WO2002026754A2 - Oligonukleotide, diese enthaltende mittel und deren verwendung - Google Patents

Oligonukleotide, diese enthaltende mittel und deren verwendung Download PDF

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Definitions

  • Special modified oligonucleotide backbones without a phosphorus atom are generally formed by short-chain alkyl or cycloalkyl internucleoside linkages, which can optionally also include heteroatoms or heterocycles. These include those with morpholino linkages (partially formed from the sugar part of the nucleoside); Siloxane backbones; Sulfide, sulfoxide and sulfone backbones; Formacetyl and thioformacetyl backbones; Methylene formacetyl and thioformacetyl backbones; Backbones containing alkene; Sulfamate backbones; Methylene imino and methylene hydrazino backbones; Sulfonate and sulfonamide backbones; Amide backbones; and others with mixed N, O, S and CH 2 component parts.
  • Modified oligonucleotides can also contain one or more substituted sugar groups.
  • the 2'-position can be substituted with OH, F, O-, S- or N-alkyl, OS- or N-alkenyl, O-, S- or N-alkynyl, or O-alkyl-O-alkyl, wherein alkyl, alkenyl and alkynyl are preferably substituted or unsubstituted C 1 -C 4 -alkyl or C 2 -C 10 -alkenyl or alkynyl.
  • oligonucleotides which are terminally modified.
  • further modifications of oligonucleotides according to the invention can relate to individual nucleosides, it being possible for several nucleosides to be modified differently or uniformly. Mixtures of differently modified oligonucleotides can also be used according to the invention, in particular with regard to the use according to the invention.
  • the compounds according to the invention can be prepared in a manner known per se.
  • Known solid phase synthesis systems are used in particular. Suitable devices are commercially available, for example from Applied Biosystems (Foster City, California). Accordingly, the compounds are synthesized in vitro.
  • Prodrugs can also be used. This is an inactive form of the active ingredient that is converted into an active form in vivo.
  • Prodrug versions of oligonucleotides can be provided, for example, as S- (acetyl-2-thioethyl) phosphate derivatives.
  • the pharmaceutically acceptable base addition salts include salts with metals or amines, such as alkali and alkaline earth metals or organic amines, in particular cations such as sodium, potassium, ammonium, magnesium and calcium or polyamines such as spermine and spermidine.
  • Another object of the present invention is the use of a compound according to the invention for inhibiting the proliferation of tumor cells.
  • the present invention also relates to agents and in particular pharmaceutical agents which comprise at least one oligonucleotide according to the invention and, if desired, suitable auxiliaries which in particular form a pharmaceutically acceptable formulation basis.
  • suitable auxiliaries which in particular form a pharmaceutically acceptable formulation basis.
  • treatment means preventive or prophylactic, or at least delay, or alleviate or remedy acute or chronic, i.e. in particular, reduce and, if necessary, suppress the proliferation of the tumor, thereby reducing the extent of the tumor and reducing the risk or incidence for metastases derived from the primary tumor.
  • the present invention therefore also relates to the use of at least one compound according to the invention for the treatment of tumors.
  • This use also includes a method in which an effective amount of at least one compound according to the invention is administered to an individual to be treated, in particular a human being and also a farm animal or pet. Administration is usually carried out once or several times a day, if appropriate together or alternating with other active substances or preparations containing active substances.
  • the therapy can include the use of further treatment measures, for example chemotherapy by administration of cytostatics or radiation therapy.
  • Panc-Tu-I, Pan-Tu-Il, A818-4 and HPAF cell lines were primarily used as human pancreatic tumor cells.
  • the uptake of the modified ODN by the cells was determined using confocal laser microscopy.
  • mice were sacrificed after 14 and 21 days, respectively.
  • pancreatic tumors were weighed and measured to calculate the volume using the formula ⁇ / 6x height x length x width. Liver, lungs, omentum and spleen were removed to be typical
  • Pancreatic tumors The volume and weight of the tumor has also decreased by approximately 2/3. This shows that not only does the growth of human pancreatic tumors stop in vivo, but that a marked reduction in the tumor is achieved within 2-3 weeks. This is also of outstanding importance insofar as the PancTuI pancreatic adenocarcinoma cell line used in vivo is a very apoptosis-resistant tumor cell line that is completely inert to numerous other treatment strategies (e.g. triggering programmed cell death through Fas / CD95 activation, TRAIL or chemotherapy drugs) ,

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft bestimmte Oligonukleotide, pharmazeutische Mittel, die diese Oligonukleotide enthalten, und deren therapeutische Verwendung. Die Oligonukleotide sind insbesondere in der Lage, die Proliferation von Prankreastumoren zu hemmen. Damit besitzen diese Oligonukleotide ein therapeutisches Potential zur Behandlung von Pankreastumoren. Es kann sich im weitesten Sinne um eine Antisense-Therapie handeln.

Description

Oligonukleotide, diese enthaltende Mittel und deren Verwendung
Die vorliegende Erfindung betrifft bestimmte Oligonukleotide, pharmazeutische Mittel, die diese Oligonukleotide enthalten, und deren Verwendung. Die Oligonukleotide sind insbesondere in der Lage, die Proliferation von Prankreastumoren zu hemmen. Damit besitzen diese Oligonukleotide ein therapeutisches Potential zur Behandlung von Pankreastumoren. Es kann sich im weitesten Sinne um eine Antisense-Therapie handeln.
