JP4944034B2 - Ｐｔｐ１ｂ発現のアンチセンス調節 - Google Patents

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Description

（関連出願への相互参照）
本出願は、2004年10月13日に出願された出願番号60/618,384、2005年2月14日に出願された出願番号60/653,165、2005年3月24日に出願された出願番号60/665,555、および2005年6月9日に出願された出願番号60/688,984に関連し、それぞれはその全体を参照によって本明細書中に援用される。
（配列リスト）
配列リストのコピー紙および2005年10月13日に作成され、BIOL0044WOSEQ.txtと名づけられたファイルを含む、ディスク上でコンピューター読み取り可能な形式の配列リストが、参照によって本明細書中に援用される。
（発明の背景）
キナーゼと呼ばれる酵素の作用によるリン酸部分の生物学的分子への結合として定義されるリン酸化のプロセスは、細胞内シグナルが伝達される1つの経路を示し、最終的に細胞の応答を生じる。細胞内でタンパク質は、セリン、トレオニンまたはチロシン残基でリン酸化され得る。リン酸化の程度は、リン酸部分を除去するホスファターゼの逆の作用で調節される。細胞内でのタンパク質のリン酸化の大半は、セリン残基およびトレオニン残基にあり、チロシンリン酸化は、腫瘍形成の形質転換および成長因子の刺激の間に最大の程度まで調節される(Zhang, Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol., 1998, 33, 1-52)。
リン酸化は、上記のような細胞内で遍在するプロセスであり、かつ細胞の表現型はこれらの経路の活性化によって主に影響を及ぼされるので、多くの疾患状態および／または障害はキナーゼおよびホスファターゼの異常な活性化またはキナーゼおよびホスファターゼの機能的な変異のいずれかの結果であるということが現在信じられている。結果的に、考慮すべき注意が、チロシンキナーゼおよびチロシンホスファターゼの特徴づけに最近向けられている。
PTP1B(タンパク質ホスファターゼ1BおよびPTPN1としても公知)は、ヒト胎盤の主要なタンパク質チロシンホスファターゼとして元々単離された、小胞体(ER)関連酵素である(Tonkら、J. Biol. Chem., 1988, 263, 6731-6737; Tonksら、J. Biol. Chem., 1988, 263, 6722-6730)。
インシュリンレセプターで媒介されるシグナリングの実質的な調節役割が、PTP1Bについて確立されている。PTP1Bは、インビトロおよびインタクトな細胞の両方で活性化されたインシュリンレセプターと相互作用し、かつこれを脱リン酸化し、シグナリング経路のダウンレギュレーションを生じる(Goldsteinら、Mol. Cell. Biochem., 1998, 182, 91-99; Seelyら、Diabetes, 1996, 45, 1379-1385)。さらに、PTP1Bはインシュリンの有糸分裂促進作用を調節する(Goldsteinら、Mol. Cell. Biochem., 1998, 182, 91-99)。PTP1Bを過剰発現するラットの脂肪細胞において、GLUT4グルコーストランスポーターの移動が阻害され、グルコース輸送の負の制御因子としてのPTP1Bもなお意味した(Chenら、J. Biol. Chem., 1997, 272, 8026-8031)。
PTP1B遺伝子を欠損するマウスのノックアウトモデルはまた、PTP1Bによるインシュリンシグナリングの負の制御を示す。壊れたPTP1B遺伝子を含むマウスは、インシュリンレセプターの増大したインシュリン感受性および増大したリン酸化を示した。高脂肪の食餌に置かれた場合にPTP1B−/−マウスは、体重増加に耐性であり、インシュリン感受性のままであった（Elcheblyら、Science, 1999, 283, 1544-1548）。これらの研究は明らかに、糖尿病および肥満の処置における治療標的としてのPTP1Bを確立する。
糖尿病および肥満（現在、時々集合的に「糖尿肥満(Diabesity)」と称される）は相互に関係づけられる。大部分のヒトの肥満は、インシュリン耐性およびレプチン耐性と関連する。事実、肥満は、糖尿病自体が影響を与えるよりもインシュリン作用にいっそう大きな影響を与え得る(Sindelkaら、Physiol Res., 2002, 51, 85-91)。X症候群またはメタボリック症候群は、共に生じる場合に糖尿病および心臓血管疾患への疾病素質を示し得る状態の集団に対する新しい用語である。高血圧、高トリグリセリド、減少されたHDLおよび肥満を含むこれらの症状は、一部の人で一緒に現れる傾向がある。糖尿病および肥満の両方での役割のために、PTP1Bは糖尿病、肥満およびメタボリック症候群を含む代謝状態の範囲に対して治療標的であると信じられている。血糖のコントロールを改善することで、PTP1Bのインヒビターはまた、網膜症、神経障害、心臓血管合併症および腎障害を含む、糖尿病の続発症を緩徐、防止、遅延または改善することに有用であり得る。
細胞周期中に別々に調節されるPTP1B(Schievellaら、Cell. Growth Differ., 1993, 4, 239-246)は、プレmRNAの選択的なスプライシングから生じる、2つの異なるアイソフォームとしてインシュリン感受性の組織で発現される(ShifrinおよびNeel, J. Biol. Chem., 1993, 268, 25376-25384)。選択的にスプライシングされた産物の割合は、インシュリンのような成長因子によって影響を受け、調査される種々の組織で異なる(SellおよびReese, Mol. Gnet. Metab., 1999, 66, 189-192)。これらの研究において、バリアントのレベルが血漿インシュリン濃度および体脂肪率と相互に関係した。これらのバリアントはそれゆえに、慢性の高インシュリン血症または2型糖尿病を有する患者に対する生体マーカーとして使用され得る。
PTP1Bヌルマウスは、野生型の同腹子と比較されるサイズにおいて正常であり、野生型のコントロールと比較される老齢時に増大された腫瘍形成率を示さない(Dube, N. PNAS, 2004, 101:1834-1839)。インシュリンレセプターに構造上相同する、上皮成長因子レセプターおよびインシュリン様成長因子レセプターを含むいくつかの他の成長因子レセプターを介したシグナリングは、PTP1Bノックアウトマウスと野生型マウスの間で変化してなかった。
現在、PTP1Bの合成または作用を阻害するように設計された治療剤は、低分子(Hamら、Bioorg. Med. Chem. Lett., 1999, 9, 185-186; Skoreyら、J. Biol. Chem., 1997, 272, 22472-22480; Taingら、Biochemistry, 1999, 38, 3793-3803; Taylorら、Bioorg. Med. Chem., 1998, 6, 1457-1468; Wangら、Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 345-350; Wangら、Biochem. Pharmacol., 1997, 54, 703-711; Yaoら、Bioorg. Med. Chem., 1998, 6, 1799-1810)およびペプチド (Chenら、Biochemistry, 1999, 38, 384-389; Desmaraisら、Arch. Biochem. Biophys., 1998, 354, 225-231; Rollerら、Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2149-2150) を含む。さらに、国際特許出願公開公報WO 97/32595(Olefsky, 1997)は、インシュリン耐性と関連する障害の処置のために、活性化されたインシュリンレセプターとPTP1Bの結合を阻害する、ホスホペプチドおよび抗体に言及し、PTP1Bに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドに広く言及している。
国際特許出願公開公報WO 03/099227(Lewisら)は、PTP1Bポリペプチドの発現を干渉し得る低分子干渉RNA(siRNA)、ならびに医薬組成物および方法に言及している。
国際特許出願公開公報WO 03/070881(McSwiggenら)は、短鎖干渉核酸(siNA)、短鎖干渉RNA(siRNA)、二重鎖RNA(dsRNA)、マイクロRNA(miRNA)、および短鎖ヘアピンRNA(shRNA)分子を用いたRNA干渉(RNAi)によって1つ以上のPTP1B遺伝子の発現をダウンレギュレートする短鎖干渉核酸(siNA)分子に言及している。
糖尿病、肥満および関連する障害を処置するために、他の化合物と組み合わせてPTP1B機能を効果的に阻害し得るさらなる薬剤および組成物に対して長期間感じられた必要性がある。
（発明の要約）
被験体におけるHbA1cレベルを減少する方法が本明細書中に提供される。好ましい態様において、該被験体はヒトである。1つの態様において、方法は、核酸塩基配列「GCTCCTTCCACTGATCCTGC」（配列番号17）を有し、かつPTP1Bを標的とするオリゴヌクレオチドを該被験体に投与する工程を含む。好ましい態様において、該オリゴヌクレオチドが複数の用量からなった投薬養生法で投与される。1つの態様において、被験体は2型糖尿病を有するか、あるいは投与工程の前に、該被験体が少なくとも130mg/dLの絶食時血糖レベル、少なくとも6％のHbA1cレベル、または25kg/m２より大きい体重指数を示す。1つの態様において、被験体は2型糖尿病を有するか、あるいは投与工程の前に、該被験体が少なくとも130mg/dLの絶食時血糖レベル、少なくとも6.8％のHbA1cレベル、または25kg/m２より大きい体重指数を示す。1つの態様において、該被験体は少なくとも約6％、少なくとも約7％、少なくとも約8％、少なくとも約9％、少なくとも約10％または少なくとも約11％のHbA1cレベルを示す。好ましい態様において、該被験体は、インシュリン、スルホニル尿素、またはメトホルミンの治療養生法で正常のグルコースレベルを達成しない。好ましい態様において、HbA1cレベルは、約7％以下に減少される。いくつかの態様において、用量はおよそ毎日、週に1回、週に2回、または月に1回投与される。1つの態様において、該複数の用量の各用量が、約0.5〜約7.5mg/kgのオリゴヌクレオチドを含む。好ましい態様において、該複数の用量の各用量が約100〜約200mgのオリゴヌクレオチドを含む。他の好ましい態様において、該複数の用量の各用量が約400mgのオリゴヌクレオチドを含む。好ましい態様において、オリゴヌクレオチドが、3'末端および5'末端で5個の2'-O-(2-メトキシエチル)ヌクレオチドに接する10個のデオキシヌクレオチドギャップ領域を特徴とし、全てのシトシンヌクレオチドが任意に5-メチルシトシンであるか、あるいは少なくとも1つのヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である。全てのシトシンは、5-メチルシトシンであり得、各ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートであり得るか、またはその両方であり得る。本明細書中に使用される場合、用語「ISIS 113715」とは、3'末端および5'末端で5個の2'-O-(2-メトキシエチル)ヌクレオチドに接する10個のデオキシヌクレオチドギャップ領域を有する配列番号17のオリゴヌクレオチドのことをいい、ここで全てのシトシンヌクレオチドは、5-メチルシトシンであり、各ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合である。
被験体において絶食時グルコースレベルを減少する方法が本明細書中にさらに提供される。好ましい態様において、該被験体はヒトである。1つの態様において、方法は、核酸塩基配列「GCTCCTTCCACTGATCCTGC」（配列番号17）を有し、かつPTP1Bを標的とするオリゴヌクレオチドを該被験体に投与する工程を含む。絶食時グルコースは、絶食時血糖、絶食時血清グルコースまたは絶食時血漿グルコースであり得る。好ましい態様において、該オリゴヌクレオチドが複数の用量からなった投薬養生法で投与される。いくつかの態様において、絶食時血漿グルコースレベルは少なくとも約25mg/dLまたは少なくとも約10mg/dLまで減少される。1つの態様において、被験体は2型糖尿病を有するか、あるいは投与工程の前に、該被験体が少なくとも130mg/dLの絶食時血糖レベル、少なくとも6％のHbA1cレベル、または25kg/m２より大きい体重指数を示す。1つの態様において、被験体は2型糖尿病を有するか、あるいは投与工程の前に、該被験体が少なくとも130mg/dLの絶食時血糖レベル、少なくとも6.8％のHbA1cレベル、または25kg/m２より大きい体重指数を示す。好ましい態様において、該被験体は、インシュリン、スルホニル尿素、またはメトホルミンの治療養生法で正常のグルコースレベルを達成しない。好ましい態様において、HbA1cレベルは、約7％以下に減少される。いくつかの態様において、用量はおよそ毎日、週に1回、週に2回、または月に1回投与される。1つの態様において、該複数の用量の各用量が、約0.5〜約7.5mg/kgのオリゴヌクレオチドを含む。好ましい態様において、該複数の用量の各用量が約100〜約200mgのオリゴヌクレオチドを含む。好ましい態様において、オリゴヌクレオチドが3'末端および5'末端で5個の2'-O-(2-メトキシエチル)ヌクレオチドに接する10個のデオキシヌクレオチドギャップ領域を特徴とし、全てのシトシンヌクレオチドが任意に5-メチルシトシンであるか、あるいは少なくとも1つのヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である。全てのシトシンは、5-メチルシトシンであり得、各ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートであり得るか、またはその両方であり得る。さらなる態様において、オリゴヌクレオチドはISIS 113715である。
被験体において、過脂肪、アポリポプロテインBレベル、LDLレベル、コレステロールレベル、トリグリセリドレベル、VLDLレベル、またはLDL：HDL比もしくはコレステロール：HDL比を減少する方法も提供される。被験体において、アディポネクチンレベル、代謝率、HDLレベルもしくはHDL：LDL比またはHDL：コレステロール比を増大する方法も提供される。好ましい態様において、該被験体はヒトである。代謝率が増大する肥満を処置する方法も提供される。好ましい態様において、方法は、核酸塩基配列「GCTCCTTCCACTGATCCTGC」（配列番号17）を有し、かつPTP1Bを標的とするオリゴヌクレオチドの複数の用量を該被験体に投与する工程を含む。好ましい態様において、該オリゴヌクレオチドが複数の用量からなった投薬養生法で投与される。いくつかの態様において、絶食時血漿グルコースレベルは少なくとも約25mg/dLまたは少なくとも約10mg/dLまで減少される。いくつかの態様において、用量はおよそ週に1回、週に2回、または毎日投与される。1つの態様において、該複数の用量の各用量が、約0.5〜約7.5mg/kgのオリゴヌクレオチドを含む。好ましい態様において、該複数の用量の各用量が約100〜約200mgのオリゴヌクレオチドを含む。好ましい態様において、オリゴヌクレオチドが、3'末端および5'末端で5個の2'-O-(2-メトキシエチル)ヌクレオチドに接する10個のデオキシヌクレオチドギャップ領域を特徴とし、シトシンヌクレオチドが任意に5-メチルシトシンであるか、あるいは少なくとも1つのヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である。全てのシトシンは、5-メチルシトシンであり得、各ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートであり得るか、またはその両方であり得る。
核酸塩基配列「GCTCCTTCCACTGATCCTGC」（配列番号17）を含み、かつPTP1Bを標的とするオリゴヌクレオチドを動物に投与工程を含み、ここで該オリゴヌクレオチドが負荷期間および維持期間中に投与される、絶食時グルコースレベルまたはHbA1cレベルを減少する方法、あるいは脂質レベルを改変する方法、またはその組み合わせも考慮される。いくつかの態様において、核酸塩基配列「GCTCCTTCCACTGATCCTGC」（配列番号17）を有し、PTP1Bを標的とし、かつ3'末端および5'末端で5個の2'-O-(2-メトキシエチル)ヌクレオチドに接する10個のデオキシヌクレオチドギャップ領域を特徴とするオリゴヌクレオチドが注射または経口で投与される。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは静脈注射または皮下注射で投与される。好ましい態様において、被験体はヒトである。いくつかの態様において、負荷期間は、器官におけるオリゴヌクレオチドの少なくとも70〜80％の定常状態レベルを生じる。いくつかの態様において、負荷期間は、オリゴヌクレオチドを被験体に1日あたり1回を10日間まで、1週あたり1回を約3週間、または1週あたり2回を約3週間投与する工程を含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは負荷期間中に静脈送達される。他の態様において、オリゴヌクレオチドは負荷期間中に皮下送達される。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは維持期間中に皮下送達される。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは投与あたり少なくとも1つの注射部位で皮下送達される。いくつかの態様において、注射部位は腹部である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドが投与あたり1つより多くの注射部位で皮下送達される。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドが投与あたり1つより多くの注射部位で皮下送達され、2つの連続注射が腹部の同じ四半分の注射部位にはない。
1つの態様において、維持期間がオリゴヌクレオチドを少なくとも約週に1回投与する工程を含む。1つの態様において、負荷期間中の投薬養生法が、処置の第１週中に少なくとも約70〜80％の定常状態の器官レベルを生じる。
本発明のいくつかの態様において、被験体が処置の開始前に高血糖症を示すか、あるいは約130mg/dLを超える絶食時血糖レベル、少なくとも約7％の基準HbA1cレベル、または25kg/m２より大きい体重指数（body mass index）を示す。
本明細書中に提供される方法は、別のグルコース低下治療薬を投与する工程をさらに含み得る。いくつかの態様において、該グルコース低下治療薬はPPARアゴニスト(γ、二重、またはパン(pan))、ジペプチジルペプチダーゼ(IV)インヒビター、GLP-1アナログ、インシュリンもしくはインシュリンアナログ、インシュリン分泌促進物質、SGLT2インヒビター、ヒトアミリンアナログ、ビグアニド、またはαグルコシダーゼインヒビターである。いくつかの態様において、さらなるグルコース低下治療薬はメトホルミン、スルホニル尿素、またはロシグリタゾンである。
少なくとも1つのグルコース低下治療薬、および核酸塩基配列「GCTCCTTCCACTGATCCTGC」（配列番号17）を有し、かつPTP1Bを標的とするオリゴヌクレオチドを含む組み合わせ治療を被験体に投与する工程を含み、該オリゴヌクレオチドが負荷期間および維持期間中に投与される、被験体において高血糖症、2型糖尿病、前糖尿病、メタボリック症候群、または肥満を処置する方法が本明細書中に提供される。かかる組み合わせ治療を用いて血糖を減少する方法も考慮される。該グルコース低下治療薬はPPARアゴニスト(γ、二重、またはパン)、ジペプチジルペプチダーゼ(IV)インヒビター、GLP-1アナログ、インシュリンもしくはインシュリンアナログ、インシュリン分泌促進物質、SGLT2インヒビター、ヒトアミリンアナログ、ビグアニド、またはαグルコシダーゼインヒビターであり得る。いくつかの態様において、グルコース低下治療薬はメトホルミン、スルホニル尿素、またはロシグリタゾンである。いくつかの態様において、グルコース低下治療薬はGLP-1アナログである。いくつかの態様において、GLP-1アナログはエキセンディン-4またはリラグルチドである。他の態様において、グルコース低下治療薬はスルホニル尿素である。いくつかの態様において、スルホニル尿素がアセトへキサミド、クロルプロパミド、トルブタミド、トラザミド、グリメピリド、グリピザイド、グリブリド、またはグリクラジドである。いくつかの態様において、グルコース低下薬がビグアニドである。いくつかの態様において、ビグアニドがメトホルミンである。いくつかの態様において、メトホルミンのみで処置された後に観察される乳酸アシドーシスと比較された場合に、血糖レベルが増大した乳酸アシドーシスなしに減少される。いくつかの態様において、グルコース低下薬がメグリチニドである。いくつかの態様において、メグリチニドがナテグリニドまたはレパグリニドである。いくつかの態様において、グルコース低下薬がチアゾリジンジオンである。いくつかの態様において、チアゾリジンジオンがピオグリタゾン、ロシグリタゾン、またはトログリタゾンである。いくつかの態様において、ロシグリタゾン処置のみで観察されるよりも血糖レベルが大きい体重増加なしに減少される。
いくつかの態様において、グルコース低下薬がα-グルコシダーゼインヒビターである。いくつかの態様において、α-グルコシダーゼインヒビターがアカルボースまたはミグリトールである。いくつかの態様において、グルコース低下治療薬がインシュリンまたはインシュリンアナログである。
少なくとも１つの脂質低下治療薬、および核酸塩基配列「GCTCCTTCCACTGATCCTGC」（配列番号17）を有し、かつPTP1Bを標的とするオリゴヌクレオチドを含む組み合わせ治療を被験体に投与する工程を含み、該オリゴヌクレオチドが負荷期間および維持期間中に投与される、被験体において高血糖症、前糖尿病、2型糖尿病、メタボリック症候群、または肥満を処置する方法も提供される。少なくとも１つの抗肥満治療薬、および核酸塩基配列「GCTCCTTCCACTGATCCTGC」（配列番号17）を有し、かつPTP1Bを標的とするオリゴヌクレオチドを含む組み合わせ治療を被験体に投与する工程を含み、該オリゴヌクレオチドが負荷期間および維持期間中に投与される、被験体において高血糖症、前糖尿病、2型糖尿病、メタボリック症候群、または肥満を処置する方法がさらに提供される。核酸塩基配列「GCTCCTTCCACTGATCCTGC」（配列番号17）を有し、かつPTP1Bを標的とするオリゴヌクレオチドを被験体に投与する工程を含み、該オリゴヌクレオチドが注射で投与され、注射部位に局所ステロイドを投与する工程をさらに含む、被験体において前糖尿病、高血糖症、2型糖尿病、メタボリック症候群、または肥満を処置する方法も提供される。
本発明はまた、10mg/mL、200mg/mLまたは250mg/mLの滅菌溶液としてISIS 113715を含むバイアルを提供する。1つの態様において、バイアルはリン酸バッファ、塩化ナトリウム、および水を含み、かつ等張性である10mg/mLのISIS 113715溶液を含む。別の態様において、バイアルは、水を含み、かつ高張性である200mg/mLのISIS 113715溶液を含む。別の態様において、バイアルは、水を含み、かつ高張性である250mg/mLのISIS 113715溶液を含む。いくつかの態様において、バイアルはまた、保存剤を含む。いくつかの態様において、保存剤がメタクレゾールである。
本発明はまた、滅菌凍結乾燥された粉末としてISIS 113715を含むバイアルを提供する。1つの態様において、バイアルが150mgのISIS 113715を含む。別の態様において、バイアルは滅菌保存された希釈剤を添加される。別の態様において、滅菌保存された希釈剤は、0.1〜1.0％のメタクレゾールを含む。好ましい態様において、滅菌保存された希釈剤は、0.3％のメタクレゾールを含む。
核酸塩基配列「GCTCCTTCCACTGATCCTGC」（配列番号17）を有し、かつPTP1Bを標的とするオリゴヌクレオチドの1つ以上の用量を含む医薬組成物が本明細書中にさらに提供され、ここで該1つ以上の用量のそれぞれが約50mg〜約900mgの範囲であり、1つ以上の負荷用量の投与後に約0.5mg/kg体重〜約7.5mg/kg体重での該オリゴヌクレオチドの被験体への皮下投与が、少なくとも約32％の血漿の絶対的な生物学的利用能を達成するのに十分である。いくつかの態様において、該医薬組成物の投与が少なくとも日に1回、少なくとも週に1回、または少なくとも月に1回生じる。
血糖レベルを減少するための医薬の調製のための、核酸塩基配列「GCTCCTTCCACTGATCCTGC」（配列番号17）を有し、かつPTP1Bを標的とするオリゴヌクレオチドの使用も本明細書中に提供され、ここで該医薬は負荷期間および維持期間中に投与される。いくつかの態様において、医薬は皮下投与または静脈投与される。他の態様において、該医薬の投与が少なくとも日に1回、少なくとも週に1回、または少なくとも月に1回生じる。いくつかの態様において、医薬に存在するオリゴヌクレオチドが、約50mg〜約900mgの用量で投与される。該医薬は2型糖尿病、メタボリック症候群、または肥満を示す被験体に投与され得る。
1つの側面において、本発明は、少なくとも1つのグルコース低下薬と組み合わせたPTP1B発現のアンチセンスインヒビターを動物に投与する工程を含む、動物において血糖レベルを減少させるか、あるいは動物において血糖レベルの増大の開始を防止または遅延する組成物および方法に関する。
別の側面において、本発明はまた、少なくとも1つのグルコース低下薬と組み合わせたPTP1B発現のアンチセンスインヒビターを動物に投与する工程を含む、動物においてインシュリン感受性を改善するか、あるいは動物においてインシュリン耐性の開始を防止または遅延する組成物および方法に関する。
さらなる側面において、本発明はさらに、少なくとも1つのグルコース低下薬と組み合わせたPTP1B発現のアンチセンスインヒビターを動物に投与する工程を含む、動物において代謝状態を処置するか、あるいは動物において代謝状態の開始を防止または遅延する組成物および方法に関する。代謝状態は、例えば、糖尿病または肥満であり得る。
本発明の他の態様は、PTP1B発現のアンチセンスインヒビターを動物に投与する工程を含む、動物においてコレステロールレベル、LDLレベルおよびVLDLレベルを減少する方法を含む。本発明の別の態様は、PTP1Bのアンチセンスインヒビターを動物に投与する工程を含む、動物においてHDLレベルを増大する方法である。本発明の別の態様は、PTP1Bのアンチセンスインヒビターを動物に投与する工程を含む、動物においてLDL：HDL比または全コレステロール：HDL比を減少する方法である。本発明の別の態様は、PTP1Bのアンチセンスインヒビターを動物に投与する工程を含む、動物においてHDL：LDL比またはHDL：全コレステロール比を増大する方法である。本発明の別の態様は、HDLの増加、LDLの低下、VLDLの低下、トリグリセリドの低下、アポリポプロテインBレベルの低下、あるいは全コレステロールレベルの低下、またはその組み合わせを含む、動物において脂質プロフィールを改善する方法である。
