연계된 올리고뉴클레오시드와 동일한 것으로 확인되었다.
포름아세탈 및 티오포름아세탈과 연계된 올리고뉴클레오시드들은 미국 특허 제5,264,562호 및 제5,264,564호에 따라 제조되었다.
에틸렌 옥사이드 연계된올리고뉴클레오시드들은 본 발명에서 참조된 미국 특허 제5,223,618호에 따라 제조되었다.
실시예 4
PNA 합성
펩타이드 핵산들(PNAs) 은 Peptide Nucleic Acids(PNA) : Systhesis, Propertiew and Potential Applications, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 1996, 4, 5-23, 에 언급된 다양한 공정들에 따라 제조된다. 그들은 또한 본 발명에 참조된 미국 특허 제5,539,082호, 제5,700,922호 및 제5,719,262호에 따라 제조될 수 있다.
실시예 5
키메라 올리고뉴클레오티드들의 합성
본 발명의 키메라 올리고뉴클레오티드들, 올리고뉴클레오시드들 또는 혼합된 올리고뉴클레오티드들/올리고뉴클레오시드들은 몇 가지 다른 형태로 존재할 수 있다. 이것들은 연결된 뉴클레오시드들의 "갭(gap)" 단편이 연결된 뉴클레오시드들의 5' 및 3' "윙(wing)" 단편의 사이에 위치하는 첫 번째 형태와, "갭" 단편이 올리고머 화합물의 3' 또는 5' 말단 중의 어느 하나에 위치하는 두 번째 형태 "오픈 엔드"를 포함한다. 첫 번째 형태의 올리고뉴클레오티드들은 이 기술분야에서 "갭머(gapmers)" 또는 갈라진 올리고뉴클레오티드들(gapped oligonucleotides)로 알려져 있다. 두 번째 형태의 올리고뉴클레오티드들은 또한 이 기술분야에서 "헤미머(hemimers)" 또는 "윙머(wingmers)" 로 알려져 있다.
[2'-O-Me]--[2'-데옥시]--[2'-O-Me] 키메라 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드
2'-O-알킬 포스포로티오에이트 및 2'-데옥시 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드 단편들을 가진 키메라 올리고뉴클레오티드들은 상기와 같이 Applied Biosystems automated DNA synthesizer Model 380B를 이용하여 합성되었다. 올리고뉴클레오티드들은 자동 합성기, DNA 일부를 위한 2'-데옥시-5'-디메톡시트리틀-3'-O-포스포라미디트와 5'와 3' 윙을 위한 5'-디메톡시트리틸-2'-O-메틸-3'-O-포스포라미디트를 이용하여 합성된다. 표준 합성 사이클은 테트라졸의 전달 후에 증가된 대기 단계와 베이스를 RNA에 대하여 4회, 2'-O-메틸에 대하여 2회 600s 반복 (repeat)으로 증가되도록 수정되었다. 완전히 프로텍트된 올리고뉴클레오트드는 지지체에서 분리되고 포스페이트 그룹은 실내 온도에서 밤새도록 암모니아/에탄올 3:1에서 디프로텍트된 후 동결건조된다. 모든 베이스를 디프로텍트 하기 위하여 메탄올 암모니아에서의 처리가 실내온도에서 24 시간 동안 행해지고, 샘플은 다시 동결건조되었다. 펠렛은 2' 위치를 디프로텍트하기 위하여 실내 온도에서 24 시간 동안 THF 내의 1 M TBAF 에서 재현탁된다. 반응은 1 M TEAA로 제지되고 샘플은 G25 크기 익스클루젼 컬럼 상에서 탈염되기 전에 로토박에 의해 1/2 부피로 감소된다. 회수된 올리고는 모세관 전기영동과 질량 분석법에 의하여 수율과 순도에 대하여 분광학적으로 분석된다.
[2'-O-(2-메톡시에틸)]-0[2'-데옥시]--[2'-O-(메톡시에틸)] 키메라 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드
[2'-O-(2-메톡시에틸)]-0[2'-데옥시]--[2'-O-(메톡시에틸)] 키메라 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드들은 2'-O-메틸 키메라 올리고뉴클레오티드에 대한 상기 공정에서 2'-O-메틸 아미디트를 2'-O-(메톡시에틸)아미디트으로 교체하여 제조하였다.
[2'-O-(2-메톡시에틸) 포스포디에스터]--[2'-데옥시 포스포로티오에이트]--[2'-O-(2-메톡시에틸) 포스포디에스터] 키메라 올리고뉴클레오티드
[2'-O-(2-메톡시에틸) 포스포디에스터]--[2'-데옥시 포스포로티오에이트]-- [2'-O-(2-메톡시에틸) 포스포디에스터] 키메라 올리고뉴클레오티드들은 2'-O-메틸 키메라 올리고뉴클레오티드에 대한 상기 공정에서 2'-O-메틸 아미디트를 2'-O-(메톡시에틸)아미디트으로 교체하고, 키메라 구조의 윙 부위 내에 포스포디에스터 뉴클레오티드 결합을 발생시키기 위하여 요오드로 산화시키며, 중앙 갭에 대한 포스포로티오에이트 뉴클레오티드 결합을 발생시키기 위하여 3,H-1,2 벤조디티올-3-원 1,1 다이옥사이드 (Beaucage Reagent) 를 이용하여 유황화(sulfurization)함으로써 제조하였다.
다른 키메라 올리고뉴클레오티드들, 키메라 올리고뉴클레오시드들 및 혼합된 키메라 올리고뉴클레오티드들/올리고뉴클레오시드들은 본 발명에서 참조된 미국 특허 5,623,065호에 따라 제조된다.
