CN115916976A - 诱导血管紧张素转换酶2基因外显子跳跃的反义核酸 - Google Patents

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松尾雅文
前田和宏
藤原健志
冈本到
闺正博
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Abstract

提供诱导ACE2基因的外显子跳跃的反义核酸。能够诱导血管紧张素转换酶2基因外显子跳跃的反义寡核苷酸、其盐或溶剂化物,所述反义寡核苷酸具有与血管紧张素转换酶2基因的外显子18的靶标部位互补的碱基序列、碱基数目是15~30。包含所述反义寡核苷酸、其盐或溶剂化物的药物、用于血管紧张素转换酶2蛋白的表达抑制和/或溶解型血管紧张素转换酶2的表达促进的药剂。

Description

诱导血管紧张素转换酶2基因外显子跳跃的反义核酸
技术领域
本发明涉及诱导血管紧张素转换酶2基因外显子跳跃的反义核酸。
背景技术
血管紧张素转换酶2(Angiotensin converting enzyme 2:ACE2)是由805个氨基酸组成的约92kDa的I型跨膜型蛋白,由位于X染色体Xp22的107kb的ACE2基因编码。cDNA的尺寸是约3kb,由19个外显子组成(NM_021804.3)。ACE2具有剪切肽的C’末端的氨基酸的水解作用,作为羧肽酶将血管紧张素II转换为血管紧张素(1-7)(Ang(1-7))。
另一方面,在2002-2003年的严重急性呼吸综合征(severe acute respiratorysyndrome(SARS))流行时,知晓ACE2是冠状病毒SARS-CoV向体内侵入时的受体,作为病毒感染成立的关键分子得到关注。并且,知晓作为COVID-19目前正在全世界蔓延的SARS-CoV-2病毒也利用ACE2作为受体(非专利文献1)。
ACE2是由细胞外·跨膜·细胞内3个结构域组成的跨膜蛋白,病毒结合结构域存在于细胞外结构域。该病毒结合结构域与SARS-CoV-2病毒亲和性高地结合,承担作为病毒的受体的功能。因此,ACE2成为SARS-CoV-2治疗靶标之一,积极研究阻止ACE2的表达的方法或利用仅由细胞外结构域组成的溶解型ACE2作为诱饵受体的方法等(非专利文献2)。
剪接是从由基因转录的pre-mRNA剪切内含子、产生仅由外显子构成的成熟mRNA的反应。剪接部位通过称为剪接共有序列的内含子两端存在的GT-AG的序列确定。除此之外,剪接促进序列起顺式因子的作用,导致正确的剪接反应。针对该剪接促进序列的反义核酸(ASO)抑制剪接促进功能导致外显子的跳跃。为了治疗遗传病等,积极开发诱导外显子的跳跃的ASO(非专利文献3)。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1
Hoffmann M,Kleine Weber H,Schroeder S,Kruger N,Herrler T,Erichsen S,et al.Hoffmann M,Kleine Weber H,Schroeder S,Kruger N,Herrler T,Erichsen S,etal.SARS-CoV-2Cell Entry Depends on ACE2 and TMPRSS2 and Is Blocked by aClinically Proven Protease Inhibitor.Cell.2020;181(2):271-80.e8.
非专利文献2
Hodgson J.The pandemic pipeline.Nat Biotechnol.2020;38(5):523-32.
非专利文献3
松尾雅文.应用反义核酸的外显子跳跃治疗的展望.日本核酸药物学会杂志5,4-13(2020)
发明概述
发明要解决的课题
此次,想到将该外显子跳跃应用于ACE2基因。ACE2基因是由外显子19组成的基因,外显子18编码跨膜结构域。使外显子18跳跃时,从mRNA消除195个碱基,ACE2蛋白缩短65个氨基酸。该蛋白是缺乏跨膜结构域的新型溶解型ACE2,期望成为病毒的诱饵受体。因此,由于外显子18的跳跃与SARS-CoV-2受体的减少共同导致诱饵受体的增加,高度期望成为阻止病毒感染的强大且突破性的治疗方法。
开始本反义核酸开发研究后,Rehman等人在计算机(in-silico)研究中应用ASO示例了ACE2基因的外显子跳跃(Rehman S,and Tabish M.Alternative splicing of ACE2possibly generates variants that may limit the entry of SARS-CoV-2:apotential therapeutic approach using SSOs.Clin Sci(Lond).2020;134(10):1143-5)。
本发明的目的是提供诱导ACE2基因的外显子跳跃的反义核酸(ASO),其目的是ACE2蛋白表达的抑制和溶解型ACE2的表达促进。
用于解决课题的手段
本发明人鉴定了诱导ACE2基因的外显子18的跳跃的反义核酸(ASO)。
本发明的主旨如下。
(1)能够诱导血管紧张素转换酶2基因外显子跳跃的反义寡核苷酸、其盐或溶剂化物,前述反义寡核苷酸具有与血管紧张素转换酶2基因的外显子18的靶标部位互补的碱基序列、碱基数为15~30。
(2)(1)记载的反义寡核苷酸、其盐或溶剂化物,其中,血管紧张素转换酶2基因的外显子18的碱基序列是序列编号1的碱基序列,血管紧张素转换酶2基因的外显子18的靶标部位在序列编号1的碱基序列的碱基编号1~195的区内存在。
(3)(1)或(2)中记载的反义寡核苷酸、其盐或溶剂化物,其中,反义寡核苷酸的碱基序列包含由序列编号2~17的任一种的碱基序列(但是,序列中的t可以是u,u可以是t)中连续的至少15个碱基组成的序列。
(4)(1)~(3)的任一项中记载的反义寡核苷酸、其盐或溶剂化物,其中,反义寡核苷酸的碱基长度是18。
(5)(4)记载的反义寡核苷酸、其盐或溶剂化物,其中,反义寡核苷酸的碱基序列是序列编号2~17的任一种的碱基序列(但是,序列中的t可以是u,u可以是t)。
(6)(1)~(5)的任一项中记载的反义寡核苷酸、其盐或溶剂化物,其中,至少1个核苷酸被修饰。
(7)(6)记载的反义寡核苷酸、其盐或溶剂化物,其中,构成修饰核苷酸的糖是D-呋喃核糖,D-呋喃核糖的2’位的羟基被修饰。
(8)(7)记载的反义寡核苷酸、其盐或溶剂化物,其中,D-呋喃核糖被2’-O-烷基化和/或2’-O,4’-C-亚烷基化。
(9)药物,其包含(1)~(8)的任一项中记载的反义寡核苷酸、其药学上可接受的盐或溶剂化物。
(10)(9)记载的药物,其用于抑制SARS-CoV-2病毒的感染性。
(11)(10)记载的药物,其具有通过受体型血管紧张素转换酶2的减少抑制病毒向细胞内摄入和/或通过能与病毒结合的溶解型血管紧张素转换酶2的增加捕获细胞外的病毒的效果。
(12)(8)~(11)的任一项中记载的药物,其用于预防和/或治疗SARS-CoV-2感染。
(13)药剂,其包含(1)~(8)的任一项中记载的反义寡核苷酸、其盐或溶剂化物,用于血管紧张素转换酶2蛋白的表达抑制和/或溶解型血管紧张素转换酶2的表达促进。
(14)缺乏跨膜结构域的溶解型血管紧张素转换酶2,其通过(1)~(8)的任一项中记载的反义寡核苷酸、其盐或溶剂化物诱导,其通过血管紧张素转换酶2基因的外显子的跳跃产生。
