DE69934998T2 - Antisense modulation der expression von integrin alpha 4 - Google Patents

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Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung stellt Zusammensetzungen und Methoden zur Modulation der Expression von Integrin α4 zur Verfügung. Diese Erfindung betrifft vornehmlich Antisense-Verbindungen, insbesondere Oligonukleotide, die spezifisch mit für humanes Integrin α4 kodierenden Nukleinsäuren hybridisierbar sind. Für solche Oligonukleotide wurde gezeigt, dass sie die Expression von humanem Integrin α4 modulieren.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Eine Entzündung ist eine örtlich begrenzte Schutzantwort, die von Geweben als Antwort auf Verletzung, Infektion oder Gewebezerstörung ausgelöst wird und zur Zerstörung des infektiösen oder verletzenden Agens und der Isolierung des verletzten Gewebes führt. Eine typische Entzündungsantwort läuft wie folgt ab: Erkennung eines Antigens als fremdartig oder Erkennung eines Gewebeschadens, Synthese und Ausschüttung von löslichen Entzündungsbotenstoffen, Rekrutierung von Zellen des Entzündungssystems zur Stelle der Infektion oder des Gewebeschadens, Zerstörung und Beseitigung des eindringenden Organismus oder beschädigten Gewebes, sowie Deaktivierung des Systems, sobald der eindringende Organismus oder Schaden beseitigt wurde. In vielen menschlichen Krankheiten mit Entzündungskomponente sind die normalen homöostatischen Mechanismen, die diese entzündlichen Antworten abschwächen, defekt, was zur Beschädigung und zur Zerstörung von normalem Gewebe führt.
  • Zell-Zell-Interaktionen sind in die Aktivierung der Immunantwort bei jedem der oben beschriebenen Schritte beteiligt. Einer der am frühesten zu detektierenden Abläufe in einer normalen Entzündungsantwort ist die Adhäsion von Leukozyten an das vaskuläre Endothelium, gefolgt von der Wanderung der Leukozyten aus dem Gefäßsystem heraus an die Stelle der Infektion oder Verletzung. Die Adhäsion dieser Leukozyten oder weißen Blutkörperchen an das vaskuläre Endothelium ist ein notwendiger Schritt bei der Wanderung aus dem Gefäßsystem heraus (Harlan, J. M., Blood 1985, 65, 513-525). Diese Antwort wird durch die Interaktion der auf der Zelloberfläche exprimierten Adhäsionsmoleküle von Leukozyten und von Zellen des vaskulären Endotheliums vermittelt. Das very late antigen-4 (auch genannt VLA-4, α4β1 oder CD49d/CD29) ist ein homodimerer Adhäsionsrezeptor, der aus nicht kovalent verbundenen α und β Einheiten zusammengesetzt ist und dazu dient, die leukozytische Adhäsion an das vaskuläre Zelladhäsionsmolekül 1 (VCAM-1) zu vermitteln, dass auf Cytokin-stimulierenden Endothelzellen exprimiert ist. Diese Interaktion zwischen VCAM-1 und VLA-4 trägt zur leukozytischen Extravasation in akuten und chronisch entzündlichen Zuständen einschliesslich multipler Sklerose (MS), rheumatoidischer Arthritis, Asthma, Psoriasis und Allergie bei.
  • Fibronektin ist ebenso ein Ligand für VLA-4. Fibronektin spielt eine wichtige Rolle in vielen Prozessen einschliesslich der embryonalen Entwicklung, der Wundheilung und der Metastasierung von Tumorzellen (Guan, J.-L. and Hynes, R.O., Cell 1990, 60, 53-61).
  • VLA-4 ist ein Heterodimer aus einem α4 Integrin und einem β1 Integrin. Das α4 Integrin kann auch mit einer β7 Integrin-Kette heterodimerisieren, um Integrin α4β7 zu bilden, das als mukosaler Homing-Rezeptor bekannt ist, weil sein Hauptligand das mukosal-vaskulär ansprechende MadCAM-1 ist. Durch das Integrin α4β7 lässt sich eine Teilmenge von T-Gedächtniszellen mit einem Tropismus für den Verdauungstrakt identifizieren, wohingegen α4β1 (VLA-4) konstitutiv auf den meisten mononukleären Leukozyten, aber nicht auf zirkulierenden Neutrophilen exprimiert wird. Die Interaktion von VCAM-1 mit VLA-4 legt nahe, dass VLA-4 ein potenzielles therapeutisches Ziel für entzündliche Krankheiten einschliesslich der Arteriosklerose, Allergie und Asthma, Arthrose und der Metastasierung von Tumorzellen darstellt (Kassner, P.D., et al., Adv. Exp. Med. Biol. 1992, 323, 163-170). Für VLA-4 wurde auch eine Rolle in der Begünstigung der Adhäsion (d. h. dem Zurückhalten) von hämatopoetischen Stammzellen im Knochenmark gefunden (Papayannopoulou and Nakamoto, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993, 90, 9374-9378).
  • Bei Asthma handelt es sich um eine Entzündungskrankheit, die mit der eosinophilen Infiltration in die Lunge assoziiert ist. VLA-4 wird auf Eosinophilen exprimiert. Metzger, W.J. (Springer Semin. Immunopathol. 1995, 16, 467-478) verwendete ein Kaninchenmodell von Asthma, um zu demonstrieren, dass sowohl ein anti-VLA-4 Antikörper als auch ein CS-1 Peptid die eosinophile Infiltration in die Lunge verringern und die Entwicklung von Asthma reduzieren.
  • Die rheumatoide Arthritis ist eine weitere entzündungassozüerte Krankheit. Müller-Ladner, U., et al., (J. Rheumatology 1997, 24, 1873-1880) fanden heraus, dass die alternativ gesplicte Form von Fibronektin, die CS-1 enthält, im rheumatoidischen Synovium exprimiert wird. Zusätzlich fanden sie heraus, dass nicht nur die Expression von Fibronektin zur Rekrutierung von VLA-4 exprimierenden Zellen führte, sondern dass Fibroblasten im rheumatoidischen Synovium VLA-4 exprimierten. Seiffge, D. (J. Rheumatology 1996, 23, 2086-2091) verwendete ein Rattenmodell der Arthritis um zu zeigen, dass ein monoklonaler Antikörper gegen die α4-Kette von VLA-4 zu einer Verbesserung der Symptome führte.
  • VLA-4 spielt auch eine Rolle bei einer Reihe von Autoimmunerkrankungen. Marazuela, M., et al., (Eur. J. Immunol. 1994, 24, 2483-2490) fanden eine erhöhte Expression von beiden, sowohl des VLA-4/VCAM-1 als auch des LFA-1/ICAM-1,3 Signalweges, in der Graves-Krankheit und der Hashimoto Thyroiditis, was nahe legt, dass beide eine Rolle bei diesen Krankheiten spielen. VLA-4 könnte auch eine Rolle bei der Multiplen Sklerose spielen. Für Antikörper gegen VLA-4 wurde herausgefunden, dass sie die experimentelle autoimmune Encephalomyelitis (EAE), eine experimentell induzierte Krankheit mit Ähnlichkeiten zur Multiplen Sklerose, verhindern (Yednock, T.A., et al., Nature 1992, 356, 63-66). Erhöhte Expressionslevel von VLA-4 wurden in einem Patienten mit systemischer Lupus-Erythematosus detektiert (Takeuchi, T., et al., Clin. Rheumatology 1995, 14, 370-374). VLA-4 ist an zellulären Antworten auf zwei operative Verfahren, nämlich die Transplantation und vaskuläre Wiederherstellungsverfahren, beteiligt. Die Abstoßung von artgleichem Transplantat ist eine übliche Antwort auf die Transplantation von fremdem Gewebe. Für CS-1 Peptide wurde herausgefunden, dass sie sowohl die akute Abstoßung (Coito, A.J., et al., Transplantation 1998, 65, 699-706) als auch die chronische Abstoßung (Korom, S., et al., Transplantation 1998, 65, 854-859) dadurch verhindern, dass sie die VLA-4 Bindung an Fibronektin blockieren. Während der vaskulären Wiederherstellungschirurgie ist eine bekannte Fehlerursache die intimale Hyperplasia, die aus der Akkumulation von Monozyten und Lymphozyten resultiert. In einem Pavianmodell demonstrierten Lumsden, A.B., et al., (J. Vasc. Surg. 1997, 26, 87-93), dass ein Anti-VLA-4-Antikörper die intimale Hyperplasia reduzierte.
  • VLA-4 spielt auch eine Rolle in der Metastasierung von Tumorzellen. Tumorzellen müssen bei der Metastasierung die extrazelluläre Matrix überwinden, das zirkulierende System erreichen und in neues Gewebe vordringen. Bao, L. et al., (Differentiation 1993, 52, 239-246) detektierten eine VLA-4 Expression von vielen menschlichen Tumorzelllinien einschliesslich Brustkrebs, Melanomen sowie Nierenkrebs und fanden heraus, dass das Vorhandensein von VLA-4 gut mit dem metastasierenden Potential korrelierte. Kawaguchi, S. et al., (Jpn. J. Cancer Res. 1992, 83, 1304-1316) transfizierten eine für die α4 Untereinheit von VLA-4 kodierende cDNA in eine menschliche Fibrosarcoma-Zelllinie. Diese Zellen überexprimierten VLA-4 und zeigten eine erhöhte in vitro invasive Fähigkeit. Für die Zunahme der Metastasierung durch IL-1 (Garofalo, A., et al., Cancer Res. 1995, 55, 414-419) oder TNF-α (Okahara, H., et al., Cancer Res. 1994, 54, 3233-3236) wurde gezeigt, dass daran die Interaktion zwischen VLA-4 und VCAM-1 beteiligt ist. Die Autoren legen nahe, dass eine Therapie, die auf die Inhibition dieser Interaktion gerichtet ist, nützlich zur Reduktion des Risikos der Metastasierung wäre sowie bei Zuständen, die mit hohen Serumkonzentrationen von TNF-α assoziiert sind, einschliesslich Cachexia, Sepsis, Operationsstress oder therapeutischen TNF-α-Anwendungen. Weil Tumorzellen oft IL-1 und TNF-α ausscheiden, könnte eine solche Therapie nützlich bei der Reduktion des Risikos der Metastasierung, die mit solchen Tumorzellen assoziiert ist, sein.
  • VLA-4 ist an der Forcierung der Retention von hämatopoetischen Progenitorzellen im Knochenmark beteiligt. Für Antikörper gegen Integrin α4 (nicht aber gegen Integrin β2) wurde herausgefunden, dass sie selektiv Progenitor/Stammzellen in den Blutkreislauf mobilisieren (Papayannopoulou and Nakamoto, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993, 90, 9374-9378). Diese Mobilisierung ist auf dem Gebiet der Knochenmarkstransplantation von klinischer Bedeutung, da sie das Bedürfnis zur Knochenmarksernte durch das zur Verfügungstellen von hämatopoetischen Progenitorzellen im zirkulierenden Blut umgeht.
  • Obwohl Steroide und andere entzündungshemmende Wirkstoffe zur Behandlung entzündlicher Krankheiten und Zustände effektiv sind, führt die Langzeitverwendung oft zu Nebenwirkungen wie etwa einem erhöhten Infektionsrisiko, das durch die Schädigung der phagozytischen Leukozytenwanderung und Funktion verursacht wird. Es gibt Bedenken, dass die Inhibition der Funktion der β1 Integrin-Kette mit einer erhöhten Anfälligkeit gegenüber Infektionen assoziiert ist, wie es durch einen β1 (auch CD18 genannt) monoklonalen Antikörpern in Hasen demonstriert wurde (Foster, C.A., 1996, J. Allergy Clin. Immunol., 98, 270-277). Man glaubt, dass die selektive Inhibition der α4-Kette ein vielversprechenderer Ansatz sein könnte. Für die Inhibition der α4-Kette nimmt man an, dass sie wahrscheinlich die Levels des VLA-4 Heterodimers wie auch des α4β7 Heterodimers reduziert.
  • Potentielle therapeutische, auf VLA-4 gerichtete Eingriffe schliessen monoklonale Antikörper und Peptidantagonisten ein. Leger, O.J.P., et al. (Human Antibodies 1997, 8, 3-16) beschreiben einen monoklonalen Antikörper gegen VLA-4, der in klinischen Studien der Phase II zur Behandlung von Multipler Sklerose ist. CS-1 Peptidantagonisten wurden von Jackson, D.Y., et al. (J. Med. Chem. 1997, 40, 3359-3369) beschrieben.
  • Hayashi et al. (Cell Struct. Funct. 1991, 16, 241-249) verwendeten einen Vektor, der zu Hühnchen-Integrin β1 komplementäre RNA exprimierte, um die Integrin β1 Expression zu reduzieren, was zu einer geänderten Zellhaftung und Zellform führte.
  • Auf verschiedene Integrine gerichtete Antisense-Oligonukleotide wurden als Hilfsmittel benutzt, um die funktionalen Interaktionen von Integrinen in komplizierten Zusammenhängen aufzulösen. Lallier und Bronner-Fraser (Science, 1993, 259, 692-695) verwendeten Phosphorothioat-Oligonukleotide gerichtet auf konservierte und nicht-konservierte Regionen von Hühnchen β1, humanen α4, Ratten-α1 und humanen α5-Integrinen, um die Effekte dieser Integrine auf die Zellanhaftung zu bestimmen. Dieselben Oligonukleotide wurden auch in neurale Kammmigrationswege des Herzens in Vogelembryos injiziert, und es wurde gezeigt, dass diese Oligonukleotide, die die Zellanhaftung in vitro inhibierten, auch Abnormalitäten in vivo im neuralen Kamm und/oder im neuralen Kanal hervorriefen (Kil et al., Devel. Biol. 1996, 179, 91-101).
  • Die EP Patentanmeldung 688 748 (Carolus et al.) offenbart 3' derivatisierte Oligonukleotid-Analoge, einschliesslich einer auf die β1-Untereinheit von VLA-4 gerichteten Sequenz.
  • Von Antisense-Oligonukleotiden wird angenommen, dass sie ein nützliche Mittel zur Modulation von Integrin α4 und zur Behandlung von Krankheiten, die mit dessen Expression assoziiert sind, darstellen.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung ist gerichtet auf Antisense-Verbindungen, insbesondere Oligonukleotide, die auf eine für Integrin α4 kodierende Nukleinsäure gerichtet sind, und die die Expression von Integrin α4 modulieren. Es werden auch pharmazeutische und andere Zusammensetzungen, die die Antisense-Verbindungen der Erfindung umfassen, zur Verfügung gestellt. Weiterhin werden Methoden zur Verfügung gestellt, um die Expression von Integrin α4 in Zellen oder Geweben zu modulieren, wobei diese den Kontakt besagter Zellen oder Gewebe mit einer oder mehrerer der Antisense-Verbindungen oder Zusammensetzungen der Erfindung umfassen. Weiterhin werden Methoden zur Verfügung gestellt, um ein Tier, insbesondere einen Menschen, der im Verdacht steht, eine Krankheit oder eine Anfälligkeit für eine Krankheit oder einen Zustand zu haben, der mit der Expression von Integrin α4 assoziiert ist, zu behandeln und zwar durch das Verabreichen einer therapeutisch oder prophylaktisch effektiven Menge einer oder mehrerer Antisense-Verbindungen oder Zusammensetzungen der Erfindung.
  • GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung verwendet oligomerische Antisense-Verbindungen, insbesondere Oligonukleotide, zur Modulation der Funktion von für Integrin α4 kodierenden Nukleinsäuremolekülen und letztendlich zur Modulation der Menge des produzierten Integrin α4. Dies wird dadurch erreicht, dass Antisense-Verbindungen, die spezifisch mit einer oder mehrerer für Integrin α4 kodierenden Nukleinsäure hybridisieren, zur Verfügung gestellt werden. Wie hier verwendet, umfassen die Begriffe „Ziel-Nukleinsäure" und „für Integrin α4 kodierende Nukleinsäure" für Integrin α4 kodierende DNA, von solcher DNA transkribierte RNA (einschliesslich pre-mRNA und mRNA) und auch von solcher RNA abstammende cDNA. Die spezifische Hybridisierung einer oligomerischen Verbindung mit ihrer Ziel-Nukleinsäure beeinträchtigt die normale Funktion dieser Nukleinsäure. Diese Modulation einer Funktion einer Ziel-Nukleinsäure durch Verbindungen, die spezifisch an sie hybridisieren, wird üblicherweise als „Antisense" bezeichnet. Die DNA-Funktionen, die beeinträchtigt werden, schließen die Replikation und Transkription ein. Die RNA-Funktionen, die beeinträchtigt werden, schließen alle vitalen Funktionen sowie zum Beispiel die Translokation der RNA an die Proteintranslationsstelle, die Proteintranslation von der RNA, das Splicen der RNA, um eine oder mehrere mRNA Spezies zu erlangen und die katalytische Aktivität, die durch die RNA erlangt oder durch sie erleichtert wird, ein. Der Gesamteffekt einer solcher Interferenz mit der Ziel-Nukleinsäurefunktion besteht in der Modulation der Expression von Integrin α4. Im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung beschreibt „Modulation" entweder eine Erhöhung (Stimulation) oder eine Erniedrigung (Inhibition) der Expression eines Genes. Im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung ist die Inhibition die bevorzugte Form der Modulation der Genexpression und mRNA ist ein bevorzugtes Ziel.
  • Es ist bevorzugt, bestimmte Nukleinsäuren als Ziel für Antisense zu verwenden. Eine Antisense-Verbindung auf eine bestimmte Nukleinsäure „auszurichten" besteht im Zusammenhang der Erfindung aus einem mehrstufigen Prozess. Der Prozess beginnt üblicherweise mit der Identifizierung einer Nukleinsäuresequenz, deren Funktion moduliert werden soll. Dies kann zum Beispiel ein zelluläres Gen (oder mRNA transkribiert von diesem Gen) sein, dessen Expression mit einer bestimmten Krankheit oder einem Krankheitszustand assoziiert ist, oder ein Nukleinsäuremolekül eines infektiösen Agens. In der vorliegenden Erfindung ist das Ziel ein für Integrin α4 kodierendes Nukleinsäuremolekül. Der Prozess des Ausrichtens schliesst auch die Bestimmung einer Stelle oder Stellen in diesem Gen zur Entstehung der Antisenseinteraktion in einer solchen Art ein, dass der gewünschte Effekt, zum Beispiel die Detektion oder Modulation der Expression des Proteins, daraus resultiert. Im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung stellt eine bevorzugte Stelle innerhalb eines Gens die Region dar, die das Translationsinitiations- oder Terminationskodon des offenen Leserahmens (ORF) des Gens umfasst. Da das Translationsinitiations-Kodon, wie im Fachgebiet bekannt, üblicherweise 5'-AUG ist (in transkribierten mRNA-Molekülen; 5'-ATG im entsprechenden DNA-Molekül) bezeichnet man das Translationsinitiations-Kodon auch als das „AUG-Kodon", das „Start-Kodon" oder das „AUG-Start-Kodon". Eine Minderheit von Genen besitzt ein Translationsinitiations-Kodon, das die RNA-Sequenz 5'-GUG, 5'-UUG oder 5'-CUG hat, und für 5'-AUA, 5'-ACG und 5'-CUG konnte gezeigt werden, dass sie in vivo funktionieren. Von daher können die Ausdrücke „Translationsinitiations-Kodon" und „Start-Kodon" viele Kodonsequenzen umfassen, auch wenn die Initiator-Aminosäure in jedem Fall üblicherweise Methionin (in Eukaryonten) oder Formyhnethionin (in Prokaryonten) ist. Es ist im Fachgebiet auch bekannt, dass eukaryontische und prokaryontische Gene zwei oder mehrere alternative Start-Kodons haben können, von denen jede bevorzugt zur Translationsinitiation in einem bestimmten Zelltyp oder Gewebe oder einem bestimmten Set von Bedingungen verwendet werden kann. Im Zusammenhang der Erfindung beziehen sich „Start-Kodon" und „Translationsinitiations-Kodon" auf das Kodon oder die Kodons, die in vivo verwendet werden, um die Translation eines mRNA-Moleküls, das von einem für Integrin α4 kodierenden Gen transkribiert wurde, zu initiieren, ungeachtet der Sequenzen) solcher Kodons.
  • Es ist im Fachgebiet auch bekannt, dass ein Translationsterminations-Kodon (oder „Stop-Kodon") eines Gens eine von drei Sequenzen, d. h. 5'-UAA, 5'-UAG und 5'-UGA (die entsprechenden DNA-Sequenzen sind 5'-TAA, 5'-TAG und 5'-TGA) haben kann. Die Ausdrücke „Start-Kodonregion" und „Translationsinitiations-Kodonregion" beziehen sich auf einen Teil einer solchen mRNA oder eines Gens, der ungefähr 25 bis ungefähr 50 angrenzende Nukleotide in jede Richtung (d. h. 5' oder 3') ausgehend von einem Translationsinitiations-Kodon umfasst. Ebenso beziehen sich die Ausdrücke „Stop-Kodonregion" und „Translationsterminations-Kodonregion" auf einen Teil einer solchen mRNA oder eines Gens, der ungefähr 25 bis ungefähr 50 benachbarte Nukleotide in jede Richtung (d. h. 5' oder 3') ausgehend von einem Translationsterminations-Kodon umfasst.
  • Der offene Leserahmen (ORF) oder die „kodierende Region", die sich im Feld bekanntermaßen auf die Region zwischen dem Translationsinitiations-Kodon und dem Translationsterminations-Kodon bezieht, stellt auch eine Region dar, die effektiv als Ziel verwendet werden kann. Weitere Zielregionen schließen die 5' untranslatierte Region (5'UTR) ein, die sich im Fachgebiet bekanntermaßen auf den Anteil in 5' Richtung ausgehend vom Translationsinitiations-Kodon einer mRNA bezieht, und daher Nukleotide zwischen der 5' Cap Stelle und dem Translationsinitiations-Kodon einer mRNA oder entsprechende Nukleotide des Gens und die 3' untranslatierte Region (3'UTR) einschliesst, die sich im Fachgebiet bekanntermaßen auf den Anteil in 3' Richtung ausgehend vom Translationsterminations-Kodon einer mRNA bezieht, und daher Nukleotide zwischen dem Translationsterminations-Kodon und dem 3' Ende einer mRNA oder entsprechende Nukleotide des Gens einschliesst. Das 5' Cap einer mRNA umfasst einen N7-methylierten Guanosin-Rest, der mit dem letzten 5' Rest der mRNA über eine 5'-5' Triphosphat-Brücke verbunden ist. Von der 5' Cap Region einer mRNA wird angenommen, dass sie die 5' Cap Struktur selbst sowie die ersten 50 an das Cap anschliessenden Nukleotide umfasst. Die 5' Cap Region kann auch eine bevorzugte Zielregion sein.
