JPWO2018062510A1 - オーバーハングを有する二本鎖核酸複合体 - Google Patents
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Abstract
Description
[1] 第1核酸鎖と第2核酸鎖とを含む核酸複合体であって、
該第1核酸鎖は、標的転写産物の少なくとも一部にハイブリダイズすることが可能な塩基配列を含み、
該第1核酸鎖は、標的転写産物に対してアンチセンス効果を有し、
該第2核酸鎖は、該第1核酸鎖に相補的な塩基配列を含む相補的領域と、該相補的領域の5'末端および/または3'末端側に位置する少なくとも1つのオーバーハング領域とを含み、
該第1核酸鎖は、該第2核酸鎖中の相補的領域にアニールしている、核酸複合体。
[2] 前記第2核酸鎖中のオーバーハング領域が、少なくとも9塩基長である、[1]に記載の核酸複合体。
[3] 前記第1核酸鎖が、13〜20塩基長である、[1]または[2]に記載の核酸複合体。
[4] 前記第2核酸鎖が、30塩基長以下である、[1]〜[3]のいずれかに記載の核酸複合体。
[5] 前記第2核酸鎖中のオーバーハング領域の遊離末端から少なくとも1つのヌクレオシド間結合が、修飾ヌクレオシド間結合である、[1]〜[4]のいずれかに記載の核酸複合体。
[6] 前記第2核酸鎖中のオーバーハング領域におけるヌクレオシド間結合の少なくとも50%が、修飾ヌクレオシド間結合である、[1]〜[5]のいずれかに記載の核酸複合体。
[7] 前記修飾ヌクレオシド間結合が、ホスホロチオエート結合である、[5]または[6]に記載の核酸複合体。
[8] 前記第2核酸鎖中のオーバーハング領域の遊離末端から少なくとも1つのヌクレオシドが、修飾ヌクレオシドである、[1]〜[7]のいずれかに記載の核酸複合体。
[9] 前記修飾ヌクレオシドが、二環式糖を含む、[8]に記載の核酸複合体。
[10] 前記第1核酸鎖が、BNA/DNAギャップマー、BNA/DNAミックスマーまたはBNA/RNAミックスマーである、[1]〜[9]のいずれかに記載の核酸複合体。
[11] 前記第1核酸鎖が、ペプチド核酸および/またはモルホリノ核酸を含む、[1]〜[10]のいずれかに記載の核酸複合体。
[12] 前記第1核酸鎖が、少なくとも1つの修飾ヌクレオシドを含み、該修飾ヌクレオシドは、2'-O-メチル基を含む糖を含む、[1]〜[11]のいずれかに記載の核酸複合体。
[13] 前記第2核酸鎖が、標識機能、精製機能、および標的送達機能から選択される機能を有する機能性部分をさらに含む、[1]〜[12]のいずれかに記載の核酸複合体。
[14] 前記第2核酸鎖中のオーバーハング領域が、治療用オリゴヌクレオチド領域ではない、[1]〜[13]のいずれかに記載の核酸複合体。
[15] 前記第2核酸鎖中の相補的領域が、少なくとも2個の連続したリボヌクレオシドを含まない、[1]〜[14]のいずれかに記載の核酸複合体。
[16] 前記第2核酸鎖中のオーバーハング領域が、二環式糖を含む修飾ヌクレオシドを含み、かつ9〜12塩基長である、[1]〜[15]のいずれかに記載の核酸複合体。
[17] 前記第2核酸鎖中のオーバーハング領域が、二環式糖を含む修飾ヌクレオシドを含まず、かつ9〜17塩基長である、[1]〜[15]のいずれかに記載の核酸複合体。
[18] [1]〜[17]のいずれかに記載の核酸複合体と、薬学的に許容可能な担体とを含む、組成物。
[19] 静脈内投与、脳室内投与、髄腔内投与、筋肉内注射投与、持続点滴投与、腹腔内投与、吸入、皮膚貼付または皮下投与用である、[18]に記載の組成物。
本発明は、核酸複合体に関する。この核酸複合体は、第1核酸鎖と第2核酸鎖とを含む。本発明に係る核酸複合体において、第1核酸鎖は、標的転写産物の少なくとも一部にハイブリダイズすることが可能な塩基配列を含むヌクレオチド鎖である。第1核酸鎖は、標的遺伝子の転写産物または標的転写産物に対してアンチセンス効果を有するヌクレオチド鎖である。
アンチセンス効果によって標的遺伝子の発現または標的転写産物のレベルを抑制するための、上記の核酸複合体を有効成分として含む組成物も提供される。本明細書では、用語「標的転写産物のレベル」は、「標的転写産物の発現量」と互換的に用いられる。
以下の実施例で用いるオリゴヌクレオチドの配列を表1にまとめて示す。
一実施形態による二本鎖核酸剤の有用性を検証するin vivo実験を行った。ヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチド(heteroduplex oligonucleotide、以下「HDO」と称する)および本発明の一実施形態のオーバーハング二重鎖オリゴヌクレオチド(overhanging-duplex oligonucleotide、以下「オーバーハング」と称する)の2種類の二本鎖剤を、従来の一本鎖LNA/DNAギャップマー型のアンチセンスオリゴヌクレオチド(以下「ASO」と称する)を対照として用いて評価した。オーバーハング部分単独の有効性も比較した。