Etwa 25.000 Amerikaner sterben im Jahr an Pankreaskrebs (A. Warshaw u. C. Fernandez- del Castillo, New England J. Med. 326, 455 (1992). Über Risikofaktoren ist wenig bekannt und das Versagten von Bestrahlungstherapie und Chemotherapie führt zu einer geringen 5- Jahres Überlebensrate nach Diagnose.
Modifizierte Oligodesoxyribonukleotide (ODN) haben sich in jüngerer Zeit als eine Gruppe vielversprechender Arzneimittel erwiesen, wobei unterschiedliche Mechanismen der Wirkung diskutiert werden. Große Erwartungen sind an die sogenannten Antisense- Oligodesocyribonukleotide (ASODN) gesetzt worden, die die Expression eines spezifischen Proteins, z.B. eines Onkogens, unterdrücken.
Trotz dieser großen Erwartungen und dem Nachweis in vitro, dass ein bestimmtes Gen weniger exprimiert wird, ist bisher nur ein einziges ASODN als Arzneimittel, Vitravene (ISIS, Carlsbad) zugelassen worden. _ _
Andererseits wird auch über sogenannte unspezifische biologische Wirkungen von
Oligodesoxyribonukleotide berichtet, die nicht die Sequenz eines ASODN aufweisen. Für die Entwicklung eines Arzneimittels ist es zunächst ohne Bedeutung, welcher Mechanismus der Wirkung zugrunde liegt, solange die Wirkung in vivo eindeutig nachgewiesen werden kann und keine oder vertretbare Nebenwirkungen auftreten.
Obwohl eine Vielzahl von Modifikationen vorgeschlagen und in vitro bei Zellkulturen durchgeführt wurden (J.P. Shaw, K. Kent, J. Bird, J. Fischback, B. Froehler, Nucl. Acid Res. 19, 747 (1991) sind klinische Studien und in v/vo-Versuche fast ausschließlich mit Phosphorothioaten durchgeführt worden, bei denen in den Phosphodiesterverknüpfungen ein Sauerstoff durch Schwefel ersetzt wird, in der Annahme, dass diese Thioate eine größere Stabilität gegenüber Nukleasen bei guter Zellgängigkeit aufweisen. Während die Halbwertszeit der normalen Phosphordiester-ODN im Durchschnitt bei 20 - 40 Minuten liegt, beträgt die Halbwertszeit der Thioate etwa 2-5 Stunden. Diese geringe Zunahme der Stabilität der Thioate mag eine Erklärung dafür sein, dass das sonst wohl so einleuchtende Modell der Antisense-Strategien in vivo noch nicht zu einem Medikament geführt hat. Bei Halbwertszeiten von 2-5 Stunden ist die Bioverfügbarkeit zu gering, und es bleibt offen,- welche Wirkung die beim Abbau entstehenden kürzeren Fragmente haben.
Es ist nun bekannt, dass in 3'- und 5'-Stellung terminal modifizierte ODN größere Stabilität gegenüber dem Angriff von Exonukleasen zeigen (M. Maier, K. Bleicher, H. Kalthoff, E. Bayer, Biomed. Peptd., Proteins & Nucl. Acids 1, 235 (1995)). Solche modifizierte ODN wurden bisher zwar in Zellkulturen, aber nicht in präklinischen Untersuchungsmodellen oder in klinischen Studien eingesetzt. Zudem wurden in den meisten in-vitro-Untersuchungen keine in 3'- und 5'-Stellung modifizierten Phosphorothioate sondern die Diester eingesetzt, so dass Endonukleasen noch angreifen können. Oft werden in vitro lipophile, kationische Tenside, wie LipofektinR zugegeben, um die Zellaufnahme zu verbessern. Die Anwendung solcher Methoden in vivo hat sich jedoch, unter anderem auch wegen der Toxizität solcher Hilfsstoffe, nicht bewährt, bzw. ist deutlich begrenzt.
Es wurde nun gefunden, dass die Proliferation von humanem Pankreastumor in vitro in Zellkulturen und in vivo im orthotopen Xenotransplantationsmodell mit bestimmten Oligodesoxyribonnukleotiden und insbesondere solchen Oligonukleotiden, die in den terminalen 3'- und/oder 5'-Stellungen kovalent gebundene Gruppen aufweisen, unterdrückt werden kann. Es wurde insbesondere gefunden, dass C- und G-reiche Sequenzen oder mindesten ein CG-Motiv die Proliferation von Pankreastumoren in vivo besonders effektiv hemmen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher die in den Ansprüchen angegebenen Oligonukleotide.