  • Auch wenn einige eukaryontische mRNA-Transkripte direkt translatiert werden, so enthalten viele eine oder mehrere als „Introns" bekannte Regionen die aus einem Transkript vor seiner Translation herausgeschnitten werden. Die verbleibenden (und daher translatierten) Regionen sind als „Exons" bekannt und werden zusammengesplict, um eine durchgehende mRNA-Sequenz zu bilden. mRNA-Splice-Stellen, d. h. Intron-Exon-Übergänge, können auch bevorzugte Zielregionen sein, und sind besonders hilfreich in Situationen, wo aberrantes Splicing in eine Krankheit impliziert ist, oder wo eine Überproduktion eines bestimmten mRNA-Spliceprodukts in eine Krankheit impliziert ist. Aberrante, durch Umlagerungen oder Deletionen entstandene Fusionsübergänge sind auch bevorzugte Ziele. Es wurde auch herausgefunden, dass auch Introns effektive und daher bevorzugte Zielregionen für Antisense- Verbindungen sind, wobei die Antisense-Verbindungen, die zum Beispiel auf DNA oder pre-mRNA gerichtet sind.
  • Nachdem eine oder mehrere Zielstellen identifiziert wurden, werden Oligonukleotide ausgesucht, die in ausreichender Form zum Ziel komplementär sind, d. h. ausreichend gut und mit ausreichender Spezifität hybridisieren, um den erwünschten Effekt zu ergeben.
  • Im Zusammenhang der Erfindung versteht man unter „Hybridisierung" Wasserstoffbrückenbindungen, die Watson-Crick, Hoogsteen oder umgekehrte Hoogsteen-Wasserstoffbrückenbindungen sein können, zwischen komplementären Nukleotiden oder Nukleotid-Basen. Zum Beispiel sind Adenin und Thymin komplementäre Nukleobasen, die durch die Formation von Wasserstoffbrückenbindungen ein Basenpaar formen. So wie der Begriff „komplementär" hier verwendet wird, bezieht er sich auf die Kapazität zur präzisen Paarung von zwei Nukleotiden. Wenn zum Beispiel ein Nukleotid an einer bestimmten Position eines Oligonukleotids in der Lage ist, mit einem Nukleotid an derselben Position eines DNA- oder RNA-Moleküls Wasserstoffbrückenbindungen auszubilden, dann spricht man davon, dass das Oligonukleotid und die DNA oder RNA an dieser Position zueinander komplementär sind. Das Oligonukleotid und die DNA oder RNA sind zueinander komplementär, wenn eine ausreichende Anzahl von entsprechenden Positionen in jedem Molekül von Nukleotiden eingenommen werden, die miteinander Wasserstoffbrückenbindungen ausbilden können. Daher sind „spezifisch hybridisierbar" und „komplementär" Ausdrücke, die verwendet werden, um ein ausreichendes Maß an Komplementarität oder an präziser Paarung anzuzeigen, sodass eine stabile und spezifische Bindung zwischen dem Oligonukleotid und dem DNA oder RNA-Ziel auftritt. Es ist im Fachgebiet bekannt, dass die Sequenz einer Antisense-Verbindung nicht 100% komplementär zu der seiner Zielnukleinsäure sein muss, um spezifisch hybridisierbar zu sein. Eine Antisense-Verbindung ist spezifisch hybridisierbar, wenn die Bindung der Verbindung an das DNA- oder RNA-Molekül die normale Funktion der Ziel-DNA oder RNA so stört, dass ein Verlust an Verwendbarkeit verursacht wird, und wenn ein ausreichendes Maß an Komplementarität vorhanden ist, um die nicht-spezifische Bindung der Antisense-Verbindung an Nicht-Zielsequenzen unter Bedingungen zu verhindern, unter welchen die spezifische Bindung erwünscht ist, d. h. unter physiologischen Bedingungen im Fall von in vivo- Versuchen oder der therapeutischen Behandlung, oder im Fall von in vitro-Versuchen, unter Bedingungen, bei welchen die Versuche durchgeführt werden.
  • Antisense-Verbindungen werden üblicherweise als Forschungs-Reagenzien und als diagnostische Agenzien eingesetzt. Zum Beispiel werden Antisense-Oligonukleotide, die in der Lage sind, die Genexpression mit exzellenter Spezifität zu inhibieren, oft von normal ausgebildeten Fachleuten verwendet, um die Funktion von bestimmten Genen aufzuklären. Antisense-Verbindungen werden zum Beispiel auch verwendet, um zwischen den Funktionen von verschiedenen Mitgliedern eines biologischen Ablaufs zu unterscheiden. Von daher ist die Antisense-Modulation für Forschungszwecke nutzbar gemacht worden.
  • Auch Fachleute haben sich die Spezifität und Sensitivität von Antisense für therapeutische Verwendungen zunutze gemacht. Antisense-Oligonukleotide wurden als therapeutische Moleküle zur Behandlung von Krankheitszuständen in Tieren und Menschen eingesetzt. Antisense-Oligonukleotide wurden Menschen sicher und zuverlässig verabreicht und zahlreiche klinische Studien sind derzeit auf dem Weg. Es ist daher etabliert, dass Oligonukleotide nützliche therapeutische Modalitäten sein können, die dazu konfiguriert werden können, um in Behandlungskuren zur Behandlung von Zellen, Gewebe und Tieren, insbesondere Menschen, nützlich zu sein.
  • Im Zusammenhang der Erfindung bezieht sich der Begriff „Oligonukleotid" auf ein Oligomer oder Polymer einer Ribonukleinsäure (RNA) oder Deoxyribonukleinsäure (DNA) oder Nachahmermolekülen davon. Dieser Ausdruck schließt Oligonukleotide ein, die aus in der Natur vorkommenden Nukleobasen, Zuckern und kovalenten Internukleosid (Rückgrat) Bindungen wie auch aus Oligonukleotiden, die keine natürlich vorkommenden Anteile haben, aber ähnlich funktionieren, zusammengesetzt sind. Solche modifizierten oder substituierten Oligonukleotide sind oft gegenüber den nativen Formen wegen wünschenswerten Eigenschaften, sowie zum Beispiel erhöhter zellulären Aufnahme, erhöhte Affinität zum Nukleinsäureziel und erhöhte Stabilität in der Gegenwart von Nukleasen, bevorzugt.
  • Obwohl Antisense-Oligonukleotide eine bevorzugte Form von Antisense-Verbindungen darstellen, bezieht sich die vorliegende Erfindung auch auf andere oligomere Antisense-Verbindungen einschließlich aber nicht limitiert auf Oligonukleotid-nachahmende Moleküle, so wie sie unten beschrieben sind. Die Antisense-Verbindungen gemäß der Erfindung umfassen bevorzugt ungefähr 8 bis ungefähr 30 Nukleobasen. Besonders bevorzugt sind Antisense-Oligonukleotide umfassend ungefähr 8 bis ungefähr 30 Nukleobasen (d. h. ungefähr 8 bis ungefähr 30 verbundene Nukleoside). Wie es im Feld bekannt ist, ist ein Nukleosid eine Basen-Zucker-Verbindung. Der Basenanteil des Nukleosids ist normalerweise eine heterozyklische Base. Die zwei gängigsten Klassen solcher heterozyklischer Basen sind die Purine und die Pyrimidine. Nukleotide sind Nukleoside, die ferner eine kovalent mit dem Zuckeranteil des Nukleosids verbundene Phosphatgruppe beinhalten. Für die Nukleoside, die einen Pentofuranosyl-Zucker beinhalten, kann die Phosphatgruppe entweder zum 2', 3' oder 5' Hydroxyl-Rest des Zuckers verbunden sein. Durch die Formation von Oligonukleotiden verbinden die Phosphatgruppen kovalent benachbarte Nukleoside miteinander, um so eine lineare polymere Verbindung zu bilden. Die entsprechenden Enden dieser linearen polymeren Struktur können wiederum weiter verknüpft sein, um eine zirkuläre Struktur zu bilden, jedoch sind offene lineare Strukturen üblicherweise bevorzugt. Innerhalb der Oligonukleotid-Struktur werden die Phosphatgruppen üblicherweise als formende Elemente für das Internukleosid-Rückgrat des Oligonukleotids angesehen. Die normale Bindung oder das Rückgrat der RNA und DNA ist eine 3' zu 5' Phosphodiester-Bindung.
  • Spezifische Beispiele von bevorzugten, für diese Erfindung nützlichen Antisense-Verbindungen schließen Oligonukleotide ein, die modifizierte Rückgrate oder nicht-natürliche Internukleosid-Bindungen enthalten. Wie in dieser Beschreibung definiert, schließen Oligonukleotide mit modifizierte Rückgraten solche ein, die ein Phosphoratom im Rückgrat behalten sowie diese, die kein Phosphoratom im Rückgrat haben. Für die Zwecke dieser Beschreibung und so wie manchmal im Feld Bezug genommen wird, können modifizierte Oligonukleotide, die kein Phosphoratom in ihrem Internukleosid-Rückgrat haben, auch als Oligonukleoside angesehen werden.
  • Bevorzugte modifizierte Oligonukleotid-Rückgrate beinhalten zum Beispiel Phosphorothioate, chirale Phosphorothioate, Phosphorodithioate, Phosphotriester, Aminoalkylphosphotriester, Methyl und andere Alkylphosphonate einschließlich 3'-Alkylenphosphonate und chirale Phosphonate, Phosphinate, Phosphoramidate einschließlich 3'-Aminophosphoramidate und Aminoalkylphosphoramidate, Thionophosphoramidate, Thionoalkylphosphonate, Thionoalkylphosphotriester und Boranophosphate, die normale 3'- 5' Bindungen haben, 2'-5' verbundene Analoge von diesen und solche, die eine invertierte Polarität besitzen, worin die benachbarten Nukleosidpaar-Einheiten 3'-5' zu 5'-3' oder 2'-5' zu 5'-2' verbunden sind. Eingeschlossen sind auch verschiedene Salze, gemischte Salze und freie Säureformen.
  • Repräsentative US-Patente, die die Herstellung der obigen Phosphor-enthaltenden Bindungen lehren, schließen ein, sind aber nicht limitiert auf die US-Patente 3,687,808; 4,469,863; 4,476,301; 5,023,243; 5,177,196; 5,188,897; 5,264,423; 5,276,019; 5,278,302; 5,286,717; 5,321,131; 5,399,676; 5,405,939; 5,453,496; 5,455,233; 5,966,677; 5,476,925; 5,519,126; 5,536,821; 5,591,306; 5,550,111; 5,563,253; 5,571,799; 5,587,361 und 5,625,050.
  • Bevorzugte modifizierte Oligonukleotid-Rückgrate, die darin kein Phosphoratom einschließen, besitzen Rückgrate, die durch kurze Ketten von Alkyl- oder Cykloalkyl-internukleosidischen Bindungen oder von gemischten Heteroatom und Alkyl- oder Cykloalkyl-internukleosidischen Bindungen, oder durch eine oder mehrere kurze Ketten von heteroatomischen oder heterocyklischen internukleosidischen Bindungen gebildet werden. Diese schließen solche mit Morpholino-Bindungen ein (zum Teil durch den Zuckeranteil eines Nukleosids gebildet); Siloxan-Rückgraten; Sulfid-, Sulfoxid- und Sulfon-Rückgraten; Formacetyl- und Thioformacetyl-Rückgraten; Methylenformacetyl- und Thioformacetyl-Rückgraten; Alken-enthaltende Rückgrate; Sulfamat-Rückgrate; Methylenimino- und Methylenhydrazino-Rückgrate; Sulfonat- und Sulfonamid-Rückgrate, Amid-Rückgrate; und andere, die gemischte N, O, S und CH2 Komponenten als Teile besitzen.
  • Repräsentative US-Patente, die die Herstellung der obigen Oligonukleoside lehren, schließen ein, sind aber nicht limitiert auf die US-Patente 5,034,506; 5,166,315; 5,185,444; 5,214,134; 5,216,141; 5,235,033; 5,264,562; 5,264,564; 5,405,938; 5,434,257; 5,466,677; 5,470,967; 5,489,677; 5,541,307; 5,561,225; 5,596,086; 5,602,240; 5,610,289; 5,602,240; 5,608,046; 5,610,289; 5,618,704; 5,623,070; 5,663,312; 5,633,360; 5,677,437 und 5,677,439.
  • In anderen bevorzugten Oligonukleotid-nachahmenden Verbindungen sind beide, sowohl der Zucker als auch die internukleosidische Bindung, d. h. das Rückgrat der Nukleotideinheit, durch neue Gruppen ersetzt. Die Basen-Einheiten werden zur Hybridisierung mit einer geeigneten Nukleinsäure-Zielverbindung beibehalten. Eine solche oligomerische Verbindung, eine Oligonukleotid-nachahmende Verbindung, von der gezeigt wurde, dass sie exzellente Hybridisierungseigenschaften besitzt, wird als Peptidnukleinsäure (PNA) bezeichnet. In PNA-Verbindungen ist das Zucker-Rückgrat eines Oligonukleotids durch ein Amid-enthaltendes Rückgrat ersetzt, insbesondere durch ein Aminoethylglycin-Rückgrat. Die Nukleobasen werden beibehalten und sind direkt oder indirekt an die Aza-Stickstoffatome des Amid-Anteils des Rückgrats gebunden. Repräsentative US-Patente, die die Herstellung von PNA-Verbindungen lehren, schließen ein, sind aber nicht limitiert auf die US-Patente: 5,539,082; 5,714,331; und 5,719,262. Eine weitere Lehre über PNA-Verbindungen kann in Nielsen et al. gefunden werden (Science, 1991, 254, 1497-1500).
  • Die am meisten bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung sind Oligonukleotide mit Phosphorothioat-Rückgraten und Oligonukleoside mit Heteroatom-Rückgraten, und im besonderen -CH2-NH-O-CH2-, -CH2-N(CH3)-O-CH2- [bekannt als Methylen (Methylimino) oder MMI-Rückgrat], -CH2-O-N-(CH2)-CH2-, -CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2- und -O-N(CH3)-CH2-CH2- [worin das native Phosphodiester-Rückgrat als -O-F-O-CH2- dargestellt ist] des oben schon zitierten US-Patents 9,489,677 und die Amid-Rückgrate des oben schon zitierten US-Patents 5,602,240. Ebenfalls bevorzugt sind Oligonukleotide, die Morpholino-Rückgratstrukturen des oben schon zitierten US-Patents 5,034,506 besitzen.
  • Modifizierte Oligonukleotide können auch eine oder mehrere substituierte Zuckeranteile enthalten. Bevorzugte Oligonukleotide umfassen dabei eine der folgenden an der 2' Position: OH; F; O-, S-, oder N-Alkyl; O-, S-, oder N-Alkenyl; O-, S- oder N-Alkynyl oder O-Alkyl-O-Alkyl, wobei das Alkyl, Alkenyl und Alkynyl ein substituiertes oder ein nicht substituiertes C1 bis C10 Alkyl oder C2 bis C10 Alkynyl oder Alkynyl sein kann. Besonders bevorzugt sind O[(CH2)nO]mCH3, O(CH2)nOCH3. O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2 und O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2, worin n und m von 1 bis ungefähr 10 reichen. Andere bevorzugte Oligonukleotide umfassen eine der folgenden an der 2' Position ein: C1 bis C10 Niederalkyl, substituiertes Niederalkyl, Alkaryl, Aralkyl, O-Alkaryl oder O-Aralkyl, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, Heterozykloalkyl, Heterozykloalkaryl, Aminoalkylamino, Polyalkylamino, substituiertes Silyl, eine RNA-schneidende Gruppe, eine Reportergruppe, ein interkalierendes Agens, eine Gruppe zur Verbesserung der pharmakokinetischen Eigenschaften eines Oligonukleotids oder eine Gruppe zur Verbesserung der pharmakodynamischen Eigenschaften eines Oligonukleotids und andere Substituenten, die ähnliche Eigenschaften haben. Eine bevorzugte Modifikation schließt ein 2'-Methoxyethoxy (2'-O-CH2CH2OCH3, auch bekannt als 2'-O-(2-Methoxyethyl) oder 2'-MOE) (Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504), d. h. eine Alkoxyalkoxy-Gruppe. Eine weitere bevorzugte Modifikation schließt ein 2'-Dimethylaminooxyethoxy, d. h. eine O(CH2)2ON(CH3)2 Gruppe, auch bekannt als 2'-DMAOE, wie in der US-Patentanmeldung mit der Seriennummer 09/016,520 beschrieben, eingereicht am 30. Januar 1998, jetzt als US-Patent 6,127,533 erteilt, das der Anmelder zusammen mit der vorliegenden Anmeldung besitzt.
  • Andere bevorzugte Modifikationen schließen ein 2'-Methoxy (2'-O-CH3), 2'-Aminopropoxy (2'-OCH2CH2CH2NH2) und 2'-Fluoro (2'-F). Ähnliche Modifikationen können auch an anderen Positionen am Oligonukleotid gemacht werden, insbesondere an der 3' Position des Zuckers am 3' terminalen Nukleotid oder in 2'-5' verbundenen Oligonukleotiden und an der 5' Position des 5' terminalen Nukleotids. Oligonukleotide können auch Zucker-nachahmende Verbindungen sowie Cyklobutyl-Gruppen anstelle des Pentofuranosyl-Zuckers haben. Repräsentative US-Patente, die die Herstellung solcher modifizierter Zuckerstrukturen lehren, schließen ein, sind aber nicht limitiert auf die US-Patente 4,981,957; 5,118,800; 5,319,080; 5,359,044; 5,393,878; 5,446,137; 5,466,786; 5,514,785; 5,519,134; 5,567,811; 5,576,427; 5,591,722; 5,597,909; 5,610,300; 5,627,053; 5,639,873; 5,646,265; 5,658,873; 5,670,633 und 5,700,920 und die zugelassene US-Patentanmeldung 08/468,037, eingereicht am 6. Juni 1995 und erteilt als US-Patent 5,859,221, das der Anmlder zusammen mit der vorliegenden Anmeldung besitzt.
  • Oligonukleotide können auch Nukleobasen-(oft im Feld einfach als „Base" bezeichnet) Modifikationen oder Austausche einschließen. Wie hier verwendet, schließen die „unmodifizierten" oder „natürlichen" Nukleobasen die Purinbasen Adenin (A) und Guanin (G) sowie die Pyrimidinbasen Thymin (T), Cytosin (C) und Uracil (U) ein. Modifizierte Nukleobasen schließen andere synthetische oder natürliche Nukleobasen ein, so wie 5-Methylcytosin (S-Me-C), 5-Hydroxymethylcytosin, Xanthin, Hypoxanthin, 2-Aminoadenin, 6-Methyl und andere Alkylderivate von Adenin und Guanin, 2-Propyl und andere Alkylderivate von Adenin und Guanin, 2-Thiouracil, 2-Thiothymin und 2-Thiocytosin, 5-Halo-Uracil und -Cytosin, 5-Propynyl-Uracil und -Cytosin, 6-Azo-Uracil, -Cytosin und -Thymin, 5-Uracil (Pseudouracil), 4-Thiouracil, 8-Halo, 8-Amino, 8-Thiol, 8-Thioalkyl, 8- Hydroxyl und andere 8-substituierte Adenine und Guanine, 5-Halo insbesondere 5-Bromo, 5-Trifluoromethyl und andere 5-substituierte Uracile und Cytosine, 7-Methylguanin und 7-Methyladenin, 8-Aza-Guanin und 8-Aza-Adenin, 7-Deaza-Guanin und 7-Deaza-Adenin und 3-Deaza-Guanin und 3-Deaza-Adenin. Weitere Nukleobasen schließen die in US-Patent Nr. 3,687,808 offenbarten, die in der The Concise Encyclopedia Of Polymer Science and Engineeering, Kroschwitz J.I. ed. John Wiley & Sons, 1990, 858-859 offenbarten, die von Englisch et al., (Angewandte Chemie, IE, 1991, 30, 613) offenbarten und die von Sanghvi, Y.S. (Antisense Research and Applications, 15, 289-302) und Crooke, S.T. und Lebleu, B., ed., (CRC Press, 1993) offenbarten ein. Bestimmte dieser Nukleobasen sind besonders geeignet zur Erhöhung der Bindungsaffinität der oligomerischen Verbindungen der Erfindung. Diese beinhalten 5-substituierte Pyrimidine, 6-Aza-Pyrimidine und N-2, N-6 und O-6 substituierte Purine einschließlich 2-Aminopropyladenin, 5-Propynyluracil und 5-Propynylcytosin. Für 5-Methylcytosin-Substitutionen wurde gezeigt, dass sie die Nukleinsäureduplex-Stabilität um 0,6-1,2°C erhöhen (Sanghvi, Y.S., Crooke, S.T. and Lebleu, B., eds., Antisense Research and Application 1993, 276-278) und sie sind zur Zeit die bevorzugten Basensubstitutionen, insbesondere dann, wenn sie mit 2'-O-Methoxyethyl Zuckermodifikationen kombiniert werden.
  • Repräsentative US-Patente, die die Herstellung von bestimmten der oben genannten modifizierten Nukleobasen sowie anderer modifizierter Nukleobasen lehren, schließen ein, sind aber nicht limitiert auf das oben genannte US-Patent 3,687,808 sowie die US-Patente: 4,845,205; 5,130,302; 5,134,066; 5,175,273; 5,367,066; 5,432,272; 5,457,187; 5,459,255; 5,484,908; 5,502,177; 5,525,711; 5,552,540; 5,587,469; 5,594,121; 5,596,091; 5,624,617; 5,681,941 und 5,750,692.
