CN107466323A - 酰基‑氨基‑lna和/或烃基‑氨基‑lna寡核苷酸 - Google Patents

酰基‑氨基‑lna和/或烃基‑氨基‑lna寡核苷酸 Download PDF

Info

Publication number
CN107466323A
CN107466323A CN201680021955.2A CN201680021955A CN107466323A CN 107466323 A CN107466323 A CN 107466323A CN 201680021955 A CN201680021955 A CN 201680021955A CN 107466323 A CN107466323 A CN 107466323A
Authority
CN
China
Prior art keywords
lna
amino
alkyl
monomers
oligonucleotides
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201680021955.2A
Other languages
English (en)
Inventor
耶斯佩·温格尔
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Marina Biotech Inc
Arcturus Therapeutics Inc
Original Assignee
MDRNA Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by MDRNA Inc filed Critical MDRNA Inc
Publication of CN107466323A publication Critical patent/CN107466323A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
    • G01N33/5026—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects on cell morphology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/16—Aptamers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/322—2'-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/323—Chemical structure of the sugar modified ring structure
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/323—Chemical structure of the sugar modified ring structure
    • C12N2310/3231—Chemical structure of the sugar modified ring structure having an additional ring, e.g. LNA, ENA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/341—Gapmers, i.e. of the type ===---===
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/346—Spatial arrangement of the modifications having a combination of backbone and sugar modifications
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C12N2310/3515—Lipophilic moiety, e.g. cholesterol
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/352—Nature of the modification linked to the nucleic acid via a carbon atom
    • C12N2310/3521—Methyl
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/353—Nature of the modification linked to the nucleic acid via an atom other than carbon
    • C12N2310/3533—Halogen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/353—Nature of the modification linked to the nucleic acid via an atom other than carbon
    • C12N2310/3535—Nitrogen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)

Abstract

一种含有两个或更多个酰基‑氨基‑LNA或烃基‑氨基‑LNA核苷酸单体的单链寡核苷酸，其中其它核苷酸单体可以是DNA、RNA或被化学修饰的核苷酸单体；其中所述寡核苷酸的单体通过磷酸二酯键和/或硫代磷酸酯键和/或磷酸三酯键连接，其中所述酰基‑氨基‑LNA和烃基‑氨基‑LNA单体的酰基和烃基任选地被取代并且因此任选地含有一个或多个羟基、氨基、硫基、氧代基、烷硫基、醚基和/或硫醇基(巯基)，并且其中所述酰基‑氨基‑LNA和烃基‑氨基‑LNA单体的酰基和烃基是直链或支链、环状或两者的组合，条件是每一个酰基和烃基中的碳原子总数小于30。

