JP2016524588A - 治療用オリゴヌクレオチドを送達するための二本鎖剤 - Google Patents
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Abstract
Description
少なくとも4個のDNAヌクレオチドを含む中央ヌクレオチド領域;
少なくとも1個がヌクレオチドアナログである1〜10個のヌクレオチドを含む、上記の中央ヌクレオチド領域の5'末端に連結された第1の5'ウイング領域;
少なくとも1個がヌクレオチドアナログである1〜10個のヌクレオチドを含む、上記の中央ヌクレオチド領域の3'末端に連結された第1の3'ウイング領域;ならびに
第2の5'ウイング領域および/または第2の3'ウイング領域を含むように配置されていてよく、ここで:
上記の第2の5'ウイング領域は、上記の第1の5'ウイング領域の5'末端に連結されており、DNアーゼまたはRNアーゼに対して天然のDNAまたはRNAより高い抵抗性を有し、且つキメラポリヌクレオチドが送達されると細胞内で欠損し;また
上記の第2の3'ウイング領域は、上記の第1の3'ウイング領域の3'末端に連結されており、DNアーゼまたはRNアーゼに対して天然のDNAまたはRNAより高い抵抗性を有する。第2鎖はまた、全体的にまたは部分的にペプチド核酸(PNA)単位も含み得る。第2鎖は、それ自体、アンチセンスオリゴヌクレオチドであってもよい。
細胞を、以下:
第2核酸鎖にアニールした第1核酸鎖を含む二本鎖核酸剤であって、ここで:
第1核酸鎖は、(i) 第1核酸鎖が第2核酸鎖にハイブリダイズしている場合にRNアーゼHにより認識され得る少なくとも2個の連続RNAヌクレオチドを有する第1RNA領域、(ii) 治療用オリゴヌクレオチド領域の3'末端および5'末端における少なくとも1つのヌクレオチド間結合が天然のヌクレオチド間結合よりもヌクレアーゼ耐性である該治療用オリゴヌクレオチド領域を含み、且つ(iii) 第1核酸鎖の3'末端および5'末端における少なくとも1つのヌクレオチド間結合は天然のヌクレオチド間結合よりもヌクレアーゼ耐性であり;
第2核酸鎖は、(i) 第1核酸鎖の第1RNA領域にハイブリダイズしており、RNアーゼHによる第1核酸鎖中の少なくとも2個の連続RNAヌクレオチドの認識を促進し得る第1DNA領域を含み、且つ場合により(ii) 第2核酸鎖の3'末端および5'末端における少なくとも1つのヌクレオチド間結合は天然のヌクレオチド間結合よりもヌクレアーゼ耐性であり;さらに
第1核酸鎖の治療用オリゴヌクレオチド領域は第2核酸鎖とハイブリダイゼーションすることができない、
上記二本鎖核酸剤
を含む組成物と接触させるステップ
を含む、上記方法。
さらにここで上記の標的化部分は、脂質、糖、ペプチド、およびタンパク質から選択され;
さらにここで上記の脂質は、コレステロール、トコフェロール、トコトリエノール、脂肪酸、脂溶性ビタミン、糖脂質、およびグリセリドから選択される、
項目(1)〜(7)のいずれか1つに記載の方法。
細胞を、以下:
第2核酸鎖にアニールした第1核酸鎖を含む二本鎖核酸剤であって、ここで:
第1核酸鎖は、(i) 第1核酸鎖が第2核酸鎖にハイブリダイズしている場合にRNアーゼHにより認識され得る少なくとも2個の連続RNAヌクレオチドを有する第1RNA領域、(ii) RNアーゼHにより認識される少なくとも2個の連続RNAヌクレオチドに対して5'および3'に位置する修飾RNAヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログから選択される1個以上のヌクレオチド、(iii) 修飾RNAヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログから選択され、さらに独立して場合によりホスホロチオエート化されている1個以上のヌクレオチドを3'末端および5'末端に含む治療用オリゴヌクレオチド領域、(iv) 3'末端ヌクレオチドまたは5'末端ヌクレオチドのいずれかに連結された、脂質、ペプチド、およびタンパク質から選択される標的化部分を含み、且つ(v) 第1核酸鎖中のヌクレオチドの総数は12〜100であり;
第2核酸鎖は、(i) 第1核酸鎖の第1RNA領域にハイブリダイズしており、RNアーゼHによる第1核酸鎖中の少なくとも2個の連続RNAヌクレオチドの認識を促進し得る第1DNA領域、および(ii) 第1DNA領域に対して5'および3'に位置する修飾DNAヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログから選択され、さらに独立して場合によりホスホロチオエート化されている1個以上のヌクレオチドを含み;さらに
第1核酸鎖の治療用オリゴヌクレオチド領域は第2核酸鎖とハイブリダイゼーションすることができない、
上記二本鎖核酸剤
を含む組成物と接触させるステップ
を含む、上記方法。
細胞を、以下:
第2核酸鎖にアニールした第1核酸鎖を含む二本鎖核酸剤であって、ここで:
第1核酸鎖は、(i) 少なくとも2個のPNAヌクレオチドを有する第1PNA領域、(ii) 治療用オリゴヌクレオチド領域の3'末端および5'末端における少なくとも1つのヌクレオチド間結合が天然のヌクレオチド間結合よりもヌクレアーゼ耐性である前記治療用オリゴヌクレオチド領域を含み、且つ(iii) 第1核酸鎖の3'末端および5'末端における少なくとも1つのヌクレオチド間結合が、天然のヌクレオチド間結合よりもヌクレアーゼ耐性であり;
