JPWO2021002359A1 - 核酸医薬とその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
[態様2]前記p53遺伝子がヒトp53遺伝子である,態様1記載の医薬組成物。
[態様3]前記p53遺伝子が配列番号132の配列を有する,態様1または2記載の医薬組成物。
[態様4]前記オリゴヌクレオチドが本質的に一本鎖の分子である,態様1〜3のいずれか記載の医薬組成物。
[態様5]前記オリゴヌクレオチドがアンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)である,態様1〜4のいずれか記載の医薬組成物。
[態様6]前記アンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)がギャップマーである,態様5記載の医薬組成物。
[態様7]前記オリゴヌクレオチドが12〜18塩基長である,態様1〜6のいずれか記載の医薬組成物。
[態様8]前記オリゴヌクレオチドが14塩基長である,態様7記載の医薬組成物。
[態様9]前記オリゴヌクレオチドが2−10−2ギャップマーである,態様8記載の医薬組成物。
[態様10]前記オリゴヌクレオチド中の塩基が前記p53遺伝子に対して80%以上相補的である,態様1〜9のいずれか記載の医薬組成物。
[態様11]前記オリゴヌクレオチド中の塩基が前記p53遺伝子に対して100%相補的である,態様1〜10のいずれか記載の医薬組成物。
[態様12]前記オリゴヌクレオチドが修飾ヌクレオシドおよび/または修飾ヌクレオシド間結合を含む,態様1〜11のいずれか記載の医薬組成物。
[態様13]修飾ヌクレオシドが架橋型核酸である,態様12記載の医薬組成物。
[態様14]架橋型核酸がLNAである,態様13記載の医薬組成物。
[態様15]修飾ヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である,態様12〜14のいずれか記載の医薬組成物。
[態様16]すべての修飾ヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である,態様12〜15のいずれか記載の医薬組成物。
[態様17]すべてのヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である,態様1〜16のいずれか記載の医薬組成物。
[態様18]修飾ヌクレオシド間結合がキラル制御されている,態様12〜17のいずれか記載の医薬組成物。
[態様19]前記オリゴヌクレオチドの末端水酸基の一方または両方が修飾されている,態様1〜18のいずれか記載の医薬組成物。
[態様20]前記オリゴヌクレオチドの末端水酸基の一方または両方にリン酸基が付加されている,態様1〜19のいずれか記載の医薬組成物。
[態様21]前記オリゴヌクレオチドの末端水酸基の一方または両方が修飾されていない,態様1〜18のいずれか記載の医薬組成物。
[態様22]前記オリゴヌクレオチドの末端水酸基の一方または両方にリン酸基が付加されていない,態様1〜18のいずれか記載の医薬組成物。
[態様23]前記オリゴヌクレオチドが配列番号1から配列番号125のいずれか1つの配列を含むオリゴヌクレオチドである,態様1〜22のいずれか記載の医薬組成物。
[態様24]前記オリゴヌクレオチドが配列番号1から配列番号125のいずれか1つの配列からなるオリゴヌクレオチドである,態様1〜22のいずれか記載の医薬組成物。
[態様25]前記オリゴヌクレオチドが配列番号1から配列番号125のいずれか1つの配列に対して少なくとも80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%,99%,または100%の同一性を有する配列からなるオリゴヌクレオチドである,態様1〜22のいずれか記載の医薬組成物。
[態様26]対象における疾患または症状の治療または予防に用いるための医薬組成物である,態様1〜25のいずれか記載の医薬組成物。
[態様27]前記疾患または症状が,p53遺伝子の発現に関連するものである,態様26記載の医薬組成物。
[態様28]前記疾患または症状が,虚血-再灌流障害,難聴,聴覚障害,バランス障害,失聴,化学療法誘発性脱毛症,放射線療法誘発性脱毛症,急性腎不全,急性腎障害,慢性腎臓病(CKD),抗癌剤療法に関連する副作用,腎移植患者における遅発性移植機能(DGF),脊髄損傷,脳損傷,発作,脳卒中,神経変性疾患,パーキンソン病,アルツハイマー病,腫瘍,熱傷,創傷,高熱症,低酸素,虚血,臓器移植,骨髄移植(BMT),心筋梗塞/心臓発作,心臓毒性,p53陽性の癌,および急性肝不全から成る群より選択される,態様26または27記載の医薬組成物。