  • Eine weitere Modifikation der Oligonukleotide der Erfindung bezieht das chemische Verknüpfen einer oder mehrerer Gruppen oder Konjugate, die die Aktivität, die zelluläre Verteilung oder die zelluläre Aufnahme des Oligonukleotids erhöhen, an das Oligonukleotid mit ein. Solche Gruppen schließen ein, sind aber nicht limitiert auf Lipid-Verbindungen sowie eine Cholesterin-Gruppe (Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553-6556), cholische Säure (Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1994, 4, 1053-1060), einen Thioether, zum Beispiel Hexyl-S-Tritylthiol (Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660, 306-309; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765-2770), ein Thiocholesterin (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res. 1992, 20, 533-538), eine aliphatischen Kette, zum Beispiel Dodecandiol oder Undecyl-Reste (Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10, 1111-1118; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 59, 327-330; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75, 49-54), ein Phospholipid, zum Beispiel di-Hexadecyl-Rac-Glycerin oder Triethylammonium 1,2-di-O-Hexadecyl-Rac-glycero-3-H-Phosphonat (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777-3783), ein Polyamin- oder eine Polyethylenglycol-Kette (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969-973) oder Adamantan-Essigsäure (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654), eine Palmityl-Gruppe (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229-237) oder eine Octadecylamin- oder Hexylamino-Carbonyl-Oxycholesterin-Gruppe (Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277, 923-937.
  • Repräsentative US-Patente, die die Herstellung solcher Oligonukleotid-Konjugate lehren, schließen ein, sind aber nicht limitiert auf die US-Patente 4,828,979; 4,948,882; 5,218,105; 5,525,465; 5,541,313; 5,545,730; 5,552,538; 5,578,717; 5,580,731; 5,580,731; 5,591,584; 5,109,124; 5,118,802; 5,138,045; 5,419,077; 5,486,603; 5,512,439; 5,578,718; 5,608,046; 4,587,044; 9,605,735; 4,667,025; 4,762,779; 4,789,737; 4,824,941; 9,835,263; 4,876,335; 4,904,582; 4,958,013; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,245,022; 5,259,469; 5,258,506; 5,262,536; 5,272,250; 5,292,873; 5,317,098; 5,371,241; 5,391,723; 5,416,203; 5,451,463; 5,510,475; 5,512,667; 5,514,785; 5,565,552; 5,567,810; 5,574,142; 5,585,481; 5,587,371; 5,595,726; 5,597,696; 5,599,923; 5,599,928 und 5,688,941.
  • Es ist für alle Positionen in einer gegebenen Verbindung nicht notwendig einheitlich modifiziert zu sein und in der Tat können mehr als eine der zuvor genannten Modifikationen in eine einzelne Verbindung oder sogar bei einem einzelnen Nukleosid in einem Oligonukleotid eingebaut sein. Die vorliegende Erfindung schließt auch Antisense-Verbindungen ein, die chimäre Verbindungen sind. „Chimäre" Antisense-Verbindungen oder „Chimeras" im Zusammenhang der Erfindung sind Antisense-Verbindungen, bevorzugt Oligonukleotide, die zwei oder mehrere chemisch unterschiedliche Regionen enthalten, jede aufgebaut aus wenigstens einer monomeren Einheit, d. h. einem Nukleotid im Falle einer Oligonukleotid-Verbindung. Diese Oligonukleotide enthalten üblicherweise wenigstens eine Region, in der das Oligonukleotid so modifiziert ist, dass dies dem Oligonukleotid eine erhöhte Resistenz gegenüber Nukleaseabbau, erhöhte zellulärer Aufnahme und/oder erhöhte Bindungsaffinität für die Zielnukleinsäure verleiht. Eine zusätzliche Region des Oligonukleotids kann als Substrat für Enzyme dienen, die in der Lage sind, RNA:DNA oder RNA:RNA Hybride zu schneiden. Die RNase H ist zum Beispiel eine zelluläre Endonuklease, die den RNA-Strang eines RNA-DNA-Duplexes schneidet. Eine Aktivierung der RNase H führt daher zum Schneiden der Ziel-RNA, wodurch die Effizienz der Oligonukleotid-Inhibition der Genexpression stark erhöht wird. Folglich können vergleichbare Resultate oft mit kürzeren Oligonukleotiden erreicht werden, wenn chimäre Oligonukleotide verwendet werden im Vergleich zu Phosphorothioat Desoxyoligonukleotioden, die an dieselbe Zielregion hybridisieren. Das Schneiden der Ziel-RNA kann routinemäßig durch die Gelelektrophorese detektiert werden und es sind im Fachgebiet, falls notwendig, die dazugehörigen Nukleinsäure-Hybridisierungstechniken bekannt.
  • Chimäre Antisense-Verbindungen der Erfindung können als zusammengesetzte Strukturen aus zwei oder mehreren Oligonukleotiden, modifizierten Oligonukleotiden, Oligonukleosiden und/oder Oligonukleotid-nachahmenden Substanzen wie oben beschrieben gebildet werden. Solche Verbindungen sind im Feld auch als Hybride oder Gapmere bekannt. Repräsentative US-Patente, die die Herstellung solcher Hybridstrukturen lehren, schließen ein, sind aber nicht limitiert auf die US-Patente 5,013,830; 5,149,797; 5,220,007; 5,256,775; 5,366,878; 4,403,711; 5,491,133; 5,565,350; 5,623,065; 5,652,355; 5,652,356 und 5,700,922, wobei jedes von diesen hier durch Referenzverweis eingeschlossen wird sowie die zugelassene US-Patentanmeldung mit der Seriennummer 08/465,880, eingereicht am 6. Juni 1995, jetzt als US-Patent 5,955,589 erteilt, das der Anmelder zusammen mit der vorliegenden Anmeldung besitzt.
  • Die gemäß der Erfindung benutzten Antisense-Verbindungen können einfach und routinemäßig durch die gut bekannte Technik der Festphasensynthese hergestellt werden. Die Ausrüstung für solch eine Synthese wird von mehreren Anbietern verkauft, einschließlich zum Beispiel Applied Biosystems (Foster City, CA). Es kann auch jede andere im Feld bekannte Maßnahme für eine solche Synthese zusätzlich oder alternativ angewendet werden. Es ist gut bekannt, ähnliche Techniken zur Herstellung von Oligonukleotiden wie den Phosphorothioaten und alkylierten Derivaten zu verwenden.
  • Die Antisense-Verbindungen der Erfindung werden in vitro synthetisiert und schließen keine Antisense-Zusammensetzung biologischen Ursprungs oder genetische Vektorkonstrukte ein, die hergestellt wurden, um die in vivo Synthese von Antisense-Molekülen anzutreiben.
  • Die Verbindungen der Erfindung können auch beigemischt, eingeschlossen, verbunden und sonstwie mit anderen Molekülen, Molekülstrukturen oder Mixturen von Verbindungen in Zusammenhang stehen, wie zum Beispiel Liposomen, Molekülen gerichtet auf Rezeptoren, oralen, rektalen, topikalen oder anderen Zusammensetzungen, um bei der Aufnahme, der Verteilung und/oder der Absorption zu helfen. Repräsentative US-Patente, die die Herstellung von solchen Formulierungen lehren, die bei der Aufnahme, der Verteilung und/oder der Absorption helfen, schließen ein, sind aber nicht limitiert auf die US-Patente 5,108,921; 5,359,844; 5,416,016; 5,459,127; 5,521,291; 5,543,158; 5,597,932; 5,583,020; 5,591,721; 4,426,330; 4,534,899; 5,013,556; 5,108,921; 5,213,804; 5,227,170; 5,264,221; 5,356,633; 5,395,619; 5,416,016; 5,417,978; 5,462,854; 5,469,854; 5,512,295; 5,527,528; 5,534,259; 5,543,152; 5,556,948; 5,580,575 und 5,595,756.
  • Die Antisense-Verbindungen der Erfindung umfassen alle pharmazeutisch verträglichen Salze, Ester oder Salze von solchen Estern, oder jede andere Verbindung, die nach der Verabreichung an ein Tier einschließlich eines Menschen in der Lage ist (direkt oder indirekt) den biologisch aktiven Metaboliten oder Rest davon zur Verfügung zu stellen. Entsprechend wird die Offenbarung zum Beispiel auch auf Pro-Wirkstoffe und pharmazeutisch verträgliche Salze der Verbindungen der Erfindung, pharmazeutisch verträgliche Salze solcher Pro-Wirkstoffe und anderer Bioäquivalente ausgeweitet.
  • Der Ausdruck „Pro-Wirkstoff" zeigt einen therapeutischen Wirkstoff an, der in einer inaktiven Form, die in eine aktive Form (d. h. einen Wirkstoff) im Körper oder Zellen davon durch die Wirkung von endogenen Enzymen oder anderer Chemikalien und/oder Bedingungen überführt wird, hergestellt ist. Insbesondere sind Pro-Wirkstoff-Versionen der Oligonukleotide der Erfindung als SATE [(S-Acetyl-2-Thioethyl) Phosphat] Derivate gemäß den Methoden offenbart in WO 93/24510 an Gosselin et al., veröffentlicht am 9. Dezember 1993 oder in WO 94/26764 an Imbach et al. hergestellt.
  • Der Ausdruck „pharmazeutisch verträgliche Salze „ bezieht sich auf physiologisch und pharmazeutisch verträgliche Salze der Verbindungen der Erfindung: d. h. Salze, die die gewünschte biologische Aktivität der Ausgangsverbindung behalten und keine unerwünschten toxischen Effekte dazu verleihen.
  • Pharmazeutisch verträgliche basische Additionssalze werden aus Metallen oder Aminen, wie etwa Alkali und alkalischen Erdmetallen oder organischen Aminen gebildet. Beispiele für als Kationen eingesetzte Metalle sind Natrium, Kalium, Magnesium, Kalzium und ähnliche. Beispiele für geeignete Amine sind N,N'-Dibenzylethylendiamin, Chloroprocain, Cholin, Diethanolamin, Dicyclohexylamin, Ethylendiamin, N-Methylglucamin und Procain (siehe zum Beispiel Berge et al. J. of Pharma Sci., 1977, 66, 1-19). Die basischen Additionssalze der genannten sauren Verbindungen werden durch den Kontakt der freien Säureform mit einer ausreichenden Menge der gewünschten Base hergestellt, um das Salz in einer herkömmlichen Art und Weise zu produzieren. Die freie Säureform kann durch den Kontakt der Salzform mit einer Säure und der Isolierung der freien Säure in einer herkömmlichen Art und Weise wiederhergestellt werden. Die freien Säureformen unterscheiden sich von ihren entsprechenden Salzformen etwas in bestimmten physikalischen Eigenschaften sowie der Löslichkeit in polaren Lösungsmitteln, ansonsten aber sind die Salze äquivalent zu ihrer entsprechenden freien Säure für die Zwecke der vorliegenden Erfindung. So wie hier benutzt, schließt ein „pharmazeutisch zugegebenes Salz" ein pharmazeutisch verträgliches Salz einer Säureform von einer der Komponenten der Zusammensetzung der Erfindung ein. Diese beinhalten organische oder anorganische saure Salze der Amine. Bevorzugte saure Salze sind die Hydrochloride, Acetate, Salicylate, Nitrate und Phosphate. Andere passende pharmazeutisch verträgliche Salze sind den Fachmännern gut bekannt und schließen basische Salze einer Vielzahl von anorganischen und organischen Säuren ein, wie etwa zum Beispiel mit anorganischen Säuren, beispielsweise Hydrochlor-Säure, Hydrobrom-Säure, Schwefelsäure oder Phosphorsäure; mit organischen Carboxyl-, Schwefel-, Sulfo- oder Phosphorsäuren oder N-substituierten sulfamischen Säuren, beispielsweise Essigsäure, Proprionsäure, Glykolsäure, Succinsäure, Maleinsäure, Hydroxymaleinsäure, Methylmaleinsäure, Fumarsäure, Malinsäure, Tartarsäure, Laktinsäure, Oxalsäure, Glukonsäure, Glukarsäure, Glukoronsäure, Zitratsäure, Benzoesäure, Zimtsäure, Mandelsäure, Salicylsäure, 4-Aminosalicylsäure, 2-Phenoxybenzoesäure, 2-Acetoxybenzoesäure, Embonsäure, Nikotinsäure oder Isonikotinsäure; und mit Aminosäuren, so wie den 20 Alpha-Aminosäuren, die in der Proteinsynthese in der Natur beteiligt sind, zum Beispiel Glutaminsäure oder Asparaginsäure und auch mit Phenylessigsäure, Methansulfonsäure, Ethansulfonsäure, 2-Hydroxyethansulfonsäure, Ethan-1,2-Disulfonsäure, Benzensulfonsäure, 4-Methylbenzensulfonsäure, Naphtalen-2-sulfonsäure, Naphtalen-1,5-disulfonsäure, 2- oder 3-Phosphorglycerat, Glukose-6-Phosphat, N-Cyclohexylsulfamsäure (mit der Bildung von Cyclamaten) oder mit anderen sauren organischen Verbindungen, wie etwa Ascorbinsäure. Pharmazeutisch verträgliche Salze von Verbindungen können auch mit einem pharmazeutisch verträglichen Kation hergestellt werden. Pharmazeutisch geeignete verträgliche Kationen sind den Fachleuten gut bekannt und schließen ein Alkali, Alkalierde, Ammonium und quaternäre Ammoniumkationen. Carbonate oder Wasserstoffcarbonate sind auch möglich.
  • Bevorzugte Beispiele von pharmazeutisch verträglichen Salzen für Oligonukleotide schließen ein, sind aber nicht limitiert auf (a) Salze gebildet aus Kationen wie etwa Natrium, Kalium, Ammonium, Magnesium, Kalzium, Polyaminen wie Spermin und Spermidin, etc.; (b) saure Additionssalze gebildet aus anorganischen Säuren, zum Beispiel Hydrochlorsäure, Hydrobrosäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Nitratsäure, und ähnliche; (c) Salze gebildet aus organischen Säuren wie etwa beispielsweise Essigsäure, Oxalsäure, Tartrarsäure, Succinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Glukonsäure, Zitratsäure, Malinsäure, Ascorbinsäure, Benzoesäure, Tanninsäure, Palmitinsäure, Algininsäure, Polyglutaminsäure, Naphtalensulfonischersäure, Methanosulfonsäure, p-Toluensulfonsäure, Napthalendisulfonsäure, Polygalacturonsäure und ähnliche; und (d) Salze gebildet aus elementaren Anionen wie etwa Chlor, Brom und Jod.
  • Die Antisense-Verbindungen der vorliegenden Erfindung können für Diagnosen, Therapien, Prophylaxen und als Forschungsreagenzien und Kits eingesetzt werden. Für Therapien wird ein Tier, bevorzugt ein Mensch, der im Verdacht steht, eine Krankheit oder Funktionsstörung, die durch die Modulation der Expression von Integrin α4 behandelt werden kann, zu haben, durch die Verabreichung von Antisense-Verbindungen gemäß der Erfindung behandelt. Die Verbindungen der Erfindung können in pharmazeutischen Zusammensetzungen durch die Zugabe einer effektiven Menge einer Antisense-Verbindung zu einem geeigneten pharmazeutisch verträglichen Verdünnungsmittel oder Trägerstoff verwendet werden. Die Benutzung der Antisense-Verbindungen und Methoden der Erfindung können auch prophylaktisch eingesetzt werden, beispielsweise um eine Infektion, eine Entzündung oder Tumorentstehung zu verhindern oder zu verzögern.
  • Die Antisense-Verbindungen der Erfindung sind nützlich zu Forschungs- und Diagnosezwecken, weil diese Verbindungen mit für Integrin α4 kodierenden Nukleinsäuren hybridisieren, was es erlaubt, Sandwich- und weitere Versuchansätze einfach aufzubauen, um diese Tatsache zu untersuchen. Die Hybridisierung der Antisense-Oligonukleotide der Erfindung mit einer für Integrin α4 kodierenden Nukleinsäure kann durch im Feld bekannte Methoden detektiert werden. Solche Methoden können die Konjugation eines Enzyms an das Oligonukleotid, die radioaktive Markierung des Oligonukleotids oder jede andere geeignete Nachweismaßnahme einschließen. Auch können Kits, die solche Detektionsvorrichtungen zur Detektion des Integrin α4 Levels in einer Probe verwenden, hergestellt werden.
  • Die vorliegende Erfindung schließt auch pharmazeutische Zusammensetzungen und Formulierungen ein, die die Antisense-Verbindungen der Erfindung einschließen. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können in einer Vielzahl von Möglichkeiten verabreicht werden, abhängig davon, ob eine lokale oder systemische Behandlung erwünscht ist und abhängig davon, welches Gebiet behandelt werden soll. Die Gabe kann topisch sein (einschließlich ophtalmologisch und auf Schleimhautmembranen gerichtet, einschließlich vaginaler und rektaler Gabe), pulmonar, zum Beispiel durch Inhalation oder Einblasen von Pulvern oder Aerosolen einschließlich durch Zerstäuber; intratracheal, intranasal, epidermal und transdermal, oral oder parenteral. Parenterale Verabreichung beinhaltet die intravenöse, intraarteriale, subkutane, intraperitoneale oder intramuskuläre Injektion oder Infusion; oder intrakranial, zum Beispiel intrathekale oder intraventrikulare Verabreichung. Für Oligonukleotide mit wenigstens einer 2'-O-Methoxyethyl-Modifikation wird angenommen, dass sie besonders zur oralen Verabreichung geeignet sind.
  • Pharmazeutische Zusammensetzungen und Formulierungen für die topische Gabe können transdermale Pflaster, Salben, Lotionen, Cremes, Gele, Drops, Zäpfchen, Sprays, Flüssigkeiten und Pulver einschließen. Konventionelle pharmazeutische Trägerstoffe, wässrige Lösungen, Pulver oder ölige Basen, Verstärker und Ähnliches können notwendig oder wünschenswert sein. Beschichtete Kondome, Handschuhe und ähnliches kann auch nützlich sein.
  • Zusammensetzungen und Formulierungen für die orale Gabe beinhalten Pulver oder Granulate, Suspensionen oder Lösungen in wässrigen oder nicht-wässrigen Medien, Kapseln, Portionen oder Tabletten. Dickungsmittel, Duftstoffe, Verdünnungsmittel, Emulsionen, Dispersionshilfen oder Bindemittel können wünschenswert sein.
  • Zusammensetzungen und Formulierungen für die parenterale, intrathekale oder intraventrikuläre Gabe können sterile wässrige Lösungen einschließen, die auch Puffer, Verdünnungsmittel und weitere geeignete Hilfsmittel wie etwa, allerdings nicht limitiert darauf, Penetrationsverstärker, Trägerverbindungen und andere pharmazeutisch verträgliche Träger oder Hilfsstoffe enthalten können.
  • Pharmazeutische Zusammensetzungen und/oder Formulierungen umfassend die Oligonukleotide der vorliegenden Erfindung können auch Penetrationsverstärker einschließen, um die Nahrungsaufnahme der Oligonukleotide zu verstärken. Penetrationsverstärker können als Mitglieder zu einer der fünf breiten Kategorien klassifiziert werden, d. h. Fettsäuren, Gallensalze, chelatierende Wirkstoffe, Tenside und Nicht-Tenside (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, 8, 91-192; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carver Systems, 1990, 7, 1-33). Ein oder mehrere Penetrationsverstärker von einer oder mehrerer dieser breiten Kategorien kann eingeschlossen sein. Penetrationsverstärker sind beschrieben in der anhängigen US-Patentanmeldung 08/886,829, eingereicht am 1. Juli 1997, jetzt erteilt als US-Patent 6,747,014 und anhängenden US-Patentanmeldung 08/961,469, eingereicht am 31. Oktober 1997, jetzt als US-Patent 6,083,923 erteilt, von denen der Anmelder beide zusammen mit der vorliegenden Anmeldung besitzt.
  • Verschiedene Fettsäuren und deren Derivate, die als Penetrationsverstärker wirken, schließen zum Beispiel ein Oleinsäure, Laurinsäure, Caprinsäure, Myristinsäure, Palmitinsäure, Stearinsäure, Linoleinsäure, Linoleninsäure, Dicaprat, Tricaprat, Recinleat, Monoolein (auch bekannt als 1-Monooleoyl-Rac-Glycerin), Dilaurin, Caprylinsäure, Arichidonsäure, Glycerin 1-Monocaprat, I-Dodecylaxacycloheptan-2-one, Acylcarnitine, Acylcholine, Mono- und Di-Glyceride und physiologisch verträgliche Salze davon (das heißt Oleat, Laurat, Caprat, Myristat, Palmitat, Stearat, Linoleat, etc.) (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, 8, 91-192; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Elektrisch-Hairi et al., J. Pharm. Pharmacol., 1992, 44, 651-654). Beispiele von zurzeit bevorzugten Fettsäuren sind Natriumcaprat und Natriumlaurat, einzeln oder in Kombination bei Konzentrationen von 0,5 bis 5% verwendet.
  • Bevorzugte Penetrationsverstärker sind in der anhängigen US-Patentanmeldung 08/886,829, eingereicht am 1. Juli 1997, offenbart, die der Anmelder zusammen mit der vorliegenden Anmeldung besitzt.
  • Die physiologischen Rollen von Gallensäure schließen die Erleichterung der Dispersion und Absorption von Lipiden und fettlöslichen Vitaminen ein (Brunton, Chapter 38 in: Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9th Ed., Hardman et al., eds., McGraw-Hill, New York, NY 1996, pages 934-935). Verschiedene natürliche Gallensalze und deren synthetische Derivate wirken als Penetrationsverstärker. Von daher schließt der Begriff „Gallensalze" jede der natürlich vorkommenden Verbindungen der Galle wie auch jede ihrer synthetischen Derivate ein. Bevorzugte Gallensalze sind in der anhängigen US-Patentanmeldung 08/886,829, eingereicht am 1. Juli 1997, beschrieben, die der Anmelder zusammen mit der vorliegenden Anmeldung besitzt und die hier durch einen Referenzverweis miteinbezogen wird. Ein zurzeit bevorzugtes Gallensalz ist die Chenodeoxycholische Säure (CDCA) (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO), üblicherweise bei Konzentrationen von 0,5 bis 2% benutzt.
  • Komplexe Formulierungen umfassend einen oder mehrere Penetrationsverstärker können verwendet werden. Zum Beispiel können Gallensalze in Verbindung mit Fettsäuren eingesetzt werden, um komplexe Formulierungen zu ergeben. Bevorzugte Kombinationen schließen CDCA in Kombination mit Natriumcaprat oder Natriumlaurat (üblicherweise 0,5 bis 5%) ein.