Der Begriff "Oligonukleotid" meint ein Oligomer aus Ribonukleinsäure (RNA) oder Desoxyribonukleinsäure (DNA) oder Mimetika davon. Hierzu gehören Oligonukleotide, die aus natürlich vorkommenden Nukleobasen, Zuckern und kovalenten Internukleosid- Verknüpfungen (Rückgrat) bestehen, genauso wie Oligonukleotide mit Teilen, die in der Natur nicht vorkommen, deren Funktion aber ähnlich ist. Derartig modifizierte Oligonukleotide werden den nativen Formen eriϊndungsgemäß vorgezogen, da sie gewünschte Eigenschaften, beispielsweise eine erhöhte zelluläre Aufnahme, eine erhöhte Affinität für Target-Nukleinsäuren und eine erhöhte Stabilität in Gegenwart von Nukleasen aufweisen. Insbesondere können die Nukleotide Modifizierungen oder Substitutionen an den Nukleobasen (hier auch einfach als "Base" bezeichnet) aufweisen. Zu den nicht modifizierten oder natürlichen Nukleobasen gehören die Purinbasen Adenin (A) und Guanin (G), und die Pyrimidinbasen Thymin (T), Cytosin (C) und Uracil (U). Zu modifizierten Nukleobasen (Mimetika der natürlichen Nukleobasen) gehören synthetische Nukleobasen wie 5- Methylcytosin (5-Me-C), 5-Hydroxymethylcytosin, Xanthin, Hypoxanthin, 2-Aminoadenin, 6- Methyl- und weitere Alkyl-Derivate von Adenin und Guanin, 2-Thiouracil, 2-Thiothymin und 2- Thiocytosin, 5-Halouracil und 5-Halocytosin, 5-Propinyluracil und 5-Propinylcytosin, 6- Azouracil, 6-Azocytosin und 6-Azothymin, 5-Uracil (Pseudouracil), 4-Thiouracil, 8-Halo-, 8- Amino-, 8-Thiol-, 8-Thioalkyl-, 8-Hydroxyl- und weitere 8-substituierte Adenine und Guanine, 5-Halo-, insbesondere 5-Bromo-, 5-Trifluormethyl- und weitere 5-substituierte Uracile und Cytosine, 7-Methylguanin und 7-Methyladenin, 8-Azaguanin und 8-Azaadenin, 7- Deazaguanin und 7-Deazaadenin und 3-Deazaguanin und 3-Deazaadenin. Von diesen Nukleobasen sind bestimmte besonders brauchbar zur Erhöhung der Bindungsaffinität. Hierzu gehören 5-substituierte Pyrimidine, 6-Azapyrimidine und N-2-, N-6- und O-6- substituierte Purine, z.B. 2-Aminopropyladenin, 5-Propinyluracil und 5-Propinylcytosin. Beispielsweise konnte gezeigt werden, dass 5-Methylcytosin die Stabilität eines Nukleinsäure-Duplex um 0,6-1 ,2°C erhöht.
Erfindungsgemäß geeignet sind C-reiche Oligonukleotide, in denen mehr als 40 % und vorzugsweise mehr als 50 % der Nukleobasen Cytosinreste oder Mimetika davon sind. Mimetika von Cytosinresten sind in obigem Sinne modifizierte Nukleobasen, die ähnliche
Bindungseigenschaften, also vor allem gleiche Spezifität, aber durchaus unterschiedliche Affinität für komplemetäre Nukleobasen aufweisen. Analoges gilt für Mimetika anderer Nukleobasen.
Ein angemessener Anteil an Guanin oder Mimetika davon ist erfindungsgemäß zweckmäßig. Ein C/G-Verhältnis von 2:1 oder mehr und vorzugsweise von 3:1 oder mehr ist von Vorteil.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform weisen erfindungsgemäße Oligonukleotide wenigstens ein GC- bzw. CG- Motiv auf, d.h. mindestens ein Cytosinrest oder ein Mimetikum davon ist in konsekutiver Abfolge (Sequenz) zu einem Guanin oder einem Mimetikum davon angeordnet.
Ferner ist ein relativ geringer Anteil, vorzugsweise von weniger als 15 % und insbesondere von weniger als 10%, an Adenin oder Mimetika davon erfindungsgemäß zweckmäßig. Gemäß einer besonderen Ausführungsform enthalten erfindungsgemäße Oligonukleotide kein Adenin.
In der Regel ist es zweckmäßig, dass die erfindungsgemäßen Oligonukleotide 8 bis 30, vorzugsweise 12 bis 25 und insbesondere etwa 15 Nukleobasen aufweisen.
Die Anordnung der Nukleobasen in erfindungsgemäßen Oligonukleotiden wird in der Regel dadurch gewährleistet, dass die Nukleobasen in geeigneterweise miteinander verknüpft sind. In der Regel ergibt sich ein Oligomer mit einer konsekutiven Abfolge von Nukleobasen (Sequenz), die über ein die Hauptkette bildendes Rückgrat miteinander verknüpft sind. Während lineare Oligomere bevorzugt sind, können in bestimmten Fällen auch verzweigte, cyklische oder gar vernetzte Strukturen geeignet sein.
Bei den Oligonukleotiden handelt es sich in der Regel um miteinander verknüpfte Nukleoside, d.h. Base-Zucker-Kombinationen. Der Basenteil der Nukleotide ist normalerweise eine heterozyklische Base, in den meisten Fällen ein Purin oder ein Pyrimidin. Die Nukleoside werden in der Regel durch eine kovalent an den Zuckerteil des Nukleosids gebundene Gruppe miteinander verknüpft. In denjenigen Nukleosiden, die einen Pentofuranosyl-Zucker aufweisen, kann diese Gruppe entweder an die 2'-, 3'- oder 5'- Hydroxylgruppe des Zuckers gebunden sein. In der Regel verknüpfen diese Gruppen kovalent benachbarte Nukleoside miteinander zu einer linearen, oligomeren Verbindung. Die jeweiligen Enden dieser linearen, oligomeren Struktur können wiederum miteinander verbunden werden, um zirkuläre Strukturen zu bilden. Offene, lineare Strukturen sind allerdings bevorzugt. Innerhalb der Oligonukleotidstruktur bilden die verknüpfenden Gruppen im Allgemeinen das Internukleosid-Rückgrat des Oligonukleotids. Die normale Verknüpfung oder das normale Rückgrat von RNA und DNA sind 3'-5'-Phosphodiester-Verknüpfungen, d.h. die verknüpfenden Gruppen sind Phosphatgruppen.