실시예 6
올리고뉴클레오티드 분리
조절된 포어 글래스 컬럼(Applied Biosystem)에서 분리되고 농축된 암모늄 하이드록사이드에서 18 시간 동안 55 ℃ 에서 디블로킹된 후, 올리고뉴클레오티드들 또는 올리고뉴클레오시드들은 2.5 부피 에탄올과 함께 0.5 M NaCl로 2회 침전으로 정제된다. 합성된 올리고뉴클레오티드들은 디네이쳐링 겔(denaturing gel) 상에 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분석되었고, 적어도 85 % 전체길이인 것으로 판단되었다. 합성에서 획득된 포스포로티오에이트 및 포스포디에스터 결합의 상대적 량은 32P 핵자기 공명 분광기에 의해 정기적으로 검사되었고, 어떤 연구들을 위하여 올리고뉴클레오티드들은 Chiang et al., J. Biol. Chem. 1991, 266, 18162-18171에 기술된 것과 같이 HPLC에 의해 정제되었다.
실시예 7
올리고뉴클레오티드 합성 - 96 웰 플레이트 포맷
올리고뉴클레오티드들은 표준 96 웰 포맷에서 96 개 서열들을 동시에 모을 수 있는 자동화된 합성기에서 고체상 P(Ⅲ) 포스포라미디트 케미스트리를 통하여 합성되었다. 포스포디에스터 뉴클레오티드간 결합은 수용성 요오도로 산화함으로써 공급되었다. 포스포로티오에이트 뉴클레오티드 결합들은 무수 아세토니트릴에서 3,H-1,2 벤조디티올-3-원 1,1 디옥사이드 (Beaucage Reagent)를 이용하여 유황화함으로써 생성되었다. 표중 베이스-프로텍트된 베타-시아노에틸디이소프로필 포스포라미디트들은 통상의 벤더 (예를 들면, PE-Appled Biosystem, Foster City, CA, 또는 Pharmacia, Piscataway, NJ) 들로부터 구입되었다. 비-표준 뉴클레오시드들은 알려진 문헌 또는 특허된 방법들에 의해 합성되었다. 그들은 베이스-프로텍트된 베타-시아노에틸디이소프로실 포스포라이디트들로 이용된다.
올리고뉴클레오티드들은 12-16 시간 동안 높은 온도에서 (55-60 ℃) 지지체로부터 분리되고 농축된 NH4OH로 디프로텍트되며, 방출된 생성물은 진공 내에서 건조되었다.
건조된 생성물은 멸균수에 재-부유되어 모든 분석적 및 테스트 플레이트 샘플들이 로봇식 피펫터를 이용하여 희석되는 마스터 플레이트를 제공한다.
실시예 8
올리고뉴클레오티드 분석 - 96 웰 플레이트 포맷
각 웰의 올리고뉴클레오티드의 농도는 샘플의 희석과 UV 흡광기에 의하여 측정되었다. 각 생산물의 전체길이는 96 웰 포맷(Beckman P/ACETM MDQ) 또는, 각각 준비된 샘플에 대하여 통상의 CE 장치 위에 (예를 들면, Beckman P/ACETM 5000, ABT 270) 모세관 전기영동(CE) 에 의하여 평가된다. 베이스와 백본 조성물은 일렉트로스프레이-매스 분광기를 사용한 화합물의 질량 분석에 의하여 확인되었다. 모든 분석 검사 플레이트들은 하나 그리고 다수- 채널의 로봇식 피펫터를 이용하여 마스터 플레이트에서 희석되었다. 플레이트들은 화합물의 적어도 85 %가 적어도 85 % 마이크로에멀젼이라면 수용될 수 있는 것으로 판단되었다.
실시예 9
세포 배양과 올리고뉴클레오티드 처리
표적 핵산 발현에 대한 안티센스 화합물의 효과는 제공되는 표적 핵산이 측정 가능한 농도로 존재하는 다양한 세포 형태의 어느 것에서도 검사될 수 있다. 이것은 상투적으로 정해져 있는 용법, 예를 들면, PCR 또는 노턴 블랏 분석법이 될 수 있다. 다음의 4개의 세포 형태는 예시적인 목적으로 제공되지만, 표적이 선택된 세포 형태에서 발현되는 것이 제공되는 다른 세포 형태들도 일상적으로 사용될 수 있다. 이것을 본 기술에서 일상적으로 방법에 의해 정해질 수 있고, 예를 들면 노턴 블랏 분석법, 리보뉴클리에이즈 프로텍션 에세이, 또는 RT-PCR 이 있다.
T-24 세포:
인간 트랜지셔날 셀 블래이더 칼시노마 셀 라인 T-24는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC)(Manassas, VA) 로 부터 입수되었다. T-24 세포들은 10 % 페이탈 칼프 시럼(Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD), mL 당 페니실린 100 유니트, mL 당 스트렙토마이신 100 마이크로그램 (Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD) 이 공급된 컴플리트 맥코이스 5A 베이션 미디어(complete McCoy's 5A basal media) (Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD) 에서 통상적으로 배양되었다. 세포들은 그것들이 90 % 컨플루언스(confluence)에 도달했을 때 트립시니제이션(trypsinization)과 희석에 의하여 통상적으로 통과되었다. 세포들은 96-웰 플레이트(Falcon-Primaria #3872) 에 RT-PCR 분석의 사용을 위한 7000 셀/웰 밀도로 시드되었다.
노턴 블랏팅 또는 다른 분석법을 위하여, 세포들은 100 mm 또는 다른 표준 조직 배양 플레이트에 시드되어, 유사하게 처리될 수 있고, 이들은 적절한 부피의 미디움과 올리고뉴클레오티드를 이용한다.