[態様29]薬学的に許容される賦形剤,緩衝剤,および/または添加物を含有する,態様1〜28のいずれか記載の医薬組成物。
[態様30]対象における疾患または症状の治療または予防に用いるための医薬組成物であって,p53遺伝子をコードするmRNAの少なくとも一部に実質的に相補的な相補性領域を含む,本質的に一本鎖のオリゴヌクレオチドを有効成分として含有し,該オリゴヌクレオチドが14塩基長のギャップマーであり,該ギャップマーの5’側および3’側のウイング領域がそれぞれ2塩基のLNAからなり,該ギャップマーの全てのヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である,医薬組成物。
[態様31]対象における疾患または症状の治療または予防に用いるための医薬組成物であって,p53−ASO−15,p53−ASO−15−11,p53−ASO−15−12,およびp53−ASO−15−16から成る群より選択されるオリゴヌクレオチドを有効成分として含有する,医薬組成物。
[態様32]p53−ASO−15,p53−ASO−15−11,p53−ASO−15−12,およびp53−ASO−15−16から成る群より選択されるオリゴヌクレオチド,またはその塩。
p53遺伝子は,細胞内でのDNA修復や細胞増殖の停止,細胞増殖サイクルの抑制などに関与しており,細胞が癌化したときにはアポトーシスを起こすとされる遺伝子である。p53はいわゆる癌抑制遺伝子の一つとされ,この遺伝子の機能が障害すると癌が起こると考えられている。細胞が癌化するためには複数の癌遺伝子と癌抑制遺伝子の変化が必要と考えられているが,p53は悪性腫瘍において最も高頻度に異常が認められている遺伝子である。p53ポリペプチドは,例えば,ガンマ線照射などのDNA損傷条件,転写または複製の調節異常,および癌遺伝子による形質転換といった,種々の異なる刺激を細胞増殖の停止やアポトーシスに変換することにより,細胞ストレス応答メカニズムにおいて重要な役割を果たしている。p53ポリペプチドは,そのような刺激に対する応答としてアポトーシス,つまり,プログラムされた細胞死を誘導する。このように,p53は細胞の恒常性の維持やアポトーシス誘導といった重要な役割を有している。ほとんどの抗癌療法は,p53を有する正常な細胞にも傷害を与え,健康な細胞の損傷または死に関連する重篤な副作用を引き起こす。そのような副作用は,p53が誘導する正常細胞の細胞死に多く起因しており,抗癌療法の急性期における一時的なp53の抑制が,こういった重篤な毒性を回避するための治療戦略として提案されている。つまり,当業者には,p53遺伝子の転写産物にASOなどの薬剤を作用させて,p53タンパク質の発現を制御することにより,アポトーシス誘導に関係する疾患または症状を治療または予防できることが理解される。p53遺伝子の発現抑制は,p53遺伝子から転写,翻訳を経て合成されるタンパク質量を,薬剤を作用させていない場合に比べて,75%以下,50%以下,40%以下,30%以下,25%以下,20%以下,15%以下,10%以下,5%以下,または3%以下に低減させることにより行われ得る。本発明の態様の一つは,対象におけるp53遺伝子の発現に関連する疾患または症状の治療または予防に用いるための医薬組成物に関する。特定の実施態様においては,標的となる疾患または症状は,虚血−再灌流障害,難聴,聴覚障害,バランス障害,失聴,化学療法誘発性脱毛症,放射線療法誘発性脱毛症,急性腎不全,急性腎障害,慢性腎臓病(CKD),抗癌剤療法に関連する副作用,腎移植患者における遅発性移植機能(DGF),脊髄損傷,脳損傷,発作,脳卒中,神経変性疾患,パーキンソン病,アルツハイマー病,腫瘍,熱傷,創傷,高熱症,低酸素,虚血,臓器移植,骨髄移植(BMT),心筋梗塞/心臓発作,心臓毒性,p53陽性の癌,または急性肝不全であるが,標的はこれらに限定はされない。
アンチセンスオリゴヌクレオチド(ASOとも呼ばれる)は,標的核酸の少なくとも一部に対して実質的に相補的な配列を有し,対応する核酸塩基間のワトソン−クリック型,フーグスティーン型,または逆フーグスティーン型の水素結合によりハイブリダイズする一本鎖オリゴヌクレオチドを指す。アンチセンスオリゴヌクレオチドは,その標的核酸へのハイブリダイゼーションに起因する検出可能または測定可能なアンチセンス活性を示すことができる。アンチセンス効果が奏されるメカニズムは,アンチセンスオリゴヌクレオチドと標的核酸とのハイブリダイゼーションに起因する任意のメカニズムを含み,例えば,そのハイブリダイゼーションの結果または効果は,標的の分解または標的の占拠のいずれかであり得る。