Erfindungsgemäß bevorzugt sind allerdings Oligonukleotide, die ein modifiziertes Rückgrat bzw. nicht-natürliche Internukleosid-Verknüpfungen aufweisen.
Insbesondere gehören zu bevorzugten, modifizierten Oligonukleotid-Rückgraten Phosphorthioate, partielll oder vollständig sulfuriert, z.B. chirale Phosphorthioate, Phosphormonothioate und Phosphordithioate. Weitere modifizierte Rückgrate sind Phosphortriester, Aminoalkylphosphotriester, Methyl- und weitere Alkylphosphonate, z.B. 3'- Alkylenphosphonate und chirale Phosphonate, Phosphinate, Phosphoramidate, z.B. 3'- Aminophosphoramidat und Aminoalkylphosphoramidate, Thionophosphoramidate, Thionoalkylphosphonate, Thionoalkylphosphotriester und Borphosphate mit normalen 3'-5'- Verknüpfungen, 2'-5'-verknüpfte Analoga davon, und solche mit entgegengesetzter Polarität, wobei die benachbarten Paare von Nukleosid-Einheiten 3'-5' zu 5'-3' oder 2'-5' zu 5'-2' verknüpft sind. Verschiedene Salze, gemischte Salze und die freien Säuren gehören ebenfalls dazu.
Besondere modifizierte Oligonukleotid-Rückgrate ohne Phosphoratom werden im allgemeinen durch kurzkettige Alkyl- oder Cykloalkyl-Internukleosid-Verknüpfungen, die gegebenenfalls auch Heteroatome oder Heterocyklen umfassen können, gebildet. Hierzu gehören diejenigen mit Morpholino-Verknüpfungen (teilweise vom Zuckerteil des Nukleosids gebildet); Siloxan-Rückgrate; Sulfid-, Sulfoxid- und Sulfon-Rückgrate; Formacetyl- und Thioformacetyl-Rückgrate; Methylenformacetyl- und Thioformacetyl-Rückgrate; Alkenenthaltende Rückgrate; Sulfamat-Rückgrate; Methylenimino- und Methylenhydrazino- Rückgrate; Sulfonate- und Sulfonamid-Rückgrate; Amid-Rückgrate; und weitere mit gemischten N-, O-, S- und CH2-Komponententeilen.
In weiteren besonderen Oligonukleotiden sind sowohl der Zucker als auch die Internukleosid- Verknüpfung, d.h. das Rückgrat natürlicher Nukleotid-Einheiten modifiziert. Bei Antisense- Anwendungen werden die Basen in der Regel zwecks Hybridisierung mit einer geeigneten Target-Nukleinsäure beibehalten. Eine derartige oligomere Verbindung, d.h. ein
Oligonukleotid mit ausgezeichneten Hybridisierungseigenschaften, wird als "Peptide Nucleic Acid" (PNA) bezeichnet. In PNA-Verbindungen ist das Zucker-Rückgrat eines
Oligonukleotids durch ein Amidrartiges Rückgrat, insbesondere ein Aminoethylglycin
Rückgrat, ersetzt. Die Nukleobasen sind erhalten und direkt oder indirekt an die Stickstoffatome des Amidteils des Rückgrats gebunden.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Oligonukleotide mit Phosphothioat-Rückgraten und ferner Oligonukleoside mit Heteroatom- Rückgraten, die insbesondere auf Struktureinheiten basieren, wie -CH2-NH-O-CH2-, -CH2- N(CH3)-O-CH2- [als Methylenmethylimino- oder kurz MMI-Rückgrat bekannt], -CH2-O- N(CH3)-CH2-, -CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2- oder -O-N(CH3)-CH2-CH2-.
Modifizierte Oligonukleotide können auch eine oder mehrere substituierte Zuckergruppen enthalten. Beispielsweise kann die 2'-Position substituiert sein mit OH, F, O-, S- oder N-Alkyl, O-S- oder N-Alkenyl, O-, S- oder N-Alkinyl, oder O-Alkyl-O-Alkyl, worin Alkyl, Alkenyl und Alkinyl vorzugsweise substituiertes oder unsubstituiertes C Cι0-Alkyl oder C2-C10-Alkenyl bzw. -Alkinyl sind. Insbesondere bevorzugt sind Substituenten, wie O[(CH2)nO]mCH3, O(CH2)nOCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nNH2 und O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2, worin n und m ganze Zahlen von 1 bis 10 sind. Zu bevorzugten Modifizierungen gehört eine Alkoxy- Alkoxy-Gruppe, z.B. Z-Methoxyethoxy (2'-O-CH2CH2OCH3, ebenfalls als 2'-O-(2- Methoxymethyl) oder Z-MOE bekannt). Zu einer weiteren bevorzugten Modifizierung gehört 2'-Dimethylaminooxyethoxy, d.h. eine O(CH2)2ON(CH3)2-Gruppe, ebenfalls als Z-DMAOE bekannt.