Description

酰基-氨基-LNA和/或烃基-氨基-LNA寡核苷酸
技术领域
本发明涉及一种含有两个或更多个酰基-氨基-LNA或烃基-氨基-LNA核苷酸单体的单链寡核苷酸。所述寡核苷酸可以是缺口体(gapmer)或混合体(mixmer)。所述寡核苷酸可以作为反义寡核苷酸用于例如通过RNase-H介导的基因沉默下调靶RNA，或用于调节RNA。所述寡核苷酸可以是靶向蛋白质或肽或除核酸外的靶分子的适体(aptamer)。本发明还涉及一种使用所述寡核苷酸介导细胞或生物体中的基因沉默的方法。本发明还涉及一种使用所述寡核苷酸检测细胞或生物体中的基因的功能的方法。本发明另外涉及一种使用所述寡核苷酸评估药剂是否作用于基因产物的方法。本发明另外涉及用于动物或人的治疗中的寡核苷酸，并涉及一种包含所述寡核苷酸的医药组合物。
背景技术
在反义技术中，RNA由互补反义寡核苷酸(AON)的Watson-Crick杂交靶向。可以通过防止mRNA成熟、阻断翻译或更常见地通过诱导靶RNA降解来实现以特异性方法抑制基因表达的目标[Crooke,S.T.Biochim.Biophys.Acta 1999,1489,31-44；Zamaratski,E.；Pradeepkumar,P.I.；Chattopadhyaya,J.J.Biochem.Biophys.Methods 2001,48,189-208]。为了有效，AON必须能够进入细胞中，对核酸酶稳定，无毒并且针对靶mRNA展示高的结合亲和力和特异性。通过使用被化学修饰的AON已经获得了关于稳定性和结合的显著进展。引入具有约束North型(N型；C3’-内型)呋喃糖环构型的核苷酸类似物已被证实可以成功获得与RNA靶的强结合，其中LNA(锁核酸)是突出的实例。LNA单体含有O2’-C4’亚甲基键，其将呋喃糖环锁定在N型构型，从而引起针对用于AON的互补RNA的前所未有的结合亲和力，所述AON由例如LNA和DNA核苷酸的混合物组成[Koshkin,A.A.；Singh,S.K.；Nielsen,P.；Rajwanshi,V.K.；Kumar,R.；Meldgaard,M.；Olsen,C.E.；Wengel,J.Tetrahedron 1998,54,3607-3630；Obika,S.；Nanbu,D.；Hari,Y.；Andoh,J.-i.；Morio,K.-i.；Doi,T.；Imanishi,T.Tetrahedron Lett.1998,39,5401-5404；Petersen,M.；Wengel,J.TrendsBiotechnol.2003,21,74-81；Vester,B.；Wengel,J.Biochemistry 2004,43,13233-13241]。
LNA核苷酸掺入AON中诱导形成由RNA补体形成的接近经典的A型螺旋结构[Petersen,M.；Bondensgaard,K.；Wengel,J.；Jacobsen,J.P.J.Am.Chem.Soc.2002,124,5974-5982；Nielsen,K.E.；Rasmussen,J.；Kumar,R.；Wengel,J.；Jacobsen,J.P.；Petersen,M.Bioconjugate Chem.2004,15,449-457；Nielsen,C.B.；Singh,S.K.；Wengel,J.；Jacobsen,J.P.J.Biomol.Struct.Dyn.1999,17,175-191；Nielsen,K.E.；Singh,S.K.；Wengel,J.；Jacobsen,J.P.Bioconjugate Chem.2000,11,228-238]，并且LNA因此可被表征为RNA的结构模拟物，虽然其缺少RNA核苷酸的2’-OH基团。相反地，立体异构α-L-LNA单体被锁定在一种构型，所述构型产生在结构上模拟DNA因而DNA/α-L-LNA混合体和RNA之间的双螺旋采取中间A/B双螺旋几何形状的AON[Nielsen,K.M.；Petersen,M.；Hakansson,A.E.；Wengel,J.；Jacobsen,J.P.Chem.Eur.J.2002,8,3001-3009；Petersen,M.；A.E.；Wengel,J.；Jacobsen,J.P.J.Am.Chem.Soc.2001,123,7431-7432]。值得一提的是，在每次修饰热变性温度(Tm值)增加～2-8℃的情况下，LNA和α-L-LNA核苷酸都诱导AON的非常高的RNA结合亲和力[Vester,B.；Wengel,J.Biochemistry 2004,43,13233-13241；M.D.；Kvaerno,L.；Bryld,T.；Hakansson,A.E.；Verbeure,B.；Gaubert,G.；Herdewijn,P.；Wengel,J.J.Am.Chem.Soc.2002,124,2164-2176]。被LNA修饰的寡核苷酸在靶向微小RNA(即作为所谓的抗MiR)方面同样显示有前景的性质，并且靶向微小RNA 122的一种LNA寡核苷酸作为用于治疗HCV感染的药物目前处在临床2期研究[www.santaris.com]。此外，被LNA修饰的寡核苷酸已经显示作为剪接调节化合物[B.Bestas等人,J.Clin.Investigation,2014,9,4067]以及作为所谓的blockmir的前景，所述blockmir是靶向微小RNA结合位点的单链寡核苷酸[www.mirrx.dk]。
已经在治疗性寡核苷酸的背景下研究了许多其它锁核苷酸，即LNA的类似物，例如BNA、碳环LNA和CEt[Rahman,S.M.A等人,Chem.Lett.2009,38,512][Zhou,C.和Chattopadhyaya,J.,Curr.Opin.Drug Disc.Devel.,2009,12,2180][Seth,P.P.和Swayze,E.E.,Natural Products in Medicinal Chemistry,编者Hanessian,S,Wiley-VCH,Weinheim,第1版,2014,203-439]。
含有被修饰核苷酸的缺口体反义寡核苷酸的效率通常很有限，因为其无法诱导靶mRNA被普遍存在的RNase H酶降解。具体来说，RNase H与其中N型核苷酸如LNA或O2’-烷基化-RNA核苷酸到处分散在AON中的底物双螺旋是不相容的[M.D.；Kvaerno,L.；Bryld,T.；Hakansson,A.E.；Verbeure,B.；Gaubert,G.；Herdewijn,P.；Wengel,J.J.Am.Chem.Soc.2002,124,2164-2176；Lima,W.F.；Nichols,J.G.；Wu,H.；Prakash,T.P.；Migawa,M.T.；Wyrzykiewicz,T.K.；Bhat,B.；Crooke,S.T.J.Biol.Chem.2004,279,36317-36326]。此类O2’-烷基化-RNA核苷酸例如可以是2’-O-甲基-RNA核苷酸或2’-O-甲氧基乙基-RNA(2’-MOE-RNA)核苷酸。
在本文中被定义为短的单链寡核苷酸的适体是用于药物开发的替代性寡核苷酸构建体。适体采取能够实现例如肽、蛋白质、小分子、病毒和活细胞的靶向的明确定义的三维形状[Eckstein,F.,Expert Opin.Biol.Ther.2007,7,1021；Famulok,M.等人,Chem.Rev.2007,107,3715；Thiel,K.W.和Giangrande,P.H.,Oligonucleotides 2009,19,209；Mayer,G.Angew.Chem.Int.Ed.2009,48,2672]。在溶液中，一起构成适体序列的核苷酸具有形成碱基配对区域的区段的可能性，所述碱基配对区域将诱导分子折叠成复杂的三维形状，从而理想地允许适体相对其靶分子的表面紧密结合。正是适体根据其序列形成不同分子形状的能力促使适体与靶点形成结合相互作用。典型地使用被称为SELEX(通过指数富集的配体系统进化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment))的方法通过所谓的体外进化针对指定靶点进化特定序列来产生适体[Ellington,A.D.和Szostak,J.W.,Nature 1990,346,818；Turk,C.和Gold,L.,Science 1990,249,5059]。SELEX包括选自核酸组分池、即选自典型地例如50-100个核苷酸长的序列的大型文库的已结合适体的重复多轮筛选和聚合酶催化富集(PCR)，所述50-100个核苷酸长的序列包括侧接两个引物结合区的中心可变(序列随机化)区。
适体是通用的药物候选物，因为其可以针对胞外靶点如受体或特定信号分子进化。适体也可以针对胞内组分进化，因而一旦内化入细胞中之后就介导生物应答。适体已经在体内应用以作为抗癌siRNA特异性地递送到前列腺癌细胞[Dassie,J.P.等人,NatureBiotechnology 2009,27,839]。适体的胞内应用是一项有挑战的任务，因为其相对大的尺寸和聚阴离子特性引起不佳的胞内递送。另一个挑战是生物分布，因为一些未缀合的寡核苷酸在静脉内给药时通过肾脏快速排泄。聚乙二醇化(通过所谓的聚(乙二醇)缀合的化学连接)和脂质纳米粒子调配是已经用于改善生物分布的示例方法[Veronese,F.M.等人,Drug Disc.Today 2005,10,1451]。
一种适体已被批准用作药物(哌加他尼(pegaptanib)；用于在眼睛中局部给药时治疗年龄相关黄斑变性)，其它适体正处在或已经处在针对不同疾病的临床开发的各种阶段[Famulok,M.,J.Med.Chem.2009,52,6951]。这些治疗候选物一般通过已经由完全SELEX程序进化而来的适体的所谓的后SELEX修饰来获得。后SELEX修饰典型地包括截短成更短的适体候选物，进行缀合(例如聚乙二醇化)以用于改善生物分布，和/或掺入被化学修饰的核苷酸以用于提高生物稳定性。后SELEX化学修饰是必需的，因为只有极少数的被修饰核苷三磷酸酯，例如2’-氟-RNA、2’-氨基-RNA和5-取代的嘧啶核苷三磷酸酯[Mayer,G.,Angew.Chem.Int.Ed.2009,48,2672]是有效SELEX程序所需的聚合酶催化反应的底物。后SELEX修饰典型地在重复多轮合成和结合分析/生物评估中进行，以确保修饰与期望的适体特性是相容的。
AS1411是富含G的26-mer寡脱氧核苷酸。像绝大多数适体一样，AS1411的核苷组分被天然磷酸二酯(PO)键连接在一起，因为这些天然磷酸二酯(PO)键与SELEX程序是高度相容的。已经报道AS1411折叠成稳定的二聚体G-四重结构[Collie G.W.和Parkinson,G.N.Chem.Soc.Rev.2011,40,5867]。AS1411可以诱导人癌细胞系中的细胞死亡，对正常细胞的影响极小，并且已经在晚期癌症患者的I期和II期临床试验中得到了测试[Reyes-Reyes,E.M.等人,Cancer Res.2010,70,8617]。AS1411的靶点已被确认为核仁素，虽然其作用机制尚不完全清楚。已经提出了核仁素结合引起AS-1411被摄取到癌细胞中。更多最新研究已经证实AS1411的作用中涉及核仁素，并且已经提出AS1411的摄取可能是通过巨胞饮进行的[Reyes-Reyes,E.M.等人,Cancer Res.2010,70,8617]。
从公开的科学著作已知酰基-氨基-LNA和烃基(例如烷基)-氨基-LNA单体和寡聚物的一些衍生物和特性。最近发表了关于氨基-LNA衍生物(包括酰基-氨基-LNA和烷基-氨基-LNA)的一篇综述[I.K.Astakhova和J.Wengel,Acc.Chem.Res.,2014,47,1768]。当和对应的DNA/RNA寡核苷酸比较时，酰基-氨基-LNA和烃基(例如烷基)-氨基-LNA寡核苷酸通常对于互补DNA/RNA链显示增加的亲和力，这和对于对应的LNA寡核苷酸观测到的增加的亲和力非常一致。
甘氨酰基-氨基-LNA和棕榈酰基-氨基-LNA单体可以与LNA和DNA单体混合[Johannsen,M.W.等人,Org.Biomol.Chem.,2011,9,243]。由通过N2’-连接子连接到氨基-LNA单体的芘组成的核苷酸单体已被报道可用作荧光探针，并且含有各种氨基酸作为酰基的酰基-氨基-LNA衍生物已经显示与DNA核苷酸是相容的(可以在同一个链或寡核苷酸中混合)，并且2’-氨基-LNA和2’-N-甲基-氨基LNA单体已经显示可用于缺口体反义寡核苷酸中[参见I.K.Astakhova和J.Wengel,Acc.Chem.Res.,2014,47,1768和其中引用的参考文献]。
已经报道了含有被哌嗪基修饰的2’-氨基-LNA单体的寡核苷酸展现高的双螺旋稳定性和显著的核酸酶抗性。核酸酶抗性是针对所研究的寡核苷酸(与DNA的混合体，磷酸二酯(PO)键)而言的，即使与含有母体氨基-LNA单体而不是被哌嗪基修饰的2’-氨基-LNA单体的对应寡核苷酸相比显著增加[Lou,C.,Vester,B.和Wengel,J.Chem.Comm.2015.19,4024-4027]。另外还显示了被诱导的溶核稳定性朝向距离被哌嗪基修饰的2’-氨基-LNA单体几个DNA核苷酸远的寡核苷酸的3’端延伸。这些结果证明本发明的寡核苷酸即使作为全-PO寡核苷酸依然针对溶核降解显示显著的稳定性。
关于在体内RNA靶向(例如在反义、antimir或blockmir的背景下，或作为能够调节剪接事件的化合物)方面使用含有酰基-氨基-LNA，例如甘氨酰基-氨基-LNA或棕榈酰基-氨基-LNA的寡核苷酸还没有公开报道。
本发明公开了使用含有两个或更多个酰基-氨基-LNA和/或烃基-氨基-LNA单体的寡核苷酸作为RNA靶向构建体以用于治疗或诊断目的。所发明的构建体的实例包括缺口体反义构建体、混合体反义构建体、antimir构建体、blockmir构建体和适体构建体。
本发明中并不包括使用含有2’-氨基-LNA(“2’-NH”)和2’-N-甲基-氨基-LNA(“2’-NCH3”)单体作为唯一的氨基-LNA型单体的缺口体反义构建体、混合体反义构建体、antimir构建体、blockmir构建体和适体构建体。
本发明还公开了使用含有两个或更多个酰基-氨基-LNA和/或烃基-氨基-LNA单体作为核酸适体的寡核苷酸，以作为用于治疗或诊断目的的非RNA靶向构建体。
本发明的寡核苷酸可用于介导动物或人的无法由标准单链RNA靶向寡核苷酸(例如硫代磷酸酯-LNA寡核苷酸或硫代磷酸酯-MOE寡核苷酸)到达的器官中的RNA靶向。所述作用之所以能被介导是因为范围广泛的烃基和酰基可以连接到烃基-氨基-LNA和酰基-氨基-LNA单体中的氨基-LNA单体的N2’位置并被掺入到寡核苷酸中。因而可实现寡核苷酸的药代动力学特性的调节。举例来说，疏水性酰基或烃基(例如烷基)使穿过细胞膜的穿透变得容易，并且可以另外导致肝组织中改善的积聚。另外，许多脂肪酸残基如棕榈酰基或肉豆蔻酰基当连接到本发明的寡核苷酸中的氨基-LNA单体的N2’位置时，导致与血浆蛋白质如白蛋白的结合，这又会引起改善的血液中循环时间和改善的组织分布和摄取。
本发明中，存在所述脂肪酸缀合氨基-LNA-修饰(例如棕榈酰基-氨基-LNA残基)中的两个是一种特别优选的设计，以便对基于磷酸二酯或硫代磷酸酯的寡核苷酸，例如用于靶向mRNA或非编码RNA(例如用于miRNA靶向、调节剪接切换、miRNA靶位点阻断、基因沉默或基因表达上调)的缺口体或混合体，实现增加的血液半衰期和改善的组织分布和摄取。在所述反义寡核苷酸的磷酸二酯变异体的情况下，与例如被组成为LNA-DNA-LNA或BNA-DNA-BNA缺口体或LNA/DNA、BNA/DNA、LNA/2’-O-Me-RNA、BNA/2’-O-Me-RNA或LNA/DNA/2’-OMe-RNA混合体的对应寡核苷酸相比，针对溶核降解的稳定性增加，尤其当LNA或BNA单体中的两个被本发明的酰基-LNA或氨基-LNA单体交换时。
携带一个或多个正电荷的酰基或烃基(例如烷基)对于细胞膜穿透性和组织靶向是有利的。其它选择包括与碳水化合物如半乳糖单元或CPP(细胞穿透肽)缀合。相对于未被修饰的或含有LNA的参考寡核苷酸，寡核苷酸中存在至少两个酰基-氨基-LNA和/或烃基(例如烷基)-氨基-LNA单体会提高核酸酶稳定性。可以连接不同大小的基团而不会干扰RNA靶向能力这一事实使得能够改造出期望的生物稳定性，例如改造出针对核酸酶降解的增加的稳定性。
对于反义应用，通常使用所谓的缺口体。这些缺口体是嵌合AON，具有RNase H募集核苷酸(典型地是DNA或硫代磷酸酯DNA核苷酸，但替代性地例如硫代磷酸酯FANA核苷酸[Lok,C.N.；Viazovkina,E.；Min,K.L.；Nagy,E.；Wilds,C.J.；Damha,M.J.；Parniak,M.A.Biochemistry 2002,41,3457-3467])的中心连续链段，所述中心连续链段侧接经过亲和力增强修饰的核苷酸(例如LNA、α-L-LNA或O2’-烷基化RNA核苷酸)[Jepsen,J.S.；Sorensen,M.D.；Wengel,J.Oligonucleotides 2004,14,130-146；Monia,B.P.；Lesnik,E.A.；Gonzalez,C.；Lima,W.F.；McGee,D.；Guinosso,C.J.；Kawasaki,A.M.；Cook,P.D.；Freier,S.M.J.Biol.Chem.1993,268,14514-14522；Kurreck,J.；Wyszko,E.；Gillen,C.；Erdmann,V.A.Nucleic Acids Res.2002,30,1911-1918；Frieden,M.；Christensen,S.M.；Mikkelsen,N.D.；Rosenbohm,C.；Thrue,C.A.；Westergaard,M.；Hansen,H.F.；Orum,H.；Koch,T.Nucleic Acids Res.2003,31,6365-6372]。已经发现最佳的缺口大小取决于基序，缺口大小和亲和力之间需要适当平衡[Kurreck,J.；Wyszko,E.；Gillen,C.；Erdmann,V.A.Nucleic Acids Res.2002,30,1911-1918]，以及在缺口内一个或两个DNA模拟α-L-LNA单体的存在与RNase H活性是至少部分相容的[M.D.；Kvaerno,L.；Bryld,T.；Hakansson,A.E.；Verbeure,B.；Gaubert,G.；Herdewijn,P.；Wengel,J.J.Am.Chem.Soc.2002,124,2164-2176；Frieden,M.；Christensen,S.M.；Mikkelsen,N.D.；Rosenbohm,C.；Thrue,C.A.；Westergaard,M.；Hansen,H.F.；Orum,H.；Koch,T.Nucleic Acids Res.2003,31,6365-6372]。
之前已经将酰基-氨基-LNA和烃基(例如烷基)-氨基-LNA单体掺入DNA链中，因此已经报道了用于制备所述单体的用于自动化寡核苷酸合成的亚磷酰胺结构单元(phosphoramidite building block)的程序以及用于将所述单体掺入寡核苷酸(例如DNA、RNA、LNA、UNA(解锁核酸)或2’-OMe-RNA寡核苷酸)中的程序[参见I.K.Astakhova和J.Wengel,Acc.Chem.Res.,2014,47,1768和其中引用的参考文献，尤其是Johannsen,M.W.等人,Org.Biomol.Chem.,2011,9,243]。
以下结构和功能特征被视为对于发明人的反义型寡核苷酸(例如缺口体或混合体)是最佳的：
(a)相对小的尺寸，即总共低于20个核苷酸；
(b)含有磷酸二酯(PO)或大多数的PO核苷间键代替PS核苷间键；
(c)长的血清半衰期；
(d)通过肾脏的有限的排泄(尿)；
(e)针对溶核降解的稳定性；
(f)能够在不添加转染剂或使用纳米粒子制剂的情况下穿透细胞膜并介导基因表达的调节。
a)的满足对于生产目的是有利的，并且可以另外帮助细胞膜穿透和/或生物分布。掺入LNA型核苷酸(或BNA型核苷酸)是缩短治疗性寡核苷酸的长度的优选方法，因为LNA(或BNA)核苷酸诱导高的RNA靶点亲和力[Obad,S.等人Nature Genetics 2011,43,371-378]。掺入LNA(或BNA)核苷酸还可以实现短的治疗性适体的开发，因为LNA(或BNA)核苷酸的优秀的杂交特性即使对于更短的适体序列依然可以促进分子内结构化。
b)的满足对于避免形成在每一个PS(硫代磷酸酯)键上产生的非对映异构混合物是有利的。作为实例，16-mer全-PS标准反义寡核苷酸可以作为215(＝32,768)个不同分子的混合物存在[Wan,W.B.等人,Nucleic Acids Res.2014,42,13456-13468]，其中一些可以促成期望的治疗作用，另一些可以例如产生不想要的作用。含有PS键的寡核苷酸的一些脱靶效应可能来源于和蛋白质的非特异结合以及免疫相关副作用[Jastrzebska等人Org.Biomol.Chem.2015,13,10032-10040和其中引用的参考文献]。标准PS-寡核苷酸的这些难题已经促使对P-立体结构的PS寡核苷酸的合成进行研究，并且所述化合物的制备需要使用和开发繁琐的合成方法并且尚未得到改良的治疗性衍生物[Wan,W.B.等人,NucleicAcids Res.2014,42,13456-13468；Jastrzebska等人Org.Biomol.Chem.2015,13,10032-10040]。优先含有或唯独含有PO键的治疗性寡核苷酸被视为期望的，因为其将显示更少的脱靶效应。
c)、d)和e)的满足对于获得寡核苷酸药物开发所需的药代动力学特性是令人满意的。为了满足这三点，PS键已经典型地用于实现和血浆蛋白质的结合，从而减少通过肾脏的排泄，并且另外针对核酸酶降解实现保护。然而，还是观察到大量的通过肾脏的不期望的快速排泄。或者，脂质衍生物(最典型地是胆固醇基)已被用于介导与血浆蛋白质的结合。具体来说，已经对siRNA构建体(双链RNA)研究了这种情况[Wolfrum,C.等人,NatureBiotech.2007,25,1149-1157；Howard,K.A.,Bienk,K.和Kragh-Hansen,U.WO2014/005596]，但是没有siRNA或单链寡核苷酸的脂质衍生物已被批准用作药物，并且存在挑战[Wittrup,A.和Lieberman,J.,Nature Rev.Gen.2015,16,543-552]。有趣的是，对于被单胆固醇基或双胆固醇基修饰的siRNA报道了使用转染剂和白蛋白的有前景的基因沉默活性，但是值得注意的是，对于相应的C12-C16脂肪酸官能化siRNA没有报道所述基因沉默活性[Wolfrum,C.等人,Nature Biotech.2007,25,1149-1157；Howard,K.A.,Bienk,K.和Kragh-Hansen,U.WO2014/005596]。
对于适体，典型地已经通过与PEG(聚乙二醇)单元缀合满足了c)和d)[Hirota,M.等人,Nucleic Acids Ther.2016,26,10-19]。然而这是不优选的解决方案。首先，与PEG缀合是获得最终药物组分的一个额外的复杂步骤，其次，已经报道了针对PEG单元的免疫反应以及聚乙二醇化系统的快速清除[Yang,Q.和Lai,S.K.,Advanced Review 2015,7,655-677]。
已经报道了寡核苷酸的有效的所谓的gymnotic递送(或不使用转染剂的非辅助式递送)和伴随的基因调节活性与体内活性尤其好地相关联，并且所述有效的非辅助式细胞穿透现在因此被视为对于寡核苷酸药物开发工作是非常重要的。已经对于高亲和力LNA型反义缺口体[Stein,C.A.等人Nucleic Acids Res.2010,38,e3；Zhang,Y.等人GeneTherapy 2011,18,326-333]和相对高亲和力的2’-FANA寡核苷酸[Souleimanian,N.等人,Mol.Ther.Nucleic Acids 2012,1,e43]证实了有效的非辅助式递送。因此已经通过使用含有高亲和力单体，但值得注意地仅在PS键的背景中的寡核苷酸满足了f)。应该提到的是，针对基因表达抑制而获得的IC50值典型地处于低的微摩尔范围内，显著高于当使用转染剂时通常获得的纳摩尔范围。此外，应注意的是，标准全-PO寡核苷酸在非辅助式递送条件下无法显示活性或摄取。
基于迄今为止在文献中报道的单链寡核苷酸，没有构建体满足以上列举和讨论的所有期望的6个要点a)-f)。以下基于报道的数据总结一些关键点：
1)相对于全-PO寡核苷酸，全-PS寡核苷酸显示改善的药代动力学特性，但是其治疗用途因不期望的脱靶效应和相对高的肾清除率而受到阻碍；
2)siRNA构建体的双胆固醇基官能化已经显示与使用转染辅助/穿透辅助分子的有效的体外基因沉默是相容的，而相同siRNA的双棕榈酰基官能化无法显示类似条件下的有效基因沉默；
3)已经对胆固醇基和棕榈酰基官能化的siRNA报道了改善的循环半衰期，即降低的肾清除率；
4)针对用于单链寡核苷酸的核酸外切酶和核酸内切酶的稳定性典型地需要在链中的大多数核苷酸位置中或通过在基本上全部键位置处都使用PS键来使用被化学修饰的核苷酸。
5)含有超过30-40％RNA核苷酸和PO键的单链寡核苷酸典型地对于溶核降解是不稳定的。
6)在非辅助式递送条件下的有效的细胞摄取和基因沉默活性需要使用在大多数键位置中具有PS键的单链寡核苷酸。
本发明的一个目的是提供即使不使用转染剂，依然在真核细胞或生物体例如动物或人的细胞中具有高转染效率的单链寡核苷酸。
本发明的一个目的是提供在动物例如哺乳动物的血清中具有长半衰期的寡核苷酸。
本发明的一个目的是提供当结合到RNA靶序列时作为RNase H型酶的有效底物的反义寡核苷酸。
本发明的另一个目的是提供在不作为RNase H底物的情况下强有力地结合到靶RNA，从而引起基因表达的调节的反义寡核苷酸。靶RNA可以是mRNA或非编码RNA。
本发明的另一个目的是提供在针对细胞培养物中或体内的酶降解的稳定性方面具有改善的特性的反义寡核苷酸。另外一个目标是提供相对于不含两个或更多个酰基-氨基-LNA和/或烃基-氨基-LNA单体的对应反义寡核苷酸，显示提高的生物利用度、增加的组织分布或其它方面的改善特性(例如改善的体内基因沉默效应)的反义寡核苷酸。
发明人已经意外地发现，含有两个或更多个酰基-氨基-LNA或烃基(例如烷基)-氨基-LNA核苷酸单体的本发明的单链寡核苷酸满足以上列出的所有期望的要点a)-f)。本发明的寡核苷酸因此显示以下几点：
7)其作为相对短的链是有效的，因为存在由酰基-氨基-LNA和烃基(例如烷基)-氨基-LNA核苷酸单体介导的LNA型高亲和力杂交；
8)其被细胞有效地摄取，并且在非辅助式递送条件下，在不仅作为全-PO寡核苷酸(即在全部键或大多数键处具有PO)，而且作为全-PS衍生物时都显示基因调节活性；
9)其作为全-PO和全-PS衍生物显示增加的血清半衰期，即使当与不具有酰基-氨基-LNA和烃基-氨基-LNA核苷酸单体的对应全-PS寡核苷酸相比时；
10)其作为全-PO和全-PS衍生物显示更少的肾内积聚，即使当与不具有酰基-氨基-LNA和烷基-氨基-LNA核苷酸单体的对应全-PS寡核苷酸相比时；
11)其作为全-PO和全-PS衍生物显示令人满意的针对溶核水解的稳定性，这也通过其很长的(substantial)血清半衰期证实；
12)其作为全-PO和全-PS衍生物显示穿透细胞膜并介导基因表达的调节的能力，无需添加转染剂或使用纳米粒子制剂。
发明内容
本发明尤其提供以下项目1)到46)：
1)一种单链寡核苷酸，其含有两个或更多个酰基-氨基-LNA或烷基-氨基-LNA核苷酸单体，其中其它核苷酸单体可以是DNA、RNA或被化学修饰的核苷酸单体；
其中所述寡核苷酸的单体通过磷酸二酯键和/或硫代磷酸酯键和/或磷酸三酯键连接，
其中所述酰基-氨基-LNA和烷基-氨基-LNA单体的酰基和烷基任选地被取代并且因此任选地含有一个或多个羟基、氨基、硫基、氧代基、烷硫基、醚基和/或硫醇基(巯基)，和
其中所述酰基-氨基-LNA和烷基-氨基-LNA单体的酰基和烃基是直链或支链、环状或两者的组合，条件是每一个酰基和烷基中的碳原子总数小于30。
2)一种单链寡核苷酸，其含有两个或更多个酰基-氨基-LNA或烃基-氨基-LNA核苷酸单体，其中其它核苷酸单体可以是DNA、RNA或被化学修饰的核苷酸单体；
其中所述寡核苷酸的单体通过磷酸二酯键和/或硫代磷酸酯键和/或磷酸三酯键连接，
其中所述酰基-氨基-LNA和烃基-氨基-LNA单体的酰基和烃基任选地被取代并且因此任选地含有一个或多个羟基、氨基、硫基、氧代基、烷硫基、醚基和/或硫醇基(巯基)，和
其中所述酰基-氨基-LNA和烃基-氨基-LNA单体的酰基和烃基是直链或支链、环状或两者的组合，条件是每一个酰基和烃基中的碳原子总数小于30。
(3)根据以上项目1或2的单链寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的所有核苷间键的至少50％、优选至少70％、更优选至少90％且最优选至少95％是磷酸二酯键。
(4)根据以上项目1至3的单链寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的核苷酸单体部分的至多40％、优选至多30％、更优选至多20％且最优选至多10％是核糖核苷酸单体部分。
5)根据以上项目1至4中任一项的单链寡核苷酸，其中所述烃基-氨基-LNA核苷酸单体是烷基-氨基-LNA核苷酸单体。
6)根据以上项目1至5中任一项的单链寡核苷酸，其中所述寡核苷酸含有至少两个N-酰基-氨基-LNA核苷酸单体，或至少两个N-烃基-氨基-LNA核苷酸单体，或至少一个N-酰基-氨基-LNA核苷酸单体和至少一个N-烃基-氨基-LNA核苷酸单体。
7)根据以上项目1至6中任一项的单链寡核苷酸，所述寡核苷酸含有一个或两个连接到胆固醇基部分的核苷酸单体单元(部分)。
8)根据以上项目1至7中任一项的单链寡核苷酸，其中所述酰基-氨基-LNA核苷酸单体单元的酰基部分是N-烷酰基、N-烯酰基和/或N-炔酰基部分，其各自具有4到30个碳原子，优选7到22个碳原子，更优选10到22个碳原子，所述酰基部分未被取代或被一个或多个选自羟基、C1-C6烷氧基、氨基、C1-C6单烷基氨基或二烷基氨基、氧代基、硫醇基和C1-C6烷硫基的基团取代。
9)根据以上项目1、2、3、4、5、6、7或8中任一项的单链寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含至少7个核苷酸单体单元，优选至少8个核苷酸单体单元，更优选至少11个核苷酸单体单元，并且甚至更优选至少12个单体单元。