特定の実施形態において,アンチセンス活性は,標的核酸の量または発現の減少,またはそのような標的核酸によってコードされるタンパク質の量または発現の減少である。例えば,アンチセンス活性は,特定の実施形態においては,標的の分解(切断)によるアンチセンス阻害であり,これは,標的核酸に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドの存在下における標的核酸レベルの低下を意味する。特に,4塩基以上の連続したDNAを少なくとも一部に含むアンチセンスオリゴヌクレオチドは,標的RNAとハイブリダイズして細胞内のRNase Hの基質となり,標的RNAの特異的な分解(切断)を誘導することができる。また,特定の実施形態において,アンチセンス活性は,標的の占拠による立体障害に起因するタンパク質結合阻害であり,その結果,翻訳の抑制やスプライシングの調節(例えば,エキソンスキッピング)が生じる。
修飾ヌクレオシドとしては,例えばRNAまたはDNAと比較して,ヌクレアーゼ耐性の向上または安定化させるため,相補鎖核酸とのアフィニティーをあげるため,細胞透過性をあげるため,あるいは可視化させるために,リボヌクレオシド,デオキシリボヌクレオシド,RNAまたはDNAに修飾を施した分子を挙げることができ,例えば,2’−MOE、LNA、ENAなどの糖部修飾ヌクレオシドが例示される。本発明のASOは,例えば,Khvorova & Watts(Nature Biotechnology 35, 238-248 (2017) doi:10.1038/nbt.3765)に開示の修飾核酸分子を含んでいてもよい。
天然のDNA,RNAはヌクレオシド間結合として,ホスホジエステル結合を有している。本発明の一つの態様においては,ヌクレオシド間結合は,修飾を含んでいてもよい。修飾ヌクレオシド間結合とは,天然に存在するヌクレオシド間結合(すなわち,ホスホジエステル結合)からの置換または任意の変化を有するヌクレオシド間結合を指し,修飾ヌクレオシド間結合には,リン原子を含むヌクレオシド間結合,およびリン原子を含まないヌクレオシド間結合が含まれる。修飾ヌクレオシド間結合としては,ヌクレオチドのリン酸ジエステル結合の化学構造の一部あるいは全てに対し,任意の化学物質を付加あるいは置換したものでもよく,例えば,ホスホロチオエート結合に置換された修飾ヌクレオシド間結合,N3’−P5’ホスフォアミデート結合に置換された修飾ヌクレオシド間結合等を挙げることができる。他の修飾ヌクレオシド間結合としては(SC5’Rp)−α,β−CNA,PMOなどが挙げられる。
核酸に別の化学物質を付加した分子としては,例えば,5’−ポリアミン付加誘導体,コレステロール付加誘導体,ステロイド付加誘導体,胆汁酸付加誘導体,ビタミン付加誘導体,Cy5付加誘導体,Cy3付加誘導体,6−FAM付加誘導体,ビオチン付加誘導体等および北出らの誘導体(PCT/JP2007/000087,PCT/JP2016/59398)を挙げることができる。リガンド等を付加する部位は,オリゴヌクレオチドの末端(5’末端または3’末端)および/またはオリゴヌクレオチドの内部であり得る。リガンド等は,リガンド等を付加したASOに相補的なオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを介して間接的に結合していてもよい(WO2013/089283A1)。
ASOの配列は,標的とする遺伝子の塩基配列に基づき設計することができる。ASO配列の設計方法は,当業者には公知であり,これまでに多数のASOが設計され,その活性が評価されている。例えば,p53遺伝子を標的としたアンチセンスオリゴヌクレオチドの例は,EP1012267B1,EP1889911A2,WO98/33904,EP1598420A2,WO95/09916,WO20/24885,WO98/22142,WO1993/003770,米国特許第5654415号,米国特許第5641754号,米国特許第5087617号,日本国特許第5671791号,Hata et al.Biochemical and Biophysical Research Communivcations 1991, 179, 528-534, Bayever et al. Leukemia & Lymphoma 1994, 12, 223-231, Mahdi et al. Journal of Cell Science 1995, 108, 1287-1293, Hirota et al. Jpn. J. Cancer Res. 1996, 87, 735-742, Dai et al. Acta Pharmacologica Sinica 2006, 27, 1453-1458,Robu et al. Pros Genetics 2007, 3, e78, alachkar et al.Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis,2012,71, 228-232, Gorska et al. 2013, PLoS ONE 8(11): e78863, Swiatkowska et al. PLOS ONE, 2015, 10, e0141676, Swaitkowska et al. Acta Biochimica Polonica, 2016, 63, 645-651.に開示されている。ASOの配列は,標的とするRNAの二次構造あるいは三次構造を考慮して決定してもよい。本発明者らは,MobyDick(商標)と名付けた独自のアルゴリズムを配列決定の際に利用している。
- Markham, N. R. & Zuker, M. (2005) DINAMelt web server for nucleic acid melting prediction. Nucleic Acids Res., 33, W577-W581;
- Markham, N. R. & Zuker, M. (2008) UNAFold: software for nucleic acid folding and hybridization. In Keith, J. M., editor, Bioinformatics, Volume II. Structure, Function and Applications, number 453 in Methods in Molecular Biology, chapter 1, pages 3-31. Humana Press, Totowa, NJ. ISBN 978-1-60327-428-9.)。
本発明に係るアンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)は,配列番号1から配列番号125のいずれか1つの配列に対して実質的に同一であり得る。ここで,実質的に同一とは,オリゴヌクレオチドが標的配列に対して完全(100%)に同一である必要はなく,80%以上の同一性を有することを意味する。特定の実施形態においては,オリゴヌクレオチドが配列番号1から配列番号125のいずれか1つの配列に対して少なくとも80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%,99%,または100%の同一性を有するオリゴヌクレオチドであり得る。同一性の値は,WO2016/027747の記載に従って算出することができる(その内容は参照により本明細書に取り込まれる)。ASOによる発現または活性の阻害は,発現または活性の減少または阻止を指し,必ずしも発現または活性が完全に排除される必要はない。
オリゴヌクレオチドの細胞への送達には,トランスフェクション試薬,リポソーム,ベクター,ナノミセル,相補的核酸などのDDSツールが利用されうる。なお,本発明の一部の態様において,アンチセンスオリゴヌクレオチドは,本質的に一本鎖の分子である。ここで,本質的に一本鎖であるとは,オリゴヌクレオチドの送達や製剤化の過程において,一時的に相補的な別個の核酸と二本鎖を形成しても良いことを意味する。オリゴヌクレオチドが,標的RNAにハイブリダイズしてアンチセンス効果を発揮する際には,一本鎖のオリゴヌクレオチドの形で作用し,最終的には標的RNAとASOとにより二本鎖が形成される。なお,本発明の一部の態様において,配列番号1から125の配列を有するオリゴヌクレオチドは,siRNAの一部としても用いられうる。
国際公開第2013/089283号およびNishina et al., Nature Communications volume 6, Article number: 7969 (2015)には,ASOと相補的なRNAオリゴヌクレオチドを含む二本鎖オリゴヌクレオチド(HDOとも呼ばれる)がASOと比較して、効率よく肝臓に送達,集積され,肝臓での標的遺伝子の発現が抑制されることが記載されている。国際公開第2015/105083号には,HDOにGalNAc誘導体がリンカーを介して結合しているASOが記載されており,そのようなアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いると,トコフェロール(Toc)修飾体より効率的に標的遺伝子の発現が抑制されることが記載されている。さらに,国際公開第2017/13112号には,ASOに相補的なオリゴヌクレオチドを連結させて,分子内で二本鎖を形成するようにした一本鎖オリゴヌクレオチドが,二本鎖オリゴヌクレオチドと同等以上のアンチセンス効果を示すことが記載されている。よって,本発明の一部の態様では,ASOは,それに相補的な核酸鎖と二本鎖を形成していてもよい。また,本発明の一部の態様では,ASOは,それに相補的な核酸鎖と連結されており,分子内のセルフアニーリングにより,二本鎖部分を形成していてもよい。さらに,本発明の一部の態様では,ASOに相補的な核酸領域にトコフェロール(Toc)やGalNAcなどのリガンドが連結されていてもよい。さらに,一部の態様では,本開示のオリゴヌクレオチドは,siRNA二重鎖の一部として用いられてもよい。
