DE10048091A1 - Anwendung chemisch modifizierter Oligodesoxyribonukleotide zur Unterdrückung der Proliferation von humanem Pankreastumor - Google Patents

Anwendung chemisch modifizierter Oligodesoxyribonukleotide zur Unterdrückung der Proliferation von humanem Pankreastumor

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von in Zellkulturen humaner Pankreastumoren und in in-vivo-Experimenten an SCID-Mäusen, denen humane Pankreastumorzellen implantiert wurden, selektionierten chemisch modifizierten Oligodesoxyribonukleotiden zur Apoptose und zur Hemmung der Proliferation von Pankreaskrebszellen. Die chemische Modifizierung erfolgt durch kovalente terminale Bindung von lipophilen Resten oder nicht-kovalente Fixierung von Polymeren und in der Regel als partiell oder durchgängig sulfurierte Phosphorothioate.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Konstrukten aus chemisch modifizierten Oligodesoxyribonukleotiden mit kovalent in 3'- und 5'-Stellung als Ester oder Amide gebundenen, vorzugsweise hydrophoben Gruppen bzw. Konjugate mit Polymeren zur Unterdrückung der Proliferation von humanen Pankreastumorzellen in vitro und in vivo.
Etwa 25.000 Amerikaner sterben im Jahr an Pankreaskrebs (A. Warshaw u. C. Fernandez-del Castillo, New England J. Med. 326, 455 (1992). Über Risikofaktoren ist wenig bekannt und das Versagen von Bestrahlungstherapie und Chemotherapie führt zu einer geringen 5-Jahres Überlebensrate nach Diagnose.
Modifizierte Oligodesoxyribonukleotide (ODN) haben sich in jüngerer Zeit als eine Gruppe vielversprechender Arzneimittel erwiesen, wobei unterschiedliche Mecha­ nismen der Wirkung diskutiert werden. Große Erwartungen sind an die sog. Antisen­ se-Oligodesoxyribonukleotide (ASODN) gesetzt worden, die die Expression eines spezifischen Proteins, z. B. eines Onkogens, unterdrücken.
Trotz dieser großen Erwartungen und dem Nachweis in vitro, daß ein bestimmtes Gen weniger exprimiert wird, ist bisher nur ein einziges ASODN als Arzneimittel, Vi­ travene (ISIS, Carlsbad) zugelassen worden.
Andererseits wird auch über sog. unspezifische biologische Wirkungen von Oligode­ soxyribonukleotiden berichtet, die nicht die Sequenz eines ASODN aufweisen. Für die Entwicklung eines Arzneimittels ist es zunächst ohne Bedeutung, welcher Me­ chanismus der Wirkung zugrunde liegt, solange die Wirkung in vivo eindeutig nach­ gewiesen werden kann und keine oder vertretbare Nebenwirkungen auftreten.
Daher haben wir Bibliotheken von Oligodesoxyribonukleotiden sowie chemisch mo­ difizierten Oligodesoxyribonukleotiden einem mehrstufigen Screening unterzogen mit humanen Pankreaszellen mit folgenden Selektionskriterien:
  • - Hemmung der Proliferation des Wachstums von Pankreastumorzellen durch Bestimmung des 3H-Thymidineinbaus.
  • - Stabilität der Konstrukte gegen den Angriff von endo- und exo-Nukleasen durch Messung der Halbwertszeit der ODN mittels Kapillarelektrophorese.
  • - Bestimmung der Aufnahme der ODN in Zellen durch konfokale Laser-Scanning Mikroskopie.
  • - Apoptose-Induktion
Die selektionierten optimalsten ODN wurden anschließend in vivo in einem orthoto­ pen Xenotransplantationsmodell (Nacktmaus) auf Unterdrückung des Wachstums transplantierter humaner Pankreastumorzellen untersucht.