10)根据以上项目1至9中任一项的单链寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的所有核苷酸单体单元都通过磷酸二酯键连接。
11)根据以上项目1至10中任一项的单链寡核苷酸，其是缺口体、适体或混合体。
12)根据以上项目1至11中任一项的单链寡核苷酸，其中所述寡核苷酸从5’端到3’端具有三个区段：至少2个核苷酸单元的5’端区段，长度为至少6个核苷酸单元的中心结合区段，和长度为至少2个核苷酸单元的3’端区段，
其中所述寡核苷酸在所述5’端区段或所述3’端区段中含有至少两个酰基-氨基-LNA或烃基-氨基-LNA核苷酸单体，但在所述中心区段中一个也没有；或者在所述末端区段中的每一个中都含有至少一个N-酰基-氨基-LNA或烃基-氨基-LNA核苷酸单体，但在所述中心区段中一个也没有。
13)根据以上项目1至11中任一项的单链寡核苷酸，其中所述寡核苷酸是以下组成的缺口体：
NV-MY-NZ，
其中M表示能与靶RNA的RNase H降解相容的核苷酸单体，N表示选自亲和力增强(affinity enhancing)核苷酸单体、酰基-氨基-LNA和/或烃基-氨基-LNA单体、和DNA核苷酸单体的单体，并且其中V、Y和Z表示所述区段中的单体的数目，并且其中连字符指示两个翼序列区段NV和NZ与间隔序列区段MY之间的分隔；数字V和Z可以在2和8之间变化并且数字Y可以在6和14之间变化，条件是V+Z+Y的总和最大是30，限制条件是
在所述翼区段、即由N单体组成的区段中的每一个中都存在至少一个酰基-氨基-LNA和/或烃基-氨基-LNA单体；或
在所述翼区段、即由N单体组成的区段中的一个中存在至少两个酰基-氨基-LNA和/或烃基-氨基-LNA单体。
14)根据以上项目13的单链寡核苷酸，其中所述寡核苷酸具有以下组成5’-(L)2-4-(D)6-10-(L)2-4，其中D表示DNA核苷酸单体并且L表示亲和力增强核苷酸单体或酰基-氨基-LNA和/或烃基-氨基-LNA单体，条件是
在所述翼区段、即由L单体组成的区段中的每一个中都存在至少一个酰基-氨基-LNA和/或烃基-氨基-LNA单体；或
在所述翼区段、即由L单体组成的区段中的一个中存在至少两个酰基-氨基-LNA和/或烃基-氨基-LNA单体。
15)根据以上项目1至14中任一项的反义寡核苷酸，其能够通过由RNase-H介导的反义RNA靶向来介导基因调控。
16)根据以上项目1至11中任一项的单链寡核苷酸，其中在半序列区段的一个中、即所述寡核苷酸序列的5’端半部分或所述寡核苷酸序列的3’端半部分中存在至少两个酰基-氨基-LNA和/或烃基-氨基-LNA单体，条件是如果所述寡核苷酸中的核苷酸总数是奇数，那么在所述两个半序列区段中的任一个中都不包含中心核苷酸单体；或者如果所述寡核苷酸中的核苷酸单体总数是奇数，那么所述至少两个酰基-氨基-LNA和/或烃基-氨基-LNA单体中的一个任选地可以是中心核苷酸单体。
17)一种具有组成5’-(N)7-26的单链寡核苷酸，其中N表示至少一个亲和力增强单体并且另外可以表示任何其它类型的核苷酸单体，条件是至少两个N核苷酸是酰基-氨基-LNA和/或烃基-氨基-LNA单体，并且
每一个序列元件、即所述寡核苷酸序列的5’端半部分和所述寡核苷酸序列的3’端半部分各自含有至少一个酰基-氨基-LNA和/或烃基-氨基-LNA单体，或
在半序列元件的一个中、即所述寡核苷酸序列的5’端半部分或所述寡核苷酸序列的3’端半部分中存在至少两个酰基-氨基-LNA和/或烃基-氨基-LNA单体，
条件是如果核苷酸总数是奇数，那么在所述两个序列元件中的任一个中都不包含中心核苷酸单体，或者
如果所述寡核苷酸中的核苷酸单体总数是奇数，那么所述至少两个酰基-氨基-LNA和/或烃基-氨基-LNA单体中的一个任选地可以是中心核苷酸单体，
和
其中所述寡核苷酸的单体通过磷酸二酯键和/或硫代磷酸酯键和/或磷酸三酯键连接，
其中所述酰基-氨基-LNA和烃基-氨基-LNA单体的酰基和烃基任选地被取代并且因此任选地含有一个或多个羟基、氨基、硫基、氧代基、烷硫基、醚基或硫醇基(巯基)，和
其中所述酰基-氨基-LNA和烃基-氨基-LNA单体的酰基和烃基可以是直链或支链、环状或两者的组合，条件是每一个酰基和烃基中的碳原子总数小于30。
18)根据项目17的单链寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的所有核苷间键的至少50％、优选至少70％、更优选至少90％且最优选至少95％是磷酸二酯键。
19)根据项目17或18的单链寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的核苷酸单体的至多40％、优选至多30％、更优选至多20％且最优选至多10％是核糖核苷酸单体。
20)根据以上项目17至19中任一项的单链寡核苷酸，其中组成是5’-(N)7-12，其中N表示亲和力增强核苷酸和至少两个酰基-氨基-LNA和/或烃基-氨基-LNA单体，使得所述序列元件中的每一个都含有至少一个酰基-氨基-LNA和/或烃基-氨基-LNA单体。
21)根据以上项目17至19中任一项的单链寡核苷酸，其中组成是5’-(N)12-22，其中N表示至少四个LNA型亲和力增强单体、多个DNA或2’-OMe-RNA单体、和至少两个酰基-氨基-LNA和/或烃基-氨基-LNA单体，使得所述序列元件中的每一个都含有至少一个酰基-氨基-LNA和/或烃基-氨基-LNA单体。
22)根据以上项目17至19中任一项的单链寡核苷酸，其中组成是5’-(N)15-22，其中N表示至少三个LNA型亲和力增强单体、一个或多个2’-OMe-RNA单体、和至少两个酰基-氨基-LNA和/或烃基-氨基-LNA单体，使得所述序列元件中的每一个都含有至少一个酰基-氨基-LNA和/或烃基-氨基-LNA单体。
23)根据以上项目17至19中任一项的单链寡核苷酸，其中组成是5’-(N)7-12，其中N构成亲和力增强核苷酸和至少两个酰基-氨基-LNA和/或烃基-氨基-LNA单体，使得在半序列元件的一个中、即所述序列的5’端半部分或所述序列的3’端半部分中存在至少两个酰基-氨基-LNA和/或烃基-氨基-LNA单体，条件是如果核苷酸总数是奇数，那么在所述两个序列元件中的任一个中都不包含中心核苷酸单体；或者如果所述寡核苷酸中的核苷酸单体总数是奇数，那么所述至少两个酰基-氨基-LNA和/或烃基-氨基-LNA单体中的一个任选地可以是中心核苷酸单体。
24)根据以上项目17至19中任一项的单链寡核苷酸，其中组成是5’-(N)12-22，其中N表示至少四个LNA型亲和力增强单体、多个DNA或2’-OMe-RNA单体、和至少两个酰基-氨基-LNA和/或烃基-氨基-LNA单体，使得在半序列元件的一个中、即所述序列的5’端半部分或所述序列的3’端半部分中存在至少两个酰基-氨基-LNA和/或烃基-氨基-LNA单体，条件是如果核苷酸总数是奇数，那么在所述两个序列元件中的任一个中都不包含中心核苷酸单体；或者如果所述寡核苷酸中的核苷酸单体总数是奇数，那么所述至少两个酰基-氨基-LNA和/或烃基-氨基-LNA单体中的一个任选地可以是中心核苷酸单体。
25)根据以上项目17至19中任一项的单链寡核苷酸，其中组成是5’-(N)15-22，其中N表示至少三个LNA型亲和力增强单体、多个2’-OMe-RNA单体、和至少两个酰基-氨基-LNA和/或烃基-氨基-LNA单体，使得在半序列元件的一个中、即所述序列的5’端半部分或所述序列的3’端半部分中存在至少两个酰基-氨基-LNA和/或烃基-氨基-LNA单体，条件是如果核苷酸总数是奇数，那么在所述两个序列元件中的任一个中都不包含中心核苷酸单体；或者如果所述寡核苷酸中的核苷酸单体总数是奇数，那么所述至少两个酰基-氨基-LNA和/或烃基-氨基-LNA单体中的一个任选地可以是中心核苷酸单体。
26)一种介导细胞或生物体中的基因沉默的方法，其包括将所述细胞或生物体与如以上项目1至25中任一项中所定义的寡核苷酸如反义寡核苷酸接触。
27)根据项目26的方法，所述方法在体外或在分离的细胞上进行；或者所述方法在哺乳动物(例如整体动物或人)体内进行，例如通过将所述寡核苷酸施予所述哺乳动物。
28)根据项目26的方法，其中所述寡核苷酸与在所述细胞或生物体中表达的靶基因或靶RNA具有互补性，以用于介导所述靶基因或靶RNA的沉默，优选地由RNase H介导。
29)如以上项目1至25中任一项所定义的寡核苷酸，用于动物或人的治疗中。
30)根据项目29使用的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸与靶基因或靶RNA具有互补性，以用于介导所述靶基因或靶RNA的沉默，优选地由RNase H介导。
31)一种检查细胞或生物体中的基因的功能的方法，其包括：
将如以上项目1至25中任一项所定义的靶向RNA以用于基因沉默的寡核苷酸引入到所述细胞或生物体中，从而产生测试细胞或测试生物体；
将所述测试细胞或测试生物体维持在发生基因沉默的条件下，从而产生其中所述基因的RNA水平下降的测试细胞或测试生物体；和
观测产生的测试细胞或生物体的表型，并且任选地比较观测到的表型与适当对照细胞或对照生物体的表型，从而提供关于所述基因的功能的信息。
32)根据项目31的方法，其用于确定基因产物是否是治疗干预的合适靶点。
33)根据以上项目31或32的方法，所述方法在体外或在分离的细胞上进行。
34)根据项目31和32的方法，所述方法在整体动物体内或在人体内进行。
35)一种评估药剂是否作用于基因产物的方法，其包括以下步骤：
将如以上项目1至25中任一项所定义的靶向RNA以用于介导基因沉默的反义寡核苷酸引入到细胞或生物体中，从而产生测试细胞或测试生物体；
将所述测试细胞或测试生物体维持在发生基因沉默的条件下，从而产生其中所述基因的RNA水平下降的测试细胞或测试生物体；
将所述药剂引入到所述测试细胞或测试生物体中；和
观测所述测试细胞或生物体的表型，并且任选地比较观测到的表型与对照细胞或对照生物体的表型，从而提供关于所述药剂是否作用于所述基因产物的信息。
36)根据项目35的方法，所述方法在体外或在分离的细胞上进行。
37)根据项目35的方法，所述方法在整体动物体内或在人体内进行。
38)一种医药组合物，其包含根据以上项目1至25中任一项的寡核苷酸和药学上可接受的稀释剂、载体或佐剂。
39)根据以上项目1至25中任一项的寡核苷酸，其用作药物或用在通过疗法治疗人或动物体的方法中。
40)根据以上项目1至25中任一项的寡核苷酸，其用在对人或动物体实施的诊断方法中。
41)根据以上项目1至25中任一项的寡核苷酸，其用于疾病预后。
42)根据以上项目1至25中任一项的寡核苷酸，其用于研究用途。
43)根据以上项目1至25中任一项的寡核苷酸，其中所述两个或更多个酰基-氨基-LNA和/或烃基-氨基-LNA核苷酸单体选自甘氨酰基-氨基-LNA单体、棕榈酰基-氨基-LNA单体、肉豆蔻酰基-氨基-LNA单体和乙酰基-氨基-LNA单体。
44)根据以上项目1至25中任一项的反义寡核苷酸，其中所述两个或更多个酰基-氨基-LNA和/或烃基-氨基-LNA核苷酸单体是棕榈酰基-氨基-LNA单体、肉豆蔻酰基-氨基-LNA单体或用另一个脂肪酸酰基进行N-酰化的氨基-LNA单体，所述脂肪酸酰基优选地是饱和脂肪酸的脂肪酸酰基和/或优选地包括10到18个碳原子。
45)根据前述项目中任一项的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸含有连接在所述寡核苷酸的3’端和/或5’端的一个或多个缀合基团。
46)一种含有根据以上项目1至25中任一项的寡核苷酸的试剂。
发明人已经意外地发现，通过在即使不使用转染子(无辅助地递送到细胞中)的情况下也显示对于真核细胞的高转染效率、通过显示针对核酸酶介导的降解的高稳定性、通过结合到白蛋白、通过显示长的血清半衰期、通过显示生物活性，本发明的具有两个或更多个酰基-氨基-LNA或烃基(例如烷基)-氨基-LNA核苷酸单体单元的寡核苷酸例如可用作单链寡核苷酸治疗剂。在肠胃外给药后，血清半衰期很高并且生物利用度也很高。因此，本发明的寡核苷酸非常适用于例如治疗目的以及诊断目的，尤其在体内。
附图说明
图1.在实施例4中针对白蛋白结合评估的反义寡核苷酸(ODN)的示意图。
图2部分2-1.白蛋白/ODN复合物的退火的PAGE，其使用具有一个(ON7452；左边)和两个(ODN7453；右边)棕榈酰基-氨基-LNA修饰的ODN或作为对照组的不具有棕榈酰基-氨基-LNA修饰(ON7451)的ODN，并通过SYBR金染色可视化，参见实施例4。这里的ODN具有磷酸二酯核苷间键。上方箭头显示白蛋白在凝胶中所处的位置；可见条带来源于染色ODN(结合于白蛋白)，而下方的染色条带是未结合的ODN。最上方的条带(白蛋白多聚体)被认为是ODN与超过一个白蛋白的联合体(再次通过染色ODN可视化)。
图2部分2-2.白蛋白/ODN复合物的退火的PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)，其使用具有一个(ON7455；左边)和两个(ODN7456；右边)棕榈酰基-氨基-LNA修饰的ODN或作为对照组的不具有棕榈酰基-氨基-LNA修饰(ON7454)的ODN，并通过SYBR金染色可视化。这里的ODN具有硫代磷酸酯核苷间键。上方箭头显示白蛋白在凝胶中所处的位置；可见条带来源于染色ODN(结合于白蛋白)，而下方的染色条带是未结合的ODN。
图2部分2-3.具有磷酸二酯键的ODN(ON7451；左边)和具有硫代磷酸酯键的ODN(ON7454；右边)的白蛋白/ODN复合物的退火的PAGE，通过SYBR金染色可视化。
图3.实施例5中使用的具有参考编号的被修饰ODN的图形表示。
图4.实施例5的通过用滴定法测量白蛋白与ODN的比率的白蛋白/ODN复合物的退火的PAGE。左边是PO-ODN(NAC7451)的结果，右边是PS-ODN(NAC7454)的结果。
图5.实施例5的通过用滴定法测量白蛋白与ODN的比率的白蛋白/ODN复合物的退火的PAGE。左边是PO-ODN(NAC7452)的结果，右边是PS-ODN(NAC7455)的结果。
图6.实施例5的通过用滴定法测量白蛋白与ODN的比率的白蛋白/ODN复合物的退火的PAGE。左边是PO-ODN(NAC7453)的结果，右边是PS-ODN(NAC7456)的结果。
图7.实施例5的通过用滴定法测量白蛋白与ODN的比率的白蛋白/ODN复合物的退火的PAGE。左边是PO-ODN(NAC7714)的结果，右边是PS-ODN(NAC7715)的结果。
图8.实施例5的通过用滴定法测量白蛋白与ODN的比率的白蛋白/ODN复合物的退火的PAGE。左边是PO-ODN(NAC7716)的结果，右边是PS-ODN(NAC7718)的结果。
图9.实施例5的通过用滴定法测量白蛋白与ODN的比率的白蛋白/ODN复合物的退火的PAGE。左边是PO-ODN(NAC7717)的结果，右边是PS-ODN(NAC7719)的结果。
图10.白蛋白/ODN复合物的退火的PAGE，其使用实施例8的具有PO键(左边)或PS键(右边)并且无棕榈酰基化氨基LNA修饰的ODN。ODN通过SYBR金染色可视化。上部：用不同浓度的白蛋白滴定的荧光2×棕榈酰基ODN。下部：用白蛋白滴定的非荧光2×棕榈酰基ODN(先前数据；参见图4)。
图11.白蛋白/ODN复合物的退火的PAGE，其使用实施例8的具有PO键(左边)或PS键(右边)并且无棕榈酰基化氨基LNA修饰的3’双重棕榈酰基化ODN。ODN通过SYBR金染色可视化。上部：用不同浓度的白蛋白滴定的荧光2×棕榈酰基ODN。下部：用白蛋白滴定的非荧光2×棕榈酰基ODN(先前数据；参见图7)。
图12.在实施例7的指定时间点的Cy5.5荧光ODN构建体的血浆水平。使用LivingImage(Perkin Elmer)定量荧光，并将量标准化为1分钟后的水平。右上角的插图是前4小时的放大图。上部显示实验时间线。
图13.实施例7中使用的具有参考编号的被修饰ODN的图形表示。
图14.注射后24小时，在IVIS扫描仪中扫描的小鼠器官(实施例7)。从上到下的器官：心脏、肺、肝、脾和肾。对于PS，左边的第二只小鼠是PBS对照，对于PO、PS 2×pal和PO 2×pal，左边的小鼠是PBS对照。所有图像分开采集，作为一个组载入，并使用Living Images软件(Perkin Elmer)标准化为相同的比例。
图15.注射后24小时，来自在IVIS扫描仪中扫描的分离器官的荧光定量。将荧光强度标准化为来自PS肾的信号并作为具有标准偏差的平均值(N＝5)呈现。
图16.在软骨细胞中的非辅助摄取之后的共聚焦显微镜照片和流式细胞仪结果(实施例8)。
具体实施方式
本发明提供含有两个或更多个酰基-氨基-LNA或烃基(例如烷基)-氨基-LNA核苷酸单体的单链寡核苷酸，其中其它核苷酸单体可以是DNA、RNA或被化学修饰的核苷酸单体；其中所述寡核苷酸的单体通过磷酸二酯键(本文中也称为“PO”)和/或硫代磷酸酯键(本文中也称为“PS”)和/或磷酸三酯键连接；其中所述酰基-氨基-LNA和烃基-氨基-LNA单体的酰基和烃基任选地被取代并且因此任选地含有一个或多个羟基、氨基、硫基、氧代基、烷硫基、醚基和/或硫醇基(巯基)；和其中所述酰基-氨基-LNA和烃基(例如烷基)-氨基-LNA单体的酰基和烃基(例如烷基)是直链或支链、环状或两者的组合，条件是每一个酰基和烃基中的碳原子总数小于30。
本发明的寡核苷酸包含至少10个核苷酸单体单元，优选至少11个核苷酸单体单元，更优选至多12个单体单元。寡核苷酸可以由10到30个单体单元，优选11到30个单体单元，更优选12到26个单体单元，甚至更优选14到24个单体单元，并且甚至更优选14到20个单体单元组成。在一个实施方案中，寡核苷酸具有12到16个核苷酸单体单元。因为核苷酸单体单元连接在一起形成寡核苷酸，所以术语“核苷酸单体单元”或简言之“单体单元”指示核苷酸单体并非分离的分子，而是与寡核苷酸中的一个或两个其它核苷酸单体单元连接的化学部分。在寡核苷酸的上下文中的术语“单体”意思是单体单元或部分。术语“寡核苷酸”在本文中可被缩写成“oligo”。缩写“ODN”和“AON”意思是反义寡核苷酸。
在本发明的寡核苷酸中，寡核苷酸的单体通过磷酸二酯键和/或硫代磷酸酯键和/或磷酸三酯键连接。给定寡核苷酸可以具有仅一种类型的这些键、两种类型的这些键或甚至所有三种类型的键。在优选实施方案中，在单链寡核苷酸中，核苷间键的至少50％、优选至少70％、更优选至少80％、更优选至少90％并且最优选至少95％是磷酸二酯键(PO)，并且其余的核苷间键可以是硫代磷酸酯键和/或磷酸三酯键。在一个优选实施方案中，本发明的寡核苷酸的核苷间键全部是PO(全部磷酸二酯)。也存在具有全部PS(全部硫代磷酸酯)或PO和PS核苷间键的混合物的实施方案。所属领域技术人员根据常识可以知晓这些类型的键以及具有这些键的寡核苷酸的自动化合成方法。
核苷酸单体单元的核碱基(简称为“碱基”)实际上不限于本发明的寡核苷酸；它们可以是标准核碱基腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶，或其任何衍生物或任何被化学修饰的核碱基，其中5-甲基胞嘧啶和被5位取代的尿嘧啶是尤其优选的实例。
本发明的寡核苷酸具有两个或更多个酰基-氨基-LNA或烃基(例如烷基)-氨基-LNA核苷酸单体。酰基-氨基-LNA或烃基-氨基-LNA是具有2’-氨基-LNA部分的核苷酸单体单元，即LNA的2’-氧原子被酰化或烃基化(例如烷基化)的2’-氮原子取代。氨基-LNA在现有技术中是已知的，参见例如I.K.Astakhova和J.Wengel,Acc.Chem.Res.,2014,47,1768的综述。因此，酰基-氨基-LNA是2’-N-酰基-2’-氨基LNA并且烃基-氨基-LNA是2’-N-烃基-2’-氨基LNA。酰基-氨基-LNA或烃基-氨基-LNA的核碱基无特定的限制并且可以是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶，或其任何衍生物或任何被化学修饰的核碱基。为了易于制备2’-氨基-LNA核苷，2’-氨基-LNA部分的碱基可以是胸腺嘧啶或5-甲基胞嘧啶。
本发明的寡核苷酸中的其它核苷酸单体单元在其核糖部分或其衍生物方面无特定的限制。它们可以是DNA或RNA或可以具有被化学修饰的核糖衍生物。它们因此可以是DNA、RNA、LNA、BNA、UNA、2’-氨基-LNA、α-L-LNA、2’-F-RNA、2’-O-烷基-RNA和/或2’-O-烷氧基烷基-RNA单体单元或其混合物。2’-O-烷基-RNA单体可以是2’-O-C1-C26-烷基-RNA单体单元。2’-O-烷氧基烷基-RNA单体单元可以是2’-O-C1-C6-烷氧基-C1-C26-烷基-RNA单体单元，例如2’-O-甲氧基乙基-RNA单元。BNA覆盖具有双环核糖单元并且所述双环核糖单元在C2’原子和C4’原子之间具有连接子的多种锁核苷酸，包括碳环-LNA和CEt[Rahman,S.M.A等人,Chem.Lett.2009,38,512][Zhou,C.和Chattopadhyaya,J.,Curr.Opin.Drug Disc.Devel,2009,12,2180]，并且UNA是核糖单元被无环单元、优选2’,3’-seco-RNA单元取代的一类核苷酸单体[Langkjaer,N.,Pasternak,A.和Wengel,J.,Bioorg.Med.Chem.2009,17,5420-5]。在本发明的单链寡核苷酸中，寡核苷酸的核苷酸单体的至多30％可以是核糖核苷酸单体(RNA)。优选地，寡核苷酸的核苷酸单体的至多20％、更优选至多10％、甚至更优选至多5％是核糖核苷酸单体。在一个重要实施方案中，寡核苷酸不具有核糖核苷酸单体单元。在一个实施方案中，其它核苷酸单体单元全部是脱氧核糖核苷酸单体单元(DNA)，并且在另一个实施方案中，它们全部是2’-O-甲基-RNA单体单元。在另一个实施方案中，其它单体单元是DNA和RNA单元，然而RNA单元的总数不大于寡核苷酸中的核苷酸单体单元的总数的30％。与通常理解和IUPAC定义一致，术语核糖核苷酸是指除了1’-位置的核碱基和5’-位置的磷酸酯部分以外，在核糖部分上无取代的核苷酸。相应地，术语核糖核苷酸单体(单元)是指除了1’-位置的核碱基和5’-位置和任选地3’-位置的可能核苷间键以外，在核糖部分上无取代的核苷酸单体(单元)。更详细地说，核糖核苷酸在2’-位置和2’-OH基团上未被取代。
本发明的寡核苷酸中的其它核苷酸单体单元的一个实例是优选地在核糖部分上被例如天线状单体、二聚体或三聚体半乳糖基或N-乙酰氨基半乳糖基部分修饰的核苷酸单体单元。作为优选实施方案，本发明包括寡核苷酸与这些单体、二聚体或三聚体半乳糖基或N-乙酰氨基半乳糖基部分的3’端或5’端缀合物。(例如天线状)单体、二聚体或三聚体半乳糖基或N-乙酰氨基半乳糖基部分可以连接到寡核苷酸中的氨基-LNA核苷酸单体单元的2’-氨基。最近，许多报道已经说明了如何使用反义寡核苷酸与(例如天线状)单体、二聚体或三聚体半乳糖基或N-乙酰氨基半乳糖基部分的缀合物实现反义寡核苷酸到肝脏(例如肝细胞)的靶向递送。这些已经和使用多种不同键(稳定的键或可在体内裂解的键)的反义寡核苷酸关联起来，并且其通用制备方法描述在以下两个参考文献中：[Prakash,T.P.等人,Nucleic Acids Res.2014,42,8796-8807；Albaek,N.等人,US20150368642]。这些方法可以用于设计和合成本发明的反义寡核苷酸与天线状单体、二聚体或三聚体半乳糖基或N-乙酰氨基半乳糖基部分的类似缀合物。
本发明的寡核苷酸中的酰基-氨基-LNA和烃基-氨基-LNA核苷酸单体的数目是至少两个。一般地，寡核苷酸中的单体单元总数的不超过40％、优选不超过30％、更优选不超过20％是酰基-氨基-LNA和烃基-氨基-LNA核苷酸单体。寡核苷酸中的酰基-氨基-LNA和烃基-氨基-LNA核苷酸单体的数目可以是2到8，优选地2到6，更优选地2到4，例如2或3。这些数目是指寡核苷酸中的酰基-氨基-LNA和烃基-氨基-LNA核苷酸单体的总数。本发明的寡核苷酸可以含有至少两个N-酰基-氨基-LNA核苷酸单体，或至少两个N-烃基-氨基-LNA核苷酸单体，或至少一个N-酰基-氨基-LNA核苷酸单体和至少一个N-烃基-氨基-LNA核苷酸单体。在一个实施方案中，本发明的寡核苷酸含有在刚刚定义的内容中的酰基-氨基-LNA核苷酸单体单元，但可以不具有烃基-氨基-LNA核苷酸单元。在另一个实施方案中，本发明的寡核苷酸含有在刚刚定义的内容中的烃基-氨基-LNA核苷酸单体单元，但可以不具有酰基-氨基-LNA核苷酸单元。
寡核苷酸的至少两个酰基-氨基-LNA和/或烃基-氨基-LNA单体可以靠近寡核苷酸的5’端和/或3’端定位，并且可以不存在于寡核苷酸的中心区中。在一个实施方案中，它们全部存在于从寡核苷酸的5’端开始的核苷酸位置1到4，优选地1到3，其中5’端单体单元是位置1；和/或它们存在于从寡核苷酸的3’端开始的核苷酸位置t到(t-3)，优选地t到(t-2)，其中3’端单体单元是位置t。
在一个实施方案中，所述至少两个酰基-氨基-LNA和/或烃基-氨基-LNA单体全部存在于寡核苷酸的半序列区段的一个中，即在序列的5’端半部分或序列的3’端半部分中。在一个替代性实施方案中，至少一个酰基-氨基-LNA和/或烃基-氨基-LNA单体存在于寡核苷酸的半序列区段的每一个中，即至少一个存在于序列的5’端半部分并且至少一个存在于序列的3’端半部分。如果寡核苷酸中的核苷酸单元总数是奇数，那么在两个半序列区段中的任一个中都不包含中心核苷酸单体。在一个实施方案中，如果寡核苷酸中的核苷酸单体总数是奇数，那么至少两个酰基-氨基-LNA和/或烃基-氨基-LNA单体中的一个是中心核苷酸单体。这个段落和先前段落的实施方案可以与以上给出的寡核苷酸的长度定义、以上给出的优选核苷间键、以上给出的寡核苷酸中的RNA核苷酸单体的最大数目和/或以上给出的寡核苷酸中的酰基-氨基-LNA和烃基-氨基-LNA单体的数目组合。
接下来描述烃基-氨基-LNA核苷酸单元的烃基部分。烃基(例如烷基)-氨基-LNA核苷酸单元的烃基(例如烷基)是直链或支链，环状(例如环烷基)，或环状基团与直链或支链的组合。烃基(例如烷基)中的碳原子总数小于30。优选地，烃基(例如烷基)中碳原子的最大数目是2，优选地6，优选地7，并且更优选地10。在一个实施方案中，烃基或烷基具有6到30个，优选地7到22个，更优选地10到22个碳原子，甚至更优选地12到20个碳原子，并且最优选地14到18个碳原子。优选地，烃基-氨基-LNA核苷酸单元的烃基是直链或支链，例如直链或支链烃基。烃基-氨基-LNA核苷酸单元的烃基可以未被取代或如以下进一步定义地被取代。
烃基基团或部分是通过从烃上去除氢原子而形成的一价基团。烃基可以是饱和或不饱和的，其可以是直链、支链或环状基团，或其中任一种的组合。直链或支链烃基是优选的。优选直链或支链烃基的实例是烷基、烯基和炔基。优选烷基的具体实例是N-乙基、N-十四基和N-十六基，其中N-十六基是最优选的。最优选的烃基是烷基，尤其是直链或支链烷基。其碳原子数目如上文所指定。
环状烃基的实例是(C4-C8环烷基)和(C4-C8环烯基)，优选地(C5-C7环烷基)。具体实例是环丁基、环戊基、环己基和环庚基。烃基部分可以未被取代或如以下所定义地被取代。环状烷基可以是环烷基。环状烷基的实例是C4-C8环烷基，优选地C5-C7环烷基。具体实例是环丁基、环戊基、环己基和环庚基。
烃基或烷基中的一方面的直链或支链与另一方面的环状基团的组合可以是以下基团：环烷基-烷基、烷基-环烷基、二烷基-环烷基、烷基-环烷基-烷基和环烷基-烷基。这些组合中连接到环烷基部分的一价烷基部分可以是直链或支链并且可以具有1到24个碳原子，优选地2到20个碳原子，更优选地3到16个碳原子，并且最优选地4到12个碳原子。这些组合中的碳原子总数可以如上文关于烃基的碳原子数所指定的那样。
烃基-氨基-LNA核苷酸单体的烃基(例如烷基)可以未被取代或被一个或多个羟基、氨基、硫基、氧代基、烷硫基、醚基和/或硫醇基(巯基)取代。烷硫基可以是C1-C6烷硫基，优选地C1-C3烷硫基。醚基是C1-C10烷氧基，优选地C1-C6烷氧基，更优选地C1-C3烷氧基。其它可能的取代基是C1-C3烷基氨基和二(C1-C3烷基)氨基。因此，烃基(例如烷基)可以是具有以上给出的碳原子数的烃基(例如C7-C22烷基)，其可以被一个或多个选自由以下组成的组的取代基取代：羟基、氨基、硫基、氧代基、C1-C6烷硫基、C1-C6烷硫基(优选地C1-C3烷硫基)、C1-C6烷氧基(优选地C1-C3烷氧基)、C1-C3烷基氨基和二(C1-C3烷基)氨基。
本发明的寡核苷酸中的多个烃基-氨基-LNA核苷酸单元的烃基可以是相同的或不同的。作为烃基-氨基-LNA核苷酸单体的替代物，烃基可以被如以下定义的杂烃基取代。
接下来描述酰基-氨基-LNA核苷酸单元的酰基部分。酰基-氨基-LNA核苷酸单体单元的酰基是基团-C(＝O)R，其连接到氨基-LNA部分的2’-N原子上以形成酰胺基，其中R是有机基团。本发明的寡核苷酸的酰基-氨基-LNA单体单元的酰基是直链或支链、环状或两者的组合，条件是每一个酰基中的碳原子总数小于30。
酰基中的碳原子总数可以是至少2，优选地至少6，更优选地至少7，并且甚至更优选地至少10。在一个实施方案中，酰基具有4到30个碳原子，优选地6到30个，优选地7到22个，更优选地10到22个碳原子，甚至更优选地12到20个碳原子，并且最优选地14到18个碳原子。优选地，酰基-氨基-LNA核苷酸单元的酰基是直链或支链酰基。
酰基可以是烃基羰基或杂烃基-羰基，其中前者是优选的。除了碳原子和氢原子以外，杂烃基部分还含有1到3个选自O、S或N、优选地O的杂原子，优选地1或2个杂原子。因此，酰基可以是具有1到3个氧杂原子的杂烃基羰基。烃基和杂烃基部分可以是饱和的或不饱和的，优选是饱和的。烃基和杂烃基可以未被取代或如以下定义地被取代。
环状酰基可以是环状烃基羰基或杂烃基羰基。环状基团的实例是(C4-C8环烷基)羰基，优选地(C5-C7环烷基)羰基。具体实例是环丁基羰基、环戊基羰基、环己基羰基和环庚基羰基。对应的杂烃基羰基可以是刚刚提到的基团中的任一个，其中1到3个C1单元被O、S、N或NH单元、优选地O取代。烃基和杂烃基部分可以未被取代或如以下定义地被取代。
作为酰基的直链或支链可以是直链或支链烃基羰基或杂烃基羰基。直链或支链(和烃基羰基)可以是烷酰基、烯酰基或炔酰基。对应的杂烃基羰基可以是刚刚提到的基团中的任一个，其中1到3个C1单元被O、S、N或NH单元、优选地O取代。这些基团可以具有2到30个碳原子，优选地7到22个碳原子，更优选地10到22个碳原子，并且最优选地14到18个碳原子。优选的直链或支链(或直链或支链烃基羰基)是烷酰基，例如衍生自饱和脂肪酸的那些。优选烷酰基的具体实例是N-乙酰基、N-肉豆蔻酰基和N-棕榈酰基，其中N-棕榈酰基是最优选的。烃基和杂烃基部分可以未被取代或如以下定义地被取代。