  • Chelat-bildende Wirkstoffe schließen ein, sind aber nicht limitiert auf Dinatrium-Ethylendiamintetraacetat (EDTA), Zitratsäure, Salicylate (zum Beispiel Natriumsalicylat, 5-Methoxysalicylat und Homovanillat), N-Acylderivate von Kollagen, Laureth-9 und N- Aminoacylderivate von Beta-Diketonen (Enamine) (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, 8, 92-192; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Buur et al., J. Control Rel., 1990, 14, 43-51). Chelat-bildende Wirkstoffe haben den zusätzlichen Vorteil, dass sie auch als DNase-Inhibitoren fungieren.
  • Tenside schließen zum Beispiel Natriumlaurylsulfat, Polyoxyethylen-9-Laurylether und Polyoxyethylen-20-Cetylether (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, 8, 92-191); und Perfluor-chemische Emulsionen, so wie FC-43 ein (Takahashi et al., J. Pharm. Pharmacol., 1988, 40, 252-257).
  • Nicht-Tenside schließen zum Beispiel ungesättigte zyklische Harnstoffe, 1-Alkyl- und 1-Alkenylazacyclo-Alkanon Derivate (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, 8, 92-191); und nicht-steroidische entzündungshemmende Wirkstoffe wie etwa Diclofenac-Natrium, Indomethacin und Phenylbutazon ein (Yamashita et al., J. Pharm. Pharmacol., 1987, 39, 621-626).
  • Wie hier benutzt, bezieht sich „Trägerverbindung" auf eine Nukleinsäure oder ein Analog davon, das inert ist (d. h., keine biologische Aktivität per se besitzt), aber bei in vivo Prozessen als Nukleinsäure erkannt wird, die die Bioverfügbarkeit von Nukleinsäure mit biologischer Aktivität reduziert, zum Beispiel durch den Abbau der biologisch-aktiven Nukleinsäure oder deren verstärkter Entfernung aus dem Kreislauf. Die Gabe einer Nukleinsäure zusammen mit einer Trägerverbindung, üblicherweise mit einem Überschuss der letzteren Substanz, kann in einer substantiellen Reduktion der Menge der Nukleinsäure resultieren, die in der Leber, der Niere oder anderen extrazirkulatorischen Reservoirs aufgenommen wird, wahrscheinlich durch die Kompetition zwischen deer Trägerverbindung und der Nukleinsäure um einen gemeinsamen Rezeptor. Zum Beispiel ist die Aufnahme eines partiell phosphorothioatischen Oligonukleotids im Lebergewebe reduziert, wenn es zusammen mit Polyinosinsäure, Dextransulfat, Polycytidinsäure oder 4-Actetoamid-4'-Isothiocyano-Stilben-2,2'-disulfonsäure verabreicht wird (Miyao et al., Antisense Res. Dev., 1995, 5, 115-121; Takakura et al., Antisense & Nucl. Acid Drug Dev., 1996, 6, 177-183).
  • Im Gegensatz zu einer Trägerverbindung ist ein „pharmazeutisch verträglicher Trägerstoff" (Hilfsstoff) ein pharmazeutisch verträgliches Lösungsmittel, suspendierender Wirkstoff oder jedes andere pharmakologisch inerte Vehikel für die Gabe einer oder mehrerer Nukleinsäuren an ein Tier. Der pharmazeutisch verträgliche Trägerstoff kann flüssig oder fest sein und wird mit Blick auf die geplante Art der Verabreichung so ausgewählt, dass er die gewünschte Masse, Konsistenz, usw. zur Verfügung stellt, wenn er mit einer Nukleinsäure und den anderen Komponenten einer bestimmten pharmazeutischen Zusammensetzung kombiniert wird. Typische pharmazeutisch verträgliche Trägerstoffe schließen ein, sind aber nicht limitiert auf bindende Wirkstoffe (zum Beispiel pregelatinisierte Maisstärke, Polyvinylpyrrolidon oder Hydroxypropylmethylcellulose, etc.); Füllstoffe (zum Beispiel Laktose und andere Zucker, mikrokristalline Zellulose, Pektin, Gelatin, Kalziumsulfat, Ethylzellulose, Polyacrylate oder Kalziumhydrogenphosphat, etc.); Gleitmittel (zum Beispiel Magnesiumstearat, Talk, Silikat, kolloidale Silikondioxide, Stearinsäure, metallische Stearate, hydrogenisierte Gemüseöle, Getreidestärke, Polyethylenglykole, Natriumbenzoat, Natriumacetat, etc.); Sprengmittel (zum Beispiel Stärke, Natriumstärkeglycolat, etc.); oder Netzmittel (zum Beispiel Natriumlaurylsulfat, etc.). Orale Gabesysteme mit verlängerter Freisetzung und/oder enterische Schichten für oral verabreichte Dosierungsformen sind in den US-Patenten 4,704,295; 4,556,552; 4,309,406 und 4,309,404 beschrieben.
  • Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können zusätzlich andere Hilfskomponenten enthalten, die üblicherweise in pharmazeutischen Zusammensetzungen gefunden werden, zu ihren jeweiligen Zweckbestimmten Verwendungszwecken. Daher können die Zusammensetzungen zum Beispiel zusätzliche passende pharmazeutisch aktive Materialien enthalten, so wie zum Beispiel antijuckende, astringierende, lokalanästhetische oder antientzündliche Wirkstoffe, oder können zusätzliche Materialien enthalten, die nützlich zur Formulierung verschiedener Dosierungsformen der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung sind, wie etwa Farbstoffe, Geschmacksstoffe, Präservative, Antioxidantien, Trübungsmittel, Verdickungsmittel und Stabilisatoren. Solche Materialien sollten allerdings, wenn zugegeben, nicht übermäßig die biologischen Aktivitäten der Komponenten der Zusammensetzung der Erfindung stören.
  • Unabhängig von der Methode, mit der die Antisense-Verbindungen der Erfindung in den Patienten eingeführt werden, können kolloidale Dispersionssysteme als Trägervehikel verwendet werden, um die in vivo Stabilität der Verbindungen zu erhöhen und/oder die Verbindungen zu einem bestimmten Organ, Gewebe oder Zelltyp abzurichten. Kolloidale Dispersionssysteme schließen ein, sind aber nicht limitiert auf Makromolekülkomplexe, Nanokapseln, Mikrokugeln, Kügelchen und auf Lipid-basierende Systeme einschließlich Öl-in-Wasser-Emulsionen, Mizellen, gemischte Mizellen, Liposomen und Lipid:Oligonukleotid-Komplexe von uncharakterisierter Struktur. Ein bevorzugtes kolloidales Dispersionssystem ist eine Vielzahl von Liposomen. Liposomen sind mikroskopische Kugeln, die einen wässrigen Kern umgeben von einer oder mehrerer äußerer Schichten) bestehend aus Lipiden und angeordnet in einer zweilagigen Konfiguration besitzen (siehe allgemein Chonn et al., Current Op. Biotech., 1995, 6, 698-708).
  • Eine Liposomenpräparation ist in der anhängigen US-Patentanmeldung 08/961,469, eingereicht am 31. Oktober 1997 und jetzt als US-Patent 6,083,469 erteilt, beschrieben, das der Anmelder zusammen mit der vorliegenden Anmeldung besitzt.
  • Bestimmte Ausführungsformen der Erfindung stellen Liposomen und andere Zusammensetzungen zur Verfügung, die beinhalten (a) eine oder mehrere Antisense-Verbindungen und (b) einen oder mehrere andere chemotherapeutische Wirkstoffe, die durch einen Nicht-Antisense-Mechanismus wirken. Beispiele solcher chemotherapeutischer Wirkstoffe schließen ein, sind aber nicht limitiert auf Antikrebswirkstoffe wie etwa Daunorubicin, Dactinomycin, Doxorubicin, Bleomycin, Mitomycin, Stickstoffsenf, Chlorambucil, Melphalan, Cyclophosphamid, 6-Mercaptopurin, 6-Thioguanin, Cytarabin (CA), 5-Fluorouracil (5-FU), Floxuridin (5-FudR), Methotrexat (MTX), Colchicin, Vincristin, Vinblastin, Etoposid, Teniposid, Cisplatin und Diethylstilbestrol (DES). Vergleiche allgemein The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 1987, Berkow et al., eds., Rahway, N.J., 1206-1228. Anti-entzündliche Wirkstoffe schließen ein, sind aber nicht limitiert auf nicht-steroide anti-entzündliche Wirkstoffe und Corticosteroide, und antivirale Wirkstoffe einschließlich aber nicht limitiert auf Ribivirin, Vidarabin, Acyclvir und Ganciglovir, können auch in Zusammensetzungen der Erfindung enthalten sein. Vergleiche allgemein The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 1987, Berkow et al., eds., Rahway, N.J., pages 2499-2506 und 46-49). Andere Nicht-Antisense chemotherapeutische Wirkstoffe liegen auch im Umfang der Erfindung. Zwei oder mehrere kombinierte Verbindungen können zusammen oder sequentiell benutzt werden.
  • In einer weiteren ähnlichen Ausführungsform können die Zusammensetzungen der Erfindung eine oder mehrere Antisense-Verbindungen, besonders Oligonukleotide, gerichtet auf eine erste Nukleinsäure sowie eine oder mehrere zusätzliche Antisense-Verbindungen, gerichtet auf ein zweites Nukleinsäureziel, enthalten. Zwei oder mehrere kombinierte Verbindungen können zusammen oder sequentiell verwendet werden.
  • Für die Formulierung der therapeutischen Zusammensetzungen und ihre nachfolgende Verabreichung wird angenommen, dass sie innerhalb des Wissensbereichs des Fachmanns liegt. Die Dosierung ist abhängig von der Schwere und der Fähigkeit zur Antwort des Krankheitszustandes, der behandelt wird, wobei der Verlauf der Behandlung von mehreren Tagen bis mehreren Monaten oder bis eine Heilung erreicht ist oder eine Verringerung des Krankheitszustandes gegeben ist, dauert. Optimale Dosierungsabläufe können aus den Messungen der Wirkstoffakkumulation im Körper des Patienten errechnet werden. Auch einfache geschulte Personen können die optimalen Dosierungen leicht bestimmen sowie die Dosierungsmethodologien und Wiederholungsraten. Optimale Dosierungen können in Abhängigkeit von der relativen Stärke der individuellen Oligonukleotide variieren und können üblicherweise auf Basis des EC50S, der in in vitro und in vivo Tiermodellen als effektiv herausgefunden wurde, bestimmt werden. Üblicherweise reicht die Dosierung von 0,01 μg bis 100 g pro kg Körpergewicht, und kann einmal oder mehrmals am Tag, in der Woche, im Monat oder im Jahr oder sogar jede zwei bis 20 Jahre gegeben werden. Fachleute mit normalem Kenntnisstand können leicht die Wiederholungsraten für die Dosierung berechnen, basierend auf gemessenen Verbleibzeiten und Konzentrationen des Wirkstoffes in Körperflüssigkeiten und Geweben. Nach erfolgreicher Behandlung kann es wünschenswert sein, den Patienten einer Nachsorgetherapie zu unterziehen, um dem Wiederauftreten des Krankheitszustandes vorzubeugen, wobei bei dieser Kur das Oligonukleotid in Nachsorgedosen verabreicht wird, die von 0,01 μg bis 100 g pro kg Körpergewicht, einmal oder mehrmals täglich bis einmal oder alle 20 Jahre reichen.
  • Obwohl die vorliegende Erfindung mit Spezifität im Einklang mit bestimmten ihrer bevorzugten Ausführungsformen beschrieben wurde, dienen die folgenden Beispiele dazu, die Erfindung zu illustrieren und sind nicht gedacht, die Erfindung zu limitieren.
  • BEISPIELE
  • Beispiel 1
  • Nucleosid-Phosphoramidite zur Oligonukleotid-Synthese Desoxy und 2'-Alkoxy-Amidite
  • 2'-Desoxy und 2'-Methoxy-Beta-Cyanoethyldiisopropyl-Phosphoramidite werden von gewerblichen Quellen gekauft (zum Beispiel Chemgenes, Needham MA oder Glen Research, Inc. Sterling VA). Andere 2'-O-Alkoxy-substituierte Nukleosid-Amidite werden wie im US-Patent 5,506,351, welches hiermit durch Referenzverweis einbezogen wird, beschrieben, hergestellt. Für Oligonukleotide, die unter der Verwendung von 2'-Alkoxy-Amiditen synthetisiert werden, wird der Standardzyklus für unmodifizierte Oligonukleotide verwendet, mit der Ausnahme, dass der Warteschritt nach der gepulsten Zugabe von Tetrazol und der Base auf 360 Sekunden erhöht wird.
  • 5-Methyl-2'-Desoxycytidin (S-Me-C) Nukleotide enthaltende Oligonukleotide werden gemäß den veröffentlichten Methoden synthetisiert (Sanghvi, et al., Nucleic Acids Research, 1993, 21, 3197-3203) unter der Verwendung von käuflich erhältlichen Phosphoramiditen (Glen Research, Sterling, VA oder ChemGenes, Needham, MA).
  • 2'-Fluoramidite
  • 2'-Fluorodesoxyadenosinamidite
  • 2'-Fluoro-Oligonukleotide werden wie früher (Kawasaki, et al., J. Med. Chem., 1993, 36, 831-841) und im US-Patent 5,670,633, welches hiermit durch Referenzverweis einbezogen wird, beschrieben, synthetisiert. Kurz zusammengefasst wird das geschützte Nukleosid N6-Benzoyl-2' Desoxy-2'-Fluoroadenosin unter der Verwendung von kommeziell erhältlichem 9-Beta-D-Arabinofuranosyladenin als Ausgangsmaterial und unter der Verwendung von modifizierten Literaturangaben, wobei das 2'-Alpha-Fluoratom durch einen SN2-Austausch einer 2'-Beta-Trityl-Gruppe eingeführt wird, synthetisiert. Daher ist das N6-Benzoyl-9-Beta-D-Arabinofuranosyladenin selektiv in einer moderate Ausbeute geschützt als das 3',5'-Ditetrahydropyranyl (THP) Intermediat. Die Entfernung des Schutzes der THP und N6-Benzoyl-Gruppen wird unter der Verwendung von Standardmethodologien erreicht und Standardmethoden werden dazu benutzt, die 5'-Dimethoxytrityl-(DMT) und 5'-DMT-3'-Phosphoramidit-Intermediate zu erhalten.
  • 2'-Fluordesoxyguanosin
  • Die Synthese von 2'-Desoxy-2'-Fluoroguanosin wird unter der Verwendung von Tetraisopropyldisiloxyanyl (TPDS) geschütztem 9-Beta-D-Arabinofuranosylguanin als Ausgangsmaterial erreicht, sowie durch das Überführen in das Intermediat Diisobutyryl-Arabinofuranosylguanosin. Dem Entfernen des Schutzes der TPDS Gruppe folgt der Schutz der Hydroxyl-Gruppe mit THP, um Diisobutyryl-di-THP geschütztes Arabinofuranosylguanin zu ergeben. Auf die selektive O-Deacylierung und Triflation folgt die Behandlung des Rohproduktes mit Fluorid, darauf die Entfernung des Schutzes von den THP-Gruppen. Standardmethodologien werden verwendet, um die 5'-DMT- und 5'-DMT-3'-Phosphoramidite zu erhalten.
  • 2'-Fluorouridin
  • Die Synthese von 2'-Desoxy-2'-Fluorouridin wird erreicht durch die Modifizierung eines Literaturverfahrens, in welchem das 2,2'-Anhydro-1-Beta-D-Arabinofuranosyluracil mit 70%igem Wasserstoff Fluor-Pyridin behandelt wird. Standardverfahren werden verwendet, um die 5'-DMT und 5'-DMT-3'-Phosporamidite zu erhalten.
  • 2'-Fluorodesoxycytidin
  • 2'-Desoxy-2'-Fluorocytidin wird über die Aminierung von 2'-Desoxy-2'-Fluorouridin synthetisiert, gefolgt von einem selektiven Schutz um N4-Benzoyl-2'-Desoxy-2'-Fluorocytidin zu ergeben. Standardverfahren werden verwendet, um die 5'-DMT und 5'-DMT-3'-Phosphoramidite zu erhalten.
  • 2'-O-(2-Methoxyethyl) modifizierte Amidite
  • 2'-O-Methoxyethyl-substituierte Nukleosidamidite wurden entweder wie folgt oder alternativ wie durch die Methode von Martin, P. (Helvetica Chimica Acta, 1995, 78, 486-504) hergestellt.
  • 2,2'-Anhydro[1-(Beta-D-Arabinofuranosyl)-5-Methyluridin]
  • 5-Methyluridin (Ribosylthymin, kommerziell erhältlich von Yamasa, Choshi, Japan) (72,0 g, 0,279 M), Diphenylcarbonat (90,0 g, 0,420 M) und Natriumbicarbonat (2,0 g, 0,024 M) wurden zu DMF (300 ml) zugegeben. Die Mischung wurde unter Rühren zum Rückfluss erhitzt, wobei das entstehende Kohlenstoffdioxidgas in kontrollierter Art und Weise abgezogen werden konnte. Nach einer Stunde wurde die leicht dunkle Lösung unter reduziertem Druck aufkonzentriert. Der resultierende Sirup wurde unter Rühren in Diethylether (2,5 l) eingefüllt. Das Produkt formte einen Gummi. Der Ether wurde abdekantiert und der Rückstand wurde in einer minimalen Menge von Methanol (ca. 400 ml) gelöst. Die Lösung wurde im frischen Ether (2,5 l) eingebracht, um einen harten Gummi zu ergeben. Der Ether wurde abdekantiert und der Gummi wurde in einem Vakuumofen (60°C bei 1 mm HG für 24 h) getrocknet, um einen Feststoff zu ergeben, der in ein leichtes bräunliches Pulver (57 g, 85% Rohausbeute) zerdrückt wurde. Das NMR-Spektrum war mit der Struktur konsistent, kontaminiert mit Phenol als dessen Natriumsalz (ca. 5%). Das Material wurde in diesem Zustand für weitere Reaktionen so eingesetzt (oder es kann auch weiter durch Säulenchromatographie aufgereinigt werden unter der Verwendung eines Gradienten von Methanol in Ethylacetat (10-25%), um einen weißen Feststoff, Schmelzpunkt 222-4°C, zu ergeben).
  • 2'-O-Methoxyethyl-5-Methyluridin
  • 2,2'-Anhydro-5-Methyluridin (195 g, 0,81 M), Tris(2-Methoxyethyl)Borat (231 g, 0,98 M) und 2-Methoxyethanol (1,2 l) wurden in einen 2 l Druckbehälter aus rostfreiem Stahl gegeben und in ein auf 160°C vorgeheiztes Ölbad überführt. Nach dem Erhitzen für 48 Stunden bei 155-160°C wurde das Gefäß geöffnet und die Lösung bis zur Trockenheit evaporiert und mit MeOH (200 ml) zerrieben. Der Rückstand wurde in heißem Aceton (1 l) suspendiert. Die unlöslichen Salze wurden filtriert, mit Aceton (150 ml) gewaschen und das Filtrat evaporiert. Der Rückstand (280 g) wurde in CH3CN (600 ml) gelöst und evaporiert. Eine Silicagelsäule (3 kg) wurde in CH2Cl2/Aceton/MeOH (20:5:3) enthaltendem 0,5%igem Et3NH gepackt. Der Rückstand wurde in CH2Cl2 (250 ml) gelöst und auf Silica (150 g) adsorbiert, bevor er auf die Säule geladen wurde. Das Produkt wurde mit dem Packungslösungsmittel eluiert, um 160 g (63%) des Produkts zu ergeben. Zusätzliches Material wurde durch das wiederholende Aufarbeiten von unreinen Fraktionen erhalten.
  • 2'-O-Methoxyethyl-5'-O-Dimethoxytrityl-5-Methyluridin
  • 2'-O-Methoxyethyl-5-Methyluridin (160 g, 0,506 M) wurde mit Pyridin (250 ml) co-evaporiert und der getrocknete Rückstand in Pryridin (1,3 l) gelöst. Ein erstes Aliquot von Dimethoxytritylchlorid (94,3 g, 0,278 M) wurde zugegeben und die Mischung bei Raumtemperatur für eine Stunde gerührt. Ein zweites Aliquot von Dimethoxytritylchlorid (94,3 g, 0,278 M) wurde zugegeben und die Reaktion für eine weitere Stunde gerührt. Methanol (170 ml) wurde dann zugegeben, um die Reaktion abzustoppen. Die HPLC-Analyse ergab das Vorhandensein von ungefähr 70% Produkt. Das Lösungsmittel wurde evaporiert und mit CH3CN (200 ml) zerrieben. Der Rückstand wurde in CHCl3 (1,5 l) gelöst und mit 2 × 500 ml gesättigtem NaHCO3 und 2 × 500 ml von gesättigtem NaCl extrahiert. Die organische Phase wurde über Na2SO4 getrocknet, filtriert und evaporiert. 275 g des Rückstands wurden erhalten. Der Rückstand wurde auf einer 3,5 kg Silicagelsäule aufgereinigt, die gepackt und mit EtOAc/Hexan/Aceton (5:5:1) enthaltendem 0,5% Et3NH eluiert wurde. Die reinen Fraktionen wurden evaporiert und ergaben 164 g des Produkts. Zusätzlich ungefähr 20 g wurden aus den unreinen Fraktionen erhalten, um eine Gesamtausbeute von 183 g (57%) zu ergeben.
  • 3'-O-Acetyl-2'-O-Methoxyethyl-5'-O-Dimethoxytrityl-5-Methyluridin
  • 2'-O-Methoxyethyl-5'-O-Dimethoxytrityl-5-Methyluridin (106 g, 0,167 M), DMF/Pyridin (750 ml einer 3:1 Mischung, hergestellt aus 562 ml DMF und 188 ml Pyridin) und Essigsäureanhydrid (24,38 ml, 0,258 M) wurden vereinigt und bei Raumtemperatur für 24 Stunden gerührt. Die Reaktion wurde durch Dünnschichtchromatographie (TLC) überwacht, wobei die TLC-Probe zuerst durch die Zugabe von Methanol gequencht wurde. Nach der Vollständigkeit der Reaktion, beurteilt durch TLC, wurde MeOH (50 ml) zugegeben und die Mischung bei 35°C evaporiert. Der Rückstand wurde in CHCl3 (800 ml) gelöst und mit 2 × 200 ml einer gesättigten Natriumbicarbonat und 2 × 200 ml von gesättigtem NaCl extrahiert. Die wässrigen Phasen wurden mit 200 ml CHCl3 zurückextrahiert. Die kombinierten organischen Fraktionen wurden mit Natriumsulfat getrocknet und evaporiert, um 122 g Rückstand zu ergeben (ungefähr 90% Produkt). Der Rückstand wurde auf einer 3,5 kg Silicagelsäule aufgereinigt und unter der Verwendung von EtOAc/Hexan (9:1) eluiert. Reine Produktfraktionen wurden evaporiert, um 96 g (84%) zu ergeben. Zusätzlich wurden 1,5 g aus späteren Fraktionen erhalten.