アンチセンス核酸はそれ単独で製剤化することもできるが,通常は薬理学的に許容される1つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し,製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として投与するのが望ましい。医薬組成物には,異なる配列を有する複数のASOの混合物が含まれていてもよい。
本発明の一つの態様は,患者における疾患または障害の治療または予防に用いるための医薬の製造における,約14〜20merのオリゴヌクレオチド(ASO)の使用に関する。一部の態様においては,14merのASOが好適に用いられる。
急性腎不全(ARF)は,例えば,心血管系の大手術を受けた患者においては,手術中の腎臓への局所血流の減少および血流回復後の再灌流障害に起因して,術後数時間から数日以内に発症するおそれがあり,発症後30日の死亡率は50%を超える。急性腎不全の予防,重症度の軽減,または治療を行うために,本発明に係るASOを患者に投与することができる。ASOの投与は,例えば,手術の開始前(例えば,2時間前,4時間前,または6時間前)から手術後8時間以内(例えば術後3時間後,4時間後,または5時間後)のいずれかの時点で行うことができる。投与は,単回または複数回のいずれでも行われ得る。投与は,例えば静脈注射により行われ得る。
p53を標的とした配列をASOについて設計し,合成した。設計にはNCBI Refseqコレクションに登録されているヒト転写物NM_000546.5(配列番号132,図1)を利用した。合成は株式会社ジーンデザイン(GeneDesign)に委託した。
5’-5(L)G(L)t^t^g^t^t^t^t^c^a^g^G(L)A(L)-3’
p53−ASO−02(配列番号2)
5’-T(L)G(L)a^a^c^c^a^t^t^g^t^t^5(L)A(L)-3’
p53−ASO−03(配列番号3)
5’-G(L)T(L)g^a^a^c^c^a^t^t^g^t^T(L)5(L)-3’
p53−ASO−04(配列番号4)
5’-5(L)A(L)c^g^c^c^c^a^c^g^g^a^T(L)5(L)-3’
p53−ASO−05(配列番号5)
5’-5(L)T(L)c^a^c^g^c^c^c^a^c^g^G(L)A(L)-3’
p53−ASO−06(配列番号6)
5’-5(L)A(L)t^c^t^c^g^a^a^g^c^g^5(L)T(L)-3’
p53−ASO−07(配列番号7)
5’-T(L)G(L)a^g^t^t^c^c^a^a^g^g^5(L)5(L)-3’
p53−ASO−08(配列番号8)
5’-5(L)5(L)t^t^g^a^g^t^t^c^c^a^A(L)G(L)-3’
p53−ASO−09(配列番号9)
5’-G(L)G(L)a^g^c^c^c^a^g^c^a^g^5(L)T(L)-3’
p53−ASO−10(配列番号10)
5’-5(L)G(L)g^a^g^c^c^c^a^g^c^a^G(L)5(L)-3’
p53−ASO−11(配列番号11)
5’-5(L)T(L)c^c^c^a^g^c^c^c^g^a^A(L)5(L)-3’
p53−ASO−12(配列番号12)
5’-5(L)5(L)c^a^g^c^c^c^g^a^a^c^G(L)5(L)-3’
p53−ASO−13(配列番号13)
5’-G(L)T(L)c^a^c^c^g^t^c^g^t^g^G(L)A(L)-3’
p53−ASO−14(配列番号14)
5’-T(L)5(L)c^a^g^g^g^a^a^g^c^g^T(L)G(L)-3’
p53−ASO−15(配列番号15)
5’-G(L)G(L)c^a^g^t^g^a^c^c^c^g^G(L)A(L)-3’
p53−ASO−16(配列番号16)
5’-5(L)5(L)c^a^c^a^g^c^t^g^c^a^5(L)A(L)-3’
p53−ASO−17(配列番号17)
5’-G(L)T(L)c^a^t^g^t^g^c^t^g^t^G(L)A(L)-3’
p53−ASO−18(配列番号18)
5’-A(L)G(L)t^g^t^t^t^c^t^g^t^c^A(L)T(L)-3’