Durch die chemische Modifzierung wird die Bioverfügbarkeit der ODN vergrößert. Obwohl eine Vielzahl von Modifikationen vorgeschlagen und in vitro bei Zellkulturen durchgeführt wurden (J. P. Shaw, K. Kent, J. Bird, J. Fischback, B. Froehler, Nucl. Acids Res. 19, 747 (1991)) sind klinische Studien und in vivo-Versuche fast aus­ schließlich mit Phosphorothioaten durchgeführt worden, bei denen in den Phospho­ diesterverknüpfungen ein Sauerstoff durch Schwefel ersetzt wird, in der Annahme, daß diese Thioate eine größere Stabilität gegenüber Nukleasen bei guter Zellgängig­ keit aufweisen. Während die Halbwertszeit der normalen Phosphordiester-ODN im Durchschnitt bei 20-40 Minuten liegt, beträgt die Halbwertszeit der Thioate etwa 2-5 Stunden. Diese geringe Zunahme der Stabilität der Thioate mag eine Erkärung dafür sein, daß das sonst wohl so einleuchtende Modell der Antisense-Strategien in vivo noch nicht zu einem Medikament geführt hat. Bei Halbwertszeiten von 2-5 Stunden ist die Bioverfügbarkeit zu gering, und es bleibt offen, welche Wirkung die beim Ab­ bau entstehenden kürzeren Fragmente haben.
Es ist nun bekannt, daß in 3'- und 5'-Stellung terminal modifzierte ODN größere Sta­ bilität gegenüber dem Angriff von Exonukleasen zeigen (M. Maier, K. Bleicher, H. Kalthoff, E. Bayer, Biomed. Peptd., Proteins & Nucl. Acids 1, 235 (1995)). Solche modifizierte ODN wurden bisher zwar in Zellkulturen, aber nicht in präklinischen Un­ tersuchungsmodellen oder in klinischen Studien eingesetzt. Zudem wurden in den meisten in-vitro-Untersuchungen keine in 3'- und 5'-Stellung modifizierten Phospho­ rothioate sondern die Diester eingesetzt, sodaß Endonukleasen noch angreifen kön­ nen. Oft werden in vitro lipophile, kationische Tenside, wie LipofektinR zugegeben, um die Zellaufnahme zu verbessern. Die Anwendung solcher Methoden in vivo hat sich jedoch, unter anderem auch wegen der Toxizität solcher Hilfsstoffe, nicht be­ währt, bzw. ist deutlich begrenzt.
Es wurde nun gefunden, daß durch Einführung kovalent gebundener Gruppen in den terminalen 3'- und 5'-Stellungen eines Oligodesoxyribonukleotids mit 8-30 Mono­ mereinheiten die Proliferation von humanem Pankreastumor in vitro in Zellkulturen und in vivo im orthotopen Xenotransplantationsmodell unterdrückt werden kann. Die Oligodesoxyribonukleotide können als durchgehend oder partiell vorliegende Phos­ phordiester oder Phosphorothioate eingesetzt werden. Es wurde gefunden, daß C- und G-reiche Sequenzen oder mindestens ein CG-Motiv die Proliferation von Pan­ kreastumor in vivo besonders effektiv hemmen. Als kovalent in 3'- und 5'-Stellung gebundene Gruppen haben sich natürlich vorkommende lipophile Reste wie Chole­ sterol, Fettsäuren, Tocopherole und deren Derivate geeignet erwiesen. Durch Modifi­ kation mit lipophilen Resten in 3'- und 5'-Stellung wird die Bioverfügbarkeit wegen der um eine Größenordnung verlängerten Halbwertszeit gegenüber dem Angriff von Nukleasen erhöht. Die gleichen Effekte werden durch kovalente Bindung von Polye­ thylenglykol in 3'-Stellung erreicht. Durch die Bindung der ODN an positiv geladene Nanopartikel auf Polystyrol- oder Polyacrylatbasis wird die Stabilität gegenüber dem Angriff von Nukleasen sowohl bei unmodifizierten ODN, den Phosphorothiaten als auch bei den in 3'- und 5'-Stellung modifzierten ODN erhöht und eine vorzügliche Aufnahme in Tumorzellen beobachtet. Beispiele für eine hervorragende Hemmung der Proliferation von humanen Pankreastumorzellen sind die mehr als 50% Cytosin­ reste enthaltenden Sequenzen.