体重20〜25gの4週齢の雌のICRマウスを使用した。核酸剤を、マウスにそれぞれ尾静脈を通じて0.173μmol/kgの量(n=5)で静脈内注射した。さらにまた、陰性対照群として、(核酸剤の代わりに)PBSのみを注射したマウスも作製した。注射の72時間後、PBSをマウスに灌流させ、その後マウスを解剖して肝臓を摘出した。続いて、RNAを、IsogenIIキット(株式会社ジーンデザイン)を使用してプロトコルに従って抽出した。cDNAは、Transcriptor Universal cDNA Master, DNase (ロシュ・ダイアグノスティックス社(Roche Diagnostics))を使用してプロトコルに従って合成した。定量RT-PCRは、TaqMan(ロシュ・アプライドサイエンス社(Roche Applied Science))により実施した。定量RT-PCRにおいて使用したプライマーは、様々な遺伝子数に基づいて、サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック社(Thermo Fisher Sceientific、旧ライフ・テクノロジーズ社(Life Technologies Corp))によって設計および製造された製品であった。増幅条件(温度および時間)は以下のとおりであった:95℃で15秒、60℃で30秒、および72℃で1秒(1サイクル)を40サイクル繰り返した。このようにして得られた定量RT-PCRの結果に基づいて、アポリポタンパク質B(ApoB)の発現量/GAPDH(内部標準遺伝子)の発現量をそれぞれ計算した。また各群の結果を比較し、さらにボンフェローニ検定によって評価した。
実施例1の結果は、図6のグラフに示される。1本鎖「ASO」、「HDO」および「オーバーハング」の3つの核酸試薬は全て、陰性対照(PBSのみ)と比較して、ApoB mRNAの発現の阻害を示した。しかし、本発明の一実施形態である「オーバーハング」によって得られた阻害度は、一本鎖ASOおよびHDOによって得られた阻害度よりも大きく、その差は統計的に有意であった。一方で、オーバーハング部分単独は、ApoB mRNAの発現を阻害しなかった。 これらの結果から、アンチセンスオリゴヌクレオチドを、オーバーハング領域を有する相補鎖とアニールさせた二本鎖核酸複合体は、生体内に効率的に送達され、アンチセンス効果をもたらすことが示された。
第2鎖の突出方向または二本鎖形成部分の化学修飾が異なる、一実施形態による二本鎖核酸剤の有用性を検証するin vivo実験を行った。標的は実施例1と同じApoB mRNAとした。対照(ASO)も実施例1と同じ一本鎖LNA/DNAギャップマーとした。LNA/DNAギャップマー(第1鎖)を相補鎖(第2鎖)とアニールさせることにより、4つの二本鎖剤(「オーバーハング-5'」、「オーバーハング-3'」、「オーバーハングDNA」、および「オーバーハング2'-OMe」と称する)を調製した。「オーバーハング-5'」および「オーバーハング-3'」は、それぞれ5'末端側および3'末端側にオーバーハングを有する。また、「オーバーハング-5'」の第2鎖における第1鎖と相補的な領域は、5'末端側から数えて11個のRNAヌクレオシドおよび2個の2'-O-Me RNAヌクレオシドを含むのに対し、「オーバーハングDNA」では「オーバーハング-5'」のRNAがDNAに置換されており、「オーバーハング2'-OMe」では「オーバーハング-5'」のRNAが2'-O-メチルRNAに置換されている。実施例2で用いたポリヌクレオチドの配列、化学修飾および構造は、表1および図7に示す。二本鎖剤は実施例1と同様に調製した。
核酸剤を、マウスにそれぞれ尾静脈を通じて0.173μmol/kgの量(n=4)で静脈内注射した。用いたマウスおよびApoB mRNA発現解析方法は実施例1に記載したとおりである。
実施例2の結果は、図8のグラフに示される。5つの核酸試薬は全て、陰性対照(PBSのみ)と比較して、ApoB mRNAの発現の阻害を示した。特に、3種の二本鎖剤(「オーバーハング-5'」、「オーバーハング-3'」、および「オーバーハングDNA」)によって得られた阻害度は、一本鎖ASOによって得られた阻害度よりも大きく、その差は統計的に有意であった。しかし、第2鎖における第1鎖と相補的な領域の一部をRNase耐性2'-O-メチル化RNAに置換した二本鎖剤(「オーバーハング2'-OMe」)では、一本鎖ASOと比較して阻害効果の向上は見られなかった。