第2核酸鎖は、(i) 第1核酸鎖の第1PNA領域にハイブリダイズした第1DNA領域を含み、且つ(ii) 第2核酸鎖の3'末端および5'末端における少なくとも1つのヌクレオチド間結合は、天然のヌクレオチド間結合よりもヌクレアーゼ耐性であり;さらに
第1核酸鎖の治療用オリゴヌクレオチド領域は第2核酸鎖とハイブリダイゼーションすることができない、
上記二本鎖核酸剤
を含む組成物と接触させるステップ
を含む、上記方法。
第2核酸鎖にアニールした第1核酸鎖を含む二本鎖核酸剤であって、ここで:
第1核酸鎖は、(i) 第1核酸鎖が第2核酸鎖にハイブリダイズしている場合にRNアーゼHにより認識され得る少なくとも2個の連続RNAヌクレオチドを有する第1RNA領域、(ii) 治療用オリゴヌクレオチド領域の3'末端および5'末端における少なくとも1つのヌクレオチド間結合が天然のヌクレオチド間結合よりもヌクレアーゼ耐性である該治療用オリゴヌクレオチド領域を含み、(iii) 第1核酸鎖の3'末端および5'末端における少なくとも1つのヌクレオチド間結合が、天然のヌクレオチド間結合よりもヌクレアーゼ耐性であり、且つ(iv) 第1核酸鎖中のヌクレオチドの総数は12〜100であり;
第2核酸鎖は、(i) 第1核酸鎖の第1RNA領域にハイブリダイズしており、RNアーゼHによる第1核酸鎖中の少なくとも2個の連続RNAヌクレオチドの認識を促進し得る第1DNA領域を含み、(ii) 場合により第2核酸鎖の3'末端および5'末端における少なくとも1つのヌクレオチド間結合は、天然のヌクレオチド間結合よりもヌクレアーゼ耐性であり、且つ(iii) 第2核酸鎖中のヌクレオチドの総数は少なくとも8であり;さらに
第1核酸鎖の治療用オリゴヌクレオチド領域は、哺乳動物細胞中で生理的温度において、第2核酸鎖とハイブリダイゼーションすることができない、
上記二本鎖核酸剤
を含む組成物。
(a) 少なくとも1種の項目(16)の二本鎖核酸剤;および
(b) 製薬上許容可能な担体
を含む治療上有効量の医薬組成物を投与するステップを含む、前記方法。
R1およびR2は、互いに同一であっても異なっていてもよく、それぞれ、水素原子、核酸合成のためのヒドロキシル基の保護基、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アシル基、スルホニル基、シリル基、リン酸基、核酸合成のための保護基によって保護されているリン酸基、または-P(R4)R5(ここで、R4およびR5は、互いに同一であっても異なっていてもよく、それぞれ、ヒドロキシル基、核酸合成のための保護基によって保護されているヒドロキシル基、メルカプト基、核酸合成のための保護基によって保護されているメルカプト基、アミノ基、1〜5個の炭素原子を有するアルコキシ基、1〜5個の炭素原子を有するアルキルチオ基、1〜6個の炭素原子を有するシアノアルコキシ基、または1〜5個の炭素原子を有するアルキル基で置換されているアミノ基を表す)を表す。
一実施形態による二本鎖核酸剤における第2鎖のギャップマー型またはミックスマー型構造の有用性を示すin vivo実験を行った。二本鎖剤の構造および実験結果は、図7-1および7-2に示される。
第1鎖
(配列番号1) 31merToc-cRNA-G
5'-Toc-u*g*a*AUACCAAUg*c*uacgcauacgcacca*c*c*a-3'
(配列番号2) 31merToc-2'OMe RNA
5'-Toc-u*g*a*auaccaaug*c*uacgcauacgcacca*c*c*a-3'
第2鎖
(配列番号3) 13merLNA/DNAギャップマー
5'-G*C*a*t*t*g*g*t*a*t*T*C*A-3'
(配列番号4) 13merLNA/DNAミックスマー
5'-G*c*a*t*T*g*g*T*a*t*t*C*A-3'
大文字/下線:LNA(C = メチルシトシンLNA)
小文字:DNA
大文字:RNA
小文字/下線:2'-O-Me RNA
*:ホスホロチオエートヌクレオチド間結合
(配列番号5) 20mercRNA
5'-GCUACGCAUACGCACCACCA-3'
(配列番号6) 22mercRNA
5'-AUGCUACGCAUACGCACCACCA-3'
(配列番号7) 23mercRNA
5'-AAUGCUACGCAUACGCACCACCA-3'
(配列番号8) 24mercRNA
5'-CAAUGCUACGCAUACGCACCACCA-3'
(配列番号9) 25mercRNA
5'-CCAAUGCUACGCAUACGCACCACCA-3'
(配列番号10) 31mercRNA
5'-UGAAUACCAAUGCUACGCAUACGCACCACCA-3'
(略語は上記のとおり)
(配列番号11) 28mer3'DIG-DNA
5'-tggtgcgtatgcgtagcagtggtattca-DIG-3'
(略語は上記のとおり)