酰基中的一方面的直链或支链与另一方面的环状基团的组合可以是以下烃基羰基：环烷基-烷基羰基、烷基-环烷基羰基、二烷基-环烷基羰基、烷基-环烷基-烷基羰基和环烷基-烷基羰基。对应的杂烃基羰基可以是刚刚提到的基团中的任一个，其中1到3个C1单元被O、S、N或NH单元、优选地O取代。这些组合中连接到环烷基部分的一价烷基部分可以是直链或支链并且可以具有1到24个碳原子，优选地2到20个碳原子，更优选地3到16个碳原子，并且最优选地4到12个碳原子。这些组合中的碳原子总数可以如上文关于酰基的碳原子数所指定的那样。烃基和杂烃基部分可以未被取代或如以下定义地被取代。
酰基-氨基-LNA核苷酸单体的酰基、例如烃基羰基或杂烃基羰基可以未被取代或被(或包含)一个或多个羟基、氨基、硫基、氧代基、烷硫基、醚基和/或硫醇基(巯基)取代。烷硫基可以是C1-C6烷硫基，优选地C1-C3烷硫基。醚基是C1-C12烷氧基，优选地C1-C6烷氧基，优选地C1-C3烷氧基。其它可能的取代基是C1-C3烷基氨基和二(C1-C3烷基)氨基。烃基羰基和/或杂烃基羰基是具有以上给出的碳原子数的酰基，其可以被一个或多个、优选地一个或两个选自由以下组成的组的取代基取代：羟基、氨基、硫基、氧代基、C1-C6烷硫基(优选地C1-C3烷硫基)、C1-C6烷氧基(优选地C1-C3烷氧基)、C1-C3烷基氨基和二(C1-C3烷基)氨基。在一个实施方案中，烃基羰基和/或杂烃基羰基具有以上给出的碳原子数，其可以被一个或多个、优选地一个或两个选自由以下组成的组的取代基取代：羟基、氧代基、C1-C3烷硫基和C1-C3烷氧基。
在优选实施方案中，酰基-氨基-LNA核苷酸单体的酰基部分(例如烃基羰基)是未被取代或被取代的N-烷酰基、N-烯酰基或N-炔酰基，其具有2到30个碳原子，优选地7到22个碳原子，更优选地10到22个碳原子，并且最优选地14到18个碳原子。其中N-烷酰基、例如衍生自饱和脂肪酸的那些是优选的。优选N-烷酰基的具体实例是N-乙酰基、N-肉豆蔻酰基和N-棕榈酰基，其中N-棕榈酰基是最优选的。
在另一个实施方案中，作为酰基的(杂)烃基羰基的碳原子数是2到22个，优选地2到16个，更优选地2到10个，并且甚至更优选地2到6个碳原子，并且烃基羰基未被取代或被一个选自由以下组成的组的取代基取代：羟基、氨基、硫基、氧代基、C1-C6烷硫基(优选地C1-C3烷硫基)、C1-C6烷氧基(优选地C1-C3烷氧基)、C1-C3烷基氨基和二(C1-C3烷基)氨基。在一个子实施方案中，取代基是氨基。这些酰基可以是衍生自α-氨基酸如20种标准氨基酸的酰基。具体实例是衍生自甘氨酸或N-甲基甘氨酸的酰基，从而酰基-氨基-LNA分别是甘氨酰基-氨基-LNA或N-甲基甘氨酰基-氨基-LNA。
本发明的寡核苷酸中的多个酰基-氨基-LNA核苷酸单元的酰基可以是相同的或不同的。
本发明的寡核苷酸可被聚乙二醇化，例如用于改善寡核苷酸的血清半衰期。用聚(乙二醇)(PEG)修饰寡核苷酸在所属领域中是已知的并且由Ikeda和Nagasaki,Journal ofApplied Polymer Sciences 2014,40293综述。本发明的寡核苷酸可以在寡核苷酸的一个或两个核苷酸单元上被聚乙二醇化，例如在一个或两个5’核苷酸单元，或在一个或两个3’端核苷酸单元上，或在5’端或3’端单元上。将PEG连接到寡核苷酸的化学是已知的(参阅例如以上引用的Ikeda和Nagasaki以及其中引用的参考文献)。PEG可以是直链或支链PEG，并且可以具有5到50000个，优选地20到20000个，更优选地100到10000个，并且甚至更优选地500到5000个-CH2CH2O-单元。如果本发明的寡核苷酸在寡核苷酸的一端含有酰基-氨基-LNA或烃基-氨基-LNA核苷酸单元，那么聚乙二醇化可以存在于寡核苷酸的另一端。在一个优选实施方案中，本发明的寡核苷酸没有被聚乙二醇化，因为本发明的寡核苷酸的有利特性允许在即使不经过聚乙二醇化的情况下也能实现足够的血清半衰期以获得高转染效率。
上文例如关于碱基部分、氨基-LNA部分和主链键给出的优选实施方案与本发明的寡核苷酸中的酰基-氨基-LNA和/或烃基-氨基-LNA核苷酸单体的内容可以组合。
本发明的寡核苷酸可以用作反义寡核苷酸。本发明的寡核苷酸可以是缺口体或混合体。本发明还提供共同之处在于都靶向RNA的缺口体反义寡核苷酸、混合体反义寡核苷酸、antimir寡核苷酸和blockmir寡核苷酸的设计和使用。
缺口体是嵌合反义寡核苷酸，其具有RNase H募集核苷酸的中心连续链段，侧接有含有亲和力增强(被修饰)核苷酸(例如LNA、α-L-LNA、BNA、CEt或O2’-烷基化RNA核苷酸)的翼。缺口体可以用于RNase-H介导的反义RNA靶向和其沉默。本发明的缺口体的一般组成是5’-翼-间隔-翼。
RNase H募集核苷酸或核苷酸单体单元(在本文中也称为与RNase H降解相容的核苷酸(或核苷酸单体单元))可以是DNA核苷酸或FANA核苷酸。核苷间键可以是磷酸二酯键或硫代磷酸酯键。优选地，RNase H募集核苷酸是具有磷酸二酯键或硫代磷酸酯键，优选地如上所述的高磷酸二酯含量，更优选地磷酸二酯键的DNA核苷酸。在另一个实施方案中，RNaseH募集核苷酸是具有磷酸二酯键或硫代磷酸酯键的FANA核苷酸。FANA核苷酸意味着2’-脱氧-2’-氟代阿拉伯糖基核苷酸[Kalota,A等人,Nucleic Acids Res.2006,34,451-461]。
亲和力增强单体可以是LNA、α-L-LNA、BNA、CEt或O2’-烷基化(例如2’-O-C1-C6烷基)RNA核苷酸。核苷间键是磷酸二酯键或硫代磷酸酯键，优选地磷酸二酯键。本发明的酰基-氨基-LNA和/或烃基(例如烷基)-氨基-LNA单体属于亲和力增强单体的类别。但是不能排除某些酰基-氨基-LNA和/或烷基-氨基-LNA单体自身并不针对RNA诱导亲和力增加的可能性，然而，这可以通过将上述亲和力增强单体中的其它单体掺入缺口体的翼中或一般来说掺入寡核苷酸内而被调节。因此，亲和力增强单体可以是LNA、α-L-LNA、BNA、CEt或2’O-烷基化RNA核苷酸，和/或本发明的酰基-氨基-LNA和/或烃基(例如烷基)-氨基-LNA单体。在亲和力增强单体的区段中也可以存在DNA核苷酸单体，虽然它们在本文中并不被视为亲和力增强性的。
缺口体可以是从5’端到3’端包含或由以下三个区段组成的寡核苷酸：至少2个核苷酸单元的5’端区段，长度为至少6个核苷酸单元的中心结合区段，和长度为至少2个核苷酸单元的3’端区段，其中所述寡核苷酸在5’端区段或3’端区段中含有至少两个2’-N-酰基-2’-氨基-LNA或2’-N-烃基(例如烷基)-氨基-LNA核苷酸单体，或者在所述末端区段中的每一个中都含有至少一个2’-N-酰基-2’-氨基-LNA或2’-N-烃基(例如烷基)-氨基-LNA核苷酸单体，但在一个更具体的实施方案中，在中心区段中一个也没有。寡核苷酸可以在5’端区段或3’端区段中的核苷酸单元(例如上文更概括地定义的末端单元)上被聚乙二醇化，然而在一个优选实施方案中，寡核苷酸在5’端区段和3’端区段中的核苷酸单元上都没有被聚乙二醇化。5’端和/或3’端区段可以具有至少3个或至少4个核苷酸单元；和/或中心结合区段的长度可以是至少8个或至少10个核苷酸单元。本文中，术语“区段”是指寡核苷酸中的多个邻接核苷酸单体单元。当涉及寡核苷酸的一部分时，术语“元件”有时候在本文中以相同含义使用。
在另一个实施方案中，寡核苷酸是以下组成的缺口体：
NV-MY-NZ，
其中M表示能与靶RNA的RNase H降解相容的核苷酸单体，N表示选自亲和力增强核苷酸单体、本文中定义的酰基-氨基-LNA和/或烃基(例如烷基)-氨基-LNA单体、和/或DNA核苷酸单体的单体，并且其中V、Y和Z指示所述区段中的邻接单体的数目。连字符指示两个翼序列区段(元件)NV和NZ与间隔序列区段(元件)MY之间的键(或标记分隔)；数字V和Z是2到8、优选地2到5的整数，并且数字Y是6到14、优选地8到13的整数，条件是V+Z+Y的总和是10到30，优选地12到26。在一个实施方案(a)中，在所述两个翼区段(元件)、即由N单体单元组成的区段中的每一个中都存在至少一个酰基-氨基-LNA和/或烃基-氨基-LNA单体。在另一个实施方案(b)中，在所述两个翼区段(元件)中的一个中存在至少两个酰基-氨基-LNA和/或烃基-氨基-LNA单体，但是在另一个翼区段中一个也没有。
单链寡核苷酸可以具有以下组成：
5’-(L)2-4-(D)6-10-(L)2-4，
其中D表示DNA核苷酸单体并且L表示亲和力增强核苷酸单体，或本文中定义的酰基-氨基-LNA和/或烃基(例如烷基)-氨基-LNA单体，或DNA单体，或2’-O-烷基-RNA单体，或2’-O-烷氧基烷基-RNA单体。在所述两个翼区段、即由L单体单元组成的区段中的每一个中都存在至少一个酰基-氨基-LNA和/或烃基(例如烷基)-氨基-LNA单体。或者，在所述翼区段中的一个中存在至少两个酰基-氨基-LNA和/或烃基(例如烷基)-氨基-LNA单体单元，另一个翼区段可以没有或可以具有一个或两个酰基-氨基-LNA和/或烃基(例如烷基)-氨基-LNA单体单元。
本发明的混合体可以是含有如上文所定义的被修饰的亲和力增强核苷酸(例如LNA、α-L-LNA、BNA、CEt或O2’-烷基化RNA核苷酸)的嵌合反义寡核苷酸分子。另外，其也可以含有DNA或RNA核苷酸。术语混合体意思是没有组成缺口体、即不受限于通用结构5’-翼-间隔-翼的RNA靶向寡核苷酸。其因此例如可以由交替的DNA和LNA型核苷酸组成，其中至少两个LNA型核苷酸选自酰基-氨基-LNA和/或烃基(例如烷基)-氨基-LNA单体，或者作为另一实例，其可以由大约60-70％的2’-O-Me-RNA和大约30-40％的LNA型核苷酸组成，其中至少两个LNA型核苷酸选自酰基-氨基-LNA和/或烃基(例如烷基)-氨基-LNA单体。被修饰或被取代的RNA、例如2’-O-Me-RNA在本文中不被视为(未被取代的)RNA。当在本文中使用时，术语混合体打算涵盖antimir、blockmir、剪接切换、外显子跳读和空间位阻反义寡核苷酸。
本发明提供具有组成5’-(N)7-26、优选地5’-(N)8-26的单链(混合体反义)寡核苷酸，其中N表示任何核苷酸单体单元，优选地其中至少一个N可以是亲和力增强单体并且其它N可以是任何其它类型的核苷酸单体，条件是至少两个N核苷酸单体单元是如以上所述的酰基-氨基-LNA和/或烃基(例如烷基)-氨基-LNA单体。该组成的序列可以被分成相等数目的核苷酸单元的两个序列区段(元件)，即5’区段和3’区段。在一个实施方案(a)中，每一个序列区段(元件)、即5’区段和3’区段各自含有至少一个酰基-氨基-LNA和/或烃基(例如烷基)-氨基-LNA单体。在另一个实施方案(b)中，在所述两个区段(元件)中的一个中、即5’区段或3’区段中存在至少两个酰基-氨基-LNA和/或烃基(例如烷基)-氨基-LNA单体，但在另一个区段中一个也没有。其中，如果核苷酸单元总数是奇数，即用于确定5’区段和3’区段，那么在所述两个序列区段(元件)中的任一个中都不包含中心核苷酸单体单元。然而，这不排除中心单体单元也可能是酰基-氨基-LNA和/或烃基(例如烷基)-氨基-LNA单体的可能性，所述酰基-氨基-LNA和/或烃基(例如烷基)-氨基-LNA单体可以是所述至少两个酰基-氨基-LNA和/或烃基(例如烷基)-氨基-LNA单体中的一个。在一个替代方案中，在半序列元件中的一个中存在一个酰基-氨基-LNA和/或烃基(例如烷基)-氨基-LNA单体，并且如果核苷酸总数是奇数，那么存在第二酰基-氨基-LNA和/或烃基(例如烷基)-氨基-LNA单体作为中心单体。寡核苷酸的单体通过磷酸二酯键和/或硫代磷酸酯键和/或磷酸三酯键连接，其中以上被描述为优选的磷酸二酯键的百分比对于混合体寡核苷酸也是优选的。
在一个实施方案中，单链混合体反义寡核苷酸具有组成5’-(N)7-12，其中N表示亲和力增强核苷酸和至少两个酰基-氨基-LNA和/或烃基(例如烷基)-氨基-LNA单体，使得所述序列区段(元件)中的每一个都含有至少一个酰基-氨基-LNA和/或烃基(例如烷基)-氨基-LNA单体。在另一个实施方案中，单链混合体反义寡核苷酸具有组成5’-(N)12-22，其中N表示至少四个LNA型亲和力增强单体、多个DNA或2’-OMe-RNA单体、和至少两个酰基-氨基-LNA和/或烃基(例如烷基)-氨基-LNA单体，使得所述序列元件中的每一个都含有至少一个酰基-氨基-LNA和/或烃基(例如烷基)-氨基-LNA单体。在一个其它实施方案中，单链混合体反义寡核苷酸具有组成5’-(N)15-22，其中N表示至少三个LNA型亲和力增强单体、多个2’-OMe-RNA单体、和至少两个酰基-氨基-LNA和/或烃基(例如烷基)-氨基-LNA单体，使得所述序列元件中的每一个都含有至少一个酰基-氨基-LNA和/或烃基(例如烷基)-氨基-LNA单体。
在另一个实施方案中，单链混合体反义寡核苷酸具有组成5’-(N)7-12，其中N构成亲和力增强核苷酸和至少两个酰基-氨基-LNA和/或烃基(例如烷基)-氨基-LNA单体，使得在半序列元件中的一个中、即所述序列的5’端半部分或所述序列的3’端半部分中存在至少两个酰基-氨基-LNA和/或烃基(例如烷基)-氨基-LNA单体，条件是如果核苷酸总数是奇数，那么在所述两个序列元件中的任一个中都不包含中心核苷酸单体。或者，在半序列元件中的一个中存在一个酰基-氨基-LNA和/或烃基(例如烷基)-氨基-LNA单体，并且如果核苷酸总数是奇数，那么存在第二酰基-氨基-LNA和/或烃基(例如烷基)-氨基-LNA单体作为中心核苷酸单体。在另一个实施方案中，单链混合体反义寡核苷酸具有组成5’-(N)12-22，其中N表示至少四个LNA型亲和力增强单体、多个DNA或2’-OMe-RNA单体、和至少两个酰基-氨基-LNA和/或烃基(例如烷基)-氨基-LNA单体，使得半序列元件中的一个中、即所述序列的5’端半部分或所述序列的3’端半部分中存在至少两个酰基-氨基-LNA和/或烃基(例如烷基)-氨基-LNA单体，条件是如果核苷酸总数是奇数，即用于确定5’区段和3’区段，那么在所述两个序列元件中的任一个中都不包含中心核苷酸单体。然而，这不排除中心核苷酸单体单元是酰基-氨基-LNA和/或烃基(例如烷基)-氨基-LNA单体的实施方案。在另一个实施方案中，单链混合体反义寡核苷酸具有组成5’-(N)15-22，其中N表示至少三个LNA型亲和力增强单体、多个2’-OMe-RNA单体、和至少两个酰基-氨基-LNA和/或烃基(例如烷基)-氨基-LNA单体，使得半序列元件中的一个中、即所述序列的5’端半部分或所述序列的3’端半部分中存在至少两个酰基-氨基-LNA和/或烃基(例如烷基)-氨基-LNA单体，条件是如果核苷酸总数是奇数，那么在所述两个序列元件中的任一个中都不包含中心核苷酸单体。
本发明的反义寡核苷酸的通用结构如下：5’-(N)7-30，意味着其由7到30个核苷酸组成。这些核苷酸(核苷酸单体)可以具有从文献获知的任何核苷酸结构，条件是至少两个是酰基-氨基-LNA和/或烃基(例如烷基)-氨基-LNA单体；以上描述的优选实施方案中的任一个都可以和这个通用结构组合。
在以下章节中，描述本发明的反义寡核苷酸的优选实施方案。在本发明的缺口体反义寡核苷酸的一个实施方案中，酰基-氨基-LNA和/或烃基(例如烷基)-氨基-LNA单体中的至少一个位于接近5’端的翼序列元件中，并且酰基-氨基-LNA和/或烃基(例如烷基)-氨基-LNA单体中的至少一个位于接近3’端的翼序列元件中。这模拟混合体情形，其中寡核苷酸的序列可被认为分成相等数目的核苷酸单元的两个序列区段(元件)，即5’区段和3’区段，从而在奇数的情况下，在划分中忽略中心核苷酸单元。通过具有这些组成，所述两个酰基-氨基-LNA和/或烃基(例如烷基)-氨基-LNA单体的作用将互相补充，因此提供改善的特性，例如增加的针对溶核降解的抗性、增加的生物稳定性、增加的生物分布、增加的组织分布、增加的细胞穿透、增加的用于调节体内基因表达的能力、和/或降低的毒性。
如果例如反义寡核苷酸在如上描述的每一个序列区段(元件)中含有一个棕榈酰基-2’-氨基-LNA单体-序列元件在本文中意思是缺口体的两个翼或混合体的每一个序列元件(序列的5’端半部分和3’端半部分)，那么其被包括在本发明中。同样地，如果例如反义寡核苷酸在如上描述的每一个序列元件中含有一个甘氨酰基-氨基-LNA单体，那么其也被包括在本发明中。同样地，如果例如反义寡核苷酸含有一个甘氨酰基-氨基-LNA单体和一个棕榈酰基-氨基-LNA单体，那么它们可以位于两个不同的序列元件中。如果例如反义寡核苷酸含有三个甘氨酰基-氨基-LNA单体，那么它们可以分散在两个序列元件中。类似地，如果在缺口体或混合体反义寡核苷酸中包含超过两个、例如3个、4个、5个或6个酰基-氨基-LNA和/或烃基(例如烷基)-氨基-LNA单体，那么它们可以分散在两个序列元件中。这意味着每一个序列元件都可以含有酰基-氨基-LNA和/或烃基(例如烷基)-氨基-LNA单体中的至少一个。
在可以和以上提及的任一个实施方案组合的一个实施方案中，本发明的寡核苷酸具有通过连接子连接到胆固醇基部分的一个或两个核苷酸单体。胆固醇基部分可以通过其连到磷酸二酯核苷间键的羟基连接到核苷酸，例如如WO2014/005596中所描述。或者，胆固醇基部分可以连接到寡核苷酸中的另一个2’-氨基LNA核苷酸单元的2’-氨基。后者的实例如下：
左边显示胆固醇基通过氨基甲酸酯键连接到氨基-LNA单体(这里示为磷酸二酯衍生物)的一个实例。右边显示胆固醇基通过可变连接子X连接到氨基-LNA单体(这里示为磷酸二酯衍生物)的一个实例，X可以是1,6-己二基单元或己酰-6-基连接子(即N2’-酰化衍生物)；X替代性地可以是各种组成的更短或更长连接子，优选地可以具有2到20个碳原子的基于直链烷二基或烷酰基的连接子。
在一个通常优选的实施方案A替代方案(i)中，缺口体寡核苷酸具有以上定义的组成NV-MY-NZ。在另一个优选的实施方案B中，缺口体反义寡核苷酸的组成如下：5’-LLL-DDDDDDDDD-LLL，其中D表示DNA核苷酸单体，L表示亲和力增强核苷酸单体或酰基-氨基-LNA和/或烷基-氨基-LNA单体，并且连字符指示两个翼序列元件与间隔序列元件之间的分隔(键)。在另一个优选的实施方案C中，缺口体反义寡核苷酸的组成如下：5’-LL-DDDDDDDD-LL，其中D表示DNA核苷酸单体，L表示亲和力增强核苷酸单体或酰基-氨基-LNA和/或烃基(例如烷基)-氨基-LNA单体，并且连字符指示两个翼序列元件(由L核苷酸单元组成)与中心间隔序列元件(由D核苷酸单元组成)之间的分隔(键)。在另一个优选的实施方案D中，缺口体反义寡核苷酸的组成如下：5’-LLLL-DDDDDDDD-LLLL，其中D表示DNA核苷酸单体，L表示亲和力增强核苷酸单体或酰基-氨基-LNA和/或烃基(例如烷基)-氨基-LNA单体，并且连字符指示两个翼序列元件与间隔序列元件之间的分隔(键)。在另一个优选的实施方案E中，缺口体反义寡核苷酸的组成具有以上定义的式5’-(L)2-4-(D)6-10-(L)2-4。为了清楚，应注意指示两个翼序列元件与间隔序列元件之间的间隔(键)的连字符各自可以是硫代磷酸酯键(L与D单体之间)、磷酸二酯键(L与D单体之间)或磷酸三酯键(L与D单体之间)；寡核苷酸的所有单体单元可以通过相同的键连接。
在先前段落的实施方案(实施方案A-E)中，在一个子实施方案中，每一个翼区段中的一个单体L可以是酰基-氨基-LNA单体，其中酰基是脂肪酸残基(例如棕榈酰基)。在另一个子实施方案中，每一个翼中的一个单体L是含有嘧啶核碱基的棕榈酰基-氨基-LNA单体。在另一个子实施方案中，每一个翼中的一个单体L是含有嘧啶核碱基的肉豆蔻酰基-氨基-LNA单体。在另一个子实施方案中，至少一个单体L是含有嘧啶核碱基的棕榈酰基-氨基-LNA单体。在另一个子实施方案中，至少一个单体L是含有嘧啶核碱基的肉豆蔻酰基-氨基-LNA单体。在另一个子实施方案中，一个翼中的一个单体L是肉豆蔻酰基-氨基-LNA单体，并且另一个翼区段中的另一个单体L是甘氨酰基-氨基-LNA单体。在另一个子实施方案中，至少一个单体L是含有嘧啶核碱基的甘氨酰基-氨基-LNA单体。在另一个子实施方案中，至少一个单体L是含有嘧啶核碱基的赖氨酰基-氨基-LNA单体。
在实施方案A-E的一个优选子实施方案中，所述翼元件中的一个中的两个单体L是酰基-氨基-LNA单体，其中酰基是脂肪酸残基(例如棕榈酰基)。在实施方案A-E的另一个优选子实施方案中，所述翼元件中的一个中的两个单体L是含有嘧啶核碱基的棕榈酰基-氨基-LNA单体。在实施方案A-E的另一个优选子实施方案中，所述翼元件中的一个中的两个单体L是含有嘧啶核碱基的肉豆蔻酰基-氨基-LNA单体。
在一个优选实施方案F中，本发明的混合体反义寡核苷酸具有组成5’-(N)7-26，其中N表示至少一个亲和力增强单体并且另外可以表示任何其它类型的已知核苷酸单体，条件是至少两个N核苷酸是酰基-氨基-LNA和/或烃基(例如烷基)-氨基-LNA单体并且每一个序列元件(参见上文)都含有至少一个酰基-氨基-LNA和/或烃基(例如烷基)-氨基-LNA单体。
在一个优选实施方案G中，混合体反义寡核苷酸具有组成5’-(N)7-12，其中N构成亲和力增强核苷酸和至少两个酰基-氨基-LNA和/或烃基(例如烷基)-氨基-LNA单体，使得每一个序列元件(参见上文)都含有至少一个酰基-氨基-LNA和/或烃基(例如烷基)-氨基-LNA单体。
在一个优选实施方案H中，本发明的混合体反义寡核苷酸具有组成5’-(N)12-22，其中N表示至少四个LNA型亲和力增强单体、多个DNA或2’-OMe-RNA单体、和至少两个酰基-氨基-LNA和/或烃基(例如烷基)-氨基-LNA单体，使得每一个序列元件(参见上文)都含有至少一个酰基-氨基-LNA和/或烃基(例如烷基)-氨基-LNA单体。
在另一个优选实施方案I中，本发明的混合体反义寡核苷酸具有组成5’-(N)15-22，其中N表示至少三个LNA型亲和力增强单体、多个2’-OMe-RNA单体、和至少两个酰基-氨基-LNA和/或烃基(例如烷基)-氨基-LNA单体，使得每一个序列元件(参见上文)都含有至少一个酰基-氨基-LNA和/或烃基(例如烷基)-氨基-LNA单体。
在实施方案F到I的一个优选子实施方案中，每一个序列元件中的一个单体N是酰基-氨基-LNA单体，其中酰基是脂肪酸残基(例如棕榈酰基)。
在实施方案F到I的另一个优选子实施方案中，每一个序列元件中的一个单体N是含有嘧啶核碱基的棕榈酰基-氨基-LNA单体。
在实施方案F到I的另一个优选子实施方案中，每一个序列元件中的一个单体N是含有嘧啶核碱基的肉豆蔻酰基-氨基-LNA单体。
在实施方案F到I的一个优选子实施方案中，至少一个单体N是酰基-氨基-LNA单体，其中酰基是脂肪酸残基(例如棕榈酰基)。
在实施方案F到I的另一个优选子实施方案中，至少一个单体N是含有嘧啶核碱基的棕榈酰基-氨基-LNA单体。
在实施方案F到I的另一个优选子实施方案中，至少一个单体N是含有嘧啶核碱基的肉豆蔻酰基-氨基-LNA单体。
在实施方案F到I的另一个优选子实施方案中，每一个序列元件中的一个单体N是肉豆蔻酰基-氨基-LNA单体并且另一个单体N是甘氨酰基-氨基-LNA单体。
在实施方案F到I的另一个优选子实施方案中，至少一个单体N是含有嘧啶核碱基的甘氨酰基-氨基-LNA单体。
在实施方案F到I的另一个优选子实施方案中，至少一个单体N是含有嘧啶核碱基的赖氨酰基-氨基-LNA单体。
在实施方案A到I的一个子实施方案中，存在至少一个含有金刚烷基作为酰基部分的酰基-氨基-LNA单体。
在实施方案A到I的另一个子实施方案中，存在至少一个乙酰基-氨基-LNA单体。
在实施方案A到I的一个优选子实施方案中，存在一个到三个氨基-LNA单体(即未被官能化的2’-NH-LNA)，以便介导因质子化作用(质子化N-2’衍生物的公开pKa值是约6.1)引起的内体逃逸(endosomal escape)。
在一个优选实施方案F’中，本发明的混合体反义寡核苷酸具有组成5’-(N)7-26，其中N表示至少一个亲和力增强单体并且另外可以表示任何其它类型的已知核苷酸单体，条件是至少两个N核苷酸是酰基-氨基-LNA和/或烃基(例如烷基)-氨基-LNA单体，并且所述序列元件(参见上文)中的一个含有至少两个酰基-氨基-LNA和/或烃基(例如烷基)-氨基-LNA单体。
在一个优选实施方案G’中，混合体反义寡核苷酸具有组成5’-(N)7-12，其中N构成亲和力增强核苷酸和酰基-氨基-LNA和/或烃基(例如烷基)-氨基-LNA单体，条件是至少两个N核苷酸是酰基-氨基-LNA和/或烃基(例如烷基)-氨基-LNA单体，并且所述序列元件(参见上文)中的一个含有至少两个酰基-氨基-LNA和/或烃基(例如烷基)-氨基-LNA单体。
在一个优选实施方案H’中，本发明的混合体反义寡核苷酸具有组成5’-(N)12-22，其中N表示至少四个LNA型亲和力增强单体、多个DNA或2’-OMe-RNA单体、和至少两个酰基-氨基-LNA和/或烃基(例如烷基)-氨基-LNA单体，条件是所述序列元件(参见上文)中的一个含有至少两个酰基-氨基-LNA和/或烃基(例如烷基)-氨基-LNA单体。
在另一个优选实施方案I’中，本发明的混合体反义寡核苷酸具有组成5’-(N)15-22，其中N表示至少三个LNA型亲和力增强单体、多个2’-OMe-RNA单体、和至少两个酰基-氨基-LNA和/或烃基(例如烷基)-氨基-LNA单体，条件是所述序列元件(参见上文)中的一个含有至少两个酰基-氨基-LNA和/或烃基(例如烷基)-氨基-LNA单体。
在实施方案F’到I’的一个优选子实施方案中，所述序列元件中的一个中的两个N单体是酰基-氨基-LNA单体，其中酰基是脂肪酸残基(例如棕榈酰基)。
在实施方案F’到I’的另一个优选子实施方案中，所述序列元件中的一个中的两个N单体是含有嘧啶核碱基的棕榈酰基-氨基-LNA单体。
在实施方案F’到I’的另一个优选子实施方案中，所述序列元件中的一个中的两个N单体是含有嘧啶核碱基的肉豆蔻酰基-氨基-LNA单体。
在实施方案F’到I’的一个优选子实施方案中，所述序列元件中的一个中的两个N单体是酰基-氨基-LNA单体，其中酰基是脂肪酸残基(例如棕榈酰基)。
在实施方案F’到I’的另一个优选子实施方案中，所述序列元件中的一个中的两个N单体是含有嘧啶核碱基的棕榈酰基-氨基-LNA单体。
在实施方案F’到I’的另一个优选子实施方案中，所述序列元件中的一个中的两个N单体是含有嘧啶核碱基的肉豆蔻酰基-氨基-LNA单体。
在实施方案F’到I’的另一个优选子实施方案中，一个单体N是肉豆蔻酰基-氨基-LNA单体并且另一个单体N是甘氨酰基-氨基-LNA单体。
在一个优选实施方案中，所有的核苷间键都是磷酸二酯键。
在一个实施方案中，所有的核苷间键都是硫代磷酸酯键。
本发明包括脂质纳米粒子、其它纳米颗粒和树枝状聚合物(树枝状大分子)制剂，以及其它由缺口体或混合体反义寡核苷酸组成或包括缺口体或混合体反义寡核苷酸的纳米材料。
本发明包括反义寡核苷酸的缀合物、例如天线状低聚半乳糖衍生物作为一个实施方案。
本发明包括反义寡核苷酸与天线状单体、二聚体或三聚体半乳糖基或N-乙酰氨基半乳糖基部分的3’端或5’端缀合物作为一个优选实施方案。
本发明的反义寡核苷酸可用于调节体外或体内基因表达，例如用以诊断疾病或治疗疾病。
在一个优选实施方案中，本发明的反义寡核苷酸能够结合到血浆蛋白上，这增加人体中RNA复合物的保留。
在一个优选实施方案中，本发明的反义寡核苷酸缀合到已知可介导改善的生物分布、细胞膜穿透性、组织生物分布等的基团上。所属领域技术人员已知的此类基团的实例是细胞穿透肽、胆固醇、半乳糖或α-生育酚部分。
在本发明的另一个实施方案中，反义寡核苷酸相对于没有酰基-氨基-LNA和烃基(例如烷基)-氨基-LNA单体的对应反义寡核苷酸产生降低的免疫应答。
在本发明的另一个实施方案中，反义寡核苷酸相对于没有酰基-氨基-LNA和烃基(例如烷基)-氨基-LNA单体的对应反义寡核苷酸展示降低的毒性。
在本发明的另一个实施方案中，反义寡核苷酸相对于没有酰基-氨基-LNA和烃基(例如烷基)-氨基-LNA单体的对应反义寡核苷酸具有延长的作用。
在另外一个实施方案中，本发明的反义寡核苷酸被有效地运送到人或动物的特定器官或组织。
在另外一个实施方案中，本发明的反义寡核苷酸能够有效穿透细胞膜。
本发明的反义和适体寡核苷酸可以在其序列的一个半区段中含有至少两个酰基-氨基-LNA和/或烃基(例如烷基)-氨基-LNA核苷酸。这种设计意外地共同产生非常吸引人的特性，即和人血清白蛋白的很高结合，这限制肾排泄并且导致改善的生物分布和生物作用。本发明的反义和适体寡核苷酸可以在其序列的一个半区段中含有至少两个酰基-氨基-LNA和/或烃基(例如烷基)-氨基-LNA核苷酸，使得两个酰基-氨基-LNA和/或烷基-氨基-LNA核苷酸位于次末的4个核苷酸中。本发明的反义和适体寡核苷酸可以在其序列的一个半区段中含有至少两个酰基-氨基-LNA和/或烷基-氨基-LNA核苷酸，使得两个酰基-氨基-LNA和/或烃基(例如烷基)-氨基-LNA核苷酸作为两个最外端的(位于末端的)核苷酸定位。
本发明公开如何修饰适体以改善生物分布和生物利用度。这通过使用包含至少两个根据本发明的酰基-和/或烃基(例如烷基)-氨基-LNA单体单元作为适体的寡核苷酸实现。这将导致改善的和血浆蛋白如人血清白蛋白的结合，从而增加循环时间，即阻碍快速清除并且从而减轻与更大的分子实体如PEG或纳米颗粒制剂缀合的需求。
本发明提供含有酰基-和/或烃基(例如烷基)-氨基-LNA单体的寡核苷酸作为适体。这些适体例如可用作抗增殖剂和抗癌药或用作药物递送装置。被酰基-和/或烃基(例如烷基)-氨基-LNA修饰的适体(aptamersay)也可以用于对抗其它疾病。
在一个实施方案中，本发明的适体的所有酰基-和/或烃基(例如烷基)-氨基-LNA单体单元都连续地连接到本专利适体(patent aptamer)的一端。
在另一个实施方案中，本发明的适体的每一端都含有至少一个酰基-和/或烃基(例如烷基)-氨基-LNA单体。
在另外一个实施方案中，母体适体中所包含的核苷酸中的两个或更多个已经各自被酰基-和/或烃基(例如烷基)-氨基-LNA单体取代。
在其它实施方案中，产生以上三个实施方案的组合，使得得到的适体含有至少两个酰基-和/或烃基(例如烷基)-氨基-LNA单体。
一个实施方案包括总共含有2到4个酰基-和/或烃基(例如烷基)-氨基-LNA核苷酸的适体。
在另一个实施方案中，本发明的适体总共含有两个酰基-和/或烃基(例如烷基)-氨基-LNA核苷酸。
在一个优选实施方案中，本发明的适体含有两个棕榈酰基-氨基-LNA核苷酸。
本发明的适体可以使用标准自动化核酸合成方法合成，所述方法对于本发明的其它构建体也举例说明。这样，各种被修饰和未被修饰的核苷酸可以与酰基-和/或烃基(例如烷基)-氨基-LNA单体混合以便产生本发明的适体。
本发明的寡核苷酸可用于调节生物应答，这对于体内疾病干预或治疗是重要的。