好ましい態様において、PTP1Bのアンチセンスインヒビターは、配列番号17の核酸塩基配列を有する。他の好ましい態様において、PTP1BのアンチセンスインヒビターはISIS 113715である。
他の側面および利点は以下の発明の詳細な説明に開示される。
（発明の詳細な説明）
本発明の特定の態様が、以下の番号をつけたパラグラフに記載される。
1. 核酸塩基配列「GCTCCTTCCACTGATCCTGC」（配列番号17）を有し、かつPTP1Bを標的とするオリゴヌクレオチドを被験体に投与する工程を含む、被験体においてHbA1cレベルを減少する方法。
2. 該オリゴヌクレオチドが複数の用量からなった投薬養生法で投与される、パラグラフ１記載の方法。
3. 該被験体が2型糖尿病を有する、パラグラフ１記載の方法。
4. 投与工程の前に、該被験体が少なくとも130mg/dLの絶食時血糖レベル、少なくとも6％のHbA1cレベル、または25kg/m２より大きい体重指数を示す、パラグラフ１記載の方法。
5. 該被験体がインシュリン、スルホニル尿素、またはメトホルミンの治療養生法で正常のグルコースレベルを達成しない、パラグラフ４記載の方法。
6. HbA1cレベルが、約7％に減少される、パラグラフ１記載の方法。
7. HbA1cレベルが、約7％以下に減少される、パラグラフ１記載の方法。
8. 該用量がおよそ週に1回投与される、パラグラフ２記載の方法。
9. 該用量がおよそ週に2回投与される、パラグラフ２記載の方法。
10. 該用量が毎日投与される、パラグラフ２記載の方法。
11. 該複数の用量の各用量が約0.5〜約7.5mg/kgのオリゴヌクレオチドを含む、パラグラフ１記載の方法。
12. 該複数の用量の各用量が約100〜約200mgのオリゴヌクレオチドを含む、パラグラフ１記載の方法。
13. 該オリゴヌクレオチドが3'末端および5'末端で5個の2'-O-(2-メトキシエチル)ヌクレオチドに接する10個のデオキシヌクレオチドギャップ領域を特徴とし、全てのシトシンが5-メチルシトシンであるか、あるいは少なくとも1つのヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である、パラグラフ１〜１２いずれか記載の方法。
14. 全てのシトシンが5-メチルシトシンである、パラグラフ１３記載の方法。
15. 各ヌクレオシド間結合がホスホロチオエートである、パラグラフ１３記載の方法。
16. 核酸塩基配列「GCTCCTTCCACTGATCCTGC」（配列番号17）を有し、かつPTP1Bを標的とするオリゴヌクレオチドを被験体に投与する工程を含む、被験体において絶食時グルコースレベルを減少する方法。
17. 絶食時グルコースが絶食時血糖、絶食時血清グルコース、または絶食時血漿グルコースである、パラグラフ１６記載の方法。
18. 該オリゴヌクレオチドが複数の用量からなった投薬養生法で投与される、パラグラフ１６記載の方法。
19. 絶食時血漿グルコースレベルが少なくとも約25mg/dLまで減少される、パラグラフ１６記載の方法。
20. 絶食時血漿グルコースレベルが少なくとも約10mg/dLまで減少される、パラグラフ１６記載の方法。
21. 該複数の用量の少なくとも1つの用量が約週に一回投与される、パラグラフ１６記載の方法。
22. 該複数の用量の少なくとも1つの用量が約隔週毎に一回投与される、パラグラフ１６記載の方法。
23. 該複数の用量の少なくとも1つの用量が約日に一回投与される、パラグラフ１６記載の方法。
24. 該複数の用量の各用量が約0.5〜約7.5mg/kgを含む、パラグラフ１６記載の方法。
25. 該複数の用量の各用量が、週あたり約100〜約200mgのオリゴヌクレオチドを含む、パラグラフ１６記載の方法。
26. 該オリゴヌクレオチドが3'末端および5'末端で5個の2'-O-(2-メトキシエチル)ヌクレオチドに接する10個のデオキシヌクレオチドギャップ領域を特徴とし、全てのシトシンが5-メチルシトシンであり、かつ各ヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である、パラグラフ１６〜２５いずれか記載の方法。
27. 核酸塩基配列「GCTCCTTCCACTGATCCTGC」（配列番号17）を有し、かつPTP1Bを標的とするオリゴヌクレオチドの複数の用量を被験体に投与する工程を含む、被験体において代謝率を増大する方法。
28. 核酸塩基配列「GCTCCTTCCACTGATCCTGC」（配列番号17）を有し、かつPTP1Bを標的とする該オリゴヌクレオチドが、3'末端および5'末端で5個の2'-O-(2-メトキシエチル)ヌクレオチドに接する10個のデオキシヌクレオチドギャップ領域を特徴とする、パラグラフ２７記載の方法。
29. 核酸塩基配列「GCTCCTTCCACTGATCCTGC」（配列番号17）を有し、かつPTP1Bを標的とするオリゴヌクレオチドの複数の用量を被験体に投与する工程を含む、被験体においてLDLレベルを減少する方法。
30. 核酸塩基配列「GCTCCTTCCACTGATCCTGC」（配列番号17）を有し、かつPTP1Bを標的とする該オリゴヌクレオチドが、3'末端および5'末端で5個の2'-O-(2-メトキシエチル)ヌクレオチドに接する10個のデオキシヌクレオチドギャップ領域を特徴とする、パラグラフ２９記載の方法。
31. 核酸塩基配列「GCTCCTTCCACTGATCCTGC」（配列番号17）を有し、かつPTP1Bを標的とするオリゴヌクレオチドの複数の用量を被験体に投与する工程を含む、被験体においてコレステロールレベルを減少する方法。
32. 核酸塩基配列「GCTCCTTCCACTGATCCTGC」（配列番号17）を有し、かつPTP1Bを標的とする該オリゴヌクレオチドが、3'末端および5'末端で5個の2'-O-(2-メトキシエチル)ヌクレオチドに接する10個のデオキシヌクレオチドギャップ領域を特徴とする、パラグラフ３１記載の方法。
33. 核酸塩基配列「GCTCCTTCCACTGATCCTGC」（配列番号17）を有し、かつPTP1Bを標的とするオリゴヌクレオチドの複数の用量を被験体に投与する工程を含む、被験体においてHDLレベルを増大する方法。
34. 核酸塩基配列「GCTCCTTCCACTGATCCTGC」（配列番号17）を有し、かつPTP1Bを標的とする該オリゴヌクレオチドが、3'末端および5'末端で5個の2'-O-(2-メトキシエチル)ヌクレオチドに接する10個のデオキシヌクレオチドギャップ領域を特徴とする、パラグラフ３３記載の方法。
35. 核酸塩基配列「GCTCCTTCCACTGATCCTGC」（配列番号17）を有し、かつPTP1Bを標的とするオリゴヌクレオチドの複数の用量を被験体に投与する工程を含む、被験体においてHDL:LDL比を増大する方法。
36. 核酸塩基配列「GCTCCTTCCACTGATCCTGC」（配列番号17）を有し、かつPTP1Bを標的とする該オリゴヌクレオチドが、3'末端および5'末端で5個の2'-O-(2-メトキシエチル)ヌクレオチドに接する10個のデオキシヌクレオチドギャップ領域を特徴とする、パラグラフ３５記載の方法。
37. 核酸塩基配列「GCTCCTTCCACTGATCCTGC」（配列番号17）を有し、かつPTP1Bを標的とするオリゴヌクレオチドの複数の用量を被験体に投与する工程を含む、被験体において循環トリグリセリドを減少する方法。
38. 核酸塩基配列「GCTCCTTCCACTGATCCTGC」（配列番号17）を有し、かつPTP1Bを標的とする該オリゴヌクレオチドが、3'末端および5'末端で5個の2'-O-(2-メトキシエチル)ヌクレオチドに接する10個のデオキシヌクレオチドギャップ領域を特徴とする、パラグラフ３７記載の方法。
39. 核酸塩基配列「GCTCCTTCCACTGATCCTGC」（配列番号17）を有し、かつPTP1Bを標的とするオリゴヌクレオチドの複数の用量を被験体に投与する工程を含む、被験体において過脂肪を減少する方法。
40. 核酸塩基配列「GCTCCTTCCACTGATCCTGC」（配列番号17）を有し、かつPTP1Bを標的とする該オリゴヌクレオチドが、3'末端および5'末端で5個の2'-O-(2-メトキシエチル)ヌクレオチドに接する10個のデオキシヌクレオチドギャップ領域を特徴とする、パラグラフ３９記載の方法。
41. 核酸塩基配列「GCTCCTTCCACTGATCCTGC」（配列番号17）を含み、かつPTP1Bを標的とするオリゴヌクレオチドを動物に投与する工程を含み、該オリゴヌクレオチドが負荷期間および維持期間中に投与される、動物において絶食時グルコースレベルまたはHbA1cレベルを減少する方法。
42. 負荷期間が器官におけるオリゴヌクレオチドの少なくとも70〜80％の安定状態レベルを生じる、パラグラフ４１記載の方法。
43. 負荷期間がオリゴヌクレオチドを被験体に1日あたり1回を10日間まで投与する工程を含む、パラグラフ４１記載の方法。
44. 負荷期間がオリゴヌクレオチドを被験体に約1週あたり1回を約3週間投与する工程を含む、パラグラフ４１記載の方法。
45. 負荷期間がオリゴヌクレオチドを被験体に約1週あたり2回を約3週間投与する工程を含む、パラグラフ４１記載の方法。
46. オリゴヌクレオチドが負荷期間中に静脈送達される、パラグラフ４１記載の方法。
47. オリゴヌクレオチドが負荷期間中に皮下送達される、パラグラフ４１記載の方法。
48. オリゴヌクレオチドが維持期間中に皮下送達される、パラグラフ４１記載の方法。
49. オリゴヌクレオチドが投与あたり少なくとも1つの注射部位で皮下送達される、パラグラフ４１記載の方法。
50. オリゴヌクレオチドが投与あたり少なくとも1つの注射部位で皮下送達され、注射部位が腹部である、パラグラフ４１記載の方法。
51. オリゴヌクレオチドが投与あたり1つより多くの注射部位で皮下送達される、パラグラフ４１記載の方法。
52. オリゴヌクレオチドが投与あたり1つより多くの注射部位で皮下送達され、2つの連続注射が腹部の同じ四半分の注射部位にはない、パラグラフ４１記載の方法。
53. 維持期間がオリゴヌクレオチドを少なくとも約週に1回投与する工程を含む、パラグラフ４１記載の方法。
54. 負荷期間中の投薬養生法が、処置の第１週中に少なくとも約70〜80％の定常状態の器官レベルを生じる、パラグラフ４１記載の方法。
55. 該被験体が処置の開始前に高血糖症を示す、パラグラフ４１記載の方法。
56. 該被験体が約130mg/dLを超える絶食時血糖レベル、少なくとも約7％の基準HbA1cレベル、または25kg/m２より大きい体重指数を示す、パラグラフ４１記載の方法。
57. 別のグルコース低下薬の投与をさらに含む、パラグラフ４１記載の方法。
58. 該グルコース低下薬がPPARアゴニスト、ジペプチジルペプチダーゼ(IV)インヒビター、GLP-1アナログ、インシュリンもしくはインシュリンアナログ、インシュリン分泌促進物質、SGLT2インヒビター、ヒトアミリンアナログ、ビグアニド、またはαグルコシダーゼインヒビターである、パラグラフ５７記載の方法。
59. 該グルコース低下薬がメトホルミン、スルホニル尿素、またはロシグリタゾンである、パラグラフ５７記載の方法。
60. 少なくとも1つのグルコース低下薬、および核酸塩基配列「GCTCCTTCCACTGATCCTGC」（配列番号17）を有し、かつPTP1Bを標的とするオリゴヌクレオチドを含む組み合わせ治療を被験体に投与する工程を含み、該オリゴヌクレオチドが負荷期間および維持期間中に投与される、被験体において2型糖尿病、メタボリック症候群、または肥満を処置する方法。
61. 該グルコース低下薬が、PPARアゴニスト、ジペプチジルペプチダーゼ(IV)インヒビター、GLP-1アナログ、インシュリンもしくはインシュリンアナログ、インシュリン分泌促進物質、SGLT2インヒビター、ヒトアミリンアナログ、ビグアニド、またはαグルコシダーゼインヒビターである、パラグラフ６０記載の方法。
62. 該グルコース低下薬がメトホルミン、スルホニル尿素、またはロシグリタゾンである、パラグラフ６０記載の方法。
63. 核酸塩基配列「GCTCCTTCCACTGATCCTGC」（配列番号17）を有し、PTP1Bを標的とし、かつ3'末端および5'末端で5個の2'-O-(2-メトキシエチル)ヌクレオチドに接する10個のデオキシヌクレオチドギャップ領域を特徴とするオリゴヌクレオチドと組み合わせたグルコース低下薬を被験体に投与する工程を含む、被験体において血糖レベルを減少する方法。
64. 該グルコース低下薬が、PPARアゴニスト、ジペプチジルペプチダーゼ(IV)インヒビター、GLP-1アナログ、インシュリンもしくはインシュリンアナログ、インシュリン分泌促進物質、SGLT2インヒビター、ヒトアミリンアナログ、ビグアニド、またはαグルコシダーゼインヒビターである、パラグラフ６３記載の方法。
65. 該グルコース低下薬がGLP-1アナログである、パラグラフ６３記載の方法。
66. GLP-1アナログがエキセンディン-４またはリラグルチドである、パラグラフ６５記載の方法。
67. 該グルコース低下薬がスルホニル尿素である、パラグラフ６３記載の方法。
68. スルホニル尿素がアセトへキサミド、クロルプロパミド、トルブタミド、トラザミド、グリメピリド、グリピザイド、グリブリド、またはグリクラジドである、パラグラフ６７記載の方法。
69. グルコース低下薬がビグアニドである、パラグラフ６３記載の方法。
70. ビグアニドがメトホルミンである、パラグラフ６９記載の方法。
71. メトホルミンのみでの処置後に観察される乳酸アシドーシスと比較された場合に、血糖レベルが増大した乳酸アシドーシスなしに減少される、パラグラフ７０記載の方法。
72. 該グルコース低下薬がメグリチニドである、パラグラフ６３記載の方法。
73. メグリチニドがナテグリニドまたはレパグリニドである、パラグラフ７２記載の方法。
74. グルコース低下薬がチアゾリジンジオンである、パラグラフ６３記載の方法。
75. チアゾリジンジオンがピオグリタゾン、ロシグリタゾン、またはトログリタゾンである、パラグラフ７４記載の方法。
76. 血糖レベルがロシグリタゾンのみで観察されるよりも大きい体重増加なしに減少される、パラグラフ７５記載の方法。
77. グルコース低下薬がα-グルコシダーゼインヒビターである、パラグラフ６３記載の方法。
78. α-グルコシダーゼインヒビターがアカルボースまたはミグリトールである、パラグラフ７７記載の方法。
79. グルコース低下薬がインシュリンまたはインシュリンアナログである、パラグラフ６３記載の方法。
80. 核酸塩基配列「GCTCCTTCCACTGATCCTGC」（配列番号17）を有し、PTP1Bを標的とし、かつ3'末端および5'末端で5個の2'-O-(2-メトキシエチル)ヌクレオチドに接する10個のデオキシヌクレオチドギャップ領域を特徴とするオリゴヌクレオチドが注射または経口で投与される、パラグラフ６３記載の方法。
81. 核酸塩基配列「GCTCCTTCCACTGATCCTGC」（配列番号17）を有し、PTP1Bを標的とし、かつ3'末端および5'末端で5個の2'-O-(2-メトキシエチル)ヌクレオチドに接する10個のデオキシヌクレオチドギャップ領域を特徴とするオリゴヌクレオチドが静脈注射または皮下注射で投与される、パラグラフ６３記載の方法。
82. 少なくとも１つの脂質低下薬、および核酸塩基配列「GCTCCTTCCACTGATCCTGC」（配列番号17）を有し、かつPTP1Bを標的とするオリゴヌクレオチドを含む組み合わせ治療を被験体に投与する工程を含み、該オリゴヌクレオチドが負荷期間および維持期間中に投与される、被験体において高血糖症、2型糖尿病、メタボリック症候群、または肥満を処置する方法。
83. 少なくとも１つの抗肥満薬、および核酸塩基配列「GCTCCTTCCACTGATCCTGC」（配列番号17）を有し、かつPTP1Bを標的とするオリゴヌクレオチドを含む組み合わせ治療を被験体に投与する工程を含み、該オリゴヌクレオチドが負荷期間および維持期間中に投与される、被験体において高血糖症、2型糖尿病、メタボリック症候群、または肥満を処置する方法。
84. 核酸塩基配列「GCTCCTTCCACTGATCCTGC」（配列番号17）を有し、かつPTP1Bを標的とするオリゴヌクレオチドを被験体に投与する工程を含み、該オリゴヌクレオチドが注射で投与され、注射部位に局所ステロイドを投与する工程をさらに含む、被験体において高血糖症、2型糖尿病、メタボリック症候群、または肥満を処置する方法。
85. 10mg/mL、200mg/mLまたは250mg/mLの滅菌溶液として、ISIS 113715を含むバイアル。
86. リン酸バッファ、塩化ナトリウム、および水を含み、かつ等張性である10mg/mLのISIS 113715溶液を含む、パラグラフ８５記載のバイアル。
87. 水を含み、かつ高張性である200mg/mLのISIS 113715溶液を含む、パラグラフ８５記載のバイアル。
88. 水を含み、かつ高張性である250mg/mLのISIS 113715溶液を含む、パラグラフ８５記載のバイアル。
89. 保存剤も含む、パラグラフ８５記載のバイアル。
90. 該保存剤がメタクレゾールである、パラグラフ８９記載のバイアル。
91. 滅菌凍結乾燥された粉末として、ISIS 113715を含むバイアル。
92. 150mgのISIS 113715を含む、パラグラフ９１記載のバイアル。
93. 滅菌保存された希釈剤を添加された、パラグラフ９１記載のバイアル。
94. 滅菌保存された希釈剤が、0.3％のメタクレゾールを含む、パラグラフ９３記載のバイアル。
95. 核酸塩基配列「GCTCCTTCCACTGATCCTGC」（配列番号17）を有し、かつPTP1Bを標的とするオリゴヌクレオチドの1つ以上の用量を含む医薬組成物であって、該1つ以上の用量のそれぞれが約50mg〜約900mgの範囲であり、1つ以上の負荷用量の投与後に約0.5mg/kg体重〜約7.5mg/kg体重での該オリゴヌクレオチドの被験体への皮下投与が少なくとも約32％の絶対的な血漿の生物学的利用能を達成するのに十分である、医薬組成物。
96. 血糖レベルを減少するための医薬の調製のための、核酸塩基配列「GCTCCTTCCACTGATCCTGC」（配列番号17）を有し、かつPTP1Bを標的とするオリゴヌクレオチドの使用であって、該医薬が負荷期間および維持期間中に投与される、使用。
97. 該医薬の投与が少なくとも日に1回生ずる、パラグラフ９６記載の使用。
98. 該医薬の投与が少なくとも週に1回生ずる、パラグラフ９６記載の使用。
99. 該医薬の投与が少なくとも月に1回生ずる、パラグラフ９６記載の使用。
100. 該医薬が皮下投与または静脈投与される、パラグラフ９６記載の使用。
101. 該医薬の投与が少なくとも日に1回生ずる、パラグラフ９６記載の使用。
102. 該医薬の投与が少なくとも週に1回生ずる、パラグラフ９６記載の使用。
103. 該医薬の投与が少なくとも月に1回生ずる、パラグラフ９６記載の使用。
104. 医薬に存在するオリゴヌクレオチドが、約50mg〜約900mgの用量で投与される、パラグラフ９６記載の使用。
105. 該医薬が高血糖症、2型糖尿病、メタボリック症候群、または肥満を示す被験体に投与される、パラグラフ９６記載の使用。
治療について、PTP1Bの発現を調節することで処置され得る疾患または障害を有することが疑われる動物、好ましくはヒトは、本発明に従ってアンチセンス化合物、特にISIS 113715を投与することで処置される。例えば、非限定の1つの態様において、方法は、治療有効量のPTP1Bインヒビターを動物に投与する工程を含む。本発明のPTP1BインヒビターはPTP1Bタンパク質の活性を有効に阻害するか、あるいはPTP1Bタンパク質の発現を有効に阻害する。1つの態様において、動物におけるPTP1Bの活性または発現は、約10％まで阻害される。好ましくは、動物におけるPTP1Bの活性または発現は、約30％まで阻害される。より好ましくは、動物におけるPTP1Bの活性または発現は、約50％以上まで阻害される。このように、オリゴマーアンチセンス化合物は、PTP1B mRNAの発現を少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、または100％まで調節する。
好ましくは、分析されている該体液、組織、または器官内の細胞は、PTP1Bタンパク質をコードする核酸分子および／またはPTP1Bタンパク質自体を含む。器官または組織の試料は、常套の臨床的生検から得ることができる。血液または尿等の体液試料は、常套的におよび簡単に試験される。例えば、血糖レベルは、一般に入手可能な試験キットまたは糖度計(例えば、Ascensia ELITETM キット, Ascensia(Bayer), Tarrytown NY, またはAccucheck, Roche Diagnostics)を用いて医者または患者によってでも決定され得る。代替的にまたはさらに、糖化ヘモグロビン(HbA1c)が測定され得る。HbA1cは、グルコースによる翻訳後修飾を介してインビボで形成される、少数で安定なヘモグロビンバリアントであり、主に糖化されたNH2末端β鎖を含む。前の3ヶ月の間のHbA1cレベルと平均血糖レベルとの間に強い相関がある。このように、HbA1cは、持続される血糖コントロールを測定するための「黄金標準」としてしばしば見られている(Bunn, H.F.ら、1978, Science. 200, 21-7)。HbA1cは、イオン交換HPLCまたは免疫アッセイによって測定され得；HbA1c測定のための家庭での血液採取およびメーリングキットが現在広く入手可能である。血清フルクトサミンは、別の測定の安定なグルコースコントロールであり、比色定量法によって測定され得る(Cobas Integra, Roche Diagnostics)。
ISIS 113715は、例えば、血糖を低下し、かつインシュリン感受性を改善することに有用であることが示されているので、代謝状態、特に、2型糖尿病のようなインシュリン耐性および／または上昇した血糖と関連するものを処置することに有用である。ISIS 113715の使用および本発明の方法は、例えば、糖尿病または上昇した血糖レベルの進行または発達を防止または遅延するために予防的に有用である。
ISIS 113715は、本明細書中に高脂肪食を与えた正常な動物におけるインシュリン感受性を増大し、かつこれらの動物の体重増加を減少することが示されているので、ISIS 113715は、インシュリン耐性および体重増加を処置、防止または遅延することに有用である。
ISIS 113715は、有効量の化合物を適切な薬学的に許容され得る希釈剤または担体に添加することで医薬組成物中に利用され得る。化合物の使用および本発明の方法はまた、かかる疾患または障害を防止すること、例えば、過度の体重増加、または糖尿病を防止または遅延することに予防的に有用であり得る。
メタボリック症候群
「メタボリック症候群」は、代謝起源の脂質および非脂質の心臓血管リスク因子のクラスタリングとして定義される。これはインシュリン耐性として公知の一般化された代謝障害と密接に関連づけられている。コレステロール教育国家プログラム(NCEP)成人処置調査委員会III(ATPIII)は、5つのリスク決定因子のうち3つ以上が存在する場合にメタボリック症候群の診断に対する基準を確立した。5つのリスク決定因子は、男性について102cmより大きいウエスト周囲または女性について88cmより大きいウエスト周囲として定義される腹部の肥満、150mg/dL以上のトリグリセリドレベル、男性について40mg/dLより小さいHDLコレステロールレベルおよび女性について50mg/dLより小さいHDLコレステロールレベル、130/85mm Hg以上の血圧ならびに110mg/dL以上の絶食時グルコースレベルである。これらの決定因子は、臨床実施においてたやすく測定され得る(JAMA, 2001, 285:2486-2497)。世界保健機関のメタボリック症候群の定義は、糖尿病、絶食時グルコース減損、グルコース寛容減損、またはインシュリン耐性（クランプ試験によって評価される）および以下の基準：男性において0.90より大きいウエスト対ヒップ比または女性において0.85より大きいウエスト対ヒップ比、1.7mmol/l以上の血清トリグリセリドまたは男性において0.9mmolより小さいHDLコレステロールおよび女性において1.0mmolより小さいHDLコレステロール、140/90 mmHg以上の血圧、20μg/分より大きい尿アルブミン排出速度または30mg/g以上のアルブミン対クレアニチン比、の少なくとも2つである(Diabetes Care, 2005, 28(9): 2289-2304)。
糖尿病の研究についての米国糖尿病協会および欧州協会からの声明は、リスク因子のクラスタリングを示すようなメタボリック症候群の構成について説明している。基礎的な病態生理学研究についての提案に加えて、推奨は、個別的におよび積極的に全ての心臓血管疾患のリスク因子を処置することを包含する(Diabetes Care, 2005, 28(9): 2289-2304)。それゆえに、本発明の別の態様は、ISIS 113715を用いて心臓血管疾患のリスク因子を処置する方法である。男性について102cmより大きいウエスト周囲もしくは女性について88cmより大きいウエスト周囲、150mg/dL以上のトリグリセリドレベル、男性について40mg/dLより小さいHDLコレステロールレベルおよび女性について50mg/dLより小さいHDLコレステロールレベル、130/85mm Hg以上の血圧または110mg/dL以上の絶食時グルコースレベル、または任意のその組み合わせを有する、被験体を処置するためのISIS 113715の使用も考慮される。男性について102cmより大きいウエスト周囲もしくは女性について88cmより大きいウエスト周囲、150mg/dL以上のトリグリセリドレベル、男性について40mg/dLより小さいHDLコレステロールレベルおよび女性について50mg/dLより小さいHDLコレステロールレベル、130/85mm Hg以上の血圧または110mg/dL以上の絶食時グルコースレベル、または任意のその組み合わせを有する被験体において、ISIS 113715を投与することでHbA1cレベルまたは絶食時グルコースレベルを低下する方法も考慮される。かかる被験体において、脂質プロフィールを変更するか、アディポネクチンレベルを増大するか、またはアポリポプロテインBレベルを減少する方法も考慮される。糖尿病、絶食時グルコース減損、グルコース寛容減損、またはインシュリン耐性（クランプ試験によって評価される）、男性において0.90より大きいウエスト対ヒップ比または女性において0.85より大きいウエスト対ヒップ比、1.7mmol/l以上の血清トリグリセリドまたは男性において0.9mmolより小さいHDLコレステロールおよび女性において1.0mmolより小さいHDLコレステロール、140/90 mmHg以上の血圧、20μg/分より大きい尿アルブミン排出速度または30mg/g以上のアルブミン対クレアニチン比、またはその組み合わせを有する被験体を処置するためのISIS 113715の使用も考慮される。かかる被験体において脂質プロフィールを変更するか、アディポネクチンレベルを増大するか、またはアポリポプロテインBレベルを減少する方法も考慮される。
心臓血管リスク因子
心臓血管疾患を発現するリスクと関連する状態としては、限定されないが、心筋梗塞の病歴、不安定なアンギナ、安定なアンギナ、冠状動脈の処置（血管形成術またはバイパス手術）、臨床的に重要な心筋虚血の証拠、アテローム性動脈硬化症の非冠状の形態（末梢動脈疾患、腹部の大動脈瘤、頚動脈疾患）、糖尿病、喫煙、高血圧、低HDLコレステロール、早発性CHDの家族性の病歴、肥満、身体的な不活性、上昇したトリグリセリド、またはメタボリック症候群が挙げられる(Jama, 2001, 285, 2486-2497; Grundyら、Circulation, 2004, 110, 227-239)。
塩、プロドラッグおよび生物学的同等物