4〜5週齢の雌の野生型Crlj:CD1(ICR)マウス(オリエンタル酵母工業株式会社(Oriental Yeast)、東京、日本)を、病原体除去動物施設において12時間の明/暗周期で飼育し、食餌と水を自由に摂取させた。二本鎖剤を、6mg/kg/用量の尾静脈注射により、1匹のマウスにそれぞれ1回投与した。対照マウスはPBSの注射を受けた。静脈注射の24時間後、ノーザンブロッティングによる分析のために肝臓を摘出した。肝臓中の全RNAを、ISOGEN IIキット(和光純薬工業株式会社(Wako Pure Chemicals)、大阪、日本)を使用して抽出した。
全RNA(30マイクロg)を、18%ポリアクリルアミド/尿素ゲル上の電気泳動によって分離した。移動標準の配列番号4〜9、さらにまた一本鎖としての第1鎖を、対照として別のレーンに含めた。電気泳動した物質を、Hybond-N+膜(アマルシャム・バイオサイエンス社(Amersham Biosciences)、ピスカタウェイ、ニュージャージー州)に転写した。このブロットを、3'-DIG DNAプローブとハイブリダイズさせ、Gene Images装置で可視化した。ギャップマーとミックスマーを比較した結果(図7-1A対7-1B)は、図7-2Dに示される。切断可能なRNA-ベースの相補領域を有する第1鎖を含む二本鎖剤を、完全に2'-Oメチル化されたRNA鎖を有する第1鎖を含む二本鎖剤に対して比較した結果(図7-1A対7-1C)は、図7-2Eに示される。別々のブロットを、内部対照としてのマウスU6マイクロRNA配列とハイブリダイズさせた(データは示されない)。
図7-2Dのブロッティング分析は、それぞれの二本鎖剤におけるToc-cRNA-G第1鎖が、in vivoでより短い長さに切断されたことを示す。プロセッシングされていないToc-cRNA-G対照(レーンM7)と比較して、ギャップマー二本鎖剤(レーン1)は、Toc-cRNA-G第1鎖の、より短い長さへの本質的に完全な変換を明らかにした。同様に、ミックスマー二本鎖剤(レーン2)は、より短い長さのプローブへの有意な変換を示した。第1鎖はいずれの場合も、レーンM1〜M5における対照cRNAの移動距離との比較に基づけば、20〜約26塩基を有するオリゴヌクレオチドにプロセッシングされた。
一実施形態による二本鎖核酸剤によるマイクロRNA発現のin vivo阻害効力を評価する実験を行った。2つの従来の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド対照を、本二本鎖剤と比較した。ポリヌクレオチド構造は図8に示される。
第1鎖
(配列番号12) 36merRNA鎖
5'-a*c*aaacaccauugucacacuc*c*a*UGAAUACCAAU*g*c-3'-コレステロール(chol)
第2鎖
(配列番号13) 13merLNA/DNAギャップマー相補鎖
5'-G*C*a*t*t*g*g*t*a*t*T*C*A-3'
一本鎖対照
(配列番号14) antimiR(miR122)
5'-C*c*A*t*t*G*T*c*a*C*a*C*t*C*C-3'
(略語は上記のとおり)
マウスは、体重20〜25gの4〜6週齢の雌のICRマウスであった。マウスを使用する実験は全て、n=3で実施した。核酸剤を、マウスにそれぞれ尾静脈を通じて0.75mg/kgの量で静脈内注射した。さらにまた、陰性対照群として、(核酸剤の代わりに)PBSのみを注射したマウスも作製した。
図8の結果によって示されるとおり、3つの核酸試薬は全て、陰性対照(PBSのみ)と比較して、miR122の発現の阻害を示す。しかし、本発明の一実施形態による二本鎖剤によって得られた阻害度は、一本鎖オリゴヌクレオチドによって得られた阻害度よりも大きく、その差は統計的に有意である。
In vivoにおけるマイクロRNA阻害に関するキメラ二本鎖核酸剤の有用性を示す実験を行った。具体的には、この実験において使用される核酸の直接標的であるマイクロRNA122(miR122)に対する阻害効果だけでなく、miR122の下流標的であるアルドラーゼA(ALDOA)および分岐鎖ケト酸デヒドロゲナーゼキナーゼ(BCKDK)mRNAの発現に対する阻害効果も評価した。ALDOAの表現型である総血清コレステロール値および低密度リポタンパク質(LDL)値もまた評価した。miR122を阻害する既知の一本鎖核酸剤を対照として使用し、さらにこの対照核酸剤を、既知の一本鎖核酸が導入されたヘテロ二本鎖核酸と比較した。核酸構造は図9に示される。LNA/DNAミックスマーantimiR(miravirsen(登録商標))を陽性対照として使用した。PBSを投与した群を陰性対照として使用した。鎖の配列、組成、および鎖長は以下のとおりであった:
第1鎖
(配列番号15) 28merRNA鎖
5'-C*c*A*t*t*G*T*c*a*C*a*C*t*C*CGCGAUACCAAU*c*g-3'
第2鎖
(配列番号16) 13merLNA/DNAギャップマー相補鎖
5'-C*G*a*t*t*g*g*t*a*t*C*G*C-3'
一本鎖対照
(配列番号14) antimiR(miR122)
5'-C*c*A*t*t*G*T*c*a*C*a*C*t*C*C-3'
(略語は上記のとおり)