A549 세포:
인간 렁 칼시노마 셀 라인 A549는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC)(Manassas, VA) 로 부터 입수되었다. A549 세포들은 10 % 페이탈 칼프 시럼(Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD), mL 당 페니실린 100 유니트, mL 당 스트렙토마이신 100 마이크로그램(Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD)이 공급된 DMEM 배이셜 미디어 (Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD) 에서 통상적으로 배양되었다. 세포들은 그것들이 90 % 컨플루언스(confluence)에 도달했을 때 트립시니제이션(trypsinization)과 희석에 의하여 통상적으로 통과되었다.
NHDF 세포:
인간 네오나탈 더말 피브로블라스트(NHDF)는 클레오네틱스 코포레이션(Walkersville MD) 에서 입수되었다. NHDFs는 공급자에 의해 추천된 대로 공급된 피브로블라스트 성장 배지(Clonetics Corporation, Walkersville MD) 에서 통상적으로 유지되었다. 세포들은 공급자에 의해 추천된 10 passages 동안 유지되었다.
HEK 세포:
인간 엠브로닉 케라티노사이트(HEK)은 클로네틱스 코포레이션 (Walkersville MD)에서 입수되었다. HEKs는 공급자에 의해 추천된 대로 제조된 케라티오사이트 성장 배지(Clonetics Corporation, Walkersville MD)에서 통상적으로 유지되었다. 세포들은 공급자에 의해 추천된 10 passages 동안 유지되었다.
안티센스 화합물로 처리:
세포의 80 % 컨플루언시에 도달했을 때, 그들은 올리고뉴클레오티드로 처리되었다. 96-웰 플레이트에서 배양된 세포들에 대하여, 세포들은 200㎕ OPTI-MEMTM-1 감소된 시럼 미디움(Gibco BRL)으로 한번 세척된 후, 3.75 ㎍/㎖ LIPOFECTINTM (Gibco BRL) 및 바람직한 농도의 올리고뉴클레오티드를 함유하는 130 ㎕의 OPTI-MEMTM-1 으로 처리되었다. 4-7 시간 처리 후, 배지는 새로운 배지로 교체되었다. 세포들은 올리고뉴클레오티드 처리 후, 16-24 시간 경과하여 채취되었다.
이용된 올리고뉴클레오티드의 농도는 세포 라인에서 세포 라인까지 다양하다. 특별한 세포 라인에 대한 적절한 올리고뉴클레오티드 농도를 결정하기 위하여, 세포들은 농도의 범위에서 파지티브 컨트롤 올리고뉴클레오티드로 처리된다. 인간 세포에 대하여 파지티브 컨트롤 올리고뉴클레오티드는 ISIS 13920, TCCGTCATCGCTCCTCAGGG, 서열 번호: 1, 인간 H-ras 에 표적된 포스포로티오에이트 백본이 있는 2'-O-메톡시에틸 갭머(굵게 나타낸 2'-O-메톡시에틸) 이다. 마우스 또는 랫(rat) 세포에 대하여, 파지티브 콘트롤 올리고뉴클레오티드는 ISIS 15770, ATGCATTCTGCCCCCAAGGA, 서열 번호: 2, 마우스 및 랫 c-raf 에 표적된 포스포로티오에이트 백본이 있는 2'-O-메톡시에틸 갭머(굵게 나타낸 2'-O-메톡시에틸) 이다. c-Ha-ras (ISIS 13920 에 대하여) 또는 c-raf(ISIS 15770 에 대하여) mRNA의 80 % 저해를 초래하는 파지티브 컨트롤 올리고뉴클레오티드의 농도는 상기 세포 라인에 대 한 연속되는 실험에서 새로운 올리고뉴클레오티드에 대한 스크린 농도로 이용된다. 80 % 저해가 획득되지 않는다면, H-ras 또는 c-raf mRNA 의 60 % 저해를 초래하는 파지티브 컨트롤 올리고뉴클레오티드의 가장 낮은 농도는 상기 세포 라인에 대한 연속되는 실험에서 올리고뉴클레오티드에 스크린 농도로 이용된다. 60 % 저해가 획득되지 않는다면, 상기 특별한 세포 라인은 올리고뉴클레오티드 트랜스펙션 실험에 적절하지 않은 것으로 생각된다.
실시예 10
인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 6 발현의 올리고뉴클레오티드 저해의 분석
인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 6 발현의 안티센스 저절은 본 기술 분야에서 알려진 다양한 방법으로 분석될 수 있다. 예를 들면, 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 5 mRNA 농도는 예를 들면, 노턴 블랏 분석법, 컴피터티브 폴리머라제 체인 리액션(PCR), 또는 리얼-타임 PCR(RT-PCR) 에 의해서 정량될 수 있다. 리얼-타임 콴티터티브(real-time quantitative) PCR이 바람직하다. RNA 분석은 전체 세포적 RNA 또는 폴리(A)+mRNA 상에서 수행될 수 있다. RNA 분리의 방법은 예를 들면, Ausubel. F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Volume 1, pp. 4.1.1-4.2.9 및 4..5.1-4..5.3, John Wiley & Sons, Inc., 1993. 에 나타나있다. 노턴 블랏 분석법은 본 기술 분야에서 일반적이며 예를 들면, Ausubel. F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Volume 1, pp. 4.2.1-4.2.9, John Wiley & Sons, Inc., 1996. 에 나타나있다. 리얼-타임 콴티터티브(PCR) 은 통상적으로 이용되는 ABI PRISMTM 7700 시퀀스 디텍션 시스템을 이용하여 통상적으로 수행될 수 있고, 이것은 PE-Applied Biosystem, Foster City, CA 로부터 이용가능하고 제조업자의 지시에 따라 이용된다.