本発明のアンチセンス化合物は、ヒトを含む動物に投与する際、生物学的に活性な代謝産物またはその残渣物を（直接的にまたは間接的に）提供し得る任意の薬学的に許容され得る塩、エステル、もしくはかかるエステルの塩、または任意の他の化合物を包含する。従って、例えば、該開示も、本発明の化合物のプロドラッグおよび薬学的に許容され得る塩、かかるプロドラッグの薬学的に許容され得る塩、ならびに他の生物学的同等物へと導かれる。
用語「プロドラッグ」は、内在性酵素または他の化学物質の作用および／または状態によってその生体内または細胞内で活性形態（即ち、薬物）に変換される、不活性形態またはより低い活性形態で調製される治療剤を示す。特に、本発明のオリゴヌクレオチドのプロドラッグ版が、1993年12月9日に公開された国際特許出願公開公報番号WO 93/24510、および国際特許出願公開公報番号WO 94/26764、ならびに米国特許番号5,770,713に記載される方法に従ってSATE((S-アセチル-2-チオエチル)ホスフェート)誘導体として調製される。
用語「薬学的に許容され得る塩」とは、本発明の化合物の生理学的におよび薬学的に許容され得る塩、即ち、親化合物の所望される生物学的な活性を保持し、そこで望まれない毒物学的効果を与えない塩のことをいう。オリゴヌクレオチドについて、薬学的に許容され得る塩およびその使用の好ましい例が、その全体を本明細書中に援用する米国特許番号6,287,860にさらに記載される。
薬学的に許容され得る塩基付加塩は、アルカリ金属およびアルカリ土類金属または有機アミンのような金属またはアミンと共に形成される。カチオンとして使用される金属の例は、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム等である。適切なアミンの例は、N,N'-ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、エチレンジアミン、N-メチルグルカミン、およびプロカインである（例えば、Bergeら、「Pharmaceutical Salts」,J. of Pharma Sci., 1977, 66, 1-19を参照）。該酸性化合物の塩基付加塩は、慣例的な様式で塩を製造するように遊離酸形態を十分な量の所望される塩基と接触させることで調製される。遊離酸形態は、塩形態を酸と接触させ、慣例的な様式で遊離酸を単離することで再生され得る。遊離酸形態は、極性溶媒中の溶解性のような特定の物理的特性においてそれぞれの塩形態と少し異なるが、他の点では、塩は本発明の目的に関してそれぞれの遊離酸に同等である。本明細書中に使用される場合、「薬学的な付加塩」は、本発明の組成物の構成成分の1つである酸形態の薬学的に許容され得る塩を含む。これらはアミンの有機酸塩および無機酸塩を含む。酸の塩は、塩酸塩、酢酸塩、サリチル酸塩、硝酸塩およびリン酸塩である。他の適切な薬学的に許容され得る塩は、当業者に周知であり、例えば、塩酸、臭化水素、硫酸またはリン酸等の無機酸と共に；有機カルボン酸、スルホン酸、スルホ酸もしくはホスホ酸またはN-置換スルファミン酸、例えば、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、コハク酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、メチルマレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、乳酸、シュウ酸、グルコン酸、グルカル酸、グルクロン酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、サリチル酸、4-アミノサリチル酸、2-フェノキシ安息香酸、2-アセトキシ安息香酸、エンボン酸(embonic acid)、ニコチン酸またはイソニコチン酸と共に；および天然でタンパク質合成に関わる20個のαアミノ酸、例えば、グルタミン酸またはアスパラギン酸等のアミノ酸と共に、ならびにフェニル酢酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、2-ヒドロキシエタンスルホン酸、エタン-1,2-ジスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、4-メチルベンゼンスルホ酸、ナフタレン-2-スルホン酸、ナフタレン-1,5-ジスルホン酸、2-ホスホグリセリン酸または3-ホスホグリセリン酸、グルコース-6-リン酸、N-シクロヘキシルスルファミン酸(シクラミン酸の形成を伴う)と共に、またはアスコルビン酸等の他の酸有機化合物と共に等の、様々な無機酸および有機酸の塩基性塩を含む。化合物の薬学的に許容され得る塩はまた、薬学的に許容され得るカチオンを用いて調製され得る。適切な薬学的に許容され得るカチオンは、当業者に周知であり、アルカリ、アルカリ土類、アンモニウムおよび４級アンモニウムカチオンを含む。炭酸塩または炭酸水素塩もまた、可能である。
オリゴヌクレオチドについて、薬学的に許容され得る塩の例としては、限定されないが、(a)ナトリウム、カリウム、アンモニウム、マグネシウム、カルシウム等のカチオン、スペルミンおよびスペルミジン等のポリアミン等で形成される塩；(b)例えば塩酸、臭化水素、硫酸、リン酸、硝酸等の無機酸で形成される酸付加塩；(c)例えば、酢酸、蓚酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、パルミチン酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンスルホン酸、メタンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、ポリガラクツロン酸等の有機酸で形成される塩；ならびに(d)塩素、臭素、およびヨウ素等の元素の陰イオンから形成される塩を含む。アンチセンスオリゴヌクレオチドのナトリウム塩が有用であり、ヒトへの治療投与について十分に受け入れられている。別の態様において、dsRNA化合物のナトリウム塩もまた、提供される。
賦形剤
担体化合物とは対照的に、「医薬担体」または「賦形剤」は、一つ以上の核酸を動物に送達するための、薬学的に許容され得る溶媒、懸濁剤または任意の他の薬理学的に不活性なビヒクルである。賦形剤は液体もしくは固体であり得、核酸と所定の医薬組成物の他の成分とが組み合わされる場合、所望の大きさ、軟度等をもたらすように、計画された投与の様式を考慮して選択される。典型的な医薬担体としては、結合剤（例えば、前もってゼラチン化されたトウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース等）；充填剤（例えば、ラクトースおよび他の糖、微結晶セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリル酸塩またはリン酸水素カルシウム等）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸、金属ステアリン酸塩、硬化植物油、コーンスターチ、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、等）；崩壊剤（例えば、スターチ、デンプングリコール酸ナトリウム等）；ならびに湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸（sulphate）ナトリウム等）が挙げられるが、これらに限定されない。
核酸と有害に反応しない、腸管投与に適した薬学的に許容され得る有機または無機賦形剤も、本発明の組成物の処方に用いられ得る。適切な、薬学的に許容され得る担体としては、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等が挙げられるが、これらに限定されない。
核酸の局所投与のための製剤には、滅菌および非滅菌水溶液、アルコール等の一般的な溶媒中の非水性溶液、または液状もしくは固形の油ベース中の核酸の溶液が挙げられ得る。該溶液には、バッファ、希釈液および他の適切な添加剤も包含され得る。核酸と有害に反応しない、腸管投与に適した薬学的に許容され得る有機または無機賦形剤が使用され得る。
適切な、薬学的に許容され得る賦形剤としては、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等が挙げられるが、これらに限定されない。
組成物または治療におけるPTP1Bアンチセンス化合物との組合せのための他の活性成分
A. グルコース低下薬／薬剤／治療薬、抗肥満薬／薬剤／治療薬、脂質低下薬／薬剤／治療薬
本発明の化合物、特にISIS 113715は、組み合わせ治療において使用され得、ここで状態を治療するために本発明の一つ以上の化合物および一つ以上の他の適切な治療薬／予防化合物を投与することで、付加的効果は達成される。（一つまたは複数の）適切な治療／予防化合物としては、グルコース低下剤（本明細書中でグルコース低下薬またはグルコース低下治療薬としても言われる）、抗肥満剤（本明細書中で抗肥満薬または抗肥満治療薬としても言われる）、および脂質低下剤（本明細書中で脂質低下薬または脂質低下治療薬としても言われる）が挙げられるが、これらに限定されない。グルコース低下剤としては、PPARアゴニスト、ジペプチジルペプチダーゼ(IV)インヒビター、GLP-1アナログ、インシュリンもしくはインシュリンアナログ、インシュリン分泌促進薬、SGLT2インヒビター、ヒトアミリンアナログ、ビグアニド、またはアルファグルコシダーゼインヒビターが挙げられるが、これに限定されない。グルコース低下剤としては、ホルモン、ホルモン模倣物質（hormone mimetics）、またはインクレチン模倣物質（例えば、吸引性インシュリンを含むインシュリン、GLP-1もしくはリラグルチド等のGLP-1アナログ、またはエキセナチド）、DPP(IV)インヒビター、スルホニル尿素（例えば、アセトヘキサミド、クロルプロパミド、トルブタミド、トラザミド、グリメピリド、グリピザイド、グリブリドまたはグリクラジド）、ビグアニド（メトホルミン）、メグリチニド（例えば、ナテグリニドまたはレパグリニド）、チアゾリジンジオンまたは他のPPAR-γアゴニスト（例えば、ピオグリタゾンまたはロシグリタゾン）、αグルコシダーゼインヒビター（例えば、アカルボースまたはミグリトール）、またはPTP1Bを標的としないアンチセンス化合物が挙げられるが、これらに限定されない。二元的PPAR-アゴニスト（例えば、Bristol-Myers Squibbにより開発されているマルグリタザー、またはAstra-Zenecaにより開発されているテサグリタザー（tesaglitazar））もまた挙げられる。開発中の他の糖尿病治療薬（例えば、Novartisにより開発されているLAF237；Merckにより開発されているMK-0431；またはSanofi-Aventis により開発されているリモナバン）も含まれる。Roche、ConjuChem、Sanofi-Aventis、Teijin Pharma Limited、Ipsen Pharmaceuticals、およびServier Research Instituteにより開発されているものを含むが、これらに限定されない、開発中のGLP-1模倣物質も含まれる。Glaxo Smith Klineにより開発中のものまたはSanofi-Aventisで開発中のAVE2268を含むが、これらに限定されない、開発中のSGLT2インヒビターも含まれる。Novartis（例えば、ビルダグリプチン）、Merck、GSK、またはBMSにより開発されているものを含むが、これらに限定されない、開発中のDPP(IV)インヒビターも含まれる。開発中のグルコキナーゼインヒビターも含まれる。抗肥満剤としては、食欲抑制剤（例えばフェンテルミンまたはMeridiaTM）、オルリスタット等の脂肪吸収インヒビター（例えばXenicalTM）、および食欲を刺激する空腹信号を阻害する改変型の毛様体神経栄養因子が挙げられるが、これらに限定されない。抗肥満剤には、末梢またはCNSベースの薬剤が含まれる。脂質低下剤には、胆汁酸塩隔離樹脂（例えば、コレスチラミン、コレスチポール、および塩酸コレセベラム）、HMGCoA-レダクターゼインヒビター（例えば、ロバスタチン、プラバスタチン、アトルバスタチン、シンバスタチン、およびフルバスタチン）、ニコチン酸、フィブリン酸誘導体（例えば、クロファイブレート、ゲムフィブロジル、フェノフィブレート、ベザフィブレート、およびシプロフィブレート）、プロブコール、ネオマイシン、デキストロチロキシン、植物スタノールエステル、コレステロール吸収インヒビター（例えば、エゼチミブ）、CETPインヒビター（例えば、トルセトラピブ、およびJTT-705）、MTPインヒビター（例えば、インプリタピド）、胆汁酸トランスポーターのインヒビター（先端ナトリウム依存型胆汁酸トランスポーター）、肝臓CYP7aの調節因子、ACATインヒビター（例えば、Avasimibe）、エストロゲン置換治療薬（例えば、タモキシゲン（tamoxigen））、合成HDL（例えば、ETC-216）、抗炎症薬（例えば、グルココルチコイド）、またはPTP1Bを標的としないアンチセンス化合物が挙げられるが、これらに限定されない。一つ以上のこれらの薬物を一つ以上のPTP1Bのアンチセンスインヒビターと組み合わせて、さらなる治療効果を達成し得る。
インシュリン、他のホルモンおよびホルモンのアナログおよび模倣物質を包含する糖尿病薬剤、ならびに経口投与型グルコース低下薬を包含する他のグルコース低下剤もまた、PTP1Bのアンチセンスインヒビターと組み合わせ得る。用語「グルコース低下剤」には、限定されないが、スルホニル尿素、ビグアニド、メグリチニド、ペルオキシソーム増殖因子活性化レセプターγ（PPARγ）アゴニスト（例えば、チアゾリジンジオン）およびαグルコシダーゼインヒビターが挙げられる。
膵臓のβ細胞のインシュリン分泌を刺激することによりスルホニル尿素は作用し、周辺組織でのインシュリン感受性も改善し得る。アセトヘキサミド（DymelorTM）、クロルプロパミド（DiabineseTM, GlucamideTM）、トルブタミド（OrinaseTM, MobenolTM）、およびトラザミド（TolamideTM, TolinaseTM）等の初期のスルホニル尿素は一般的に、グリメピリド（AmarylTM）、グリピザイド（GlucotrolTM）、徐放性グリピザイド（Glucotrol XLTM）、グリブリド（MicronaseTM, EugluconTM, DiabetaTM）、グリクラジド（DiamicronTM、および微小化グリブリド（GlynaseTM）（Luna & Feinglos; AACE et al., 2002）等の、より優れた副作用プロフィール（特に心臓血管危険因子がより低いもの）を有する、より新しいスルホニル尿素に取って代わられている。スルホニル尿素の副作用には、低血糖症および体重の増加が挙げられる。
肝臓のグルコースアウトプットを低下させること、ならびに肝臓および周辺組織のインシュリン感受性を高めることにより、メトホルミン（GlucophageTM）等のビグアニドは作用する。メトホルミンは、うっ血性心不全または重度の肝臓疾患を有する患者での使用が禁止されている（contrainidated）。
膵臓のベータ細胞を刺激してインシュリンを産生させることで、メグリチニドは作用する。ナテグリニド（StarlixTM）およびレパグリニド（PrandinTM）はこの種類の例である。
チアゾリジンジオン等のペルオキシソーム増殖因子活性化レセプターγ（PPAR-γ）アゴニストは筋肉および脂肪組織のインシュリン感受性を高め、より低い程度に肝臓のグルコース産生を阻害する。チアゾリジンジオンには、ピオグリタゾン（ActosTM）およびロシグリタゾン（AvandiaTM ; GlaxoSmithKline）が挙げられる。米国での使用が認可された最初のチアゾリジンジオンであるトログリタゾン（RezulinTM）は、重度の肝臓毒性のために市場から回収された。チアゾリジンジオンはまた、2型糖尿病を患う患者の脂質プロフィールにも影響をもたらす。ロシグリタゾンは全、LDLおよびHDLコレステロールレベルの増加に関係し、トリグリセリドレベルの変化または増加には何も関係しないことが研究により示されている。ピオグリタゾンはトリグリセリドレベルの平均減少、HDLコレステロールレベルの平均増加、ならびにLDLおよび全コレステロールレベルの一定でない平均変化に関係している。チアゾリジンジオンに関係する他の潜在的副作用には、体重の増加、緩やかな作用の開始、および潜在的な肝臓毒性が挙げられる（Luna & Feinglos, 2001）。
新しいPPAR-γアゴニストが開発中であり；それにはイサグリタゾン（isaglitazone）（ネトグリタゾン）、ならびにPPAR-γおよびPPAR-αの両方に親和性を有する二元作用性PPARアゴニストが含まれる。二元作用性PPARアゴニストの例は、BMS-298585およびテサグリタザーである。他のPPARのアゴニスト（例えばα、δ）またはパン-PPARアゴニストも有用であり得る。
α-グルコシダーゼインヒビターは、吸収される前の複合炭水化物の分解の原因である、小腸の内層に見られる酵素を阻害する。かかるインヒビターにはアカルボース（PrecoseTM）およびミグリトール（GlysetTM）が挙げられる。
経口グルコース低下薬はしばしば組み合わせて、2型糖尿病の治療に使用される。上記の多くの組合せが可能であるが、いくつかは組合せ製剤（例えば、AvandametTM（ロシグリタゾン+メトホルミン）；GlucovanceTM（グリブリド/メトホルミン）；およびMetaglipTM（グリピザイド/メトホルミン）として既に市場に出ている。糖尿病または肥満の治療のためのこれらの、および他の組合せ製剤はPTP1Bのアンチセンスインヒビターと組み合わせて投与され得る。
他の種類のグルコース低下糖尿病薬が開発中である。注射により投与する通常のインシュリンの代替物として、インシュリンリスプロ（HumalogTM）およびインシュリングラルギン（LantusTM）等のインシュリンアナログを使用し得る。両方は、通常のインシュリンのように注射で与えられるが、通常のインシュリンより少ない低血糖症事象をもたらす。さらに、これらのものによる作用の開始および持続時間は、通常のインシュリンとは異なっている。インシュリングラルギン、の引き続いてのアナログであるインシュリングルリシンがAventisにより開発されている。Novo Nordiskは、長期間作用性アナログインシュリンデテミルを開発している。
通常のインシュリンの、代替的な調製／送達方法も開発されている。現在、液状および乾燥粉末状吸引型インシュリン製剤の両方は、開発の後期段階にあるか、または最近認可されている一例は、最近認可された粉末状のExuberaTM（Nektar/Pfizer/Aventis）、およびエーロゾル液状のAERxTM（Aradigm/Novo Nordisk）を含む。吸引型インシュリンは注射型インシュリンよりも便利で、侵襲性が低いと期待されるが、吸入型インシュリンのコストはより高いものになると予想される。
複数の会社がインシュリンの経口製剤を開発している。OralinTM（Generex Biotechnology）が開発中のものの最先端であるが、他のものもある。
開発中の他のホルモンおよびホルモン模倣物質には、プラムリンチドアセテート（SymlinTM）およびGLP-1が挙げられる。抗糖尿病剤としての臨床的な使用について、GLP-1レセプターアゴニストおよびGLP-1アナログが評価されている。GLP-1自体は、2位のアラニンでのジペプチジルペプチダーゼ（DPP-IV）媒介性切断によるペプチドのN末端分解のために、短い半減期を有する。このため、天然のGLP-1またはその合成バージョンの臨床の有用性は制限される。DP IV-耐性GLP-Iアナログであるエキセンディン-4（ExenatideTM、Exenatide LARTM）、およびアシル化アルブミン結合ヒトGLP-IアナログであるLiragultideTMを含む、より長時間作用するアナログが開発された。
DPP-IVインヒビターも薬物として研究されており、現在一つ（LAF-237, Novartis）が高等臨床試験にある。グルカゴンインヒビターも糖尿病に有用であり得る。
脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド（PACAP）およびペプチドYY（PYY）（およびその部分ペプチドPYY[3-36]）等の他のペプチドも、糖尿病および／または肥満について研究中である（Yamamoto et al., 2003, Diabetes 52, 1155-1162; Pittner et al., Int. J. Obes. Relat. Metab. Disord. 2004, 28, 963-71）。
これらのグルコース低下薬のいずれかは、本明細書に記載のISIS 113715または別のPTP1Bのアンチセンスインヒビターと組み合わせた際に有用である。一つ以上のこれらの薬物が、単一の組成物中で一つ以上のPTP1Bのアンチセンスインヒビター（antisense inhibitors or PTP1B）と組み合わされ得るか、組合せ投与、つまりそれらの連続的もしくは同時投与のための治療に使用され得る。
PTP1Bのアンチセンス阻害は、高脂肪食を与えられた動物の体重増加を減少させるように本明細書の以下に示され、肥満の治療に有用であり得る。体重減少剤の使用はまた、一般に糖尿病の管理、およびグルコース寛容減損を有する患者の明白な2型糖尿病の発症または進行を遅延または阻害するために有用であると見なされている（Heymsfield SB, 2000, Archives of Internal Medicine, 160, 1321-1326）。従って、抗肥満薬は、医薬組成物中でPTP1B発現のアンチセンスインヒビターと組み合わせて、または組み合わせられた治療養生法において有用である。抗肥満薬（「ダイエット薬」とも呼ばれる）の例としては、限定されないが、フェンテルミンおよびMeridiaTM等の食欲抑制剤、オルリスタット（XenicalTM）等の脂肪吸収インヒビター、ならびに食欲を刺激する空腹信号を阻害する改変型の毛様体神経栄養因子のAxokineTMが挙げられる。肥満について評価中の他の薬物または薬物の種類は、CB1インバースアゴニスト、PYY、MCH4およびMTPインヒビターである。
前述の任意のものは、ISIS 113715または本発明によるPTP1Bの別のアンチセンスインヒビターとの組合せに有用である。組合せ化合物（2つ以上）は一緒に、または連続的に使用され得る。
B. PTP1Bアンチセンス化合物と組合せて他の細胞標的に指向する薬物／他のアンチセンス化合物
別の関連する態様において、本発明の組成物は、PTP1Bを標的とする一つ以上のアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチド、および第二の核酸標的を標的とする一つ以上のさらなるアンチセンス化合物を包含し得る。かかるアンチセンス化合物についての種々の有用な標的が以下に挙げられ、当該分野に公知である。二つ以上の組み合わされた化合物は、組成物中で、または組合せ治療養生法中で、一緒に、または連続的に使用され得る。
従って、PTP1Bのアンチセンスインヒビターとの組合せの利点には：グルコースおよび／またはインシュリン代謝、脂肪および／またはトリグリセリドレベル、または肥満に関わる遺伝子もしくは遺伝子産物のインヒビターも含まれる。これらのインヒビターとしては低分子、抗体、ペプチド断片またはアンチセンスインヒビター（リボザイムおよびsiRNA分子を含む）が挙げられ得るが、これらに限定されない。特にアンチセンスインヒビターが適している。
阻害される遺伝子の例としては、グルカゴンレセプター、グルココルチコイドレセプター、26-HSD、ヒドロキシステロイド11-βデヒドロゲナーゼ1、フォークヘッドO1A、他のフォークヘッド遺伝子、フルクトース1,6-ビスホスファターゼ、グルコース-6-ホスファターゼ（トランスロカーゼおよび／または触媒サブユニット）、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（DGAT1）、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ-2（DGAT2）、ステアリン酸CoA脱飽和酵素1（SCD-1）、アセチルCoAカルボキシラーゼ1および2、ホルモン感受性リパーゼ、脂肪酸シンターゼ、ナトリウム-グルコースコトランスポーター1および2（SGLT1および2）、ミクロソームトリグリセリドトランスファータンパク質（MTP）、アポリポプロテイン-CIII、アポリプロテイン（apoliprotein）B（特にApoB100）ならびにインヒビターがグルコース、コレステロールおよび／またはトリグリセリドの低下を引き起こすか、または肥満に拮抗すると考えられる他の遺伝子が挙げられる。これらの標的の一部の発現を阻害するアンチセンス化合物も、グルコース低下薬として分類されるであろう。
C. 単剤療法として、または組合せ組成物におけるISIS 113715の投薬および投与
本明細書で使用する場合、「用量」は一日にヒト被験体に、単回投与または複数に分けられる投与、例えば静脈内または皮下投与で与えられる薬物の量を言う。
ISIS 113715の用量の好ましい範囲は、約50〜約900mgである。一週間当り50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850または900mgの用量は、全て50〜900mgの範囲内であることが理解される。本明細書で使用する場合、用語「患者」および「被験体」は交換可能である。
好ましい用量の範囲は、一週間当り約0.5〜約7.5mg/kg体重または等量である。別の好ましい用量の範囲は、一週間当り約0.25mg/kg〜約9mg/kgまたは等量である。別の好ましい用量の範囲は、1週間当り約1〜約6mg/kgまたは等量である。さらなる範囲としては、約0.1〜5mg/kg、約0.5〜3mg/kg、約0.5〜8mg/kg、約0.25〜3mg/kg、約5〜9mg/kg、約7〜9mg/kg、約3〜5mg/kg、または約0.25〜2mg/kgが含まれる。
投薬養生法には、負荷（loading）期間および／または維持期間中の用量が含まれ得る。通常またはほとんどの場合に治療の開始時に起こり、およそ1〜3週間（例えば3, 4, 5, 6, または22, 23, 24, 25日程度であり得るが）続く負荷期間中に、毎日、2日毎、3日毎、4日毎、5日毎、6日毎、または1週間毎に単回投与が施され得るか、または複数投与が施され得る。あるいは、負荷期間は、例えば11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34または35日程度であり得るが、約28日続き得、毎日、2日毎、3日毎、4日毎、5日毎、6日毎、または7日毎に単回投与が施され得る。負荷期間に続いて起こり、数年間または被験体の寿命の間続き得る維持期間中に、毎日、2日毎、3日毎、4日毎、5日毎、6日毎、1週間毎、2週間毎、3週間毎、4週間毎、毎月、2ヶ月毎または3ヶ月毎が含まれると理解される、毎日〜3ヶ月毎の範囲の頻度で投薬が施され得る。
代替的な投薬養生法には、先に負荷期間を有することのない維持期間中に投与される用量が含まれ得る。用量は、毎日、2日毎、3日毎、4日毎、5日毎、6日毎、1週間毎、2週間毎、3週間毎、4週間毎、毎月、2ヶ月毎または3ヶ月毎が含まれると理解される、毎日〜3ヶ月毎の範囲の頻度で施され得る。
一つの態様において、負荷段階は、各々が約0.5mg/kg〜約7.5mg/kgであり、約1週間にわたり投与される3の用量からなる。別の態様において、負荷段階は、各々が約0.5mg/kg〜約7.5mg/kgであり、約2週間にわたり投与される4の用量からなる。別の態様において、負荷段階は、約0.5mg/kg〜約7.5mg/kgであり、約3週間にわたり投与される5の用量からなる。一つの態様において、負荷段階の後に、1週間毎に等量〜約0.5〜約7.5mg/kgの用量が1週毎に約1度、2週毎に約1度、または1月毎に約1度投与される維持段階が続く。一つの態様において、負荷期間または維持期間またはその両方のいずれかについて、皮下または静脈内で用量が投与される。投与は負荷および維持が同一の経路によることを必要としない。