マウスは、体重20〜25gの4週齢の雌のICRマウスであった。マウスを使用する実験は全て、n=3で実施した。核酸剤を、マウスに尾静脈を通じて静脈内注射した。miR122の阻害効果を評価する実験(図10a)においては、核酸剤を、マウスに0.1mg/kgの量でそれぞれ1回注射した。次いで、注射の72時間後にPBSをマウスに灌流させ、肝左葉を採取した。miR122の下流標的であるALDOA(図10b)およびBCKDK(図10c)、ならびに総血清コレステロール(図10c)を評価する実験においては、核酸剤を、マウスに0.75mg/kgの量でそれぞれ1週間に3回注射した。次いで、注射時および注射の168時間後、また肝臓組織を採取した際にも血液を採取した。実施例2と同じプロトコルによってRNA抽出、cDNA合成および定量的PCRを行った。評価は、直接標的であるmiRNA(図10a)の内部対照であるU6で補正することによって、またALDOA(図10b)およびBCKDK(図10c)の内部対照であるGAPDHで補正することによって実施した。各群の発現レベルは、実施例2のように比較した。表現型の評価において、注射後0時間〜168時間の総血清コレステロール(図10d)および血清LDL(低密度リポタンパク質)(図10e)の低下を測定し、PBSを注射した群と比較した。表現型に対する用量依存性効果の評価については、核酸剤を0.1、0.75および1.5mg/kgの量でそれぞれ1週間に3回注射し、総血清コレステロールの低下を前と同様に評価した(図10f)。
図10aの結果によって示されるとおり、3つの核酸試薬は全て、陰性対照(PBSのみ)と比較してmiR122の発現の阻害を示す。しかし、本発明の一実施形態による二本鎖剤によって得られた阻害度は、一本鎖オリゴヌクレオチドによって得られた阻害度よりも大きく、その差は統計的に有意である。図10bおよび図10cによって示されるとおり、二本鎖antimiRは、一本鎖核酸と比較して、miR122の下流標的(ALDOA、BCKDK)の発現の統計的に有意な上昇を示した。図10dおよび10eによって示されるとおり、二本鎖antimiRは、一本鎖核酸と比較して、総血清コレステロールおよびLDLの統計的に有意な低下を示した。図10fによって示されるとおり、二本鎖antimiRは、一本鎖antimiRより優れた用量依存性表現型効果を示した。
本発明者らは、他の標的および標的RNAとの相互作用を有する他の種類のオリゴヌクレオチドへの、二本鎖核酸剤の適用を評価する実験を行った。標的RNAは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー(Duchenne Muscular Dystrophy(DMD))の責任遺伝子であるジストロフィンのプレ-mRNAであった。実施例4のオリゴヌクレオチドは、スプライススイッチングオリゴヌクレオチド(SSO)であり、ジストロフィンのスキッピングエクソン58を誘導した。ポリヌクレオチド構造は、図11に示される。
第1鎖
(配列番号17) 28merRNA鎖
5'-t*C*t*g*G*g*c*T*c*c*T*g*g*T*aGCGAUACCAAU*c*g-3'
第2鎖
(配列番号16) 13merLNA/DNAギャップマー相補鎖
5'-C*G*a*t*t*g*g*t*a*t*C*G*C-3'
一本鎖対照
(配列番号18) 15merSSO
5'-t*C*t*g*G*g*c*T*c*c*T*g*g*T*a-3'
(略語は上記のとおり)
構築のための開始プラスミドは、pcDNA5/FRTベクター(インビトロゲン社、カールスバッド、カリフォルニア州)であった。Flagタグを含む断片を作製するため、2つのオリゴヌクレオチド:5'-AGCTTACCATGGATTACAAGGACGACGACGACAAGGGGGTAC-3'(配列番号19)(HindIII部位およびKpnI部位(下線部)を含む)と、5'-CCCCTTGTCGTCGTCGTCCTTGTAATCCATGGTA-3'(配列番号20)を一緒にアニールした。アニーリング後、上記の断片をpcDNA5/FRTベクター(pcDNA5/FRT-FLAG)のHindIII/KpnI部位中にクローン化した。このFlagタグは、余分な第1メチオニンの偶発的な発現を回避するため、2つのサイレント変異を含む。
Flp-In-293(インビトロゲン社、カールスバッド、カリフォルニア州)細胞を、10%ウシ胎仔血清(FBS)(バイオウェスト社(Biowest)、ニュアイエ(Nuaille)、フランス)、2%ペニシリン-ストレプトマイシン混合溶液(ペニシリン10,000単位/mL、ストレプトマイシン10,000マイクロg/mL)(ナカライテスク株式会社(Nacalaitesque)、京都、日本)を含有する10%ウシ胎仔血清を補充したダルベッコ改変イーグル培地(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)(DMEM)(ナカライテスク株式会社、京都、日本)中で培養し、37℃において100mg/mLのゼオシンで選択した。pcDNA5/FRT-Flag-Dys57>59di-NLS-DsRed-EGFPおよびpOG44(Flpリコンビナーゼ発現プラスミド)(インビトロゲン社、カールスバッド、カリフォルニア州)を、Flp-In-293細胞に共トランスフェクトした。安定な細胞株を、ハイグロマイシンB 50mg/mL(インビトロゲン社、カールスバッド、カリフォルニア州)耐性に基づいて選択した。