인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 5의 단백질 농도는 면역 침강, 웨스턴 블랏 분석법(이뮤노블랏팅), ELISA 또는 형광-활성 세포 분리법 (FACS) 과 같은 본 기술 분야에서 잘 알려진 다양한 방법으로 정량될 수 있다. 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 5에 대한 항체들이 동정될 수 있고, 항체의 MSRS 카탈로그 (Aerie Corporation, Birmingham, MI), 또는 전통적인 항체 생성 방법을 통하여 제조될 수 있는, 다양한 공급원으로부터 획득될 수 있다. 폴리클로날 항혈청의 제조방법은 예를 들면, Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Volumn 2, pp. 11.12.1- 11.12.9, John Wiley & Sons, Inc., 1997, 에 나타나있다.
면역침전법은 본 기술 분야에서 일반적으로 사용되고, 예를 들면 Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Volumn 2, pp. 10.8.1- 10.8.21, John Wiley & Sons, Inc., 1997, 효소-결합된 면역흡착 분석법(ELISA) 는 본 기술 분야에서 일반적으로 사용되고, 예를 들면 Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Volumn 2, pp. 11.2.1- 11.2.22, John Wiley & Sons, Inc., 1991,
실시예 11
폴리(A) + mRNA 분리
폴리(A) + mRNA는 Miura et al., Clin. Chem., 1996, 42, 1758-1764 에 따라 분리되었다. 폴리(A) + mRNA 분리에 대한 다른 방법들은 Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Volumn 1, pp. 4.5.1-4.5.3, John Wiley & Sons, Inc., 1991, 에 나타나있다. 요약하면 96-웰 플레이트에서 배양된 세포에 대하여, 성장배지세포로부터 제거되고 각 웰은 200??L의 저온 PBS로 세척되었다. 60 μL 용해 버퍼 (10 mM Tris-HCl, pH 7.6, 1mM EDTA, 0.5 M NaCl, 0.5 % Np-40, 20 mM 바나딜-리보뉴클레오시드 복합체) 가 각 웰에 가해지고, 그 플레이트는 서서히 교반되고 실내온도에서 5 분간 인큐베이트되었다. 55 ㎕의 용해물이 올리고 d(T) 코우티드 96-웰 플레이트(AGCT Inc., Irvine CA) 에 옮겨졌다. 플레이트들은 60 분간 실내온도에서 인큐베이트되고, 200 ㎕ 의 워시 버퍼(10 mM Tris-HCl pH 7.6, 1 mM EDTA, 0.3 M NaCl) 로 3회 세척되었다. 마지막 세척 후, 플레이트는 초과된 워시 버퍼를 wrj하기 위하여 종이 타월 위에서 블랏된 후, 5 분간 공기 건조되었다. 70 ℃로 예열된 60 ㎕ 의 용출 버퍼(5 mM Tris-HCl pH 7.6) 가 각 웰에 가해지고, 플레이트는 5 분간 90 ℃ 핫 플레이트 상에서 인큐베이트되고, 용출액은 새로운 96-웰 플레이트에 옮겨졌다.
100 nm 또는 다른 표준 플레이트 상에서 배양된 세포들은 총 용액의 적절한 부피를 이용하여 유사하게 처리될 수 있다.
실시예 12
전체 RNA 분리
전체 RNA는 다음과 같은 제조업자가 추천한 공정에 따라 Qiagen Inc.(Valencia CA)에서 구입한 RNEASY 96TM 키트와 버퍼를 이용하여 분리되었다. 요약하면 96-웰 플레이트 상에서 배양된 세포에 대하여, 성장배지는 세포로부터 제거되고 각 웰은 각 웰은 200 ㎕의 저온 PBS로 세척되었다. 100 ㎕ 버퍼 RLT가 각 웰에 가해지고, 그 플레이트는 20 초간 격렬하게 교반되었다. 100㎕의 70 % 에탄올이 각 웰에 가해지고, 그 내용물은 3회 상하로 피펫팅하여 혼합하였다. 샘플은 오물 수집 트레이에 적합한 QIAVACTM 매니폴드(manifold)에 부착되고 진공 공급원에 부착된 RNEASY 96TM 웰 플레이트로 옮겨졌다. 진공은 15 초 동안 적용되었다. 1mL의 버퍼 RW1은 RNEASY 96TM 플레이트의 각 웰에 가해지고 진공은 다시 15 초간 적용되었다. 1mL의 버퍼 RPE는 RNEASY 96TM 플레이트의 각 웰에 가해지고 진공은 다시 15 초간 적용되었다. 버퍼 RPE 워시가 반복되고 진공은 부가적으로 10 분 동안 적용되었다. 플레이트는 QIAVACTM 매니폴드로부터 제거되고 블랏팅하여 종이 타올 위에서 건조하였다. 플레이트는 1.2 mL 콜렉션 튜브를 포함하는 콜렉션 튜브 랙(collection tube rack)에 적합한 QIAVACTM 매니폴드에 재-부착되었다. RNA는 60㎕의 물을 각 웰에 넣어 피펫팅하고, 1 분간 인큐베이트한 후, 30 초간 진공에 적용함으로써 용리된다. 용리 단계는 부가적인 60 ㎕의 물로 반복되었다.
반복적인 피펫팅과 용리 단계는 QUIGEN Bio-Robot 9604(Qiagen, Inc., Valencia CA) 을 이용하여 자동화될 수 있다. 필수적으로, 배양 플레이트 상에서 세포를 용해한 후, 플레이트는 피펫팅, DNase 처리 및 용리 단계가 수행되는 로봇 데크로 이동된다.