Zu weiteren bevorzugten Modifizierungen gehören 2'-Methoxy (2'-O-CH3), 2'-Aminopropoxy (2'-OCH2CH2CH2NH2) und 2'-Fluoro (Z-F). Ähnliche Modifizierungen können auch an anderen Positionen auf dem Oligonukleotid, insbesondere an der 3'-Position des Zuckers des 3'-terminalen Nukleotids oder in 2'-5'-verknüpften Oligonukleotiden, und an der 5'- Position des 5'-terminalen Nukleotids vorgenommen werden. Ebenfalls können erfindungsgemäße Oligonukleotide Zucker-Mimetika, wie Cyclobutyl-Gruppen anstatt des Pentofuranosyl-Zuckers aufweisen.
Weitere Modifikationen erfindungsgemäßer Oligonukleotide beinhalten, dass man an das Oligonukleotid eine oder mehrere Gruppen oder Konjugate knüpft, die Aktivität, celluläre Verteilung oder celluläre Aufnahme der Oligonukleotide erhöhen. Zu derartigen Gruppen gehören vor allem Polyglykole, insbesondere Polyalkylenglykole, vorzugsweise Polyethylenglykole, Peptide und vor allem lipophile Reste, wie Fettsäurereste mit vorzugsweise 8 bis 32 Kohlenstoffatomen, die gesättigt oder einfach oder mehrfach ungesättigt sein können, Cholesterol, Tocopherole, insbesondere α-Tocopherol und hioervon vor allem das natürlich vorkommende D-Enantjomer, oder Steroide, sowie Derivate davon, insbesondere Cholinsäure, Thioether, z.B. Hexyl-S-Tritylthiol, Thiocholesterol, aliphatische Ketten, z.B. Dodecandiol- oder Undecyl-Reste, Phospholipide, z.B. Dihexyldecyl-rac-Glycerol oder Triethylammonium-1 ,2-die-O-Hexadecyl-rac-Glycero-3-H-Phosphonat, Polyaminketten, Adamantanessigsäure, Palmitylgruppen, oder Octadecylamin- bzw. Hexylaminocarbonyloxicholesterol-Gruppen. Zu den Konjugaten gehören beispielsweise Nanopartikel, die zweckmäßigerweise positiv geladen sind. Durchmesser von 100 bis 500 nm sind brauchbar. Polymere finden in diesem Zusammenhang besondere Verwendung. So sind insbesondere Partikel auf Polystyrol- oder Polyacrylatbasis zu nennen.
Durch die Modifikation mit lipophilen Resten vor allem in 3'- und 5'-Stellung wird die Bioverfügbarkeit wegen der um Größenordnungen verlängerten Halbwertszeit gegenüber dem Angriff von Nukleasen erhöht. Ähnliche Effekte werden auch bestimmte hydrophile Reste wie Polyethylenglykole vor allem in 3'-Stellung erzielt. Konjugiert man die erfindungsgemäßen Oligonukleotide an positiv geladene Nanopartikel, wird ebenfalls die Stabilität gegenüber dem Angriff von Nukleasen sowohl bei nicht modifizierten, Phosphorthioat-Verknüpfungen aufweisenden als auch terminal modifizierten Oligonukleotiden erhöht und eine vorzügliche Aufnahme in Tumorzellen beobachtet.
Erfindungsgemäß besonders bevorzugt sind Oligonukleotide, die terminal modifizeirt sind. Zudem können weitere Modifizierungen erfindungsgemäßer Oligonukleotide einzelne Nukleoside betreffen, wobei mehrere Nukleoside unterschiedlich oder einheitlich modifiziert sein können. Auch Gemische aus unterschiedlich modifizierten Oligonukleotiden sind insbesondere im Hinblick auf die erfindungsgemäße Anwendung erfindungsgemäß brauchbar.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in an sich bekannter Art und Weise hergestellt werden. Insbesondere finden bekannte Festphasensynthese-Systeme Anwendung. Geeignete Vorrichtungen sind kommerziell erhältlich, beispielsweise von Applied Biosystems (Foster City, Kalifornien). Demnach werden die Verbindungen in-vitro synthetisiert.
Brauchbar sind ebenfalls pharmazeutisch verträgliche Salze, Ester, Salze der Ester oder beliebige weitere Verbindungen, die nach Verabreichung an ein Tier, insbesondere Menschen, in der Lage sind, direkt oder indirekt den biologisch aktiven Metaboliten oder einen Teil davon, zu liefern.
So sind_heispielsweise auch sogenannte "Prodrugs" brauchbar. Hierbei handelt es sich um eine inaktive Form des Wirkstoffs, die in-vivo in eine aktive Form umgewandelt wird. Prodrug-Versionen von Oligonukleotiden können beispielsweise als S-(Acetyl-2- thioethyl)phosphat-Derivate bereitgestellt werden.
Zu den pharmazeutisch verträglichen Basenadditionssalzen gehören Salze mit Metallen oder Aminen, wie Alkali- und Erdalkalimetallen oder organischen Aminen, insbesondere Kationen wie Natrium, Kalium, Ammonium, Magnesium und Caicium bzw. Polyaminen wie Spermin und Spermidin.