p53−ASO−19(配列番号19)
5’-G(L)G(L)c^a^c^c^a^c^c^a^c^a^5(L)T(L)-3’
p53−ASO−20(配列番号20)
5’-5(L)T(L)c^c^a^t^c^c^a^g^t^g^G(L)T(L)-3’
p53−ASO−21(配列番号21)
5’-5(L)T(L)t^c^a^g^g^t^g^g^c^t^G(L)G(L)-3’
p53−ASO−22(配列番号22)
5’-T(L)T(L)t^a^t^g^g^c^g^g^g^a^G(L)G(L)-3’
p53−ASO−23(配列番号23)
5’-G(L)A(L)g^t^t^t^t^t^t^a^t^g^G(L)5(L)-3’
5%CO2雰囲気下で37℃において,10%FBS(Cat no.F7524,SIGMA,非働化済),1%抗体含有D−MEM(和光純薬工業株式会社Cat no.041-29775)培地でHeLa細胞を直径10cmのシャーレに播種して,コンフルエンス近くに培養してから,トリプシン処理によってプレートから遊離させた。24ウェルプレート内で,2×104細胞数/500μL/1ウェル,計2ウェルとして(N=2),一晩培養した。次の日には,予めrefolding(85℃,5min後、氷上で急冷)を実施したp53−ASO−01〜23をそれぞれ最終濃度125nMになるように,また,非カチオン性脂質担体TransIT-TKO(Mirus社製Cat no.MIR2150)1ウェルあたり2.5μLを上述の無血清培地にそれぞれ添加して,最終的に50μLなるようにピペッティングで良く混ぜたあと,室温で15分間インキュベートし,こちらの混合液を各ウェルにゆっくり添加して,形質移入を実施した。細胞を24または48時間のいずれかにわたり培養した。
p53 5’プライマー: 5’-CCTCTCCCCAGCCAAAGAAG-3’
配列番号127
p53 3’プライマー: 5’-GCCTCATTCAGCTCTCGGAA-3’
配列番号128
GAPDH 5’プライマー: 5’-CCCACTCCTCCACCTTTGAC-3’
配列番号129
GAPDH 3’プライマー: 5’-ACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3’
配列番号130
UBC 5’プライマー: 5’-ATTTGGGTCGCGGTTCTTG-3’
配列番号131
UBC 3’プライマー: 5’-TGCCTTGACATTCTCGATGGT-3’
p53−ASO−15の設計を基に,標的mRNAにハイブリダイズするASOの位置を5’側あるいは3’側にずらしたアンチセンス配列(ASO−24,ASO−15−18〜ASO−15−28;配列番号24〜35)を設計した。鎖長はp53−ASO−15と同じ14merである。なお,以下に示す配列は,左側が3’末端,右側が5’末端となっており,小文字はDNA,大文字はLNA,大文字のCは特にLNA型の5−メチルシチジンを表している(以下同様)。
p53−ASO−15の設計を基に,標的mRNAにハイブリダイズするASOの位置を5’側あるいは3’側にずらして設計した(ASO−25〜ASO−36;配列番号36〜47)。鎖長はp53−ASO−15よりも1nt短い13merとした。
p53−ASO−15の設計を基に,ASOの位置を5’側あるいは3’側にずらして設計した(ASO−37〜ASO−49,ASO−15−40;配列番号48〜61)。鎖長はp53−ASO−15よりも1nt長い15merとした。
p53−ASO−15の設計を基に,ASOの位置を5’側あるいは3’側にずらして設計した(ASO−50〜ASO−63,ASO−15−10;配列番号62〜76)。鎖長はp53−ASO−15よりも2nt長い16merである。
p53−ASO−15の設計を基に,ASOの位置を5’側あるいは3’側にずらして設計した(ASO−64〜ASO−78,ASO−15−41;配列番号77〜92)。鎖長はp53−ASO−15よりも3nt長い17merである(以後17merシリーズと呼ぶ)。
p53−ASO−15の設計を基に,ASOの位置を5’側あるいは3’側にずらして設計した(ASO−79〜ASO−94,ASO−(95),ASO−15−11;配列番号93〜109)。鎖長はp53−ASO−15よりも4nt長い18merである(以後18merシリーズ)。
p53−ASO−15の設計を基に,両端に位置するLNAの数を変更し,発現抑制効果に与える影響を調べた(ASO−15−29〜ASO−15−33;配列番号110〜114)。また,両末端のLNAを2’−O−メトキシエチル(MOE)に変更したASOも同時に抑制効果を評価した。