安定細胞株を、10%ウシ胎仔血清(FBS)(バイオウェスト社、ニュアイエ、フランス)および2%ペニシリン-ストレプトマイシン混合溶液(ペニシリン10,000単位/mL、ストレプトマイシン10,000マイクロg/mL)(ナカライテスク株式会社、京都、日本)を含有するダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)(ナカライテスク株式会社、京都、日本)中で培養した。
この細胞を、24ウェルプレート中の、抗生物質を含まない血清含有培地にプレーティングした。脂質ベースのトランスフェクションのため、一本鎖対照と二本鎖剤のいずれかを、製造者の使用説明書に従ってリポフェクタミンRNAiMAX(インビトロゲン社)と混合し、無血清培地中で4時間細胞と共にインキュベートした。細胞をPBSで1回洗浄し、RNA抽出前に抗生物質を含む完全培地中で20時間インキュベートした。mRNAは、Isogenキット(株式会社ジーンデザイン)を製造者の使用説明書に従って使用して抽出した。cDNAは、Transcriptor Universal cDNA Master(ロシュ・アプライドバイオサイエンス社)をプロトコルに従って使用して合成した。定量RT-PCRは、SYBR Green Real Time PCR Master Mix(ロシュ・アプライドバイオサイエンス社)により実施した。プライマーの配列は以下に示される。
配列番号31:5'-AACGGTACCAACGCTGCTGTTCTTTTTCA-3'
配列番号32:5'-CTTGGAGCCGTACTGGAACT-3'
GAPDH分析プライマー:
配列番号33:5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'
配列番号34:5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'
図12の結果によって示されるとおり、本発明の一実施形態による二本鎖剤によって得られたエクソンスキッピングの程度は、一本鎖オリゴヌクレオチドによって得られたエクソンスキッピングの程度よりも大きく、その差は統計的に有意である。
本発明者らは、他の標的および化学構造を有する他の種類のアンチセンスオリゴヌクレオチドへの、二本鎖核酸剤の適用を評価する実験を行った。標的は、アポリポタンパク質Bのプレ-mRNAのイントロンであった。ポリヌクレオチド構造は、図13に示される。
第1鎖
(配列番号35) 29merRNA鎖
5'-C*T*C*c*c*a*c*c*a*c*a*t*a*G*C*AGCGAUACCAAU*c*g-3'
第2鎖
(配列番号16) 13merLNA/DNAギャップマー相補鎖
5'-C*G*a*t*t*g*g*t*a*t*C*G*C-3'
一本鎖対照
(配列番号36) 16merイントロンギャップマー
5'-C*T*C*c*c*a*c*c*a*c*a*t*a*G*C*A-3'
(略語は上記のとおり)
Huh-7(ヒト肝細胞癌細胞株-7)細胞を、推奨培地条件下で培養した。細胞を、24ウェルプレート中の抗生物質を含まない血清含有培地にプレーティングした。脂質ベースのトランスフェクションのため、一本鎖対照と二本鎖剤のいずれかを、リポフェクタミンRNAiMAX(インビトロゲン社)と製造者の使用説明書に従って混合し、無血清培地中で4時間細胞と共にインキュベートした。細胞をPBSで1回洗浄し、RNA抽出前に抗生物質を含む完全培地中でで20時間インキュベートした。mRNAは、Isogenキット(株式会社ジーンデザイン)を製造者の使用説明書に従って使用して抽出した。cDNAは、Transcriptor Universal cDNA Master(ロシュ・アプライドバイオサイエンス社)をプロトコルに従って使用して合成した。定量RT-PCRは、TaqMan(ロシュ・アプライドバイオサイエンス社)により実施した。定量RT-PCRにおいて使用したプライマーは、様々な遺伝子数に基づいて、ライフテクノロジーズ社によって設計および製造された製品であった。増幅条件(温度および時間)は以下のとおりであった:95℃で15秒、60℃で30秒、および72℃で1秒(1サイクル)を40サイクル繰り返した。このようにして得られた定量RT-PCRの結果に基づいて、アポBの発現量/グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH;内部標準遺伝子)の発現量をそれぞれ計算し、また各群の結果を比較し、さらにt-検定によって評価した。結果は、図14のグラフに示される。
図14の結果に示されるとおり、一本鎖イントロンギャップマーは、陰性対照(リポフェクタミンのみ)と比較して、アポB mRNAの発現の阻害を示さなかった。しかし、本発明の一実施形態による二本鎖剤は、アポB mRNAの有意な阻害を達成した。
本発明者らは、第2鎖が13merLNA/DNAギャップマーから13merLNA/DNAミックスマーに変更された二本鎖核酸剤の適用を評価する実験を行った。標的は、実施例2〜3と同様に、マイクロRNA122であった。そのポリヌクレオチド構造は図15に示される。
第1鎖
(配列番号37) 36merRNA鎖
5'- a*c*aaacaccauugucacacuc*c*a*UGAAUACCAAU*g*c-3'
第2鎖
(配列番号4) 13merLNA/DNAミックスマー相補鎖
5'- G*c*a*t*T*g*g*T*a*t*t*C*A-3'
一本鎖対照
(配列番号38) 23merアンタゴmiR(miR122)