실시예 13
인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 5 mRNA 농도의 리얼-타임 콴티터티브 PCR 분석법
인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 5 mRNA 농도의 정량은 제조업자의 지시에 따라 ABI PRISNTM 7700 시퀀스 디텍션 시스템 (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) 을 이용한 리얼 타임 콴티터티브 PCR 에 의해서 결정되었다. 이것은 리얼-타임 내에 폴리머레이즈 체인 리액션 (PCR) 생성물의 높은 처리량을 허용하는 폐쇄된-튜브, 비-겔-기재의, 형광 감지 시스템이다. 표준 PCR에 반대로, 증폭 결과물은 PCR이 완료된 후에 정량되고, 리얼 타임 콴티터티브 PCR 내의 결과물들은 그들이 축적된 대로 정량된다. 이것은 PCR 반응에서 포워드(forward)와 리벌스(reverse) PCR 프라이머 사이를 특이적으로 연결하는 올리고뉴클레오티드 프로브를 포함하여 수행되고, 두 개의 형광 색소를 함유한다. 리포터 다이 (예를 들면, Operon Technologies Inc., Alameda, CA 또는 PE-Applied Biosystems, Foster City, CA 에서 입수한 JOE, FAM, 또는 VIC) 는 프로브의 3' 말단에 부착된다. 프로브와 다이가 손상되지 않을 때, 리포터 다이 방사는 3' 컨쳐(quencher) 다이의 접근에 의해 꺼진다. 증폭되는 동안, 표적 서열에 대한 프로브의 어닐링(annealing)은 Taq 폴리머라제의 5'-엑소뉴클레아제 활성에 의해 잘릴 수 있는 기질을 만든다. PCR 증폭 사이클의 연장(extension) 단계 동안, Taq 폴리머라제에 의한 프로브의 절단은 프로브의 남은 부분에서(그리고 컨쳐 부분으로부터) 리포터 다이를 방출하고, 서열-특이적 형광 신호가 발생한다. 각 사이클마다, 첨가되는 리포터 다이 분자들은 그들의 각각의 프로브에서 절단되고 형광 강도는 ABI PRISMTM 7700 Sequence Detection System에 설치된 레이저 렌즈에 의하여 일정한 간격으로 감시된다. 각 분석에서, 처리되지 않은 대조구 샘플 출처의 mRNA의 연속적인 희석을 포함하는 일련의 병렬(pararrel) 반응은 검사 시료의 안티센스 올리고뉴클레오티드 처리 후에 저해 퍼센트를 정량하기 위하여 사용되는 표준 곡선을 발생시킨다.
콴티터티브 PCR 분석 이전에, 측정될 표적 유전자에 특이적인 프라이머-프로브 세트들은 GAPDH 증폭 반응으로 "멀티플렉스"되는 그들의 능력에 대하여 평가되었다. 멀티플렉스에서, 표적 유전자와 내부 표준 유전자 GAPDH 둘 다 하나의 시료에서 동시에 증폭된다. 이 분석에서, 처리되지 않은 세포에서 분리된 mRNA는 연속적으로 희석된다. 각 희석은 GAPDH 에만 특이한 프라이머-프로브 세트, 표적 유전자만("싱글-플렉싱"), 또는 둘 다(멀티플렉싱) 의 존재 하에서 증폭된다. PCR 증폭 후, 희석의 함수로서 GAPDH과 표적 mRNA 신호의 표준 곡선은 싱글-플레스와 멀티플레스된 시료 모두에서 발생된다. GAPDH와 표적 신호에서 발생되는 기울기와 상관계 수 둘다가 싱글-플렉스된 시료에서 발생되는 그들의 해당 값의 10 % 내 멀티플렉스된 시료 폴에서 발생된다면, 상기 표적에 특이한 프라이머-프로브 세트는 멀티플렉스 가능한 것으로 생각된다. PCR의 다른 방법들은 또한 본 기술 분야에서 알려져 있다.
PCR 시약들은 PE-Applied Biosystems, Foster City, CA에서 입수되었다. RT-PCR 반응은 25 ㎕ 전체 RNA를 함유하는 96 웰 플레이트에 25 ㎕ PCR 칵테일(1×TAQMANTM 버퍼 A, 5.5 mM MgCl2, dATP, dCTP 및 dGTP 의 각 300 ㎛, dUTP 600 ㎛ 포워드 프라이머, 리버스 프라이머 및 프로브의 각각 100 nM, RNAse 저해제 20 유닛, AMPLITAQ GOLDTM 1.25 유닛, MuLV 역전사효소 12.5 유닛) 을 가함으로써 수행되었다. RT 반응은 48 ℃에서 30 분간 인큐베이트 함으로써 수행되었다. AMPLITAQ GOLDTM을 활성화시키기 위하여 95 ℃에서 10 분 인큐베이트한 다음, 두 단계 PCR 프로토콜 40 사이클이 수행되었다: 15 초간 95 ℃(변성) 으로 유지하고, 1.5 분 동안 60 ℃(어닐링/연장) 로 유지하였다.
리얼 타임 RT-PCR에 의해 얻어진 유전자 표적량은 발현이 일정한 GAPDH, 유전자의 발현 농도를 사용함으로써, 또는 RoboGreenTM(Molecular Probes, Inc, Eugene, OR)을 이용하여 전체 RNA를 정량함으로써 표준화된다. GAPDH 발현은 표적과 함께 동시에 가동하는 멀티플렉싱으로, 또는 분리하여 가동함으로써 리얼 타임 RT-PCR에 의해 정량된다. 전체 RNA는 Molecular Probes의 RoboGreenTM RNA정량 시액 을 사용하여 정량된다. RoboGreenTM에 의한 RNA 정량방법은 Jones, L.J., et al, Analytical Biochemistry, 1998, 265, 368-374 에 나타나있다.