第2鎖のオーバーハング領域の化学修飾が異なる、一実施形態による二本鎖核酸剤の有用性を検証するin vivo実験を行った。標的は実施例1と同じApoB mRNAとした。対照(ASO)も実施例1と同じ一本鎖LNA/DNAギャップマーとした。LNA/DNAギャップマー(第1鎖)を相補鎖(第2鎖)とアニールさせることにより、3つの二本鎖剤(「オーバーハングDNAのみ」、「オーバーハングDNA/LNA」、および「オーバーハングRNA/LNA」と称する)を調製した。「オーバーハングDNAのみ」のオーバーハング領域は、13個のDNAヌクレオシドを含む。「オーバーハングDNA/LNA」のオーバーハング領域は、5'末端側から順に2個のLNAヌクレオシド、8個のDNAヌクレオシド、および3個のLNAヌクレオシドを含む。「オーバーハングRNA/LNA」では、「オーバーハングDNA/LNA」のオーバーハング領域のDNAがRNAに置換されている。実施例3で用いたポリヌクレオチドの配列、化学修飾および構造は、表1および図9に示す。二本鎖剤は実施例1と同様に調製した。
核酸剤を、マウスにそれぞれ尾静脈を通じて0.173μmol/kgの量(n=4)で静脈内注射した。用いたマウスおよびApoB mRNA発現解析方法は実施例1に記載したとおりである。
実施例3の結果は、図10のグラフに示される。4つの核酸試薬は全て、陰性対照(PBSのみ)と比較して、ApoB mRNAの発現の阻害を示した。本発明の特定の実施形態に係る3種の二本鎖剤(「オーバーハングDNAのみ」、「オーバーハングDNA/LNA」、および「オーバーハングRNA/LNA」)によって得られた阻害度は、一本鎖ASOによって得られた阻害度よりも大きく、その差は統計的に有意であった。
第2鎖がホスホロチオエート置換によって修飾されたヌクレオシド間結合の数において異なる、一実施形態による二本鎖核酸剤の有用性を検証するin vivo実験を行った。標的は実施例1と同じApoB mRNAとした。対照(ASO)も実施例1と同じ一本鎖LNA/DNAギャップマーとした。LNA/DNAギャップマー(第1鎖)を相補鎖(第2鎖)とアニールさせることにより、3つの二本鎖剤(「オーバーハング」、「オーバーハングPS-10」、および「オーバーハングPS+11」と称する)を調製した。「オーバーハング」では、第2鎖(26塩基長)の25個のヌクレオシド間結合は、5'末端側から順に、12個のホスホロチオエート結合(オーバーハング領域における)、ならびに11個のホスホジエステル結合および2個のホスホロチオエート結合とした。「オーバーハングPS-10」では、「オーバーハング」のオーバーハング領域における12個のホスホロチオエート結合を、5'末端の2個のホスホロチオエート結合以外は、ホスホジエステル結合に置換した。「オーバーハングPS+11」では、第2鎖の全てのヌクレオシド間結合をホスホロチオエート結合とした。実施例4で用いたポリヌクレオチドの配列、化学修飾および構造は、表1および図11に示す。二本鎖剤は実施例1と同様に調製した。
核酸剤を、マウスにそれぞれ尾静脈を通じて0.173μmol/kgの量(n=4)で静脈内注射した。用いたマウスおよびApoB mRNA発現解析方法は実施例1に記載されたとおりであった。加えて、核酸剤の肝臓内濃度をTaqMan Small RNA Assay(ロシュ・アプライドサイエンス社)を用いてプロトコルに従って定量RT-PCRにより測定した。
実施例4の結果は、図12のグラフに示される。4つの核酸試薬は全て、陰性対照(PBSのみ)と比較して、ApoB mRNAの発現の阻害を示した。特に、2種の二本鎖剤(「オーバーハング」および「オーバーハングPS+11」)によって得られた阻害度は、一本鎖ASOによって得られた阻害度よりも大きく、その差は統計的に有意であった。一方、第2鎖のオーバーハング領域の多くのホスホロチオエート結合がホスホジエステル結合で置換された二本鎖剤(「オーバーハングPS-10」)によって得られた阻害度は、一本鎖ASOと同程度であった。
この傾向と一致して、「オーバーハング」および「オーバーハングPS+11」の肝臓内濃度は、一本鎖ASOと比較して有意に増加したが、「オーバーハングPS-10」の肝臓内濃度は、一本鎖ASOと同程度であった。
これらの結果から、二本鎖剤の第2鎖のオーバーハング領域におけるホスホロチオエート結合の数が多い場合に、当該二本鎖剤の生体内への送達が促進され、アンチセンス効果が増強されることが示された。
第2鎖が15mer〜26merの範囲にある(第2鎖のオーバーハング領域が2塩基長〜13塩基長の範囲にある)、一実施形態による二本鎖核酸剤の有用性を検証するin vivo実験を行った。標的は実施例1と同じApoB mRNAとした。対照(ASO)も実施例1と同じ一本鎖LNA/DNAギャップマーとした。LNA/DNAギャップマー(第1鎖)を相補鎖(第2鎖)とアニールさせることにより、6つの二本鎖剤(「オーバーハング26mer DNA」、「オーバーハング24mer DNA」、「オーバーハング22mer DNA」、「オーバーハング20mer DNA」、「オーバーハング18mer DNA」、および「オーバーハング15mer DNA」)を調製した。これらの二本鎖剤のオーバーハング領域は、それぞれ、13、11、9、7、5および2個のDNAヌクレオシドを有する。実施例5で用いたポリヌクレオチドの配列、化学修飾および構造は、表1および図13に示す。二本鎖剤は実施例1と同様に調製した。