5'- a*c*aaacaccauugucacacuc*c*a-3'
(略語は上記のとおり)
Huh-7(ヒト肝細胞癌細胞株-7)細胞を、推奨培地条件下で培養した。この細胞を、24ウェルプレート中の抗生物質を含まない血清含有培地にプレーティングした。脂質ベースのトランスフェクションのため、一本鎖対照と二本鎖剤のいずれかを、リポフェクタミン2000(インビトロゲン社)と製造者の使用説明書に従って混合し、無血清培地中で4時間細胞と共にインキュベートした。細胞をPBSで1回洗浄し、RNA抽出前に抗生物質を含む完全培地中で20時間インキュベートした。mRNAは、Isogenキット(株式会社ジーンデザイン)を製造者の使用説明書に従って使用して抽出した。cDNAは、Transcriptor Universal cDNA Master(ロシュ・アプライドバイオサイエンス社)をプロトコルに従って使用して合成した。定量RT-PCRは、TaqMan(ロシュ・アプライドバイオサイエンス社)により実施した。定量RT-PCRにおいて使用したプライマーは、様々な遺伝子数に基づいて、ライフテクノロジーズ社によって設計および製造された製品であった。増幅条件(温度および時間)は以下のとおりであった:95℃で15秒、60℃で30秒、および72℃で1秒(1サイクル)を40サイクル繰り返した。このようにして得られた定量RT-PCRの結果に基づいて、マイクロRNA(miR122)の発現量/マイクロRNA(U6;内部標準遺伝子)の発現量をそれぞれ計算し、また各群の結果を比較し、さらにt-検定によって評価した。結果は、図16のグラフに示される。
核酸試薬は両方とも、陰性対照(リポフェクタミンのみ)と比較して、miR122の発現の阻害を示す。しかし、本発明の一実施形態による二本鎖剤によって得られた阻害度は、一本鎖オリゴヌクレオチドによって得られた阻害度よりも大きく、その差は統計的に有意である。
本発明者らは、第2鎖が13merLNA/DNAギャップマーから13merLNA/DNAミックスマーに変更された別の二本鎖核酸剤の適用を評価する実験を行った。標的は、実施例4と同様にジストロフィンのプレ-mRNAであった。実施例6のオリゴヌクレオチドは、スプライススイッチングオリゴヌクレオチド(SSO)であり、ジストロフィンのスキッピングエクソン58を誘導した。ポリヌクレオチド構造は図17に示される。
第1鎖
(配列番号17) 28merRNA鎖
5'-t*C*t*g*G*g*c*T*c*c*T*g*g*T*aGCGAUACCAAU*c*g-3'
第2鎖
(配列番号4) 13merLNA/DNAミックスマー相補鎖
5'-G*c*a*t*T*g*g*T*a*t*t*C*A-3'
一本鎖対照
(配列番号18) 15merSSO
5'- t*C*t*g*G*g*c*T*c*c*T*g*g*T*a-3'
(略語は上記のとおり)
実験条件は、実施例4と同様であった。
図18の結果に示されるとおり、本発明の一実施形態による二本鎖剤によって得られたエクソンスキッピングの程度は、一本鎖オリゴヌクレオチドによって得られたエクソンスキッピングの程度よりも大きく、その差は統計的に有意である。
本発明者らは、第2鎖が13merLNA/DNAギャップマーから13mer/LNA/DNAミックスマーに変更された別の二本鎖核酸剤の適用を評価する実験を行った。標的は、実施例5と同様に、アポリポタンパク質Bのプレ-mRNAのイントロン、であった。ポリヌクレオチド構造は、図19に示される。
第1鎖
(配列番号35) 29merRNA鎖
5'-C*T*C*c*c*a*c*c*a*c*a*t*a*G*C*AGCGAUACCAAU*c*g-3'
第2鎖
(配列番号4) 13merLNA/DNAミックスマー相補鎖
5'- G*c*a*t*T*g*g*T*a*t*t*C*A-3'
一本鎖対照
(配列番号36) 16merイントロンギャップマー
5'-C*T*C*c*c*a*c*c*a*c*a*t*a*G*C*A-3'
(略語は上記のとおり)
実験条件は、実施例5と同様であった。
図20の結果によって示されるとおり、一本鎖イントロンギャップマーは、陰性対照(リポフェクタミンのみ)と比較して、アポB mRNAの発現の阻害を示さなかった。しかし,本発明の一実施形態による二本鎖剤は、用量依存様式でアポB mRNAの有意な阻害を達成した。
本発明者らは、核酸剤の位置がRNA鎖の5'末端から3'末端に変更された二本鎖核酸剤の適用を評価する実験を行った。標的は、実施例2〜3と同様に、マイクロRNA122であった。ポリヌクレオチド構造は図21に示される。
第1鎖
(配列番号15) 28merRNA鎖-5'
5'-C*c*A*t*t*G*T*c*a*C*a*C*t*C*CGCGAUACCAAU*c*g-3'
(配列番号39) 28merRNA鎖-3’
5'-g*c*g*AUACCAAUCGC*c*A*t*t*G*T*c*a*C*a*C*t*C*C-3'
第2鎖
(配列番号16) 13merLNA/DNAミックスマー相補鎖
5'-C*G*a*t*t*g*g*t*a*t*C*G*C-3'
一本鎖対照
(配列番号14) 23mer antimiR(miR122)
5'-C*c*A*t*t*G*T*c*a*C*a*C*t*C*C-3'
(略語は上記のとおり)