本发明的反义寡核苷酸可以通过所属领域技术人员已知的自动化寡核苷酸合成法制备。本发明的酰基-氨基-LNA和烷基-氨基-LNA单体掺入到本发明的寡核苷酸中是遵循寡核苷酸合成、处理、纯化和分离的标准方法[F.Eckstein,Oligonucleotides andAnalogues,IRL Press,Oxford University Press,1991]，存在已公开的修改[Johannsen,M.W.等人,Org.Biomol.Chem.,2011,9,243]。预先已经合成了可用于制造本发明的寡核苷酸的一些酰基-氨基-LNA和烷基-氨基-LNA单体，并且已经报道了用于制备所述单体的用于自动化寡核苷酸合成的亚磷酰胺结构单元的程序[Johannsen,M.W.等人,Org.Biomol.Chem.,2011,9,243][I.K.Astakhova和J.Wengel,Acc.Chem.Res.,2014,47,1768和其中引用的参考文献]。
本发明的寡核苷酸可以用在动物、例如哺乳动物并且优选地人的治疗中。治疗可以是癌症治疗。本发明还提供用作药物的本发明的寡核苷酸。本发明还提供用于诊断如分子诊断中的本发明的寡核苷酸。本发明还提供用于疾病预后中的本发明的寡核苷酸。对于所属领域技术人员显而易见的是，本发明的反义和适体寡核苷酸可被设计成靶向特异性基因和基因产物。应了解反义寡核苷酸可用于靶向RNA序列。然而，如果基因产物如蛋白质的相关mRNA或非编码RNA例如通过RNA降解或翻译抑制而被修饰，那么基因产物如蛋白质的水平可受到间接影响。编码蛋白质的基因的表达也可能受到影响，例如因为DNA甲基化。
本发明的反义和适体寡核苷酸可以用作药物。一旦确认了治疗靶点，所属领域技术人员就可以设计影响靶点的水平和活性的寡核苷酸，因为反义寡核苷酸的特异性只位于反义寡核苷酸的序列和组成中。
本发明还提供一种医药组合物，其包含本发明的反义寡核苷酸和药学上可接受的赋形剂，例如稀释剂、载体或佐剂。
包含本发明的寡核苷酸的医药组合物可以在生理学上可接受的介质(例如去离子水、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、盐水、乙醇或其它醇水溶液、血浆、蛋白质溶液、甘露醇、葡萄糖水溶液、植物油等)中像所属领域中已知的那样给药。因此，本发明的另一个实施方案涉及一种医药组合物，其包含寡核苷酸以及合适的赋形剂。也可以包含缓冲剂，尤其在介质通常被缓冲在约5到10的范围内的pH的情况下，其中缓冲剂一般在约50到250mM盐的浓度范围，其中盐浓度一般在约5到500mM的范围，生理学上可接受的稳定剂等。寡核苷酸或组合物可被冻干以方便储存和运输。因此，在本发明的另一个实施方案中，组合物包含一种或多种赋形剂、稀释剂和/或载体。水性悬浮液可以含有和赋形剂混合的适合于制造水性悬浮液的活性物质。所述赋形剂包括悬浮剂，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基-甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍胶和阿拉伯树胶；分散剂或湿润剂可以是天然存在的磷脂如卵磷脂，或环氧烷与脂肪酸的缩合产物，如聚氧乙烯硬脂酸酯，或环氧乙烷与长链脂肪族醇的缩合产物，如十七碳乙烯氧基鲸蜡醇，或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物，如聚氧乙烯山梨醇单油酸酯，或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物，如聚乙烯脱水山梨醇单油酸酯。另一种可能的赋形剂是白蛋白，如人血清白蛋白。
水性悬浮液还可以含有一种或多种防腐剂如对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸正丙酯、一种或多种着色剂、一种或多种调味剂以及一种或多种甜味剂如蔗糖或糖精。然而，优选的是，医药组合物不包含防腐剂，但是是无菌的并封装在单剂量单元中。
可以通过将活性成分悬浮在植物油(例如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油)或矿物油(例如液体石蜡)中来配制油性悬浮液。油性悬浮液可以含有增稠剂，例如蜂蜡、硬石蜡或鲸蜡醇。可以添加甜味剂和着色剂以提供可口的口服制剂。这些组合物可以通过添加抗氧化剂如抗坏血酸来防腐。
适合于通过添加水制备水性悬浮液的可分散粉末和颗粒提供活性成分(例如采取冻干形式)与分散剂或湿润剂、悬浮剂和一种或多种防腐剂的混合物。合适的分散剂或湿润剂或悬浮剂由以上已经提及的那些举例说明。也可以存在另外的赋形剂，例如甜味剂、调味剂和着色剂。本发明的组合物也可以采取水包油乳液的形式。油相可以是植物油或矿物油或其混合物。
合适的乳化剂可以是天然存在的树胶，例如阿拉伯树胶或黄蓍胶；天然存在的磷脂，例如大豆卵磷脂；和衍生自脂肪酸和己糖醇酐的酯或偏酯，例如脱水山梨醇单油酸酯；和所述偏酯与环氧乙烷的缩合产物，例如聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯。乳液也可以含有甜味剂和调味剂。本发明的化合物可以在无菌介质中肠胃外给药。
取决于所用的运载体和浓度，单独的或与赋形剂组合的寡核苷酸可以悬浮或溶解在运载体中。有利地，佐剂如局部麻醉剂、防腐剂和缓冲剂可以溶解在运载体中。
如所属领域中同样已知的，寡核苷酸和医药组合物通常肠胃外给药，例如静脉内(IV)、动脉内(LA)、肌肉内(LM)、皮下(SC)、经粘膜、口服等。给药可以通过输液进行，或者其可以是经粘膜的、口服的、经鼻的、经直肠的、经皮的或气雾剂，其中缀合物的本质允许传递到血管系统。通常将使用单次注射，虽然必要时也可以使用多次注射。给药可以通过任何便利的装置，包括注射器、套管针、导管等。具体给药方式将取决于待给药的浓度、单次弹丸给药还是连续给药等变化。给药可以是静脉内的，其中引入部位对于本发明不是关键的，优选地在存在快速血流的部位(例如静脉内、外周静脉或中心静脉)处。优选地，给药途径是经粘膜或口服。其它给药途径也是适用的，例如其中将给药与缓释技术或保护性基质联合。
作为活性成分的寡核苷酸的剂量水平大约是每天每千克体重约0.1mg到约140mg，这在所描述的病症的治疗中是适用的(每天每名患者约0.5mg到约7g)。可以和载体物质组合以产生单一剂型的活性成分的量可以取决于治疗的宿主和具体给药模式而变化。用于给药的寡核苷酸的浓度可以在约1pg/ml到100mg/ml的范围，给药前。静脉内给予的总量通常将在约0.1mg到约500mg、优选地约1mg到约250mg的范围。
可配制本发明的组合物用于预期目的。因此，本发明的一个实施方案涉及一种被配制成用于口服或经粘膜给药的组合物。
医疗用途和治疗
寡核苷酸或医药组合物可用于治疗哺乳动物的疾病，其中特定基因的基因表达的抑制是有益的。用于治疗目的的“哺乳动物”是指被归类为哺乳动物的任何动物，包括人、家畜和农场动物以及动物园动物或体育动物(sports animal)，例如狗、马、猫、牛等。优选地，哺乳动物是人。可以治疗的疾病是可以通过下调或沉默基因或其产物而得到治疗的疾病，例如WO 2014/005596中给出的那些。这些疾病包括但不限于癌症、自身免疫疾病、病毒感染和细菌感染、内分泌系统疾病、神经疾病(包括中枢和外周神经系统疾病)、心血管疾病、肺病和生殖系统疾病。
在本发明的一个实施方案中，本发明的寡核苷酸和组合物可用于改善和/或治疗癌症和其它过度增殖病症。癌细胞的特征通常是基因的异常表达。本发明提供治疗的癌症和其它过度增殖病症包括但不限于：与结缔组织和肌肉骨骼系统组织有关的肿瘤，例如纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、粘液肉瘤、软骨肉瘤、骨原性肉瘤、脊索瘤和脂肪肉瘤；位于腹部、骨、脑、乳房、结肠、消化系统、内分泌腺(肾上腺、甲状旁腺、脑垂体、睾丸、卵巢、胸腺、甲状腺)、眼睛、头和颈、肝、淋巴系统、神经系统(中枢和外周)、胰腺、骨盆、腹膜、皮肤、软组织、脾、胸部和泌尿生殖道中的肿瘤；白血病(包括急性早幼粒细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性粒细胞白血病、原粒细胞白血病、早幼粒细胞性白血病、粒单核细胞白血病、单核细胞白血病、红白血病)；淋巴瘤(包括霍奇金和非霍奇金淋巴瘤)；多发性骨髓瘤；结肠癌；前列腺癌；肺癌；小细胞肺癌；支气管癌；睾丸癌；宫颈癌；卵巢癌；乳腺癌；血管肉瘤；淋巴管肉瘤；内皮肉瘤；淋巴管内皮肉瘤；滑膜瘤；间皮瘤；尤文肉瘤(Ewing’s sarcoma)；平滑肌肉瘤；鳞状细胞癌；基底细胞癌；胰腺癌；肾细胞癌；肾母细胞瘤(Wilm’s tumor)；肝细胞瘤；胆管癌；腺癌；上皮癌；黑素瘤；汗腺癌；皮脂腺癌；乳头状癌；乳头状腺癌；神经胶质瘤；星形细胞瘤；髓母细胞瘤；颅咽管瘤；室管膜瘤；松果体瘤；成血管细胞瘤；听神经瘤；少突神经胶质瘤；脑膜瘤；神经母细胞瘤；视网膜母细胞瘤；膀胱癌；胚胎癌；囊腺癌；髓样癌；绒毛膜癌和精原细胞瘤。
因此，本发明的一方面涉及本文所述的寡核苷酸用于治疗受益于肠递送的疾病(例如以上所述的癌症、炎性疾病)的用途。
本发明的另一方面涉及本文所述的寡核苷酸用于药物的肠递送的用途。本发明的另一个应用涉及调控和疾病有关的转录物或蛋白质的基因表达。本发明的另一个应用涉及一种治疗疾病的方法，其包括将本发明的寡核苷酸或组合物给予有需要的哺乳动物。
本发明另外提供一种介导细胞或生物体中靶核酸的核酸修饰的方法，其包括以下步骤：
a.在可以发生靶核酸的修饰的条件下将细胞或生物体与本发明的反义寡核苷酸接触；和
b.从而介导靶核酸的修饰。
介导靶核酸的核酸修饰的方法可以在体外或体内、即在动物如哺乳动物体内或在人体内进行。介导靶核酸的核酸修饰的方法可以替代性地在细胞培养物中或在分离的细胞上进行。在一个优选实施方案中，所述方法的核酸修饰是基因沉默(＝基因表达的下调)，优选地是靶mRNA的降解或靶mRNA的翻译抑制或其它类型的RNA(例如非编码RNA)的抑制。因此，本发明提供一种介导细胞或生物体中的基因沉默的方法，其包括将所述细胞或生物体与本发明的反义寡核苷酸接触。在另一个实施方案中，本发明提供一种调节细胞或生物体如人中的剪接事件以提供基因产物的方法，所述基因产物能够缓解以发生故障的RNA剪接作为一个原因的疾病。
本发明的另一方面是一种检查细胞或生物体中的基因的功能的方法，其包括：
a.将对应于所述基因的本发明的反义寡核苷酸引入到细胞或生物体中，从而产生测试细胞或测试生物体；
b.将测试细胞或测试生物体维持在可以发生靶核酸的修饰的条件下；和
c.观测在步骤b中产生的测试细胞或生物体的表型，并且任选地比较观测到的表型与适当对照细胞或对照生物体的表型，从而提供关于所述基因的功能的信息。
细胞优选地是动物细胞，例如哺乳动物细胞或人细胞。在检查细胞或生物体中的基因功能的方法的优选实施方案中，所述方法在细胞培养物中、在体外或在体内进行。在另外一个实施方案中，所述方法在分离的细胞上进行。
本发明的反义寡核苷酸可以例如使用所属领域技术人员已知的转染或gymnotic递送引入到细胞中。寡核苷酸可以例如通过所属领域技术人员已知的静脉内或皮下注射，或者通过所属领域技术人员已知的其它引入方法引入到生物体中。
关于基因功能所获得的信息可用于确定基因产物是否是和特定疾病有关的治疗干预的合适靶点。因此，如果证实某一基因产物以已知在例如特定癌症亚型中受影响的某一生物化学路径起作用，那么所述基因产物可能是用于治疗以上提及的癌症亚型的治疗干预的合适靶点。
在检查细胞或生物体中的基因功能的方法的一个优选实施方案中，所述方法的核酸修饰是基因沉默(＝基因表达的下调)，优选地是靶mRNA的降解或靶RNA的翻译抑制。
本发明的另一方面是一种评估药剂是否作用于基因产物的方法，其包括以下步骤
a.将对应于所述基因的本发明的反义寡核苷酸引入到细胞或生物体中，从而产生测试细胞或测试生物体；
b.将测试细胞或测试生物体维持在发生靶核酸的修饰的条件下；
c.将药剂引入到测试细胞或测试生物体中；和
d.观测在步骤c中产生的测试细胞或生物体的表型，并且任选地比较观测到的表型与适当对照细胞或对照生物体的表型，从而提供关于所述药剂是否作用于所述基因产物的信息。
在评估药剂是否作用于基因或基因产物的方法的一个优选实施方案中，所述方法的核酸修饰是基因沉默(＝基因表达的下调)，优选地是靶RNA的降解或靶RNA的翻译抑制。在评估药剂是否作用于基因产物的方法的优选实施方案中，所述方法在细胞培养物中、在体外或在体内进行。在另外一个实施方案中，所述方法在分离的细胞上进行。
本发明的寡核苷酸也适用于研究目的。举例来说，如何使用包括被化学修饰的寡核苷酸在内的寡核苷酸研究基因功能是众所周知的。这包括在可以发生细胞膜穿透的条件下将寡核苷酸添加到细胞培养物中。通过将序列设计成和靶基因或靶核酸互补，可以评估所述RNA/核酸靶向的作用。这例如实现了评估所述给定基因的表达的重要性和作用。这项研究因此对于评估给定基因的表达(例如由所述基因编码的蛋白质)与给定疾病的发展的关联性是重要的。因此，本发明还提供一种含有根据本发明的寡核苷酸的试剂。所述试剂可以另外含有赋形剂，例如以上提及的那些赋形剂中的任一种或多种。
实施例
实施例1.酰基-氨基-LNA和烃基-氨基-LNA单体的合成
先前已经合成了本发明的一些酰基-氨基-LNA和烃基-氨基-LNA单体，并且已经报道了用于制备所述单体的用于自动化寡核苷酸合成的亚磷酰胺结构单元的程序[Madsen,A.S.等人,J.Org.Chem.2012,77,10718][Johannsen,M.W.等人,Org.Biomol.Chem.,2011,9,243][I.K.Astakhova和J.Wengel,Acc.Chem.Res.,2014,47,1768和其中引用的参考文献]。这些方法对于所属领域技术人员是众所周知的，并且可用于合成其它酰基-氨基-LNA和烃基-氨基-LNA单体的亚磷酰胺结构单元。
实施例2.本发明的寡核苷酸的合成
通过所属领域技术人员已知的自动化寡核苷酸合成法制备本发明的寡核苷酸。本发明的酰基-氨基-LNA和烃基(例如烷基)-氨基-LNA单体掺入到本发明的寡核苷酸中是遵循寡核苷酸合成、处理、纯化和分离的标准方法[F.Eckstein,Oligonucleotides andAnalogues,IRL Press,Oxford University Press,1991]，存在公开的细微修改[Johannsen,M.W.等人,Org.Biomol.Chem.,2011,9,243][I.K.Astakhova和J.Wengel,Acc.Chem.Res.,2014,47,1768和其中引用的参考文献]。
本发明的酰基-氨基-LNA和烃基(例如烷基)-氨基-LNA的结构在以下举例说明(MeC代表5-甲基胞嘧啶-1-基)：
用于比较的LNA核苷酸单体的结构：
嘧啶乙酰基-氨基-LNA单体的结构：
嘧啶棕榈酰基-氨基-LNA单体的结构：
嘧啶甘氨酰基-氨基-LNA单体的结构[备注：酰基取代基的氨基将在生理pH下质子化]：
实施例3.缺口体反义寡核苷酸的反义活性
在利用非辅助式递送(即没有添加转染剂)的细胞培养的比较研究中，在其中大部分是标准LNA-DNA-LNA(3-9-3)型的一系列缺口体反义寡核苷酸中，以下反义寡核苷酸是最好的：
SEQ ID NO:27：5’-IG X X-dC dT dC dG dA dG dC dG dT-X X IC[全部PS核苷间键]，
其中IG和IC是LNA核苷酸，dC、dA、dG和dT是DNA核苷酸，并且X代表嘧啶甘氨酰基-氨基-LNA单体(参见以上结构)。
作为实例，以下组成的序列在类似研究中也是有效的：
SEQ ID NO:28：5’-IG P L-dC dT dC dG dA dG dC dG dT-L P IC[全部PS核苷间键]，
SEQ ID NO:29：5’-IG P X-dC dT dC dG dA dG dC dG dT-X P IC[全部PS核苷间键]，
其中P是胸腺嘧啶棕榈酰基-氨基-LNA单体(参见以上结构)，dC、dA、dG和dT是DNA核苷酸，IT和IG是LNA核苷酸，L是嘧啶LNA单体，并且X是甘氨酰基-氨基-LNA单体(参见以上结构)。
基于这个实验得出以下结论：
a)本发明的反义构建体在非辅助式递送条件(“自主(gymnotic)递送”)下可以有效沉默(即下调)靶基因，和
b)本发明的寡核苷酸构建体的氨基-LNA单体可以同时位于LNA(氨基-LNA)-DNA-LNA(氨基-LNA)缺口体反义寡核苷酸的两个“翼”中(两个翼的每一个中都存在棕榈酰基-氨基-LNA单体)，并且所述构建体是生物活性的。
实施例4.本发明的缺口体反义寡核苷酸的白蛋白结合
图1给出针对白蛋白结合评估的反义寡核苷酸(ODN)的示意图。下表总结棕榈酰基化的氨基-LNA单体的数目，和哪些ONN具有硫代磷酸酯(“+”)核苷间键。不存在硫代磷酸酯(“-”)意味着核苷间键是磷酸二酯键。
以下显示6个寡核苷酸的序列：
ON7451 5’-TAGcctgtcacttCTC(全-PO)SEQ ID NO:1
ON7452 5’-PAGcctgtcacttCTC(全-PO)SEQ ID NO:2
ON7453 5’-PAGcctgtcacttP*TC(全-PO)SEQ ID NO:3
ON7454 5’-TAGcctgtcacttCTC(全-PS)SEQ ID NO:4
ON7455 5’-PAGcctgtcacttCTC(全-PS)SEQ ID NO:5
ON7456 5’-PAGcctgtcacttP*TC(全-PS)SEQ ID NO:6
P和P*分别表示棕榈酰基-氨基-LNA胸腺嘧啶和棕榈酰基-氨基-LNA 5-甲基-胞嘧啶单体。A、C、G和T表示LNA单体，并且a、c、g和t表示DNA单体。
用滴定法测量白蛋白与ODN的比率以可视化脂肪酸缀合的被氨基-LNA修饰的ODN(这里以被棕榈酰基-氨基-LNA修饰的ODN作为实例)与白蛋白的结合。对所有6个ODN(图2-1、图2-2和图2-3)进行此操作。使用XCell SureLockTMMine-Cell电泳系统，使用NovexTM8％聚丙烯酰胺凝胶1×TBE缓冲液，12孔(Invitrogen,Carlsbad,CA)，或在使用ProtoGel 30％(National Diagnostics,Somerville,NJ)的非市售腔室中进行凝胶实验。使用NovexTMTBE跑胶缓冲液(5×)(Invitrogen)将样品上样。凝胶在1×TBE缓冲液(来自10×储备液，Gibco,Live Technologies,Carlsbad,CA)中跑胶。使用SYBR-Gold核酸染料(Invitrogen)，遵照标准方案对ODN染色。
图2-1中的两个凝胶显示在和白蛋白一起孵育4小时后，与ODN(其尤其含有磷酸二酯核苷间键)中的一个(ON7452；左边)或两个(ON7453；右边)棕榈酰基-氨基-LNA修饰形成的复合物。我们观测到具有一个棕榈酰基-氨基-LNA修饰的ODN与白蛋白之间没有明显的相互作用，即使在40:1的白蛋白:ODN比下。相反，具有两个棕榈酰基-氨基-LNA修饰的ODN(ON7453)即使在低的白蛋白:ODN比下依然结合白蛋白，并且在40:1的白蛋白:ODN比下观测不到游离ODN(图2-1，右边)。不具有棕榈酰基-氨基-LNA修饰的对照ODN(ON7451)在40:1的白蛋白:ODN比下不显示与白蛋白的结合(图2-1的两个凝胶中左边的泳道。)。
用具有硫代磷酸酯键的ODN进行类似实验(图2-2)。对于不具有棕榈酰基-氨基-LNA修饰的ODN(ON7454)(40:1的白蛋白:ODN比)，小条带似乎是白蛋白所在的位置，但是因为单独的白蛋白也显现相同的条带，所以其出现的最可能原因是SYBR金与白蛋白的非特异性结合(图2-2的两个凝胶的左边的泳道)。也观测到主ODN条带正上方的小条带，然而其与白蛋白无关并且最可能反映ODN聚集体的存在。对于具有一个棕榈酰基-氨基-LNA修饰的ODN(ON7455)，观测到与白蛋白的某种相互作用，虽然获得大量的结合到白蛋白的ODN需要高度过量的白蛋白(40:1)(图2-2，左边)。具有两个棕榈酰基-氨基-LNA修饰的ODN(ON7456)在最小的白蛋白:ODN比(0.652:1)下就已经开始结合白蛋白，并且在10:1的白蛋白:ODN比下所有的ODN已经结合到白蛋白(图2-2，右边)。
为了进一步强调脂肪酸单元对白蛋白结合的重要性，用不具有棕榈酰基-氨基-LNA修饰的两个ODN进行研究(图2-3)。如以下可以看出，对于具有磷酸二酯键的ODN(ON7451)和具有硫代磷酸酯键的ODN(ON7454)都没有观测到与白蛋白的显著结合。
基于这些结果，我们得出以下结论：
(a)连接有两个脂肪酸氨基-LNA单元的ODN显示与白蛋白的高度结合。
(b)具有两个棕榈酰基-氨基-LNA修饰的ODN显示与白蛋白的高度结合。
(c)具有两个棕榈酰基-氨基-LNA修饰(一个处于LNA-DNA-LNA缺口体反义寡核苷酸的一端)的ODN显示与白蛋白的高度结合。
(d)具有两个棕榈酰基-氨基-LNA修饰(一个处于LNA/DNA或LNA/2’-OMe-RNA混合体反义寡核苷酸的一端)的ODN显示与白蛋白的高度结合。
(e)含有磷酸二酯键并且不含硫代磷酸酯键但具有两个棕榈酰基-氨基-LNA修饰的ODN显示与白蛋白的高度结合。
■硫代磷酸酯键可以增加被棕榈酰基-氨基-NA修饰的ODN与白蛋白的结合。
■脂肪酸残基似乎是ODN与白蛋白的有效结合的关键组分。
实施例5.缺口体反义寡核苷酸的白蛋白结合
这个实施例的背景是以下常识：
-白蛋白具有作为药物载体的很大潜力
-硫代磷酸酯形式的反义寡核苷酸(ODN)可以结合到白蛋白和其它血清蛋白上，防止其通过肾脏快速排泄
-脂肪酸残基可以结合到白蛋白和被修饰/工程改造的白蛋白衍生物和变异体上。
针对白蛋白结合评估的反义寡核苷酸(ODN)的示意图在图3显示并且在下表中列举。
以上列举的ODN具有以下序列。
NAC7451 5’-TAGcctgtcacttCTC(全-PO)SEQ ID NO:1
NAC7452 5’-PAGcctgtcacttCTC(全-PO)SEQ ID NO:2
NAC7453 5’-PAGcctgtcacttP*TC(全-PO)SEQ ID NO:3
NAC7454 5’-TAGcctgtcacttCTC(全-PS)SEQ ID NO:4
NAC7455 5’-PAGcctgtcacttCTC(全-PS)SEQ ID NO:5
NAC7456 5’-PAGcctgtcacttP*TC(全-PS)SEQ ID NO:6
NAC7714 5’-TAGcctgtcacttCPP*(全-PO)SEQ ID NO:7
NAC7715 5’-TAGcctgtcacttCPP*(全-PS)SEQ ID NO:8
NAC7716 5’-MAGcctgtcacttCTC(全-PO)SEQ ID NO:9
NAC7717 5’-MAGcctgtcacttM*TC(全-PO)SEQ ID NO:10
NAC7718 5’-MAGcctgtcacttCTC(全-PS)SEQ ID NO:11
NAC7719 5’-MAGcctgtcacttM*TC(全-PS)SEQ ID NO:12
P和M分别表示棕榈酰基-氨基-LNA和肉豆蔻酰基-氨基-LNA胸腺嘧啶单体，P*和M*分别表示棕榈酰基-氨基-LNA和肉豆蔻酰基-氨基-LNA 5-甲基-胞嘧啶单体。A、C、G和T表示LNA单体，并且a、c、g和t表示DNA单体。
在实施例4和整体公开中，公开了含有两个远端定位的所述脂肪酸缀合氨基-LNA修饰(例如棕榈酰基-氨基-LNA残基)的寡核苷酸，并且显示所述“分开的设计”是尤其优选的设计以便实现基于磷酸二酯或硫代磷酸酯的反义寡核苷酸的高白蛋白结合。实施例4中针对用于支持本发明的ODN NAC7451、NAC7452、NAC7453、NAC7454、NAC7455和NAC7456报道了数据，并且所述数据可用于本实施例中以进行比较。
以下针对NAC7716、NAC7717、NAC7718和NAC 7719报道的数据显示两个远端定位的肉豆蔻酰基-氨基-LNA单体(NAC7717和NAC 7719)像两个远端定位的棕榈酰基-氨基-LNA单体(NAC7453和NAC7456)一样诱导类似的白蛋白结合。然而，本实施例中针对寡核苷酸NAC7714和NAC7715报道的数据意外地显示，两个酰基-氨基-LNA单体(此处是棕榈酰基-氨基-LNA单体)的紧密定位同样诱导与人血清白蛋白的强结合。已知这种蛋白质具有用于脂肪酸残基的结合位点，但是非常令人吃惊的是，发现在与NAC7714和NAC7715中相同的寡核苷酸半区段中非常紧密地定位的两个酰基链能够促进此种高白蛋白结合(参见图4到图9以及以下说明)。
白蛋白/寡核苷酸复合物形成的数据
用滴定法测量白蛋白与ODN的比率以可视化ODN与白蛋白的结合。图4到图9的凝胶中描绘结果，所述结果在左边显示PO-ODN的结果并且在右边显示PS-ODN的结果。对于不存在任何酰基-氨基-LNA单体的PO-寡核苷酸和PS-寡核苷酸都没有观测到显著的白蛋白结合。对于具有一个棕榈酰基-氨基-LNA单体的PO-ODN，我们观测到即使在高度过量的白蛋白(40:1)下，PO-ODN与白蛋白只有非常弱的相互作用。对于PS-ODN，我们观测到在5:1的白蛋白:ODN比率下开始的PS-ODN与白蛋白的弱结合。对于具有两个远端定位的棕榈酰基-氨基-LNA单体的PO-ODN，我们观测到在5:1的白蛋白:ODN比率下开始的PO-ODN与白蛋白的相互作用。对于PS-ODN，甚至观测到与白蛋白的更强结合。对于在3’端具有两个棕榈酰基-氨基-LNA单体的PO-ODN，我们观测到即使在最低的白蛋白与ODN的比率下，PO-ODN与白蛋白也有强结合。对于对应的PS-ODN观测到略微更强的结合。对于具有一个肉豆蔻酰基-氨基-LNA单体的PO-ODN，我们没有观测到与白蛋白的显著相互作用。对于相应的PS-ODN，发现从5:1的白蛋白:ODN比率开始结合的迹象。对于具有两个远端定位的肉豆蔻酰基-氨基-LNA单体的PO-ODN，我们观测到从5:1的白蛋白:ODN比率开始的某种结合，然而对应的PS-ODN显示在最低的白蛋白:ODN比率下已经开始结合。
基于本实施例，我们得出以下结论：
a)含有两个脂肪酸官能化氨基-LNA单体的寡核苷酸显示与白蛋白的高度结合。
b)含有两个棕榈酰基-氨基-LNA单体的寡核苷酸显示与白蛋白的高度结合。
c)含有两个肉豆蔻酰基-氨基-LNA单体的寡核苷酸显示与白蛋白的高度结合。
d)含有两个紧密定位的棕榈酰基-氨基-LNA单体的寡核苷酸显示与白蛋白的高度结合。
e)含有两个紧密定位的棕榈酰基-氨基-LNA单体的缺口体反义寡核苷酸显示与白蛋白的高度结合。
f)具有磷酸二酯(PO)键并且含有两个脂肪酸氨基-LNA单体的寡核苷酸显示与白蛋白的高度结合。
g)具有硫代磷酸酯(PS)键并且含有两个脂肪酸氨基-LNA单体的寡核苷酸通常显示比对应的具有磷酸二酯(PO)键的寡核苷酸更高的白蛋白结合。
h)酰基-氨基-LNA单体中存在的脂肪酸残基似乎是诱导ODN与白蛋白的非常有效结合的关键组分。
实施例6：适体AS1411和11-mer适体针对CD-133的衍生化.
在以下所示的实施例中，以下命名用于适体序列中所含的核苷酸单体：
小写字母：DNA核苷酸
大写字母：LNA核苷酸
P：棕榈酰基-氨基-LNA-T核苷酸
P*：棕榈酰基-氨基-LNA-5-甲基-C核苷酸
uC：UNA-C核苷酸
fC,fU：2’-氟-2’-脱氧核苷酸
rA：RNA-A核苷酸
mG：2’-O-甲基-RNA核苷酸
Cy5荧光花青(cyanine)染料标记(结构单元是市售的)
AS1411是26-mer全DNA序列(所有核苷间键都是PO)。母体AS1411的序列显示如下：
5’-ggt ggt ggt ggt tgt ggt ggt ggt gg SEQ ID NO:13
在一个实施例中，两个棕榈酰基-氨基-LNA单体直接连接到AS1411的3’端：
5’-ggt ggt ggt ggt tgt ggt ggt ggt ggPP(全-PO键)SEQ ID NO:14
在另一个实施例中，两个棕榈酰基-氨基-LNA单体通过三聚体核苷酸连接子(ttt)连接到AS1411的3’端：
5’-ggt ggt ggt ggt tgt ggt ggt ggt ggt ttP P(全-PO键)SEQ ID NO:15
以下显示已被显示结合CD133表位的适体的序列，已知CD133表位在例如结肠癌细胞和其它实体肿瘤中过量存在并且被视为癌症干细胞标志物。
5’-Cy5-CtfCuCfUrAfCrAfUAmG SEQ ID NO:16
在一个实施例中，通过用两个棕榈酰基-氨基-LNA单体取代接近5’端的两个LNA核苷酸，将两个棕榈酰基-氨基-LNA单体引入到这个适体中。
5’-Cy5-P*PfCuCfUrAfCrAfUAmG SEQ ID NO:17
本实施例证实以下内容：
-本发明的适体可以按各种构建体的形式被设计和合成。
-酰基-氨基-LNA和/或烷基-氨基-LNA单体可以作为与母体适体相比的额外核苷酸，和/或通过取代母体适体的一个或多个核苷酸，和/或通过另外的连接子单元向一个末端掺入。
-本发明的适体可以含有天然核苷酸以及各种被修饰核苷酸加上酰基-氨基-LNA和/或烷基-氨基-LNA单体。
-本发明的适体可以含有缀合部分如荧光基团，或者可以缀合到其它基团如报告基团(reporter group)上。
实施例7：被脂肪酸修饰的反义寡核苷酸显示增加的循环半衰期和改变的体内生物分布.
设立本实验以探究被两个酰基-氨基-LNA或烷基-氨基-LNA单体修饰的反义寡核苷酸(ODN)结合到白蛋白上的先前观测结果(参见上文)。目的是研究被两个酰基-氨基-LNA或烷基-氨基-LNA单体修饰的ODN是否显示治疗相关活性。
先前的实施例已经显示本发明的棕榈酰基化ODN结合到人血清白蛋白上。包括以下反义寡核苷酸(ODN)，其各自具有连接到5’端的荧光标记Cy5.5：
NAC7834 5’-Cy5.5-TAGcctgtcacttCTC(全-PO) SEQ ID NO:18
NAC7833 5’-Cy5.5-TAGcctgtcacttCTC(全-PS) SEQ ID NO:19
NAC7836 5’-Cy5.5-TAGcctgtcacttCPP*(全-PO) SEQ ID NO:20
NAC7835 5’-Cy5.5-TAGcctgtcacttCPP*(全-PS) SEQ ID NO:21
P和P*分别表示棕榈酰基-氨基-LNA胸腺嘧啶和棕榈酰基-氨基-LNA 5-甲基-胞嘧啶单体单元。A、C、G和T表示LNA单体，并且a、c、g和t表示DNA单体。Cy5.5是荧光花青染料标记(用于掺入到寡核苷酸中的结构单元是市售的)。这些寡核苷酸是先前研究的序列NAC7451、NAC7454、NAC7714和NAC7715的衍生物。
白蛋白/ODN复合物形成