(15)多核苷酸,其包含编码(14)记载的溶解型血管紧张素转换酶2的核苷酸序列和/或与其互补的序列。
(16)抑制SARS-CoV-2病毒的感染性的方法,其包括以有效量向受试者施用(1)~(8)的任一项中记载的反义寡核苷酸、其药学上可接受的盐或溶剂化物。
(17)预防和/或治疗SARS-CoV-2感染的方法,其包括以有效量向受试者施用(1)~(8)的任一项中记载的反义寡核苷酸、其药学上可接受的盐或溶剂化物。
(18)血管紧张素转换酶2蛋白的表达抑制和/或溶解型血管紧张素转换酶2的表达促进方法,其包括以有效量向受试者施用(1)~(8)的任一项中记载的反义寡核苷酸、其药学上可接受的盐或溶剂化物。
(19)(1)~(8)的任一项中记载的反义寡核苷酸、其药学上可接受的盐或溶剂化物,其用于在抑制SARS-CoV-2病毒的感染性的方法中使用。
(20)(1)~(8)的任一项中记载的反义寡核苷酸、其药学上可接受的盐或溶剂化物,其用于在预防和/或治疗SARS-CoV-2感染的方法中使用。
(21)(1)~(8)的任一项中记载的反义寡核苷酸、其药学上可接受的盐或溶剂化物,其用于在血管紧张素转换酶2蛋白的表达抑制和/或溶解型血管紧张素转换酶2的表达促进方法中使用。
(22)(1)~(8)的任一项中记载的反义寡核苷酸、其药学上可接受的盐或溶剂化物在制备用于抑制SARS-CoV-2病毒的感染性的药物中的应用。
(23)(1)~(8)的任一项中记载的反义寡核苷酸、其药学上可接受的盐或溶剂化物在制备用于预防和/或治疗SARS-CoV-2感染的药物中的应用。
(24)(1)~(8)的任一项中记载的反义寡核苷酸、其药学上可接受的盐或溶剂化物在制备用于血管紧张素转换酶2蛋白的表达抑制和/或溶解型血管紧张素转换酶2的表达促进的药剂中的应用。
发明效果
通过ACE2基因的外显子18的跳跃,产生由外显子18编码的缩短195个碱基的mRNA。其结果,产生缩短65个氨基酸的ACE2蛋白。此外,该65个氨基酸中,构成跨膜结构域的氨基酸序列全部包含,产生缺乏跨膜结构域的溶解性ACE2。其结果,实现SARS-CoV-2的感染的受体表达的抑制、诱饵受体的表达、肽酶的表达。期望得到SARS-CoV-2的感染的大的预防效果。
本说明书包含作为本申请的优先权的基础的日本专利申请、特愿2020-127142的说明书和/或附图中记载的内容。
序列表
<110> 神户天然物化学株式会社
学校法人神户学院
<120> 诱导血管紧张素转换酶2基因外显子跳跃的反义核酸
<130> FP-300PCT
<150> JP 2020-127142
<151> 2020-07-28
<160> 28
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 195
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反义寡核苷酸
<400> 24
gtcattcaga cggaaagc 18
<210> 25
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反义寡核苷酸
<400> 25
tcattcagac ggaaagca 18
<210> 26
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反义寡核苷酸
<400> 26
attcagacgg aaagcatc 18
<210> 27
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反义寡核苷酸
<400> 27
tcagacggaa agcatcat 18
<210> 28
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反义寡核苷酸
<400> 28
ggctgttgtc attcagac 18
附图简述
[图1]ACE2的pre-mRNA和ASO的靶标部位。由ACE2基因转录产生的ACE2pre-mRNA由19个外显子构成。以外显子18的跳跃为目的,制备与ACE2的外显子18内的序列互补的ASO1、2、3。
[图2]ASO的有效性的比较。在人肝癌细胞(HepG2)中分别导入ASO1、2、3,显示其ACE2 mRNA的RT-PCR的结果。a)显示人肝癌细胞(HepG2)的ACE2 mRNA、GAPDH mRNA的RT-PCR的结果。w/o是无ASO处理。白箭头表示ACE2,黑箭头表示外显子18跳跃的ACE2。b)从RT-PCR的结果求得ACE2外显子18跳跃mRNA/总ACE2 mRNA。总结独立的3次实验结果。*P<0.05。
[图3]ACE2的pre-mRNA和ASO的靶标部位。进一步,为了搜索外显子18的跳跃中有效的ASO,制备与ACE2的外显子18内的序列互补的ASO4、5、6、7、8。
[图4]ASO的有效性的比较。在人肝癌细胞(HepG2)中分别导入ASO4、5、6、7、8,显示其ACE2 mRNA的RT-PCR的结果。a)显示人肝癌细胞(HepG2)的ACE2 mRNA、GAPDH mRNA的RT-PCR的结果。w/o是无ASO处理。白箭头表示ACE2,黑箭头表示外显子18跳跃的ACE2。b)从RT-PCR的结果显示ACE2外显子18跳跃mRNA/总ACE2 mRNA。总结独立的3次实验结果。**P<0.01。***P<0.001
[图5]ACE2的pre-mRNA和ASO的靶标部位。进一步,为了搜索外显子18的跳跃中有效的ASO,制备与ACE2的外显子18和两侧的内含子序列互补的ASO9、In16Ex17、Ex17In17。
[图6]ASO的有效性的比较。在人肝癌细胞(HepG2)中分别导入ASO9、In16Ex17、Ex17In17,显示其ACE2 mRNA的RT-PCR的结果。a)显示人肝癌细胞(HepG2)的ACE2 mRNA、GAPDH mRNA的RT-PCR的结果。w/o是无ASO处理。白箭头表示ACE2,黑箭头表示外显子18跳跃的ACE2。b)显示ACE2外显子18跳跃mRNA/总ACE2 mRNA。总结独立的3次实验结果。
[图7]ACE2的pre-mRNA和ASO的靶标部位。进一步,为了搜索外显子18的跳跃中有效的ASO,制备与ACE2的外显子18、内含子17的序列互补的ASO4+5、4-13、5-5、6+7、6-11。
[图8]ASO的有效性的比较。在人肝癌细胞(HepG2)中分别导入ASO4+5、4-13、5-5、6+7、6-11,显示其ACE2 mRNA的RT-PCR的结果。a)显示人肝癌细胞(HepG2)的ACE2 mRNA、GAPDH mRNA的RT-PCR的结果。w/o是无ASO处理。白箭头表示ACE2,黑箭头表示外显子18跳跃的ACE2。b)显示ACE2外显子18跳跃mRNA/总ACE2 mRNA。总结独立的3次实验结果。*P<0.05,***P<0.001
[图9]ACE2的pre-mRNA和ASO的靶标部位。根据以上4次ASO的效果研究结果,选择外显子18的外显子跳跃效果高的5种,进行这些ASO的效果比较。