Huh-7(ヒト肝細胞癌細胞株-7)細胞を、推奨培地条件下で培養した。この細胞を、24ウェルプレート中の抗生物質を含まない血清含有培地にプレーティングした。脂質ベースのトランスフェクションのため、一本鎖対照と二本鎖剤のいずれかを、リポフェクタミンRNAi MAX(インビトロゲン社)と製造者の使用説明書に従って混合し、無血清培地中で4時間細胞と共にインキュベートした。細胞をPBSで1回洗浄し、RNA抽出前に抗生物質を含む完全培地中で20時間インキュベートした。マイクロRNAは、Isogenキット(株式会社ジーンデザイン)を製造者の使用説明書に従って使用して抽出した。cDNAは、Transcriptor Universal cDNA Master(ロシュ・アプライドバイオサイエンス社)をプロトコルに従って使用して合成した。定量RT-PCRは、TaqMan(ロシュ・アプライドバイオサイエンス社)により実施した。定量RT-PCRにおいて使用したプライマーは、様々な遺伝子数に基づいて、ライフテクノロジーズ社によって設計および製造された製品であった。増幅条件(温度および時間)は以下のとおりであった:95℃で15秒、60℃で30秒、および72℃で1秒(1サイクル)を40サイクル繰り返した。このようにして得られた定量RT-PCRの結果に基づいて、マイクロRNA(miR122)の発現量/マイクロRNA(U6;内部標準遺伝子)の発現量をそれぞれ計算し、また各群の結果を比較し、さらにt-検定によって評価した。この結果は、図22のグラフに示される。
二本鎖antimiR-5'およびantimiR-3'は両方とも、陰性対照(リポフェクタミンのみ)および一本鎖antimiRと比較して、miR122の発現の阻害を示す。しかし、二本鎖antimiR-3によって得られた阻害度は、二本鎖antimiR-5'によって得られた阻害度に満たない。
21-34 プライマー
Claims (14)
- 第2核酸鎖にアニールした第1核酸鎖を含む二本鎖核酸剤であって、ここで:
第1核酸鎖は、(i) 第1核酸鎖が第2核酸鎖にハイブリダイズしている場合にRNアーゼHにより認識され得る少なくとも2個の連続RNAヌクレオチドを有する第1RNA領域、(ii) 治療用オリゴヌクレオチド領域の3'末端および5'末端における少なくとも1つのヌクレオチド間結合が天然のヌクレオチド間結合よりもヌクレアーゼ耐性である該治療用オリゴヌクレオチド領域を含み、且つ(iii) 第1核酸鎖の3'末端および5'末端における少なくとも1つのヌクレオチド間結合は天然のヌクレオチド間結合よりもヌクレアーゼ耐性であり;
第2核酸鎖は、(i) 第1核酸鎖の第1RNA領域にハイブリダイズしており、RNアーゼHによる第1核酸鎖中の少なくとも2個の連続RNAヌクレオチドの認識を促進し得る第1DNA領域を含み、且つ(ii) 第2核酸鎖の3'末端および5'末端における少なくとも1つのヌクレオチド間結合は天然のヌクレオチド間結合よりもヌクレアーゼ耐性であり;さらに
第1核酸鎖の治療用オリゴヌクレオチド領域は第2核酸鎖とハイブリダイゼーションすることができない、
前記二本鎖核酸剤。 - 第1核酸鎖および第2核酸鎖が、RNAヌクレオチド、DNAヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、およびPNAヌクレオチドから選択されるヌクレオチドを含む、請求項1に記載の二本鎖核酸剤。
- 第1核酸鎖が、DNAヌクレオチド、RNAヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、およびPNAヌクレオチドから選択されるヌクレオチドを含み、第2核酸鎖が、DNAヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、およびPNAヌクレオチドから選択されるヌクレオチドを含む、請求項1に記載の二本鎖核酸剤。
- 治療用オリゴヌクレオチド領域が、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンタゴmirオリゴヌクレオチド、スプライススイッチングオリゴヌクレオチド、一本鎖siRNAオリゴヌクレオチド、二本鎖siRNA、マイクロRNA、プレ-マイクロRNA、およびアプタマーから選択されるオリゴヌクレオチドを含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の二本鎖核酸剤。
- アンタゴmirオリゴヌクレオチドが、ミックスマーであるか、一種類のヌクレオチドもしくはヌクレオチドアナログで構成されているか、またはギャップマーである、請求項4に記載の二本鎖核酸剤。
- アンタゴmirオリゴヌクレオチドが、2'-OMe RNA、MOE、CET、ENA、LNAおよびAmNAから選択される少なくとも1つのヌクレオチドを含み、且つ少なくとも1つのヌクレオチド間結合が場合によりホスホロチオエート化されている、請求項5に記載の二本鎖核酸剤。
- 第2核酸鎖がギャップマーまたはミックスマーである、請求項1〜6のいずれか1項に記載の二本鎖核酸剤。
- 二本鎖核酸剤が、脂質、糖、ペプチド、およびタンパク質から選択され、且つ第2核酸鎖の3'末端ヌクレオチドもしくは5'末端ヌクレオチドまたは第1核酸鎖の3'末端ヌクレオチドもしくは5'末端ヌクレオチドに連結された標的化部分をさらに含む、請求項1〜7のいずれか1項に記載の二本鎖核酸剤。