  • 3'-O-Acetyl-2'-O-Methoxyethyl-5'-O-Dimethoxytrityl-5-Methyl-4-Triazoluridin
  • Eine erste Lösung wurde durch das Auflösen von 3'-O-Acetyl-2'-O-Methoxyethyl-5'-O-Dimethoxytrityl-5-Methyluridin (96 g, 0,144 M) in CH3CN (700 ml) hergestellt und auf die Seite gelegt. Triethylamin (189 ml, 1,44 M) wurde zu einer Lösung von Triazol (90 g, 1,3 M) in CH3CN (1 l) zugegeben, auf –5°C gekühlt und für eine halbe Stunde unter der Verwendung eines Überkopfrührers gerührt. POCl3 wurde tropfenweise über einen Zeitraum von 30 Minuten zu der gerührten Lösung, die bei 0-10°C gehalten wurde, zugegeben und die resultierende Mischung für weitere 2 Stunden gerührt. Die erste Lösung wurde tropfenweise über einen Zeitraum von 45 Minuten zur letzteren Lösung zugegeben. Die resultierende Reaktionsmischung wurde über Nacht in einem Kühlraum aufbewahrt. Salze wurden aus der Reaktionsmischung gefiltert und die Lösung wurde evaporiert. Der Rückstand wurde in EtOAc (1 l) gelöst und die unlöslichen festen Bestandteile wurden durch Filtration beseitigt. Das Filtrat wurde mit 1 × 300 ml NaHCO3 und 2 × 300 ml einer gesättigten NaCl-Lösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und evaporiert. Der Rückstand wurde mit EtOAc zerrieben, um die im Titel genannte Verbindung zu ergeben.
  • 2'-O-Methoxyethyl-5'-O-Dimethoxytrityl-5-Methylcytidin
  • Eine Lösung von 3'-O-Acetyl-2'-O-Methoxyethyl-5'-O-Dimethoxytrityl-5-Methyl-4-Triazoluridin (103 g, 0,141 M) in Dioxan (500 ml) und NH4OH (30 ml) wurde bei Raumtemperatur für 2 Stunden gerührt. Die Dioxan-Lösung wurde evaporiert und der Rückstand mit MeOH (2 × 200 ml) azeotropiert. Der Rückstand wurde in MeOH (300 ml) aufgelöst und in einen 2 l rostfreien Stahldruckbehälter überführt. Mit NH3-Gas gesättigter MeOH (400 ml) wurde zugegeben und das Reaktionsgefäß auf 100°C für zwei Stunden aufgeheizt (TLC zeigte eine komplette Umsetzung an). Die Reaktionsgefäßinhalte wurden zur Trockenheit evaporiert und der Rückstand wurde in EtOAc (500 ml) gelöst und einmal mit gesättigtem NaCl (200 ml) gewaschen. Die organischen Rückstände wurden über Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel wurde evaporiert, um 85 g (95%) der im Titel genannten Verbindung zu ergeben.
  • N4-Benzoyl-2'-O-Methoxyethyl-5'-O-Dimethoxytrityl-5-Methylcytidin
  • 2'-O-Methoxyethyl-5'-O-Dimethoxytrityl-5-Methylcytidin (85 g, 0,134 M) wurde in DMF (800 ml) gelöst und Benzoeanhydrid (37,2 g, 0,165 M) wurde unter Rühren zugegeben. Nach Rühren für 3 Stunden zeigte die TLC an, dass die Reaktion zu ungefähr 95% abgelaufen war. Das Lösungsmittel wurde evaporiert und der Rückstand mit MeOH (200 ml) aceotropiert. Der Rückstand wurde in CHCl3 (700 ml) gelöst und mit gesättigtem NaHCO3 (2 × 300 ml) und gesättigtem NaCl (2 × 300 ml) extrahiert, über MgSO4 getrocknet und evaporiert, um einen Rückstand zu ergeben (96 g). Der Rückstand wurde auf einer 1,5 kg Silicasäule chromatographiert unter der Verwendung von EtOAc/Hexan (1:) enthaltenden 0,5% Et3NH als das eluierende Lösungsmittel. Die reinen Produktfraktionen wurden evaporiert, um 90 g (90%) der im Titel genannten Verbindung zu ergeben.
  • N4-Benzoyl-2'-O-Methoxyethyl-5'-O-Dimethoxytrityl-5-Methylcytidin-3'-Amidit
  • N4-Benzoyl-2'-O-Methoxyethyl-5'-O-Dimethoxytrityl-5-Methylcytidin (74 g, 0,10 M) wurde in CH2Cl2 (1 l) gelöst. Tetrazol Diisopropylamin (7,1 g) und 2-Cyanoethoxy-Tetra-(isopropyl)Phosphit (40,5 ml, 0,123 M) wurden unter Rühren in einer Stickstoffatmosphäre zugegeben. Die resultierende Mischung wurde für 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt (TLC-Analyse ergab, dass die Reaktion zu 95% abgelaufen war). Die Reaktionsmischung wurde mit gesättigtem NaHCO3 (1 × 300 ml) und gesättigtem NaCl (3 × 300 ml) extrahiert. Die wässrigen Waschschritte wurden mit CH2Cl3 (300 ml) zurückextrahiert und die Extrakte wurden kombiniert, über MgSO getrocknet und aufkonzentriert. Der erhaltene Rückstand wurde an einer 1,5 kg Silicasäule unter der Verwendung von EtOAc/Hexan (3:1) als eluierendes Lösungsmittel chromatographiert. Die reinen Fraktionen wurden vereinigt, um 90,6 (87%) der im Titel genannten Verbindung zu ergeben.
  • 2'-(Aminooxyethyl) Nukleosidamidite und 2'-(Dimethylaminooxyethyl) Nukleosidamidite
  • Aminooxyethyl und Dimethylaminooxyethylamidite werden wie in den Methoden der US-Patentanmeldungen mit der Seriennummer 60/037, 143, eingereicht am 14. Februar 1998 und der Seriennummer 09/016,520, eingereicht am 30. Januar 1998, jetzt als US-Patent 6,127,533 zugeteilt, hergestellt, wobei jedes von diesen beiden der Anmelder zusammen mit der vorliegenden Anmeldung besitzt.
  • Beispiel 2
  • Oligonukleotid-Synthese
  • Unsubstituierte und substituierte Phosphodiester (P = O) Oligonukleotide wurden auf einem automatischen DNA-Synthesizer (Applied Biosystems Model 3808) unter der Verwendung von Standard-Phosphoramidit-Chemie mit einer Oxidation durch Jod synthetisiert.
  • Phosphorothioate (P = S) wurden wie die Phosphodiester-Oligonukleotide synthetisiert, mit der Ausnahme, dass die Standardoxidationsflasche durch eine 0,2 M Lösung von 3H-1,2-Benzodithiol-3-One 1,1-Dioxid in Acetonitril zur schrittweisen Thioatisierung der Phosphit-Bindungen ersetzt wurde. Dieser Warte-Thioatisierungsschritt wurde auf 68 Sekunden erhöht und es folgte der Capping-Schritt. Nach der Spaltung von der CPG-Säule und der Deblockierung in konzentrierter Ammoniumhydroxidlösung bei 55°C (18 Stunden) wurden die Oligonukleotide durch zweimalige Fällung mit 2-5 Volumina Ethanol aus einer 0,5 M NaCl-Lösung aufgereinigt.
  • Phosphinat-Oligonukleotide werden wie im US-Patent 5,508,270, das durch diesen Referenzverweis miteinbezogen wird, beschrieben, hergestellt.
  • Alkylphosphonat-Oligonukleotide werden wie beschrieben im US-Patent 4,469,863 hergestellt.
  • 3'-Desoxy-3'-Methylenphosphonat-Oligonukleotide werden wie im US-Patent 5,610,289 oder US-Patent 5,625,050 beschrieben hergestellt.
  • Phosphoramidit-Oligonukleotide werden wie im US-Patent 5,256,775 oder US-Patent 5,366,878 beschrieben hergestellt.
  • Alkylphosphonothioat-Oligonukleotide werden wie in den veröffentlichten PCT-Anmeldungen PCT/US94/009902 und PCT/US93/06976 (veröffentlicht als WO 94/17093 bzw. WO 94/02499) beschrieben hergestellt.
  • 3'-Desoxy-3'-Aminophosphoramidat-Oligonukleotide werden wie im US-Patent 5,476,925 beschrieben hergestellt.
  • Phosphotriester-Oligonukleotide werden wie im US-Patent 5,023,243 beschrieben hergestellt.
  • Boranphosphat-Oligonukleotide werden wie in den US-Patenten 5,130,302 und 5,177,198 beschrieben hergestellt.
  • Beispiel 3
  • Oligonukleosid-Synthese
  • Methylenmethylimino-verbundene Oligonukleoside, auch bezeichnet als MMI-verbundene Oligonukleoside, Methylendimethylhydrazo-verbundene Oligonukleoside, auch bezeichnet als MDH-verbundene Oligonukleoside und Methylencarbonylamino-verbundene Oligonukleoside, auch bezeichnet als Amid-3-verbundene Oligonukleoside und Methylenaminocarbonyl-verbundene Oligonukleoside, auch bezeichnet als Amid-4-verbundene Oligonukleoside, sowie auch Verbindungen mit gemischten Rückgraten, die zum Beispiel alternierende MMI und P = O oder P = S Bindungen aufweisen, werden wie in den US-Patenten 5,378,825, 5,386,023, 5,489,677, 5,602,240 und 5,610,289 beschrieben hergestellt.
  • Formacetal und Thioformacetal-verbundene Oligonukleoside werden wie in den US-Patenten 5,264,562 und 5,264,564 beschrieben hergestellt.
  • Ethylenoxid-verbundene Oligonukleoside werden wie im US-Patent 5,223,618 beschrieben hergestellt.
  • Beispiel 4
  • PNA-Synthese
  • Peptidnukleinsäuren (PNAs) werden im Einklang mit jedem der zahlreichen Verfahren, auf die in Peptide Nucleic Acids (PNA):Synthesis, Properties and Potential Applications, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 1996, 4, 5-23, verwiesen wird, hergestellt. Sie können auch gemäß den US-Patenten 5,539,082, 5,700,922 und 5,719,262 hergestellt werden.
  • Beispiel 5
  • Synthese von chimären Oligonukleotiden
  • Bei erfindungsgemäßen chimären Oligonukleotiden, Oligonukleosiden oder gemischten Oligonukleotiden/Oligonukleosiden kann es sich um mehrere verschiedene Arten handeln. Diese schließen eine erste Art, in der das „Gap"-Segment der verbundenen Nukleoside zwischen den 5' und 3' „Wing"-Segmenten der verbundenen Nukleoside positioniert ist und einen zweiten „Open end" Typ ein, worin das „Gap"-Segment entweder am 3' oder am 5'-Ende der oligomeren Verbindung lokalisiert ist. Oligonukleotide des ersten Typs sind im Fachgebiet auch als „Gapmers" oder gegappte Oligonukleotide bekannt. Oligonukleotide des zweiten Typs sind im Fachgebiet auch als „Hemimers" oder „Wingmers" bekannt.
  • [2'-O-Membran]--[2'-Desoxy]--[2'-O-Me] chimäre Phosphorothioat-Oligonukleotide
  • Chimäre Oligonukleotide, die 2'-O-Alkylphosphorothiat und 2'-Desoxyphosphorothioat-Oligonukleotidsegmente besitzen, werden unter der Verwendung eines automatischen Applied Biosystems DNA-Synthesizer Modell 380B synthetisiert, wie oben beschrieben. Die Oligonukleotide werden synthetisiert unter der Verwendung des automatischen Synthesizers und 2'-Desoxy-5'-Dimethoxytrityl-3'-O-Phosphoramidit für den DNA-Anteil und 5'-Dimethoxytrityl-2'-O-Methyl-3',O-Phosphoramidit für die 5' und 3' Flügel. Der Standardsynthesezyklus wird durch das Erhöhen des Warteschritts nach der Zugabe von Tetrazol und einer Base auf 600 Sekunden abgeändert und viermal für RNA und zweimal für 2'-O-Methyl wiederholt. Das vollständig geschützte Oligonukleotid wird von der Matrix abgeschnitten und die Phosphatgruppe wird in 3:1 Ammonium/Ethanol bei Raumtemperatur über Nacht entschützt und dann zur Trockenheit lyophilisiert. Eine Behandlung in methanolischem Ammoniak für 24 Stunden bei Raumtemperatur folgt danach, um alle Basen von den Schutzgruppen zu befreien und die Probe wurde wiederum bis zur Trockenheit lyophilisiert. Das Pellet wird in 1 M TBAF in THF für 24 Stunden bei Raumtemperatur resuspendiert um die 2'-Positionen von den Schutzgruppen zu befreien. Die Reaktion wird dann mit 1 M TEAA gequencht und die Probe wird danach auf ein halbes Volumen durch einen Rotovac reduziert, bevor sie auf einer G25-Ausschlussgrößensäule entsalzt wird. Das erhaltene Oligo wird dann spektrophotometrisch zur Bestimmung der Ausbeute und durch Kapillarelektrophorese und durch Massenspektrometrie zur Bestimmung der Reinheit analysiert.
  • [2'-O-(2-Methoxyethyl)]--[2'-Desoxy]--[2'-O-(Methoxyethyl)] chimäre Phosphorothioat-Oligonukleotide
  • [2'-O-(2-Methoxyethyl)]--[2'-Desoxy]--[2'-O-(Methoxyethyl)] chimäre Phosphorothioat-Oligonukleotide wurden analog der obigen Prozedur für die 2'-O-Methyl chimären Oligonukleotide mit dem Austausch von 2'-O-(Methoxyethyl) Amiditen für die 2'-O-Methylamidite hergestellt.
  • [2'-O-(2-Methoxyethyl)Phosphodiester]--[2'-Desoxyphosphorothioat]--[2'-O-(2-Methoxyethyl)Phosphodiester] chimäre Oligonukleotide
  • [2'-O-(2-Methoxyethyl)Phosphodiester]--[2'-Desoxyphosphorothioat]--[2'-O-(2-Methoxyethyl)Phosphodiester] chimäre Oligonukleotide werden analog der obigen Prozedur für die 2'-O-Methyl chimären Oligonukleotide hergestellt, mit dem Austausch von 2'-O-(Methoxyethyl) Amiditen für die 2'-O-Methylamidite, der Oxidation mit Jod um die Phosphodiester-Internukleotiden-Verbindungen innerhalb der Flügelanteile der chimären Strukturen zu generieren und der Verschwefelung unter der Verwendung von 3,H-1,2 Benzodithiol-3-On 1,1 Dioxid (Beaucage Reagent) um die Phosphorothioat-Internukleotid-Verbindungen für den zentralen Gap-Anteil zu generieren.
  • Weitere chimäre Oligonukleotide, chimäre Oligonukleoside und gemischte chimäre Oligonukleotide/Oligonukleoside werden gemäß US-Patent 5,623,065 synthetisiert, das durch diesen Referenzverweis miteinbezogen wird.
  • Beispiel 6
  • Oligonukleotid-Isolierung
  • Nach der Abspaltung von der kontrollierten Glasporensäule (Applied Biosystems) und der Entfernung der Schutzgruppen in konzentriertem Ammoniumhydroxid bei 55°C für 18 Stunden werden die Oligonukleotide oder Oligonukleoside durch zweimalige Fällung aus 0,5 M NaCl mit 2,5 Volumen Ethanol aufgereinigt. Die synthetisierten Oligonukleotide wurden durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese auf denaturierenden Gelen analysiert und als wenigstens 85% Volllängenmaterial beurteilt. Die in der Synthese erhaltenen relativen Mengen der Phosphorothioat- und Phosphodiester-Bindungen wurden periodisch durch 31P Kernspinresonanzspektroskopie kontrolliert, und für einige Studien wurden die Oligonukleotide durch HPLC wie bei Chiang et al. (J. Biol. Chem. 1991, 266, 18162-18171) beschrieben aufgereinigt. Die Ergebnisse, die mit dem durch HPLC aufgereinigten Material erhalten wurden, entsprechen denen, die mit nicht-HPLC aufgereinigten Material erhalten wurden.
  • Beispiel 7
  • Analyse der Oligonukleotid-Inhibierung der Expression von Integrin α4
  • Die Antisense-Modulation der Integrin α4 Expression kann auf eine Vielzahl von im Feld bekannten Arten untersucht werden. Zum Beispiel kann der Integrin α4 mRNA-Level quantifiziert werden, beispielsweise durch Northern Blot Analyse, kompetitive Polymerase-Kettenreaktion (PCR) oder Echtzeit-PCR (RT-PCR). Die quantitative Echtzeit-PCR ist derzeit bevorzugt. RNA-Analyse kann basierend auf gesamter zellulärer RNA oder poly(A)+mRNA durchgeführt werden. Die Methoden zur RNA-Isolierung werden zum Beispiel in Ausubel, F.M. et al. Gelehrt (Current Protocols in Molecular Biology, 1993, 1, 4.1.1-4.2.9 und 4.5.1-4.5.3). Die Northern Blot Analyse ist eine Routinemethode im Feld und wird zum Beispiel in Ausubel, F.M. et al. (Current Protocols in Molecular Biology, 1996, 1, 4.2.1.-4.2.9) gelehrt. Die quantitative Echtzeit-PCR kann unter der Verwendung des käuflich erhältlichen ABI PRISMTM 7700 Sequence Detection System, erhältlich von PE-Applied Biosystems, Foster City, CA einfach durchgeführt werden und gemäß den Angaben des Herstellers verwendet werden. Andere PCR-Methoden sind im Feld auch bekannt.
  • Integrin α4 Proteinlevel können durch eine Vielzahl von im Feld sehr gut bekannten Arten quantifiziert werden, wie etwa der Immunpräzipitation, Western Blot Analyse (Immunoblotting), ELISA oder Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS). Gegen Integrin α4 gerichtete Antikörper können identifiziert werden und aus einer Vielzahl von Quellen erhalten werden, so wie zum Beispiel dem MSRS-Katalog von Antikörpern (Aerie Corporation, Birmingham, MI) oder können via konventionelle Antikörperherstellungsmethoden hergestellt werden. Methoden zur Herstellung von polyklonalen Antisera werden zum Beispiel in Ausubel, F.M. et al. (Current Protocols in Molecular Biology 1997, 2, 11.12.1-11.12.9) gelehrt. Die Herstellung von monoklonalen Antikörpern wird zum Beispiel in Ausubel, F.M. et al. (Current Protocols in Molecular Biology, 1997, 2, 11.4.1-11.11.5) gelehrt.
  • Immunpräzipitationsmethoden sind Standardmethoden im Feld und können zum Beispiel in Ausubel, F.M. et al. (Current Protocols in Molecular Biology, 1998, 2, 10.16.1-10.16.11) gefunden werden. Western Blot (Immunoblot) Analyse ist eine Standardmethode im Feld und kann zum Beispiel in Ausubel, F.M. et al. (Current Protocols in Molecular Biology, 1997, 2, 10.8.1-10.8.21) gefunden werden. Mit Enzymen verbundene Immunosorbent Versuchanordnungen (ELISA) sind Standardmethoden im Feld und können zum Beispiel in Ausubel, F.M. et al. (Current Protocols in Molecular Biology, 1991, 2, 11.2.1-11.2.22) gefunden werden.
  • Beispiel 8
  • Antisense-Inhibierung der Expression von humanen Integrin α4
  • Im Einklang mit der vorliegenden Erfindung wurde eine Serie von Oligonukleotiden hergestellt, um auf verschiedene Regionen der humanen Integrin α4 RNA abzuzielen, unter der Verwendung von veröffentlichten Sequenzen (GenBank Accession Number L12002, hier als SEQ ID NO: 1 als Referenz miteinbezogen). Die Oligonukleotide sind in Tabelle 1 gezeigt. Die Zielstellen sind durch Nukleotidnummern angezeigt, wie sie auch in der Sequenzquellreferenz angegeben sind (GenBank Accession No. L12002), an welche das Oligonukleotid bindet. Alle Verbindungen in Tabelle 1 sind 18 Nukleotide lang, mit einem Phosphorothioat-Rückgrat und einem mittleren 10-Basen Desoxynukleotid-Gap, flankiert von 2'-Methoxyethoxy (2'MOE) Flügeln. Humane A375 Melanomazellen (American Type Culture Collection, Manassas, VA) wurden zwei Tage vor der Oligonukleotid-Behandlung mit einer Dichte von 2000 Zellen/cm2 ausplattiert. Die Zellen wurden mit den Oligonukleotiden bei einer Dosis von 200 nM Oligonukleotid und 6 μg/ml LIPOFECTIN für vier Stunden behandelt. Die Zellen wurden über Nacht inkubiert und mit 2 mM EDTA in PBS abgeerntet. Die Zellen wurden in 2% Rinderserumalbumin, 0,2% Natriumacid in D-PBS bei 4°C gewaschen. Die Zellen wurden bei 200 × g zentrifugiert und der Überstand wurde abgenommen. Die Proteinlevel wurden durch Flow Cytometry gemäß den veröffentlichten Methoden bestimmt (Condon and Bennett, J. Biol. Chem. 1996, 271, 30398-30403). Der spezifisch konjugierte Antikörper CD49d-FITC (Immunotech, Westbrook, Membran, Klon HP2/1) wurde mit 2 μl/Testvertiefung zugegeben und der Kontroll-IgG (Maus IgGI-FITC, PharMingen, San Diego, CA) wurde bei einer Konzentration von μg/ml zugegeben. Die Antikörper wurden mit den Zellen für 30 Minuten bei 4°C im Dunkeln unter leichtem Schütteln inkubiert. Die Zellen wurden wiederum wie oben gewaschen und dann in 0,3 ml FacsFlow Puffer mit 0,5% Formaldehyd resuspendiert. Die Zellen wurden auf einem Becton Dickinson FACScan analysiert. Die Ergebnisse sind als Prozent von Kontrollexpression basierend auf einer mittleren Fluoreszenzintensität angegeben.