[图10]ASO的有效性的比较。在人肝癌细胞(HepG2)中分别导入5种ASO,显示其ACE2 mRNA的RT-PCR的结果。a)显示人肝癌细胞(HepG2)的ACE2 mRNA、GAPDH mRNA的RT-PCR的结果。w/o是无ASO处理。白箭头表示ACE2,黑箭头表示外显子18跳跃的ACE2。b)显示ACE2外显子18跳跃mRNA/总ACE2 mRNA。总结独立的3次实验结果。*P<0.05,***P<0.001
[图11]ACE2的pre-mRNA和ASO的靶标部位。进一步,为了搜索外显子18的跳跃中有效的ASO,制备与ACE2的外显子18内的序列互补的ASO5+5、5+6、5+7、5+8、5+10、5+12。
[图12]ASO的有效性的比较。在人肝癌细胞(HepG2)中分别导入ASO5+5、5+6、5+7、5+8、5+10、5+12,显示其ACE2 mRNA的RT-PCR的结果。a)显示人肝癌细胞(HepG2)的ACE2mRNA、GAPDH mRNA的RT-PCR的结果。w/o是无ASO处理。白箭头表示ACE2,黑箭头表示外显子18跳跃的ACE2。b)显示ACE2外显子18跳跃mRNA/总ACE2mRNA。总结独立的3次实验结果。***P<0.001
[图13]ACE2的pre-mRNA和ASO的靶标部位。为了搜索外显子18的跳跃中最有效的ASO,制备与ACE2的外显子18内的序列互补的ASO5+7和5c。ASO5c的靶标序列与ASO5相同,但ASO中的ENA、2’OMe的位置与ASO5不同。
[图14]ASO的有效性的比较。在人肝癌细胞(HepG2)中分别导入ASO5+7、5c,显示其ACE2 mRNA的RT-PCR的结果。a)显示人肝癌细胞(HepG2)的ACE2 mRNA、GAPDH mRNA的RT-PCR的结果。w/o是无ASO处理。白箭头表示ACE2,黑箭头表示外显子18跳跃的ACE2。b)显示ACE2外显子18跳跃mRNA/总ACE2 mRNA。总结独立的2次实验结果。显示ASO5+7在HepG2细胞中对ACE2外显子18的跳跃最有效。
用于实施发明的方式
以下,关于本发明的实施方式进行详细说明。
本发明提供能够诱导血管紧张素转换酶2基因外显子跳跃的反义寡核苷酸、其盐或溶剂化物,前述反义寡核苷酸具有与血管紧张素转换酶2基因的外显子18的靶标部位互补的碱基序列、碱基数目是15~30。
人血管紧张素转换酶2基因的外显子18的碱基序列示于序列编号1。在本发明中,在血管紧张素转换酶2基因的外显子18的碱基序列是序列编号1的碱基序列的情形中,血管紧张素转换酶2基因的外显子18的靶标部位可以在序列编号1的碱基序列的碱基编号1~195的区内存在。
进一步,在本发明中,反义寡核苷酸的碱基序列可以包含由序列编号2~17的任一种的碱基序列(但是,序列中的t可以是u,u可以是t)中连续的至少15个碱基组成的序列。
反义寡核苷酸的碱基长度可以是18,反义寡核苷酸的碱基序列可以是序列编号2~17的任一种的碱基序列(但是,序列中的t可以是u,u可以是t)。
构成反义寡核苷酸的核苷酸可以是天然型DNA、天然型RNA、它们的修饰体的任一种,优选至少1个是修饰核苷酸。
作为修饰核苷酸,可以示例糖被修饰的那种(例如,(例如,D-呋喃核糖被2′-O-烷基化的那种、D-呋喃核糖被2′-O,4′-C-亚烷基化的那种等D-呋喃核糖的2’位羟基被修饰的那种)、磷酸二酯键被修饰(例如,硫代)的那种、碱基被修饰的那种、将它们组合的那种等。由于构成反义寡核苷酸的至少1个D-呋喃核糖被2′-O-烷基化的那种或2′-O,4′-C-亚烷基化的那种对RNA的结合力高、对核酸酶的耐性高,可以期望比天然型核苷酸(即,寡DNA、寡RNA)高的治疗效果。此外,由于构成寡核苷酸的至少1个磷酸二酯键被硫代的那种对核酸酶的耐性高,可以期望比天然型核苷酸(即,寡DNA、寡RNA)高的治疗效果。由于包含如上述修饰的糖和修饰的磷酸两者的寡核苷酸对核酸酶的耐性更高,可以期望进一步高的治疗效果。
关于反义寡核苷酸,作为糖的修饰的实例,可以列举D-呋喃核糖的2′-O-烷基化(例如,2′-O-甲基化、2′-O-氨基乙基化、′-O-丙基化、2′-O-烯丙基化、2′-O-甲氧基乙基化、2′-O-丁基化、2′-O-戊基化、2′-O-炔丙基化等)、D-呋喃核糖的2′-O,4′-C-亚烷基化(例如,2′-O,4′-C-1,2-亚乙基化、2′-O,4′-C-亚甲基化、2′-O,4′-C-亚丙基化、2′-O,4′-C-四亚甲基化、2′-O,4′-C-五亚甲基化等)、3′-脱氧-3′-氨基-2′-脱氧-D-呋喃核糖、3′-脱氧-3′-氨基-2′-脱氧-2′-氟-D-呋喃核糖等。
关于反义寡核苷酸,作为磷酸二酯键的修饰的实例,可以列举硫代磷酸酯键、甲基膦酸酯键、甲基硫代磷酸酯键、二硫代磷酸酯键、氨基磷酸酯键等。
关于反义寡核苷酸,作为碱基的修饰的实例,可以列举胞嘧啶的5-甲基化、5-氟化、5-溴化、5-碘化、N4-甲基化、胸苷的5-去甲基化(尿嘧啶)、5-氟化、5-溴化、5-碘化、腺嘌呤的N6-甲基化、8-溴化、鸟嘌呤的N2-甲基化、8-溴化、尿苷的假尿苷化、1-甲基假尿苷化等。
本发明的反义寡核苷酸可以是盐的形式。在将本发明的反义寡核苷酸用于药物的情形中,盐可以是药学上可接受的盐,作为这样的盐,可以列举如钠盐、钾盐、锂盐的碱金属盐,如钙盐、镁盐的碱土类金属盐,铝盐、铁盐、锌盐、铜盐、镍盐,钴盐等金属盐;如铵盐的无机盐,如叔辛胺盐、二苄胺盐、吗啉盐、葡糖胺盐、苯基甘氨酸烷基酯盐、乙二胺盐、N-甲基葡糖胺盐、胍盐、二乙胺盐、三乙胺盐、二环己胺盐、N,N′-二苄基乙二胺盐、氯普鲁卡因盐、普鲁卡因盐、二乙醇胺盐、N-苄基-苯乙胺盐、哌嗪盐、四甲基铵盐、三(羟甲基)氨基甲烷盐的有机盐等胺盐;如氢氟酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐的氢卤酸盐、硝酸盐、高氯酸盐、硫酸盐、磷酸盐等无机酸盐;如甲磺酸盐、三氟甲磺酸盐、乙磺酸盐的低级烷磺酸盐,如苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐的芳基磺酸盐,乙酸盐、苹果酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、草酸盐、马来酸盐等有机酸盐;如甘氨酸盐、赖氨酸盐、精氨酸盐、鸟氨酸盐、谷氨酸盐、天冬氨酸盐的氨基酸盐等。这些盐可以用公知方法制备。
此外,反义寡核苷酸有时也作为溶剂化物(例如,水合物)存在,可以是这样的溶剂化物。
进一步,反义寡核苷酸可以以前体药物的方式施用,作为前体药物,可以列举酰胺、酯、氨基甲酸盐、碳酸盐、脲、磷酸盐等。这些前体药物可以用公知方法制备。
反义寡核苷酸的合成方法没有特别限定,可以采用以往公知的方法。前述合成方法列举例如通过基因工程的方法、化学合成法等。基因工程方法列举例如体外转录合成法、应用载体的方法、通过PCR盒的方法。前述载体没有特别限制,列举质粒等非病毒载体、病毒载体等。前述化学合成法没有特别限制,列举例如亚磷酰胺法和H-膦酸盐法等。前述化学合成法可以使用例如市售的自动核酸合成仪。前述化学合成法通常使用亚酰胺。前述亚酰胺没有特别限制,在后述实施例中,反义寡核苷酸应用ENA-2CE亚磷酰胺和2′OMe-2CE亚磷酰胺用亚磷酰胺法合成。
亚磷酰胺试剂关于天然型核苷和2′-O-甲基核苷(即,2′-O-甲基鸟苷、2′-O-甲基腺苷、2′-O-甲基胞嘧啶、2′-O-甲基尿苷)可以应用市售的试剂。关于烷基的碳原子数是2~6个的2′-O-烷基鸟苷、腺苷、胞嘧啶和尿苷如下。