用于体内半衰期研究的Cy5.5荧光标记ODN最初与白蛋白在不同浓度下一起孵育4小时以确认荧光团不干扰用先前测试的非荧光ODN观测到的结合。图10和图11显示PAGE凝胶；左边研究具有PO键的ODN，右边研究具有PS键的ODN。
对于不具有棕榈酰基的ODN，不具有PS键的ODN没有被观测到结合。对于不具有棕榈酰基但具有PS键的ODN，观测到(非常)轻微的结合。
对于在ODN的3’端具有2个棕榈酰基的ODN，我们在最低的白蛋白与ODN的比率下对于具有和不具有PS键的ODN都观测到结合。一般来说，我们对于具有5’-Cy5.5荧光团的ODN观测到与不具有标记的ODN相同的趋势。
体内循环半衰期
将Cy5.5荧光标记ODN静脉内注射入8-9周大的雌性C57BL/6小鼠的尾静脉中。对小鼠给予3.5mg/kg ODN，总体积200μl。1分钟后从舌头收集血液，并且在30分钟、2小时、4小时和24小时后从尾巴收集血液。分离血浆并在IVIS扫描仪中扫描。24小时后，处死动物，并将器官和尸体在IVIS扫描仪中扫描。图12上部给出实验时间线。
我们观测到与裸ODN相比，棕榈酰基化ODN NAC7835和NAC7836的增加的半衰期，参见图12(也参见图13中的被研究寡核苷酸的示意图)。此外，我们也观测到，与具有PO键的ODN相比，具有PS键的ODN的半衰期增加，但是与NAC7834(具有全部PO键的参照物)和NAC7833(具有全部PS键的参照物)两者相比，对于NAC7836(全部PO键)也观测到显著的增加。拟合指数衰减曲线得出以下半衰期：23分钟、28分钟、49分钟和66分钟(分别是PO[NAC7834]、PS[NAC7833]、PO 2×pal[NAC7836]和PS 2×pal[NAC7835])。值得注意的是，用棕榈酰基[NAC7836]修饰全部PO ODN[NAC7834]导致循环半衰期增加超过两倍。
器官生物分布
扫描器官揭示了非棕榈酰基化ODN[NAC7834和NAC7833]在肾脏内的积聚，其中POODN[NAC7834]的积聚是更高的，参见图14。然而，对于2×palODN，我们观测到在器官中更均匀的分布(图14和图15)，意味着NAC7836和NAC7835中存在的两个棕榈酰基氨基-LNA单体影响与对应的非棕榈酰基化ODN NAC7834和NAC7833相关的生物分布，在肾脏中的积聚较少和在肝脏和脾脏中的积聚较多。获得的数据指示施用本发明的构建体可以影响在多种器官中的生物分布。对于含有两个棕榈酰基-氨基-LNA单体的ODN观测到的体内循环半衰期增加和生物分布模式改变的可能解释是先前实施例中所证明的与白蛋白的结合的增加。
实施例8.用共聚焦显微镜和流式细胞仪研究的软骨细胞中的无辅助摄取
在本研究中包括以下列举的缺口体：
NAC7771 5’-Cy3-GTCctcgagcgtCTC(全-PS) SEQ ID NO:22
NAC7772 5’-Cy3-GPCctcgagcgtCPC(全-PO) SEQ ID NO:23
NAC7773 5’-Cy3-GPCctcgagcgtCPC(全-PS) SEQ ID NO:24
NAC7774 5’-Cy3-GT*C*ctcgagcgtC*T*C(全-PS) SEQ ID NO:25
NAC7775 5’-Cy3-GT**CctcgagcgtCT**C(全-PS) SEQ ID NO:26
P表示棕榈酰基-氨基-LNA胸腺嘧啶单体。T*和C*分别表示甘氨酰基-氨基-LNA胸腺嘧啶和5-甲基胞嘧啶单体。T**表示半乳糖基官能化的氨基-LNA胸腺嘧啶单体，其在β构型的半乳糖基单元的N2’-原子与O1-原子之间具有-C(＝O)CH2-连接子(即N2’-C(＝O)CH2-O1连接子)。A、C、G和T表示LNA单体，并且a、c、g和t表示DNA单体。
在和人软骨细胞一起孵育时，对50nM下的缺口体摄取进行共聚焦显微镜分析。用Hoechst对核染色，并用Cy3(红色)标记缺口体。初始放大倍率是40倍。图16(上部)描绘结果。对照组没有添加Cy3标记的寡核苷酸。还对在50nM下与人软骨细胞一起孵育24小时后的缺口体摄取进行流式细胞仪分析，从而评估摄取(图16，下图)。
可以得出结论：在使用非辅助摄取条件并且没有添加转染剂的软骨细胞中，LNA-DNA-LNA缺口体对照组(NAC7771；全部PS键)像预期的那样被有效摄取。在使用非辅助摄取条件并且没有添加转染剂的软骨细胞中，具有两个棕榈酰基-氨基-LNA单体(作为全-PO(NAC7772)和全-PS(NAC7773)衍生物)的寡核苷酸也被有效摄取。应注意全-PO变异体NAC7772的摄取比全-PS变异体NAC773的摄取更有效。此外，在使用非辅助摄取条件并且没有添加转染剂的软骨细胞中，具有四个甘氨酰基-氨基-LNA单体(NAC7774；全-PS)的寡核苷酸和具有两个被半乳糖基官能化的烷基-氨基-LNA单体(NAC7775；全-PS)的寡核苷酸也被有效摄取。
以下4个丹麦优先权申请的内容以全文引用的方式被包括在本文中：2015年2月15日提交的PA 2015 00090，2015年8月8日提交的PA 2015 00440，2015年11月10日提交的PA2015 00711，和2015年11月10日提交的PA 201500712。
序列表
<110> 里博塔斯克公司
<120> 酰基-氨基-LNA和/或烃基-氨基-LNA寡核苷酸
<130> PCT-16982
<160> 29
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
<223> 具有碱基TAG的LNA的链段
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(16)
<223> 具有碱基CTC的LNA的链段
<400> 1
nnncctgtca cttnnn 16
<210> 2
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 含有棕榈酰基-氨基-LNA的寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 棕榈酰基-氨基-LNA-T
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(3)
<223> LNA链段碱基AG
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(16)
<223> LNA链段碱基ctc
<400> 2
nnncctgtca cttnnn 16
<210> 3
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 含有棕榈酰基-氨基-LNA的寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 棕榈酰基-氨基-LNA-T
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(3)
<223> LNA链段碱基AG
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> 棕榈酰基-氨基-LNA-5-甲基-胞嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(16)
<223> LNA链段碱基TC
<400> 3
nnncctgtca cttnnn 16
<210> 4
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
<223> 具有碱基TAG的LNA的链段
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(16)
<223> 具有碱基CTC的LNA的链段
<400> 4
nnncctgtca cttnnn 16
<210> 5
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 含有棕榈酰基-氨基-LNA的寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 棕榈酰基-氨基-LNA-T
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(3)
<223> LNA碱基AG的链段
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(16)
<223> LNA碱基CTC的链段
<400> 5
nnncctgtca cttnnn 16
<210> 6
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 含有棕榈酰基-氨基-LNA的寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 棕榈酰基-氨基-LNA-T
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(3)
<223> LNA碱基AG的链段
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> 肉豆蔻酰基-氨基-LNA-5-甲基-胞嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(16)
<223> LNA碱基TC的链段
<400> 6
nnncctgtca cttnnn 16
<210> 7
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 含LNA的寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
<223> LNA碱基TAG的链段
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> LNA-C
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> 棕榈酰基-氨基-LNA-T
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> 棕榈酰基-氨基-LNA-5-甲基-胞嘧啶
<400> 7
nnncctgtca cttnnn 16
<210> 8
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 含有LNA和氨基-LNA的寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
<223> LNA碱基TAG的链段
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> LNA-C
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> 棕榈酰基-氨基-LNA-T
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> 棕榈酰基-氨基-LNA-5-甲基-胞嘧啶
<400> 8
nnncctgtca cttnnn 16
<210> 9
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 含有LNA和氨基-LNA的寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 肉豆蔻酰基-氨基-LNA-T
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(3)
<223> LNA AG的链段
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(16)
<223> LNA CTC的链段
<400> 9
nnncctgtca cttnnn 16
<210> 10
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 含有LNA和氨基-LNA的寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 肉豆蔻酰基-氨基-LNA-T
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(3)
<223> LNA AG的链段
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> 肉豆蔻酰基-氨基-LNA-5-甲基-胞嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(16)
<223> LNA碱基TC的链段
<400> 10
nnncctgtca cttnnn 16
<210> 11
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 含有LNA和氨基-LNA的寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 肉豆蔻酰基-氨基-LNA-T
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(3)
<223> LNAs AG
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(16)
<223> LNAs CTS
<400> 11
nnncctgtca cttnnn 16
<210> 12
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 含有LNA和氨基-LNA的寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 肉豆蔻酰基-氨基-LNA-T
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(3)
<223> LNA碱基AG的链段
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> 肉豆蔻酰基-氨基-LNA-5-甲基-胞嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(16)
<223> LNA碱基TC的链段
<400> 12
nnncctgtca cttnnn 16
<210> 13
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 13
ggtggtggtg gttgtggtgg tggtgg 26
<210> 14
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 含有棕榈酰基-氨基-LNA-T的寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (27)..(28)
<223> 棕榈酰基-氨基-LNA-T
<400> 14
ggtggtggtg gttgtggtgg tggtggnn 28
<210> 15
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 含有棕榈酰基-氨基-LNA-T的寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (30)..(31)
<223> 棕榈酰基-氨基-LNA-T
<400> 15
ggtggtggtg gttgtggtgg tggtggtttn n 31
<210> 16
<211> 11
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 被多重修饰的寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> LNA-C
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> 2’-氟-2’-脱氧-U
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> 2’-氟-2’-脱氧-C
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> UNA-C
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> 2’-氟-2’-脱氧-U
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> RNA-A
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> 2’-氟-2’-脱氧-C
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> RNA-A
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> 2’-氟-2’-脱氧-U
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> LNA-A
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> 2’-O-甲基-RNA G
<400> 16
ntnnnnnnnn n 11
<210> 17
<211> 11
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 被多重修饰的寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 棕榈酰基-氨基-LNA-5-甲基-胞嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> 棕榈酰基-氨基-LNA-T
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> 2’-氟-2’-脱氧-C
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> UNA-C
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> 2’-氟-2’-脱氧-U
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> RNA-A
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> 2’-氟-2’-脱氧-C
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> RNA-A
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> 2’-氟-2’-脱氧-U
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> LNA-A
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> 2’-O-甲基-RNA G
<400> 17
nnnnnnnnnn n 11
<210> 18
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 被多重修饰的寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
<223> LNA碱基TAG
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
<223> LNA碱基TAG，Cy5.5标记的
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(16)
<223> LNA碱基ctc
<400> 18
nnncctgtca cttnnn 16
<210> 19
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 被多重修饰的寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
<223> LNA碱基TAG
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(16)
<223> LNA碱基ctc
<400> 19
nnncctgtca cttnnn 16
<210> 20
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 被多重修饰的寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
<223> LNAs TAG
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> LNA-C
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> 棕榈酰基-氨基-LNA T
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> 棕榈酰基-氨基-LNA-5-甲基-胞嘧啶
<400> 20
nnncctgtca cttnnn 16
<210> 21
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 被多重修饰的寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
<223> LNAs TAG
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> LNAs-C
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> 棕榈酰基-氨基-LNA T
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> 棕榈酰基-氨基-LNA-5-甲基-胞嘧啶
<400> 21
nnncctgtca cttnnn 16
<210> 22
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 被修饰的寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
<223> LNAs GTC
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(15)
<223> LNAs CTC
<400> 22
nnnctcgagc gtnnn 15
<210> 23
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 被修饰的寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> LNA-G
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> 棕榈酰基-氨基-LNA T
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> LNA-C
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> LNA-C
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> 棕榈酰基-氨基-LNA T
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> LNA-C
<400> 23
nnnctcgagc gtnnn 15
<210> 24
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 被修饰的寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> LNA-G
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> 棕榈酰基-氨基-LNA T
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> LNA-C
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> LNA-C
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> 棕榈酰基-氨基-LNA T
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> LNA-C
<400> 24
nnnctcgagc gtnnn 15
<210> 25
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 被修饰的寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> LNA-G
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> 甘氨酰基-氨基-LNA-T
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> 甘氨酰基-氨基-LNA-5-甲基-胞嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> 甘氨酰基-氨基-LNA-5-甲基-胞嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> 甘氨酰基-氨基-LNA-T
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> LNA-T
<400> 25
nnnctcgagc gtnnn 15
<210> 26
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 被修饰的寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> LNA-T
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> 半乳糖基官能化的氨基-LNA-T
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> LNA-C
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> LNA-C
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> 半乳糖基官能化的氨基-LNA-T
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> LNA-C
<400> 26
nnnctcgagc gtnnn 15
<210> 27
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> LNA-G
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> 嘧啶甘氨酰基-氨基-LNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> 嘧啶甘氨酰基-氨基-LNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> 嘧啶甘氨酰基-氨基-LNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> 嘧啶甘氨酰基-氨基-LNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> LNA-C
<400> 27
nnnctcgagc gtnnc 15
<210> 28
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ligo
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> LNA-G
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> 嘧啶甘氨酰基-氨基-LNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> 嘧啶LNA单体
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> 嘧啶LNA单体
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> 棕榈酰基-氨基-LNA-T
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> LNA-C
<400> 28
nnnctcgagc gtnnn 15
<210> 29
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> LNA-G
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> 棕榈酰基-氨基-LNA-T
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> 甘氨酰基-氨基-LNA-T
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> 甘氨酰基-氨基-LNA-T
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> 棕榈酰基-氨基-LNA-T
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> LNA-C
<400> 29
nnnctcgagc gtnnn 15