5'-TGC TCC CCC CTG GCT-3' (I)
5'-CCT CGC TTC GCC CGT-3' (II)
Die Sequenzen sind durchgehend als Phosphorothioate modifiziert. Besonders ef­ fektiv sind die in 3'-Stellung mit Polyethylenglykol (MW 1500) und in 5'-Stellung mit α-Tocopherol zusätzlich modifizierten ODN. Während Sequenz (I) beispielhaft für ein Antisense-ODN zur Unterdrückung der Genexpression des mutierten p53-Proteins ist, ist Sequenz (II) beispielhaft für eine aus einer randomisierten Oligonukleotidbi­ bliothek selektionierten Sequenz.
Methodischer Teil Synthesen
Die modifizierten ODN wurden an einem Applied Biosystem Modell 394 DNA/RNA Synthesizer mit TentaGel (Rapp Polymere Tübingen) als Träger hergestellt. Modifizierte Protokolle für die Synthese an Tentagel wurden entsprechend der Lite­ ratur (E. Bayer, M. Maier, K. Bleicher, H.-J. Gaus, Z. Naturforsch. 50b, 671-676 (1995)) verwendet. PEG, Fettsäurereste, Cholesteryl- und Tocopherylreste am 5'- Ende wurden als Phosphoramidite in CH2Cl2 bzw. Acetonitril (0.1 M) eingeführt. Als Sulfurierungsreagens wurde vorwiegend TETD (ABI, Weiterstadt) benutzt. Die Reini­ gung der DMT-geschützten ODN's wurde mit HPLC durchgeführt: 15 min. linearer Gradient 20-80% Acetonitril in 0.1 M Triethylammoniumacetat, Fluß 1 ml/min. Säule Nucleosil 100 C18, 250 × 4 mm, bzw. Fluß 15 ml/min. Säule GROM-SIL 100 ODS2 FE, 250 × 20 mm (Grom, Herrenberg).
Zellkulturen und Zellaufnahme
Als humane Pankreastumorzellen wurden vor allem Panc-Tu-I-, Panc-Tu-II-, A818-4 und HPAF-Zelllinien verwendet. Die Zellaufnahme der modifzierten ODN wurde mit konfokaler Lasermikroskopie gemessen.
Messung der Proliferation in vitro
Zellsuspensionen (7 × 104 Zellen ml-1) werden in jedes weil einer 96-well- Mikrotiterplatte (Nung, Wiesbaden) gebracht. Nach 24 Stunden wird das Medium gewechselt und die Zellkulturen (mit der jeweiligen ODN-Behandlung und die Kontrollen ohne Behandlung) werden in 100 µl Ansätzen mit 10 jsl Medium, das 7.4 kBq Methyl-3H-Thymidin (Amersham, Braunschweig) enthält, während der letzten 3 Stunden der angegebenen Inkubationszeiten markiert. Anschließend werden die Zellen geerntet und die Radioaktivität mit einem Flüssig-Szintillationszähler gemes­ sen.
In vitro wurden auch Bestimmungen des p53-Proteins mittels ELISA oder Western­ blot durchgeführt.
In vivo-Untersuchungen an SCID-Mäusen
Verwendet wurden dabei weibliche SCID Mäuse, die nicht älter als acht Wochen wa­ ren. Den Tieren wurden nach Laparotomie in Narkose 1 × 106 PancTu-I Zellen in das Pankreas injiziert. Eine Gruppe wurde über subkutan implantierte Dauerpumpen (ALZET©-Pumpen), die andere Gruppe wurde einmal täglich intraperitoneal mit ODN behandelt in einer Konzentration von 6 bzw. 18 mg/kg Körpergewicht/d.
Die Mäuse wurden nach 14 bzw. 21 Tagen getötet. Die Pankreastumoren wurden gewogen und vermessen um das Volumen nach der Formel π/6 × Höhe × Länge × Breite zu berechnen. Leber, Lungen, Omentum und Milz wurden entnommen, um typische Metasierungswege zu erfassen.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung verdeutlichen ohne sie zu begrenzen.
Hemmung der Proliferation in vivo
Abb. 1a zeigt das Größen- und Abb. 1b das Gewichtwachstum von 2 Behandlungs­ gruppen mit dem ODN 5'Tocopheryl-TGC TCC CCC CTG GCT-3'-PEG1500 als Phosphorothioate. Gegenüber der Kontrollgruppe ist das Größen- und Gewichts­ wachstum deutlich verringert. Das Volumen des Tumors hat bei intraperitonealer In­ jektion um 64% abgenommen. Noch günstiger erscheint die Behandlung mit der subkutanen Dauerpumpe. Das Volumen der Tumoren hat nach 21 Tagen um 70% abgenommen. Die histologischen und histochemischen Untersuchungen der Organe zeigen keine auffallenden Befunde. Abb. 2 zeigt die Dosisabhängigkeit der Wirkung.