2′-O-氨基乙基鸟苷、腺苷、胞嘧啶、尿苷可以按照文献(Blommers etal.Biochemistry(1998),37,17714-17725.)合成。
2′-O-丙基鸟苷、腺苷、胞嘧啶、尿苷可以按照文献(Lesnik,E.A.etal.Biochemistry(1993),32,7832-7838.)合成。
2′-O-烯丙基鸟苷、腺苷、胞嘧啶、尿苷可以应用市售的试剂。
2′-O-甲氧基乙基鸟苷、腺苷、胞嘧啶、尿苷可以按照专利(US6261840)或文献(Martin,P.Helv.Chim.Acta.(1995)78,486-504.合成。
2′-O-丁基鸟苷、腺苷、胞嘧啶、尿苷可以按照文献(Lesnik,E.A.etal.Biochemistry(1993),32,7832-7838.)合成。
2′-O-戊基鸟苷、腺苷、胞嘧啶、尿苷可以按照文献(Lesnik,E.A.etal.Biochemistry(1993),32,7832-7838.)合成。
2′-O-炔丙基鸟苷、腺苷、胞嘧啶、尿苷可以应用市售的试剂。
关于2′-O,4′-C-亚甲基鸟苷、腺苷、5-甲基胞嘧啶和胸苷,可以按照WO99/14226中记载的方法制备,关于亚烷基的碳原子数是2~5个的2′-O,4′-C-亚烷基鸟苷、腺苷、5-甲基胞嘧啶和胸苷,可以按照WO00/47599中记载的方法制备。
偶联亚磷酰胺试剂后,通过使硫、二硫化四乙基秋兰姆(TETD、AppliedBiosystems公司)、Beaucage试剂(Glen Research公司)或黄原胶氢化物等试剂反应,可以合成具有硫代磷酸酯键的反义寡核苷酸(Tetrahedron Letters,32,3005(1991),J.Am.Chem.Soc.112,1253(1990),PCT/WO98/54198)。
作为合成仪器中应用的可控孔玻璃(CPG),可以利用2′-O-甲基核苷结合的市售的那种。此外,关于2′-O,4′-C-亚甲基鸟苷、腺苷、5-甲基胞嘧啶和胸苷按照WO99/14226中记载的方法、关于亚烷基的碳原子数是2~5个的2′-O,4′-C-亚烷基鸟苷、腺苷、5-甲基胞嘧啶和胸苷按照WO00/47599中记载的方法制备的核苷可以按照文献(OligonucleotideSynthesis,Edited by M.J.Gait,Oxford University Press,1984)与CPG结合。通过应用修饰的CPG(特开平7-87982的实施例12b中记载),可以合成在3′末端结合了2-羟乙基磷酸基的寡核苷酸。此外,如果使用3′-氨基修饰剂C3 CPG、3′-氨基修饰剂C7 CPG、甘油基CPG,(Glen Research)、3′-specer C3 SynBase CPG1000、3′-specer C9 SynBase CPG 1000(Link Technologies),可以合成在3′末端结合了羟烷基磷酸基或氨基烷基磷酸基的寡核苷酸。
本发明的反义寡核苷酸可以在药物中使用。在作为药物应用的情形中,反义寡核苷酸可以是其药学上容许的盐、溶剂化物或前体药物的形式。因此,本发明提供药物,其包含能够诱导血管紧张素转换酶2基因外显子跳跃的反义寡核苷酸、其药学上可接受的盐或溶剂化物,前述反义寡核苷酸具有与血管紧张素转换酶2基因的外显子18的靶标部位互补的碱基序列、碱基数目是15~30。药物可以用于抑制SARS-CoV-2病毒的感染性,但不限于这些。本发明的药物可具有通过受体型血管紧张素转换酶2的减少抑制病毒向细胞内摄入和/或通过能与病毒结合的溶解型血管紧张素转换酶2的增加捕获细胞外的病毒的效果。本发明的药物可以用于预防和/或治疗SARS-CoV-2感染。本发明还提供抑制SARS-CoV-2病毒的感染性的方法,其包括以有效量向受试者施用上述反义寡核苷酸、其药学上可接受的盐或溶剂化物。本发明还提供预防和/或治疗SARS-CoV-2感染的方法,其包括以有效量向受试者施用上述反义寡核苷酸、其药学上可接受的盐或溶剂化物。受试者可以是人或动物。作为动物,可以示例狗、猫、貂、老虎、狮子、小鼠、大鼠、兔、绵羊、猪、牛、马等哺乳动物。
在本说明书中,“感染的预防”包括病毒感染预防、病毒感染引起的不良症状的发病(病毒感染症)的预防、病毒感染症的重症化的预防,“预防”包括病毒感染率的降低、病毒感染引起的不良症状的发病率的降低、病毒感染症的重症化率的降低、病毒感染症的重症化的程度的降低。
此外,在本说明书中,“感染的治疗”包括从病毒感染治愈、病毒感染引起的不良症状的减轻、病毒感染症的重症化的防止或延迟。
本发明的反义寡核苷酸、其药学上容许的盐、溶剂化物或前体药物(以下称为“有效成分”)可以单独、或与药理学可接受的载体、稀释剂或赋形剂共同作为适当剂型的制剂向哺乳动物(例如,人、兔、狗、猫、大鼠、小鼠)经口的或非经口施用。施用量根据施用对象、症状、施用途径等而不同,例如,作为有效成分1次量,可以将通常0.1~50mg/kg体重左右、优选0.5mg/kg体重左右以每天1-3次左右的频率、优选每天1次左右的频率鼻腔内施用或静脉施用(优选连续或隔日施用)。其它非经口施用和经口施用的情形也可以施用据此的量。症状特别重的情形可以相应于其症状进行增量。
作为用于经口施用的制剂,列举固体或液体剂型,具体地,片剂(包含糖衣片、薄膜包衣片)、丸剂、颗粒剂、散剂、胶囊剂(包含软胶囊剂)、糖浆剂、乳剂、悬浮剂等。该制剂可以通过常规方法制备,可以含有制剂领域中通常应用的载体、稀释剂或赋形剂。例如,作为用于片剂的载体、赋形剂,列举乳糖、淀粉、蔗糖、硬脂酸镁等。
作为用于非经口施用的制剂,例如,列举滴鼻剂、注射剂、栓剂等,滴鼻剂可以是滴鼻粉末剂、滴鼻液剂等剂型,注射剂可以是静脉注射剂、皮下注射剂、皮内注射剂、肌肉注射剂、点滴注射剂等剂型。滴鼻粉末剂可以将有效成分适度制成微细的粒子、按需要与添加剂混和成为均质,滴鼻液剂可以向有效成分加入溶剂和添加剂等、溶解或悬浮、按需要过滤。等渗剂可以应用pH调节剂等。作为添加剂,可以列举苯扎氯铵等防腐剂、羟丙基纤维素等粘合剂、乳糖等赋形剂等。作为溶剂,通常应用生理盐水,可以添加醇(例如,乙醇、异丙醇等)、二元醇(例如,丙二醇、聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇醚、甘油等)、聚氧乙烯醇等助溶剂。注射剂通过常规方法、即将有效成分在用于通常注射剂的无菌水性或油性液体中溶解、悬浮或乳化而配制。作为用于注射的水性液体,列举包括生理盐水、葡萄糖和其它辅助剂的等渗液等,可以与适当的助溶剂例如醇(例如,乙醇)、多元醇(例如丙二醇、聚乙二醇)、非离子表面活性剂(例如,聚山梨醇酯80、HCO-50(氢化蓖麻油的聚氧乙烯(50mol)加合物))等联用。作为油性液体,列举芝麻油、大豆油等,可以联用作为助溶剂的苯甲酸苄酯和苯甲醇等。配制的注射液通常填充在适当的安瓿中。直肠施用中应用的栓剂可以通过将有效成分与通常的栓剂用基质混合而配制。
上述的经口用或非经口用药物制剂可以配制成适于有效成分的施用量的投药单位的剂型。作为该投药单位的剂型,列举片剂、丸剂、胶囊剂、填充于滴鼻容器的用于经鼻施用的制剂、注射剂(安瓿)、栓剂等,优选每各自的投药单位剂型含有通常0.1~1.000mg的有效成分。