核酸剤を、マウスにそれぞれ尾静脈を通じて0.173μmol/kgの量(n=4)で静脈内注射した。用いたマウス、ApoB mRNA発現および肝臓内核酸剤濃度の解析方法は実施例4と同様である。
実施例5の結果は、図14のグラフに示される。二本鎖剤のオーバーハング領域の長さが長いほど、ApoB mRNA阻害度および肝臓内核酸剤濃度が増強される傾向が見られた。特に、第2鎖が20mer〜26merの範囲にある(すなわち、第2鎖のオーバーハング領域が7〜13塩基長、特に9〜13塩基長である)二本鎖剤は、高いApoB mRNA阻害度および肝臓内核酸剤濃度を示した。
第2鎖が24merまたは26merであり(第2鎖のオーバーハング領域が11塩基長または13塩基長であり)、かつ、第2鎖のオーバーハング領域の化学修飾が実施例5とは異なる、一実施形態による二本鎖核酸剤の有用性を検証するin vivo実験を行った。標的は実施例1と同じApoB mRNAとした。対照(ASO)も実施例1と同じ一本鎖LNA/DNAギャップマーとした。LNA/DNAギャップマー(第1鎖)を相補鎖(第2鎖)とアニールさせることにより、2つの二本鎖剤(「オーバーハング26mer LNA-Gap」および「オーバーハング24mer LNA-Gap」)を調製した。これらの二本鎖剤のオーバーハング領域は、5'末端側の3個のLNAヌクレオシドおよび3'末端側の2個のLNAヌクレオシド、ならびにそれらの間のDNAヌクレオシドを含み、それぞれ、13塩基長および11塩基長である。実施例6で用いたポリヌクレオチドの配列、化学修飾および構造は、表1および図15に示す。二本鎖剤は実施例1と同様に調製した。
核酸剤を、マウスにそれぞれ尾静脈を通じて0.173μmol/kgの量(n=4)で静脈内注射した。用いたマウス、ApoB mRNA発現および肝臓内核酸剤濃度の解析方法は実施例4と同様である。
実施例6の結果は、図16のグラフに示される。第2鎖が24merまたは26merである(すなわち、第2鎖のオーバーハング領域が11塩基長または13塩基長である)場合、得られたApoB mRNA阻害度および肝臓内核酸剤濃度の両者は、一本鎖ASOの場合よりも大きく、その差は統計的に有意であった。
実施例1〜6で標的としたApoBとは異なる遺伝子であるスカベンジャー受容体B1(scavenger receptor B1、SRB1)mRNAを標的とし、第2鎖が22merまたは26merである(第2鎖のオーバーハング領域が9塩基長または13塩基長である)、一実施形態による二本鎖核酸剤の有用性を検証するin vivo実験を行った。対照(ASO)は、13merの一本鎖LNA/DNAギャップマーとした。このLNA/DNAギャップマーは、5'末端の2個および3'末端の3個のLNAヌクレオシド、ならびにそれらの間の8個のDNAヌクレオシドを含む。このLNA/DNAギャップマーは、マウスのスカベンジャー受容体B1(SRB1) mRNA(配列番号2)の2479〜2491位に相補的である。LNA/DNAギャップマー(第1鎖)を相補鎖(第2鎖)とアニールさせることにより、2つの二本鎖剤(「オーバーハング26mer」および「オーバーハング22mer」)を調製した。これらの二本鎖剤のオーバーハング領域は、それぞれ、13個および9個のDNAヌクレオシドを有する。実施例7で用いたポリヌクレオチドの配列、化学修飾および構造は、表1および図17に示す。二本鎖剤は実施例1と同様に調製した。
核酸剤を、マウスにそれぞれ尾静脈を通じて0.173μmol/kgの量(n=4)で静脈内注射した。用いたマウスおよびSRB1 mRNA発現の解析方法は、SRB1を定量するために定量的RT-PCRで使用したプライマーを除いて、実施例1に記載したとおりである。
実施例7の結果は、図18のグラフに示される。第2鎖が26merまたは22merの二本鎖剤は、一本鎖ASOと比較して、SRB1発現阻害の増強を示す傾向が見られた。特に、第2鎖が26merである(すなわち、第2鎖のオーバーハング領域が13塩基長である)二本鎖剤の場合、得られたSRB1 mRNAの阻害度は、一本鎖ASOの場合よりも大きく、その差は統計的に有意であった。
この結果から、本発明の二本鎖核酸複合体の効果はApoB特異的ではなく、二本鎖核酸複合体は様々な遺伝子転写産物を標的とし得ることが示された。