Zu den pharmazeutisch akzeptablen Säureadditionssalzen gehören Salze mit anorganischen Basen, z.B. Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Salpetersäure und dergleichen, sowie mit organischen Säuren, z.B. Essigsäure, Oxalsäure, Weinsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Gluconsäure, Zitronensäure, Äpfelsäure, Ascorbinsäure, Benzoesäure, Tanninsäure, Palmitinsäure, Algininsäure, Polyglutaminsäure, Naphthalinsulfonsäure, Methansulfonsäure, p- Toluolsulfonsäure, Naphthalindisulfonsäure, Polygalactoronsäure und dergleichen.
Beispiele für eine hervorragende Hemmung der Proliferation von humanen Pankreastumorzellen sind Oligonukeotide mit folgenden Sequenzen:
5'-TGC TCC CCC CTG GCT-3' (SEQ ID NO:1 ) 5'-CCT CGC TTC GCC CGT-3^ (SEQ ID NO:2)
Insbesonder von Vorteil sind die entsprechenden Phosphorthioate. Auch die Modifizierung in 3'-SteIlung mit Poylethylenglykol (MW 1500) und in 5'-Stellung mit α-Tocopherol bringt zusätzliche Vorteile. Während Sequenz SEQ ID NO:1 beispielhaft für ein Antisense- Oligonukleotid zur Unterdrückung der Genexpression des mutierten p53-Proteins steht, ist Sequenz SEQ ID NO:2 ein Beispiel für eine aus randomisierten Oilgonukleotidbibliothek ausgewählten Sequenz. Weitere Sequenzen können aus Antisense-Sequenzen oder randomisierten Oilgonukleotidbibliotheken im Rahmen der Erfindung ausgewählt und gegebenenfalls modifiziert werden, indem man insbesondere eines oder mehrere der folgenden Selektionskriterien anwendet:
- Hemmung der Proliferation des Wachstums von Pankreastumorzellen durch
Bestimmung des 3H-Thymidineinbaus;
Stabilität der.Konstrukte gegen den Angriff von endo- und/oder exo-Nukleasen durch Messung der Halbwertszeit der Oligonukleotide mittels Kapillarelektrophorese;
Bestimmung der Aufnahme der Oligonukleotide in Zellen durch konfokale Laser- Scanning-Mikroskopie;
Apoptose-Induktion.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung einer erfindungsgemäßen Verbindung zur Proliferationshemmung von Tumorzellen.
Diese Verwendung beinhaltet auch ein Verfahren zur Proliferationshemmung von Tumorzellen, wobei man wenigstens ein erfindungsgemäßes Oligonukleotid auf Tumorzellen einwirken lässt. Grundsätzlich kann es sich bei diesem Verfahren um ein in-vitro-, ex-vivo- oder in-vivo-Verfahren handeln. Entsprechende Systeme, z.B. in Form von Zellen oder Geweben, können in an sich bekannter Weise in-vitro- oder ex-vivo als Kultur bereitgestellt werden. Eine in-vivo-Anwendung beinhaltet in der Regel die Verabreichung des Oligonukleotids an das betreffende Individuum.
Die Bereitstellung derartiger Tumorzellsysteme kann in herkömmlicher Weise durch den Fachmann erfolgen. Insbesondere sind Techniken bekannt, um Organismen und Zellen zur entsprechenden Entartung, beispielsweise über rekombinante Techniken, zu veranlassen. Es ist auch geläufiges Fachwissen, Organismen, Zellen oder Gewebe in geeigneter Weise zu kultivieren und insbesondere die Proliferation anhand geeigneter Assays qualitativ und gewünschtenfalls auch quantitativ zu beurteilen. Insbesondere ist es eine Sache der
Optimierung des Verfahrens, geeignete Bedingungen zu wählen, unter denen das Einwirken erfindungsgemäßer Oligonukleotide eine Modulation der Proliferation bewirkt.
Auch die Verabreichung erfindungsgemäßer Oligonukleotide an ein Individuum lässt sich mit geläufigem Fachwissen bewerkstelligen. In der Regel wird dem Individuum eine bestimmte Menge wenigstens eines erfindungsgemäßen Oligonukleotids, in der Regel der pharmazeutischen oder tierarzneilichen Praxis entsprechend formuliert, verabreicht.
Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung auch Mittel und insbesondere pharmazeutische Mittel, die wenigstens ein erfindungsgemäßes Oligonukleotid sowie gewünschtenfalls geeignete Hilfsstoffe, die insbesondere eine pharmazeutisch verträgliche Formulierungsgrundlage bilden, umfassen. Die Herstellung derartiger Mittel ist geläufiges Fachwissen.
Die erfindungsgemäßen Oligonukleotide können im Rahmen dieser Verwendungen und Verfahren bespielsweise wissenschaftlichen Zwecken dienen. Vor allem können die erfindungsgemäßen Verbindungen für therapeutische Zwecke verwendet werden.
Therapeutische Zwecke von besonderer Bedeutung betreffen die Behandlung von Tumoren. Behandlung meint in diesem Zusammenhang präventiv bzw. prophylaktisch vermeiden oder zumindest zeitlich verzögern, bzw. akut oder chronisch lindern oder beheben, d.h. insbesondere die Proliferation des Tumors verringern und gegebenefalls unterdrücken und damit die Tumorausdehnung verringern sowie das Risiko bzw. die Inzidenz für Metastasen, die sich vom Primärtumor ableiten, senken.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher auch die Verwendung wenigstens einer erfindungsgemäßen Verbindung zur Behandlung von Tumoren. Diese Verwendung beinhaltet auch ein Verfahren, bei dem eine wirksame Menge wenigstens einer erfindungsgemäßen Verbindung einem zu behandelnden Individuum, insbesondere einem Menschen und auch einem Nutz- oder Haustier, verabreicht wird. Die Verabreichung erfolgt in der Regel einmalig oder mehrmalig täglich, gegebenenfalls zusammen oder im Wechsel mit anderen Wirkstoffen oder wirkstoffhaltigen Präparaten. In diesem Sinne kann die Therapie die Anwendung weiterer Behandlungsmaßnahmen miteinschließen, z.B. Chemotherapie durch Verabreichung von Cytostatika oder Strahlentherapie.