이 분석에서, 175㎕의 RoboGreenTM 작용 시약(10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 7.5에서 1:2865로 희석된 RoboGreenTM 시약)은 25 ㎕의 정제된 세포 RNA를 함유하는 96-웰 플레이트에 피펫된다. 상기 플레이트는 480 nm에서 자극되고 520 nm에서 방사되어 CytoFluor 4000(PE Applied Biosystems) 에서 판독된다.
인간 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 5에 대한 프로브와 프라이머는 공지된 서열 정보(GenBank accession number M65062, 서열 번호 3으로 기재됨)를 이용하여 인간 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 5 서열에 혼성화되도록 고안되었다. 인간 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 5에 대한 PCR 프라이머는:
forward 프라이머: CCAAACACACCCGCATCTC (서열 번호 4)
reverse 프라이머: TTGGACTGGGTCAGCTTCTTTC (서열 번호 5) 및
PCR probe는: FAM-AGGCTGAAGCAGTGAAGAAGGACCGC-TAMRA (서열번호 6), 상기 FAM(PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) 및 TAMRA(PE-Applied Biosystems, Foster City, CA)은 컨쳐 다이(quencher dye)이다. 인간 GAPDH 및 PCR 프라이머는:
forward primer: GAAGGTGAAGGTCGGAGTC (서열 번호 7)
reverse primer: GAAGATGGTGATGGGATTTC (서열 번호 8) 및
PCR probe는: 5' JOE-CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC- TAMRA 3' (서열 번호 9), 상기 JOE(PE-Applied Biosystems, Foster City, CA)는 형광 리포터 다이이고 TAMRA(PE- Applied Biosystems, Foster City, CA)는 컨쳐 다이이다.
실시예 14
인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 5 mRNA 농도의 노턴 블랏 분석
안티센스 처리 후 18 시간 경과하여 세포 단층은 찬 PBS로 2회 세척되고 1 mL RNAZOLTM(TEL-TEST "B" Inc., Friendswood, TX) 에서 용해되었다. 전체 RNA는 제조업자의 추천된 프로토콜에 따라 준비되었다. 전체 RNA의 20 마이크로그램은 MOPS 버퍼 시스템(AMRESCO, Inc. Solon, OH) 을 사용하는 1.1 % 포름알데하이드를 포함하는 1.2 % 아가로스 겔에 전기영동함으로써 분획되었다. RNA는 노턴/서든 트랜스퍼 버퍼 시스템 (TEL-TEST "B" Inc., Friendswood, TX) 을 이용하고 밤새 모세관 트랜스퍼에 의하여 겔에서 HYBONDTM-N+ 나일론 멤브레인(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)으로 옮겨졌다. RNA 트랜스퍼는 UV 가시화에 의하여 확인되었다. 멤브레인들은 STARTALINKERTM UV Crosslinker 2400(Stratagene, Inc, La Jolla, CA)를 이용한 UV 교차-결합을 이용하여 고정되고, 엄격한 조건을 위한 제조업자의 권고를 이용하여 QUICKHYBTM 혼성화 용액(Stratagene, La Jolla, CA)을 이용하여 프로브되었다.
인간 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 5를 탐지하기 위하여, 인간 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 5 특이적 프로브가 forward 프라이머 CCAAACACACCCGCATCTC(서열 번호 4) 및 reverse 프라이머 TTGGACTGGGTCAGCTTCTTTC(서열 번호 5)을 이용하는 PCR에 의하여 준비되었다. 로딩과 트랜스퍼 효율의 편차를 표준화하기 위하여 막이 제거되고 인간 글리세라알데하이드-3-포스페이트 디하이드로게나제(GAPDH) RNA(Clontech, Palo Alto, CA)에 대하여 프로브되었다.
혼성화된 멤브레인들은 PHOSPHRIMAGERTM 및 IMAGEQUANTTM 소프트웨어 V3.3(Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA)을 이용하여 가시화되고 정량되었다. 데이터들은 처리되지 않은 대조군에서 GAPDH 농도에 따라 표준화되었다.
실시예 15
2'-MOE 윙과 데옥시 겝을 가지는 키메라 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드에 의한 인간 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 5 발현의 안티센스 저해
본 발명에 따르면, 일련의 올리고뉴클레오티드들은 공지된 서열들을 이용하여(본 발명의 서열 번호 10으로 기재된 GenBank accession number NM_000599, 본 발명의 서열 번호 11로 기재된 GenBank accession number AC007563의 135001-156000 부분, 본 발명의 서열 번호 12로 기재된 GenBank accession number AF147308) 인간 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 5 RNA의 다른 부위를 표적하기 위하여 고안되었다. 올리고뉴클레오티드들은 표 1에 나타내었다. "표적 부위"는 올리고뉴클레오티드가 결합하는 특이적 표적 서열에 첫 번째(5'-most) 뉴클레오티드 번호를 지시한다. 표 1의 모든 화합물들은 20 뉴클레오티드 길이의 키메라 올리고뉴클레오티드들("갭머") 이고, 이들은 5개 뉴클레오티드 "윙"이 양쪽(5' 와 3' 방향으로)에 연결된 10개 2'-데옥시뉴클레오티드들로 구성된 중앙 "갭" 부위로 구성되어 있다. 윙들은 2'-메톡시에틸(2'-MOE)뉴클레오티드들로 구성되어 있다. 뉴클레오시드간(backbone) 결합은 올리고뉴클레오티드의 처음부터 끝까지 포스포로티오에이트(P=S) 이다. 모든 시티딘 잔기들은 5-케틸시티딘들이다. 상기 화합물들은 본 발명의 다른 실시예에서 기술된 콴티터티브 리얼-타임 PCR 에 의한 인간 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 5 mRNA 농도에 대한 그들의 효과를 위하여 분석되었다. 데이터는 2가지 실험들로부터의 평균치이다. "N.D."는 "no data"를 지시하는 것이다.