本发明的反义寡核苷酸使得血管紧张素转换酶2蛋白的表达抑制和/或溶解型血管紧张素转换酶2的表达促进成为可能。因此,本发明提供用于血管紧张素转换酶2蛋白的表达抑制和/或溶解型血管紧张素转换酶2的表达促进的药剂,其包含能够诱导血管紧张素转换酶2基因外显子跳跃的反义寡核苷酸、其盐或溶剂化物,前述反义寡核苷酸具有与血管紧张素转换酶2基因的外显子18的靶标部位互补的碱基序列、碱基数目是15~30。本发明的药剂可以用作药物、或此外用作实验用试剂。本发明还提供血管紧张素转换酶2蛋白的表达抑制和/或溶解型血管紧张素转换酶2的表达促进方法,其包括以有效量向受试者施用上述反义寡核苷酸、其药学上可接受的盐或溶剂化物。受试者可以是人或动物。作为动物,可以示例狗、猫、貂、老虎、狮子、小鼠、大鼠、兔、绵羊、猪、牛、马等哺乳动物。反义寡核苷酸可以是盐、溶剂化物或前体药物的形式。作为盐、溶剂化物或前体药物的一个实例,可以列举药学上可接受的盐、溶剂化物或前体药物,关于它们见上述。
在用作实验用试剂的情形中,通过用本发明的反义寡核苷酸、其盐或溶剂化物处理表达血管紧张素转换酶2的细胞、组织或器官,可以抑制血管紧张素转换酶2的蛋白的表达,并促进溶解型血管紧张素转换酶2的表达。本发明的反义寡核苷酸、其盐和溶剂化物以抑制血管紧张素转换酶2的蛋白的表达、并促进溶解型血管紧张素转换酶2的表达的有效量应用即可。作为表达血管紧张素转换酶2的细胞,可以示例鼻粘膜上皮杯状细胞、II型肺胞上皮细胞和吸收性肠上皮细胞、肝癌细胞、血管内皮细胞、肾小管上皮细胞等。此外,除了天然来源的细胞,还可以示例导入血管紧张素转换酶2基因的重组细胞。作为表达血管紧张素转换酶2的组织和器官,可以示例心脏、肾脏、睾丸、肺、睾丸、小肠、肾脏、前列腺等。血管紧张素转换酶2的表达可以通过用RT-PCR分析样品中的血管紧张素转换酶2mRNA、用蛋白印迹法检测并用质谱法检测样品中的血管紧张素转换酶2蛋白而分析。
通过由本发明的反义寡核苷酸、其盐或溶剂化物诱导的、血管紧张素转换酶2基因的外显子的跳跃,产生缺乏跨膜结构域的溶解型血管紧张素转换酶2。本发明还提供该溶解型血管紧张素转换酶2。
此外,本发明还提供包含编码溶解型血管紧张素转换酶2的核苷酸序列和/或与其互补的序列的多核苷酸。
本发明的溶解型血管紧张素转换酶2和包含编码其的核苷酸序列的多核苷酸通过在表达血管紧张素转换酶2的细胞中由本发明的反义寡核苷酸诱导血管紧张素转换酶2基因的外显子的跳跃而产生。此外,本发明的溶解型血管紧张素转换酶2可以如下制备,从诱导血管紧张素转换酶2基因外显子跳跃的细胞提取RNA,应用逆转录酶和随机引物合成cDNA,通过PCR扩增后,进行序列分析,确定序列后,在优化了可读框的密码子使用频率的序列的5’侧和3’侧添加限制酶识别序列后,整合到适当的载体,导入适当的宿主细胞,作为重组蛋白生产。
作为载体,可以应用来自大肠菌的质粒(例如,pBR322,pBR325,pUC12,pUC13、pUC19,pET-44,pBlueScriptII)、来自枯草芽孢杆菌的质粒(例如,YEp13,pYES2,YRp7,YIp5,pYAC2、pUB110,pTP5,pC194)、来自酵母的质粒(例如,pSH19,pSH15)、λ噬菌体等噬菌体、逆转录病毒、腺病毒、慢病毒、腺伴随病毒、牛痘病毒等动物病毒、杆状病毒等昆虫病原病毒等。
表达载体中可以添加启动子、增强子、终止子、剪接信号、poly A添加信号、选择标记、SV40复制起点等。
作为宿主,可以示例细菌细胞(例如,埃希氏菌属菌、芽孢杆菌属菌、枯草芽孢杆菌等)、真菌细胞(例如,酵母、曲霉等)、昆虫细胞(例如,S2细胞、Sf细胞等)、动物细胞(例如,CHO细胞、COS细胞、HeLa细胞、C127细胞、3T3细胞、BHK细胞、HEK293细胞等)、植物细胞等。
将重组载体导入宿主可以通过Molecular Cloning 2nd Edition,J.Sambrook等人,Cold Spring Harbor Lab.Press,1989中记载的方法(例如,磷酸钙法、DEAE-葡聚糖法、转染法、显微注射法、脂质转染法、电穿孔法、转导法、刮装法、鸟枪法等)或感染进行。
可以用培养基培养转化细胞,从培养物采集溶解型血管紧张素转换酶2。在溶解型血管紧张素转换酶2向培养基分泌的情形中,回收培养基、从该培养基分离溶解型血管紧张素转换酶2、纯化即可。在溶解型血管紧张素转换酶2在转化的细胞内产生的情形中,溶解该细胞、从其溶解物分离溶解型血管紧张素转换酶2、纯化即可。
溶解型血管紧张素转换酶2的分离和纯化可以通过公知方法进行。作为公知的分离、纯化方法,应用:盐析和溶剂沉淀法等的利用溶解度的方法,透析法、超滤法、凝胶过滤法、和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法等利用分子量的差异的方法,离子交换色谱等利用电荷的差异的方法,亲和色谱等利用特异性亲和性的方法,反相高效液相色谱等利用疏水性的差异的方法,等电聚焦等利用等电点的差异的方法等。
实施例
以下,基于实施例详细说明本发明。
〔实施例1~8〕反义寡核苷酸(ASO)的合成
合成表1所示反义寡核苷酸(ASO)。与ACE2 pre-mRNA互补的ASO的序列位置示于图1、3。向ASO的序列中的A(腺嘌呤)、G(鸟嘌呤)、C(胞嘧啶)和T(胸腺嘧啶)导入修饰核酸的ENA(注册商标)(2′-O,4′-C-Ethylene-bridged Nucleic Acids),使亲和性和稳定性提高。
Figure BDA0004012301620000151
的合成(ACE2ASO1)的合成(实施例1)
应用核酸自动合成仪(日本Techno Service公司制DNA/RNA合成装置NTS H-6),以1μmol规模进行。各合成循环中的溶剂、试剂、亚磷酰胺的浓度与天然寡核苷酸合成的情形相同,试剂、2′-O-甲基核苷的亚磷酰胺(腺苷物产品编号10-3100-10、鸟苷物产品编号10-3121-10)应用GlenResearch公司制的那种。溶剂应用和光纯药工业的那种。非天然型的亚磷酰胺应用特开2000-297097的实施例22(5′-O-二甲氧基三苯甲基-2′-O,4′-C-1,2-亚乙基-4-N-苯甲酰基-5-甲基胞苷-3′-O-(2-氰乙基N,N-二异丙基)亚磷酰胺)、实施例9(5′-O-二甲氧基三苯甲基-2′-O,4′-C-1,2-亚乙基-5-甲基尿苷-3′-O-(2-氰乙基N,N-二异丙基)亚磷酰胺)的化合物。作为固相载体,应用通用可控孔玻璃(CPG)(Glen Research公司制产品编号25-5040),合成表述的化合物。但是,亚酰胺的缩合所需的时间设为15分钟。
通过用浓氨水加热处理(55℃,8小时)具有目的序列的被保护的寡核苷酸类似物以从载体切割寡聚体,同时除去磷原子上的保护基氰乙基和核酸碱基上的保护基。本氨溶液应用Glen-Pak DNA PurificationCartridge(Glen Research公司制产品编号60-5100),按照Glen Research推荐的方案进行筒(cartridge)内的脱DMT,减压蒸馏回收的溶液,用反相HPLC(岛津制作所制LC-2a、柱(YMC制Triart C18(10×150 mm))、A溶液:0.1M乙酸三乙胺水溶液(TEAA),pH 7.0、B溶液:乙腈、B%:10%→25%(30分钟,线性梯度);50℃;4.7 mL/min;280 nm)纯化残渣。溶剂蒸馏后,在10mM NaOH溶液中溶解,应用Microsep离心过滤装置(日本Pall公司制产品编号MAP003C)通过超滤纯水置换,冷冻干燥后得到目的化合物。
本化合物通过负离子MALDI-TOFMS鉴定(计算值:6461、测定值:6461)。