Besondere Vorteile ergeben sich bei der Behandlung von Pankreastumoren insbesondere beim Menschen.
Die vorliegende Erfindung wird nun anhand der nachfolgenden Beispiele weiter erläutert.
Beispiel 1
Methodischer Teil
Synthesen Die modifizierten ODN wurden an einem Applied Biosystem Modell 394 DNA/RNA
Synthesizer mit TentaGel (Rapp Polymere Tübingen) als Träger hergestellt. Modifizierte Protokolle für die Synthese an Tentagel wurden entsprechend der Literatur (E. Bayer, M. ---Maier, K. Bleicher, H.-J. Gaus, Z. Naturforsch. 50b, 671-676 (1995) verwendet. PEG,
Fettsäurereste, Cholesteryl- und Tocopherylrste am 5'-Ende wurden als Phosphoramidite in CH2CI2 bzw. Acetonitril (0,1 M) eingeführt. Als Sulfurierungsreagens wurde vorweigend TETD (ABI, Weiterstadt) benutzt. Die Reinigung der DMT-geschützten ODN's wurde mit HPLC durchgeführt: 15 min. linearer Gradient 20-80% Acetonitril in 0.1 M Trimethylammoniumacetat, Fluß 1 ml/min, Säule Nucleosil 100 C18, 250x4 mm, bzw. Fluß 15 m/min, Säule GROM-SIL 100 ODS2 FE, 250x20 mm (Gram, Herrenberg).
Zellkulturen und Zellaufnahme
Als humane Pankreastumorzellen wurden vor allem Panc-Tu-I-, Pan-Tu-Il-, A818-4 und HPAF-Zelllinien verwendet. Die Aufnahme der modifizierten ODN durch die Zellen wurde mit konfokaler Lasermikroskopie bestimmt.
Messung der Proliferation in vitro Zellsuspensionen (7 x 104 Zellen ml"1) wurden in jedes well einer 96-well-Mikrotiterplatte (Nunc, Wiesbaden) gebracht. Nach 24 Stunden wurde das Medium gewechselt und die Zellkulturen (mit jeweiligen ODN-Behandlung und die Kontrollen ohne Behandlung) wurden in 100 μl Ansätzen mit 10 μl Medium, das 7.4 kBq Methyl-3H-Thymidin (Amersham, Braunschweig) enthielt, während der letzten 3 Stunden der angegebenen Inkubationszeiten markiert. Anschließend wurden die Zellen geerntet und die Radioaktivität mit einem Flüssig- Szintillationszähler gemessen.
in vitro wurden auch Bestimmungen des p53-Proteins mittels ELISA oder Westemblot durchgeführt.
In wYo-Untersuchungen an SCID-Mäusen
Verwendet wurden dabei weibliche SCID Mäuse, die nicht älter als acht Wochen waren. Den
Tieren wurden nach Laparotomie in Narkose 1 x 106 PancTu-l Zellen in das Pankreas injiziert. Eine Gruppe wurde über subkutan (implantierte Dauerpumpen (ALZET©-Pumpen), die andere Gruppe wurde einmal täglich intraperitoneal mit ODN behandelt in einer
Konzentration von 6 bzw. 18 mg/g Körpergewicht/d.
Die Mäuse wurden nach 14 bzw. 21 Tagen getötet. Die Pankreastumoren wurden gewogen und vermessen um das Volumen nach der Formel π/6x Höhe x Länge x Breite zu berechnen. Leber, Lungen, Omentum und Milz wurden entnommen, um typische
Metasierungswege zu erfassen.
Hemmung der Proliferation in vivo
Figur 1a zeigt das Größen- und Figur 1b das Gewichtwachstum von 2 Behandlungsgruppen mit dem ODN 5 ocopheryl-TGC TCC CCC CTG GCT-3'-PEG1500 als Phosphorthioate. Gegenüber der Kontrollgruppe ist das Größen- und Gewichtswachstum deutlich verringert. Das Volumen des Tumors hat bei intraperitonealer Injektion um 64% abgenommen. Noch günstiger erscheint die Behandlung mit der subkutanen Dauerpumpe. Das Volumen der Tumoren hat nach 21 Tagen um 70% abgenommen. Die histologischen und histochemischen Untersuchungen der Organe zeigen keine auffallenden Befunde. Figur 2 zeigt die Dosisabhängigkeit der Wirkung.