ISIS번호 | 부위 | 표적 서열 번호 | 표적 부위 | 서열 | 저해 % | 서열 번호 |
154897 | 시작 코돈 | 3 | 36 | gagcaacaccatcttctctt | 87 | 13 |
154898 | 코딩 | 3 | 65 | taggcggccagcagcaggag | 72 | 14 |
154899 | 코딩 | 3 | 299 | gcgtgcagcggcttctcctc | 69 | 15 |
154900 | 코딩 | 3 | 306 | cagcagggcgtgcagcggct | 78 | 16 |
154901 | 코딩 | 3 | 333 | ttcgttgaggcaaaccccgc | 50 | 17 |
154902 | 코딩 | 3 | 338 | ctcttttcgttgaggcaaac | 67 | 18 |
154903 | 코딩 | 3 | 342 | gtagctcttttcgttgaggc | 87 | 19 |
154904 | 코딩 | 3 | 497 | tttctgcggtccttcttcac | 12 | 20 |
154905 | 코딩 | 3 | 503 | agcttctttctgcggtcctt | 90 | 21 |
154906 | 코딩 | 3 | 511 | actgggtcagcttctttctg | 43 | 22 |
154907 | 코딩 | 3 | 518 | aacttggactgggtcagctt | 79 | 23 |
154908 | 코딩 | 3 | 580 | cctgtctcatctcaggtgca | 62 | 24 |
154909 | 코딩 | 3 | 651 | catgcgtgggctggctttga | 78 | 25 |
154910 | 코딩 | 3 | 656 | ggcaccatgcgtgggctggc | 76 | 26 |
154911 | 코딩 | 3 | 676 | tgggcaggtacacagcacgg | 82 | 27 |
154912 | 코딩 | 3 | 698 | tagaatcctttgcggtcaca | 72 | 28 |
154913 | 코딩 | 3 | 703 | tcttgtagaatcctttgcgg | 56 | 29 |
154914 | 코딩 | 3 | 709 | gctttctcttgtagaatcct | 57 | 30 |
154915 | 3'UTR | 3 | 986 | gtcctcagtttcctcaaata | 74 | 31 |
154916 | 3'UTR | 3 | 991 | ccgaggtcctcagtttcctc | 89 | 32 |
154917 | 3'UTR | 3 | 996 | agattccgaggtcctcagtt | 87 | 33 |
154918 | 3'UTR | 3 | 1001 | gctagagattccgaggtcct | 89 | 34 |
154919 | 3'UTR | 3 | 1006 | cccttgctagagattccgag | 94 | 35 |
154920 | 3'UTR | 3 | 1186 | cctaactctattcgtctttc | 61 | 36 |
154921 | 3'UTR | 3 | 1394 | ggagaggtcctggagtgttt | 0 | 37 |
154922 | 3'UTR | 3 | 1579 | gatctgcttccgaaaacctc | 86 | 38 |
154923 | 5'UTR | 10 | 11 | ctttgcagctctttcctagc | 80 | 39 |
154924 | 5'UTR | 10 | 584 | cttgcaaaaatgtagagaga | 73 | 40 |
154925 | 인트론 1 | 11 | 4214 | gctttggctgcctgccacct | 79 | 41 |
154926 | 인트론 1: 엑손 2 | 11 | 16817 | ctgcaggagaaggagccgga | 72 | 42 |
154927 | 3'UTR | 12 | 197 | actgtagtcaccgtggaaga | 88 | 43 |
표 1에 볼 수 있듯이, 서열 번호 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 38, 39, 40, 41, 42 및 43 은 이 분석에서 인간 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 5 발현의 적어도 50 % 저해를 나타내었고, 그러므로 이들이 바람직하다. 상기 바람직한 서열들에 상보적인 표적 부위는 "활성 부위"로 언급되었고, 따라서 본 발명의 화합물에 의한 표적을 위하여 바람직한 부위이다.
실시예 16
인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 5 단백질 농도의 웨스턴 블랏 분석
웨스턴 블랏 분석(이뮤노블랏 분석) 은 표준 방법을 이용하여 수행된다. 세포들은 올리고뉴클레오티드로 처리하고 16-20 시간 경과 후 수집되고, PBS로 1회 세척되어, 라엠리 버퍼(Laemmli buffer) (100 ul/well) 에 현탁되고, 5 분 동안 가열되어 16 % SDS-PAGE 겔에 로딩된다. 겔은 150 V에서 1.5 시간 동안 가동되고, 웨스턴 블랏을 위하여 멤브레인에 트랜스퍼된다. 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 5에 대한 적절한 1차 항체가 1차 항체 종류에 대한 방사선동위원소로 또는 형광으로 표식된 2차 항체와 함께 이용된다. 밴드들이 PHOSPHORIMAGERTM(Molecular Dynamics, Sunnyvale CA)를 이용하여 가시화된다.
서열목록 전자파일 첨부
Claims (20)
- 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질 5를 코딩하는 핵산 분자(서열 번호 3)의 코딩 영역(coding region)의 580 내지 599 뉴클레오베이스 또는 676 내지 695 뉴클레오베이스, 3' 미번역 영역(3' untranslated region)의 996 내지 1015 뉴클레오베이스 또는 1579 내지 1598 뉴클레오베이스, 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질 5를 코딩하는 핵산 분자(서열 번호 10)의 11 내지 30 뉴클레오베이스 또는 584 내지 603 뉴클레오베이스, 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질 5를 코딩하는 핵산 분자(서열 번호 11)의 인트론 영역(intron region)의 4214 내지 4233 뉴클레오베이스, 또는 인트론/엑손 연결 영역(intron/exon junction region)의 16817 내지 16836 뉴클레오베이스, 또는 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질 5를 코딩하는 핵산 분자(서열 번호 12)의 3' 미번역 영역의 197 내지 216 뉴클레오베이스에 표적되고;올리고뉴클레오티드가 상기 영역들 중 하나와 특이적으로 혼성화하고, 서열번호 14, 15, 16, 17, 18, 19, 21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 33, 34, 35, 36, 38, 39, 40, 41, 42 또는 43으로 구성되고, 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질 5의 발현을 저해하는 것을 특징으로 하는 20 뉴클레오베이스 길이의 안티센스 올리고뉴클레오티드.