本化合物的碱基序列是与智人血管紧张素I转换酶2(ACE2)、染色体X上的RefSeqGene(Gene Bank登录号NG_012575.1的核苷酸编号36796-36813互补的序列。
Figure BDA0004012301620000161
(ACE2ASO2)的合成(实施例2)
与实施例1的化合物同样,合成具有目的序列的实施例2的化合物。
本化合物通过负离子MALDI-TOFMS鉴定(计算值:6486、测定值:6487)。
本化合物的碱基序列是与智人血管紧张素I转换酶2(ACE2)、染色体X上的RefSeqGene(Gene Bank登录号NG_012575.1的核苷酸编号36906-36923互补的序列。
Figure BDA0004012301620000162
(ACE2ASO3)的合成(实施例3)
与实施例1的化合物同样,合成具有目的序列的实施例3的化合物。
本化合物通过负离子MALDI-TOFMS鉴定(计算值:6456、测定值:6456)。
本化合物的碱基序列是与智人血管紧张素I转换酶2(ACE2)、染色体X上的RefSeqGene(Gene Bank登录号NG_012575.1的核苷酸编号36919-36936互补的序列。
Figure BDA0004012301620000163
(ACE2ASO4)的合成(实施例4)
与实施例1的化合物同样,合成具有目的序列的实施例4的化合物。
本化合物通过负离子MALDI-TOFMS鉴定(计算值:6504、测定值:6504)。
本化合物的碱基序列是与智人血管紧张素I转换酶2(ACE2)、染色体X上的RefSeqGene(Gene Bank登录号NG_012575.1的核苷酸编号36745-36762互补的序列。
Figure BDA0004012301620000164
(ACE2ASO5)的合成(实施例5)
与实施例1的化合物同样,合成具有目的序列的实施例5的化合物。
本化合物通过负离子MALDI-TOFMS鉴定(计算值:6495、测定值:6495)。
本化合物的碱基序列是与智人血管紧张素I转换酶2(ACE2)、染色体X上的RefSeqGene(Gene Bank登录号NG_012575.1的核苷酸编号36775-36792互补的序列。
Figure BDA0004012301620000171
(ACE2ASO6)的合成(实施例6)
与实施例1的化合物同样,合成具有目的序列的实施例6的化合物。
本化合物通过负离子MALDI-TOFMS鉴定(计算值:6520、测定值:6521)。
本化合物的碱基序列是与智人血管紧张素I转换酶2(ACE2)、染色体X上的RefSeqGene(Gene Bank登录号NG_012575.1的核苷酸编号36814-36831互补的序列。
Figure BDA0004012301620000172
(ACE2ASO7)的合成(实施例7)
与实施例1的化合物同样,合成具有目的序列的实施例7的化合物。
本化合物通过负离子MALDI-TOFMS鉴定(计算值:6513、测定值:6513)。
本化合物的碱基序列是与智人血管紧张素I转换酶2(ACE2)、染色体X上的RefSeqGene(Gene Bank登录号NG_012575.1的核苷酸编号36837-36854互补的序列。
Figure BDA0004012301620000173
(ACE2ASO8)的合成(实施例8)
与实施例1的化合物同样,合成具有目的序列的实施例8的化合物。
本化合物通过负离子MALDI-TOFMS鉴定(计算值:6407、测定值:6407)。
本化合物的碱基序列是与智人血管紧张素I转换酶2(ACE2)、染色体X上的RefSeqGene(Gene Bank登录号NG_012575.1的核苷酸编号36858-36875互补的序列。
Figure BDA0004012301620000174
(ACE2ASO9)的合成(实施例9)
与实施例1的化合物同样,合成具有目的序列的实施例9的化合物。
本化合物通过负离子MALDI-TOFMS鉴定(计算值:6428、测定值:6429)。
本化合物的碱基序列是与智人血管紧张素I转换酶2(ACE2)、染色体X上的RefSeqGene(Gene Bank登录号NG_012575.1的核苷酸编号36882-36899互补的序列。
Figure BDA0004012301620000181
(ACE2ASOIn16Ex17)的合成(实施例10)
与实施例1的化合物同样,合成具有目的序列的实施例10的化合物。
本化合物通过负离子MALDI-TOFMS鉴定(计算值:6452、测定值:6452)。
本化合物的碱基序列是与智人血管紧张素I转换酶2(ACE2)、染色体X上的RefSeqGene(Gene Bank登录号NG_012575.1的核苷酸编号36734-36751互补的序列。
Figure BDA0004012301620000182
(ACE2ASOEx17In17)的合成(实施例11)
与实施例1的化合物同样,合成具有目的序列的实施例11的化合物。
本化合物通过负离子MALDI-TOFMS鉴定(计算值:6375、测定值:6377)。
本化合物的碱基序列是与智人血管紧张素I转换酶2(ACE2)、染色体X上的RefSeqGene(Gene Bank登录号NG_012575.1的核苷酸编号36929-36946互补的序列。
Figure BDA0004012301620000183
(ACE2ASO4+5)的合成(实施例12)
与实施例1的化合物同样,合成具有目的序列的实施例12的化合物。
本化合物通过负离子MALDI-TOFMS鉴定(计算值:6440、测定值:6440)。
本化合物的碱基序列是与智人血管紧张素I转换酶2(ACE2)、染色体X上的RefSeqGene(Gene Bank登录号NG_012575.1的核苷酸编号36740-36757互补的序列。
Figure BDA0004012301620000184
(ACE2ASO4-13)的合成(实施例13)
与实施例1的化合物同样,合成具有目的序列的实施例13的化合物。
本化合物通过负离子MALDI-TOFMS鉴定(计算值:6493、测定值:6492)。
本化合物的碱基序列是与智人血管紧张素I转换酶2(ACE2)、染色体X上的RefSeqGene(Gene Bank登录号NG_012575.1的核苷酸编号36758-36775互补的序列。
Figure BDA0004012301620000191
(ACE2ASO5-5)的合成(实施例14)
与实施例1的化合物同样,合成具有目的序列的实施例14的化合物。
本化合物通过负离子MALDI-TOFMS鉴定(计算值:6433、测定值:6434)。
本化合物的碱基序列是与智人血管紧张素I转换酶2(ACE2)、染色体X上的RefSeqGene(Gene Bank登录号NG_012575.1的核苷酸编号36780-36797互补的序列。
Figure BDA0004012301620000192
(ACE2ASO6+7)的合成(实施例15)
与实施例1的化合物同样,合成具有目的序列的实施例15的化合物。
本化合物通过负离子MALDI-TOFMS鉴定(计算值:6482、测定值:6482)。
本化合物的碱基序列是与智人血管紧张素I转换酶2(ACE2)、染色体X上的RefSeqGene(Gene Bank登录号NG_012575.1的核苷酸编号36807-36824互补的序列。