p53−ASO−15を中心に鎖長を5’側,3’側あるいは両端に2ntずつ延長した。また,塩基間をすべてPS結合化した15−16,ギャップ領域を狭めた15−17も同時に評価した(ASO−15−07〜ASO−15−17;配列番号115〜125)。
p53−ASO−15−16の3’末端にコレステロールを付加したp53−ASO−15−16−32を終濃度20nMでHeLa細胞にトランスフェクトし,実施例2と同様なアッセイを行った。結果を図11に示す。3’末端にコレステロールを付加したp53ASO−15−16−32はMock,あるいはネガティブコントロールであるNTS1と比べて,顕著にp53mRNAレベルを減少させていた。15−16と比較すると,トランスフェクション後1日目では若干抑制効果が弱まったが,2日目では同等の効果を有していた。この結果からリガンドとしてコレステロールを付加しても抑制効果が維持されることが示された。
p53応答エレメントをもつ,レポータープラスミドを用いたルシフェラーゼアッセイにより,p53タンパク質量を測定した。p53−ASO−15,およびQuark社のsiRNAであるQP1002の発現抑制効果をルシフェラーゼアッセイによって評価した。1日後の結果を図12に示す。ASOは1.2nMから効果を示し,100nMまで濃度依存的に発現を抑制した。QPI1002(siRNA)は濃度依存的に発現を抑制し,3.7nMから上の濃度では約80%の効果で頭打ちになっていた。
p53ASO−15あるいはQPI−1002を0.046〜100nMの濃度でHCT116細胞にTFし,実施例2と同様のアッセイを行うことで発現抑制効果を測定した。結果を図14に示す。TF後24hrではp53−ASO−15は0.046〜11nMでは抑制効果をほとんど示さず,33nMで24%,100nMで49%の抑制効果を示した。同条件下でのQPI−1002の抑制効果は0.046〜11nMでは抑制効果をほとんど示さず,33nMで23%,100nMで59%の抑制効果を示した。TF後48hrではp53−ASO−15は0.046〜3.7nMでは抑制効果をほとんど示さず,11nMで10%,33nMで22%,100nMで52%の抑制効果を示した。同条件下でのQPI−1002の抑制効果は0.046〜3.7nMでは抑制効果をほとんど示さず,10nMでは15%,33nMで31%,100nMで79%の抑制効果を示した。なお、Δp53と表記したサンプルはp53遺伝子をノックアウトしたHCT116細胞から抽出したRNAを用いている。
HCT116細胞にASOあるいはQPI−1002を1〜100nMの濃度でトランスフェクト(TF)し,その後48時間で細胞を回収した。回収した細胞は二群に分け,一方からは全細胞ライゼートを調製し,もう一方からはトータルRNAを調製した(図15)。調製した全細胞ライゼートを用いてウエスタンブロッティングを行いp53タンパク質レベルを測定した。また、調製したトータルRNAを用いてリアルタイムPCRを行いp53mRNAレベルを測定した。結果を図16に示す。p53タンパク質レベルはmRNAレベルと相関しており,ASO−15,15−16を用いた場合100nMではp53のバンドが検出されないほどに減弱していた。対して,QPI−1002は100nMの濃度でもバンド強度は弱くなるものの検出は可能なレベルであった。
Claims (32)
- 細胞においてp53遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物であって,p53遺伝子をコードするmRNAの少なくとも一部に実質的に相補的な相補性領域を含むオリゴヌクレオチドを有効成分として含有する,医薬組成物。
- 前記p53遺伝子がヒトp53遺伝子である,請求項1記載の医薬組成物。
- 前記p53遺伝子が配列番号132の配列を有する,請求項1または2記載の医薬組成物。
- 前記オリゴヌクレオチドが本質的に一本鎖の分子である,請求項1〜3のいずれか一項記載の医薬組成物。
- 前記オリゴヌクレオチドがアンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)である,請求項1〜4のいずれか一項記載の医薬組成物。
- 前記アンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)がギャップマーである,請求項5記載の医薬組成物。
- 前記オリゴヌクレオチドが12〜18塩基長である,請求項1〜6のいずれか一項記載の医薬組成物。
- 前記オリゴヌクレオチドが14塩基長である,請求項7記載の医薬組成物。
- 前記オリゴヌクレオチドが2−10−2ギャップマーである,請求項8記載の医薬組成物。
- 前記オリゴヌクレオチド中の塩基が前記p53遺伝子に対して80%以上相補的である,請求項1〜9のいずれか一項記載の医薬組成物。