D. 生物学的利用能
用語「生物学的利用能」は、薬物の送達のために特定の投与様式が用いられた場合に、循環系（例えば血液、特に血漿）に達する投与された薬物の部分の測定について言う。例えば、薬物のヒト被験体への導入のために投与の皮下様式が用いられる場合、投与様式についての生物学的利用能は、適切な治療の決定を容易にするためになされる異なる投与様式（例えば静脈内投与様式）および外挿法と比較され得る。一般に、生物学的利用能は、ヒト被験体への薬物の投与後に変化しない形態の薬物の曲線下面積（AUC）または最大血清または血漿濃度（Cmax）を測定することにより評価され得る。AUCは、横座標（X軸）に沿った時間に対して、縦座標（Y軸）に沿って薬物の血清または血漿濃度をプロットする曲線下面積の決定である。通常、特定の薬物に対するAUCは、当業者に公知の方法を用いて、G. S. Banker, Modern Pharmaceutics, Drugs and the Pharmaceutical Sciences, 第4版, (May 2002) に記載のように計算され得る。いくつかの態様において、皮下投与後の薬物の血漿濃度曲線下の面積（AUCsc）を静脈投与後の薬物の血漿濃度曲線下の面積（AUCiv）で割り、静脈経路と比較した際に、皮下経路により吸収された薬物の割合を示す大きさのない商（dimensionless quotient）（相対的生物学的利用能、RB）を提供し得る。
当該分野で常套的な方法、例えばハイブリダイゼーションベースELISAによって、血漿中のオリゴヌクレオチド濃度を決定し得る。
本発明が、若干数の好ましい態様によって、特異性を有して記載されるが、以下の実施例は、本発明を説明するためのみに用いられ、それを限定することを意図しない。
実施例１：オリゴヌクレオチド合成デオキシおよび2'-アルコキシアミダイトのためのヌクレオシドホスホロアミダイト
市販の供給源（例えばChemgenes, Needham, MAまたはGlen Research, Inc., Sterling, VA）から2'-デオキシおよび2'-メトキシβ-シアノエチル-ジイソプロピルホスホロアミダイトを購入した。他の2'-O-アルコキシ置換ヌクレオシドアミダイトは、本明細書中で参照により援用されるUS Patent No. 5,506,351に記載のように調製する。2'-アルコキシアミダイトを用いて合成されるオリゴヌクレオチドについて、テトラゾールおよび塩基のパルス送達後の待機工程を360秒に延長した他は、未修飾オリゴヌクレオチドに対する標準サイクルを利用した。
市販のホスホロアミダイト（Glen Research, Sterling, VA, またはChemGenes, Needham, MA）を用いて、公開された方法[Sanghvi, et. al., Nucleic Acids Research, 1993, 21, 3197-3203] に従い、5-メチル-2'-デオキシシチジン（5-Me-C）ヌクレオチドを含有するオリゴヌクレオチドを合成した。
2'-O-(2-メトキシエチル)修飾アミダイト
以下のように、あるいはMartin, P., Helvetica Chimica Acta, 1995, 78, 486-504の方法により2'-O-メトキシエチル置換ヌクレオシドアミダイトを調製する。
2,2'-アンヒドロ[l-(β-D-アラビノフラノシル)-5-メチルウリジン]
5-メチルウリジン（リボシルチミン、Yamasa, Choshi, Japanにより市販）（72.0 g, 0.279 M）、ジフェニルカルボネート（diphenylcarbonate）（90.0g、0.420M）および炭酸水素ナトリウム（2.0g, 0.024M）をDMF（300mL）に添加した。混合物を加熱して攪拌しながら還流し、放出性二酸化炭素ガスを制御様式下で放出させた。1時間後、わずかに黒くなった溶液を減圧下で濃縮した。得られたシロップ剤を、攪拌しながらジエチルエーテル（2.5L）に注いだ。生成物はゴム質を形成した。エーテルをデカンテーションし、残渣を最小量のメタノール（ca. 400mL）に溶解した。溶液を新しいエーテル（2.5L）に注いで、硬いゴム質を生成した。エーテルをデカンテーションしてゴム質を真空オーブン（60℃、1mm Hgで24時間）で乾燥し、淡黄褐色粉末にまで砕かれた固形（57g, 85％粗収量）を得た。NMRスペクトルは構造と矛盾がなく、ナトリウム塩としてフェノールで汚染された（ca. 5%）。該物質を、現状のままで更なる反応に使用した（または酢酸エチル中のメタノールの濃度勾配（10〜25％）を用いる、カラムクロマトグラフィーによりさらに精製し、白色固体、mp222〜4℃を提供し得る）。
2'-O-メトキシエチル-5-メチルウリジン
2,2'-アンヒドロ-5-メチルウリジン（195g, 0.81M）、tris（2-メトキシエチル）ホウ酸塩（231g, 0.98M）および2-メトキシエタノール（1.2L）を、2Lのステンレス鋼圧力容器に入れ、160℃の前もって加熱したオイルバス中に置いた。155〜160℃で48時間の加熱後、容器を開け、溶液を乾燥状態まで蒸発させて、MeOH（200mL）で粉砕した。残渣を熱したアセトン（1L）に懸濁した。不溶性の塩を濾過し、アセトン（150mL）で洗浄し、濾過物を蒸発させた。残渣（280g）をCH3CN（600mL）に溶解し、蒸発させた。シリカゲルカラム（3kg）を0.5% Et3NHを含有したCH2Cl2/アセトン/MeOH（20：5：3）に詰めた。カラムにのせる前に残渣をCH2Cl2(250 mL) に溶解し、シリカ (150 g) に吸着させた。生成物を封入溶媒で溶出し、16Og (63%) の生成物を得た。精製されていない画分を再び加工することで、さらなる物質を得た。
2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルウリジン
2'-O-メトキシエチル-5-メチルウリジン（160 g, 0.506 M）をピリジン (250 mL) で共蒸発させ、乾燥残渣をピリジン(1.3 L)に溶解した。第一のアリコートのジメトキシトリチルクロリド (94.3g, 0.278M) を添加し、混合物を室温で1時間攪拌した。第二のアリコートのジメトキシトリチルクロリド (94.3 g, 0.278 M) を添加し、反応物をさらに1時間攪拌した。次いでメタノール (170 mL) を添加し、反応を停止させた。HPLCにより、およそ70％の生成物の存在が示された。溶媒を蒸発させ、CH3CN (200 mL)で粉砕した。残渣をCHCl3 (1.5 L)に溶解し、2x500 mLの飽和NaHCO3および2x500 mLの飽和NaClで抽出した。有機層をNa2SO4で乾燥させ濾過し、蒸発させた。 275gの残渣を得た。残渣を3.5 kgシリカゲルカラムで精製し、パックして0.5% Et3NHを含有するEtOAc/ヘキサン/アセトン (5:5:1)で溶出した。精製画分を蒸発させて、164gの生成物を得た。精製されていない画分から、およそ20gをさらに得、全収量183g (57%)を得た。
3'-O-アセチル-2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシ-トリチル-5-メチルウリジン
2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチル-ウリジン (106 g, 0.167 M)、DMF/ピリジン(562 mLのDMFおよび188 mLのピリジンから調製した750mLの3:1混合物) および無水酢酸 (24.38 mL、0.258 M) を合わせて、室温で24時間攪拌した。まずTLC試料をMeOHの添加でクエンチして、TLCにより反応をモニターした。TLCで判断されるように、反応の完了の時点で、MeOH (50 mL)を添加し、混合物を35℃で蒸発させた。残渣をCHCl3 (800 mL)に溶解し、2x200 mLの飽和炭酸水素ナトリウムおよび2x200 mLの飽和NaClで抽出した。200 mLのCHCl3で水層を逆抽出（back extract）した。合わせた有機物を硫酸ナトリウムで乾燥させ、蒸発させて122 gの残渣（およそ 90%生成物）を得た。3.5kgのシリカゲルカラムで残渣を精製し、EtOAc/ヘキサン（4:l）を用いて溶出した。純粋生成物画分を蒸発させ96g（84%）を得た。後の画分からさらに1.5gを回収した。
3'-O-アセチル-2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシ-トリチル-5-メチル-4-トリアゾールウリジン
3'-O-アセチル-2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルウリジン（96g, 0.144M）をCH3CN（700 mL）に溶解して第一溶液を調製し、取っておいた。トリエチルアミン（189mL, 1.44M）を、CH3CN（1L）中のトリアゾール溶液（90g, 1.3M）に添加し、−5℃まで冷却し、オーバーヘッドスターラーを用いて0.5時間攪拌した。30分間にわたりPOCl3を0〜10℃で維持された攪拌した溶液に滴下し、得られた混合物をさらに2時間攪拌した。45分間にわたり第一の溶液を後者の溶液に滴下した。得られた反応混合物を、低温室で一晩保存した。反応混合物から塩を濾過し、溶液を蒸発させた。EtOAc（1L）に残渣を溶解し、濾過により不溶性固体を除去した。1x300mLのNaHCO3および2x300mLの飽和NaClで濾過物を洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ蒸発させた。残渣をEtOAcで粉砕して見出しの化合物を得た。
2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルシチジン
ジオキサン（50OmL）およびNH4OH（3OmL）中の3'-O-アセチル-2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチル-4-トリアゾールウリジン（103g, 0.141M）の溶液を室温で2時間攪拌した。ジオキサン溶液を蒸発させて、MeOH（2x200mL）で残渣を共沸化した。残渣をMeOH（300mL）に溶解し、2リットルのステンレス鋼圧力容器に移した。NH3ガスで飽和させたMeOH（400mL）を添加し、容器を100℃で2時間加熱した（TLCは完全な変換を示した）。容器内容物を乾燥状態まで蒸発させて、残渣をEtOAc（500mL）に溶解し、飽和NaCl（200mL）で一度洗浄した。有機物を硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を蒸発させて85g（95%）の見出しの化合物を得た。
N4-ベンゾイル-2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシ-トリチル-5-メチルシチジン
2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルシチジン（85g, 0.134M）をDMF（800mL）に溶解し、攪拌しながら無水安息香酸（37.2g, 0.165M）を添加した。3時間の攪拌後、TLCにより反応がおよそ95％完了したことが示された。溶媒を蒸発させて、MeOH（200mL）で残渣を共沸化した。残渣をCHCl3（700mL）に溶解して飽和NaHCO3（2x300mL）および飽和NaCl（2x300mL）で抽出し、MgSO4で乾燥させ蒸発させて残渣（96g）を得た。溶出溶媒として、0.5% Et3NHを含有するEtOAc/ヘキサン（1:1）を用いて、1.5 kgシリカカラムで残渣をクロマトグラフにかけた。純粋生成物画分を蒸発させて、90g（90%）の見出しの化合物を得た。
N4-ベンゾイル-2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシ-トリチル-5-メチルシチジン-3'-アミダイト
N4-ベンゾイル-2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルシチジン（74g, 0.10M）をCH2Cl2（1L）に溶解した。窒素雰囲気下で、テトラゾールジイソプロピルアミン（7.1g）および2-シアノエトキシテトラ（イソプロピル）ホスファイト（40.5mL, 0.123M）を攪拌しながら添加した。得られた混合物を室温で20時間攪拌した（TLCは反応が95％完了したことを示した）。反応混合物を飽和NaHCO3（1x300mL）および飽和NaCl（3x300mL）で抽出した。水性洗浄物をCH2Cl2（300mL）で逆抽出し、抽出物を合わせてMgSO4で乾燥させ濃縮した。溶出溶媒としてEtOAc/ヘキサン（3:1）を用いて、得られた残渣を1.5kgシリカカラムでクロマトグラフにかけた。純粋画分を合わせて90.6g（87%）の見出しの化合物を得た。
実施例２：オリゴヌクレオチド合成
ヨウ素による酸化を伴う標準ホスホロアミダイト化学を用いて、自動化DNA合成機（Applied Biosystemsモデル380B）で、非置換および置換ホスホジエステル（P=O）オリゴヌクレオチドを合成する。
標準酸化ビンを、亜リン酸塩結合の段階的硫化（thiation）のためにアセトニトリル中の0.2M溶液の3H-1,2-ベンゾジチオール-3-オン1,1-ジオキサイドで置き変えたこと以外は、ホスホロジエステルオリゴヌクレオチドと同様に、ホスホロチオエート（P=S）を合成する。硫化待機工程を68秒に延長し、その後キャップ付加工程を続けた。CPGカラムからの切断および55℃での濃縮水酸化アンモニウム中での脱保護（18時間）の後、0.5 M NaCl溶液から2.5倍量のエタノールで2度沈殿させて、オリゴヌクレオチドを精製した。本明細書で参照により援用されるUS Patent No. 5,508,270に記載されるように、ホスフィネートオリゴヌクレオチドを調製する。
本明細書で参照により援用されるUS Patent No. 4,469,863に記載されるように、アルキルホスフォネートオリゴヌクレオチドを調製する。
本明細書で参照により援用されるUS Patent No. 5,610,289または5,625,050に記載のように、3'-デオキシ-3'-メチレンホスホネートオリゴヌクレオチドを調製する。
本明細書で参照により援用されるUS Patent No. 5,256,775またはUS Patent No. 5,366,878に記載されるように、ホスホロアミダイトオリゴヌクレオチドを調製する。
本明細書で参照により援用される、公開された国際特許出願公報WO 94/17093およびWO 94/02499に記載されるように、アルキルホスホノチオエートオリゴヌクレオチドを調製する。
本明細書で参照により援用される、US Patent No. 5,476,925に記載されるように、3'-デオキシ-3'-アミノホスホルアミデートオリゴヌクレオチドを調製する。
本明細書で参照により援用されるUS Patent No. 5,023,243に記載されるように、ホスホトリエステルオリゴヌクレオチドを調製する。
本明細書で参照により援用されるUS Patent Nos. 5,130,302および 5,177,198に記載されるように、ボラノ（Borano）ホスフェートオリゴヌクレオチドを調製する。
実施例３：キメラオリゴヌクレオチドの合成
本発明のキメラオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシドまたは混合オリゴヌクレオチド／オリゴヌクレオシドは、いくつかの異なる型であり得る。これらには、結合ヌクレオシドの「ギャップ」セグメントが結合ヌクレオシドの5'および3'「ウィング」セグメントの間に位置する第一の型、および「ギャップ」セグメントがオリゴマー化合物の3'または5'末端のいずれかに位置する第二の「開放末端」型が挙げられる。第一の型のオリゴヌクレオチドは、当該分野で「ギャップマー」またはギャップ付加オリゴヌクレオチドとしても公知である。第二の型のオリゴヌクレオチドは、当該分野で「ヘミマー」または「ウィングマー」としても公知である。
[2'-O-Me]-[2'-デオキシ]-[2'-O-Me]キメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチド
2'-O-アルキルホスホロチオエートおよび2'-デオキシホスホロチオエートオリゴヌクレオチドセグメントを有するキメラオリゴヌクレオチドを、上述のように、Applied Biosystems自動DNA合成機モデル380Bを用いて合成する。自動合成機、DNA部分について2'-デオキシ-5'-ジメトキシトリチル-3'-O-ホスホロアミダイトならびに5'および3'ウィングについて5'-ジメトキシ-トリチル-2'-O-メチル-3'-O-ホスホロアミダイトを用いてオリゴヌクレオチドを合成する。テトラゾールおよび塩基の送達後に、RNAについて4回および2'-O-メチルについて2回繰り返される待機工程を600秒まで延長することで標準合成サイクルを変更する。完全に保護されたオリゴヌクレオチドを支持体から切断し、室温で一晩、リン酸基を3:1アンモニア/エタノール中で脱保護し、その後乾燥状態に凍結乾燥する。次いで、室温で24時間のメタノールアンモニアでの処理を行い、全塩基を脱保護し、試料を再度、乾燥状態に凍結乾燥した。ペレットを、室温で24時間、THF中で1M TBAFに再懸濁して2'位を脱保護する。次いで、1M TEAAで反応をクエンチさせ、次いで、G25サイズ排除カラムで脱塩する前に、ロトバック（rotovac）で試料を1／2量に減じる。その後、回収されたオリゴをキャピラリー電気泳動および質量分光法により、収量および純度について分光測光法的に分析する。
[2'-O-(2-メトキシエチル)]-[2'-デオキシ]--[2'-O-(メトキシエチル)]キメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチド
[2'-O-(2-メトキシエチル)]-[2'-デオキシ]--[-2'-O-(メトキシエチル)]キメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを、上述の2'-O-メチルキメラオリゴヌクレオチドのための手法のように、2'-O-メチルアミダイトの代わりに2'-O-(メトキシエチル)アミダイトを用いて調製した。
[2'-O-(2-メトキシエチル)ホスホジエステル]-[2'-デオキシホスホロチオエート]-[2'-O-(2-メトキシエチル)ホスホジエステル]キメラオリゴヌクレオチド
[2'-O-(2-メトキシエチルホスホジエステル]-[2'-デオキシホスホロチオエート]-[2'-O-(メトキシエチル)ホスホジエステル]キメラオリゴヌクレオチドを、上述の2'-O-メチルキメラオリゴヌクレオチドのための手法のように、2'-O-メチルアミダイトの代わりに2'-O-(メトキシエチル)アミダイトの置換、キメラ構造のウィング部分内のホスホジエステルヌクレオチド間結合を生じるためのヨウ素を用いた酸化、および中心ギャップについてホスホロチオエートヌクレオチド間結合を生じるための3,H-1,2ベンゾジチオール-3-オン1,1ジオキサイド（Beaucage Reagent）を利用した硫化、を伴って調製する。
本明細書で参照により援用される、US Patent No. 5,623,065に従って、他のキメラオリゴヌクレオチド、キメラオリゴヌクレオシドおよび混合キメラオリゴヌクレオチド／キメラオリゴヌクレオシドを合成する。
実施例４：オリゴヌクレオチド単離
細孔性ガラスカラム（Applied Biosystems）からの切断および55℃、18時間の濃縮水酸化アンモニウム中の脱保護の後、2.5倍量のエタノールを有する0.5M NaClで沈殿を2度行なうことにより、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオシドを精製する。合成オリゴヌクレオチドを、変性ゲルを用いてポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析し、少なくとも完全長の85％の物質であると判断した。合成で得られたホスホロチオエートおよびホスホジエステル結合の相対量を、31P磁気共鳴分光法により定期的にチェックし、いくつかの研究についてオリゴヌクレオチドをChiang et al, J. Biol. Chem. 1991, 266, 18162-18171に記載のように、HPLCで精製した。HPLC精製物で得られた結果は、非HPLC精製物で得られた結果と同様であった。
実施例５：オリゴヌクレオチド合成-96ウェルプレート形式
標準96ウェル形式で、96配列を同時にアセンブルし得る自動合成機を用いて、固相P（III）ホスホロアミダイト化学によりオリゴヌクレオチドを合成した。水性ヨウ素での酸化により、ホスホジエステルヌクレオチド間結合を提供した。無水アセトニトリル中の3,H-1,2ベンゾジチオール-3-オン1,1ジオキサイド（Beaucage Reagent）を利用した硫化によりホスホロチオエートヌクレオチド間結合を生じた。標準塩基保護されたβシアノエチルジイソプロピルホスホロアミダイトを業者（例えばPE-Applied Biosystems, Foster City, CA, またはPharmacia, Piscataway, NJ）から購入した。公知の文献または特許された方法のように、非標準ヌクレオシドを合成する。それらは塩基保護されたβシアノエチルジイソ-プロピルホスホロアミダイトように利用される。
オリゴヌクレオチドを支持体から解離させ、濃縮NH4OHで、温度を上昇させて（55〜60℃）12〜16時間で脱保護し、その後、放出された生成物を真空中で乾燥させた。次いで、乾燥生成物を滅菌水に再懸濁して、その後全分析用および試験用プレート試料が機械化ピペッターを用いて希釈される、マスタープレートを提供した。
実施例６：オリゴヌクレオチド分析-96ウェルプレート形式
試料の希釈およびUV吸光分光学により、各ウェルのオリゴヌクレオチドの濃度を評価した。96ウェル形式（Beckman P/ACETM MDQ）か、または個々に調製した試料についてのいずれかで、市販のキャピラリー電気泳動（CE）装置（例えばBeckman P/ACETM 5000, ABI 270）を用いて、CEにより、個々の生成物の全長完全性を評価した。電気スプレー質量分光法を用いて、化合物の質量分析により、塩基および主鎖組成物を確認した。全アッセイ試験プレートは、単一および複数チャネル機械化ピペッターを用いて、マスタープレートから希釈した。プレート上の少なくとも85％の化合物が少なくとも全長の85％である場合、プレートを許容可能であると判断した。
実施例７：細胞培養およびオリゴヌクレオチド処理
標的核酸発現に対するアンチセンス化合物の効果を、標的核酸が測定可能なレベルで存在する場合、任意の種々の細胞型において試験し得る。このことは、例えばPCRまたはノザンブロット分析を用いて常套的に測定され得る。以下の細胞型は例証目的で提供されるが、選択された細胞型において標的が発現される場合、他の細胞型は常套的に用いられ得る。このことは、例えばノザンブロット分析、リボヌクレアーゼプロテクションアッセイ、またはRT-PCRの当該分野の常套的な方法により、容易に測定され得る。
T-24細胞：
ヒト移行細胞膀胱癌細胞株T-24をAmerican Type Culture Collection（ATCC）（Manassas, VA）から入手した。T-24細胞を、10%ウシ胎児血清（Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD）、ペニシリン100単位／mL、およびストレプトマイシン100μg／mL（Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD）を補充した完全McCoy's 5A基本培地（Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD）で、常套的に培養した。細胞が90％コンフルエントに達した際に、トリプシン処理および希釈により常套的に継代した。RT-PCR分析での使用のために7000細胞／ウェル細胞の密度で、細胞を96ウェルプレート（Falcon-Primaria ♯3872）に播種した。
ノザンブロットまたは他の分析のために、適切な量の培地およびオリゴヌクレオチドを用いて、細胞を100mmプレートまたは他の標準組織培養プレートに播種し同様に処理し得る。
A549細胞：
ヒト肺癌細胞株A549をAmerican Type Culture Collection（ATCC）（Manassas, VA）から入手した。A549細胞を、10%ウシ胎児血清（Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD）、ペニシリン100単位／mL、およびストレプトマイシン100μg／mL（Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD）を補充したDMEM基本培地（Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD）で常套的に培養した。細胞が90％コンフルエントに達した際に、トリプシン処理および希釈により常套的に継代した。
NHDF細胞：
ヒト新生児皮膚線維芽細胞（NHDF）をClonetics Corporation（Walkersville MD）から入手した。NHDFを、業者の推奨の通りに補充した線維芽細胞増殖培地（Clonetics Corporation, Walkersville, MD）で常套的に維持した。業者に推奨されるように、細胞を10回継代まで常套的に維持した。
HEK細胞：
ヒト胚性ケラチノサイト（HEK）をClonetics Corporation（Walkersville, MD）から入手した。HEKを、業者に推奨されるように調製したケラチノサイト増殖培地（Clonetics Corporation, Walkersville MD）で常套的に維持した。業者に推奨されるように、細胞を10回継代まで維持した。
PC-12細胞：
ラットニューロン細胞株PC-12をAmerican Type Culure Collection （Manassas, VA）から入手した。PC-12細胞を、10%ウマ血清＋5%ウシ胎児血清（Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD）を補充したDMEM、高グルコース（Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD）で常套的に培養した。細胞が90％コンフルエントに達した際に、トリプシン処理および希釈により常套的に継代した。RT-PCR分析での使用のために20000細胞／ウェルの密度で、細胞を96ウェルプレート（Falcon-Primaria ♯3872）に播種した。
ノザンブロットまたは他の分析のために、適切な量の培地およびオリゴヌクレオチドを用いて、細胞を100mmまたは他の標準組織培養プレートに播種し同様に処理し得る。
アンチセンス化合物を用いた処理：
80％コンフルエントに達した際に、細胞をオリゴヌクレオチドで処理した。96ウェルプレートで増殖した細胞について、ウェルを一度200μL OPTI-MEMTM-1血清低減培地（Gibco BRL）で洗浄し、次いで3.75μg/mL LIPOFECTINTM試薬（Gibco BRL）および所望の濃度のオリゴヌクレオチドを含有する130μLのOPTI-MEMTM-1培地で処理した 。処理の4〜7時間後、培地を新しいものに取り替えた。オリゴヌクレオチド処理の16〜24時間後、細胞を回収した。