実施例1〜7で標的としたApoBおよびSRB1とは異なる遺伝子である転位関連肺腺癌転写産物(metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1、MALAT1)ノンコーディングRNAを標的とし、かつ、第2鎖が21、25または29merである(第2鎖のオーバーハング領域が5塩基長、9塩基長または13塩基長である)、一実施形態による二本鎖核酸剤の有用性を検証するin vivo実験を行った。対照(ASO)は、16merの一本鎖LNA/DNAギャップマーとした。このLNA/DNAギャップマーは、5'末端の3個および3'末端の3個のLNAヌクレオシド、ならびにそれらの間の10個のDNAヌクレオシドを含む。このLNA/DNAギャップマーは、マウスの転位関連肺腺癌転写産物(MALAT1)ノンコーディングRNA(配列番号3)の1316〜1331位に相補的である。LNA/DNAギャップマー(第1鎖)を相補鎖(第2鎖)とアニールさせることにより、3つの二本鎖剤(「オーバーハング29mer」、「オーバーハング25mer」および「オーバーハング21mer」)を調製した。これらの二本鎖剤のオーバーハング領域は、それぞれ、13個、9個および5個のDNAヌクレオシドを有する。実施例8で用いたポリヌクレオチドの配列、化学修飾および構造は、表1および図19に示す。二本鎖剤は実施例1と同様に調製した。
核酸剤を、マウスにそれぞれ尾静脈を通じて0.0692μmol/kgの量(n=4)で静脈内注射した。用いたマウスおよびRNA発現の解析方法は、MALAT1 ncRNAを定量するために定量的RT-PCRで使用したプライマーを除いて、実施例1に記載したとおりである。
実施例8の結果は、図20のグラフに示される。二本鎖剤のオーバーハング領域の長さが長いほど、MALAT1発現阻害が増強する傾向が見られた。特に、第2鎖が29merおよび25merである(すなわち、第2鎖のオーバーハング領域が13塩基長および9塩基長である)二本鎖剤の場合、得られたMALAT1 ncRNAの阻害度は、一本鎖ASOの場合よりも大きく、その差は統計的に有意であった。
実施例1〜8で標的としたApoB、SRB1およびMALAT1とは異なるマイクロRNA-122(miR122)を標的とし、かつ、第2鎖が30merである(第2鎖のオーバーハング領域が15塩基長である)、一実施形態による二本鎖核酸剤の有用性を検証するin vivo実験を行った。対照(antimiR)は、15merの一本鎖LNA/DNAミックスマーとした。このLNA/DNAミックスマーは、マウスmiR122(配列番号4)の2〜16位に相補的である。このLNA/DNAミックスマー(第1鎖)を相補鎖(第2鎖)とアニールさせることにより、二本鎖剤(「オーバーハング」および「HDO」)を調製した。「オーバーハング」では、第2鎖は、第1鎖と相補的な領域の5'末端側に15塩基長の、DNAヌクレオシドおよびLNAヌクレオシドからなるオーバーハング領域を有する。「HDO」では、第2鎖は第1鎖と完全に相補的である。「HDO」は、国際公開第2013/089283号に記載される発明の一実施形態である。また、マウスmiR122(配列番号4)の2〜16位に相補的な配列の3'末端側に15塩基長の二重鎖核酸構造を有する「HCDO」(hetero-chimera-duplex oligonucleotide)を調製した。「HCDO」は、国際公開第2014/192310号に記載される発明の一実施形態である。実施例9で用いたポリヌクレオチドの配列、化学修飾および構造は、表1および図21に示す。二本鎖剤は実施例1と同様に調製した。
核酸剤を、マウスにそれぞれ尾静脈を通じて5.89nmol/kgの量(n=5)で静脈内注射した。用いたマウスの解析方法は、実施例1に記載したとおりである。マイクロRNAを、IsogenIIキット(株式会社ジーンデザイン)を使用してプロトコルに従って抽出した。cDNA合成および定量RT-PCRは、TaqMan MicroRNA Assays(サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック社)を使用してプロトコルに従って行った。定量RT-PCRにおいて使用したプライマーは、様々な遺伝子数に基づいて、サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック社(Thermo Fisher Sceientific、旧ライフ・テクノロジーズ社(Life Technologies Corp))によって設計および製造された製品であった。このようにして得られた定量RT-PCRの結果に基づいて、miR122の発現量/U6(内部標準遺伝子)の発現量をそれぞれ計算した。また各群の結果を比較し、さらにボンフェローニ検定によって評価した。
実施例9の結果は、図22のグラフに示される。本発明の一実施形態に係るオーバーハング領域を有する二本鎖剤(「オーバーハング」)により得られたmiR-122の阻害度は、一本鎖ASO(「antimiR」)の場合よりも大きく、その差は統計的に有意であった(図22a)。また、本発明の一実施形態に係るオーバーハング領域を有する二本鎖剤(「オーバーハング」)により得られたmiR-122の阻害度は、「HDO」および「HCDO」の場合よりも大きく、その差は統計的に有意であった(図22b)。