  • Wie in Tabelle 1 gezeigt, ergaben die Oligonukleotide 24453, 24473, 24475, 24477 und 24451 mindestens eine 50%ige Inhibierung der Integrin α4 Proteinexpression und wurden weiteren Untersuchungen unterzogen.
  • Beispiel 9
  • Dosis-Wirkungskurven für Antisense-Oligonukleotide im Hinblick auf die Integrin α4 Proteinexpression
  • A375 Zellen wurden mit ISIS 2473, 24475, 24477 und 24451 bei Konzentrationen von 50, 100, 200 und 400 nM für 4 Stunden behandelt. Die Zellen wurden zu den Zeitpunkten 48 und 72 Stunden nach der Oligonukleotid-Behandlung mit Trypsin geerntet und mit 2 μg/ml CD49d-FITC wie im früheren Beispiel gefärbt. Die Resultate sind in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 1
    Figure 00430001
    • Alle Oligonukleotide besitzen Phosphorothioat (P = S oder PS) Rückgrate und 2'-Methoxyethoxy (2'MOE) „Wings", die die 2'-Desoxy Gap-Region flankieren. 2'MOE-Nukleotide sind fett gedruckt. Alle Cytosine sind 5-Methylcytosine (5meC). Die Zielstellen beziehen sich auf die Nukleotidnummern auf dem Ziel (Genbank Accession No. L12002; SEQ ID NO: 1).
  • Tabelle 2
    Figure 00440001
  • Beispiel 10
  • Dosis-Wirkungskurven für den Effekt von Antisense-Oligonukleotiden auf die Integrin α4 Proteinexpression
  • Eine zusätzliche Serie von Oligonukleotiden wurde auf Effekte auf die Integrin α4 Proteinexpression getestet und mit den aktiven Verbindungen der vorherigen Reihenuntersuchung verglichen. Diese Oligonukleotide sind auf eine Integrin α4 Promotorensequenz gerichtet (Rosen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 1991, 88, 4094-4098; GenBank Accession No. M62841, hier als SEQ ID NO: 41 angegeben). Diese Oligonukleotide sind in Tabelle 3 gezeigt und ihre Effekte auf die Integrin α4 Proteinexpression sind in Tabelle 4 gezeigt. Wo Rückgrate gemischt sind, sind die Verbindungen als „s" für Phosphorothioate (P = S oder PS) und „o" für Phosphodiester (P = O oder PO) angegeben. Wo als Zielregion ,M62841,' angegeben ist, sind die Oligonukleotide auf die Promotor-Region, dessen Sequenz in GenBank Accession No. M62841 beschrieben ist, gerichtet. Die verbleibenden Oligonukleotide sind auf die in GenBank Accession No. L12002 beschriebene Sequenz gerichtet und ihre Zielstellen in der L12002-Sequenz sind angegeben.
  • Eine Maus-Sequenz (SEQ ID NO: 47) ist zum Vergleich eingefügt. Sie ist auf dieselbe mRNA-Region wie die humane Sequenz 27104 (die kodierende Region genau abwärts vom AUG-Kodon) gerichtet und enthält 3 nicht passende Basen mit der humanen Ziel-mRNA. Tabelle 3
    Figure 00460001
    Tabelle 4
    Figure 00470001
    • In diesem Versuch zeigten die Oligonukleotide 24475, 27104 und 27108 eine 40%ige oder größere Inhibition und sind bevorzugt. Die auf Maus-Integrin α4 gerichtete Oligonukleotid-Sequenz (SEQ ID NO: 47), die nur drei nicht passende Basen mit dem humanen Zielgen hat, zeigte auch über 40%ige Inhibition bei der höchsten Dosis.
  • Beispiel 11
  • Untersuchung auf die Inhibition von Integrin α4 Proteinlevels
  • Die neuen Oligonukleotide 26640, 26641, 26642 und 26644 wurden synthetisiert und mit den früher getesteten Oligonukleotiden verglichen. Die Oligonukleotide sind in Tabelle 5 gezeigt und ihr Effekt auf die Integrin α4 Proteinlevels ist in Tabelle 6 gezeigt. Die Zielstellen beziehen sich auf die Nukleotid-Nummern auf der Zielsequenz (GenBank Accession No. L12002), mit welcher die Oligonukleotide hybridisieren. Tabelle 5
    Figure 00480001
    Tabelle 6
    Figure 00490001
    • In diesem Versuch zeigten die Oligonukleotide 27104, 24451, 26640, 24453, 26641, 24473, 26642, 2447 und 26644 eine 40%ige oder größere Inhibition und sind bevorzugt. Die auf Maus-Integrin α4 gerichtete Oligonukleotid-Sequenz (SEQ ID NO: 47), die nur in drei Basen nicht mit dem humanen Zielgen übereinstimmt, zeigte auch eine über 40%ige Inhibition bei der höchsten Dosierung.
  • Beispiel 12
  • Antisense-Inhibition von muriner Integrin α4 mRNA-Expression in Maus P388D (IL-1) Zellen
  • Weil viele Zustände, von denen man glaubt, dass sie durch auf Integrin α4 gerichtete Antisense-Oligonukleotide deutlich verbessert werden könnten, nicht zugänglich für Studien in Menschen sind, wurde eine Serie von Oligonukleotiden hergestellt, um auf das murine Integrin α4 abzuzielen, unter Verwendung der veröffentlichten Sequenz von De Miersman et al., (DNA Cell Biol. 1994, 13: 743-754; GenBank Accession No: L20788, hier offenbart als SEQ ID NO: 48). Diese Oligonukleotide sind in Tabelle 7 gezeigt. Die fett gedruckten Nukleotid-Basen sind 2'-Methoxyethoxy (2'MOE); die verbleibenden Positionen sind 2'Desoxy. Die Zielstellen beziehen sich auf die erste Nukleotid-Position auf dem Ziel (GenBank Accession No. L20788), an welches das Oligonukleotid bindet.
  • Die Oligonukleotide wurden ursprünglich in murinen P388D (IL-1) makrophagischen Zellen (American Type Culture Collection, Manassas VA) für 4 Stunden bei einer Oligonukleotid-Konzentration von 100 nM in 3 μg/ml Lipofectin untersucht. Die Zellen wurden geerntet und die RNA wurde durch zelluläre Lyse unter der Verwendung von Catrimox-14 Lösung (Iowa Biotechnology Corp., Oakdale IA. Dahle, C.E. and Macfarlane, D.E., Bio Techniques 1993, 15, 1-4) aufgereinigt. Die RNA wurde elektrophoretisch auf einem 1%igen Agarose/1,1%igen Formaldehydgel mit 18 μg RNA pro Spur geladen aufgereinigt. Die Integrin α4 Sonde war ein PCR-gelabeltes 1025-Basen Integrin α4 Fragment (Positionen 3681-4706), das durch RT-PCR gemäß der Methode von Bednarczuk et al. (Biotechniques 1991 10, 478) hergestellt worden war. Die Ergebnisse dieser Versuchsreihe sind in Tabelle 8 gezeigt. Tabelle 7
    Figure 00520001
    Tabelle 8
    Figure 00520002
    • Wie in Tabelle 8 gezeigt waren das auf den 5'UTR gerichtete ISIS 15607 und ISIS 15608 und 15609, die beide auf das Translationsinitiations-Kodon gerichtete sind, am aktivsten in diesem Versuch. Dosis-Wirkungskurven für ISIS 15607, 15608 und 15609 sind in Tabelle 9 gezeigt. Die Ergebnisse sind Durchschnittswerte von Proben in Duplikaten.
  • Tabelle 9
    Figure 00530001
  • Beispiel 13
  • Antisense-Inhibierung von muriner Integrin α4 Proteinexpression
  • Murine IC-21 makrophagische Zellen (American Type Culture Collection, Manassas, VA) wurden für weitere Studien benutzt. Zusätzliche Oligonukleotide wurden hergestellt, um auf das Maus-Integrin α4 abzuzielen. Diese sind in Tabelle 10 gezeigt; alle 2'MOE Nukleotide sind in fett gedruckter Schrift gezeigt und die verbleibenden Positionen sind 2'Desoxy. Alle 2'-MOE-Cytosine in diesen Verbindungen sind 5'Methylcytosine. IC-21 Zellen wurden mit einer Dichte von 5 × 104 Zellen/Vertiefung in Schalen mit 24 Vertiefungen zwei Tage vor dem Versuch ausgesät. Die Zellen wurden mit 3 μg/ml LIPOFECTIN für 4 Stunden mit 25 nM Oligonukleotid behandelt. Die Vertiefungen wurden pro Versuch in Triplikaten benutzt. Die Zellen wurden mit 2 mM EDTA nach 20 Stunden geerntet und durch Flow Cytometry wie in Beispiel 8 beschrieben analysiert, unter der Verwendung von CD49d- Phycoerythrin (CD49d-PE) Antikörperkonjugat (Klon R1-2) und Ratten IgG2B-PE als Kontrolle. Die Ergebnisse sind in Tabelle 11 gezeigt. Tabelle 10
    Figure 00540001
    • Alle 2'MOE-Cytosine in Tabelle 10 sind 5-Methylcytosine.
  • Tabelle 11
    Figure 00540002
  • ISIS 16430, 16431, 16433, 16434, 16435, 16436 und 16437 ergaben eine besser als 50%ige Inhibition in diesem Versuch und sind bevorzugt.
  • Die Dosis-Wirkungen für den Effekt von ISIS 16431 und 16433 auf die Integrin α4 Pro teinlevel sind in Tabelle 12 gezeigt. Die Zellen (in Triplikaten) wurden mit einer Dichte von 2,5 × 104 Zellen/Vertiefung in 24-Vertiefungs-Platten einen Tag vor der Behandlung ausgesät. Die Oligonukleotid-Konzentrationen lagen bei 0,2, 1, 5, 25 und 50 nM in 3 μg/ml LIP OFECTIN. Die Zellen wurden durch die Behandlung mit 2 mM EDTA für 4 Minuten geerntet, danach wurde 1 ml einer 2%igen BSA, 0,2%igen Azid-Lösung pro Inhalt jeder Vertiefung zugegeben. Die Proteinlevel wurden durch Flow Cytometry wie in Beispiel 8 beschrieben analysiert, unter der Verwendung von CD49d-PE-Antikörperkonjugat mit 2 μg/ml und Ratten IgG2B mit 2 μg/ml als Kontrolle. Für ISIS 16431 und 16433 wurden IC50-Werte von ungefähr 1 nM für die Integrin α4 Proteininhibition gefunden.
  • Tabelle 12
    Figure 00550001
  • Ein weiteres Dosis-Wirkungsexperiment in Bezug auf ISIS 16433 wurde mit eingefügten Zufallskontrollen durchgeführt. IC-21 Zellen wurden mit 0,3, 1, 3, 10 und 30 nM Oligcnukleotid mit 3 μg/ml LIPOFECTIN für 4 Stunden behandelt. Die Zellen wurden für 24 Stunden inkubiert, mit Trypsin geerntet, gefärbt mit 2 μg/ml CD49d-PE und Ratten IgG2B wie in den früheren Beispielen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 13 gezeigt. Für ISIS 16433 bei einer Konzentration von 30 nM wurde eine Inhibition des Proteinlevels bis unter die basalen Level gefunden.
  • Tabelle 13
    Figure 00560001
  • Ein weiteres Dosis-Wirkungsexperiment wurde durchgeführt, um den IC50-Wert von ISIS 16433 für die Inhibition der Integrin α4 RNA zu bestimmen. IC-21-Zellen wurden in Duplikaten mit ISIS 16433 bei 6,25, 12,5, 25 oder 50 nM mit 3 μg/ml LIPOFECTIN behandelt.
  • RNA wurde mit dem Qiagen Qiashredder/RNEASYTM Kit gemäß den Angaben des Herstellers aufgereinigt. Die Sonden wurden unter der Verwendung eines Prime-a-Gene Kits (Promega, Madison, WI) zufällig geprimed. Die Ergebnisse sind in Tabelle 14 gezeigt. Für ISIS 16433 konnte ein IC50-Wert von ungefähr 10 nM für die Integrin α4 RNA-Reduktion gezeigt werden.
  • Tabelle 14
    Figure 00570001
  • Beispiel 14
  • Zusätzliche Antisense-Oligonukleotide gerichtet auf murines Integrin α4-Optimierung
  • Zusätzliche Oligonukleotide mit der ISIS 16433 Sequenz (SEQ ID NO: 47, gerichtet auf das Translationsinitiations-Kodon) wurden synthetisiert, um die Rückgratchemie und die Stelle des 2'Methoxyethoxy-Gaps zu optimieren. Diese Verbindungen wurden auf ihre Fähigkeit getestet, die Integrin α4 Proteinexpression zu inhibieren. Verbindungen und Ergebnisse sind in Tabellen 15 und 16 gezeigt. Für ISIS 17044 wurde eine Reduktion der Integrin α4 Expression bis unterhalb der Ausgangslevel gefunden und dieses Oligonukleotid wurde für weitere Untersuchungen in Tiermodellen von Krankheiten ausgewählt. Tabelle 15
    Figure 00580001
    • Internukleosid-Rückgrat. Bindungen sind einheitlich P = S außer für ISIS 17160. „o" zeigt eine Phosphodiester (P = O) Bindung und „s" zeigt eine Phosphorothioat (P = S) Bindung an.
  • Tabelle 16
    Figure 00590001
  • Beispiel 15
  • Das experimentelle autoimmune Encephalomyelitis (EAE) Modell in Maus für die Multiple Sklerose
  • Die experimentelle autoimmune Encephalomyelitis (EA) ist eine entzündliche, demyelinierende Erkrankung des zentralen Nervensystems, die häufig als Tiermodell für die Multiple Sklerose benutzt wird. Sie ist in genetisch empfänglichen Tieren induzierbar durch die Immunisierung mit Homogenisat des gesamten Rückenmarks oder Proteinkomponenten der Myelinscheide so wie dem Myelin-basischen Protein (MBP) oder dem Proteolipid-Protein (PLP) oder durch den Transfer von MBP- oder PLP-spezifischen T-Zellen. Myers et al., J. Immunol. 1993, 151, 2252-2260.
  • CSJLF-1 Mäuse (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) wurden mit dem p13 Peptid (HSLGKWLGHP-DKF-Amid, synthetisiert durch Research Genetics, Huntsville, AL, SEQ ID NO: 60) immunisiert, das den Resten 139-151 von PLP entspricht und in diesen Mäusen encephalitogenisch ist. Die Mäuse wurden im Wesentlichen wie in Myers et al. (J. Neuroimmunology 1992, 41, 1-8) beschrieben immunisiert. Kurz zusammengefasst wurde den Mäusen in die Hinterpfoten und den Steg des Schwanzes 50-100 μg des p13 Peptids als Emulsion in CFA (Difco, Detroit, MI), verstärkt mit 4 mg/ml von Hitze-abgetötetem H37Ra Mycobacterium tuberculosis Bakterien (Difco), injiziert. Zum Zeitpunkt der Pfoteninjektionen und wiederum 2 Tage danach wurde den Mäuse auch intravenös 500 ng des Pertussis Toxins injiziert (Sigma, St. Louis, MO).
  • Die Mäuse wurden mit dem Antisense-Oligonukleotid ISIS 17044 bei verschiedenen Dosen beginnend einen Tag vor der p13-Immunisierung behandelt, außer wo es anders angezeigt ist. Das Oligonukleotid war in einer 0,9%igen Salzlösung formuliert und wurde täglich durch subkutane Injektion verabreicht, wobei die Dosierungen solange anhielten, bis mehr als 50% der p13-immunisierten Gruppe, aber nicht der Salzlösung-behandelten Gruppe, Anzeichen von Krankheit zu zeigen begannen. Die Dosierung wurde dann beendet und die Mäuse wurden auf Effekte der Behandlung während des Krankheitsverlaufs hin beobachtet. Die Schwere der Krankheit wurde auf einer Skala von 0 bis 5 aufgezeichnet, mit 0 = keine Symptome, 1 = schlaffer Schwanz, 2 = Schwäche in den hinteren Gliedmaßen, 3 = Paralyse der hinteren Gliedmaßen, 4 = Paralyse der hinteren und vorderen Gliedmaßen und 5 = sterbend oder tod. Die Zeit bis zum Krankheitsausbruch wurde auch gemessen und mit den p13-immunisierten Kontrollmäusen verglichen, die eine Salzlösung anstelle des Oligonukleotids erhalten hatten.
  • Beispiel 16
  • EAE Experiment 1
  • Die Mäuse wurden mit ISIS 17044 wie in Beispiel 15 beschrieben behandelt, mit täglichen Dosen, die von 1 mg/kg bis 20 mg/kg reichten, injiziert subkutan (SC). Der mittlere Höchststand der Schwere der Krankheit und die durchschnittliche Anzahl von Tagen bis zum Krankheitsausbruch wurden gemessen und sind in Tabelle 17 gezeigt. Tabelle 17
    Figure 00610001
    • Wie gezeigt, reduzierte 17044 die Schwere der Krankheit oder verzögerte den Ausbruch der Krankheit.
  • Beispiel 17
  • EAE Experiment 2
  • Die Mäuse wurden mit ISIS 17044 wie in Beispiel 15 beschrieben behandelt, mit täglichen Dosierungen, die von 0,3 mg/kg bis 3 mg/kg reichten, subkutan injiziert und 1 mg/kg zu Vergleichszwecken intravenös injiziert. Der mittlere Höchstwert der Schwere der Krankheit und die durchschnittliche Anzahl von Tagen bis zum Ausbruch der Krankheit wurden gemessen und sind in Tabelle 18 gezeigt. Tabelle 18
    Figure 00620001
    • Wie gezeigt, reduzierte 17044 die Schwere der Krankheit und verzögerte den Ausbruch der Krankheit bei allen Konzentrationen.
  • Beispiel 18
  • EAE Experiment 3
  • Die Mäuse wurden mit ISIS 17044 wie in Beispiel 15 beschrieben behandelt, mit täglichen Dosierungen, die von 0,5 mg/kg bis 2,0 mg/kg reichten, subkutan injiziert (SC). Eine dreiwöchige Dosierungskur wurde auch getestet und eine Zufallskontrolle (ISIS 17614, GCCGACACCCGTTCGTTCGG, 2'MOE/Desoxy; P = S; SEQ ID NO: 57) wurde auch getestet. Die Schwere der Krankheit und die Zeit bis zum Ausbruch der Krankheit wurden gemessen und sind in Tabelle 19 gezeigt. Tabelle 19
    Figure 00630001
    • Wie gezeigt, reduzierte 17044 die Schwere der Krankheit oder verlangsamte den Anfang der Krankheit.
  • Beispiel 19
  • EAE Experiment 4-prophylaktische vs. therapeutische Dosierung
  • Die Mäuse wurden mit ISIS 17044 wie in Beispiel 15 beschrieben behandelt, mit täglichen Dosierungen von 0,01 mg/kg bis 2,0 mg/kg, subkutan injziert (SC). Das zufällige Kontroll-Oligonukleotid, ISIS 17614, wurde auch mit 2 mg/kg getestet. Eine 1 mg/kg tägliche Dosis, therapeutisch gegeben, wurde auch getestet. Bei diesem Behandlungsschema begann die Oligonukleotid-Behandlung am Tag 18, nachdem die Tiere Symptome von Paralyse zu zeigen begonnen hatten und wurde fortgesetzt bis Tag 31. Die Schwere der Krankheit und die Zeit bis zum Ausbruch der Krankheit wurden gemessen und sind in Tabelle 20 gezeigt. Tabelle 20
    Figure 00640001
    • Wie gezeigt, reduzierte 17044 die Schwere der Krankheit, wenn es therapeutisch gegeben wurde (für die Zeit bis zum Ausbruch der Krankheit wird nicht erwartet, dass sie erhöht ist, da die Dosierung erst nach dem Ausbruch der Krankheit beginnt).
  • Beispiel 20
  • EAE Experiment 5-prophylaktische vs. therapeutischer Dosierung
  • Die Mäuse wurden mit ISIS 17044 wie in Beispiel 15 beschrieben behandelt, mit täglichen Dosierungen von 0,01/kg bis 2,0 mg/kg, subkutan injiziert (SC). Das zufällige Kontroll-Oligonukleotid, ISIS 17614, wurde auch bei 2 mg/kg getestet. Eine 1 mg/kg tägliche, therapeutisch gegebene Dosierung wurde auch getestet. Bei dieser Kur begann die Oligonukleotid-Behandlung am Tag 11, nachdem die Tiere Symptome von Paralyse zu zeigen begonnen hatten und hielt an bis Tag 27. Die Schwere der Krankheit und die Zeit bis zum Ausbruch der Krankheit wurden gemessen und sind in Tabelle 21 gezeigt. Tabelle 21
    Figure 00650001
    • Wie gezeigt, reduzierte 17044 die Schwere der Krankheit, wenn es therapeutisch gegeben wurde (für die Zeit bis zum Beginn der Krankheit wird nicht erwartet, dass sie erhöht ist, weil die Dosierung erst nach dem Beginn der Krankheit beginnt).
  • Beispiel 21
  • Das Kollagen-induzierte Arthritis (CIA) Modell in Maus für die rheumatoide Arthritis
  • Ein Modell für die humane rheumatoide Arthritis wurde entwickelt, bei dem Mäuse mit dem Rind Typ II Kollagen immunisiert werden. Anderson et al., J. Immunol. 1991, 147, 1189-1193, zitierend Trentham et al., J. Exp. Med 1977, 146, 857. Ein Anschwellen und eine Entzündung der Gelenke folgt nach ungefähr 3 Wochen, verbunden mit Gelenkverformung und Ankylose, typisch für rheumatoide Arthritis. Dieses Modell wurde benutzt, um die Effekte des auf murines Integrin α4 gerichteten Antisense-Oligonukleotids 17044 in Bezug auf die Arthritis in Mäusen zu studieren.