Figure BDA0004012301620000193
(ACE2ASO6-11)的合成(实施例16)
与实施例1的化合物同样,合成具有目的序列的实施例16的化合物。
本化合物通过负离子MALDI-TOFMS鉴定(计算值:6482、测定值:6482)。
本化合物的碱基序列是与智人血管紧张素I转换酶2(ACE2)、染色体X上的RefSeqGene(Gene Bank登录号NG_012575.1的核苷酸编号36825-36842互补的序列。
Figure BDA0004012301620000194
(ACE2ASO5+5)的合成(实施例17)
与实施例1的化合物同样,合成具有目的序列的实施例17的化合物。
本化合物通过负离子MALDI-TOFMS鉴定(计算值:6474、测定值:6474)。
本化合物的碱基序列是与智人血管紧张素I转换酶2(ACE2)、染色体X上的RefSeqGene(Gene Bank登录号NG_012575.1的核苷酸编号36770-36787互补的序列。
Figure BDA0004012301620000201
(ACE2ASO5+6)的合成(实施例18)
与实施例1的化合物同样,合成具有目的序列的实施例18的化合物。
本化合物通过负离子MALDI-TOFMS鉴定(计算值:6487、测定值:6489)。
本化合物的碱基序列是与智人血管紧张素I转换酶2(ACE2)、染色体X上的RefSeqGene(Gene Bank登录号NG_012575.1的核苷酸编号36769-36786互补的序列。
Figure BDA0004012301620000202
(ACE2ASO5+7)的合成(实施例19)
与实施例1的化合物同样,合成具有目的序列的实施例19的化合物。
本化合物通过负离子MALDI-TOFMS鉴定(计算值:6486、测定值:6488)。
本化合物的碱基序列是与智人血管紧张素I转换酶2(ACE2)、染色体X上的RefSeqGene(Gene Bank登录号NG_012575.1的核苷酸编号36768-36785互补的序列。
Figure BDA0004012301620000203
(ACE2ASO5+8)的合成(实施例20)
与实施例1的化合物同样,合成具有目的序列的实施例20的化合物。
本化合物通过负离子MALDI-TOFMS鉴定(计算值:6470、测定值:6474)。
本化合物的碱基序列是与智人血管紧张素I转换酶2(ACE2)、染色体X上的RefSeqGene(Gene Bank登录号NG_012575.1的核苷酸编号36767-36784互补的序列。
Figure BDA0004012301620000211
(ACE2ASO5+10)的合成(实施例21)
与实施例1的化合物同样,合成具有目的序列的实施例21的化合物。
本化合物通过负离子MALDI-TOFMS鉴定(计算值:6470、测定值:6472)。
本化合物的碱基序列是与智人血管紧张素I转换酶2(ACE2)、染色体X上的RefSeqGene(Gene Bank登录号NG_012575.1的核苷酸编号36765-36782互补的序列。
Figure BDA0004012301620000212
(ACE2ASO5+12)的合成(实施例22)
与实施例1的化合物同样,合成具有目的序列的实施例22的化合物。
本化合物通过负离子MALDI-TOFMS鉴定(计算值:6470、测定值:6472)。
本化合物的碱基序列是与智人血管紧张素I转换酶2(ACE2)、染色体X上的RefSeqGene(Gene Bank登录号NG_012575.1的核苷酸编号36763-36780互补的序列。
Figure BDA0004012301620000213
(ACE2ASO5c)的合成(实施例23)
与实施例1的化合物同样,合成具有目的序列的实施例23的化合物。
本化合物通过负离子MALDI-TOFMS鉴定(计算值:6403、测定值:6399)。
本化合物的碱基序列是与智人血管紧张素I转换酶2(ACE2)、染色体X上的RefSeqGene(Gene Bank登录号NG_012575.1的核苷酸编号36775-36792互补的序列。
(表1)
本实施例中合成的ASO的序列。大写字母是ENA核酸,小写字母是2′OMe。
Figure BDA0004012301620000221
〔试验例〕
实验方法
ACE2 mRNA的评价
用人肝癌细胞(HepG2,ATCC)通过RT-PCR评价ASO导入后的ACE2的剪接模式的变化。
细胞培养
用包含10%FBS(10270-106,gibco)的E-MEM培养基(051-07615,富士胶片和光纯药)培养人肝癌细胞(HepG2)。
ASO转染
1)在100μl Opti-MEM培养基(31985070,Thermo Fisher Scientific)中分别混合2μl ASO(用无核酸酶水(AM9932,Thermo Fisher Scientific)制成50pmol/μl)。无ASO处理则混合2μl无核酸酶水。
2)在另一管中在100μl Opti-MEM培养基中混合4μl Lipofectamine3000TransfectionReagent(L3000015,Thermo Fisher Scientific)。
3)混合1)液和2)液,在室温放置15分钟。
4)用PBS洗涤12-孔板中培养的人肝癌细胞(HepG2)1次后,在孔中加入800μlOpti-MEM培养基。
5)向4)添加3)液(ASO最终浓度100nM),在37℃5%CO2下培养3小时后,将培养基交换为包含10%FBS的E-MEM培养基,进一步继续培养。
RNA配制
1)将转染了各ASO的细胞培养24小时后,用PBS洗涤1次,向细胞添加300μl高纯RNA分离试剂盒(#11828665001,Roche Life Science)的RNA提取试剂。
2)在室温放置10分钟后,将孔内的RNA提取试剂回收在管中。
3)按照高纯RNA分离试剂盒的方案提取RNA,最终得到50μl的RNA溶解液。
逆转录反应
1)向500ng RNA加入随机引物(#48190011,Thermo Fisher Scientific)、dNTP混合物(各2.5mM)(#4030,Takara),在65℃温育5分钟,在25℃温育10分钟。
2)向1)液加入M-MLV反转录酶(#28025013,Thermo Fisher Scientific)、RNaseOUT重组核糖核酸酶抑制剂(#10777-019,Thermo Fisher Scientific)、DTT(M-MLV附带)、5x第一链缓冲液(M-MLV附带),在37℃温育55分钟,在70℃温育10分钟,得到cDNA。
PCR反应和反应产物的确认
1)对2μl得到的cDNA,添加1μl引物ACE2F2(5′-ctgttccgatcatctgttgc-3′:序列编号18)、1μl引物ACE2R2(5′-gagaccaaatacacactttccc-3′:序列编号19)、0.1μl的Takara ExTaq DNA聚合酶(#RR001A,Takara)、1.6μl的dNTP混合物(各2.5mM)、2μl的10x Ex Taq缓冲液、12.3μl无核酸酶水。
2)94℃加热3分钟。
3)进行30个循环的94℃0.5分钟·60℃0.5分钟·72℃1.5分钟的处理。
4)72℃加热3分钟。