二本鎖核酸剤は、血清タンパク質への結合特性が異なるために、薬物動態が一本鎖核酸剤とは異なることが想定された。これを検証するために、ゲルシフト法を用いて核酸剤の血清タンパク質への結合特性を評価した。
実施例1で用いた1本鎖ASOまたは二本鎖剤「オーバーハング」を、蛍光色素(Alexa-568)で標識した。ex vivo実験として、蛍光色素標識した一本鎖または二本鎖核酸剤(15pmol)に、ICRマウス血清原液もしくはPBSにより2〜8倍希釈した血清(22.5μl)、ならびに10%スクロース(6μl)を混合して、サンプルを調製した。各混合サンプルを、2%アガロースゲルにてトリス-ホウ酸-EDTAバッファー中で電気泳動(100V、25分)した。蛍光色素標識した核酸剤を、ChemiDoc Touchイメージングシステム(バイオ・ラッド社(BIO RAD))を用いて紫外線下で検出した。
図23に示されるように、一本鎖ASOおよび本発明の一実施形態に係る二本鎖剤(「オーバーハング」)において、非結合核酸剤を示す下方の1バンド(一番下の矢印)は、血清の希釈に伴って増加し、一方、血清タンパク質と結合した核酸剤を示す上方の2バンド(上側の2つの矢印)は、血清の希釈に伴って減少した。特に、血清タンパク質との結合を示す2バンドのうち上方のバンドは、二本鎖剤において、一本鎖ASOと比較して高い強度を示した。この結果から、二本鎖剤は血清タンパク質への結合様式が一本鎖ASOと異なることが示された。
実施例10の結果から、本発明の一実施形態に係る二本鎖剤は、大きい粒子径の血清タンパク質への結合能が一本鎖剤より高いことが示唆された。これを検証するため、蛍光相関分光法(fluorescence correlation spectroscopy、FCS)を用いて核酸剤と血清タンパク質との複合体の拡散時間を測定した。拡散時間は、複合体の粒子径と比例する。拡散時間を用いて、核酸剤が結合しているタンパク質のサイズを評価した。
実施例1で用いた一本鎖ASOまたは二本鎖剤(「オーバーハング」)を、蛍光色素(Alexa-647)で標識した。ex vivo実験として、蛍光色素標識もしくは非標識の一本鎖または二本鎖核酸剤に、ICRマウス血清原液またはPBSにより2〜8倍希釈した血清(22.5μl)を混合して、核酸剤の最終濃度が10nMになるようにサンプルを調製した。各混合サンプルにおいて拡散時間をMF 20(オリンパス社(OLYMPUS))を用いて測定した。
図24に示されるように、本発明の一実施形態に係る二本鎖剤は、一本鎖ASOと比較して血清混合物において有意に長い拡散時間を示した。この結果から、二本鎖剤が結合する血清タンパク質は一本鎖剤が結合するタンパク質とは異なり、二本鎖剤は、より大きなサイズの血清タンパク質と結合することが示された。
一実施形態による二本鎖核酸剤の脳室内投与における脳組織への有用性を検証するin vivo実験を行った。対照(ASO)は、13merの一本鎖LNA/DNAギャップマーとした。このLNA/DNAギャップマーは、5'末端の2個および3'末端の3個のLNAヌクレオシド、ならびにそれらの間の8個のDNAヌクレオシドを含む。このLNA/DNAギャップマーは、マウスのβ-セクレターゼ1(beta-secretase 1、BACE1) mRNA(配列番号5)の1569〜1581位に相補的である。LNA/DNAギャップマー(第1鎖)を相補鎖(第2鎖)とアニールさせることにより、3種の二本鎖剤(「オーバーハング」、「HDO」および「Toc-HDO」)を調製した。「オーバーハング」では、第2鎖は、第1鎖と相補的な領域の5'末端側に13塩基長のオーバーハング領域を有する。「HDO」では、第2鎖は第1鎖と完全に相補的である。「Toc-HDO」では、第2鎖は、第1鎖と完全に相補的な鎖の5'末端に結合したトコフェロールを有する。実施例12で用いたポリヌクレオチドの配列、化学修飾および構造は、表1および図25に示す。二本鎖剤は実施例1と同様に調製した。
7週齢雌のICRマウスを、2.5〜4%イソフルレン麻酔下にて脳定位固定装置に固定した。その後、耳間に前後2〜3cmで皮膚を切開し、ブレグマ(bregma)の1mm左方かつ0.2mm後方に1mm径ドリルで穿孔した。ハミルトン(Hamilton)シリンジ内に核酸剤を充填した。穿孔部より針を3mm程度刺入し、2〜3μl/分の速度で、マウス1匹あたり6または12μmolの用量で核酸剤を脳室内投与し(図26aおよび26bに結果を示す実験ではn=4〜5、図26cに結果を示す実験ではn=3)、ナイロン糸で皮膚縫合した。注射7日後にマウスを安楽死させ、左側の海馬を採取した。その後、BACE1 mRNA発現解析を、BACE1 mRNAを定量するために定量的RT-PCRで使用したプライマーを除いて、実施例1に記載したとおりに行った。