  • DBA/1LacJ Mäuse wurden erhalten von Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME. Weibliche Mäuse im Alter von 6 bis 8 Wochen wurden verwendet und Gruppen zugeteilt, zehn Mäuse pro Gruppe. Am Tag 0 wurden die Mäuse am Steg des Schwanzes mit 100 μg von Rinder Typ II Kollagen immunisiert, das als Emulsion in Complete Freund's Adjuvanz (CFA) vorlag. Am Tag 7 wurde auf dieselbe Art und Weise eine verstärkende Dosis von Kollagen verabreicht. Am Tag 14 wurden den Mäusen subkutan 100 μg von Lipopolysaccharid (LPS) injiziert. Die Gewichte wurden wöchentlich aufgezeichnet. Die Mäuse wurden täglich für einen Ausbruch von CIA inspiziert, wobei der Ausbruch charakterisiert ist durch Erythema und Ödeme. Bis zum Ausbruch der Krankheit wurden die Pfotenweiten und die hinteren Fußknöchelweiten von betroffenen und nicht betroffenen Gelenken dreimal pro Woche gemessen, unter der Verwendung eines Greifzirkels mit konstanter Zugspannung. Zusätzlich wurden die Gliedmaßen klinisch untersucht und in 0-4 beurteilt, wobei 0 = normal; 1 = eine Anzahl geschwollen; 2 = Entzündung vorhanden in mehr als einer Anzahl; 3 = Gelenkverformung mit oder ohne Entzündung; und 4 = Gelenkversteifung, detektiert durch Gelenkmanipulation. Das Fortschreiten aller Messungen wurde bis zum Tag 50 aufgezeichnet. Am Ende des Beobachtungszeitraums für jede Maus wurden alle Pfoten entfernt und histologisch untersucht.
  • Das Oligonukleotid, die positive Kontrollsubstanz (Cyclophophamid, 5 mg/kg) und der Trägerstoff wurden jeder Maus täglich intraperitoneal (IP) verabreicht, angefangen von Tag 3 und weitergeführt für die Dauer der Untersuchung. Jedes Tier erhielt 10 mg/kg als tägliche Pillendosis.
  • Beispiel 22
  • Effekt des auf Integrin α4 gerichteten Antisense-Oligonukleotids bei der Kollagen-induzierten Arthritis (CIA)
  • In einer vorläufigen Studie wurde eine einzige 10 mg/kg tägliche Dosis von ISPH 17044 vom Zeitpunkt der Induktion der Krankheit an bis zum Abschluss der Studie 50 Tage später verabreicht. Das Auftreten von Arthritis war von 70 auf 30% in der ISIS 17044-behandelten Gruppe reduziert. Eine Zusammenfassung der klinischen Parameter ist in Tabelle 22 gezeigt. Tabelle 22 Effekt von ISIS 17044 auf Kollagen-induzierte Arthritis
    Figure 00670001
    • Schweregrad = gesamte klinische Anzahl/gesamte Anzahl von Mäusen in der Gruppe.
    • # Pfoten/Maus = mittlere Anzahl von betroffenen Pfoten bei Beendigung/gesamte Anzahl von Mäusen in der Gruppe.
    • Spitzen-Tag der Entzündung = Tag vom Ausbruch bis zur Zeit der maximalen Schwellung, gemessen für jedes Gelenk.
  • Die Mäuse, die in den verschiedenen Behandlungsgruppen Arthritis entwickelten, wurden verglichen und die Ergebnisse sind in Tabelle 23 gezeigt. Tabelle 23 Vergleich der Mäuse mit Arthritis
    Figure 00670002
    • Mittlere # von betroffenen Pfoten = Anzahl der Pfoten bei Beendigung in den betroffenen Mäusen/Anzahl von betroffenen Mäusen in der Gruppe.
    • Mittlere klinische Anzahl = gesamte klinische Anzahl von betroffenen Mäusen/gesamte Anzahl von betroffenen Mäusen in der Gruppe.
  • Beispiel 23
  • Reduktion der Leukozytensteuerung in das zentrale Nervensystem von EAE-Mäusen durch ein auf Integrin α4 gerichtete Antisense-Oligonukleotid
  • Mäuse aus dem EAE Experiment 3 (Beispiel 18 oben) wurden mit CO2 getötet und das Rückenmark wurde entfernt und in 0,5 cm große Stücke durch die lumbischen und niedrigen thorakischen Regionen geschnitten. Die Stücke wurden in O.C.T. Gewebe-Einfriermedium (Ted Pella Inc., Redding, CA) auf Trockeneis und Methylbutan eingebettet. Vier-Micron dicke gefrorene Sektionen wurden geschnitten und über Nacht luftgetrocknet. Die Sektionen wurden für drei Minuten in eiskaltem Aceton fixiert und dann auf einen Dako Autostainer (Dako Corporation, Carpinteria, CA) platziert und nach den folgenden Schritten behandelt: 5 Minuten in 0,03% H2O2, 5 Minuten in 5%igem in PBS verdünnten Affenserum, 45 Minuten in passendem verdünnten ersten Antikörper, 30 Minuten in Meerrettich-Peroxidase-gelabeltem Anti-Ratten zweiten Antikörper aus Affen (Jackson Laboratory, Bar Harbor, Me). Die Sektionen wurden zwischen den Behandlungsschritten mit PBS gewaschen. Alle verwendeten Antikörper waren Anti-Maus-Antikörper von PharMingen (San Diegeo, CA), außer BM-8, der von Bachem Bioscience Inc. war (King of Prussia, PA). Die Immunfärbung wurde mit DAB (Dako Corporation) entwickelt und mit Hematoxylin gegengefärbt.
  • Für die Behandlung mit 1 mg/kg ISIS 17044 konnte eine Reduktion der Leukozytensteuerung in die Rückenmarksregionen und Gehirne der CSJLF1 Mäuse, die zur Entwicklung von EAE direkt immunisiert worden waren, gezeigt werden. In vorläufigen Experimenten war die Leukozytensteuerung signifikant reduziert, wobei die Wanderung anhand der Expression von VLA-4, von welchem Integrin α4 eine der zwei Untereinheiten ist, CD4 (einem T-Zellen-Marker), BM-8 (einem Makrophagen-Marker) und CD18 (enthalten in den LFA-1 und MAC-1 Adhäsionsmolekülen, die auf Leukozyten gefunden werden} gemessen wurde. CD4+ T-Zellen waren in einem Experiment nahezu aus dem zentralen Nervensystem von ISIS 17044-behandelteln Mäusen eliminiert. Für diese Zellen wurde gezeigt, dass sie kritisch für die Induktion von EAE sind. In einem zweiten Experiment (EAE Experiment 4, obiges Beispiel 19) wurden diese Ergebnisse bestätigt und es schien einen Dosis-abhängigen Effekt mit 1,0 mg/kg von 17044 zu geben, das eine größere Reduktion des Leukozyteninfluxes in das zentrale Nervensystem als 0,1 mg/kg 17044 ergab. Das zufällige Kontroll-Oligonukleotid ISIS 17614 war bei der Reduktion des zellulären Influxes in diesem Experiment nicht effektiv.
  • Beispiel 24
  • Effekt von auf Integrin α4 gerichteten Antisense-Oligonukleotiden bei entzündlichen Darmerkrankungen
  • Ein Modell für entzündliche Darmerkrankungen (IBD) in Maus wurde kürzlich von Okayasu et al. entwickelt (Gastroenterology 1990, 98, 694-702). Die Gabe von Dextransulfat an Mäuse induziert eine Kolitis, die die humane IBD in fast jedem Detail nachahmt. Dextransulfat-induzierte IBD und humane IBD wurden im folgenden auf dem histologischen Level in einer engen Art und Weise verglichen und für das Mausmodell wurde herausgefunden, dass es ein extrem reproduzierbares und verlässliches Modell ist. Es wird hier verwendet, um den Effekt von ISIS 17044 auf entzündliche Darmkrankheiten zu untersuchen.
  • Weibliche Swiss Webster Mäuse (8 Wochen alt) mit einem ungefähren Gewicht von 25 bis 30 g werden unter Standardbedingungen gehalten. Den Mäusen wird es gestattet, sich für mindestens 5 Tage zu akklimatisieren, bevor die experimentellen Vorgänge gestartet werden. Den Mäusen werden in ihrem Trinkwasser 5% Dextransulfatnatrium (verfügbar wie gewünscht) 5 Tage lang gegeben. Begleitend wird das ISIS 17044 Oligonukleotid in einem pharmazeutischen Trägerstoff, der Trägerstoff alleine (negative Kontrolle) oder TGF-β (von dem bekannt ist, dass er vor Dextransulfat-vermittelter Kolitis in Mäusen schützt) verabreicht. ISIS 17044 wird als tägliche subkutane Injektion von 1 mg/kg bis 5 mg/kg für 5 Tage gegeben. TGF-β wird bei 1 μg/Maus intrakolonikal gegeben.
  • Die Mäuse werden am Tag 6 getötet und die Kolons werden histopathologischen Untersuchungen unterzogen. Bis zur Tötung wird die Aktivität der Krankheit durch das Beobachten der Mäuse im Hinblick auf Gewichtsänderungen und durch Beobachten des Stuhls im Hinblick auf das Auftreten von Kolitis überwacht. Die Mäuse werden täglich gewogen. Der Stuhl wird täglich auf Änderungen in der Konsistenz und auf das Vorhandensein von verborgenem oder rohem Blut untersucht. Ein Bewertungssystem wird verwendet, um einen Krankheitsaktivitätsindex zu entwickeln, durch welchen Gewichtsverlust, Stuhlkonsistenz und Vorhandensein van Blut auf einer Skala von 0 bis 3 bewertet werden (0 als normal und 3 als sehr ernsthaft betroffen) und es wird ein Index berechnet. Wirkstoff-induzierte Veränderungen im Krankheitsaktivitätsindex werden statistisch ausgewertet. Für den Krankheitsaktivitätsindex wurde allgemein gezeigt, dass er extrem gut mit IBD korreliert.
  • Beispiel 25
  • Effekt von auf Integrin α4 gerichteten Antisense-Oligonukleotid auf das Überleben im heterotropen murinen Herztransplantationsmodell
  • Um die therapeutischen Effekte eines Integrin α4 Antisense-Oligonukleotids bei der Verhinderung der artgleichen Zurückweisung zu untersuchen, wird das Maus-Integrin α4 spezifische Oligonukleotid ISIS 17044 auf seine Aktivität in einem vaskularisierten heterotropen Herztransplantationsmodell in Maus getestet. Herze von Balb/c-Mäusen werden in die Unterleibshöhle von C3H-Mäusen als primäre vaskularisierte Pfropfen transplantiert, im Wesentlichen wie von Isobe et al. beschrieben (Circulation 1991, 84, 1246-1255). Das Oligonukleotid wird durch kontinuierliche intravenöse Verabreichung durch eine 7 Tage ALZET-Pumpe verabreicht. Die mittlere Überlebensdauer für unbehandelte Mäuse ist gewöhnlicherweise ungefähr 9-10 Tage. Von der Behandlung der Mäuse für 7 Tage mit 1 mg/kg bis 5 mg/kg ISIS 17044 wird erwartet, dass sie die mittlere Überlebenszeit erhöht.
  • Beispiel 26
  • Effekt von auf Integrin α4 gerichteten Antisense Oligonukleotid auf die Leukozytenwanderung
  • Die Leukozyteninfiltration von Geweben und Organen ist ein Hauptaspekt des Entzündungsprozesses und trägt zu Gewebeschaden resultierend aus Entzündung bei. Der Effekt von ISIS 17044 auf die Leukozytenwanderung wird unter der Verwendung eines Mausmodells untersucht, in welchem Carrageenan-getränkte Schwämme subkutan implantiert werden. Carrageenan stimuliert die Leukozytenwanderung und Ödeme. Der Effekt vom Oligonukleotid auf die Leukozytenwanderung bei entzündlichen Exudaten wird durch die Quantifizierung von Leukozyten, die die implantierten Schwämme infiltrieren, evaluiert. Nach einer vierstündigen Fastenzeit werden 40 Mäuse zufällig in acht Gruppen mit jeweils 5 Mäusen eingeteilt. Jede Maus wird mit METOFANE betäubt und es wird ein Polyesterschwamm, imprägniert mit 1 ml einer 20 mg/ml Lösung von Carrageenan, subkutan implantiert. Gruppe 1 wird intravenös eine Salzlösung mit 10 ml/kg vier Stunden vor der Schwammimplantation verabreicht und dies dient als Kontrolle für den Trägerstoff. Indomethacin (Positivkontrolle) wird der Gruppe 2 oral täglich mit 3 mg/kg bei einem Volumen von 20 ml/kg verabreicht, unmittelbar auf die Operation folgend, wieder 6-8 Stunden später und wiederum 21 Stunden nach der Implantation. ISIS 17044 wird der Gruppe 3 intravenös mit einer Dosis von 1 mg/kg bis 5 mg/kg vier Stunden vor der Schwammimplantation verabreicht. ISIS 17044 wird intravenös bei einer Dosis von 1 mg/kg bis 5 mg/kg zur Gruppe 4 unmittelbar folgend auf die Schwammimplantation verabreicht. ISIS 17044 wird den Gruppen 5, 6, 7 und 8 intravenös mit 1 mg/kg bis 5 mg/kg bei 2, 4, 8 bzw. 18 Stunden auf die Schwammimplantation folgend verabreicht. Vierundzwanzig Stunden nach der Implantation werden die Schwämme entfernt, in EDTA und Salzlösung (5 ml) eingelegt und trockengepresst. Die Gesamtzahl von Leukozyten in den Schwammexudatmischungen wird bestimmt. Die orale Gabe von Indomethacin mit 3 mg/kg führt üblicherweise zu einer 75-80%ige Reduktion in der mittleren Leukozytenanzahl, verglichen zur Trägerstoffkontrollgruppe.
  • Beispiel 27
  • Experimenteller Metastasierungsversuch
  • Um die Rolle von Integrin α4 auf die Metastasierung zu untersuchen werden experimentelle Metastasierungsversuche durch die Injektion von 1 × 105 C8161-Zellen in die laterale Schwanzvene von athymischen Nacktmäusen durchgeführt. C8161 ist eine humane Melanom-Zelllinie. Für die Behandlung von C8161-Zellen mit dem Cytokin TNF-α und Interferon γ wurde kürzlich gezeigt, dass sie in einer erhöhten Anzahl von Lungenmetastasen resultiert, wenn die Zellen in Nacktmäuse injiziert wurden (Miller, D.E. and Welch, D.R., Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 1990, 13, 353). Vier Wochen alte weibliche athymische Nacktmäuse (Harlan Sprague Dawley) werden benutzt. Die Tiere werden nach den Richtlinien des NIH gehalten. Gruppen von jeweils 4-8 Mäusen werden in experimentellen Metastasierungsversuchen getestet.
  • Die Behandlung von C8161-Zellen mit dem Antisense-Oligonukleotid ISIS 27104, komplementär zum humanen Integrin α4, wird unter dem Vorhandensein des kationischen Lipids LIPOFECTIN (Gibco/BRL, Gaithersburg, MD) durchgeführt. Die Zellen werden in 60 mm Gewebezellkulturschalen mit einer Dichte von 106 Zellen/ml ausgesät und bei 37°C für 3 Tage inkubiert, 3 Mal mit Opti-MEM (Gibco/BRL) gewaschen und 100 μl von Opti-MEM-Medium wird zu jeder Vertiefung zugegeben. 0,5 μM Oligonukleotid und 15 μg/ml LIPOFECTIN werden bei Raumtemperatur für 15 Minuten gemischt. 25 μl der Oligonukleotid-LIPOFECTIN-Mischung wird auf die entsprechenden Schalen zugegeben und bei 37°C für 4 Stunden inkubiert. Die Oligonukleotid-LIPOFECTIN-Mischung wird entfernt und durch DME-F12 Medium ersetzt, das 10% fötales Kälberserum enthält. Nach 4 Stunden werden 500 U/ml TNF-α zu den entsprechenden Vertiefungen zugegeben und für 18 Stunden inkubiert, zu diesem Zeitpunkt werden die Zellen von den Platten entfernt, gezählt und in die athymischen Nacktmäuse injiziert. Alternativ werden Tumorzellen (nicht mit Oligonukleotid behandelt) wie oben in die athymischen Nacktmäuse implantiert und die Tumor-enthaltenden Mäuse werden jeden zweiten Tag mit Antisense-Oligonukleotid bei Dosen von 1 mg/kg bis 5 mg/kg behandelt.
  • Nach 4 Wochen werden die Mäuse getötet, die Organe in Bouin's Fixative fixiert und die metastasierenden Läsionen in den Lungen werden mit Hilfe eines Anatomiemikroskops gezählt.
  • Die Behandlung von C8161-Zellen mit ISIS 27104 erniedrigt das metastasierende Potential dieser Zellen und eliminiert die erhöhte metastasierende Fähigkeit von C8161, das aus der TNF-α Behandlung resultiert.
  • BEISPIEL 28
  • Effekt von Integrin α4 Antisense-Oligonukleotid in einem Mausmodell der Crohn's Krankheit
  • SJL/J und IL10-/-Mäuse werden in einem TNBS (2,4,5,-Trinitrobenzen Sulfonsäure) induzierten Kolitis-Modell für die Crohn's Krankheit verwendet (Neurath, M.F., et al., J. Exp. Med., 1995, 182, 1281-1290). Mäuse innerhalb der Altersgrenzen von 6 Wochen und 3 Monaten werden verwendet, um die Aktivität von TNF-α Antisense-Oligonukleotiden herauszufinden.
  • C3H/HeJ, SJL/JK und IL10-/-Mäuse werden vor der Gabe von TNBS über Nacht einer Fastenkur unterzogen. Ein dünner, flexibler Polyethylen-Schlauch wird langsam in das Kolon der Mäuse inseriert, sodass die Spitze ungefähr 4 cm proximal zum Anus zum Liegen kommt. 0,5 mg der TNBS in 50% Ethanol werden langsam aus einem Katheter injiziert, der auf eine 1 ml Spritze aufgesetzt ist. Die Tiere werden umgedreht in einer vertikalen Position für ungefähr 30 Sekunden gehalten. Das Oligonukleotid ISIS 17044 wird entweder beim ersten Anzeichen von Symptomen oder gleichzeitig mit der Induktion der Krankheit verabreicht. In den meisten Fällen werden die Tiere täglich dosiert. Die Verabreichung erfolgt i.v., i.p., s.q., durch Minipumpen oder intrakolonische Injektion. Experimentelle Gewebe werden am Ende der Behandlungskur für eine histochemische Evaluierung gesammelt.
  • BEISPIEL 29
  • Effekt von auf Integrin α4 gerichtetem Antisense-Oligonukleotid in einem Mausmodell für Hepatitis
  • Concanavalin A-induzierte Hepatitis wird als Mausmodell für Hepatitis verwendet (Mizuhara, H., et al., J. Exp. Med., 1994, 179, 1529-1537). Weibliche Balblc und C57BL/6-Mäuse innerhalb der Altersgrenzen von 6 Wochen und 3 Monaten werden verwendet, um die Aktivität des Antisense-Oligonukleotids ISIS 17044 zu untersuchen.
  • Den Mäusen wird das Oligonukleotid intravenös injiziert. Den vorbehandelten Mäusen werden dann intravenös 0,3 mg Concanavalin A (Con A) injiziert, um eine Leberverletzung zu induzieren. Innerhalb von 24 Stunden nach der Con A Injektion werden die Lebern aus den Tieren entfernt und auf Zelltod (Apoptose) durch in vitro Methoden analysiert. Bei einigen Experimenten wird Blut aus der retro-orbitalen Vene gesammelt.
  • BEISPIEL 30
  • Effekt von auf Integrin α4 gerichtetem Antisense-Oligonukleotid in einem Mausmodell für Asthma
  • Eine Luftwegsentzündung wird in Patienten mit allergischem Asthma beobachtet. Ein Mausmodell für allergisches Asthma wurde entwickelt (Hessel et al. J. Immunol. 1998, 160, 2998-3005). Die Sensibilisierung von BALB/c-Mäusen mit Ovalbumin induziert einen hohen Level von Ovalbumin-spezifischen IgEs im Serum. Die Inhalation von Ovalbumin in sensitiven Mäusen verursacht eine sofortige bronchoconstriktive Antwort. Die wiederholte Inhalation von Ovalbumin in sensitiven Tieren induziert eine nichtspezifische Atemwegs-Hyperreaktion in vivo sowie das Einwandern von Leukozyten in das Luftwegsgewebe.
  • Pathogen-freie männliche BALB/c-Mäuse (6-8 Wochen) werden von Jackson Laboratories beschafft. Eine aktive Sensibilisierung wird mittels sieben IP-Injektionen von 10 μh Ovalbumin (Sigma Chemical Co, St. Louis, MO, grade II) in 0,5 ml einer Pyrogen-freien Salzlösung an alternierenden Tagen, mit einer Injektion pro Tag, durchgeführt. Dies führt zu hohen Titern von totalem IgE im Mausserum, von dem 80% aus Ovalbumin-spezifischer IgE besteht (Hessel et al., 1998, J. Immunol. 160: 2998-3005). Vier Wochen nach der letzten Injektion werden die Mäuse einmal pro Tag für acht Tage entweder Ovalbumin-Aerosolen (2 mg/ml) oder Salzlösungs-Aerosolen ausgesetzt. Das Aerosol wird mit einem Nebulizer wie etwa einem Medix 8001 (Sussex, UK) hergestellt. Die Tiere wurden der Aerosol-Behandlung für 5 Minuten ausgesetzt.
  • Das Antisense-Oligonukleotid 17044 wird den Mäusen während der Behandlungsperiode gegeben. Dreißig Minuten vor der ersten und fünften Inhalationsgabe wurde den sensitiven Mäusen intravenös eine 1 mg/kg bis 5 mg/kg Dosis von ISIS 17044 in PBS injiziert.
  • Die Reaktion der Luftwege auf Methacholin wird in vivo 24 Stunden nach der letzten Aerosol-Exposition unter der Verwendung der Luftüberdruckmethode gemessen, in welcher die bronchiale Resistenz gegenüber der Inflation bestimmt wird. Die Mäuse werden durch IP-Injektion von Urethan 2 g/kg betäubt und auf eine beheizte Decke gelegt. Eine Kanüle wird in die Trachea gelegt und ein kleiner Polyethylen-Katheter wird für IV-Gaben in die Jugularvene platziert. Spontane Atmung ist unterdrückt durch die IV-Injektion von Tubocurarin-Chlorid (3,3 mg/kg). Wenn diese beendet ist, wird die tracheale Kanüle an eine Atmungspumpe angeschlossen. Zu Intervalen wurden ansteigende Dosen von Methacholin im Bereich von 40 bis 1280 μg/kg gegeben. Der Anstieg in Luft-Überdruck (verursacht durch die Reduktion des Luftflusses in den Lungen als ein Resultat des erhöhten Luftwegtonus) wird an seinem höchsten Punkt gemessen und als Prozentanstieg ausgedrückt.