In Abb. 3 ist das Größen- und in Abb. 2b das Gewichtswachstum von 2 Behand­ lungsgruppen mit dem ODN 5'-Tocopheryl-CCT CGC TTC GCC CGT-3-PEG1500 ge­ zeigt. Die Behandlung mit ODN setzte sofort nach Implantation des humanen Pan­ kreastumors ein. Das Volumen und Gewicht des Tumors hat ebenfalls um etwa 2/3 abgenommen.
Damit ist aufgezeigt, daß nicht nur das Wachstum humaner Pankreastumoren in vivo gestoppt wird, sondern innerhalb von 2-3 Wochen eine markante Reduktion des Tu­ mors erzielt wird. Dies ist auch insofern von herausragender Bedeutung, als es sich bei der in vivo eingesetzten Pankreasadenokarzinomzellinie PancTul um eine sehr apoptoseresistente Tumorzellinie handelt, die gegenüber zahlreichen anderen Be­ handlungsstrategien (z. B. Auslösung des programmierten Zelltodes durch Fas/CD95- Aktivierung, TRAIL oder Chemotherapeutika) völlig inert ist.

Claims (12)

1. Anwendung von Oligodesoxyribonukleotiden (ODN) zur Unterdrückung der Pro­ liferation von humanem Pankreastumor gekennzeichnet dadurch, daß die ODN zwischen 8-30 Basen aufweisen und mehr als 40% der Basen Cytosinreste sind.
2. Anwendung von ODN nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, daß minde­ stens 1 CG-Motiv in der Sequenz der ODN vorkommt.
3. Anwendung von ODN nach Anspruch 1 und 2 dadurch gekennzeichnet, daß in mindestens einer Phosphodiesterbindung ein Sauerstoff durch einen Schwefel als Phosphorothioat ersetzt ist.
4. Anwendung von ODN nach Ansprüchen 1-3 dadurch gekennzeichnet, daß in ter­ minaler 3'-Stellung der ODN Polyethylenglykol, lipophile Reste oder Peptide ge­ bunden sind.
5. Anwendung von ODN nach Ansprüchen 1-4 dadurch gekennzeichnet, daß in 3'- und 5'-Stellung Polyglykole, lipophile Reste oder Peptide als Ester oder Amide gebunden sind.
6. Anwendung von ODN nach Ansprüchen 1-5 dadurch gekennzeichnet, daß die lipophilen Reste Fettsäurereste, Cholesterol, Tocopherole oder Steroide sind.
7. Anwendung von ODN nach Ansprüchen 1-6 dadurch gekennzeichnet, daß in 3'- Stellung ein Polyethylenglykol der Molmasse von 150 bis 3000 Dalton und in 5'- Stellung ein α-Tocopherylrest oder in 3' und 5'-Stellung ein α-Tocopherylrest ge­ bunden ist.
8. Anwendung der modifizierten Oligodesoxyribonukleotide (ODN)
5'-Tocopheryl-TGC TCC CCC CTG GCT-3'-PEG
5'-Tocopheryl-CCT CGC TTC GCC CGT-3'-PEG
5'-Tocopheryl-TGC TCC CCC CTG GCT-3'-Tocopheryl
5'-Tocopheryl-CCT CGC TTC GGC CGT-3'-Tocopheryl
als Diester zur Unterdrückung des Wachstums von humanem Pankreastumor.
9. Anwendung der ODN nach Anspruch 8 als partiell oder vollständig sulfurierte Phosphorothioate.
10. Anwendung der ODN nach Ansprüchen 1-9 als Konjugate an positiv geladene Polymer-Nanopartikel von 100-500 nm Durchmesser.
11. Anwendung der ODN gemäß Ansprüchen 1-10 zur Therapie von humanem Pan­ kreastumor in Kombination mit anderen Cytostatika und Strahlentherapie.
12. Anwendung der ODN gemäß Ansprüchen 1-11 allgemein in der Krebstherapie humaner Tumoren.
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