使用したオリゴヌクレオチドの濃度は、細胞株ごとに異なる。特定の細胞株について最適なオリゴヌクレオチド濃度を決定するために、細胞を、ある範囲の濃度の陽性コントロールオリゴヌクレオチドで処理する。ヒト細胞に対する陽性コントロールオリゴヌクレオチドは、ISIS 13920、TCCGTCATCGCTCCTCAGGG、配列番号：1の、ヒトH-rasに標的とされ、ホスホロチオエート主鎖を有する2'-O-メトキシエチルギャップマー（太字で示される2'-O-メトキシエチル）である。マウスまたはラット細胞に対する陽性コントロールオリゴヌクレオチドは、ISIS 15770、ATGCATTCTGCCCCCAAGGA、配列番号：2の、マウスおよびラットc-rafの両方に標的とされ、ホスホロチオエート主鎖を有する2'-O-メトキシエチルギャップマー（太字で示される2'-O-メトキシエチル）である。次いで、該細胞株に対する以降の実験において、新たなオリゴヌクレオチドのためのスクリーニング濃度として、c-Ha-ras（ISIS 13920に対する）またはc-raf（ISIS 15770に対する）mRNAの80％阻害を生じる陽性コントロールオリゴヌクレオチドの濃度が用いられる。次いで80％阻害に達しない場合は、該細胞株に対する以降の実験においてH-rasまたはc-raf mRNAの60％阻害を生じる、最低濃度の陽性コントロールオリゴヌクレオチドをオリゴヌクレオチドスクリーニング濃度として利用する。60％阻害に達しない場合は、特定の細胞株を、オリゴヌクレオチドトランスフェクション実験には不適切と見なす。
実施例８：PTP1B発現のオリゴヌクレオチド阻害の分析
当該分野に公知の種々の方法で、PTP1B発現のアンチセンス調節をアッセイし得る。例えば、ノザンブロット分析、競合的ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、またはリアルタイムPCR（RT-PCR）により、例えばPTP1B mRNAレベルを定量し得る。現在リアルタイム定量的PCRが好ましい。全細胞RNAまたはポリ（A）＋mRNAについて、RNA分析を行い得る。RNA単離の方法は、例えばAusubel, F.M. et al, Current Protocols in Molecular Biology, Volume 1, pp. 4.1.1-4.2.9および4.5.1-4.5.3, John Wiley & Sons, Inc., 1993に教示される。ノザンブロット分析は当該分野に常套的であり、例えばAusubel, F.M. et al, Current Protocols in Molecular Biology, Volume 1, pp. 4.2.1-4.2.9, John Wiley & Sons, Inc., 1996に教示される。リアルタイム定量的（PCR）は、PE-Applied Biosystems, Foster City, CAより入手可能で、製造業者の使用説明書に従い使用される、市販のABI PRISMTM 7700配列検出システムを用いて、都合良くなされ得る。定量的PCR分析の前に、GAPDH増幅反応と「多重化」し得る能力について、測定される標的遺伝子に特異的なプライマー-プローブセットを評価する。多重化において、標的遺伝子および内部標準遺伝子GAPDHの両方を、一つの試料で同時に増幅する。この分析で、未処理細胞から単離されたmRNAを連続的に希釈する。GAPDHのみに特異的、標的遺伝子のみに特異的（「一重」）、または両方に特異的（「多重」）なプライマー-プローブセットの存在下で、各希釈物を増幅する。
PCR増幅に続いて、一重および多重の両方の試料から、希釈の関数としてGAPDHおよび標的mRNAのシグナルの標準曲線が生じる。多重化試料から生じたGAPDHおよび標的のシグナルの傾きおよび相関係数の両方が、一重化試料から生じたそれらの相当値の10％以内に収まる場合、標的に特異的なプライマー-プローブセットは多重化可能であると見なされる。PCRの他の方法も当該分野で公知である。
PTP1Bのタンパク質レベルは、免疫沈降、ウェスタンブロット分析（イムノブロッティング）、ELISAまたは蛍光細胞分析分離法（FACS）等の当該分野に周知の種々の方法で定量され得る。PTP1Bに指向する抗体を同定し、抗体のMSRSカタログ（Aerie Corporation, Birmingham, MI）等の種々の供給源から、入手し得るか；または従来の抗体作製法により調製し得る。ポリクローナル抗血清の調製法は、例えばAusubel, F.M. et al, Current Protocols in Molecular Biology, Volume 2, pp. 11.12.1-11.12.9, John Wiley & Sons, Inc., 1997に教示される。モノクローナル抗体の調製は、例えばAusubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Volume 2, pp. 11.4.1-11.11.5, John Wiley & Sons, Inc., 1997に教示される。
免疫沈降法は当該分野で標準的であり、例えばAusubel, F.M. et al, Current Protocols in Molecular Biology, Volume 2, pp. 10.16.1-10.16.11, John Wiley & Sons, Inc., 1998に見ることができる。ウェスタンブロット（イムノブロット）分析は当該分野で標準的であり、例えばAusubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Volume 2, pp. 10.8.1-10.8.21, John Wiley & Sons, Inc., 1997に見ることができる。酵素結合イムノソルベント検定法（ELISA）は当該分野で標準的であり、例えばAusubel, F.M. et al. , Current Protocols in Molecular Biology, Volume 2, pp. 11.2.1 -11.2.22, John Wiley & Sons, Inc., 1991に見ることができる。
実施例９：ポリ（A）＋mRNA単離
Miura et al., Clin. Chem., 1996, 42, 1758-1764により、ポリ（A）＋mRNAを単離した。ポリ（A）＋mRNA単離の他の方法は、例えばAusubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Volume 1, pp. 4.5.1-4.5.3, John Wiley & Sons, Inc., 1993に教示される。簡潔に言うと、96ウェルプレートで増殖した細胞について、細胞から増殖培地を除去し、各ウェルを200μLの冷PBSで洗浄した。60μLの溶解バッファ（pH 7.6の10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, 0.5M NaCl, 0.5% NP-40, 20mMバナジル-リボヌクレオシド複合体）を各ウェルに加えて、プレートを緩やかに揺らし、次いで室温で5分間インキュベートした。55μLの溶解物を、オリゴd(T)でコートした96ウェルプレート（AGCT Inc., Irvine CA）に移した。プレートを室温で60分間インキュベートし、200μLの洗浄バッファ（pH 7.6の10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, 0.3M NaCl）で3回洗浄した。最後の洗浄の後、余分な洗浄バッファを除去するために、ペーパータオルでプレートから吸い取り、次いで、5分間風乾した。70℃に予備加熱した60μLの溶出バッファ（(pH 7.6の5mM Tris-HCl）を各ウェルに添加し、プレートを90℃のホットプレートで5分間インキュベートし、その後溶出液を新しい96ウェルプレートに移した。
適当な量の全溶液を用いて、100mmまたは他の標準プレートで増殖した細胞は同様に処理され得る。
実施例１０：全RNA単離
RNEASY 96TMキットおよびQiagen, Inc. (Valencia, CA)から購入したバッファを用いて全RNAを単離し、製造者推奨の手順を続けた。簡潔に言うと、96ウェルプレートで増殖した細胞について、細胞から増殖培地を除去し、各ウェルを200μLの冷PBSで洗浄した。各ウェルに100μLのバッファRLTを加え、プレートを20秒間激しく揺らした。次いで各ウェルに100μLの70％エタノールを加え、ピペッティングにより3回上下して内容物を混ぜた。次いで、廃棄物回収トレーに適合したQIAVACTMマニフォールドに繋がれたRNEASY 96TMウェルプレートに試料を移し、真空源に繋いだ。15秒間真空にかけた。1mLのバッファRW1をRNEASY 96TMプレートの各ウェルに添加し、再度15秒間真空にかけた。次いで1mLのバッファRPEをRNEASY 96TMプレートの各ウェルに添加し、15秒間真空にかけた。次いでバッファRPE洗浄を繰り返し、さらに10分間真空にかけた。次いでプレートをQIAVACTMマニフォールドから取り外し、ペーパータオルで水分を吸い取り乾燥させた。次いでプレートを、1.2mL回収チューブを含む回収チューブラックに適合したQIAVACTMマニフォールドに再度繋いだ。
次いで、60μLの水をピペットで各ウェルに加え、1分間インキュベートし、その後30秒間真空にかけることによりRNAを溶出した。さらに60μLの水で溶出工程を繰り返した。
繰り返しのピペッティングおよび溶出工程は、QIAGEN Bio-RobotTM 9604（Qiagen, Inc., Valencia, CA）を用いて自動化し得る。本質的に、培養プレートでの細胞の溶解後、プレートを、ピペッティング、DNase処理および溶出工程を行なう機械化デッキに移す。
実施例１１：PTP1B mRNAレベルのリアルタイム定量的PCR分析
製造者の指示書に従ってABI PRISMTM 7700配列検出システム（PE-Applied Biosystems, Foster City, CA）を用いて、リアルタイム定量的PCRによりPTP1B mRNAレベルの量を測定した。これは、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）産物のリアルタイムのハイスループット定量を可能にする、閉鎖チューブ型、非ゲルベース、蛍光検出システムである。PCRが完了した後に増幅産物を定量する標準的なPCRとは対照的に、リアルタイム定量的PCRの産物は、蓄積すると定量される。これは、順方向および逆方向PCRプライマー間で特異的にアニールするオリゴヌクレオチドプローブをPCR反応中に包含することでなされ、二つの蛍光色素を含む。レポーター色素（例えばOperon Technologies Inc., Alameda, CAまたはPE-Applied Biosystems, Foster City, CAのいずれかから入手されるJOE、FAM、またはVIC）はプローブの5'末端に付加され、クエンチャー色素（例えばOperon Technologies Inc., Alameda, CAまたはPE-Applied Biosystems, Foster City, CAのいずれかから入手されるTAMRA）はプローブの3'末端に付加される。プローブおよび色素が完全な場合、レポーター色素放射は近接する3'クエンチャー色素により消光される。増幅の際の、プローブの標的配列へのアニーリングは、Taqポリメラーゼの5'-エクソヌクレアーゼ活性により切断され得る基質を生じる。PCR増幅サイクルの伸長段階の際に、Taqポリメラーゼによるプローブの切断は、プローブの残りから（およびそれによりクエンチャー部分から）レポーター色素を放出し、配列特異的蛍光シグナルを生じる。各サイクルで、さらなるレポーター色素分子がそれらの各プローブから切断され、ABI PRISMTM 7700配列検出システムに組み込まれたレーザー光学により、規則的な間隔で蛍光強度がモニターされる。各アッセイにおいて、未処理コントロール試料由来のmRNAの連続希釈物を含む、一連の並行な反応は、試験試料のアンチセンスオリゴヌクレオチド処理後のパーセント阻害の定量に使用される標準曲線を生じる。
PE-Applied Biosystems, Foster City, CAからPCR試薬を入手した。25μLのポリ（A）mRNA溶液を含有する96ウェルプレートに、25μLのPCRカクテル（1xTAQMANTMバッファA、5.5mM MgCl2、各300μMのdATP、dCTPおよびdGTP、600μMのdUTP、各100nMの順方向プライマー、逆方向プライマーおよびプローブ、20単位のRNaseインヒビター、1.25単位のAMPLITAQ GOLDTM試薬、ならびに12.5単位のMuLV逆転写酵素）を添加してRT-PCR反応を行なった。48℃で30分間のインキュベートでRT反応を行なった。95℃で10分間インキュベートしてAMPLITAQ GOLDTM試薬を活性化した後、40サイクルのツーステップPCR手順：95℃で15秒（変性）次いで60℃で1.5分（アニーリング／伸長）を行なった。
公開された配列情報（GenBank（登録商標）アクセッション番号M31724、本明細書に配列番号：3として援用）を用いて、ヒトPTP1B配列にハイブリダイズするように、ヒトPTP1Bに対するプローブおよびプライマーを設計した。ヒトPTP1Bについて、PCRプライマーは：
順方向プライマー：GGAGTTCGAGCAGATCGACAA (配列番号: 4)
逆方向プライマー：GGCCACTCTACATGGGAAGTC (配列番号: 5)であり、PCRプローブは：
FAM-AGCTGGGCGGCCATTTACCAGGAT-TAMRA
（配列番号：6）であって、FAM（PE-Applied Biosystems, Foster City, CA）が蛍光レポーター色素で）、TAMRA（PE-Applied Biosystems, Foster City, CA）がクエンチャー色素である。ヒトGAPDHについて、PCRプライマーは：
順方向プライマー：GAAGGTGAAGGTCGGAGTC (配列番号: 7)
逆方向プライマー：GAAGATGGTGATGGGATTTC (配列番号: 8)であり、PCRプローブは：5' JOE-CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC-TAMRA 3' (配列番号: 9)であって、JOE（PE-Applied Biosystems, Foster City, CA）が蛍光レポーター色素で）、TAMRA（PE-Applied Biosystems, Foster City, CA）がクエンチャー色素である。
公開された配列情報（GenBank（登録商標）アクセッション番号M33962、本明細書に配列番号；10として援用）を用いて、ラットPTP1B配列にハイブリダイズするように、ラットPTP1Bに対するプローブおよびプライマーを設計した。ラットPTP1Bについて、PCRプライマーは：
順方向プライマー：CGAGGGTGCAAAGTTCATCAT (配列番号: 11)
逆方向プライマー：CCAGGTCTTCATGGGAAAGCT (配列番号: 12)であり、PCRプローブプローブは：
FAM-CGACTCGTCAGTGCAGGATCAGTGGA-TAMRA
(配列番号: 13)であって、FAM（PE-Applied Biosystems, Foster City, CA）が蛍光レポーター色素で）、TAMRA（PE-Applied Biosystems, Foster City, CA）がクエンチャー色素である。ラットGAPDHについてPCRプライマーは：
順方向プライマー：TGTTCTAGAGACAGCCGCATCTT (配列番号: 14)
逆方向プライマー：CACCGACCTTCACCATCTTGT (配列番号: 15)であり、PCRプローブは：5' JOE-TTGTGCAGTGCCAGCCTCGTCTCA-TAMRA 3' (配列番号: 16)であって、JOE（PE-Applied Biosystems, Foster City, CA）が蛍光レポーター色素で）、TAMRA（PE-Applied Biosystems, Foster City, CA）がクエンチャー色素である。
実施例１２：PTP1B mRNAレベルのノザンブロット分析
アンチセンス処理の18時間後、細胞の単層を冷PBSで2回洗浄し、1mLのRNAZOLTM試薬（TEL-TEST「B」Inc., Friendswood, TX）に溶解した。製造者推奨のプロトコルに従って全RNAを調製した。MOPSバッファシステム（AMRESCO, Inc. Solon, OH）を用いて、1.1％ホルムアルデヒドを含む1.2％アガロースゲルでの電気泳動により20μgの全RNAを分画した。ノザン／サザン転写バッファシステム（TEL-TEST「B」Inc., Friendswood, TX）を用いて一晩キャピラリー転写することにより、RNAをゲルからHYBOND TM -N+ナイロン膜（Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ）に移した。UV可視化によりRNA転写を確認した。STRATALINKER TM UVクロスリンカー2400（Stratagene, Inc, La Jolla, CA）を用いたUV架橋により、膜を固定し、次いでQUICKHYBTMハイブリダイゼーション溶液（Stratagene, La Jolla, CA）を用いて、ストリンジェントな条件のための製造者の推奨を使用して取り去った。
ヒトPTP1Bを検出するために、順方向プライマーGGAGTTCGAGCAGATCGACAA（配列番号：4）および逆方向プライマーGGCCACTCTACATGGGAAGTC（配列番号：5）を用いたPCRにより、ヒトPTP1B特異的プローブを調製した。ローディングおよび転写の効率の変化を正規化するために、ヒトグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）RNA（Clontech, Palo Alto, CA）について膜を剥がし（stripped）、探査した。
ラットPTP1Bを検出するために、順方向プライマーCGAGGGTGCAAAGTTCATCAT（配列番号：11）および逆方向プライマーCCAGGTCTTCATGGGAAAGCT（配列番号：12）を用いたPCRにより、ラットPTP1B特異的プローブを調製した。ローディングおよび転写の効率の変化を正規化するために、ラットグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）RNA（Clontech, Palo Alto, CA）について膜を剥がし（stripped）、探査した。
PHOSPHORIMAGERTM装置およびIMAGEQUANTTMソフトウェアV3.3（Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA）を用いて、ハイブリダイズした膜を可視化し、定量した。未処理コントロールにおいて、GAPDHに対してデータを正規化した。
実施例１３：インビトロにおけるPTP1Bレベルに対するISIS 113715の効果
ISIS 113715は、配列「GCTCCTTCCACTGATCCTGC」（配列番号：17として本明細書中に援用）を有し、3'および5'末端に5個の2'-O-(2-メトキシエチル)ヌクレオチドを隣接する、10個のデオキシヌクレオチドギャップ領域を有するオリゴヌクレオチドであり、ここで全シトシンは5-メチルシトシンで、全てのヌクレオシド間結合はホスホロチオエート結合である。ISIS 113715の結合部位はPTP-1B mRNAのコーディング領域内にある。ISIS 113715の結合部位は、研究された全ての種で保存されており、マウス、ラット、イヌ、サル、およびヒトを含む今日までに研究された全ての動物で薬物は活性である。ISIS 113715の効能を評価するために、ヒト細胞株（T24およびHepG2）でいくつかの実験がなされた。ISIS 113715は、50〜150nMの間にIC50を有する、ヒトPTP1Bの非常に強力なインヒビターであると発見された。
実施例１４：血糖レベルに対するPTP1B（ISIS 113715）のアンチセンスインヒビターの効果
2型糖尿病のモデルとして、db/dbマウスを用いる。これらのマウスは高血糖症、肥満、高脂血症、およびインシュリン耐性である。db/db表現型は、C57BLKSバックグラウンドのレプチンレセプターの変異のためである。しかしながら、異なるマウスバックグラウンドにおけるレプチン遺伝子の変異は、糖尿病を伴わない肥満（ob/obマウス）を生じ得る。食欲を制御するレプチンは、脂肪により産生されるホルモンであり、レプチン欠損を有する動物またはヒトは肥満になる。ヘテロ接合体db/wtマウス（やせた同腹仔として公知）は、高血糖症／高脂血症または肥満の表現型を示さず、コントロールとして使用される。
本発明と一致して、ISIS 113715（GCTCCTTCCACTGATCCTGC、配列番号：17）は、グルコース代謝およびホメオスタシスにおけるPTP1Bの役割を扱うために設計された実験で調査された。ISIS 113715は、本明細書中で配列番号：3として援用されるヒトPTP1Bヌクレオチド配列（ヒトPTP1Bのヌクレオチド951で開始；GenBank（登録商標）アクセッション番号 M31724）、本明細書中で配列番号：10として援用されるラットPTP1Bヌクレオチド配列（ラットPTP1Bのヌクレオチド980で開始、GenBank（登録商標）アクセッション番号M33962）および本明細書中で配列番号：18として援用されるマウスPTP1Bヌクレオチド配列（マウスPTP1Bのヌクレオチド1570で開始；GenBank（登録商標）アクセッション番号U24700）のコーディング領域中の配列に完全に相補的であり、標的化される。使用したコントロールはISIS 29848（NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN、配列番号：19）であり、ここでNはA、G、TおよびCの混合物である。
雄のdb/dbマウスおよびやせた（ヘテロ接合体、すなわちdb/wt）同腹仔（時間0で9週齡）を、同一の平均血糖値を有する一致した群（n=6）に分け、食塩水、ISIS 29848（コントロールオリゴヌクレオチド）またはISIS 113715で1週間に一度、腹腔内注射により処理した。db/dbマウスを10、25または50mg/kgのISIS 113715または50mg/kgのISIS 29848の用量で処理し、一方やせた同腹仔を50または100mg/kgのISIS 113715または100mg/kgのISIS 29848の用量で処理した。処理を4週間続けて、第0日、第7日、第14日、第21日および第28日で血糖レベルを測定した（Ascensia EliteTMglucometer, Bayer, Tarrytown NY）。
第28日までにdb/dbマウスにおいて、全ての用量で血糖値は開始レベルの300mg/dLから10mg/kg用量で225mg/dLに、25mg/kg用量で175mg/dLに、50mg/kg用量で125mg/dLに減少した。野生型マウスについては（170mg/dL）、これらの最終レベルは標準範囲内である。ミスマッチコントロールおよび食塩水処理のレベルは、第28日でそれぞれ320mg/dLおよび370mg/dLであった。
やせた同腹仔において、血糖レベルは、全処理群で試験を通じて一定に保たれた（平均120mg/dL）。これらの結果より、ISIS 113715を用いた処理はdb/dbマウスにおいて血糖を下げること、およびオリゴヌクレオチド処理の結果と同様にdb/dbマウスまたはやせた同腹仔マウスにおいて低血糖症が誘導されないことが示される。
同様の実験において、ob/obマウスおよびそのやせた同腹仔（ヘテロ接合体、すなわちob/wt）に、ISIS 113715、ISIS 29848または食塩水コントロールを50mg/kgで1週間に2回投薬し、第7日、第14日および第21日の終わりに血糖値を測定した。ISIS 113715でのob/obマウスの処理で、時間経過に伴い第7日に225mg/dLから21日に95mg/dLまでの最大の血糖値の減少が生じた。ob/obマウスは、時間経過に伴い300 mg/dLから325 mg/dLの血漿グルコースの増加を示したが、一方コントロールオリゴヌクレオチドでの処理では、血漿グルコースは平均280mg/dLから130mg/dLに減少した。やせた同腹仔において、血漿グルコースレベルは、全ての処理群で変化せずに一定であった（平均レベル100mg/dL）。
実施例１５：肝臓におけるmRNA発現に対するPTP1B（ISIS 113715）のアンチセンス阻害の効果
雄のdb/dbマウスおよびやせた同腹仔（時間0で9週齡）を、同一の平均血糖レベルを有する一致した群（n=6）に分け、食塩水、ISIS 29848（コントロールオリゴヌクレオチド）またはISIS 113715で1週間に一度、腹腔内注射により処理した。db/dbマウスを10、25または50mg/kgのISIS 113715または50mg/kgのISIS 29848の用量で処理し、一方やせた同腹仔を50または100mg/kgのISIS 113715または100mg/kgのISIS 29848の用量で処理した。処理を4週間続け、その後マウスを屠殺してmRNA分析のために組織を回収した。RNA値を標準化して、食塩水処理コントロールのパーセンテージとして表す。
ISIS 113715は、試験した全ての用量で、db/dbマウスの肝臓におけるPTP1B mRNAレベルを首尾よく減少させた（PTP1B mRNAの60％減少）が、コントロールオリゴヌクレオチド処理動物はPTP1B mRNAの減少を示さず食塩水処理レベルのままであった。ISIS 113715でのやせた同腹仔の処理もまた、mRNAレベルを50mg/kg用量でのコントロールの45％および100mg/kg用量でのコントロールの25％にまで減少させた。コントロールオリゴヌクレオチド（ISIS 29848）はmRNAレベルにおいて何の減少も示さなかった。
実施例１６：体重に対するPTP1B（ISIS 113715）のアンチセンス阻害の効果
雄のdb/dbマウスおよびやせた同腹仔（時間0で9週齡）を、同一の平均血糖レベルを有する一致した群（n=6）に分け、食塩水、ISIS 29848（コントロールオリゴヌクレオチド）またはISIS 113715で1週間に一度、腹腔内注射により処理した。db/dbマウスを10、25または50mg/kgのISIS 113715または50mg/kgのISIS 29848の用量で処理し、一方やせた同腹仔を50または100mg/kgのISIS 113715または100mg/kgのISIS 29848の用量で処理した。4週間処理を続けた。28日目にマウスを屠殺して、最終体重を測定した。
ISIS 113715でのob/obマウスの処理により、用量範囲にわたり一定である体重の増加が生じ、動物が平均11.0グラム増加し、一方で食塩水処理コントロールマウスは5.5グラム増加した。コントロールオリゴヌクレオチドで処理した動物は、平均7.8グラムの体重を増加した。
50または100mg/kgのISIS 113715で処理したやせた同腹仔動物は、食塩水コントロールについての3.0グラムの増加と比較して、3.8グラムの体重が増加した。
同様の実験において、ob/obマウスおよびそのやせた同腹仔に、週に2回50mg/kgでISIS 113715、ISIS 29848または食塩水を投薬し、第7日、第14日および第21日の終わりに体重を測定した。
ISIS 113715、ISIS 29848または食塩水コントロールでのob/obマウスの処理は全て、21日間の時間経過の後、同様の体重の増加を生じた。全てのやせた同腹仔の処理群は、処理群で同等である、より少ない体重増加を示した。