  • Eine bronchoalveolare Spülung wird verwendet, um die Leukozyteneinwanderung des Luftwegsgewebes zu messen. Drei und 24 Stunden nach dem letzten Aerosol werden die Mäuse durch IP-Injektion von 0,25 ml Natriumpentobarbiton (60 mg/ml) betäubt. Der Unterleib und die Brust werden geöffnet und die Unterleibsaorta wird herausgeschnitten. Unterhalb der Larynx wird ein kleiner Schnitt gemacht, und eine flexible Polyethylen-Kanüle wird in die Trachea inseriert und mit einer Ligatur befestigt. Die Mäuse werden fünfmal gewaschen mit 1 ml Aliquots von Pyrogen-freier Salzlösung auf 37°C erwärmt. Die Zellen aus jedem Waschschritt wurden vereinigt, einmal mit kaltem PBS gewaschen und in 200 μl kaltem PBS resuspendiert. Die Gesamtanzahlen der Zellen wurden gezählt und kategorisiert.
  • Beispiel 31
  • Effekt von Antisense auf Integrin α4 in Bezug auf die Peripheralisation von hämatopoetischen Progenitorzellen
  • Die Mobilisierung (Peripheralisierung) von hämatopoetischen Progenitorzellen aus dem Knochenmark in die Blutzirkulisation ist klinisch bei der Stammzellentransplantation nützlich. Ein Mausmodell wurde entwickelt, um die Effekte von Wirkstoffverbindungen bei diesem Prozess zu evaluieren (und beim gegenteiligen Prozess, dem selektiven Haftenbleiben oder Homing von transplantierten Stammzellen zum Empfängerknochenmark) (Papayannopoulou et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 1995, 92, 9647-9651). Kurz zusammengefasst werden pathogenfreie, 3-6 Monate alte Mäuse verwendet und diese werden in einem Luftzirkulations-gefilterten Behälter für die Dauer des Experiments gehalten. Die Mäuse, die als erste oder zweite Empfänger im Homingversuch verwendet werden, werden 1150-cGy Bestrahlungseinheiten ausgesetzt, die von einer Cs-Quelle stammen.
  • Einzelzellsuspensionen werden aus dem peripheralen Blut, dem Knochenmark und der Milz präpariert. Peripherales Blut wird durch Herzpunktur in Konservierungsmittel-freiem Heparin erhalten und nukläre Zellen werden unter der Verwendung eines NH4Cl hämolytischen Puffers aufgefangen. Knochenmarkszellen werden durch das Auswaschen von Oberschenkelmark unter sterilen Bedingungen mit Iscove's modifiziertem Dulbecco-Medium (IMDM) erhalten, das 10% v/v fötales Rinderserum und Streptomycin (50 μg/ml) und Penicillin (50 U/ml) enthält. Milzzellsuspensionen werden durch die längsgerichtete Dissektion der Milz mit einem Skalpell und dem Abschaben von zellulären Materialien von der Kapsel erhalten, gefolgt von starkem Pipettieren. Alle Zellsuspensionen werden zweimal in IMDM mit 10% fötalem Kälberserum gewaschen. Die Zellzahlen werden durch die Verwendung eines Hämocytometers bestimmt.
  • Versuche zu Kolonie-formenden Einheiten in Kultur (CFU-C) und Kolonie-formierenden Einheiten in der Milz (CFU-S) werden durchgeführt, wie bei Papayannopoulou et al., beschrieben (Proc. Natl. Acad. Sci. 1995, 92, 9647-9651).
  • Um die hämatopoetische Progenitormobilisierung in normalen Tieren zu untersuchen, wird das Oligonukleotid durch tägliche IV-Injektion für drei Tage verabreicht (bei Dosierungsrahmen von 1 mg/kg bis 5 mg/kg). Die Mäuse werden am vierten Tag getötet. In 0,25-0,5 ml peripheralem Blut enthaltene Zellen mit Zellkern werden in klonogenischen Progenitorkulturen ausplatiert, um den CFU-C-Gehalt wie in Papayannopoulou et al. beschrieben, zu bestimmen, (Proc. Natl. Acad. Sci. 1995, 92, 9647-9651).
  • Beispiel 32
  • Das Untersuchen von zusätzlichen auf humanes Integrin α4 gerichteten Oligonukleotiden
  • Ein zusätzliches Set von Antisense-Oligonukleotiden wurde hergestellt, um auf humanes Integrin α4 abzuzielen (GenBank Accession no. L12002, hier als SEQ ID NO: 1 einbezogen). Die Oligonukleotide sind in Tabelle 24 gezeigt. Die Oligonukleotide wurden als „Gapmers" bestehend aus einer 9-Nukleotidregion von Desoxynukleotiden flankiert von drei 2'-O-Methoxyethyl (2'-MOE) Nukleotiden am 5'-Ende und acht 2'-MOE-Nukleotiden am 3'-Ende synthetisiert. 2'-MOE-Nukleotide sind in der Tabelle fettgedruckt gezeigt. Die Oligonukleotide wurden durchgehend mit Phosphorothioat-Rückgraten synthetisiert und alle Cytosine sind 5-Methylcytosine. Die Oligonukleotide wurden zusammen mit Lipofectin in A375 humanen Melanomazellen untersucht, wie in Beispiel 8 hier im Text oben beschrieben. Die Ergebnisse sind auch in Tabelle 24 gezeigt. Wie in der Tabelle gezeigt, ergaben die Oligonukleotide 107234, 107235, 107236, 107237, 107238, 107239, 107240, 107241, 107242, 107243, 107244, 107245, 107246, 107248, 107249, 107251, 107252, 107253, 107254, 107255, 107256, 107257, 107258, 107254 und 107260 (SEQ ID NO: 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 81, 82, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92 bzw. 93) mindestens eine 50%ige Inhibition der Integrin α4 Proteinexpression und sind bevorzugt. Von diesen wurden ISIS 107245, 107248, 107252, 107255 und 107259 (SEQ ID NO: 78, 81, 85, 88 und 92) für weitere Untersuchung ausgewählt.
  • Tabelle 24 Zusätzliche auf humanes Integrin α4 gerichtete Oligonukleotide
    Figure 00780001
  • Beispiel 33
  • Dosis-Wirkungskurven für den Effekt von Antisense-Oligonukleotiden auf die Integrin α4 Proteinexpression
  • A375-Zellen wurden mit ISIS 107245, 107248, 107252, 107255 und 107259 durch Elektroporation bei 175 V, r = 1, c = 1000, 0,2 ml Opti-MEM, 1 × 106 Zellen/ml, 2 mm Gap-Elektrode unter der Verwendung eines BTX Electro Cell Manipulators 600 (Genetronics, San Diego CA) behandelt. Die Oligonukleotid-Konzentrationen lagen bei 1, 3, 10 und 30 μM. Die Zellen wurden 24 Stunden nach der Oligonukleotid-Behandlung geerntet und mit 2 μg/ml CD49d-FITC für die Flow Cytometry wie in den vorherigen Beispielen gefärbt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 25 gezeigt.
  • Tabelle 25 Dosis-Wirkungskurven für zusätzliche auf humanes Integrin α4 gerichtete Oligonukleotide
    Figure 00790001
  • ISIS 107248 wurde direkt mit ISIS 27104 auf die Fähigkeit zur Inhibition der Integrin α4 Expression in A375 Melanomazellen hin verglichen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 26 gezeigt. Die Oligonukleotide wurden wie in dem früheren Beispiel in die Zellen elektroporiert.
  • Tabelle 26
    Figure 00800001
  • Beispiel 34
  • Antisense-Inhibition der Integrin α4 Proteinexpression in Jurkat T-Zellen
  • ISIS 107248 wurde bei Dosen von 1, 3, 10, 20 und 30 μM auf die Fähigkeit, die Integrin α4 Expression in Jurkat T-Lymphozytzellen zu inhibieren getestet, im Einklang mit den früheren Beispielen. Die Integrin α4 Proteinexpression war 24 Stunden nach der Oligonukleotid-Behandlung um ungefähr 65-72% bei Oligonukleotid-Dosen von 3-30 μM reduziert. 48 Stunden nach der Behandlung war die Integrin α4 Proteinexpression um 60% bei 3 μM und um 90% bei 10, 20 und 30 μM Oligonukleotid-Konzentration reduziert.
  • Beispiel 35
  • Antisense-Inhibition der Integrin α4 RNA Expression in Jurkat T-Zellen
  • Die Quantifizierung der Integrin α4 mRNA Levels wurde durchgeführt durch quantitative Echtzeit-PCR unter der Verwendung des ABI PRISMTM 7700 Sequence Detection Systems (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) gemäß den Angaben des Herstellers. Dabei handelt es sich um ein System mit geschlossenem Gefäß, nicht auf einem Gel basierend, und Fluoreszenz zur Detektion verwendend, das hohe Durchsatzquantifizierung von Polymerase-Kettenreaktions (PCR) Produkten in Echtzeit erlaubt. Im Gegensatz zur Standard-PCR, bei welcher die Amplifikationsprodukte nach dem Ablauf der PCR quantifiziert werden, werden die Produkte in der quantitativen Echtzeit-PCR während der Akkumulation quantifiziert. Dies wird durch den Zusatz einer Oligonukleotid-Sonde zur PCR-Reaktion erreicht, die spezifisch zwischen den Forward- und Reverse-PCR-Primern annealt, und zwei fluoreszierende Farbstoffe enthält. Ein Reporterfarbstoff (zum Beispiel JOE oder FAM, erhalten von entweder Operon Technologies Inc., Alameda, CA oder PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) wird an das 5'-Ende der Sonde angehängt und ein Quencher-Farbstoff (zum Beispiel TAMRA, erhalten von entweder Operon Technologies Inc., Alameda, CA oder PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) wird an das 3'-Ende der Sonde angehängt. Wenn die Sonde und Farbstoffe intakt sind, wird die Reporterfarbstoffemission durch die Nähe des 3'-Quencher-Farbstoffes gequencht. Während der Amplifikation entsteht durch das Annealen der Sonde an die Zielsequenz ein Substrat, das durch die 5'-Exonuklease-Aktivität der Taq-Polymerase geschnitten werden kann. Während der Extensionsphase des PCR-Amplifikationszyklus, entlässt der Schnitt der Sonde durch die Taq-Polymerase den Reporterfarbstoff von der verbleibenden Sonde (und damit von dem Quencher-Bestandteil) und ein Sequenz-spezifisches Fluoreszenzsignal wird generiert. Mit jedem Zyklus werden zusätzliche Reporterfarbstoffmoleküle von ihren entsprechenden Sonden abgeschnitten und die Fluoreszenzintensität wird bei regulären Intervallen mittels in das ABI PRISMTM 7700 Sequence Detection System eingebaute Laseroptiken aufgezeichnet. In jedem Versuch generiert eine Serie von Parallelreaktionen, die serielle Verdünnungen von mRNA aus unbehandelten Kontrollproben enthalten, eine Standardkurve, die verwendet wird, um die Prozent der Inhibition nach der Antisense Oligonukleotid-Behandlung der Testproben zu quantifizieren.
  • PCR-Reagenzien wurden von PE-Applied Biosystems, Foster City, CA erhalten. Die RT-PCR-Reaktionen wurden ausgeführt unter der Zugabe von 20 μl PCR-Cocktail (1 × TAQMANTM Puffer A, 5,5 mM MgCl2, 300 μM von jedem dATP, dCTP und dGTP, 600 μM von dUTP) 400 nM jedes des Forward- und Reverse-Primers oder 100 nM im Falle der G3PDH, 100 nM Sonde, 20 Einheiten RNAse Inhibitor, 1,25 Einheiten AMPLITAQ GOLDTM und 12,5 Einheiten MuLV Reverse Transcriptase bis 5 μl (100 ng) Gesamt-mRNA- Lösung, aufgereinigt unter der Verwendung des RNEasyTM Kits (Qiagen, Valencia CA). Die RT-Reaktionen wurden durch Inkubation für 30 Minuten bei 48°C durchgeführt. Nach einer 10-minütigen Inkubation bei 95°C zur Aktivierung der AMPLITAQ GOLDTM wurden 40 Zyklen eines Zweischritt-PCR-Protokolls ausgeführt: 95°C für 15 Sekunden (Denaturierung) gefolgt von 60°C für 1,5 Minuten (Annealing/Extension). Die Integrin α4 Sonden und Primer wurden hergestellt, um an die humane Integrin α4 Sequenz zu hybridisieren, unter der Verwendung von veröffentlichten Sequenzinformationen (GenBank Accession Number L12002, hier als SEQ ID NO: 1 mit aufgenommen).
  • Für Integrin α4 handelte es sich um folgende PCR-Primer:
    Forward Primer: GACACGCTGCGCCTCAT (SEQ ID NO: 94, hybridisiert bei Position 319-335 der Genbank Accession No. L 12002)
    Reverse Primer: ATTCAACACTAAGCGGCCACTG (SEQ ID NO: 95, hybridisiert an Position 391-412 der Genbank Accession No. L12002) und die PCR-Sonde war:
    FAM-CCAACCGTCGCATCCCGTGCAA-TAMRA
    (Die Sonde ist SEQ ID NO: 96, hybridisiert an Position 361-382 der Genbank Accession No. L12002) worin FAM (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) der fluoreszierende Reporterfarbstoff ist und TAMRA (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) der Quencher-Farbstoff ist.
  • Für GAPDH handelte es sich um folgende PCR-Primer:
    Forward Primer: GAAGGTGAAGGTCGGAGTC (SEQ ID NO: 97)
    Reverse Primer: GAAGATGGTGATGGGATTTC (SEQ ID NO: 98) und die PCR-Sonde war: 5' JOE-CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC-TAMRA 3' (die Sonde ist SEQ ID NO: 99), worin JOE (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) der fluoreszierende Reporterfarbstoff ist und TAMRA (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) der Quencher-Farbstoff ist.
  • 24 Stunden nach Behandlung der A375 Melanomazellen mit ISIS 107248 durch Elektroporation (Oligonukleotid-Konzentrationen von 0,3, 1, 3, 10 und 30 μM) wurde die gesamte RNA unter der Verwendung des RNEasyTM Kits (Qiagen, Valencia CA) isoliert und eine RT-PCR durchgeführt. Die Integrin α4 mRNA-Levels waren um ungefähr 23%, 38%, 70%, 80% und 85% im Vergleich zu einer Kontrolle bei Oligonukleotid-Dosen von 0,3, 1, 3, 10 bzw. 30 μM reduziert.
  • Beispiel 36
  • Effekt der Antisense-Inhibierung von Integrin α4 in Bezug auf die Zelladhäsion
  • Humane Nabelschnurvenen-Endothelzellen (HUVEC) (Clonetics, San Diego CA) wurden in EGM-UV-Medium (Clonetics) kultiviert und mit TNF-α für 20 Stunden behandelt, um die VCAM-Expression zu induzieren. A375-Melanomazellen wurden mit ISIS 107248 wie oben beschrieben elektroporiert. Unter der Verwendung eines Antikörpers gegen PECAM, eines spezifischen Markers für Endothelzellen, wurde die Flow Cytometry benutzt, um die Inhibierung der Adhärenz von A375-Melanomazellen an HUVECs zu quantifizieren. Im Vergleich zu einer Kontrolle (TNF behandelt, keine Oligonukleotide) inhibierte ISIS 107248 (10 μM) die A375-Melanomazelladhärenz an HUVEC um ungefähr 85%. Ein Antikörper gerichtet auf Integrin α4 inhibierte die Adhärenz um ungefähr 72%. Melanomazellen stellen ein klinisch relevantes Modell dar, weil eine statistisch signifikante Korrelation zwischen einer erhöhten Expression der VLA-4 Expression (von welchem Integrin α4 ein Mitglied ist) und der Zeit zum Fortschreiten und der gesamten Überlebenszeit von Patienten mit Melanomen gezeigt wurde. Schadendorf et al., J. Natl. Cancer Inst., 1995, 87, 366-371.
  • Ein ähnlicher Adhärierungsversuch wurde unter der Verwendung von Jurkat T-Zellen anstelle von Melanomazellen durchgeführt, wiederum zur Detektion der Adhärenz an HUVECs. Weil Jurkat-Zellen kleiner und weniger komplex sind, können sie von den HUVECs durch das Gaten auf der Basis des Unterschieds im Vorwärts- und Seitwärtslichteinfall abgetrennt werden. Für 5000 HUVEC-Ereignisse wurden die adhärenten Jurkat-Zellen quantifiziert. Bei Oligonukleotid-Konzentrationen von 1, 3, 10 und 30 μM ISIS 107248 betrug die Adhärenz von Jurkat-Zellen an HUVEC 0, 12%, 32% bzw. 63%. Ein Antikörper gegen Integrin α4 ergab eine 96%ige Inhibierung, ein Antikörper gegen VCAM-1 ergab 67%ige Inhibierung und eine Kombination von ISIS 107248 und einem VCAM-1 Antikörper ergab 78%ige Inhibition.
  • SEQUENZ-PROTOKOLL
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Claims (23)

  1. Antisense-Oligonukleotid mit einer Länge von bis zu 30 Nukleotiden, umfassend SEQ ID NO: 81, wobei das Antisense-Oligonukleotid auf ein Nukleinsäuremolekül, welches humanes Integrin α4 kodiert, gerichtet ist und die Expression von humanem Integrin α4 verhindert.
  2. Antisense-Oligonukleotid nach Anspruch 1, welches mindestens eine modifizierte Internukleosidbindung umfasst.
  3. Antisense-Oligonukleotid nach Anspruch 2, wobei die modifizierte Internukleosidbindung einer Phosphorthioatbindung ist.
  4. Antisense-Oligonukleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 3, welches mindestens eine modifizierte Zuckereinheit umfasst.
  5. Antisense-Oligonukleotid nach Anspruch 4, wobei die modifizierte Zuckereinheit eine 2'-O-methoxyethyl-Zuckereinheit ist.
  6. Antisense-Oligonukleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 5, welches mindestens eine modifizierte Nukleobase umfasst.
  7. Antisense-Oligonukleotid nach Anspruch 6, wobei die modifizierte Nukleobase ein 5-Methylcytosin ist.
  8. Antisense-Oligonukleotid nach Anspruch 1, welches ein chimäres Oligonukleotid ist.
  9. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein Antisense-Oligonukleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 8 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel.
  10. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 9, weiter umfassend ein kolloidales Dispersionssystem.
  11. Antisense-Oligonukleotid nach Anspruch 1 zur Verwendung in der Therapie.
  12. In vitro-Verfahren zum Verhindern der Expression von Integrin α4 in humanen Zellen oder Geweben, umfassend das Kontaktieren der Zellen oder Gewebe mit dem Antisense-Oligonukleotid nach Anspruch 1, so dass die Expression von Integrin α4 verhindert wird.
  13. Verwendung einer therapeutisch oder prophylaktisch wirksamen Menge des Antisense-Oligonukleotids nach Anspruch 1 in der Herstellung eines Medikaments zum Verabreichen an einen Menschen, der eine Erkrankung oder einen Zustand, die/der mit Integrin α4 in Zusammenhang steht, aufweist, so dass die Expression von Integrin α4 verhindert wird, wobei die Erkrankung oder der Zustand eine/n Entzündungskrankheit oder -zustand oder eine/n Autoimmunerkrankung oder -zustand oder ein/e metastasierende/r Erkrankung oder Zustand ist.
  14. Verwendung einer therapeutisch oder prophylaktisch wirksamen Menge eines Antisense-Oligonukleotids nach Anspruch 1 in der Herstellung eines Medikaments zur Verabreichung an einen Menschen, um die Niveaus von VLA-4 in Zellen und Geweben zu reduzieren, wobei die Reduzierung von VLA-4 in Zellen und Geweben eine/n Entzündungserkrankung oder -zustand, eine/n Autoimmunerkrankung oder -zustand oder eine/n metastasierende/n Erkrankung oder Zustand behandelt oder verhindert.
  15. Verwendung nach Anspruch 13 oder Anspruch 14, wobei die Erkrankung oder der Zustand rheumatoide Arthritis, Multiple Sklerose, Asthma, eine entzündliche Darmerkrankung, Diabetes, Hepatitis, eine Abstoßung eines Allotransplantats oder eine Tumormetastase ist.
  16. Verwendung nach Anspruch 14, wobei die Erkrankung oder der Zustand meumatoide Arthritis, Multiple Sklerose, Asthma oder eine Tumormetastase ist.
  17. Verwendung nach Anspruch 13 oder 14, wobei die Erkrankung oder der Zustand Multiple Sklerose ist.
  18. Verwendung nach Anspruch 13 oder Anspruch 14, wobei die Erkrankung oder der Zustand ein/e metastasierende/r Erkrankheit oder Zustand ist.
  19. Verwendung nach Anspruch 18, wobei die Erkrankung oder der Zustand ein Melanom ist.
  20. In vitro Verfahren zum Reduzieren der Niveaus von VLA-4 in humanen Zellen oder Geweben, umfassend das Kontaktieren der Zellen oder Gewebe mit einem Antisense-Oligonukleotid nach Anspruch 1, so dass die Niveaus von VLA-4 reduziert sind.
  21. In vitro Verfahren zum Reduzieren der Niveaus von α4β7 in humanen Zellen oder Geweben, umfassend das Kontaktieren der Zellen oder Gewebe mit dem Antisense-Oligonukleotid nach Anspruch 1, so dass die Niveaus von α4β7 reduziert sind.
  22. Verwendung einer therapeutisch oder prophylaktisch wirksamen Menge des Antisense-Oligonukleotids nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Medikaments für das Verabreichen an einen Menschen zum Erhöhen der Mobilisierung von hämopoetischen Vorläuferzellen im Kreislauf des Menschen.
  23. In vitro Verfahren zum Verringern der Adhärenz von Zellen eines ersten Zelltyps an einen zweiten Typ, umfassend das Kontaktieren von mindestens einem der Zelltypen mit einem Antisense-Oligonukleotid nach Anspruch 1.
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