- 第1核酸鎖が、RNアーゼHにより認識され得る少なくとも2個の連続RNAヌクレオチドに対して5'および3'に位置する修飾RNAヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログから選択される1個以上のヌクレオチドを含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載の二本鎖核酸剤。
- RNアーゼHにより認識され得る少なくとも2個の連続RNAヌクレオチドに対して5'および3'に位置する1個以上のヌクレオチドが、LNAヌクレオチド、BNAヌクレオチド、2'-O-Me RNAヌクレオチド、および2'-O-メトキシエチルRNAヌクレオチドから独立して選択される、請求項9に記載の二本鎖核酸剤。
- 第2核酸鎖にアニールした第1核酸鎖を含む二本鎖核酸剤であって、ここで:
第1核酸鎖は、(i) 第1核酸鎖が第2核酸鎖にハイブリダイズしている場合にRNアーゼHにより認識され得る少なくとも2個の連続RNAヌクレオチドを有する第1RNA領域、(ii) RNアーゼHにより認識される少なくとも2個の連続RNAヌクレオチドに対して5'および3'に位置する修飾RNAヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログから選択される1個以上のヌクレオチド、(iii) 修飾RNAヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログから選択され、さらに独立して場合によりホスホロチオエート化されている1個以上のヌクレオチドを3'末端および5'末端に含む治療用オリゴヌクレオチド領域、(iv) 3'末端ヌクレオチドまたは5'末端ヌクレオチドのいずれかに連結された、脂質、ペプチド、およびタンパク質から選択される標的化部分を含み、且つ(v) 第1核酸鎖中のヌクレオチドの総数は12〜100であり;
第2核酸鎖は、(i) 第1核酸鎖の第1RNA領域にハイブリダイズしており、RNアーゼHによる第1核酸鎖中の少なくとも2個の連続RNAヌクレオチドの認識を促進し得る第1DNA領域、および(ii) 第1DNA領域に対して5'および3'に位置する修飾DNAヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログから選択され、さらに独立して場合によりホスホロチオエート化されている1個以上のヌクレオチドを含み;さらに
第1核酸鎖の治療用オリゴヌクレオチド領域は第2核酸鎖とハイブリダイゼーションすることができない、
前記二本鎖核酸剤。 - 第2核酸鎖にアニールした第1核酸鎖を含む二本鎖核酸剤であって、ここで:
第1核酸鎖は、(i) 少なくとも2個のPNAヌクレオチドを有する第1PNA領域、(ii) 治療用オリゴヌクレオチド領域の3'末端および5'末端における少なくとも1つのヌクレオチド間結合が天然のヌクレオチド間結合よりもヌクレアーゼ耐性である該治療用オリゴヌクレオチド領域を含み、且つ(iii) 第1核酸鎖の3'末端および5'末端における少なくとも1つのヌクレオチド間結合が、天然のヌクレオチド間結合よりもヌクレアーゼ耐性であり;
第2核酸鎖は、(i) 第1核酸鎖の第1PNA領域にハイブリダイズした第1DNA領域を含み、且つ(ii) 第2核酸鎖の3'末端および5'末端における少なくとも1つのヌクレオチド間結合は、天然のヌクレオチド間結合よりもヌクレアーゼ耐性であり;さらに
第1核酸鎖の治療用オリゴヌクレオチド領域は第2核酸鎖とハイブリダイゼーションすることができない、
前記二本鎖核酸剤。 - 第2核酸鎖にアニールした第1核酸鎖を含む二本鎖核酸剤であって、ここで:
第1核酸鎖は、(i) 第1核酸鎖が第2核酸鎖にハイブリダイズしている場合にRNアーゼHにより認識され得る少なくとも2個の連続RNAヌクレオチドを有する第1RNA領域、(ii) 治療用オリゴヌクレオチド領域の3'末端および5'末端における少なくとも1つのヌクレオチド間結合が天然のヌクレオチド間結合よりもヌクレアーゼ耐性である該治療用オリゴヌクレオチド領域を含み、(iii) 第1核酸鎖の3'末端および5'末端における少なくとも1つのヌクレオチド間結合が、天然のヌクレオチド間結合よりもヌクレアーゼ耐性であり、且つ(iv) 第1核酸鎖中のヌクレオチドの総数は12〜100であり;
第2核酸鎖は、(i) 第1核酸鎖の第1RNA領域にハイブリダイズしており、RNアーゼHによる第1核酸鎖中の少なくとも2個の連続RNAヌクレオチドの認識を促進し得る第1DNA領域を含み、(ii) 第2核酸鎖の3'末端および5'末端における少なくとも1つのヌクレオチド間結合は、天然のヌクレオチド間結合よりもヌクレアーゼ耐性であり、且つ(iii) 第2核酸鎖中のヌクレオチドの総数は少なくとも8であり;さらに
第1核酸鎖の治療用オリゴヌクレオチド領域は、哺乳動物細胞中で生理的温度において、第2核酸鎖とハイブリダイゼーションすることができない、
前記二本鎖核酸剤。 - 治療用オリゴヌクレオチドを細胞に送達する方法であって、該細胞を、請求項1〜13のいずれか1項に記載の二本鎖核酸剤を含む組成物と接触させるステップを含む、前記方法。
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