PTP1Bアンチセンス処理が脂肪組織中での脂肪貯蔵および脂質生成を調節し得ることを示すob/obマウスでの研究は公開されている（Rondinone, C.M., Diabetes, 2002, 51(8), 2405-11）。これらの研究もまた肥満症と同様に、PTP1Bアンチセンス処理により精巣上体の脂肪組織におけるPTP1Bタンパク質の発現および過脂肪を減少させることを示す。
実施例１７：血漿インシュリンレベルに対するPTP1B（ISIS 113715）のアンチセンス阻害の効果
雄のdb/dbマウス（時間0で9週齡）を、同一の平均血糖レベルを有する一致した群（n=6）に分け、食塩水、ISIS 29848（コントロールオリゴヌクレオチド）またはISIS 113715で50mg/kgの用量で週に2回、腹腔内注射により処理した。第7日、第14日、および第21日に血漿インシュリンレベルを測定しながら処理を3週間続けた。
ISIS 113715で処理したマウスは、第7日の15ng/mLから第21日の7.5ng/mLまでの血漿インシュリンレベルの減少を示した。食塩水処理動物は、第7日の37ng/mLの血漿インシュリンレベルを有し、第4日で25ng/mLに落ちたが、第21日で33ng/mLに再び上昇した。コントロールオリゴヌクレオチドで処理したマウスも、研究の時間経過の後第7日の25ng/mLから第21日の10ng/mLまでの血漿インシュリンレベルの減少を示した。しかしながら、経時的に、血漿インシュリンレベルを減少させるという点において、ISIS 113715は最も効果的であった。この化合物も、ob/obマウスにおいて血漿インシュリンレベルを減少する（Zinker et al., 2002, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 99, 11357-11362）。
実施例１８：カニクイザルの肝臓、筋肉および脂肪組織におけるPTP1B発現のアンチセンス阻害（ISIS 113715）
さらなる態様において、雄のカニクイザルをISIS 113715（配列番号：17）で処理し、PTP1BのmRNAおよびタンパク質のレベルを、筋肉、脂肪および肝臓組織で測定した。インシュリンレベルについて血清試料も測定した。
雄のカニクイザルを、コントロール動物（n=4；食塩水処理のみ）および処理動物（n=8：ISIS 113715で処理）の二つの処理群に分けた。全ての動物は、インシュリンおよびグルコースの基準値を設けるために行なった2回の予備投薬グルコース負荷試験（GTT）を受けた。第1日、第8日、および第15日に、処理群の動物に、3mg/kg、6mg/kgおよび12mg/kgのISIS 113715をそれぞれ皮下投薬した。コントロール群の動物は未処理であった。投薬4日後、全ての動物に第5日、第13日および第19日にGTTを行なった。12mg/kgの最終投薬の10日後に、処理群（ISIS 113715）の全動物は、6mg/kgのISIS 113715の1回投薬を受けた。3日後、全動物を屠殺し、PTP1BのmRNAおよびタンパク質のレベルの分析のために組織を取り出した。食塩水処理動物に対してmRNAおよびタンパク質のレベルを標準化した。
試験した組織のうち、脂肪および肝臓においてPTP1B mRNAレベルは最大程度減少し、41％および40％減少した。筋肉におけるmRNAレベルは10％減少した。タンパク質レベルは、肝臓で60％および筋肉で45％減少した。
肝臓の酵素ALTおよびASTのレベルを毎週測定し、それにより変化は示されず、オリゴヌクレオチド処理の進行中の毒性効果は示されなかった。全ての投薬後、肝臓機能の試験は注目すべきものではなく、血清脂質の変化も報告されなかった。試験の経過を通じて、6mg/kgのSC注射部位の近くにわずかに腫れが見られた一匹のサル以外、有意な臨床的徴候は見られなかった。このサルの異なる注射部位での2回目の12mg/kg注射によって、観察される変化は生じなかった。投薬養生法の増加に関する毒性の証拠は何もなかった。
絶食時インシュリンおよびグルコース値：ISIS 113715での非肥満カニクイザルの処理により、絶食時血漿インシュリンレベルが減少した。コントロール動物において、絶食時インシュリン濃度は減少しなかった。第5週の時点で、ISIS 113715処理動物の血漿インシュリンレベルは、基準値よりもおよそ50％低かった（18.6＋7.4対基準値33.9＋6.6μU/ml*分、p < 0.05）。用量を上げることで効果の増加が生じるように思われた。絶食時インシュリンレベルの減少は、処理群、コントロール群のいずれの絶食時グルコース濃度の変化とも関係がなかった。試験の間、コントロール群においてグルコースレベルは48.0〜51.5mg/dLに変化し、処理群において平均値は53.0〜54.0 mg/dLに変動した。これらの動物は正常な動物であり、低血糖症（40mg/dL未満の血漿グルコース）はいずれの動物、いずれの時点でも観察されなかったので、グルコースの変化は予想されなかった。
IVGTTデータ-グルコース：グルコース負荷試験（glucose challenge）に対する応答は、動物ごと、日ごとに有意な変動性を示した。グルコース使用の指数であるグルコース消失曲線の傾きを比較した場合に、明白な傾向はなかった。グルコースAUCまたはGTTの間に観察された最大グルコース濃度に対して、ISIS 113715の効果はなかった。
IVGTTデータ-インシュリン：処理動物においてインシュリンについてのAUCにおける用量依存的な減少が観察され、最大用量での基準値と比較した際に、ISIS 113715処理動物において全60分間の曲線下面積がおよそ25％減少した（第5週：9638±6431対基準値12448±8047μU/ml*分）。
インシュリン感受性の指数は、グルコース消失曲線の傾き（5〜20分）およびインシュリンのAUCの比に由来し得る。第5週で、ISIS 113715処理群において、基準値（2.12±0.47対基準値1.61±0.89、p=0.04）と比較した際に、インシュリン感受性のわずかな増加が見られた。コントロールのサルにおいて、インシュリン感受性の指数は基準値と比べて第5週で変化しなかった（1.60±0.42対基準値1.63±0.57）。
実施例１９：細分化された肝臓におけるmRNA発現に対するPTP1B（ISIS 113715）のアンチセンス阻害の効果
雄のdb/dbマウス（時間0で9週齡）を、同一の平均血糖レベルを有する一致した群に分け（n=6）、食塩水、ISIS 29848（コントロールオリゴヌクレオチド）またはISIS 113715で1週間に一度、腹腔内注射により処理した。db/dbマウスを50mg/kgのISIS 113715または50mg/kgのISIS 29848または100mg/kgのISIS 29848の用量で処理した。処理を3週間続け、その後マウスを屠殺して分析のために組織を回収した。肝臓組織を取り出し、標準的な方法（Graham et al.,J. Pharmacol. Exp. Ther., 1998, 286, 447-458）により、全体または細分化されたものをホモジナイズして肝細胞および非実質（NP）細胞画分にした。研究の間、両細胞画分においてPTP1B mRNAレベルと同様に血漿グルコースレベルを測定した。RNA値を標準化し、食塩水処理コントロールのパーセントとして表す。
ISIS 113715でのdb/dbマウスの処理により、血漿グルコースレベルの有意な減少が生じた（食塩水=500 +/- 25対処理=223 +/- 21 mg/dL ; p=0.0001）。
肝細胞およびNP細胞画分の両方で、ISIS 113715はPTP1B mRNAレベルを首尾よく減少させ、肝細胞において80％減少で、NP細胞画分において30％減少であった。さらに、二つの細胞画分におけるPTP1B発現は劇的に異なるようであり、NP画分において5〜8倍高いレベルの発現が見られた。
実施例２０：肥満インシュリン耐性高インシュリン血症アカゲザルにおけるPTP1B発現（ISIS 113715）のアンチセンス阻害の効果-改善されたインシュリン感受性
さらなる態様において、5匹の雄の、肥満インシュリン耐性高インシュリン血症アカゲザルをISIS 113715（配列番号：17）で処理し、インシュリン感受性、グルコース寛容ならびにPTP1BのmRNAおよびタンパク質を測定した。インシュリンレベルについて血清試料も測定した。これらの動物は、肥満であるが、血糖正常であったので、絶食時インシュリンおよびGTTインシュリンレベルにおいて、一次終点は減少であった。
全ての動物は、インシュリンおよびグルコース基準値を設けるために行なった、2回の予備投薬グルコース負荷試験（GTT）を受けた。肩甲領域内に20mg/kgの用量で、動物に皮下投薬した（最初の週1日おきに3回注射し、次の3週間に週に1回の注射を続けた）。薬理学的終点として、絶食時のグルコース／インシュリンレベルおよびグルコース負荷（IVGTT）を測定した。第2週の間、投薬の48時間後に絶食時試料を回収した。第3週の間、投薬48時間後にIVGTTを行なった。
基準値と比較した際に、血漿グルコースレベルのどのような変化も伴わない、絶食時インシュリンレベルの50%減少を観察した（処理：31＋9対基準値：67＋7μU/mL、p=0.0001）。さらに、IVGTT後にインシュリンレベルの著しい減少（AUC）を観察した（処理：7295±3178対基準値：18968±2113μU-分/mL、p=0.0002）。インシュリン感受性もまた有意に上昇した（グルコース傾き／インシュリンAUC；5〜20分）。
16時間絶食動物においてさえも、低血糖症は観察されなかった。肝臓酵素のALTおよびASTのレベルを毎週測定したが変化は見られず、オリゴヌクレオチド処理の進行中の毒性の効果がないことが示された。腎臓機能試験も正常であった。注射部位での何らかの皮下的な反応を含む、有意な臨床的な徴候はなかった。血清トリグリセリドが減少に向かう傾向があった（基準131mg/dLから処理後93mg/dL）。さらに、処理動物の大部分の基準と比較して、アポリポプロテインB（アポB）レベルが減少した（群当りn=5について、平均は基準で約74mg/dLであり、処理後59mg/dLであった）。図9に示すように、血清コレステロール（群当りn=5について、平均は基準で約174mg/dLであり、処理後161mg/dLであった）および血清LDLレベル（群当たりn=5について、平均は基準で約84mg/dLであり、処理後70mg/dLであった）が減少した。
アディポネクチンは特に辺縁組織、すなわち骨格筋におけるインシュリン感受性に正に関連していると思われる。低い血漿アディポネクチン濃度は、インシュリン感受性の減少の先に起こると見られている。 Stefan et al., 2002, Diabetes 51, 1884-1888。肥満アカゲザルの基準およびISIS 113715処理の第4週で、市販のヒトアディポネクチンELISAアッセイキットを用いて、血漿のアディポネクチンレベルを測定した。血漿アディポネクチンレベルは、ISIS 113715での処理の4週間で、2倍になることが見出された。
この研究の結果は、本明細書中で記載される先のげっ歯類およびサルの研究で見られたことと矛盾がなく、これはインシュリンレベルの有意な低下を示し、インシュリン効能（感受性）がISIS 113715処理で増加したことを示唆する。これらの発見は、げっ歯類の研究における全ての先の発見で矛盾がない。これらの動物が血糖正常であったこと、およびインシュリンレベルに対する終点効果は、あからさまな糖尿病動物におけるグルコースレベルの低下よりも感受性が低いと考えられることは留意すべきである。
実施例２１：高脂肪食給餌マウスにおけるISIS 113715の効果
4週齢の雄のC57BL/6Jマウス（Jackson Laboratories）を4週間、高脂肪食（60％脂肪）に置いた。続いて、マウスを、6週間50mg/kgの用量で週に1度の腹腔内注射により、食塩水、ミスマッチコントロールオリゴヌクレオチド（ISIS 141923；CCTTCCCTGAAGGTTCCTCC；配列番号：20）またはISIS 113715（配列番号：17）のいずれかで処理した（n=10／処理群）。週に1度動物を計量し、処理開始の4週後にGTTを行なった。第6週の終わりに、マウスを屠殺し、肝臓を取り出した。組織抽出物を調製し、PTP1Bタンパク質レベルの変化を測定するためにウェスタンブロット分析にかけた。
ISIS 113715で処理した高脂肪食給餌マウスにおいて、有意に減少した体重増加が見られた。第6週の終わりに、食塩水またはコントロールオリゴヌクレオチド処理マウスと比較して、ISIS 113715処理マウスは45%低く体重を増加し、精巣上体脂肪パッドの重量において同様の減少を有した。ISIS 113715処理マウスにおける血清インシュリン濃度は普通食給餌（normal chow-fed）マウスで見られる値にまで減少し（高脂肪食給餌：2.8±0.3；ISIS 113715処理：0.9±0.3；普通食：1.1±0.5ng/ml）、該マウスでグルコース負荷試験も良好に行なった（時間0で約175mg/dLから30分で約430mg/dLおよび60分で最大約460mg/dLのグルコース可動域を有する高脂肪食給餌の食塩水処理動物と比較して；最大血糖可動域は、時間0で約125mg/dLから30分で約300 mg/dLに移行した。普通食給餌のマウスは、時間0で約100mg/dLから30分で最大約175mg/dLのグルコース可動域を有した。）。ISIS 113715で処理した動物の肝臓において、PTP1Bタンパク質発現は約50%減少した。従って、高脂肪食給餌の正常マウスにおいて、PTP1Bアンチセンス処理によりインシュリン感受性が上昇し、体重増加が減少した。
実施例２２：肥満性2型糖尿病（ZDF）ラットに対するPTP1Bレセプターのアンチセンスインヒビターの効果
レプチンレセプター欠損肥満性2型糖尿病（ZDF）ラットは、2型糖尿病の研究のための別の有用なモデルである。この雄のラットにおいては、8〜10週齡で糖尿病は自発的に発症し、糖尿病は過食症、多尿症、多渇症および体重増加の低下、糖尿病の臨床的症状と対応する症状に関係する（Phillips MS, et al, 1996, Nat Genet 13, 18-19）。
ZDF/GmiCrl-fa/fa（ZDF）雄ラットを、Charles River Laboratories（Wilmington, MA, USA）から購入した。6週齢のZDF雄ラットに、4週間週に2回で、25mg/kgの用量でオリゴヌクレオチドを腹腔内注射した。用いたPTP1Bアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ISIS 113715（配列番号：17）およびマウスおよびラットのPTP1Bに相補的であり、ホスホロチオエート主鎖を有する2'-MOEギャップマーであるISIS 106425（TGAACAGGTTAAGGCCCTGA；配列番号：21）であった。ISIS 113715の6ミスマッチコントロールであるISIS 141923（配列番号：20）を、ネガティブオリゴヌクレオチドコントロールとして用いた。食塩水注射動物もコントロールとして用いた。
PTP1BのアンチセンスインヒビターであるISIS 113715（配列番号：17）で処理したZDFラットにおいて、給餌時血漿グルコースレベルは、第0週で約274±43mg/dL、第1週で302±51mg/dL、第2週で315±44mg/dL、第3週で320±43mg/dLおよび第4週で299±46mg/dLであった。PTP1Bの別のアンチセンスインヒビターであるISIS 106425（配列番号：415）で処理したラットにおいて、給餌時血漿グルコースレベルは、第0週で約275±43mg/dL、第1週で302±53mg/dL、第2週で293±50mg/dL、第3週で315±54mg/dLおよび第4週で272±41mg/dLであった。対照的に、食塩水のみで処理したラットは、第0週で約302±44mg/dL、第1週で400±17mg/dL、第2週で441±13mg/dL、第3週で453±26mg/dLおよび第4週で425±10mg/dLの給餌時血漿グルコースレベルを有した。ネガティブコントロールオリゴヌクレオチドISIS 141923で処理したラットは、第0週で約306±59mg/dL、第1週で391±35mg/dL、第2週で402±37mg/dL、第3週で411±27mg/dLおよび第4週で392±11mg/dLの給餌時血漿グルコースレベルを有した。
腹腔内グルコース負荷試験（IPGTT）も行なった。ラットにグルコースの腹腔内注射を与え、グルコース負荷試験の前に、2時間より長い間隔を開けて血糖およびインシュリンレベルを測定する。血糖レベル（mg/dL）を以下の表1に示す：

表１に示した血糖レベルを時間に対してグラフにし、曲線下面積（AUC）を計算する。グルコースについてのより小さいAUC（グルコース負荷試験後のより小さい血糖可動域）は、より良好なグルコース許容を示す。食塩水処理ラットについてのグルコース可動域（AUC）は約72,000であり；ネガティブコントロールISIS 141923処理ラットについては約80,000であり、ISIS 113715処理ラットについては約60,000であり、ISIS 106425処理ラットについては約63,000であった。
IPGTT後のインシュリン可動域も、表２に示すように上昇した。
AUC値を出すために、表２の数値を時間に対してグラフにした。AUCは、食塩水処理ラットについては約300であり、ISIS 141923コントロール処理ラットについては320であり、ISIS 113715処理動物については約400であり、ISIS 106425処理動物については約680であった。
血漿トランスアミナーゼ（ASTおよびALT）は、食塩水処理ラットと比較して、いずれのPTP1Bアンチセンスオリゴヌクレオチド処理によっても有意に変化せず、肝臓毒性がないことを示した。
ウェスタンブロット分析によりPTP1Bタンパク質レベルを測定した。食塩水処理動物と比較して、PTP1Bレベルは、ISIS 141923での処理後10％減少し、ISIS 113715での処理後約55％減少し、ISIS 106425での処理後約50％減少した。
実施例２３：PTP1Bレセプターのアンチセンスインヒビターの肥満性II型糖尿病（ZDF）ラットに対する効果−ロシグリタゾンおよびメトホルミンに対する比較
７週齢雄ZDFラットを、５週間腹腔内（IP）注射によって５０ｍｇ／ｋｇ／週の用量で食塩水またはISIS１１３７１５のいずれかで処置した（食塩水についてｎ＝７およびISIS１１３７１５についてｎ＝１０）。ISIS１１３７１５の効果を、ロシグリタゾン（経口的に、１０ｍｇ／ｋｇ／日 ｎ＝８）またはメトホルミン（経口的に、８００ｍｇ／ｋｇ／日 ｎ＝８）と比較した。細身ラットの食塩水処置群をまた研究に含めた。全ての薬物での処置を、約８週齢で生じる糖尿病に率直にラットがなる前に開始した。血漿グルコースレベルを処置開始後３週および５週で測定した。体重を１週間に１回測定し；さらに、HbA1cレベルを研究の終わりにHPLCによって測定した。食餌許容試験（meal tolerance test）をまた、処置後４週で実施した。
５週の終わりに、数匹のラットを屠殺し、肝臓および精巣上体脂肪パッドを除去した。残りの動物（ｎ＝４／群）を処置の中止後血漿グルコースレベルの変化について試験した。回復期の間のグルコース測定を、処置の停止後１０日および５週に実施した。結果を表３に示す。組織抽出物をウエスタンブロット分析に供し、PTP1Bタンパク質レベルの変化を測定した。
ISIS１１３７１５は、ZDFラットにおける糖尿病の進行を予防または遅延した。ISIS１１３７１５のグルコース低下効果は、処置の中止後５週間までの間持続され；かかる永続的制御は、ロシグリタゾンまたはメトホルミン処置のいずれかを用いては見られなかった。
ＨｂＡ1cは、食塩水に比べて全ての薬物処置群において減少された（食塩水処置ZDFラットについて９．２％、食塩水処置細身のラットについて５．５％、ISIS１１３７１５処置ZDFラットについて６．８％、ロシグリタゾン処置ZDFラットについて５．４％およびメトホルミン処置ZDFラットについて６．１％）。全ての処置は、食塩水処置動物に比べて％ＨｂＡ1cの統計的に有意な（ｐ＜０．００１）減少を生じた。前の３ヶ月（ヒトについて；赤血球の入れ替わりがより早いために齧歯類については１ヶ月）にわたってのＨｂＡ1cのレベルと平均血糖値との間に強い相関が存在し、従って、ＨｂＡ1cは、持続的血糖コントロールの基準である(Bunn, H.F. et al., 1978, Science. 200, 21-7)。
食餌許容試験は、ISIS113715がグルコース可動域の改善を引き起こし、これは、改善された糖耐性を示した。同様の効果は、本研究において使用される高い用量でのロシグリタゾンおよびメトホルミンを用いて観察された。体重は、ISIS113715またはメトホルミンでの処置後変わらないままであったが、ロシグリタゾン処置後増加した。
実施例２４−前臨床的毒物学および薬物動力学−要約
ISIS113715を用いて完了される安全研究は、２週間ラット毒性研究、３ヶ月ラット毒性研究および２の３ヶ月サル毒性研究を含む。ISIS113715は、完全な相同性を有するヒト、マウス、ラットおよびサルのPTP1Bを標的とする。
処置の１３週後のISIS113715の組織濃度は、一般的に同等の用量レベルでラットで観察されるよりもサルでより高かった（以下の表４を参照）。薬理学的目的物の組織において観察される分布および蓄積は、ISIS113715の臨床的応用について一般的に好ましい。
さらに、皮下投与後の組織濃度は、（用量について調節される場合）サルにおけるIV投与後のものと同等であり、このことは、この経路による完全全身吸収を示した。SC注射後のISIS113715の組織分布および排出は、IV注入で生じるものと類似しており、このことは、全身的に吸収されるISIS113715が投与の経路に独立して分布されることを示唆した。しかし、継続する遅い吸収過程に起因してSC注射後の見かけの血漿半減期はより長かった（２００〜３００分）。
組織からのISIS113715のクリアランスは、血漿クリアランスに比べて非常に遅かった。ラットにおける組織半減期は、８．６〜３５日（放射性同位元素を測定した）であり、サルにおいて８日〜２３日（親薬物を測定した）であった。この遅いクリアランスは、たまの投薬を支持する。負荷期（３回の投薬について２日おきに投薬する）の後、組織濃度は、単回用量濃度に比べてラットおよびサルにおいて約２〜３倍高かった。維持投薬（３ヶ月間１週間に１回）は、濃度を維持したかまたは濃度の１〜２倍のさらなる増加を生じたかのいずれかであった。
実施例２５：しばしばサンプリングされる静脈内糖耐性試験（IVGTT）プロトコル
ヒト被験体／患者を試験前１２時間絶食させる。試験の日に、被験体の体重を量り、注入されるべき５０％グルコース溶液の体積を以下の式によって計算する：
被験体の体重（ｋｇ）×０．６＝注入されるべきグルコース溶液のｍｌ数。
試験前血液試料を得、遠心分離し、２mＬの被験体血清を取っておく。３０ｍｌの１U／ｍｌインシュリン溶液を、通常のヒトインシュリン（０．３ｍｌの１００U／ｍｌのHumalin, Novolin-Rまたは等価物）および食塩水(27.7 ml)および被験体の血清（またはヒト血清アルブミン）（２ｍｌ）を使用して調製する。必要とされるインシュリン用量を以下の式から計算する：
インシュリン用量＝体重（ｋｇ）×０．０３U／ｋｇ＝インシュリンの単位数。
インシュリン体積＝１U／ｍｌ溶液×単位数＝希釈されたインシュリン溶液のｍｌ数（最も近い０．５に概数にする）。
カニューレを、患者の各肘前静脈または手に配置する。１つのカニューレを、カニューレの開通性を維持するように約０．５ｍｌ／分の速度で注入される通常の食塩水の袋に連結する。このカニューレをグルコースおよびインシュリン溶液を注射するために使用する。
他の腕において、第２カニューレを０．５ｍｌ／分の速度で注入される通常の食塩水の第２の袋に連結する。このカニューレを全てのIVGTT血液試料を得るために使用する。
血液試料を５０％グルコースボーラス注射前２０分、１０分および１分に得る。０分血液を得た直後、５０％グルコース注入物を１分にわたってスムースボーラスとして反対の腕に投与する。さらなる血液試料をグルコース注射のちょうど２分、３分、４分、５分、６分、８分、１０分、１４分および１９分後に得る。全てのIVGTT試料を氷上に配置し、遠心分離し、採取の１時間以内に凍結する。
グルコースボーラス注射の完了のちょうど２０分後、インシュリン注射液を、グルコース注射を受けた同じ腕に投与する。さらなる血液試料を２２分、２４分、２７分、３０分、４０分、５０分、７０分、９０分、１２０分、１５０分、１８０分および（任意に、プロトコルに依存して）２４０分に得る。全てのIVGTT試料を氷上に配置し、遠心分離し、採取の１時間以内に凍結する。
実施例２６：ISIS１１３７１５のヒト臨床試行−健康な志願者および２型糖尿病に静脈投与されたISIS113715の単回用量および複数回用量の安全性、許容可能性、薬物動力学および薬力学を評価するための二重盲検、プラシーボ制御、用量段階的拡大、第１／２A相研究（CS-1）
第１相臨床試行（CS1）を、２０人の健康な志願者に静脈的に与えられた漸増用量のISIS113715の安全性および薬物動力学プロフィールを評価するために実施した。
研究母集団に対する含入基準は以下の通りであった：
１．年齢：１８〜６５歳；
２．性別：男性または女性であるが、女性は閉経後であるかまたは外科的に不妊でなければならない。
３．試行への参加に対する同意書を提出すること。
除外基準：
１．妊婦または授乳している母親；
２．病歴または身体検査における臨床的に有意な異常
３．実験室検査における臨床的に有意な異常；
４．補体における臨床的に有意な異常；
５．凝固パラメーターにおける臨床的に有意な異常；
６．女性について１．２ｍｇ／dＬ以上の血清クレアチニンレベルもしくは男性について１．５ｍｇ／dＬ以上の血清クレアチニンレベルまたは被験体の年齢および性別についての正常な範囲外にあるクレアチニンクリアランスを有する被験体。
７．HIV陽性；
８．抗ウイルス療法または抗微生物療法を必要とする活動性感染症；
９．エストロゲン補充療法の他の処方箋投薬を受けていること；
１０．悪性疾患（十分に処置され、１年を超えて再発がない場合、皮膚の基底細胞癌または扁平上皮細胞癌の他の）；
１１．制御されない慢性疾患；
１２．調査者の意見において、研究への参加またはコンプライアンスでの干渉を排除する任意の他の同時の状態；
１３．現在のアルコールまたは薬物乱用の病歴；
１４．１日に１０本を超えて喫煙をする被験体；
１５．理想体重より１０％を超えて、より重いかまたはより軽い被験体；
１６．スクリーニングの前９０日以内に別の調査用薬物、生物学的薬剤または装置での処置を受けているまたは受けたことがある；
１７．スクリーニングの３ヶ月以内の献血。
この試行は５の初期コホート（A〜E）を有し、１コホートあたり４人の被験体を有した。４人の被験体を、各コホートの中でISIS１１３７１５またはプラシーボそれぞれを受けるように３：１の比にランダム化した。各コホートは、異なる投薬量のISIS１１３７１５を受けた。（コホートA−０．５ｍｇ／ｋｇ ISIS１１３７１５またはプラシーボ；コホートB−１．０ｍｇ／ｋｇ ISIS１１３７１５またはプラシーボ；コホートC−２．５ｍｇ／ｋｇ ISIS１１３７１５またはプラシーボ；コホートD−５．０ｍｇ／ｋｇ ISIS１１３７１５またはプラシーボ；コホートE−７．５ｍｇ／ｋｇ ISIS１１３７１５またはプラシーボ）。コホートB単回投薬は、コホートA単回投薬が完了した後、開始した。複数回投薬は、コホートAおよびBの単回投薬からのデータの安全な概観の後、開始した。複数回投薬について、単回用量を与え、次いで、２〜４週間の休息の後、３のさらなる用量を５日間にわたって与えた。ISIS１１３７１５を２時間連続静脈注入として投与した。ISIS１１３７１５を、必要な場合希釈された滅菌非保存緩衝化食塩水中の１０ｍｇ／ｍｌ溶液として提供した。