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 포스포로티오에이트, 키랄 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 아미노알킬포스포트리에스테르, 3'-알킬렌 포스포네이트와 5'-알킬렌포스포네이트와 키랄 포스포네이트를 포함하는 메틸 그리고 알킬 포스포네이트, 포스피네이트, 3'-아미노 포스포아미데이트와 아미노알킬포스포아미데이트를 포함하는 포스포아미데이트, 티아노포스포아미데이트, 티아노알킬포스포네이트, 티아노알킬포스포트리에스테르, 셀레노포스페이트 그리고 노말 3'-5'결합을 가지거나 이와 유사한 2'-5'결합을 가진 보라노포스페이트, 및 하나 이상의 뉴클레오티드간 결합이 3'-3', 5'-5', 2'-2' 결합인 전화된 극성을 가진 것들로 이루어진 군으로부터 선택되는 변형된 뉴클레오시드간 결합(modified internucleoside linkage)으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
- 제3항에 있어서, 상기 변형된 뉴클레오시드간 결합은 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 결합인 것을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
- 제1항에 있어서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 2'-O-메톡시에틸, 2'-디메틸아미노옥시에톡시, 2'-디메틸아미노에톡시에틸, 2'-수산화 그룹이 당 고리에 있는 3' 또는 4' 탄소 원자와 결합되어 있어서 바이사이클릭 당부분을 형성하는 잠긴 핵산(LANs), 2'-메톡시 (2'-O-CH3), 2'-아미노프록폭시 (2'-OCH2CH2CH2NH2) 및 2'-알릴 (2'-CH2-CH=CH2), 2'-O-알릴 (2'-O-CH2-CH=CH2), 및 2'-플르오르 (2'-F)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 변형을 가지는 변형된 당 부분(modified sugar moiety)으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
- 제5항에 있어서, 상기 변형된 당 부분은 2'-O-메톡시에틸(2'-0-methoxyethyl) 당 부분인 것을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
- 제1항에 있어서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 5-메틸시토신; 5-하이드록시 메틸시토신; 잔틴; 하이포잔틴; 2-아미노아데닌; 6-메틸 및 아데닌과 구아닌의 다른 알킬기 유도체; 2-티오우라실; 2-티오티민과 2-티오시토신; 5-할로우라실과 시토신; 5-프로피닐(-C≡C-CH3) 우라실과 시토신과 피리미딘 염기들의 알키닐기 유도체; 6-아조 우라실; 시토신과 티민; 5-우라실(유사우라실), 4-티오우라실 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-하이드록실 및 8-대체된 아데닌들과 구아닌들; 5-할로 부분적으로 5-브로모, 5-트리플르오로메틸과 5-대체된 우라실과 시토신들; 7-메틸구아닌; 7-메틸아데닌; 2-F-아데닌; 2-아미노-아데닌; 8-아자구아닌; 8-아자아데닌; 7-디아자구아닌; 7-디아자아데닌; 3-디아자구아닌; 3-디아자아데닌; 페녹사신 사이티딘(1H-pyrimido[5,4-b] benzoxazin-2(3H)-one); 페녹시아진사이티딘(1H- pyrimido[5,4-b]benzothiazin-2(3H)-one); 9-(2-아미노에톡시)-H-피리미도[5,4-b][1,4]benzoxazin-2(3H)-one을 포함하는 대체된 페녹사진 시티딘; 카바졸 시티딘(H-pyrido[4,5-b]indol-2-one); 피리도인돌 시토신(H-pyrido[3', 2' : 4, 5]pyrrolo[2, 3-d]pyrimidin-2-one); 7-디아자-아데닌; 7-디아자구아노신; 2-아미노피리딘; 및 2-피리돈으로 이루어진 군으로부터 선택된 변형된 뉴클레오베이스로 이루어지는 것을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
- 제7항에 있어서, 상기 변형된 뉴클레오베이스는 5-메틸시토신(5-methylcytosine)인 것을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
- 제1항에 있어서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 두 가지 이상의 서로 다른 올리고뉴클레오티드, 변형된 올리고뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오시드의 혼합된 형태로 구성되는 하나의 키메라 올리고뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
- 제1항의 안티센스 올리고뉴클레오티드와 제약적으로 수용 가능한 운반체 또는 희석제를 포함하는 것을 특징으로 하는 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질 5의 발현을 저해하여 암, 대장염, 뒤센형 근위축증, 당뇨병, 골다공증 및 골경화증을 치료하거나 예방하기 위한 조성물.
- 제10항에 있어서, 콜로이드성 분산계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질 5의 발현을 저해하여 암, 대장염, 뒤센형 근위축증, 당뇨병, 골다공증 및 골경화증을 치료하거나 예방하기 위한 조성물.
- 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질 5의 발현을 저해하도록 시험관 내(in vitro)의 세포 또는 조직을 상기 제1항의 안티센스 올리고뉴클레오티드와 접촉시키는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 시험관 내의 세포 또는 조직에서 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질 5의 발현을 저해하는 방법.
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