実施例12の結果は、図26のグラフに示される。マウス1匹あたり6μmol(図26a)および12μmol(図26b)の両方の投与量において、本発明の一実施形態に係る二本鎖剤(「オーバーハング」)によって得られた阻害度は、一本鎖ASOよりも大きく、その差は統計的に有意であった。また、マウス1匹あたり12μmolの投与量において、オーバーハング領域の無い「HDO」および「Toc-HDO」によって得られた阻害度は、一本鎖ASOと同等であった(図26c)。
この結果から、静脈内投与だけでなく脳室内投与によっても本発明に係る核酸複合体は生体内に効率的に送達され、アンチセンス効果をもたらすことが示された。また、本発明に係る核酸複合体は、従来公知の二本鎖剤よりも優れた効果をもたらし得ることが示された。
実施例1〜12で用いた標的遺伝子とは異なるPTEN(Phosphatase and Tensin Homolog Deleted from Chromosome 10) mRNAを標的とする、本発明の一実施形態による二本鎖核酸剤の有用性を、国際公開第2014/192310号に記載される発明の一実施形態と比較して検証するin vivo実験を行った。対照(ASO)は、16merの一本鎖LNA/DNAギャップマーとした。このLNA/DNAギャップマーは、5'末端の3個および3'末端の3個のLNAヌクレオシド、ならびにそれらの間の10個のDNAヌクレオシドを含む。このLNA/DNAギャップマーは、マウスのPTEN mRNA(配列番号6)の59〜74位に相補的である。LNA/DNAギャップマー(第1鎖)を相補鎖(第2鎖)とアニールさせることにより、二本鎖剤(「オーバーハング」)を調製した。また、マウスPTEN mRNA(配列番号6)の59〜74位に相補的な配列の3'末端側に13塩基長の二重鎖核酸構造を有する「HCDO」を調製した。「HCDO」は、国際公開第2014/192310号に記載される発明の一実施形態である。実施例13で用いたポリヌクレオチドの配列、化学修飾および構造は、表1および図27に示す。二本鎖剤は実施例1と同様に調製した。
核酸剤を、マウスにそれぞれ尾静脈を通じて5.89nmol/kgの量(n=5)で静脈内注射した。用いたマウスおよびRNA発現の解析方法は、PTEN mRNAを定量するために定量的RT-PCRで使用したプライマーを除いて、実施例1に記載したとおりである。
実施例13の結果は、図28のグラフに示される。本発明の一実施形態に係るオーバーハング領域を有する二本鎖剤(「オーバーハング」)により得られたPTEN mRNAの阻害度は、「ASO」および「HCDO」の場合よりも大きく、その差は統計的に有意であった。
この結果から、本発明に係る核酸複合体は、従来公知の二本鎖剤よりも優れた効果をもたらし得ることが示された。
一実施形態による二本鎖核酸剤の皮下投与における有用性を検証するin vivo実験を行った。標的は実施例1〜6と同じApoB mRNAとした。対照(ASO)も実施例1〜6と同じ一本鎖LNA/DNAギャップマーとした。LNA/DNAギャップマー(第1鎖)を相補鎖(第2鎖)とアニールさせることにより、二本鎖剤(「オーバーハング」)を調製した。二本鎖剤のオーバーハング領域は、13個のDNAヌクレオシドを有する。実施例14で用いたポリヌクレオチドの配列、化学修飾および構造は、表1および図29に示す。二本鎖剤は実施例1と同様に調製した。
核酸剤を、マウスにそれぞれ0.173μmol/kgの量(n=4)で皮下注射により投与した。用いたマウスおよびApoB mRNA発現解析方法は実施例1に記載したとおりである。
実施例14の結果は、図30のグラフに示される。2つの核酸試薬は共に、陰性対照(PBSのみ)と比較して、ApoB mRNAの発現の阻害を示した。二本鎖剤「オーバーハング」によって得られた阻害度は、一本鎖ASOによって得られた阻害度よりも大きく、その差は統計的に有意であった。
この結果から、皮下投与によっても本発明に係る核酸複合体は生体内に効率的に送達され、アンチセンス効果をもたらすことが示された。
実施例1〜14とは異なる標的臓器(腎臓)における、本発明の一実施形態による二本鎖核酸剤の有用性を検証するin vivo実験を行った。標的RNAは実施例13と同じPTEN mRNAとした。実施例13と同じ一本鎖対照(ASO)および二本鎖剤(「オーバーハング」)を用いた。二本鎖剤は実施例1と同様に調製した。
核酸剤を、マウスにそれぞれ尾静脈を通じて5.65μmol/kgの量(n=4)で静脈内注射した。注射の72時間後、PBSをマウスに灌流させ、その後マウスを解剖して腎臓を摘出した。用いたマウスおよびRNA発現の解析方法は、PTEN mRNAを定量するために定量的RT-PCRで使用したプライマーを除いて、実施例1に記載したとおりである。
実施例15の結果は、図31のグラフに示される。本発明の一実施形態による二本鎖剤(「オーバーハング」)により得られたPTEN mRNAの阻害度は、「ASO」の場合よりも大きく、その差は統計的に有意であった。