血液および尿試料を、研究薬物投与の後の選択された時点での化学、CBC、凝固、補体、尿検査およびISIS１１３７１５濃度のために回収した。ISIS１１３７１５ PK分析のための血液サンプリングをまた、処置の第１日、第２日および第４日に回収した。絶食１２０分静脈糖耐性試験（IVGTT）を、投薬の前およびコホートDおよびE（５．０および７．５ｍｇ／ｋｇコホート）のみについて投薬の５日後に実施した。より広範囲の絶食２４０分のしばしばサンプリングされるIVGTTをまた、本明細書中他の実施例に記載されるように実施し得る。
結果を以下のように要約する：ISIS１１３７１５を、本第１相研究において０．５、１．０、２．５、５．０および７．５ｍｇ／ｋｇ体重の単回および複数回用量で１５人の健康な志願者患者に投与した。研究の単回用量成分の間、患者は上記用量でISIS１１３７１５またはプラシーボの単回用量を受けた。この３〜４週間後に、ISIS１１３７１５またはプラシーボが５日の期間にわたって３回投与された研究の複数回用量成分が続いた。
EKG、尿検査および化学、血液学ならびに凝固パネルを含む実験室パラメーターに臨床的に関連する変化はなかった。後遺症のなかったaPTTの一過性の用量関連延長（２６〜４３秒の通常の参照範囲に比べて５．０ｍｇ／ｋｇ用量コホートにおいて４０±２秒および７．５ｍｇ／ｋｇコホートにおいて５１±９秒）があった。補体分裂産物（complement split product）、C5aおよびBbの分析は、ベースラインから変化がないことを明らかにした。
ISIS113715の血漿濃度を単回および複数回用量の後決定した。最高濃度（Cmax）は、２時間注入の終わりまたは終わり近くに見られ、その後血漿クリアランスを支配する初期の相対的に速い分布相を伴う複数相減衰（０．５〜１．９時間平均半減期）が見られ、その後少なくとも１つのより遅い配置相が見られた。単回投薬および複数回投薬の両方の後で、Cmaxが用量比例増加を示し、その一方で、AUCtlastは、用量比例増加より大きく、このことは、より高い用量での血漿クリアランスの減少に対応した。血漿クリアランスの用量依存減少は、より高い用量での組織分布の飽和に一部起因して起こりそうである。これはまた、前臨床モデルにおいて観察された。クリアランスは、２．５〜７．５ｍｇ／ｋｇの用量にわたって本質的に直線（用量非依存性）であった。ISIS113715のCmaxおよびAUCtlastの両方は、用量に関わらず、単回投薬と複数回投薬との間で類似しており、このことは、投薬期間にわたって血漿における薬物の蓄積はないことを示唆した。
研究の間、重大で有害な出来事（SAE）は報告されなかった。すなわち、５人のプラシーボ処置患者およびISIS113715を受けた１４人の患者によって、７２の有害な出来事（AE）が報告された。活性な薬物を受けた患者のAE対プラシーボ処置患者のAEの比は、３．２：１であり；この比は、３：１の研究ランダム化に類似している。AEの数は、５のみのAEが報告された０．５mg/kgコホートの他の用量コホートの間で等しく分布した。AEの大部分（４６）は、調査者によって研究薬物と関係がないとみなされ、その一方で、残りの２６は、おそらく関係すると考えられた。AEは、非特異的であり、頭痛、不眠症および傾眠からカニューレ挿入の部位での血腫までにわたった。
ISIS113715の薬理学的活性を、静脈糖耐性試験を用いて５．０および７．５ｍｇ／ｋｇ用量コホートにおいて試験した。インシュリン、グルコースおよびC-ペプチドに対する曲線下面積（AUC）を決定した；この予備分析を表５に示す。
非糖尿病患者に対して予想され得るように、いずれかのコホートにおけるISIS113715投与の前および後にグルコース可動域およびAUCの変化はなかった。低血糖症の指示はなかった。しかし、インシュリンAUCは、５．０および７．５ｍｇ／ｋｇコホートそれぞれにおいて、ベースラインに比べて２７％および３２％減少した。対照的に、インシュリンAUCは、２人のプラシーボ処置患者においてISIS１１３７１５投与の後、ベースラインに比べて１９％上昇した。
この研究は、ISIS113715を受けた全ての患者において改善された糖耐性および改善されたインシュリン感受性（糖耐性試験によって測定された場合）を示し、薬物は、大いに許容された。低血糖症は観察されなかった。これらの結果は、齧歯類および非ヒト霊長類における臨床前薬理学と一致した。
正常な患者志願者におけるこれらの有望な結果に基づいて、２型糖尿病を有する１０人の患者をコホートFとして試行に加えた。含入基準は、コホートA〜Eに対するものおよび以下であった：
１．患者は診断以来８年未満の期間２型糖尿病を有する；
２．患者はスクリーニングの前少なくとも３ヶ月間経口スルホニル尿素（グリベンクラミド、グリピザイド又はグリメプリド（glimepride））を安定用量受けている；
３．患者は１２５ｍｇ／ｄｌと２００ｍｇ／ｄｌとの間の絶食時血糖を有する。
４．患者は７〜１０％のHbA1cを有する；
５．患者は３２ｋｇｍ−２以下のボディマス指数を有する。
コホートFの患者を、ISIS113715（５．０ｍｇ／ｋｇ、用量あたり４００ｍｇを超えない）またはプラシーボそれぞれをうけるように７：３の比にランダム化した。複数用量薬物処置相の後、コホートFの被験体は、１５日の延長期間に入り、ISIS113715の３のさらなる用量を受けた（１週あたり１注入）。患者を、上記コホートA〜Eに対してと同様に評価する。
実施例２７：ヒト臨床試行−第２相−２型糖尿病を有し以前に治療を受けていない患者におけるISIS113715の安全性、許容可能性、薬物動力学および活性を評価するための二重盲検、プラシーボ制御、用量段階的拡大研究（CS-７）
第２相臨床試行は、２型糖尿病を有する患者における血糖値を調節するISIS113715の能力をさらに評価するために進行中である。研究に必然的に含まれる２型糖尿病（５コホート）に、１００、２００、４００または６００ｍｇのISIS113715を静脈投薬する。
コホートA：１００ｍｇ ISIS113715またはプラシーボ；コホートB：２００ｍｇ ISIS113715またはプラシーボ；コホートC：４００ｍｇ ISIS113715またはプラシーボ；コホートD：６００ｍｇ ISIS113715またはプラシーボ；コホートE：２００ｍｇ ISIS113715またはプラシーボ。全部で９６人の患者について約１６人の患者は、３：１の比（ISIS113715対プラシーボ）で各４つの用量コホート（コホートA〜D）にランダム化され、約３２人の患者は、３：１の比（ISIS113715対プラシーボ）でコホートEにランダム化される。
研究のために選択された用量範囲、１００〜６００ｍｇは、７０ｋｇの患者について１．４３〜８．５７ｍｇ／ｋｇと等価である。２型糖尿病を有する患者がしばしば肥満であるので、実際の曝露はより少ない（１００ｋｇの患者について１〜６ｍｇ／ｋｇ）。これらの用量は、第１相研究（CS1）における健康な志願者患者に安全に投与された用量（０．５〜７．５ｍｇ／ｋｇ）と同等である。該研究において、IVGTTチャレンジの後５．０または７．５ｍｇ／ｋｇ用量コホートに続いて、インシュリンAUCの２７％および３２％の減少があった。より低い用量が該研究においてIVGTTを用いてチャレンジされず、その一方で、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いる臨床前経験は、２ｍｇ／ｋｇほど低い用量が薬理学を示すことを予測する。
患者は、全部で６週間の間、第１週に３の負荷用量を受け、次いで、第２週〜第６週に１週間に１回投薬される。研究の最初の週の間の代替日投与（負荷用量）は、定常状態が迅速に達成され得るように選択された。１０〜３０日の組織半減期を伴って、達成される定常状態は、瞬間ではない。薬物動力学的研究からのデータは、負荷用量戦略が第１週の間に約７０％〜８０％定常状態レベルを達成する器官を戦略的に生じることを示す。この１週間に３回のスケジュールを、第１相臨床研究（CS1）において使用した。研究薬物は、第１週の第１日、第３日、および第５日に、コホートA、B、CおよびEについては１時間静脈注入を介する３の負荷用量として、コホートDについては２時間注入を介する３の負荷用量として、投与される。研究薬物は、処置期間の残りの週の間、静脈注入を介して１週間に１回投与される。
個々の患者についてのCS7研究は、２週間のスクリーニング期、３週間のベースライン期、６週間の処置期および処置後評価期からなる。コホートEの患者について処置期は１２週間であった。コホートAの患者およびコホートBのほとんどの患者について、処置後評価期は４週間であった。コホートBの数人の患者およびコホートC〜Eの全ての患者について、処置後期は１２週間であった。研究について、含入基準は：年齢１８〜６５歳、男性または女性の性別であるが、女性は閉経後または外科的に不妊でなければならない、期間が５年未満の２型真性糖尿病、低血糖症治療を受けたことがない、１３０ｍｇ／dＬと２２０ｍｇ／dＬの間の絶食時血糖（コホートA〜Dについて７．２〜１２．２mmol/LおよびコホートEについて１４０ｍｇ／ｄLと２２０ｍｇ／ｄLの間（７．８および１２．２mmol/L））、コホートA〜Dについて６．８％と１０．０％との間のHbA1cおよびコホートEについて７．５％と１１．０％の間のHbA1c、２５ｋｇｍ−２より大きく３５ｋｇｍ−２より小さいボディマス指数、ならびに研究に参加するための同意書の提出、を含む。
除外基準は：スクリーニングの１ヶ月以内のグルコース恒常性に影響し得る投薬（例えば、全身性糖質コルチコイド）、病歴または身体検査における臨床的に有意な異常、実験室検査における臨床的に有意な異常、HIV感染の病歴、抗ウイルス治療または抗微生物治療を必要とする活動性感染症、悪性疾患（十分に治療され、スクリーニングの時点で１年を超えて再発がない場合、皮膚の基底細胞癌または扁平上皮細胞癌を除く）、調査者の意見においてコンプライアンスへの参加を除外するまたはコンプライアンスに干渉する任意の他の状態、アルコールまたは薬物乱用、スクリーニングの９０日以内に別の調査用薬物、生物学的薬剤または装置での処置を受けているまたは受けたことがある、男性について１．５ｍｇ／dＬを超える濃度および女性について１．２ｍｇ／dＬを超える濃度として規定される異常血清クレアチニン濃度、アセチルサリチル酸または非ステロイド性抗炎症性薬剤以外の凝固に影響し得る投薬（ヘパリン、ワルファリン、など）、ならびに硫黄含有投薬に対するアレルギー、を含む。
ECGは、研究薬物注入の前に第３週および第６週（コホートA〜D）ならびに第３週、第６週、第９週および第１２週（コホートE）に実施される。一晩絶食（少なくとも１２時間）後のFSIVGTTは、コホートA、およびコホートBの８人の患者の第１の群について第６週の第３日に実施される。短縮された手順（３の時点でのグルコース、インシュリンおよびC-ペプチドについて回収された血液試料ならびにHBA1Cのためのさらなる試料）は、第６週（コホートC、D、およびコホートBの８人の患者の第２の群）ならびに第３週、第６週および第１２週（コホートE）での研究薬物注入の前に実施される。
ISIS113715 PK分析のための血液試料は、各コホートの第１の１２人の患者に対する処置の間、各往診で回収される。さらに、尿は、PK評価のために第１週（第１日）に、および第６週（コホートA〜D）または第１２週（コホートE）のいずれかに２４時間回収される。各コホート内の残りの患者は、第１週（第１日）、第２週、第４週および第６週（コホートA〜D）ならびに第１週（第１日）、第２週、第４週、第６週、第８週、第１０週および第１２週（コホートE）に回収された血液試料を用いて短縮されたPK評価を受ける。
ISIS113715は、滅菌の非保存緩衝化食塩水中の２５０ｍｇ／ｍｌ溶液として提供される。プラシーボは、着色のためのリボフラビンを有する０．９％食塩水である。ISIS113715は、第１週の第１日、第３日および第５日に、コホートA〜Cについて１時間静脈注入を介する３の負荷用量としておよびコホートDについて２時間注入を介する３の負荷用量として投与される。凝固および補体のための血液試料は、第１日の研究薬物注入開始後２．５および４時間で回収される。血液は、さらなる安全実験室のために回収される。患者は、薬物注入、有害な出来事の報告および安全分析のための実験室試験のために第３日および第５日に研究センターに戻る。患者は、毎日家で絶食時血糖値を測定する。
ISIS113715 PK分析のための血液試料は、各コホートの第１の１２人の患者に対する処置の間に各往診で回収される。さらに、尿は、PK評価のために第１週（第１日）に、および第６週（コホートA〜D）または第１２週（コホートE）のいずれかに２４時間回収される。各コホート内の残りの患者は、第１週（第１日）、第２週、第４週および第６週（コホートA〜D）ならびに第１週（第１日）、第２週、第４週、第６週、第８週、第１０週および第１２週（コホートE）に回収された血液試料を用いて短縮されたPK評価を受ける。
本研究は、安全性および許容可能性研究として意図され、効力を試験するために設計または邁進されていなかった。
本研究における１１３１５の活性は、HbA1C、絶食時血糖、インシュリンおよびC-ペプチドに対するISIS−１１３７１５処置の変化の最後をプラシーボと比較することによって評価される。全研究にわたるインシュリン感受性およびβ細胞機能の誘導された測定のさらなる分析はまた、実施される。インシュリン感受性の測定は、Quantitative Insulin Sensitivity Check Index (QUICKI)を含む。QUICKI指数は、1/ log 10として計算される（絶食時血漿グルコース［ｍｇ／dＬ］×絶食時インシュリン［μU／mＬ］）。β細胞機能は、Homeostasis Model Assessment (HOMA)β細胞機能指数を使用して見積もられる。この指数は、２０×絶食時インシュリン（μU／mＬ）／（（絶食時血漿グルコース（ｍｇ／dＬ）／１８）−３．５）として計算される。脂質測定は、トリグリセリド、HDL、LDLおよびVLDLコレステロールならびに全コレステロールを含む。誘導された脂質測定は、全コレステロール／HDLコレステロールの比およびHDL対LDLコレステロールの比を含む。ISIS113715の、血糖上昇コントロール（HbA1C、絶食時血漿グルコース、患者によって測定された毎日の血糖）に対する効果および脂質レベル（全コレステロール、HDL、LDL、HDL：LDL比、トリグリセリド）に対する効果は、コホートA（１００ｍｇ）、B（２００ｍｇ）およびC（４００ｍｇ）について評価された。これらの研究からのデータは、示されるように、第６週の間および第１０週の間のベースライン測定からの実際の変化およびベースライン測定からのパーセント変化として以下の表に示される。評価されたデータ点の数（n）、各処置群についての平均値および標準偏差（ｓｔｄ）ならびに各処置群についての最小および最大測定が、表に示される。第６週の測定は、ISIS113715の８の用量の後生じる（第１週の間に３の用量および第２週から第６週の間に各１の用量）。第１０週での測定は、最後の用量の４週間後に生じる。負の数は、ベースラインまたはスクリーンからの減少を示し、その一方で、正の数は、ベースラインまたはスクリーンからの増加を示す。これらの研究からのデータはまた、本明細書中に援用される図面において示される。CS-7からのデータを含む図面について、ISIS１１３７１５処置群とプラシーボとの間の違いは、ANCOVAを使用して見積もられ、スクリーニング測定またはベースライン測定は、モデルにおける共変数として含まれた。同時９５％信頼性区間は、Dunnettの方法を使用して構成された。
第６週および第１０週でのHbA1C変化の測定が表６aに示される。ベースラインHbA1Cレベルは、１００ｍｇコホートについて測定されなかったが、プロトコルは、コホートCの患者およびコホートBの数人の患者に対する測定を取り込むために時間が修正された。
表６aに示されるように、平均して、ISIS113715で処置された患者は、第６週でプラシーボ処置患者よりHbA1Cレベルのより大きな変化を示し、効果は、第１０週でなお明らかであり、延長された効果を示唆した。
HbA1Cレベルは、スクリーニングの間コホートAおよびBにおける患者について測定され、第６週でのプールされた１００ｍｇおよび２００ｍｇのコホート対プラシーボの間の調節された処置の違いをスクリーニングするための共分散結果の分析が図１に示される。図２は、第６週での１００ｍｇおよび２００ｍｇコホートについてプラシーボからの別々に調節された違いのスクリーニングを示す。表６aに示されるベースラインレベルに対する比較に関して、これらのデータは、ISIS113715での処置が２型糖尿病におけるHbA1Cレベルの低下を引き起こすことを示す。前の３ヶ月にわたって、HbA1Cレベルと平均血糖値との間には強い相関があり、従って、HbA1Cの低下は、持続的な血糖コントロールを示す。従って、ちょうど６週間の処置にわたる低下は、起こる見込みがある。
スクリーニング、ベースライン（測定された場合）、ならびに第６週および第１０週でのプラシーボ群、コホートA（１００ｍｇ）、コホートB（２００ｍｇ）およびコホートC（４００ｍｇ）における個々の患者についてのHbA1Cレベル（％）が表６ｂに示される。

プラシーボと比較した場合のコホートCについてのHbA1C%のベースラインからの中間パーセント変化は、図３に示される。プラシーボ群における中間HbA1Cレベルの最初の低下があるが、この傾向は、ほぼ第６週の後安定に達するように見え、その一方で、処置群で観察されるより劇的な減少は、第１４週まで減少傾向が続く。この分析について、週は、２週間ウィンドウにおいて第１用量日から計算された。これらのデータは、ISIS113715処置に伴うHbA1Cの延長された減少を支持する。
ベースラインレベルと比較した場合の、第６週および第１０週で測定された絶食時血清グルコースレベルの変化は、表７に示される。
表７に示されるように、第１０週で２型糖尿病を有する患者におけるISIS113715での処置を伴う絶食時血清グルコースには減少傾向がある。図４および５は、コホートA、BおよびCの個々の患者からのデータを示し、HbA1Cレベルおよび絶食時血清グルコースレベルの平行減少を示す。
ベースラインレベルと比較された場合の、患者によって測定された平均毎日絶食時血糖値の平均変化を表８に示す。測定は、各患者について１週間で平均される。この様式で処理された各処置群についての平均データが、示される。
コホートCについて、プラシーボコントロールと比較した場合に４００ｍｇ処置群においてベースラインからのより著しい減少があり、ISIS113715で処置された患者における高血糖症の管理と一致する。
第６週での絶食時血漿グルコースレベルの変化は、表９に示される。
表９に示されるように、ISIS113715での処置は、プラシーボと比較される場合ベースラインからのより顕著な減少を引き起こした。図６および７は同様に、コントロールと比較される場合、ベースライン調節処置群についての共分散結果の分析において絶食時血漿グルコースの減少を示す。図５に示されるように、平均のISIS113715での処置は、絶食時血漿グルコースレベルを約２５ｍｇ/ｄL減少した。
表１０〜１５は、第６週および第１０週でのベースライン測定からの脂質レベルの変化を示す。


表１０〜１５に示される脂質レベルの平均変化の調査は、ISIS113715で処置された群における、コレステロール、LDLレベル、VLDLレベルおよびトリグリセリドの低下ならびにHDLレベルおよびHDL:LDL比の上昇を示し、脂質変化は、第６週および第１０週に存在する。用量コホートによって分離された脂質パラメーターに対する、プラシーボからのベースライン調節処置の差についての共分散結果の分析は、図８に示される。これらの結果は、ISIS113715での処置が２型糖尿病を有する患者において脂質レベルを、結果として脂質プロフィールを変更することを示す。
実施例２８：ヒト臨床試行−第１相、正常被験体への低用量皮下投与（CS-8）
CS-3に対する第２世代研究を、毎日低用量でISIS113715の皮下投与の安全性および許容可能性を評価するためにならびにISIS113715の血漿バイオアベイラビリティーを評価するために実施した。２つのコホートの２０人の正常な志願者は薬物を受けた。コホートAは、１０の連続した日の間１５ｍｇ／日でISIS113715の皮下注射を受けた。コホートBは、１０の連続した日の間３０ｍｇ／日でISIS113715の皮下注射を受けた。追跡はさらなる１の週（第１１日〜第１７日）であった。研究の終点は、安全性および許容可能性および薬物動力学である。予備薬物動力学分析は、注射用量あたり１５および３０ｍｇでの皮下経路による再現性（reproductibel）曝露および用量依存性曝露を示す。Cmax濃度は、１５および３０ｍｇの単回用量投与それぞれの後、０．１２８μｇ／ｍLおよび０．３２０μｇ／ｍLであった。平均tmaxは、s.c.注射の後２〜３．７時間の範囲にわたった。単回注射の後２４時間までに、血漿濃度は、Cmaxの５０〜１００分の１に減少した。さらに１０の連続した毎日のs.c.用量の後に、薬物動力学は、変更されず、CmaxおよびAUC測定に基づいて血漿中で蓄積を示さなかった。平均血漿バイオアベイラビリティー（％F）は、病歴i.v.血漿AUCに基づいて３２％と４６％との間であると見積もられた（３２．４ｍｇの用量で６．１５μｇ・ｈ／ｍL（０．５ｍｇ／ｋｇ））。
実施例２９：臨床評価のための固体投薬処方物
本研究の目的は、初期量の後C10のさらなる量を放出することによって、カプリン酸ナトリウム（C10）の動的作用を迅速に生じさらに延長するために、増加した経口オリゴヌクレオチド吸収に対するPEGベースの即時の放出および拍動性の処方物を臨床的に評価することである。拍動性の放出処方物は、公開されたUS特許出願公報２００３／０１２４１９６に記載され、その内容は、その全体を参照によって本明細書中に援用される。４つの処方物を代表する３つの型の投薬形態は、ヒトにおいて評価される：
１．完全用量のオリゴヌクレオチドおよびC10を有する即時放出（IR）２ｍｍ小錠剤の単一集団を含む腸溶性被覆（EC）カプセル；
２．完全用量のオリゴヌクレオチドおよびC10を含むECモノリシックな錠剤；および
３．完全用量のオリゴヌクレオチドおよび部分用量のＣ１０とＩＲ２ｍｍ小錠剤との混合物ならびにＣ１０用量の残りおよび欠けているオリゴヌクレオチドを有する徐放性２ｍｍ小錠剤の両方を含むＥＣパルス放出カプセル。
上記の３つの投薬形態の即時放出成分（４の処方バッチ）は、好ましくは約７０℃の制御された温度での高剪断ミキサーにおいて、例えば、ＰＥＧ−３３５０の高温融解顆粒、ＩＳＩＳ１１３７１５およびカプリン酸ナトリウムから作られる。顆粒は、さらなる賦形剤の使用なしに錠剤または小錠剤に圧縮され得る。
２つのアプローチが徐放性（パルスＣ１０）小錠剤のために意図される。マトリクス化ポリマーは、Ｃ１０の典型的な突発性放出、その後の指示された時間にわたる徐放を有することが信じられている。被覆ポリマーアプローチは、徐放から予想されるプロフィールではなく遅延（ボーラス放出）プロフィールより多くのラグ時間によって特徴付けられる。これらのアプローチの両方は、上記投薬形態３に示される２つのパラメーター、つまり遅延時間および放出されるべきＣ１０の部分量を効果的に一まとめに扱うために追跡される。マトリクス突発から放出されたＣ１０は、カプセル中の小錠剤（ＩＲ処方物）の他の集団から−初期放出Ｃ１０パルスの一部として実際に解釈される。さらなる初期Ｃ１０のこの考察は、浸透性増強のために必要とされる溶解されたＣ１０の認められる最小の閾値の点から重要である。従って、小錠剤の適切な集団は、大きさ００のカプセルに充填され、次いで、ＨＰＭＣ−５０での腸被覆の前にまとめられる。
表１６および１７は、４つの試料処方物を詳述する。

上記の薬学的処方物は、約５０ｍｇオリゴヌクレオチドと１０００ｍｇオリゴヌクレオチドとの間、好ましくは約１００ｍｇオリゴヌクレオチドと５００ｍｇオリゴヌクレオチドとの間、およびより好ましくは約１００ｍｇオリゴヌクレオチドと２００ｍｇオリゴヌクレオチドとの間を含む量で、１日あたり１回の単回経口用量（例えば、単一錠剤中に２００ｍｇオリゴヌクレオチド）または分割経口用量（例えば、同時に摂取される２×１００ｍｇオリゴヌクレオチド錠剤）として投与され得る。あるいは、全投薬は、分割され、１日あたり２回または３回以上の別々の投薬として投与され得る（すなわち、１日あたり２回の１００ｍｇ錠剤）。
実施例３０：高齢ＺＤＦラットにおいてＩＳＩＳ１１３７１５およびロシグリタゾンを使用する組み合わせ療法
ロシグリタゾン（AvandiaTM; GlaxoSmithKline）は、インシュリン感作物質のチアゾリジンジオン（ＴＺＤ）種の成員である。それは、単剤療法またはスルホニル尿素、インシュリンもしくはメトホルミンとの組み合わせのいずれかとして、２型糖尿病に対する受け入れられる処置である。それは、筋肉組織、肝臓組織および脂肪組織においてインシュリン感受性を増加する。ロシグリタゾンは、体液停留を引き起こし得るので、水腫を有する患者または心不全の危険にある患者においては注意して使用されなければならない。ロシグリタゾンはまた、用量依存性様式で体重増加を引き起こす。
ＩＳＩＳ１１３７１５とロシグリタゾンとの組み合わせは、研究の最初に約１５週間加齢した非常にインシュリン抵抗性の高齢のＺＤＦラットに投与された（対照的に、以前の研究においてＺＤＦラットは、研究の最初に６〜１０週齢である）。これらの高齢の動物は、この年齢までにほとんどインシュリンを有さず、従って、最大用量のＩＳＩＳ１１３７１５単独またはロシグリタゾン単独には応答しない。
高齢ＺＤＦラットは、１週間に２回２５ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内注射によってＩＳＩＳ１１３７１５を与えられ、３週間３ｍｇ／ｋｇ／日で経口的に（食餌中）ロシグリタゾンを与えられた。血漿グルコースは、第０週（処置前）ならびに処置の１週間後、２週間後および３週間後に測定された。ロシグリタゾン単独でもＩＳＩＳ１１３７１５単独でも、食塩水またはネガティブコントロールオリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ１４１９２３）処置ラットに比べて、３週間の間いつでも血糖の有意な減少を生じなかった。ＩＳＩＳ１４１９２３（２５ｍｇ／ｋｇ）とロシグリタゾン（３ｍｇ／ｋｇ／日）との組み合わせはまた、効果を有さなかった。これらの群の全ては、約４００〜４６０ｍｇ／ｄＬの血糖値を有した。
しかし、ＩＳＩＳ１１３７１５とロシグリタゾンとの組み合わせは、血糖を第１週に約３２０ｍｇ／ｄＬまで、第２週に約３１０ｍｇ／ｄＬまで、および第３週に約２３０ｍｇ／ｄＬまで低下した。
これらのラットは、処置の第２週および第３週に体重を量られた。食塩水処置ラットは、第２週の後に平均約１１ｇ、第３週の後に平均約８ｇ体重が増えた。予想される増加した体重上昇は、ロシグリタゾン処置動物において観察されたが（第２週の後約３２ｇ、第３週の後約４０ｇの体重増加）、これは、ＩＳＩＳ１１３７１５との組み合わせ処置によっては、有意に増加も減少もしなかった（ロシグリタゾンおよびＩＳＩＳ１１３７１５処置について、第２週の後約３９ｇおよび第３週の後約４３ｇの体重増加）。ＩＳＩＳ１１３７１５単独は、有意な体重増加を引き起こさなかった（第２週の後約１７ｇおよび第３週の後約９ｇの体重増加）。
従って、ＩＳＩＳ１１３７１５との組み合わせ療法は、ロシグリタゾン単独で観察される体重に対する副作用を含まない。
ＡＳＴ／ＡＬＴレベルおよび血漿コレステロールレベルは、第１週、第２週、第３週、第４週および第５週にラットにおいて測定されたが、いずれの処置群（食塩水、コントロールオリゴヌクレオチドＩＳＩＳ１４１９２３、ＰＴＰ１Ｂ ＩＳＩＳ１１３７１５に対してアンチセンス、ロシグリタゾン単独、ロシグリタゾンおよびＩＳＩＳ１４１９２３ならびにロシグリタゾンおよびＩＳＩＳ１１３７１５）においても有意な効果は見られなかった。