- 前記オリゴヌクレオチド中の塩基が前記p53遺伝子に対して100%相補的である,請求項1〜10のいずれか一項記載の医薬組成物。
- 前記オリゴヌクレオチドが修飾ヌクレオシドおよび/または修飾ヌクレオシド間結合を含む,請求項1〜11のいずれか一項記載の医薬組成物。
- 修飾ヌクレオシドが架橋型核酸である,請求項12記載の医薬組成物。
- 架橋型核酸がLNAである,請求項13記載の医薬組成物。
- 修飾ヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である,請求項12〜14のいずれか一項記載の医薬組成物。
- すべての修飾ヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である,請求項12〜15のいずれか一項記載の医薬組成物。
- すべてのヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である,請求項1〜16のいずれか一項記載の医薬組成物。
- 修飾ヌクレオシド間結合がキラル制御されている,請求項12〜17のいずれか一項記載の医薬組成物。
- 前記オリゴヌクレオチドの末端水酸基の一方または両方が修飾されている,請求項1〜18のいずれか一項記載の医薬組成物。
- 前記オリゴヌクレオチドの末端水酸基の一方または両方にリン酸基が付加されている,請求項1〜19のいずれか一項記載の医薬組成物。
- 前記オリゴヌクレオチドの末端水酸基の一方または両方が修飾されていない,請求項1〜18のいずれか一項記載の医薬組成物。
- 前記オリゴヌクレオチドの末端水酸基の一方または両方にリン酸基が付加されていない,請求項1〜18のいずれか一項記載の医薬組成物。
- 前記オリゴヌクレオチドが配列番号1から配列番号125のいずれか1つの配列を含むオリゴヌクレオチドである,請求項1〜22のいずれか一項記載の医薬組成物。
- 前記オリゴヌクレオチドが配列番号1から配列番号125のいずれか1つの配列からなるオリゴヌクレオチドである,請求項1〜22のいずれか一項記載の医薬組成物。
- 前記オリゴヌクレオチドが配列番号1から配列番号125のいずれか1つの配列に対して少なくとも80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%,99%,または100%の同一性を有する配列からなるオリゴヌクレオチドである,請求項1〜22のいずれか一項記載の医薬組成物。
- 対象における疾患または症状の治療または予防に用いるための医薬組成物である,請求項1〜25のいずれか一項記載の医薬組成物。
- 前記疾患または症状が,p53遺伝子の発現に関連するものである,請求項26記載の医薬組成物。
- 前記疾患または症状が,虚血-再灌流障害,難聴,聴覚障害,バランス障害,失聴,化学療法誘発性脱毛症,放射線療法誘発性脱毛症,急性腎不全,急性腎障害,慢性腎臓病(CKD),抗癌剤療法に関連する副作用,腎移植患者における遅発性移植機能(DGF),脊髄損傷,脳損傷,発作,脳卒中,神経変性疾患,パーキンソン病,アルツハイマー病,腫瘍,熱傷,創傷,高熱症,低酸素,虚血,臓器移植,骨髄移植(BMT),心筋梗塞/心臓発作,心臓毒性,p53陽性の癌,および急性肝不全から成る群より選択される,請求項26または27記載の医薬組成物。
- 薬学的に許容される賦形剤,緩衝剤,および/または添加物を含有する,請求項1〜28のいずれか一項記載の医薬組成物。
- 対象における疾患または症状の治療または予防に用いるための医薬組成物であって,p53遺伝子をコードするmRNAの少なくとも一部に実質的に相補的な相補性領域を含む,本質的に一本鎖のオリゴヌクレオチドを有効成分として含有し,該オリゴヌクレオチドが14塩基長のギャップマーであり,該ギャップマーの5’側および3’側のウイング領域がそれぞれ2塩基のLNAからなり,該ギャップマーの全てのヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である,医薬組成物。
- 対象における疾患または症状の治療または予防に用いるための医薬組成物であって,p53−ASO−15,p53−ASO−15−11,p53−ASO−15−12,およびp53−ASO−15−16から成る群より選択されるオリゴヌクレオチドを有効成分として含有する,医薬組成物。
- p53−ASO−15,p53−ASO−15−11,p53−ASO−15−12,およびp53−ASO−15−16から成る群より選択されるオリゴヌクレオチド,またはその塩。
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