5)对于PCR反应的反应产物,应用Agilent2100生物分析仪电泳系统(AgilentTechnology株式会社)进行PCR反应产物的电泳、定量。
6)对GAPDH,应用引物GAPDH H_F (5′-cccttcattgacctcaac-3′:序列编号20)、GAPDH H_R(5′-ttcacacccatgacgaac-3′:序列编号21),进行上述1)~5),(3)进行18个循环)。
实验结果
以ACE2的外显子18的跳跃为目的,制备23种具有与ACE2pre-mRNA的外显子18互补的序列的18个碱基的ASO(图1、3、5、7、9、11、13)。各ASO基于ACE2 pre-mRNA中剪接因子的结合预测制备。将人肝癌细胞(HepG2)用各自的ASO处理24小时后,用RT-PCR验证ACE2mRNA时,见到ACE2ASO3、4+5、4、4-13、5、5-5、5+5、5+7、5+8、5+10、5+12、5c处理下,外显子18跳跃ACE2在总ACE2中占据的比例的增加是显著的(图2、4、8、10、12、14)。
研究
由于ACE2作为病毒的受体对病毒感染是必需的,ACE2的受体功能的抑制作为针对病毒的预防性治疗方法被关注。实际上,报告了细胞中使ACE2抗体或肽作用抑制ACE2的功能时病毒感染减少。此外,也验证了通过使用siRNA降低ACE2的表达量而抑制病毒感染的方法。ACE2由18个外显子构成,预期通过使外显子18跳跃可以制备消除跨膜结构域的ACE2。因此,在本研究中,以利用ASO使ACE2的外显子18跳跃、通过跨膜结构域消除引起受体型ACE2的减少和游离型ACE2的增加为目的。由此,可以期望通过受体型ACE2的减少抑制病毒向细胞内摄入和通过能与病毒结合的游离型ACE2的增加捕获细胞外的病毒的双重效果。由于本发明的ACE2ASO3、4+5、4、4-13、5、5-5、5+5、5+7、5+8、5+10、5+12、5c的外显子18跳跃的ACE2在总ACE2中占据的比例增加,期望发挥对病毒感染预防的效果。
本说明书中引用的全部出版物、专利和专利申请原样作为参考并入本说明书。
产业上的可利用性
本发明可以用作基于ASO的预防治疗方法。知晓ASO诱导ACE2基因的外显子跳跃。该结果期望通过ACE2蛋白的降低而抑制病毒的体内侵入和通过溶解型ACE2产生经病毒诱饵(decoy)发挥病毒中和作用和Ang(1-7)作用。因此,考虑作为病毒感染的预防·治疗的鼻腔内施用和作为防止感染加重的治疗方法的静脉施用。应用该ASO预防·治疗的优点是:
1.施用途径容易得到:需要施用部位的残存评价
2.效果是双重作用:1)ACE2减少,2)病毒诱饵增加,3)Ang(1-7)增加
3.可以大量合成。
序列表自由文本
<序列编号1>显示血管紧张素转换酶2基因的外显子18的碱基序列。
Figure BDA0004012301620000251
<序列编号2~17和22~28>显示实施例中合成的ASO的碱基序列。构成反义寡核苷酸的核苷酸可以是天然型DNA、天然型RNA、DNA/RNA的嵌合物、它们的修饰物的任一种,此外,至少1个可以是修饰核苷酸。
<序列编号18~21>显示试验例中应用的引物的碱基序列。

Claims (24)

1.能够诱导血管紧张素转换酶2基因外显子跳跃的反义寡核苷酸、其盐或溶剂化物,所述反义寡核苷酸具有与血管紧张素转换酶2基因的外显子18的靶标部位互补的碱基序列、碱基数目是15~30。
2.权利要求1所述的反义寡核苷酸、其盐或溶剂化物,其中,血管紧张素转换酶2基因的外显子18的碱基序列是序列编号1的碱基序列,血管紧张素转换酶2基因的外显子18的靶标部位在序列编号1的碱基序列的碱基编号1~195的区内存在。
3.权利要求1或2中所述的反义寡核苷酸、其盐或溶剂化物,其中,反义寡核苷酸的碱基序列包含由序列编号2~17的任一种的碱基序列(但是,序列中的t可以是u,u可以是t)中连续的至少15个碱基组成的序列。
4.权利要求1~3的任一项中所述的反义寡核苷酸、其盐或溶剂化物,其中,反义寡核苷酸的碱基长度是18。
5.权利要求4所述的反义寡核苷酸、其盐或溶剂化物,其中,反义寡核苷酸的碱基序列是序列编号2~17的任一种的碱基序列(但是,序列中的t可以是u,u可以是t)。
6.权利要求1~5的任一项中所述的反义寡核苷酸、其盐或溶剂化物,其中,至少1个核苷酸被修饰。
7.权利要求6所述的反义寡核苷酸、其盐或溶剂化物,其中,构成修饰核苷酸的糖是D-呋喃核糖,D-呋喃核糖的2’位的羟基被修饰。
8.权利要求7所述的反义寡核苷酸、其盐或溶剂化物,其中,D-呋喃核糖被2’-O-烷基化和/或2’-O,4’-C-亚烷基化。
9.药物,其包含权利要求1~8的任一项中所述的反义寡核苷酸、其药学上可接受的盐或溶剂化物。
10.权利要求9所述的药物,其用于抑制SARS-CoV-2病毒的感染性。
11.权利要求10所述的药物,其具有通过受体型血管紧张素转换酶2的减少抑制病毒向细胞内摄入和/或通过能与病毒结合的溶解型血管紧张素转换酶2的增加捕获细胞外的病毒的效果。
12.权利要求8~11的任一项中所述的药物,其用于预防和/或治疗SARS-CoV-2感染。
13.药剂,其用于血管紧张素转换酶2蛋白表达的抑制和/或溶解型血管紧张素转换酶2表达的促进,其包含权利要求1~8的任一项中所述的反义寡核苷酸、其盐或溶剂化物。
14.缺乏跨膜结构域的溶解型血管紧张素转换酶2,其通过权利要求1~8的任一项中所述的反义寡核苷酸、其盐或溶剂化物诱导,通过血管紧张素转换酶2基因的外显子跳跃产生。
15.多核苷酸,其包含编码权利要求14所述的溶解型血管紧张素转换酶2的核苷酸序列和/或与其互补的序列。
16.抑制SARS-CoV-2病毒的感染性的方法,其包括以有效量向受试者施用权利要求1~8的任一项中所述的反义寡核苷酸、其药学上可接受的盐或溶剂化物。
17.预防和/或治疗SARS-CoV-2感染的方法,其包括以有效量向受试者施用权利要求1~8的任一项中所述的反义寡核苷酸、其药学上可接受的盐或溶剂化物。
18.血管紧张素转换酶2蛋白的表达抑制和/或溶解型血管紧张素转换酶2的表达促进方法,其包括以有效量向受试者施用权利要求1~8的任一项中所述的反义寡核苷酸、其药学上可接受的盐或溶剂化物。
19.权利要求1~8的任一项中所述的反义寡核苷酸、其药学上可接受的盐或溶剂化物,其用于在抑制SARS-CoV-2病毒的感染性的方法中使用。
20.权利要求1~8的任一项中所述的反义寡核苷酸、其药学上可接受的盐或溶剂化物,其用于在预防和/或治疗SARS-CoV-2感染的方法中使用。
21.权利要求1~8的任一项中所述的反义寡核苷酸、其药学上可接受的盐或溶剂化物,其用于在血管紧张素转换酶2蛋白的表达抑制和/或溶解型血管紧张素转换酶2的表达促进方法中使用。
22.权利要求1~8的任一项中所述的反义寡核苷酸、其药学上可接受的盐或溶剂化物在制备用于抑制SARS-CoV-2病毒的感染性的药物中的应用。
23.权利要求1~8的任一项中所述的反义寡核苷酸、其药学上可接受的盐或溶剂化物在制备用于预防和/或治疗SARS-CoV-2感染的药物中的应用。
24.权利要求1~8的任一项中所述的反义寡核苷酸、其药学上可接受的盐或溶剂化物在制备用于血管紧张素转换酶2蛋白的表达抑制和/或溶解型血管紧张素转换酶2的表达促进的药物中的应用。
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