インシュリン許容試験（ITT）を第３週にラットにおいて実施した。インシュリン（３Ｕ／ｍＬでＰＢＳ中１，５Ｕ／Ｋｇ）を腹腔内注射し、血漿グルコースを経時的に測定した。結果をグラフ化し、曲線下面積（ＡＵＣ、ｍｇ／ｄＬ×分で表される）は、インシュリン感受性の指標である。これらの「高齢」ＺＤＦラットは、インシュリンに対して正常に非常に抵抗性である（大きなＡＵＣ）。
食塩水処置ラットは、約１８６００ｍｇ／ｄＬ×分の平均ＡＵＣを有した。ネガティブコントロールオリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ１４１９２３）、ＰＴＰ１Ｂに対してアンチセンス（ＩＳＩＳ１１３７１５）またはロシグリタゾンで処置されたラットは、約１３８００〜１４６００ｍｇ／ｄＬ×分の類似した平均ＡＵＣを有した。ロシグリタゾンとＩＳＩＳ１１３７１５との組み合わせで処置されたラットは、ほぼ６０％減少した、約７５００の平均ＡＵＣを有した。
このことは、ロシグリタゾンがＰＴＰ１ＢのアンチセンスインヒビターであるＩＳＩＳ１１３７１５と組み合わせられた場合、インシュリン感受性の有意かつ相乗的な増加を示す。低血糖症は、高い用量のインシュリンが注射されたときでさえもロシグリタゾンとＩＳＩＳ１１３７１５との組み合わせから生じた。
実施例３１：ＺＤＦラットにおけるＩＳＩＳ１１３７１５およびメトホルミンを使用する組み合わせ療法
メトホルミン（グルコファージＴＭ）は、単剤療法またはスルホニル尿素、インシュリンまたはロシグリタゾンとの組み合わせとして、２型糖尿病に対して受け入れられた処置である。それは、周辺グルコース取込みおよび利用を増加することによって糖耐性およびインシュリン感受性を改善する。メトホルミンは、うっ血性心不全を有する患者において禁忌を示される。乳酸アシドーシス、血液中の乳酸の蓄積はまた、メトホルミン処置の公知の副作用である。まれ（３３０００人の患者のうち１人）であるが、それは、それを進行する患者の半分までにおいて致死であり得る。
ＩＳＩＳ１１３７１５とメトホルミンとの組み合わせを、ＺＤＦラットに投与した。
１０週齢ＺＤＦラットに、ＩＳＩＳ１１３７１５を１週間に２回の１２．５ｍｇ／ｋｇの腹腔内注射によって、およびメトホルミンを４週間１日あたり１００、３００または５００ｍｇ／ｋｇで経口栄養法によって与えた。５００ｍｇ／ｋｇは、これらのラットによって許容され得る最高有効用量である。血漿グルコースを、第０週（処置前）ならびに処置の１週後、２週後および４週後に測定した。結果を表１８に示す。
メトホルミン単独の効果は、これらの動物の糖尿病状態が悪くなるにつれて経時的に失われた。これは、患者が薬物に対する応答がより低くなった場合の臨床的状態を模倣する。ＩＳＩＳ１１３７１５とメトホルミンとの組み合わせは、さらなる効果を生じ；さらに、血糖のこの低下は、研究の間ずっと永続性がありかつ続いた。ＩＳＩＳ１１３７１５単独はまた、類似した持続性効果を有した。
低血糖症は、高い用量の場合でさえも、メトホルミンとＩＳＩＳ１１３７１５との組み合わせから生じなかった。任意の動物群において、ＡＳＴ／ＡＬＴレベル、血漿トリグリセリドレベルまたは血漿コレステロールレベルに有意な変化はなかった。メトホルミン処置に関連する乳酸アシドーシスの危険性のために、血漿乳酸塩レベルを測定した。乳酸塩の用量依存性増加は、メトホルミンでの処置の４週間後に見られた。乳酸塩の類似したレベルは、メトホルミンとＩＳＩＳ１１３７１５との組み合わせを与えられたラットにおいて見られ、このことは、乳酸アシドーシスの潜在性が組み合わせ処置によって複合されていると信じられていないことを示した。ＩＳＩＳ１１３７１５単独は、血漿乳酸塩の増加を引き起こさなかった。
実施例３２：ZDFラットにおいてＩＳＩＳ１１３７１５およびスルホニル尿素を使用する組み合わせ療法
スルホニル尿素（ｓｕｌｆｏｎｙｌｕｒｅａ）、またはスルホニル尿素（ｓｕｌｐｈｏｎｙｌｕｒｅａ）は、膵臓β細胞からインシュリンの分泌を増強する、１つのクラスの低血糖症剤である。スルホニル尿素はまた、血清グルカゴンの減少を生じ、膵臓外組織でのインシュリンの作用を増強し得る。これらは、第２世代のスルホニル尿素（例えば、グリピザイド、グリメピリド）より効能が低い第１世代のスルホニル尿素（例えば、トルブマチド（ｔｏｌｂｕｍａｔｉｄｅ）、クロルプロパミド）を用いて効能が非常に変化する。これらは、経口的に与えられる。スルホニル尿素は、体重増加を引き起こし、低血糖症の危険性を保有し得る。
ＩＳＩＳ１１３７１５とグリピザイドとの組み合わせを、ＺＤＦラットに投与する。ラットに、ＩＳＩＳ１１３７１５を１週間に２回２５ｍｇ／ｋｇで腹腔内投与によって、および３週間グリピザイド（経口的に投与する、１０ｍｇ／ｋｇ／日）を与える。血漿グルコースを、第０週（処置前）ならびに処置の１週後、２週後および３週後に測定する。
これらのラットを処置の第２週および第３週に体重測定する。ＡＳＴ／ＡＬＴレベルおよび血漿コレステロールレベルをラットにおいて第１週、第２週、第３週および第４週に測定する。
グルコースおよびインシュリン許容試験（ＩＴＴ）をラットに施した（第３週）。インシュリン（３Ｕ／ｍＬでＰＢＳ中１．５Ｕ／ｋｇ）を注射し、血漿グルコースを経時的に測定する。結果をグラフ化し、曲線下面積（ＡＵＣ）は、インシュリン感受性の指標である。
実施例３３：ＧＬＰ類似体とＩＳＩＳ１１３７１５の組み合わせ
ＧＬＰ−１類似体は、抗糖尿病剤として臨床的使用のために評価されている。ＧＬＰ−１それ自体は、２位のアラニンでのジペプチジルペプチダーゼ（ＤＰＰ−ＩＶ）媒介性切断によるペプチドのＮ末端分解に起因して、短い半減期を有する。これは、ネイティブのＧＬＰ−１またはその合成版の臨床的有用性を制限する。エキセンディン−４（ＥｘｅｎａｔｉｄｅＴＭ、Ｅｘｅｎａｔｉｄｅ ＬＡＲＴＭ）、ＤＰＩＶ耐性ＧＬＰ−１類似体およびアシル化されたアルブミン結合ヒトＧＬＰ−１類似体であるＬｉｒａｇｌｕｔｉｄｅＴＭを含む、より長く作用する類似体が開発されてきた。
ＺＤＦラットに対する慢性（５〜６週）エキセンディン−４投与は、食塩水処置と比べてグリケート化ヘモグロビンの減少と関連することが示された。最後の注射の後実施された高インシュリン血症−オイグリセミッククランプ研究において、エキセンディン−４で処置されたラットは、インシュリン感受性の５０％改善を示した(Young et al., 1999, Diabetes 48, 1026-1034)。
ISIS113715とGLP-1類似体との組み合わせを、高齢ZDFラットに投与する。ラットに、ISIS113715を１週間に２回２５ｍｇ／ｋｇで腹腔内注射によって、およびエキセンディン−４（腹腔内注射、０．２μｇ／ｋｇ、毎日２回）を３週間与える。血漿グルコースを第０週（処置前）ならびに処置の１週後、２週後および３週後に測定する。
これらのラットを処置の第２週および第３週に体重測定する。ＡＳＴ／ＡＬＴレベルおよび血漿コレステロールレベルを、ラットにおいて第１週、第２週、第３週および第４週に測定する。
グルコースおよびインシュリン許容試験（ＩＴＴ）を第３週にラットに対して施す。インシュリンを、注射し、血漿グルコースを経時的に測定する。結果をグラフ化し、曲線下面積（ＡＵＣ）は、インシュリン感受性の指標である。
実施例３４：ヒト臨床試行−メトホルミン、グリピザイド、ロシグリタゾンとの組み合わせ（ＣＳ−３）
薬物相互作用研究を３０人の正常なヒト被験体（３コホート）を使用して実施した。ＩＳＩＳ１１３７１５（２００ｍｇ）を皮下的に投与し、各コホートは、経口投与されるメトホルミン（５００ｍｇ）、グリピザイド（５ｍｇ）またはロシグリタゾン（２ｍｇ）のいずれかを受けた。経口薬剤を第１日および第８日に投与し、ＩＳＩＳ１１３７１５（またはプラシーボ）を第４日、第６日および第８日に投与した。全ての被験体が３つ全ての注射を受けたわけではない。研究の終点は、安全性および許容可能性および薬物動力学的分析であった。研究の完了によって、薬物動力学的相互作用は、ＩＳＩＳ１１３７１５または共投与された経口抗糖尿病薬のいずれかについても観察されなかった。ＩＳＩＳ１１３７１５は、正常な志願者に皮下投与される場合、安全であり十分に許容されることが見出された。いくつかの局所的紅斑および硬化が、注射部位に認められ；全身効果は観察されなかった。
実施例３５：ヒト臨床試行−スルホニル尿素と組み合わせた第ＩＩ相皮下ＩＳＩＳ１１３７１５（ＣＳ−４）
第ＩＩ相研究を７５人の２型糖尿病（５コホート）に対して実施する。患者に、５ｍｇのスルホニル尿素（グリピザイド／グリブリド）とともにＩＳＩＳ１１３７１５を１週間当たり５０、１００、２００または４００ｍｇ与える。ＩＳＩＳ１１３７１５を皮下（ＳＣ）投与する。第１週は負荷期であり（１週あたり５０、１００、２００または４００ｍｇでのＩＶ用量（第１日、第３日および第５日に１時間注入において与えられる３用量に分割される））、次いで、薬物を、５週間毎日ＳＣで与える。スルホニル尿素を５週間１日に１回（７で分割された１週間用量）経口的に与える。研究は１３週間研究である（２週間スクリーニング、３週間ベースライン、６週間処置、４週間追跡調査）。終点は、安全性および許容可能性、薬物動力学、ＩＶＧＴＴ（グルコース、インシュリン、Ｃ−ペプチド、絶食時血糖）である。この研究の開放標識延長（ＣＳ−５）は、１３週間までの間ＣＳ−４において投薬された、５ｍｇのグリピザイド／グリブリドと組み合わせたＩＳＩＳ１１３７１５の安全かつ効果的な用量（ＣＳ−４において決定された）を使用する。
実施例３６：ヒト臨床試行−メトホルミンと組み合わせた第ＩＩ相皮下ＩＳＩＳ１１３７１５（ＣＳ−６）
第ＩＩ相研究を７５人の２型糖尿病（５コホート）において実施する。患者に５００ｍｇのメトホルミンと共に、ＩＳＩＳ１１３７１５を５０、１００、２００または４００ｍｇで与える。ＩＳＩＳ１１３７１５を皮下投与する。第１週は、負荷期であり（前記の実施例におけるように）、次いで、薬物を、５週間毎日ＳＣで与える。メトホルミンを、６週間毎日１回経口的に与える。研究は１３週間研究である（２週間スクリーニング、３週間ベースライン、６週間処置、４週間追跡調査）。終点は、安全性および許容可能性、薬物動力学、ＩＶＧＴＴ（グルコース、インシュリン、Ｃ−ペプチド、ＦＢＳ）である。
実施例３７：ＩＳＩＳ１１３７１５によるＰＴＰ１Ｂ阻害の特異性
ＰＴＰ１ＢとＴ細胞ホスファターゼ（ＴＣ−ＰＴＰａｓｅ、ＰＴＰＮ２）との間には、特に触媒ドメインに高い度合いの相同性が存在する。これは、ＰＴＰ１Ｂに対して特異的な小分子薬物の設計において問題を示し得る。ＩＳＩＳ１１３７１５のＰＴＰ１Ｂのレベルを特異的に減少する（すなわち、ＴＣ−ＰＴＰａｓｅのレベルを減少しない）能力を試験した。ＨＥＰＧ２ヒト肝細胞肝臓癌細胞（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ ＶＡ）を、２ｍＭ Ｌ−グルタミン酸、および１．５ｇ／Ｌ炭酸水素ナトリウム、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、および１．０ｍＭピルビン酸ナトリウム、９０％胎児ウシ血清を含むように調節されたイーグルのＢＳＳを有する最小必須培地（イーグル）中で常套的に維持する。
細胞を前記の実施例におけるように１５０ｎＭのＩＳＩＳ１１３７１５で処置した。ＰＴＰ１ＢおよびＴＣ−ＰＴＰａｓｅタンパク質のレベルを、ヒト標的タンパク質を特異的に同定し、０．２５ｕｇ/ｍｌで使用されたＰＴＰ１Ｂに対するマウスモノクローナル抗体（ＡＢ−１）およびＴＣ−ＰＴＰａｓｅに対するマウスモノクローナル抗体（ＡＢ−１）(CalBiochem/Oncogene sciences, EMD Biosciences, Inc., San Diego CA)を使用するウエスタンブロットによって測定した。結果をコントロール（オリゴ処置なし）のパーセントとして表した。
ＩＳＩＳ１１３７１５は、ＰＴＰ１Ｂタンパク質レベルを８９％減少し、ＴＣ−ＰＴＰａｓｅレベルを５％減少した。ネガティブコントロールオリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ１４１９２３）は、ＰＴＰ１ＢレベルもＴＣ−ＰＴＰａｓｅレベルも減少しなかった。このことは、ＩＳＩＳ１１３７１５によるＰＴＰ１Ｂのアンチセンス阻害が潜在的および特異的の両方であることを示す。
実施例３８：負荷／維持養生後のｏｂ／ｏｂマウスにおけるＩＳＩＳ１１３７１５の持続性効果
ｏｂ／ｏｂマウスに、組み合わせた負荷および維持用量プロトコルを使用して４週間の間毎週投薬した。２つのかかるプロトコル（高用量および低用量）を評価した。高用量プロトコルにおいて、マウスは、第１週に５０ｍｇ／ｋｇのＩＳＩＳ１１３７１５の単回ＩＰ注射ならびに第２週、第３週および第４週の各々において２０ｍｇ／ｋｇの単回ＩＰ注射を受けた。血糖を８週間（処置の停止の後４週間）毎週測定した。低用量プロトコルにおいて、マウスは、第１週に２０ｍｇ／ｋｇのＩＳＩＳ１１３７１５の単回ＩＰ注射ならびに第２週、第３週および第４週の各々において１０ｍｇ／ｋｇの単回ＩＰ注射を受けた。血糖を８週間（処置の停止の後４週間）毎週測定した。結果を表１９に示す。
図１９に示されるように、血糖値は、毎週投薬の中止の後４週でさえもベースライン値より下のままである。肝臓中のＩＳＩＳ１１３７１５の濃度を、投薬の中止時（４週時点）に測定し、高用量養生について５７．６±２．０μｇ／ｇおよび低用量養生について３５．９±３．６μｇ／ｇであることが見出された。
実施例３９：ガラス瓶におけるＩＳＩＳ１１３７１５の供給
ＩＳＩＳ１１３７１５は、栓をされ封をされたガラス瓶中の１０ｍｇ/ｍＬ、２００ｍｇ/ｍＬまたは２５０ｍｇ/ｍＬ滅菌溶液として提供される。１０ｍｇ/ｍＬのＩＳＩＳ１１３７１５処方物は、等張であり、注射のための水（ＷＦＩ）中にリン酸バッファおよび塩化ナトリウムを含む。２００ｍｇ/ｍＬおよび２５０ｍｇ/ｍＬ処方物は、高張でありＷＦＩ中にＩＳＩＳ１１３７１５のみを含む。これらの薬物生成物は、単回使用のためのものであり、保存料を含まない。
ＩＳＩＳ１１３７１５注射はまた、栓をされたガラス瓶中に含まれる滅菌１５０ｍｇ／瓶の凍結乾燥粉末として供給され得る。０．３％メタクレゾールを含む滅菌保存希釈剤はまた、凍結乾燥された薬物を再構築するために供給される。
実施例４０：臨床研究のための薬物動力学的分析
ＩＳＩＳ１１３７１５の非区画薬物動力学的分析は、各個々の患者データセットに対して実施される。最大実測薬物濃度（Ｃｍａｘ）およびＣｍａｘに到達するためにかかる時間（Ｔｍａｘ）は、濃度−時間データから直接得られる。見かけの終末排出期に関連する血漿排出半減期（ｔ１／２λｚ）は、式、ｔ１／２λｚ＝０．６９３λｚから計算され、ここで、λｚは、見かけの終末排出期に関連する速度定数である。単回および複数回用量の後、０時間（投薬前）から無限時間までの血漿濃度−時間曲線下面積（ＡＵＣ∞）はまた、線形台形規則を使用して計算される。０時間（投薬前）から無限時間までの血漿濃度−時間曲線下面積（ＡＵＣ∞）はまた、線形台形規則および最終測定可能濃度（Ｃｌａｓｔ）をλｚで割ることによる無限大への外挿を使用して計算される。さらに、０時間（投薬前）からｉ．ｖ．注射開始後の選択された時間（ｔ）までの血漿濃度−時間曲線下部分面積（ＡＵＣｔ）は、線形台形規則を使用して計算され得る。血漿クリアランス（ＣＬ）は、ＣＬ＝実際の用量／ＡＵＣ∞から計算される。分布の定常状態体積［Ｖｓｓ＝ＡＵＭＣ∞名目用量］／（ＡＵＣ∞）２、ここで、ＡＵＭＣ∞は、第１のモーメント曲線下面積である］はまた、計算される。
尿に排出されるＩＳＩＳ１１３７１５および全オリゴヌクレオチドの量は、以下の式から決定される：
Ａｅｔ＝Ｃｕｒｉｎｅ×Ｖｕｒｉｎｅ
ここでＡｅｔは、いくつかの固定時間ｔ（すなわち２４時間）までに排出された量であり、Ｃｕｒｉｎｅは、分析物の尿濃度であり、Ｖｕｒｉｎｅは、全尿体積である。次いで、尿中に排出された投与された用量（完全または全オリゴヌクレオチドとして）のパーセンテージは、以下の式から計算された：
％排出された用量＝（Ａｅｔ／投与された用量）×１００％
実施例４１：ＩＳＩＳ１１３７１５のヒト臨床試行−２型真性糖尿病を有しスルホニル尿素で処置された患者において毎日投与されたＩＳＩＳ１１３７１５の安全性、許容可能性、薬物動力学および活性を評価するためのランダム化、二重盲検、プラシーボ制御、用量段階的拡大研究（ＣＳ−１２）
第２相臨床研究は、スルホニル尿素（ＳＵ）と組み合わせた２つのＩＳＩＳ１１３７１５皮下用量の安全性、許容可能性および薬物動力学対ＳＵおよびプラシーボと組み合わせた２つのＩＳＩＳ１１３７１５皮下用量の安全性、許容可能性および薬物動力学を評価するために設計される。特に、この研究はスルホニル尿素での継続中の処置に関わらず不十分に制御された２型糖尿病（１５０〜２７０ｍｇ／ｄＬ（８．３〜１４．９ｍｍｏｌ／Ｌ）の絶食時血漿グルコース［FPG］および８．０〜１１．０％のＨｂＡ１Ｃとして規定される）を有する患者に焦点を当てる。本発明の１つの態様は、ＩＳＩＳ１１３７１５を投与する工程を包含する不十分に制御された２型糖尿病を有する被験体を処置する方法である。研究はまた、ＳＵおよびプラシーボでの処置と比較される、ＳＵと組み合わせた２つの用量のＩＳＩＳ１１３７１５での処置の絶食時血漿グルコースおよびＨｂＡ１Ｃに対する効果を試験する。ＳＵならびにＳＵおよびプラシーボと組み合わせたＩＳＩＳ１１３７１５の、インシュリン感受性およびβ細胞機能（ＱＵＩＣＫＩおよびＨＯＭＡ−Ｂ指数）、プロインシュリン／インシュリン比、絶食時インシュリン、Ｃ−ペプチドおよびプロインシュリン、脂質およびリポタンパク質値（アポＢ−１００を含む）、血液学、肝臓および腎臓機能（見積もられたＧＦＲを含む）、血圧および体重ならびに１週間７点グルコースプロフィールに対する効果もまた評価される。
患者は、ＳＵに対して推奨される最大処置用量または患者が許容し得る最大用量のいずれかを受けることが要求される。さらに、患者は、スクリーニング評価の前少なくとも３ヶ月間安定な用量を受けなければならず、研究の間ずっとＳＵの安定用量（プロトコルによって減少されない限り）を続けることが要求される。好ましいＳＵは、グリベンクラミドであるが、グリピザイドは許容される。他のＳＵを使用する患者の潜在的登録は、Isis Medical Monitorを用いて議論されなければならない。処置コホートは以下の通りである：
コホートＡ＝１時間ｉ．ｖ．注入によって第１週に３回与えられる１００ｍｇのＩＳＩＳ１１３７１５またはプラシーボならびに第２週〜第７週および第９週〜第１４週の間の毎日のｓ．ｃ．注射による１５ｍｇのＩＳＩＳ１１３７１５またはプラシーボ。
コホートＢ＝１時間ｉ．ｖ．注入によって第１週に３回与えられる２００ｍｇのＩＳＩＳ１１３７１５またはプラシーボならびに第２週〜第７週および第９週〜第１４週の間の毎日のｓ．ｃ．注射による１５ｍｇのＩＳＩＳ１１３７１５またはプラシーボ。
１８人の患者は、コホートＡに登録され、１５ｍｇ／日のＩＳＩＳ１１３７１５またはプラシーボのいずれかであってＳＵの安定用量と組み合わされる両方のものを用いる処置を受けるように２：１の比にランダム化される。１８人の患者のコホートＢ（用量段階的拡大）への登録は、一旦（１）コホートＡの６人の患者が満足できる安全性プロフィールで処置期１を終え、（２）１８人の患者がコホートＡに割り当てられたら、始まる。投薬量の他は、コホートＢの患者は、コホートＡと同じスケジュールをたどる。
診断および含入のための主な基準は、スクリーニングの前３ヶ月以下の間安定最大用量のＳＵで処置され、１５０〜２７０ｍｇ／ｄＬの絶食時血糖値および８．０〜１１．０％のＨｂＡ１Ｃレベルを有する、８年以下の期間の２型真性糖尿病であると診断された１８〜７０歳の男性または女性（閉経後および／または外科的に不妊）である。
主な排除基準は、スクリーンの６ヶ月以内の３を超える重篤な低血糖症エピソード、糖尿病の合併症（例えば、神経障害、腎症およびレジノパシー（ｒｅｇｉｎｏｐａｔｈｙ））、臨床的に有意かつ現在活性な疾患、病歴における臨床的に有意な異常、身体検査または実験室検査である。
ＩＳＩＳ１１３７１５（１００または２００ｍｇ／注入）またはプラシーボの負荷用量は、全部で３回の注入について第１日、第３日および第５日に１時間ｉ．ｖ．注入を介して投与される（コホートＡおよびＢそれぞれにおいてＩＳＩＳ１１３７１５を受けるようにランダム化された患者について３００ｍｇ／週または６００ｍｇ／週）。残りの処置の間（第２週〜第７週および第９週〜第１４週）、患者は、朝に１日に１回ＩＳＩＳ１１３７１５（１５ｍｇまたは３０ｍｇ）またはプラシーボのｓ．ｃ．注射を自己投与する。全ての患者は、用量の減少が必要とされない限り、投薬期間の間、経口ＳＵの処方された毎日用量を取り続ける。
薬物動態学プロフィールは、各コホートのISIS 113715およびSUの用量を受ける全ての患者ならびにプラシーボおよびSUの用量を受ける全ての患者において評価される。薬理学的な活性は、以下の測定：HbA1cおよび絶食時グルコース、週1回の7点グルコースプロフィール、平均の絶食時インシュリンおよびC-ペプチド、絶食時プロインシュリン、脂質およびリポプロテイン値、インシュリン感受性およびβ細胞機能、ならびにアディポネクチンレベル、によって評価される。
第1週中のi.v.負荷用量について、調査者は、200mg/mLのISIS 113715注射（注射用水中のISIS 113715）またはプラシーボ（注射用水、0.004 mg/mLリボフラビン、および9.0mg/mLの塩化ナトリウム）のいずれかからなる1mLの滅菌溶液を含むストッパー付きのガラスバイアルを受ける。薬物産物溶液のバイアルは、単回のみの使用である。
第2〜7週および第9〜14週中のs.c.注射について、調査者に、150mgのISIS 113715またはプラシーボのいずれかからなる滅菌凍結乾燥された粉末を含むストッパー付きのガラスバイアルを提供する。これらの薬物産物に加えて、調査者はまた、凍結乾燥された薬物産物の再構築のための希釈剤を与えられる。希釈剤は、注射用の水、3.00mg/mLのメタクレゾール、0.26 mg/ mLのリン酸二水素ナトリウム一水和物および、2.14mg/mLのリン酸二ナトリウム七水和物を含む、0.3％の注射用メタクレゾールである。
凍結乾燥された調査用薬物産物の再構築のために、1.4mLの0.3%注射用メタクレゾールが無菌技術を用いて薬剤師または設計者によって凍結乾燥された産物のバイアルあたりに添加される。少なくとも１０分間が凍結乾燥された物質の希釈剤への溶解のために与えられる。一度再構築されると、調査用薬物溶液は、使用されるまで2〜8℃で保存され、光から保護されるべきである。
s.c.注射の時に、再構築された調査用薬剤溶液は、バイアルから取り出され、0.15mL(コホートＡ)または0.30mL(コホートＢ)のいずれかが腹部の4つの四半分の1つに注射される。注射部位は、毎日交代されるべきである。
ISIS 113715を用いた2型糖尿病を有する患者の処置はHbA1cレベルの減少を生じる。プラシーボとの差で調節された処置のスクリーニングに対する共分散の結果の分析を示す。本明細書中に記載されるCS−7からの100mgおよび200mg用量コホートからプールされたデータについて、HbA1cレベルの差および95％の信頼区間を示す。 ISIS 113715を用いた2型糖尿病を有する患者の処置は処置6週間後にHbA1cレベルの減少を生じる。プラシーボとの差で調節された処置のスクリーニングに対する共分散の結果の分析を示す。本明細書中に記載されるCS−7からの100mgおよび200mg用量コホートの両方について、HbA1cレベルの差および95％の信頼区間を示す。 ISIS 113715を用いた2型糖尿病を有する患者の処置は任意のプラシーボ効果より長く残るHbA1cレベルの減少を生じる。基準測定値からコホートC (400mg)HbA1cレベルの中位パーセント変化は、プラシーボ処置された患者について観察されたものより大きく、処置群においてHbA1cレベルの減少が続くが、一方で初期減少はプラシーボ群について定常状態に達する。CS-7からのデータを示す。 ISIS 113715を用いた処置は絶食時血清グルコースレベルおよびHbA1cレベルの並行した減少を生じる。CS-7からのコホートA (100mg)由来の患者およびコホートB (200mg)由来の患者についてのFSGレベルおよびHbA1cレベルを示す。 ISIS 113715を用いた処置は絶食時血清グルコースレベルおよびHbA1cレベルの並行した減少を生じる。CS-7のコホートC (400mg)由来の患者についてのFSGレベルおよびHbA1cレベルを示す。 絶食時血漿グルコース(FPG)はISIS 113715で処置された2型糖尿病を有する患者において減少された。プラシーボとの差で調節された処置のスクリーニングに対する共分散の結果の分析を示す。プラシーボと比較された場合にCS−7からの100mgおよび200mg用量コホートからプールされたデータについて、絶食時血漿グルコースレベルの差および95％の信頼区間を示す。 絶食時血漿グルコース(FPG)はISIS 113715で処置された2型糖尿病を有する患者において減少された。プラシーボとの差で調節された処置のスクリーニングに対する共分散の結果の分析を示す。プラシーボと比較された場合にCS−7からの100mgおよび200mg用量コホートからのデータについて、絶食時血漿グルコースレベルの差および95％の信頼区間を示す。 ISIS 113715を用いた処置は、2型糖尿病を有する患者において脂質プロフィールの変化を生じる。脂質に対するISIS 113715の効果を共分散の結果の分析に示す。プラシーボとの差で調節された基準脂質をCS-7からの100mg、200mgおよび400mgコホートについて示す。 ISIS 113715は、肥満のサルにおけるapoB-100、血清コレステロールおよび血清LDLを減少する。 ISIS 113715は、高脂肪の食餌を与えたマウスにおいて代謝率を増大する。高脂肪の食餌を与えたマウスは、25mg/kgのISIS 113715で週あたり2回を5週間処置された。示されるように、増大された代謝率と一致して、VO2消費(mL/g/h)はISIS 113715で処置された動物において増大された。代謝率は当該分野で公知の間接熱量測定法を用いて(例えば、Oxymax system, Columbus Instruments, Columbus, OHを用いて)測定された。

Claims (10)

  1. チアゾリジンジオン単独投与による血糖低下効果およびオリゴヌクレオチド（配列番号：１７）単独投与による血糖低下効果に耐性の被験体において血糖を低下させるための医薬の製造における、少なくとも１つのチアゾリジンジオン、およびオリゴヌクレオチド（配列番号：１７）の使用。
  2. 該チアゾリジンジオンが、ロシグリタゾン、ピオグリタゾン、およびトログリタゾンから選択される、請求項１記載の使用。
  3. 医薬の投与によりインシュリン抵抗性がさらに低下する、請求項１記載の使用。
  4. 該少なくとも１つのチアゾリジンジオン、およびオリゴヌクレオチド（配列番号：１７）が、併用して投与される、請求項１記載の使用。
  5. 該オリゴヌクレオチドが、負荷期間および維持期間中に投与される、請求項１記載の使用。
  6. チアゾリジンジオン単独投与による血糖低下効果およびオリゴヌクレオチド（配列番号：１７）単独投与による血糖低下効果に耐性の被験体において血糖を低下させるための、少なくとも１つのチアゾリジンジオン、およびオリゴヌクレオチド（配列番号：１７）を含有してなる組成物。
  7. 該チアゾリジンジオンが、ロシグリタゾン、ピオグリタゾン、およびトログリタゾンから選択される、請求項６記載の組成物。
  8. 該組成物の投与によりインシュリン抵抗性がさらに低下する、請求項６記載の組成物。
  9. 該少なくとも１つのチアゾリジンジオン、およびオリゴヌクレオチド（配列番号：１７）が、併用して投与される、請求項６記載の組成物。
  10. 該オリゴヌクレオチドが、負荷期間および維持期間中に投与される、請求項６記載の組成物。
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