In Figur 3 ist das Größen- und in Figur 2b das Gewichtswachstum von 2 Behandlungsgruppen mit dem ODN 5'-Tocopheryl-CCT CGC TTC GCC CGT-3-PEGι5oα gezeigt. Die Behandlung mit ODN setzte sofort nach Implantation des humanen
Pankreastumors ein. Das Volumen und Gewicht des Tumors hat ebenfalls um etwa 2/3 abgenommen. Damit ist aufgezeigt, dass nicht nur das Wachstum humaner Pankreastumoren in vivo gestoppt wird, sondern innerhalb von 2-3 Wochen ein markante Reduktion des Tumors erzielt wird. Dies ist auch insofern von herausragender Bedeutung, als es sich bei der in vivo eingesetzten Pankreasadenokarzinomzellinie PancTuI um eine sehr apoptoseresistente Tumorzellinie handelt, die gegenüber zahlreichen anderen Behandlungsstrategien (z.B. Auslösung des programmierten Zelltodes durch Fas/CD95-Aktivierung , TRAIL oder Chemotherpeutika) völlig inert ist.

Claims

Patentansprüche
I . Oligonukleotid, dadurch gekennzeichnet, dass mehr als 40 % der Nukleobasen Cytosinreste oder Mimetika davon sind. 2. Oligonukleotid nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein
Cytosinrest oder ein Mimetikum davon in konsekutiver Abfolge zu einem Guanin oder einem Mimetikum davon angeordnet ist .
3. Oligonukleotid nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Verhältnis von Cytosin oder Mimetika davon zu Guanin oder Mimetika davon wenigstens 2:1 beträgt.
4. Oligonukleotid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass weniger als 15 % der Nukleobasen Adenin oder Mimetika davon sind.
5. Oligonukleotid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Oligonukleotid eine Anordnung von wenigstens 8 konsekutiven Nukleobasen aus einer der Sequenzen SEQ ID NO:1 oder SEQ ID NO:2 aufweist.
6. Oligonukleotid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens ein Teil der Nukleobasen entsprechend der Sequenz SEQ ID NO:1 oder SEQ ID NO:2 angeordnet ist.
7. Oligonukleotid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Oligonukleotid 8 bis 30 Nukleobasen aufweist.
8. Oligonukleotid mit der Sequenz SEQ ID NO:1.
9. Oligonukleotid mit der Sequenz SEQ ID NO:2. 10. Oligonukleotid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Oligonukleotid wenigstens eine Phosphorthioat- Verknüpfung aufweist.
I I . Oligonukleotid nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass das sämtliche Nukleoside über Phosphorthioate verknüpft sind. 12. Oligonukleotid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Oligonukleotid terminal modifiziert ist.
13. Oligonukleotid nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Oligonukleotid am 3' und/oder 5'-Ende modifiziert ist.
14. Oligonukleotid nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass terminal wenigstens ein Polyalkylenglykol, eine lipophiler Rest oder ein Peptid gebunden ist.
15. Oligonukleotid nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Polyalkylenglykol ein Poylethylenglykol ist.
16. Oligonukleotid nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass das Poylethylenglykol eine mittlere Molmasse von 150 bis 3000 Dalton aufweist. 17. Oligonukleotid nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass das
Poylethylenglykol Hexaethylenglykol ist. 18. Oligonukleotid nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass der lipophile
Rest ein Fettsäurerest, Cholesterol, ein Steroidrest, oder ein Tocopherylrest, bzw. ein Derivat dieser Reste ist. 19. Oligonukleotid nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass der lipophile
Rest α-Tocopheryl, vorzugsweise D-Tocopheryl ist. 20. Oligonukleotid nach Anspruch 12, 16, 17 oder 19, dadurch gekennzeichnet, dass ein Terminus einen Polythylenglykolrest und der andere Terminus einen Tocopherylrest aufweist. 21. Oligonukleotid nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass der
Polythylenglykolrest am 3'-Terminus und der Tocopherylrest am 5'-Terminus gebunden ist. 22. Oligonukleotid nach Anspruch 12 oder 19, dadurch gekennzeichnet, dass beide Termini einen Tocopherylrest aufweisen. 23. Oligonukleotid nach einem der Ansprüche 12 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass der terminale Rest über eine Amid- oder Esterbindung gebunden ist.
24. Oligonukleotid nach Anspruch 1 , 10, 11 , 16, 17, 19 oder 23, nämlich: 5'rTocopheryl-TGC TCC CCC CTG GCT-3'-PEG;
5'-Tocopheryl- CCT CGC TTC GCC CGT -3'-PEG; δ'-Tocopheryl-TGC TCC CCC CTG GCT-3'- Tocopheryl;
5'-Tocopheryl- CCT CGC TTC GCC CGT -3'- Tocopheryl.
25. Pharmazeutisches Mittel, enthaltend wenigstens ein Oligonukleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 24 und gegebenenfalls pharmazeutisch verträgliche Hilfsstoffe. 26. Verwendung eines Oligonukleotids nach einem der Ansprüche 1 bis 24, zur
Herstellung eines pharmazeutischen Mittels zur Behandlung von Tumoren, insbesondere humaner Tumoren. 27. Verwendung nach Anspruch 26, wobei die Behandlung auf Pankreastumoren gerichtet ist. 28. Verwendung nach Anspruch 26 oder 27, wobei die Behandlung adjuvant ist.
29. Verwendung nach einem der Ansprüche 26 bis 28, wobei die Behandlung in Kombination mit wenigstens einem Cytostatikum und/oder Strahlentherapie erfolgt.
30. Verfahren zur Hemmung der Proliferation von Tumorzellen, wobei man wenigstens ein Oligonukleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 24 auf Tumorzellen einwirken lässt.
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