この結果から、本発明に係る核酸複合体は、一本鎖ASOと比較して腎臓においても優れたアンチセンス効果をもたらし得ることが示された。
実施例1〜15とは異なる標的臓器または組織(副腎、骨格筋および肺)における、本発明の一実施形態による二本鎖核酸剤の有用性を検証するin vivo実験を行った。標的RNAは実施例7と同じSRB1 mRNAとした。実施例7と同じ一本鎖対照(ASO)および二本鎖剤(オーバーハング26mer、図17b参照)を用いた。二本鎖剤は実施例1と同様に調製した。
核酸剤を、マウスにそれぞれ尾静脈を通じて7.02μmol/kgの量(n=4)で静脈内注射した。注射の72時間後、PBSをマウスに灌流させ、その後マウスを解剖して左副腎、左大腿四頭筋(骨格筋)、および左肺を摘出した。用いたマウスおよびRNA発現の解析方法は、SRB1 mRNAを定量するために定量的RT-PCRで使用したプライマーを除いて、実施例1に記載したとおりである。
実施例16の結果は、図32のグラフに示される。本発明の一実施形態による二本鎖剤(「オーバーハング」)により得られたSRB1 mRNAの阻害度は、「ASO」の場合よりも大きく、その差は統計的に有意であった。
この結果から、本発明に係る核酸複合体は、一本鎖ASOと比較して副腎、筋肉、および肺においても優れたアンチセンス効果をもたらし得ることが示された。
Claims (19)
- 第1核酸鎖と第2核酸鎖とを含む核酸複合体であって、
該第1核酸鎖は、標的転写産物の少なくとも一部にハイブリダイズすることが可能な塩基配列を含み、
該第1核酸鎖は、標的転写産物に対してアンチセンス効果を有し、
該第2核酸鎖は、該第1核酸鎖に相補的な塩基配列を含む相補的領域と、該相補的領域の5'末端および/または3'末端側に位置する少なくとも1つのオーバーハング領域とを含み、
該第1核酸鎖は、該第2核酸鎖中の相補的領域にアニールしている、核酸複合体。 - 前記第2核酸鎖中のオーバーハング領域が、少なくとも9塩基長である、請求項1に記載の核酸複合体。
- 前記第1核酸鎖が、13〜20塩基長である、請求項1または2に記載の核酸複合体。
- 前記第2核酸鎖が、30塩基長以下である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の核酸複合体。
- 前記第2核酸鎖中のオーバーハング領域の遊離末端から少なくとも1つのヌクレオシド間結合が、修飾ヌクレオシド間結合である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の核酸複合体。
- 前記第2核酸鎖中のオーバーハング領域におけるヌクレオシド間結合の少なくとも50%が、修飾ヌクレオシド間結合である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の核酸複合体。
- 前記修飾ヌクレオシド間結合が、ホスホロチオエート結合である、請求項5または6に記載の核酸複合体。
- 前記第2核酸鎖中のオーバーハング領域の遊離末端から少なくとも1つのヌクレオシドが、修飾ヌクレオシドである、請求項1〜7のいずれか一項に記載の核酸複合体。
- 前記修飾ヌクレオシドが、二環式糖を含む、請求項8に記載の核酸複合体。
- 前記第1核酸鎖が、BNA/DNAギャップマー、BNA/DNAミックスマーまたはBNA/RNAミックスマーである、請求項1〜9のいずれか一項に記載の核酸複合体。
- 前記第1核酸鎖が、ペプチド核酸および/またはモルホリノ核酸を含む、請求項1〜10のいずれか一項に記載の核酸複合体。
- 前記第1核酸鎖が、少なくとも1つの修飾ヌクレオシドを含み、該修飾ヌクレオシドは、2'-O-メチル基を含む糖を含む、請求項1〜11のいずれか一項に記載の核酸複合体。
- 前記第2核酸鎖が、標識機能、精製機能、および標的送達機能から選択される機能を有する機能性部分をさらに含む、請求項1〜12のいずれか一項に記載の核酸複合体。
- 前記第2核酸鎖中のオーバーハング領域が、治療用オリゴヌクレオチド領域ではない、請求項1〜13のいずれか一項に記載の核酸複合体。
- 前記第2核酸鎖中の相補的領域が、少なくとも2個の連続したリボヌクレオシドを含まない、請求項1〜14のいずれか一項に記載の核酸複合体。
- 前記第2核酸鎖中のオーバーハング領域が、二環式糖を含む修飾ヌクレオシドを含み、かつ9〜12塩基長である、請求項1〜15のいずれか一項に記載の核酸複合体。
- 前記第2核酸鎖中のオーバーハング領域が、二環式糖を含む修飾ヌクレオシドを含まず、かつ9〜17塩基長である、請求項1〜15のいずれか一項に記載の核酸複合体。
- 請求項1〜17のいずれか一項に記載の核酸複合体と、薬学的に許容可能な担体とを含む、組成物。
- 静脈内投与、脳室内投与、髄腔内投与、筋肉内注射投与、持続点滴投与、腹腔内投与、吸入、皮膚貼付または皮下投与用である、請求項18に記載の組成物。
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