Claims (45)

1.一种单链寡核苷酸，其含有两个或更多个酰基-氨基-LNA核苷酸单体或烃基-氨基-LNA核苷酸单体，其中其它核苷酸单体可以是DNA、RNA或被化学修饰的核苷酸单体；
其中所述寡核苷酸的单体通过磷酸二酯键和/或硫代磷酸酯键和/或磷酸三酯键连接，
其中所述酰基-氨基-LNA单体和烃基-氨基-LNA单体的酰基和烃基任选地被取代并且因此任选地含有一个或多个羟基、氨基、硫基、氧代基、烷硫基、醚基和/或硫醇基(巯基)，和
其中所述酰基-氨基-LNA单体和烃基-氨基-LNA单体的酰基和烃基是直链或支链、环状或两者的组合，条件是每一个酰基和烃基中的碳原子总数小于30。
2.根据权利要求1所述的单链寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的所有核苷间键的至少50％、优选至少70％、更优选至少90％且最优选至少95％是磷酸二酯键。
3.根据权利要求1或2所述的单链寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的核苷酸单体的至多40％、优选至多30％、更优选至多20％且最优选至多10％是核糖核苷酸单体。
4.根据权利要求1至3中任一权利要求所述的单链寡核苷酸，其中所述烃基-氨基-LNA核苷酸单体是烷基-氨基-LNA核苷酸单体。
5.根据权利要求1至4中任一权利要求所述的单链寡核苷酸，其中所述寡核苷酸含有至少两个N-酰基-氨基-LNA核苷酸单体，或至少两个N-烃基-氨基-LNA核苷酸单体，或至少一个N-酰基-氨基-LNA核苷酸单体和至少一个N-烃基-氨基-LNA核苷酸单体。
6.根据权利要求1至5中任一权利要求所述的单链寡核苷酸，所述寡核苷酸含有一个或两个连接到胆固醇基部分的核苷酸单体。
7.根据权利要求1至6中任一权利要求所述的单链寡核苷酸，其中所述酰基-氨基-LNA核苷酸单体的酰基部分是N-烷酰基、N-烯酰基和/或N-炔酰基部分，其各自具有4到30个碳原子，优选7到22个碳原子，更优选10到22个碳原子，所述酰基部分未被取代或被一个或多个选自羟基、C1-C6烷氧基、氨基、C1-C6单烷基氨基或二烷基氨基、氧代基、硫醇基和C1-C6烷硫基的基团取代。
8.根据权利要求1、2、3、4、5、6或7中任一权利要求所述的单链寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含至少7个核苷酸单体单元，优选至少8个核苷酸单体单元，更优选至少11个核苷酸单体单元，更优选至少12个单体单元。
9.根据权利要求1至8中任一权利要求所述的单链寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的所有核苷酸单体单元都通过磷酸二酯键连接。
10.根据权利要求1至9中任一权利要求所述的单链寡核苷酸，其是缺口体(gapmer)、适体(aptamer)或混合体(mixmer)。
11.根据权利要求1至10中任一权利要求所述的单链寡核苷酸，其中所述寡核苷酸从5’端到3’端具有三个区段：至少2个核苷酸单元的5’端区段，长度为至少6个核苷酸单元的中心结合区段，和长度为至少2个核苷酸单元的3’端区段，
其中所述寡核苷酸在所述5’端区段或所述3’端区段中含有至少两个2’-N-酰基-2’-氨基-LNA核苷酸单体或2’-N-烃基-氨基-LNA核苷酸单体，但在所述中心区段中没有2’-N-酰基-2’-氨基-LNA核苷酸单体或2’-N-烃基-氨基-LNA核苷酸单体；或者在所述末端区段中的每一个中都含有至少一个2’-N-酰基-2’-氨基-LNA核苷酸单体或2’-N-烃基-氨基-LNA核苷酸单体，但在所述中心区段中没有2’-N-酰基-2’-氨基-LNA核苷酸单体或2’-N-烃基-氨基-LNA核苷酸单体。
12.根据权利要求1至10中任一权利要求所述的单链寡核苷酸，其中所述寡核苷酸是以下组成的缺口体：
NV-MY-NZ，
其中M表示能与靶RNA的RNase H降解相容的核苷酸单体，N表示选自亲和力增强核苷酸单体、酰基-氨基-LNA和/或烃基-氨基-LNA单体、和DNA核苷酸单体的单体，并且其中V、Y和Z表示所述区段中的单体的数目，并且其中连字符指示两个翼序列区段NV和NZ与间隔序列区段MY之间的分隔；数字V和Z可以在2和8之间变化并且数字Y可以在6和14之间变化，条件是V+Z+Y的总和最大是30，限制条件是
(a)在所述翼区段、即由N单体组成的区段中的每一个中都存在至少一个酰基-氨基-LNA单体和/或烃基-氨基-LNA单体；或
(b)在所述翼区段、即由N单体组成的区段中的一个中存在至少两个酰基-氨基-LNA单体和/或烃基-氨基-LNA单体。
13.根据权利要求12所述的单链寡核苷酸，其中所述寡核苷酸具有以下组成5’-(L)2-4-(D)6-10-(L)2-4，其中D表示DNA核苷酸单体并且L表示亲和力增强核苷酸单体或酰基-氨基-LNA和/或烃基-氨基-LNA单体，条件是
(a)在所述翼区段，即由L单体组成的区段中的每一个中都存在至少一个酰基-氨基-LNA和/或烃基-氨基-LNA单体；或
(b)在所述翼区段，即由L单体组成的区段中的一个中存在至少两个酰基-氨基-LNA和/或烃基-氨基-LNA单体。
14.根据权利要求1至13中任一权利要求所述的反义寡核苷酸，其能够通过由RNase-H介导的反义RNA靶向来介导基因调控。
15.根据权利要求1至10中任一权利要求所述的单链寡核苷酸，其中在半序列区段的一个，即所述寡核苷酸序列的5’端半部分或所述寡核苷酸序列的3’端半部分中存在至少两个酰基-氨基-LNA单体和/或烃基-氨基-LNA单体，条件是如果所述寡核苷酸中的核苷酸总数是奇数，那么在所述两个半序列区段中的任一个中都不包含中心核苷酸单体；或者如果所述寡核苷酸中的核苷酸单体总数是奇数，那么所述至少两个酰基-氨基-LNA和/或烃基-氨基-LNA单体中的一个任选地可以是中心核苷酸单体。
16.一种具有组成5’-(N)7-26的单链混合体反义寡核苷酸，其中N表示至少一个亲和力增强单体并且另外可以表示任何其它类型的核苷酸单体，条件是至少两个N核苷酸是酰基-氨基-LNA单体和/或烃基-氨基-LNA单体，并且
(a)每一个序列元件，即所述寡核苷酸序列的5’端半部分和所述寡核苷酸序列的3’端半部分各自含有至少一个酰基-氨基-LNA单体和/或烃基-氨基-LNA单体，或
(b)在半序列元件的一个，即所述寡核苷酸序列的5’端半部分或所述寡核苷酸序列的3’端半部分中存在至少两个酰基-氨基-LNA和/或烃基-氨基-LNA单体，
条件是如果核苷酸总数是奇数，那么在所述两个序列元件中的任一个中都不包含中心核苷酸单体，或者
(c)如果所述寡核苷酸中的核苷酸单体总数是奇数，那么所述至少两个酰基-氨基-LNA和/或烃基-氨基-LNA单体中的一个任选地可以是中心核苷酸单体，
和
其中所述寡核苷酸的单体通过磷酸二酯键和/或硫代磷酸酯键和/或磷酸三酯键连接，
其中所述酰基-氨基-LNA单体和烃基-氨基-LNA单体的酰基和烃基任选地被取代并且因此任选地含有一个或多个羟基、氨基、硫基、氧代基、烷硫基、醚基或硫醇基(巯基)，和
其中所述酰基-氨基-LNA和烃基-氨基-LNA单体的酰基和烃基可以是直链或支链、环状或两者的组合，条件是每一个酰基和烃基中的碳原子总数小于30。
17.根据权利要求16所述的单链寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的所有核苷间键的至少50％、优选至少70％、更优选至少90％且最优选至少95％是磷酸二酯键。
18.根据权利要求16或17所述的单链寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的核苷酸单体的至多40％、优选至多30％、更优选至多20％且最优选至多10％是核糖核苷酸单体。
19.根据权利要求16至18中任一权利要求所述的单链混合体反义寡核苷酸，其中组成是5’-(N)7-12，其中N表示亲和力增强核苷酸和至少两个酰基-氨基-LNA单体和/或烃基-氨基-LNA单体，使得所述序列元件中的每一个都含有至少一个酰基-氨基-LNA单体和/或烃基-氨基-LNA单体。
20.根据权利要求16至18中任一权利要求所述的单链混合体反义寡核苷酸，其中组成是5’-(N)12-22，其中N表示至少四个LNA型亲和力增强单体、多个DNA单体或2’-OMe-RNA单体、和至少两个酰基-氨基-LNA单体和/或烃基-氨基-LNA单体，使得所述序列元件中的每一个都含有至少一个酰基-氨基-LNA单体和/或烃基-氨基-LNA单体。
21.根据权利要求16至18中任一权利要求所述的单链混合体反义寡核苷酸，其中组成是5’-(N)15-22，其中N表示至少三个LNA型亲和力增强单体、一个或多个2’-OMe-RNA单体、和至少两个酰基-氨基-LNA单体和/或烃基-氨基-LNA单体，使得所述序列元件中的每一个都含有至少一个酰基-氨基-LNA单体和/或烃基-氨基-LNA单体。
22.根据权利要求16至18中任一权利要求所述的单链混合体反义寡核苷酸，其中组成是5’-(N)7-12，其中N构成亲和力增强核苷酸和至少两个酰基-氨基-LNA单体和/或烃基-氨基-LNA单体，使得在半序列元件的一个,即所述序列的5’端半部分或所述序列的3’端半部分中存在至少两个酰基-氨基-LNA单体和/或烃基-氨基-LNA单体，条件是如果核苷酸总数是奇数，那么在所述两个序列元件中的任一个中都不包含中心核苷酸单体；或者如果所述寡核苷酸中的核苷酸单体总数是奇数，那么所述至少两个酰基-氨基-LNA和/或烃基-氨基-LNA单体中的一个任选地可以是中心核苷酸单体。
23.根据权利要求16至18中任一权利要求所述的单链混合体反义寡核苷酸，其中组成是5’-(N)12-22，其中N表示至少四个LNA型亲和力增强单体、多个DNA或2’-OMe-RNA单体、和至少两个酰基-氨基-LNA单体和/或烃基-氨基-LNA单体，使得在半序列元件的一个,即所述序列的5’端半部分或所述序列的3’端半部分中存在至少两个酰基-氨基-LNA单体和/或烃基-氨基-LNA单体，条件是如果核苷酸总数是奇数，那么在所述两个序列元件中的任一个中都不包含中心核苷酸单体；或者如果所述寡核苷酸中的核苷酸单体总数是奇数，那么所述至少两个酰基-氨基-LNA和/或烃基-氨基-LNA单体中的一个任选地可以是中心核苷酸单体。
24.根据权利要求16至18中任一权利要求所述的单链混合体反义寡核苷酸，其中组成是5’-(N)15-22，其中N表示至少三个LNA型亲和力增强单体、多个2’-OMe-RNA单体、和至少两个酰基-氨基-LNA和/或烃基-氨基-LNA单体，使得在半序列元件的一个,即所述序列的5’端半部分或所述序列的3’端半部分中存在至少两个酰基-氨基-LNA单体和/或烃基-氨基-LNA单体，条件是如果核苷酸总数是奇数，那么在所述两个序列元件中的任一个中都不包含中心核苷酸单体；或者如果所述寡核苷酸中的核苷酸单体总数是奇数，那么所述至少两个酰基-氨基-LNA和/或烃基-氨基-LNA单体中的一个任选地可以是中心核苷酸单体。
25.一种介导细胞或生物体中的基因沉默的方法，其包括在能发生基因沉默的条件下将所述细胞或生物体与权利要求1至24中任一权利要求的寡核苷酸如反义寡核苷酸接触。
26.根据权利要求25所述的方法，所述方法在体外或在分离的细胞上进行；或者所述方法在整体动物体内或在人体内进行。
27.根据权利要求25所述的方法，其中所述寡核苷酸与在所述细胞或生物体中表达的靶基因或靶RNA具有互补性，以介导所述靶基因或靶RNA的沉默，优选地由RNase H介导。
28.根据权利要求1至24中任一权利要求所述的寡核苷酸，用于动物或人的治疗中。
29.根据权利要求28所使用的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸与靶基因或靶RNA具有互补性，以介导所述靶基因或靶RNA的沉默，优选地由RNase H介导。
30.一种检查细胞或生物体中的基因的功能的方法，其包括：
将根据权利要求1至24中任一权利要求所述的靶向RNA以用于基因沉默的寡核苷酸引入到所述细胞或生物体中，从而产生测试细胞或测试生物体；
将所述测试细胞或测试生物体维持在发生基因沉默的条件下，从而产生其中所述基因的RNA水平下降的测试细胞或测试生物体；和
观测产生的测试细胞或生物体的表型，并且任选地比较观测到的表型与适当对照细胞或对照生物体的表型，从而提供关于所述基因的功能的信息。
31.根据权利要求30所述的方法，其用于确定基因产物是否是治疗干预的合适靶点。
32.根据权利要求30或31所述的方法，所述方法在体外或在分离的细胞上进行。
33.根据权利要求30和31所述的方法，所述方法在整体动物体内或在人体内进行。
34.一种评估药剂是否作用于基因产物的方法，其包括以下步骤：
将根据权利要求1至24中任一权利要求所述的靶向RNA以用于介导基因沉默的反义寡核苷酸引入到细胞或生物体中，从而产生测试细胞或测试生物体；
将所述测试细胞或测试生物体维持在发生基因沉默的条件下，从而产生其中所述基因的RNA水平下降的测试细胞或测试生物体；
将所述药剂引入到所述测试细胞或测试生物体中；和
观测所述测试细胞或生物体的表型，并且任选地比较观测到的表型与对照细胞或对照生物体的表型，从而提供关于所述药剂是否作用于所述基因产物的信息。
35.根据权利要求34所述的方法，所述方法在体外或在分离的细胞上进行。
36.根据权利要求34所述的方法，所述方法在整体动物体内或在人体内进行。
37.一种医药组合物，其包含根据权利要求1至24中任一权利要求所述的寡核苷酸和药学上可接受的稀释剂、载体或佐剂。
38.根据权利要求1至24中任一权利要求所述的寡核苷酸，其用作药物。
39.根据权利要求1至24中任一权利要求所述的寡核苷酸，其用在分子诊断内。
40.根据权利要求1至24中任一权利要求所述的寡核苷酸，其用于疾病预后。
41.根据权利要求1至24中任一权利要求所述的寡核苷酸，其用于研究用途。
42.根据权利要求1至24中任一权利要求所述的寡核苷酸，其中所述两个或更多个酰基-氨基-LNA单体和/或烃基-氨基-LNA核苷酸单体选自甘氨酰基-氨基-LNA单体、棕榈酰基-氨基-LNA单体、肉豆蔻酰基-氨基-LNA单体和乙酰基-氨基-LNA单体。
43.根据权利要求1至24中任一权利要求所述的反义寡核苷酸，其中所述两个或更多个酰基-氨基-LNA单体和/或烃基-氨基-LNA核苷酸单体是棕榈酰基-氨基-LNA单体、肉豆蔻酰基-氨基-LNA单体或用另一种脂肪酸酰基进行N-酰化的氨基-LNA单体，所述脂肪酸酰基优选地是饱和脂肪酸的脂肪酸酰基和/或优选地包括10到18个碳原子。
44.根据前述权利要求中任一权利要求所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸含有连接在所述寡核苷酸的3’端和/或5’端的一个或多个缀合基团。
45.一种含有根据权利要求1至24中任一权利要求所述的寡核苷酸的试剂。
CN201680021955.2A 2015-02-15 2016-02-15 酰基‑氨基‑lna和/或烃基‑氨基‑lna寡核苷酸 Pending CN107466323A (zh)

Applications Claiming Priority (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DKPA201500090 2015-02-15
DKPA201500090 2015-02-15
DKPA201500440 2015-08-03
DKPA201500440 2015-08-03
DKPA201500711 2015-11-10
DKPA201500712 2015-11-10
DKPA201500712 2015-11-10
DKPA201500711 2015-11-10
PCT/EP2016/053202 WO2016128583A2 (en) 2015-02-15 2016-02-15 Acyl-amino-lna and/or hydrocarbyl-amino-lna oligonucleotides

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN107466323A true CN107466323A (zh) 2017-12-12

Family

ID=55398281

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201680021955.2A Pending CN107466323A (zh) 2015-02-15 2016-02-15 酰基‑氨基‑lna和/或烃基‑氨基‑lna寡核苷酸

Country Status (7)

Country Link
US (1) US10731154B2 (zh)
EP (1) EP3256586B1 (zh)
JP (1) JP6826984B2 (zh)
CN (1) CN107466323A (zh)
AU (1) AU2016217825B2 (zh)
CA (1) CA2976688A1 (zh)
WO (1) WO2016128583A2 (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SG11202104901VA (en) 2018-11-12 2021-06-29 Mitsubishi Tanabe Pharma Corp Crosslinked artificial nucleic acid alna
WO2023093960A1 (en) * 2021-11-26 2023-06-01 Syddansk Universitet Modified peptide-oligonucleotide conjugate

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014118267A1 (en) * 2013-01-30 2014-08-07 Santaris Pharma A/S Lna oligonucleotide carbohydrate conjugates

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE60315444T2 (de) 2002-05-08 2008-04-30 Santaris Pharma A/S Synthese von locked nucleic acid-derivaten
WO2009039862A2 (en) * 2007-09-28 2009-04-02 Ribotask Aps Enzymatic incorporation of lna nucleotides
AR090905A1 (es) * 2012-05-02 2014-12-17 Merck Sharp & Dohme Conjugados que contienen tetragalnac y peptidos y procedimientos para la administracion de oligonucleotidos, composicion farmaceutica
RU2650510C2 (ru) * 2013-05-01 2018-04-16 Ионис Фармасьютикалз, Инк. Композиции и способы модулирования экспрессии аполипопротеина c-iii

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014118267A1 (en) * 2013-01-30 2014-08-07 Santaris Pharma A/S Lna oligonucleotide carbohydrate conjugates

Non-Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
C A STEIN 等: "Efficient gene silencing by delivery of locked nucleic acid antisense oligonucleotides, unassisted by transfection", 《NUCLEIC ACIDS RESEARCH》 *
JENS KURRECK等: "Design of antisense oligonucleotides stabilized by locked nucleic acids", 《NUCLEIC ACIDS RESEARCH》 *
KARIN E LUNDIN 等: "Biological activity and biotechnological aspects of locked nucleic acids", 《ADVANCES IN GENETICS》 *
MADS D. SØRENSE等: "Functionalized LNA (locked nucleic acid): high-affinity hybridization of oligonucleotides containing N-acylated and N-alkylated 2′-amino-LNA monomers", 《CHEMICAL COMMUNICATIONS》 *
MARIE W. JOHANNSEN等: "Amino acids attached to 2′-amino-LNA: synthesis and excellent duplex stability", 《ORGANIC & BIOMOLECULAR CHEMISTRY》 *
MICHAEL LYKKE HVAM等: "Fatty Acid-Modified Gapmer Antisense Oligonucleotide and Serum Albumin Constructs for Pharmacokinetic Modulation", 《MOLECULAR THERAPY : THE JOURNAL OF THE AMERICAN SOCIETY OF GENE THERAPY》 *
TROELS KOCH: "LNA Antisense: A Review", 《CURRENT PHYSICAL CHEMISTRY》 *
Y ZHANG等: "Down-modulation of cancer targets using locked nucleic acid (LNA)-based antisense oligonucleotides without transfection", 《GENE THERAPY》 *
YAMING WU等: "Downregulation of HER3 by a Novel Antisense Oligonucleotide, EZN-3920, Improves the Antitumor Activity of EGFR and HER2 Tyrosine Kinase Inhibitors in Animal Models", 《MOLECULAR CANCER THERAPEUTICS》 *
李雁斌等: "《临床规范化诊疗与护理》", 31 December 2011, 天津科学技术出版社 *

Also Published As

Publication number Publication date
AU2016217825A1 (en) 2017-09-28
US20180030437A1 (en) 2018-02-01
WO2016128583A3 (en) 2016-10-06
CA2976688A1 (en) 2016-08-18
WO2016128583A2 (en) 2016-08-18
JP2018514186A (ja) 2018-06-07
EP3256586B1 (en) 2021-04-07
US10731154B2 (en) 2020-08-04
EP3256586A2 (en) 2017-12-20
JP6826984B2 (ja) 2021-02-10
AU2016217825B2 (en) 2022-03-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6960123B2 (ja) キメラ２重鎖核酸
CN104245935B (zh) 三环硫代磷酸酯dna
JP4584987B2 (ja) Ｃ５修飾ピリミジンを含むオリゴヌクレオチド
CN110520531A (zh) 产品和组合物
WO2018062510A1 (ja) オーバーハングを有する二本鎖核酸複合体
CN111465694A (zh) 用于抑制细胞中lpa的表达的核酸
CN108186667A (zh) RNAi试剂、组合物及其用于治疗甲状腺素运载蛋白（TTR）相关疾病的使用方法
CN110072530A (zh) 4′-磷酸酯类似物和包含其的寡核苷酸
CN108513588A (zh) Kras表达的调节剂
CN108271351A (zh) 用于调节血管紧张素原表达的化合物和方法
CN103108642A (zh) 皮肤与纤维化症候中的rna干扰
CN104884094A (zh) 通过选择性递送寡核苷酸分子至特定神经元类型治疗帕金森病的组合物和方法
CN110446784A (zh) Pcsk9表达的调节剂
JP2023018065A (ja) Ｒｅｖｅｒｓｉｒ（商標）化合物
TW202126809A (zh) 具有最小氟含量之小干擾rna的化學修飾
JP2020531450A (ja) 調整性ｒｅｖｅｒｓｉｒ（商標）化合物
JP2003505517A (ja) 接合体ならびにそれらの製造方法および生体膜を横切り分子を輸送するためのそれらの使用
CN107466323A (zh) 酰基‑氨基‑lna和/或烃基‑氨基‑lna寡核苷酸
WO2021157730A1 (ja) 核酸医薬とその使用
US11306310B2 (en) MicroRNA inhibitor
JPWO2021002359A1 (ja) 核酸医薬とその使用
EA045986B1 (ru) Нуклеиновые кислоты для ингибирования экспрессии lpa в клетке

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination