JP2002526095A - 腫瘍壊死因子受容体関連因子（ｔｒａｆ）の発現のアンチセンスモジュレーション - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 腫瘍壊死因子受容体関連因子（TRAF）の発現を調節するための組成物および方法を提供する。TRAFをコードする核酸を標的とするアンチセンス化合物、特に、アンチセンスオリゴヌクレオチドが好適である。TRAF発現のモジュレーションのためにおよびTRAFの発現に関係した疾患の治療のために、これら化合物を使用する方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 発明の分野 本発明は、腫瘍壊死因子受容体関連因子（TRAF）の発現を調節するための組成
物および方法を提供する。詳しくは、本発明は、ヒトTRAFをコードする核酸と特
異的にハイブリッド形成しうるアンチセンス化合物、特に、オリゴヌクレオチド
に関する。このようなオリゴヌクレオチドは、TRAFの発現を調節することが分か
っている。

【０００２】 発明の背景 腫瘍壊死因子（TNF）受容体スーパーファミリーメンバーは、炎症および免疫
応答において、細胞の増殖、分化およびアポトーシスを調節する。この受容体ス
ーパーファミリーには、1型および2型TNF受容体（TNFR1およびTNFR2）、Fas、CD
27、4-1BB、CD40およびCD30が含まれるがこれらに制限されるわけではない一群
の関連細胞表面受容体が含まれる。TNF受容体スーパーファミリーメンバーによ
るシグナリングは、三量体のリガンドを用いたそれら受容体のオリゴマー化によ
って開始され、細胞内ドメインをごく接近させる（Pullenら、Biochemistry 199
8, 37, 11836-11845）。TNF受容体スーパーファミリーメンバーと結合するアダ
プタータンパク質の二つのファミリー、すなわち、TNF受容体関連因子（TRAF）
ファミリーおよび細胞死誘導領域（death domain）含有タンパク質ファミリーが
識別されている。

【０００３】 タンパク質のTRAFファミリーメンバーは、当該技術分野においてTRAFドメイン
と称される、アミノ末端RINGフィンガーモチーフおよび相同のカルボキシ末端領
域を共有している（Yuan, J., Curr.Opin.Cell Biol. 1997, 9, 247-251）。こ
の保存されるカルボキシ末端領域は、受容体細胞質ドメインに結合し、そしてシ
グナリングタンパク質NF-κB誘導キナーゼ（NIK）およびI-TRAFT／TANKとの相互
作用を媒介する（Chengら、Science 1995, 267, 1494-1498；Cheng, G. および
Baltimore, D., Genes Dev. 1996, 10, 963-973；Rotheら、Proc.Natl Acad.Sci
. USA 1996, 93, 8241-8246；Malininら、Nature 1997, 385, 540-544）。TRAF
ホモ-およびヘテロオリゴマー化を媒介する予想されるコイルドコイル領域は、T
RAFドメインのN末端のより少ない保存領域中にある（Caoら、Nature 1996, 383,
443-446；Chengら、Science 1995, 267, 1494-1498；Rotheら、Cell 1994, 78,
681-692；Satoら、FEBS Lett 1995, 358, 113-118；および Takeuchiら、J.Bio
l.Chem. 1996, 271, 19935-19942）。

【０００４】 哺乳動物TRAFファミリーには、現在、6種類のメンバー、すなわち、TRAF-1、T
RAF-2、TRAF-3、TRAF-4、TRAF-5およびTRAF-6が含まれている。これらタンパク
質は、概して、選択されたTNFファミリーサイトカインを細胞に添加後に、細胞
のサイトゾル内においてサイトゾル小胞と一緒にかまたは原形質膜で見出されて
いる。TRAFファミリーのメンバーは、多種多様な受容体のシグナルを媒介する。
TRAFファミリーメンバーのサブセットは、TNF受容体ファミリーメンバー（TNFR2
、CD40、CD30、LTβR、ATAR、OX40および4-1BB）と相互作用することが分かって
いる。

【０００５】 例えば、TRAF-1およびTRAF-2は、TNFR2の細胞質ドメインと相互作用するそれ
らの能力によって識別された（Rotheら、Cell 1994, 78, 681-691）。TNFR2は、
細胞増殖およびNFκB活性化を刺激するTNFの能力と関係している（Tartagliaら
、Proc.Natl Acad.Sci.USA 1991, 88, 9292-9296）。TRAF-1は、アポトーシスの
調節に関与していると考えられる（Speiserら、J.Exp.Med. 1997, 185, 1777-17
83）。TRAF-2およびその共関連タンパク質の減少も、TNFR1のような細胞死誘導
受容体の活性化の際に、アポトーシスを受ける細胞の感受性を増加させることが
分かっている（Duckett, C.S. および Thompson, C.B., Genes & Development 1
997, 11, 2810-2821；Yehら、Immunity 1997, 7, 715-725）。したがって、受容
体に媒介されるTRAF-2消耗およびTRAF-2翻訳の速度は、細胞生存の調節において
動的役割を果たすことが示唆されている（Duckett, C.S. および Thompson, C.B
., Genes & Development 1997, 11, 2810-2821）。マウスにおけるTRAF-2遺伝子
の選択的（targeted）破壊もまた、TNFR1によるc-Jun N末端キナーゼ（JNK）活
性化を激しく欠損させることが分かっている（Yehら、Immunity 1997, 7, 715-7
25）。

【０００６】 TRAF-2（Rotheら、Science 1995, 269, 1424-1427）、TRAF-3（Chengら、Scie
nce 1995, 267, 1494-1498）、TRAF-5（Ishidaら、Proc.Natl Acad.Sci.USA 199
6, 93, 9437-9442）およびTRAF-6（Pullenら、Biochemistry 1998, 37, 11836-1
1845）も、Bリンパ球受容体CD40と相互作用することが分かっている。CD40は、B
細胞、マクロファージおよび樹状細胞のような抗原提示細胞中で活性化シグナル
を与えるTNF受容体スーパーファミリーメンバーである。CD40の活性化は、B細胞
の生存、成長および分化をもたらす。293T細胞において、TRAF-3の発現は、NFκ
Bの構成性活性を抑制したが、TRAF-5の発現はNFκB活性を生じた。マウスにおけ
るTRAF-3遺伝子の選択的破壊は、T依存性抗原への減少した免疫応答を引き起こ
し、初期の出生後致死を引き起こす（Xuら、Immunity 1996, 5, 407-415）。哺
乳動物細胞中でのTRAF-2、TRAF-5またはTRAF-6の過発現も、JNK活性化を生じる
。

【０００７】 TRAF-4は、乳癌で発現される。in vitro 結合検定において、TRAF-4は、リン
ホトキシンβ受容体（LTβR）のサイトゾルドメインと相互作用し、p75神経成長
因子受容体と弱く相互作用するが、TNFR1、TNFR2、FasまたはCD40とは相互作用
しないことが分かっている（Karjewskaら、Am.J.of Pathol. 1998, 152, 6, 154
9-1561）。

【０００８】 TRAF-6も、IL-1によって誘導されるシグナル伝達経路を媒介して、IL-1受容体
関連キナーゼ（IRAK）であるセリン／トレオニンキナーゼを補充することによっ
てNFκBを活性化することが報告されている（Caoら、Nature 1996, 93:9437-944
2）。したがって、TRAFの役割は、TNF受容体スーパーファミリーのシグナル伝達
因子であること以外に広範囲にわたっている。

【０００９】 TRAF-5タンパク質およびTRAF-5をコードするDNAは、WO97／38099号に開示され
ている。WO97／38099号に更に開示されているのは、そのDNAに対するアンチセン
スオリゴヌクレオチド、抗TRAF-5抗体、そのDNAを含有するベクター、このベク
ターを含有する形質転換細胞、およびこのベクターを用いてTRAF-5を製造する方
法である。更に、このPCT出願には、TRAF-5に結合する物質、およびこのタンパ
ク質の活性および発現を調節する物質をスクリーニングする方法が開示されてい
る。

【００１０】 TRAFファミリー分子、この分子をコードするポリヌクレオチド、その分子に対
する抗体、およびその分子のアンチセンスポリヌクレオチドも、WO97／31110号
に開示されている。このPCT出願に開示されているのは、この“未知の”TRAFフ
ァミリー分子の遺伝子の塩基配列およびアミノ酸であり、それらは、抗体の他に
、この分子が関与しているTNF-Rファミリーのタンパク質およびシグナル伝達シ
ステムの機能を解明する手段を提供し、研究および診断用のプローブを提供し、
そして治療薬の使用を指示することを示唆している。

【００１１】 しかしながら、現在、1種類またはそれ以上の選択されたTRAFファミリーメン
バーの合成を有効に阻害する治療薬は知られていない。結果として、TRAF発現を
有効に阻害しうる物質が長い間要求されている。したがって、1種類またはそれ
以上のTRAFに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、多数の治療、診断およ
び研究用途において無類に有用であることが判明しうる。

【００１２】 発明の概要 本発明は、ある選択された腫瘍壊死因子受容体関連因子（TRAF）をコードする
核酸を標的とし、その選択されたTRAFの発現を調節するアンチセンス化合物、特
に、オリゴヌクレオチドに関する。本発明のアンチセンス化合物を含む医薬組成
物および他の組成物も提供する。更に提供されるのは、細胞または組織中でのTR
AFの発現を調節する方法であって、1種類またはそれ以上の本発明のアンチセン
ス化合物または組成物とそれら細胞または組織を接触させることを含む方法であ
る。更に提供されるのは、ある選択されたTRAFの発現に関係した疾患または状態
を有するまたはその傾向があると疑われる動物、特に、ヒトを治療する方法であ
って、1種類またはそれ以上の本発明のアンチセンス化合物または組成物の治療
的または予防的有効量を投与することによる方法である。

【００１３】 発明の詳細な説明 本発明は、選択された腫瘍壊死因子受容体関連因子（TRAF）をコードする核酸
分子の機能を調節する、根本的には、選択されたTRAFの生産される量を調節する
場合に用いるためのオリゴマーアンチセンス化合物、特に、オリゴヌクレオチド
を用いる。これは、選択されたTRAFをコードする一つまたはそれ以上の核酸と特
異的にハイブリッド形成するアンチセンス化合物を提供することによって行われ
る。“選択されたTRAF”とは、タンパク質のTRAFファミリーのいずれかのメンバ
ー、最も好ましくは、TRAF-1、TRAF-2、TRAF-3、TRAF-4、TRAF-5またはTRAF-6を
意味する。本明細書中で用いられる“標的核酸”および“TRAFをコードする核酸
”という用語は、TRAFファミリーメンバーをコードするDNA、このようなDNAから
転写されるRNA（前mRNAおよびmRNAを含む）、そして更に、このようなRNAに由来
するcDNAを包含する。オリゴマー化合物とその標的核酸との特異的ハイブリダイ
ゼーションは、その核酸の正常な機能を妨げる。標的核酸の機能についての、そ
れに特異的にハイブリッド形成する化合物によるこのモジュレーションは、概し
て、“アンチセンス”と称される。妨げられるDNAの機能には、複製および転写
が含まれる。妨げられるRNAの機能には、例えば、タンパク質翻訳部位へのRNAの
転位、RNAからのタンパク質の翻訳、1種類またはそれ以上のmRNA種を生じるRNA
のスプライシング、およびRNAによって行われうるまたは促進されうる触媒活性
などの全ての生体機能が含まれる。標的核酸機能のこのような妨害の作用は全て
、選択されたTRAFの発現のモジュレーションである。本発明の文脈中、“モジュ
レーション”とは、遺伝子の発現の増加（刺激）かまたは減少（阻害）を意味す
る。本発明の場合、阻害は、遺伝子発現の好ましい形のモジュレーションであり
、mRNAは好ましい標的である。

【００１４】 アンチセンスに特異的な核酸を標的にすることは好適である。特定の核酸への
アンチセンス化合物の“標的化”は、本発明の場合、多段階プロセスである。こ
のプロセスは、通常、その機能が調節される核酸配列の同定で始まる。これは、
例えば、その発現が特定の障害または疾患状態と関係している細胞遺伝子（また
はその遺伝子から転写されるmRNA）、または感染物質からの核酸分子でありうる
。本発明において、その標的は、1種類またはそれ以上の選択されたTRAFをコー
ドする一つまたはそれ以上の核酸分子である。標的化プロセスには、所望の作用
、例えば、タンパク質の発現の検出またはモジュレーションが行われるようにア
ンチセンス相互作用を生じさせるためのこの遺伝子中の1ヶ所または複数の部位
の決定も含まれる。本発明の場合、好ましい遺伝子内部位は、その遺伝子のオー
プンリーディングフレーム（ORF）の翻訳開始または終止コドンを包含する領域
である。当該技術分野において知られているように、翻訳開始コドンは、典型的
に、5'-AUG（転写されたmRNA分子中；該当するDNA分子中の5'-ATG）であるので
、その翻訳開始コドンは、“AUGコドン”、“スタートコドン”または“AUGスタ
ートコドン”とも称される。少数の遺伝子は、RNA配列5'-GUG、5'-UUGまたは5'-
CUGを有する翻訳開始コドンを有するが、5'-AUA、5'-ACGおよび5'-CUGは in viv
o で機能することが分かっている。したがって、“翻訳開始コドン”および“ス
タートコドン”という用語は、それぞれの場合のイニシエーターアミノ酸が、典
型的にメチオニン（真核生物の場合）またはホルミルメチオニン（原核生物の場
合）であるものの、多数のコドン配列を包含しうる。真核性および原核性遺伝子
は、二つまたはそれ以上の別のスタートコドンを有することがありうるというこ
とも当該技術分野において知られており、それらのいずれか一つは、特定の細胞
種類または組織中での、または特定の条件設定の下での翻訳開始に優先的に利用
することができる。本発明の文脈中、“スタートコドン”および“翻訳開始コド
ン”とは、このようなコドンの一つまたは複数の配列とは無関係に、TRAFをコー
ドする遺伝子から転写されるmRNA分子の翻訳を開始するのに in vivo で用いら
れる一つまたは複数のコドンを意味する。

【００１５】 遺伝子の翻訳終止コドン（または“停止コドン”）は、三つの配列、すなわち
、5'-UAA、5'-UAGおよび5'-UGA（該当するDNA配列は、それぞれ、5'-TAA、5'-TA
Gおよび5'-TGAである）の内一つを有することがありうるということも当該技術
分野において知られている。“スタートコドン領域”および“翻訳開始コドン領
域”という用語は、翻訳開始コドンから両方向（すなわち、5'または3'）に約25
個〜約50個連続したヌクレオチドを包含するこのようなmRNAまたは遺伝子の一部
分を意味する。同様に、“停止コドン領域”および“翻訳終止コドン領域”とい
う用語は、翻訳終止コドンから両方向（すなわち、5'または3'）に約25個〜約50
個連続したヌクレオチドを包含するこのようなmRNAまたは遺伝子の一部分を意味
する。

【００１６】 当該技術分野において、翻訳開始コドンと翻訳終止コドンとの間の領域を意味
することが知られているオープンリーディングフレーム（ORF）すなわち“コー
ディング領域”もまた、有効に標的とされうる領域である。他の標的領域には、
当該技術分野において、翻訳開始コドンから5'方向のmRNAの一部分、したがって
、mRNAの5'キャップ部位と翻訳開始コドンとの間のヌクレオチドまたは遺伝子上
の該当するヌクレオチドを含めた部分を意味することが知られている5'非翻訳領
域（5'UTR）、および当該技術分野において、翻訳終止コドンから3'方向のmRNA
の一部分、したがって、mRNAの翻訳終止コドンと3'末端との間のヌクレオチドま
たは遺伝子上の該当するヌクレオチドを含めた部分を意味することが知られてい
る3'非翻訳領域（3'UTR）が含まれる。mRNAの5'キャップは、mRNAの最も5'の残
基に5'-5'三リン酸結合によって結合したN7メチル化グアノシン残基を含む。mRN
Aの5'キャップ領域は、5'キャップ構造自体を、更には、そのキャップに隣接し
た最初の50ヌクレオチドを含むと考えられる。5'キャップ領域は、好ましい標的
領域でもありうる。

【００１７】 真核性mRNA転写物の中には直接的に翻訳されるものがあるが、多くは、それが
翻訳される前に転写物から切除される“イントロン”として知られる1個または
それ以上の領域を含有する。残りの（したがって、翻訳される）領域は、“エク
ソン”として知られ、連続したmRNA配列を互いに形成するようにスプライシング
される。mRNAスプライス部位、すなわち、イントロン-エクソン結合も、好まし
い標的領域でありうるし、特に、異常なスプライシングが疾患に関係している場
合、または特定のmRNAスプライス生産物の過剰生産が疾患に関係している場合に
有用である。再配列または欠失による異常な融合結合も、好ましい標的である。
イントロンは、例えば、DNAまたは前mRNAを標的とするアンチセンス化合物にと
って有効な、したがって好ましい標的領域でもありうるということも判明してい
る。

【００１８】 一つまたはそれ以上の標的部位が同定されたら、その標的に充分に相補的であ
る、すなわち、充分によくそして充分な特異性によってハイブリッド形成するオ
リゴヌクレオチドを選択し、所望の作用を生じる。

【００１９】 本発明の文脈中、“ハイブリダイゼーション”とは、相補的ヌクレオシドまた
はヌクレオチド塩基間のワトソン・クリック型、フーグスティーン型または逆フ
ーグスティーン型水素結合であってよい水素結合を意味する。例えば、アデニン
およびチミンは、水素結合の形成によって対になる相補的ヌクレオ塩基である。
本明細書中で用いられる“相補的”とは、二つのヌクレオチド間で正確に対合す
る能力を意味する。例えば、オリゴヌクレオチドのある位置のヌクレオチドが、
DNAまたはRNA分子の同じ位置のヌクレオチドと水素結合できるならば、そのオリ
ゴヌクレオチドおよびDNAまたはRNAは、その位置で互いに相補的であると考えら
れる。そのオリゴヌクレオチドおよびDNAまたはRNAは、それぞれの分子中の充分
に多数の該当位置が、互いに水素結合できるヌクレオチドによって占められてい
る場合、互いに相補的である。したがって、“特異的にハイブリッド形成しうる
”および“相補的”とは、オリゴヌクレオチドとDNAまたはRNA標的との間に安定
でそして特異的な結合が生じるような、充分な程度の相補性または正確な対合を
示すのに用いられる用語である。当該技術分野において、アンチセンス化合物の
配列は、特異的にハイブリッド形成しうるその標的核酸の配列と100％相補的で
ある必要はないということが理解される。アンチセンス化合物は、その化合物の
標的DNAまたはRNA分子への結合が、標的DNAまたはRNAの正常な機能を妨げて有用
性を損なわせる場合に特異的にハイブリッド形成可能であり、特異的結合が望ま
れる条件下において、すなわち、in vivo 検定または治療的処置の場合の生理学
的条件下において、または in vitro 検定の場合の検定が行われる条件下におい
て、アンチセンス化合物の非標的配列への非特異的結合をさせない充分な程度の
相補性が存在する。

【００２０】 アンチセンス化合物は、研究用試薬および診断薬として一般的に用いられる。
例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、正確な特異性で遺伝子発現を阻害
することができ、しばしば、当業者が特定の遺伝子の機能を解明するのに用いら
れている。アンチセンス化合物は、例えば、生物学的経路のいろいろなメンバー
の機能を区別するのにも用いられる。したがって、アンチセンスモジュレーショ
ンは研究用途に利用されている。

【００２１】 アンチセンスの特異性および感受性は、当業者によって治療的用途にも利用さ
れる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、動物およびヒトの疾患状態の治療に
おいて治療的部分として用いられている。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、
安全そして有効にヒトに投与されており、現在、多数の臨床試験が行われている
。このように、オリゴヌクレオチドは、細胞、組織および動物、特にヒトの治療
計画において有用であるように設定することができる有用な治療様式でありうる
ということが確かめられている。

【００２２】 本発明の文脈中、“オリゴヌクレオチド”という用語は、リボ核酸（RNA）ま
たはデオキシリボ核酸（DNA）のオリゴマーまたはポリマー、またはその模擬体
を意味する。この用語には、天然に存在するヌクレオ塩基、糖および共有ヌクレ
オシド間（バックボーン）結合から成るオリゴヌクレオチド、更には、同様に機
能する天然に存在しない部分を有するオリゴヌクレオチドが含まれる。このよう
な修飾されたまたは置換されたオリゴヌクレオチドは、例えば、増加した細胞取
込み、核酸標的への増加した親和性およびヌクレアーゼの存在下における増加し
た安定性などの望ましい性状のために、天然の形よりも好適であることが多い。

【００２３】 アンチセンスオリゴヌクレオチドは、アンチセンス化合物の好ましい形である
が、本発明は、下記のようなオリゴヌクレオチド模擬体が含まれるがそれらに制
限されるわけではない他のオリゴマーアンチセンス化合物を包含する。本発明に
よるアンチセンス化合物は、好ましくは、約8個〜約30個のヌクレオ塩基を含む
。特に好ましいのは、約8個〜約30個のヌクレオ塩基（すなわち、約8個〜約30個
結合したヌクレオシド）を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドである。当該技
術分野において知られているように、ヌクレオシドは塩基-糖組合せである。ヌ
クレオシドの塩基部分は、通常は、複素環式塩基である。このような複素環式塩
基の二つの最も一般的なクラスは、プリンおよびピリミジンである。ヌクレオチ
ドは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合したリン酸基を更に含むヌクレオシドで
ある。ペントフラノシル糖を含むヌクレオシドに関して、リン酸基は、糖の2'か
、3'かまたは5'ヒドロキシル部分に結合しうる。オリゴヌクレオチドを形成する
場合、それらリン酸基は、隣接したヌクレオシドに互いに共有結合させて、直鎖
状ポリマー化合物を形成する。次に、この直鎖状ポリマー構造のそれぞれの末端
を更に結合させて、環状構造を形成することができるが、しかしながら、概して
、開環直鎖状構造が好適である。オリゴヌクレオチド構造中において、リン酸基
は、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間バックボーンを形成すると一般的にい
われている。RNAおよびDNAの通常の結合すなわちバックボーンは、3'-5'ホスホ
ジエステル結合である。

【００２４】 本発明において有用な好ましいアンチセンス化合物の具体的な例には、修飾さ
れたバックボーンまたは非天然ヌクレオシド間結合を含有するオリゴヌクレオチ
ドが含まれる。本明細書中に定義のように、修飾されたバックボーンを有するオ
リゴヌクレオチドには、バックボーン中にリン原子を保持するものおよびバック
ボーン中にリン原子を有していないものが含まれる。本明細書の目的に関して、
および当該技術分野において時々論及されるように、ヌクレオシド間バックボー
ン中にリン原子を有していない修飾オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオシド
であると考えることもできる。

【００２５】 好ましい修飾オリゴヌクレオチドバックボーンには、例えば、ホスホロチオエ
ート；キラルホスホロチオエート；ホスホロジチオエート；ホスホトリエステル
；アミノアルキルホスホトリエステル；3'-アルキレンホスホネートおよびキラ
ルホスホネートを含めたメチルおよび他のアルキルホスホネート；ホスフィネー
ト；3'-アミノホスホルアミデートおよびアミノアルキルホスホルアミデートを
含めたホスホルアミデート；チオノホスホルアミデート；チオノアルキルホスホ
ネート；チオノアルキルホスホトリエステル；および通常の3'-5'結合を有する
ボラノホスフェート、これらの2'-5'結合類似体、およびヌクレオシド単位の隣
接した対が、3'-5'〜5'-3'または2'-5'〜5'-2'に結合している逆方向極性を有す
るものが含まれる。いろいろな塩、混合塩および遊離酸形も含まれる。

【００２６】 上のリン含有結合の製造を示す代表的な米国特許には、本明細書中にそれぞれ
援用されるU.S.：3,687,808号；4,469,863号；4,476,301号；5,023,243号；5,17
7,196号；5,188,897号；5,264,423号；5,276,019号；5,278,302号；5,286,717号
；5,321,131号；5,399,676号；5,405,939号；5,453,496号；5,455,233号；5,466
,677号；5,476,925号；5,519,126号；5,536,821号；5,541,306号；5,550,111号
；5,563,253号；5,571,799号；5,587,361号；および5,625,050号が含まれるが、
これらに制限されるわけではない。

【００２７】 リン原子をその中に含まない好ましい修飾オリゴヌクレオチドバックボーンは
、短鎖アルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子およ
びアルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または1個またはそれ以
上の短鎖ヘテロ原子または複素環式ヌクレオシド間結合によって形成されるバッ
クボーンを有する。これらには、モルホリノ結合を有するもの（ヌクレオシドの
糖部分から一部分形成される）；シロキサンバックボーン；スルフィド、スルホ
キシドおよびスルホンバックボーン；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル
バックボーン；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチルバックボーン
；アルケン含有バックボーン；スルファメートバックボーン；メチレンイミノお
よびメチレンヒドラジノバックボーン；スルホネートおよびスルホンアミドバッ
クボーン；アミドバックボーン；および混合成分部分N、O、SおよびCH₂を有する
他のものが含まれる。

【００２８】 上のオリゴヌクレオシドの製造を示す代表的な米国特許には、本明細書中にそ
れぞれ援用されるU.S.：5,034,506号；5,166,315号；5,185,444号；5,214,134号
；5,216,141号；5,235,033号；5,264,562号；5,264,564号；5,405,938号；5,434
,257号；5,466,677号；5,470,967号；5,489,677号；5,541,307号；5,561,225号
；5,596,086号；5,602,240号；5,610,289号；5,602,240号；5,608,046号；5,610
,289号；5,618,704号；5,623,070号；5,663,312号；5,633,360号；5,677,437号
；および5,677,439号が含まれるが、これらに制限されるわけではない。

【００２９】 他の好ましいオリゴヌクレオチド模擬体において、ヌクレオチド単位の糖およ
びヌクレオシド間結合、すなわちバックボーンは両方とも、新規な基で置き換え
られている。塩基単位は、適当な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションの
ために維持される。優れたハイブリッド形成性を有することが示されているオリ
ゴヌクレオチド模擬体である一つのこのようなオリゴマー化合物は、ペプチド核
酸（PNA）と称される。PNA化合物において、オリゴヌクレオチドの糖-バックボ
ーンは、アミド含有バックボーン、特に、アミノエチルグリシンバックボーンで
置き換えられている。ヌクレオ塩基は保持され、バックボーンのアミド部分のア
ザ窒素原子に直接的にまたは間接的に結合している。PNA化合物の製造を示す代
表的な米国特許には、本明細書中にそれぞれ援用されるU.S.：5,539,082号；5,7
14,331号；および5,719,262号が含まれるが、これらに制限されるわけではない
。PNA化合物についての更に別の教示は、Nielsenら、Science, 1991, 254, 1497
-1500 で見出されうる。

【００３０】 本発明の最も好ましい実施態様は、ホスホロチオエートバックボーンを含むオ
リゴヌクレオチドおよびヘテロ原子バックボーンを含むオリゴヌクレオシド、特
に、上に挙げられた米国特許第5,489,677号の-CH₂-NH-O-CH₂-、-CH₂-N（CH₃）-O
-CH₂-［メチレン（メチルイミノ）またはMMIバックボーンとして知られる］、-C
H₂-O-N（CH₃）-CH₂-、-CH₂-N（CH₃）-N（CH₃）-CH₂-および-O-N（CH₃）-CH₂-CH₂ -［式中、天然のホスホジエステルバックボーンは、-O-P-O-CH₂-として示される
］、および上に挙げられた米国特許第5,602,240号のアミドバックボーンである
。更に好ましいのは、上に挙げられた米国特許第5,034,506号のモルホリノバッ
クボーン構造を有するオリゴヌクレオチドである。

【００３１】 修飾オリゴヌクレオチドは、1個またはそれ以上の置換された糖部分を含有し
てもよい。好ましいオリゴヌクレオチドは、次の内の一つを2'位に含む：OH；F
；O-、S-またはN-アルキル；O-、S-またはN-アルケニル；O-、S-またはN-アルキ
ニル；O-アルキル-O-アルキル（但し、アルキル、アルケニルおよびアルキニル
は、置換または非置換のC₁〜C₁₀アルキルまたはC₂〜C₁₀アルケニルおよびアルキ
ニルであってよい）。特に好ましいのは、O［（CH₂）_nO］_mCH₃、O（CH₂）_nOCH₃
、O（CH₂）_nNH₂、O（CH₂）_nCH₃、O（CH₂）_nONH₂およびO（CH₂）_nON［（CH₂）_nCH ₃ ）］₂であり、ここにおいて、nおよびmは1〜約10である。他の好ましいオリゴ
ヌクレオチドは、次の内の一つを2'位に含む。C₁〜C₁₀低級アルキル、置換低級
アルキル、アルカリール、アラルキル、O-アルカリールまたはO-アラルキル、SH
、SCH₃、OCN、Cl、Br、CN、CF₃、OCF₃、SOCH₃、SO₂CH₃、ONO₂、NO₂、N₃、NH₂、
ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポ
リアルキルアミノ、置換シリル、RNA切断基、リポーター基、インターカレータ
ー、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的性質を向上させる基またはオリゴヌクレ
オチドの薬力学的性質を向上させる基、および同様の性質を有する他の置換基。
好ましい修飾には、2'-メトキシエトキシ（2'-O-CH₂CH₂OCH₃、2'-O-（2-メトキ
シエチル）または2'-MOEとしても知られる）（Martinら、Helv.Chim.Acta, 1995
, 78, 486-504）、すなわち、アルコキシアルコキシ基が含まれる。更に好まし
い修飾には、本出願と共通に所有されそして本明細書中にその内容が援用される
、1998年1月30日出願の米国特許出願第09／016,520号に記載の2'-ジメチルアミ
ノオキシエトキシ、すなわち、2'-DMAOEとしても知られる基O（CH₂）₂ON（CH₃） ₂ が含まれる。

【００３２】 他の好ましい修飾には、2'-メトキシ（2'-O-CH₃）、2'-アミノプロポキシ（2'
-OCH₂CH₂CH₂NH₂）および2'-フルオロ（2'-F）が含まれる。同様の修飾は、オリ
ゴヌクレオチド上の他の位置、特に、3'末端ヌクレオチド上または2'-5'結合オ
リゴヌクレオチド中の糖の3'位、および5'末端ヌクレオチドの5'位で行われても
よい。オリゴヌクレオチドは、ペントフラノシル糖の代わりに、シクロブチル残
基のような糖模擬体を有してもよい。このような修飾された糖構造の製造を示す
代表的な米国特許には、本明細書中にそれぞれ援用されるU.S.：4,981,957号；5
,118,800号；5,319,080号；5,359,044号；5,393,878号；5,446,137号；5,466,78
6号；5,514,785号；5,519,134号；5,567,811号；5,576,427号；5,591,722号；5,
597,909号；5,610,300号；5,627,053号；5,639,873号；5,646,265号；5,658,873
号；5,670,633号；および5,700,920号が含まれるが、これらに制限されるわけで
はない。

【００３３】 オリゴヌクレオチドには、ヌクレオ塩基（当該技術分野において、しばしば、
簡単に“塩基”と称される）の修飾または置換も含まれうる。本明細書中で用い
られる“非修飾”または“天然の”ヌクレオ塩基には、プリン塩基アデニン（A
）およびグアニン（G）、およびピリミジン塩基チミン（T）、シトシン（C）お
よびウラシル（U）が含まれる。修飾ヌクレオ塩基には、5-メチルシトシン（5-M
e-C）、5-ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、2-アミノ
アデニン、アデニンおよびグアニンの6-メチルおよび他のアルキル誘導体、アデ
ニンおよびグアニンの2-プロピルおよび他のアルキル誘導体、2-チオウラシル、
2-チオチミンおよび2-チオシトシン、5-ハロウラシルおよびシトシン、5-プロピ
ニルウラシルおよびシトシン、6-アゾウラシル、シトシンおよびチミン、5-ウラ
シル（プソイドウラシル）、4-チオウラシル、8-ハロ、8-アミノ、8-チオール、
8-チオアルキル、8-ヒドロキシルおよび他の8-置換アデニンおよびグアニン、5-
ハロ、特に、5-ブロモ、5-トリフルオロメチルおよび他の5-置換ウラシルおよび
シトシン、7-メチルグアニンおよび7-メチルアデニン、8-アザグアニンおよび8-
アザアデニン、7-デアザグアニンおよび7-デアザアデニン、および3-デアザグア
ニンおよび3-デアザアデニンのような他の合成および天然のヌクレオ塩基が含ま
れる。更に別のヌクレオ塩基には、米国特許第3,687,808号に開示されたもの、T
he Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, 858-859頁、K
roschwitz, J.I. 監修、John Wiley & Sons, 1990 に開示されたもの、Englisch
ら、Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613 によって開示
されたもの、および Sanghvi, Y.S., Crooke, S.T. および Lebleu, B. 監修、A
ntisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp.289-
302 によって開示されたものが含まれる。これらヌクレオ塩基のいくつかは、本
発明のオリゴマー化合物の結合親和性を増加させるのに特に有用である。これら
には、2-アミノプロピルアデニン、5-プロピニルウラシルおよび5-プロピニルシ
トシンを含めた、5-置換ピリミジン、6-アザピリミジン、およびN-2、N-6および
O-6置換プリンが含まれる。5-メチルシトシン置換は、核酸二重らせん安定性を0
.6〜1.2℃だけ増加させることが分かっており（Sanghvi, Y.S., Crooke, S.T.
および Lebleu, B. 監修、Antisense Research and Applications, CRC Press,
Boca Raton, 1993, pp.276-278）、現在のところ、好ましい塩基置換であり、特
に、2'-O-メトキシエチル糖修飾と組み合わされた場合、より一層好ましい。

【００３４】 上記の修飾ヌクレオ塩基並びに他の修飾ヌクレオ塩基のいくつかの製造を示す
代表的な米国特許には、本明細書中にそれぞれ援用されるU.S.：3,687,808号；4
,845,205号；5,130,302号；5,134,066号；5,175,273号；5,367,066号；5,432,27
2号；5,457,187号；5,459,255号；5,484,908号；5,502,177号；5,525,711号；5,
552,540号；5,587,469号；5,594,121号；5,596,091号；5,614,617号；5,681,941
号；および5,750,692号が含まれるが、これらに制限されるわけではない。

【００３５】 本発明のオリゴヌクレオチドのもう一つの修飾には、オリゴヌクレオチドの活
性、細胞分布または細胞取込みを増加させる一つまたはそれ以上の部分または結
合体をオリゴヌクレオチドに化学的に結合することが含まれる。このような部分
には、コレステロール部分のような脂質部分（Letsingerら、Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA, 1989, 86, 6553-6556）、コール酸（Manoharanら、Bioorg.Med.Chem.Let
., 1994, 4, 1053-1060）、チオエーテル、例えば、ヘキシル-S-トリチルチオー
ル（Manoharanら、Ann.N.Y.Acad.Sci., 1992, 660, 306-309；Manoharanら、Bio
org.Med.Chem.Let., 1993, 3, 2765-2770）、チオコレステロール（Oberhauser
ら、Nucl.Acids Res., 1992, 20, 533-538）、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオ
ールまたはウンデシル残基（Saison-Behmoarasら、EMBO J., 1991, 10, 1111-11
18；Kabanovら、FEBS Lett., 1990, 259, 327-330；Svinarchukら、Biochimie,
1993, 75, 49-54）、リン脂質、例えば、ジヘキサデシル-rac-グリセロールまた
は1,2-ジ-O-ヘキサデシル-rac-グリセロ-3-H-リン酸トリエチルアンモニウム（M
anoharanら、Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654；Sheaら、Nucl.Acids R
es., 1990, 18, 3777-3783）、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖（Ma
noharanら、Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969-973）、またはアダマ
ンタン酢酸（Manoharanら、Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654）、パル
ミチル部分（Mishraら、Biochim.Biophys.Acta, 1995, 1264, 229-237）、また
はオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノカルボニルオキシコレステロール部
分（Crookeら、J.Pharmacol.Exp.Ther., 1996, 277, 923-937）が含まれるが、
これらに制限されるわけではない。

【００３６】 このようなオリゴヌクレオチド結合体の製造を示す代表的な米国特許には、本
明細書中にそれぞれ援用されるU.S.：4,828,979号；4,948,882号；5,218,105号
；5,525,465号；5,541,313号；5,545,730号；5,552,538号；5,578,717号；5,580
,731号；5,580,731号；5,591,584号；5,109,124号；5,118,802号；5,138,045号
；5,414,077号；5,486,603号；5,512,439号；5,578,718号；5,608,046号；4,587
,044号；4,605,735号；4,667,025号；4,762,779号；4,789,737号；4,824,941号
；4,835,263号；4,876,335号；4,904,582号；4,958,013号；5,082,830号；5,112
,963号；5,214,136号；5,082,830号；5,112,963号；5,214,136号；5,245,022号
；5,254,469号；5,258,506号；5,262,536号；5,272,250号；5,292,873号；5,317
,098号；5,371,241号；5,391,723号；5,416,203号；5,451,463号；5,510,475号
；5,512,667号；5,514,785号；5,565,552号；5,567,810号；5,574,142号；5,585
,481号；5,587,371号；5,595,726号；5,597,696号；5,599,923号；5,599,928号
；および5,688,941号が含まれるが、これらに制限されるわけではない。

【００３７】 ある与えられる化合物中の全ての位置が均一に修飾されている必要はなく、実
際上、前述の修飾の二つ以上が、一つの化合物中に、またはオリゴヌクレオチド
中の一つのヌクレオシドにさえも包含されうる。本発明は、キメラな化合物であ
るアンチセンス化合物も包含する。本発明の文脈中、“キメラな”アンチセンス
化合物または“キメラ”は、アンチセンス化合物、特に、オリゴヌクレオチドで
あって、少なくとも一つのモノマー単位、すなわち、オリゴヌクレオチド化合物
の場合はヌクレオチド、からそれぞれ成る二つまたはそれ以上の化学的に異なっ
た領域を含有するものである。これらオリゴヌクレオチドは、典型的に、増加し
たヌクレアーゼ分解耐性、増加した細胞取込み、および／または標的核酸への増
加した結合親和性をオリゴヌクレオチドに与えるようにオリゴヌクレオチドが修
飾される少なくとも一つの領域を含有する。オリゴヌクレオチドの追加の領域は
、RNA：DNAまたはRNA：RNAハイブリッドを切断することができる酵素の基質とし
て役立ちうる。例として、RNase Hは、RNA：DNA二重鎖のRNA鎖を切断する細胞エ
ンドヌクレアーゼである。したがって、RNase Hの活性化は、RNA標的の切断を生
じさせ、それによって、遺伝子発現のオリゴヌクレオチド阻害効率を大きく増加
させる。その結果として、キメラなオリゴヌクレオチドを用いた場合、同じ標的
領域にハイブリッド形成するホスホロチオエートデオキシオリゴヌクレオチドと
比較して、しばしば、より短いオリゴヌクレオチドを用いて同様の結果を得るこ
とができる。RNA標的の切断は、日常的に、ゲル電気泳動によって、そして必要
ならば、当該技術分野において知られている関連する核酸ハイブリダイゼーショ
ン技術によって検出することができる。

【００３８】 本発明のキメラなアンチセンス化合物は、上記のようなオリゴヌクレオチド、
修飾オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシドおよび／またはオリゴヌクレオチ
ド模擬体の二つまたはそれ以上の複合構造として形成されうる。このような化合
物は、当該技術分野において、ハイブリッドまたはギャップマー（gapmers）と
も称されている。このようなハイブリッド構造の製造を示す代表的な米国特許に
は、本明細書中にそれぞれ援用されるU.S.：5,013,830号；5,149,797号；5,220,
007号；5,256,775号；5,366,878号；5,403,711号；5,491,133号；5,565,350号；
5,623,065号；5,652,355号；5,652,356号；および5,700,922号が含まれるが、こ
れらに制限されるわけではない。

【００３９】 本発明によって用いられるアンチセンス化合物は、好都合にそして日常的に、
周知の固相合成技術によって製造されうる。このような合成のための装置は、例
えば、Applied Biosystems（フォスター・シティー、CA）を含めたいくつかの業
者によって販売されている。当該技術分野において知られているこのような合成
のためのいずれの他の手段も、更にまたは代わりに用いることができる。ホスホ
ロチオエートおよびアルキル化誘導体のようなオリゴヌクレオチドを製造するの
に同様の技術を用いることは周知である。

【００４０】 本発明のアンチセンス化合物は、in vitro で合成されるので、生物学的起源
のアンチセンス組成物も、アンチセンス分子の in vivo合成を指示するように設
計される遺伝子ベクター構築物も含まない。

【００４１】 本発明の化合物は、取込み、分布および／または吸収を助けるための、例えば
、リポソーム、受容体を標的とする分子、経口用、直腸用、局所用または他の製
剤のような他の分子、分子構造または化合物の混合物と混合され、カプセル封入
され、抱合されまたはそれ以外の方法で一緒にされてもよい。取込み、分布およ
び／または吸収を助けるこのような製剤の製造を示す代表的な米国特許には、本
明細書中にそれぞれ援用されるU.S.：5,108,921号；5,354,844号；5,416,016号
；5,459,127号；5,521,291号；5,543,158号；5,547,932号；5,583,020号；5,591
,721号；4,426,330号；4,534,899号；5,013,556号；5,108,921号；5,213,804号
；5,227,170号；5,264,221号；5,356,633号；5,395,619号；5,416,016号；5,417
,978号；5,462,854号；5,469,854号；5,512,295号；5,527,528号；5,534,259号
；5,543,152号；5,556,948号；5,580,575号；および5,595,756号が含まれるが、
これらに制限されるわけではない。

【００４２】 本発明のアンチセンス化合物は、ヒトを含めた動物への投与の際に、生物学的
に活性な代謝産物またはその残基を（直接的にまたは間接的に）与えることがで
きるいずれかの薬学的に許容しうる塩、エステルまたはこのようなエステルの塩
、またはいずれかの他の化合物を包含する。したがって、例えば、本開示は、本
発明の化合物のプロドラッグおよび薬学的に許容しうる塩、このようなプロドラ
ッグの薬学的に許容しうる塩、および他の生物学的等価物にも向けさせる。

【００４３】 “プロドラッグ”という用語は、生体中またはその細胞中において内因性酵素
または他の化学物質および／または条件の作用によって活性型（すなわち、薬物
）に変換される不活性型で製造される治療薬を示す。特に、本発明のオリゴヌク
レオチドのプロドラッグ型は、WO93／24510号またはWO94／26764号に開示された
方法にしたがって、SATE［（S-アセチル-2-チオエチル）リン酸］誘導体として
製造される。

【００４４】 “薬学的に許容しうる塩”という用語は、本発明の化合物の生理学的にそして
薬学的に許容しうる塩、すなわち、親化合物の所望の生物学的活性を保持しそし
てそれに望ましくない毒物学的作用を与えない塩を意味する（例えば、Bergeら
、“Pharmaceutical Salts, ”J.of Pharma Sci., 1977, 66, 1-19 を参照され
たい）。

【００４５】 オリゴヌクレオチドに関する薬学的に許容しうる塩の好ましい例には、（a）
ナトリウム、カリウム、アンモニウム、マグネシウム、カルシウム、スペルミン
およびスペルミジンなどのポリアミン等のような陽イオンを用いて形成される塩
；（b）無機酸、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸等を用いて形
成される酸付加塩；（c）有機酸、例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸
、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、
安息香酸、タンニン酸、パルミチン酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタ
レンスルホン酸、メタンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、ナフタレンジスル
ホン酸、ポリガラクツロン酸等を用いて形成される塩；および（d）塩素、臭素
およびヨウ素のような元素陰イオンから形成される塩が含まれるが、これらに制
限されるわけではない。

【００４６】 本発明のアンチセンス化合物は、診断薬、治療薬、予防薬に、および研究用試
薬およびキットとして利用することができる。治療薬については、TRAFファミリ
ーの一つまたはそれ以上のメンバーの発現を調節することによって治療すること
ができる疾患または障害を有することが疑われる動物、好ましくは、ヒトを、本
発明にしたがってアンチセンス化合物を投与することによって治療する。本発明
の化合物は、有効量のアンチセンス化合物を適当な薬学的に許容しうる希釈剤ま
たは担体に加えることによって医薬組成物中で利用することができる。本発明の
アンチセンス化合物の使用および方法は、予防的に、例えば、感染、炎症または
腫瘍形成を、例えば、予防するまたは遅延させるのにも有用でありうる。

【００４７】 本発明のアンチセンス化合物は、一つまたはそれ以上の選択されたTRAFをコー
ドする核酸にこれら化合物がハイブリッド形成するので、研究および診断薬に有
用であり、これを利用するようにサンドイッチ検定および他の検定を容易に組み
立てることができる。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドと、一つまたは
それ以上のTRAFをコードする核酸とのハイブリダイゼーションは、当該技術分野
において知られている手段によって検出することができる。このような手段には
、オリゴヌクレオチドへの酵素の結合、オリゴヌクレオチドの放射性標識または
いずれかの他の適当な検出手段が含まれうる。試料中のTRAFレベルを検出するた
めのこのような検出手段を用いたキットを製造することもできる。

【００４８】 本発明には、本発明のアンチセンス化合物を含む医薬組成物および製剤も含ま
れる。本発明の医薬組成物は、局所治療が望まれるか全身治療が望まれるかによ
っておよび治療される部位によって、多数の方式で投与することができる。投与
は、局所（眼、および膣および直腸内デリバリーを含めた粘膜を含む）、肺、例
えば、ネブライザーを含めた散剤またはエアゾル剤の吸入または吹入による（気
管内、鼻腔内、表皮および経皮）、経口または非経口であってよい。非経口投与
には、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内または筋肉内への注射または注入；または
頭蓋内、例えば、クモ膜下内または脳室内への投与が含まれる。少なくとも一つ
の2'-O-メトキシエチル修飾を含むオリゴヌクレオチドは、経口投与に特に有用
であると考えられる。

【００４９】 局所投与用の医薬組成物および製剤には、経皮パッチ、軟膏剤、ローション剤
、クリーム剤、ゲル剤、滴剤、坐剤、噴霧剤、液状製剤および散剤が含まれうる
。慣用的な医薬担体、水性、粉末または油状の基剤、粘稠化剤等は、必要であり
うるしまたは望まれることがありうる。コーティングコンドーム、グローブ等も
有用でありうる。

【００５０】 経口投与用の組成物および製剤には、散剤または顆粒剤、水中または非水性基
剤中の懸濁剤または液剤、カプセル剤、サシェ剤（sachets）または錠剤が含ま
れる。粘稠化剤、着香剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤または結合剤は、望まれる
ことがありうる。

【００５１】 非経口、クモ膜下内または脳室内への投与用の組成物および製剤には、緩衝剤
、希釈剤、および浸透促進剤、担体化合物および他の薬学的に許容しうる担体ま
たは賦形剤に制限されるわけではないがこのような他の適当な添加剤も含有しう
る滅菌水性液剤が含まれうる。

【００５２】 例えば、本発明のオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物および／または製剤に
は、オリゴヌクレオチドの食餌性供給を促進するために、浸透促進剤が含まれう
る。浸透促進剤は、大まかな五つの種類、すなわち、脂肪酸、胆汁酸塩、キレー
ト化剤、界面活性剤および非界面活性剤の一つに属するように分類することがで
きる（Leeら、Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991,
8, 91-192；Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Syst
ems, 1990, 7, 1-33）。これら大まかな分類の一つまたはそれ以上からの1種類
またはそれ以上の浸透促進剤が含まれうる。

【００５３】 浸透促進剤として作用する種々の脂肪酸およびそれらの誘導体には、例えば、
オレイン酸、ラウリン酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリ
ン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、レシンレエー
ト（recinleate）、モノオレイン（1-モノオレオイル-rac-グリセロールとして
も知られる）、ジラウリン、カプリル酸、アラキドン酸、1-モノカプリン酸グリ
セリン、1-ドデシルアザシクロヘプタン-2-オン、アシルカルニチン、アシルコ
リン、モノ-およびジグリセリド、およびそれらの生理学的に許容しうる塩（す
なわち、オレイン酸塩、ラウリン酸塩、カプリン酸塩、ミリスチン酸塩、パルミ
チン酸塩、ステアリン酸塩、リノール酸塩等）が含まれる（Leeら、Critical Re
views in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, 8, 2, 91-192；Muranishi
, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1, 1-33
；El-Haririら、J.Pharm.Pharmacol., 1992, 44, 651-654）。現在のところ好ま
しい若干の脂肪酸の例は、0.5〜5％の濃度で単独にまたは組合せで用いられるカ
プリン酸ナトリウムおよびラウリン酸ナトリウムである。

【００５４】 胆汁の生理学的役割には、脂質および脂溶性ビタミン類の分散および吸収の促
進が含まれる（Brunton, Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of T
herapeutics, 第9版の第38章、Hardman ら監修、McGraw-Hill, ニューヨーク、N
Y, 1996, 934-935頁）。種々の天然の胆汁酸塩およびそれらの合成誘導体は、浸
透促進剤として作用する。したがって、“胆汁酸塩”という用語には、胆汁の天
然に存在する成分のいずれか、更には、それらの合成誘導体のいずれかが含まれ
る。

【００５５】 本発明のアンチセンス化合物が患者に導入される方法とは無関係に、コロイド
分散系をデリバリービヒクルとして用いて、化合物の in vivo 安定性を増加さ
せることができるし、および／または特定の器官、組織または細胞種類に化合物
を標的化させることができる。コロイド分散系には、高分子複合体、ナノカプセ
ル、ミクロスフェア、ビーズ、および水中油エマルジョン、ミセル、混合ミセル
、リポソームおよび特性決定されていない構造の脂質：オリゴヌクレオチド複合
体を含めた脂質基剤系が含まれるが、これらに制限されるわけではない。好まし
いコロイド分散系は、複数のリポソームである。リポソームは、二層配置で配列
された脂質から成る1層またはそれ以上の外層によって取り囲まれた水性コアを
有する顕微鏡的球体である（概して、Chonnら、Current Op.Biotech., 1995, 6,
698-708 を参照されたい）。

【００５６】 リポソーム製造は、本出願と共通に所有されそして本明細書中に援用される、
1997年10月31日出願の係属米国特許出願第08／961,469号に記載されている。 本発明の特定のの実施態様は、（a）1種類またはそれ以上のアンチセンス化合
物および（b）非アンチセンス機序によって機能する1種類またはそれ以上の他の
化学療法薬を含有するリポソームおよび他の組成物を提供する。他の非アンチセ
ンス化学療法薬も、本発明の範囲内である。2種類またはそれ以上の組み合わさ
れる化合物は、一緒にまたは逐次的に用いることができる。

【００５７】 もう一つの関連の態様において、本発明の組成物は、第一の核酸に標的化する
1種類またはそれ以上のアンチセンス化合物、特に、オリゴヌクレオチド、およ
び第二の核酸標的に標的化する1種類またはそれ以上の追加のアンチセンス化合
物を含有しうる。2種類またはそれ以上の組み合わされる化合物は、一緒にまた
は逐次的に用いることができる。

【００５８】 治療的組成物の製剤化およびそれらに引き続く投与は、当業者の技術の範囲内
であると考えられる。投薬量は、数日間から数ヶ月間、または治癒するまでまた
は疾患状態の軽減が得られるまで継続する治療経過と共に、治療される疾患状態
の重症度および応答性に依る。最適の投薬計画は、患者体内の薬物蓄積の測定値
から計算することができる。当業者は、最適用量、投薬方法および反復率を容易
に決定することができる。最適用量は、個々のオリゴヌクレオチドの相対力価に
よって異なることがありうるが、概して、in vitroおよび in vivoの動物モデル
において有効であると判明したEC₅₀に基づいて算定することができる。概して、
用量は、0.01μg〜100 g／kg体重であり、1日に、1週間に、1ヶ月にまたは1年に
1回またはそれ以上与えられてよいし、または2年〜20年毎に1回でもよい。当業
者は、体液または組織中で測定される薬物の滞留時間および濃度に基づいて、投
薬反復率を容易に算定することができる。治療が成功した後、疾患状態の再発を
防止するために、患者が維持療法を受けていることが望ましいことがあるが、こ
の場合、オリゴヌクレオチドは、0.01μg〜100 g／kg体重の維持量で1日に1回ま
たはそれ以上、20年ごとに1回まで投与される。

【００５９】 本発明をその好ましい実施態様のいくつかによって具体的に記載してきたが、
次の実施例は、発明を単に詳しく説明するためのものであり、発明を制限するた
めのものではない。

【００６０】

【実施例】

実施例1 オリゴヌクレオチド合成のためのヌクレオシドホスホロアミダイト デオキシおよび2'-アルコキシアミダイト 2'-デオキシおよび2'-メトキシベータ-シアノエチルジイソプロピルホスホロ
アミダイトは市販品（例えば、Chemgenes, Needham, MAまたはGlen Research, I
nc. Sterling VA）を購入する。他の2'-O-アルコキシ置換ヌクレオシドアミダイ
トは、参照として本明細書に援用した、米国特許第5,506,351に記載の方法で製
造する。2'-アルコキシアミダイトを使用して合成するオリゴヌクレオチドには
、テトラゾールおよび塩基のパルス送達後の待ち工程が360秒に増加すること以
外は、非修飾オリゴヌクレオチドの標準サイクルを使用する。

【００６１】 5-メチル-2'-デオキシシチジン（5-Me-C）ヌクレオチドを含有するオリゴヌク
レオチドは市販のホスホロアミダイト（Glen Research, Sterling VAまたはChem
Genes, Needham, MA）を使用して、刊行物に記載された方法（Sanghvi, et. al.
, Nucleic Acids Research, 1993, 21, 3197-3203）に従って合成した。

【００６２】 2'-フルオロアミダイト 2'-フルオロデオキシアデノシンアミダイト 2'-フルオロオリゴヌクレオチドは、Kawasaki, et al., J. Med. Chem., 1993
, 36, 831-842および参照として本明細書に援用した、米国特許第5,670,633に以
前記載の方法で製造する。簡単に述べると、保護化ヌクレオシドN6-ベンゾイル-
2'-デオキシ-2'-フルオロアデノシンは、出発物質として市販の9-ベータ-D-アラ
ビノフラノシルアデニンを使用し、2'-アルファ-フルオロ原子を2'-ベータ-トリ
チル基のS_N2-置換により導入する文献の方法を修整して合成する。このようにし
て、N6-ベンゾイル-9-ベータ-D-アラビノフラノシルアデニンを選択的に3',5'-
ジテトラヒドロピラニル（THP）中間体として適度の収率で保護化する。THPおよ
びN6-ベンゾイル基の脱保護化は標準方法論を使用して行い、標準法を使用して
、5'-ジメトキシトリチル-（DMT）および5'-DMT-3'-ホスホロアミダイト中間体
を得る。

【００６３】 2'-フルオロデオキシグアノシン 2'-デオキシ-2'-フルオログアノシンの合成は、出発物質としてテトライソプ
ロピルジシロキサニル（TPDS）保護化9-ベータ-D-アラビノフラノシルグアニン
を使用して行い、中間体ジイソブチリルアラビノフラノシルグアノシンに変換す
る。TPDS基の脱保護化に続くTHPによるヒドロキシル基の保護化により、ジイソ
ブチリルジ-THP保護化アラビノフラノシルグアニンを得る。選択的O-脱アシル化
およびトリフラート化に続き、粗生成物をフルオリドで処理し、THP基を脱保護
化する。標準方法論を使用して5'-DMTおよび5'-DMT-3'ホスホロアミダイトを得
る。

【００６４】 2'-フルオロウリジン 2'-デオキシ-2'-フルオロウリジンの合成は、2,2'-アンヒドロ-1-ベータ-D-ア
ラビノフラノシルウラシルを70％水素フルオリド-ピリジンで処理する文献の方
法を修整して行う。標準法を使用して5'-DMTおよび5'-DMT-3'ホスホロアミダイ
トを得る。

【００６５】 2'-フルオロデオキシシチジン 2'-デオキシ-2'-フルオロシチジンは、2'-デオキシ-2'-フルオロウリジンのア
ミノ化により合成し、それに続く選択的保護化によりN4-ベンゾイル-2'-デオキ
シ-2'-フルオロシチジンを得る。標準法を使用して5'-DMTおよび5'-DMT-3'ホス
ホロアミダイトを得る。

【００６６】 2'-O-（2-メトキシエチル）修飾アミダイト 2'-O-メトキシエチル-置換ヌクレオシドアミダイトは以下に従って、またはか
わりにMartin, P., Helvetica Chimica Acta, 1995, 78, 486-504の方法により
製造した。

【００６７】 2,2'-アンヒドロ［1-（ベータ-D-アラビノフラノシル）-5-メチルウリジン 5-メチルウリジン（リボシルチミン、Yamasa, Choshi, Japanから市販）（72.
0 g、0.279 M）、ジフェニルカーボネート（90.0 g、0.420 M）および炭酸水素
ナトリウム（2.0 g、0.024 M）をDMF（300 mL）に添加した。混合物を攪拌しな
がら加熱還流し、調節下で遊離された二酸化炭素を放出させた。1時間後、わず
かに褐色を帯びた溶液を減圧下で濃縮した。得られたシロップを攪拌しながら、
ジエチルエーテル（2.5 L）に注いだ。生成物はゴム状物を形成した。エーテル
をデカンテーションし、残渣を最少量のメタノール（約400 mL）で溶解した。溶
液を新鮮なエーテル（2.5 L）に注ぎ、硬いゴム状物を得た。エーテルをデカン
テーションし、ゴム状物を真空オーブンで乾燥（60℃、1 mmHg、24時間）して固
体を得て、それを粉砕して明黄褐色粉末にした（57 g、85％粗収量）。NMRスペ
クトルは構造と一致し、ナトリウム塩としてのフェノールが混在していた（約5
％）。生成物は別の反応に使用した（または酢酸エチル中のメタノールグラジエ
ント（10〜25％）を使用したカラムクロマトグラフィーによりさらに精製し、白
色固体、mp222〜4℃を得た）。

【００６８】 2'-O-メトキシエチル-5-メチルウリジン 2,2'-アンヒドロ-5-メチルウリジン（195 g、0.81 M）、トリス（2-メトキシ
エチル）ボレート（231 g、0.98 M）および2-メトキシエタノール（1.2 L）を2
Lステンレス製圧力容器に添加し、160℃に予熱した油浴に置いた。155〜160℃で
48時間加熱後、容器を開き、溶液を蒸発させて乾燥し、MeOH（200 mL）で粉砕し
た。残渣は熱アセトン（1 L）に懸濁した。不溶性の塩をろ過し、アセトン（150
mL）で洗浄し、ろ液を蒸発させた。残渣（280 g）をCH₃CN（600 mL）に溶解し
、蒸発させた。シリカゲルカラム（3 kg）を、0.5％Et₃NHを含むCH₂Cl₂／アセト
ン／MeOH（20：5：3）でパッキングした。残渣をCH₂Cl₂（250 mL）に溶解し、カ
ラムに乗せる前にシリカ（150 g）に吸着させた。生成物をパッキング溶媒で溶
出し、生成物160 g（63％）を得た。不純な画分を精製することにより、さらに
生成物を得た。

【００６９】 2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルウリジン 2'-O-メトキシエチル-5-メチルウリジン（160 g、0.506 M）をピリジン（250
mL）とともに蒸発させ、乾燥した残渣をピリジン（1.3 L）に溶解した。ジメト
キシトリチルクロリド（94.3 g、0.278 M）の初めのアリコートを添加し、混合
物を室温で1時間攪拌した。ジメトキシトリチルクロリド（94.3 g、0.278 M）の
2番目のアリコートを添加し、反応物をさらに1時間攪拌した。続いてメタノール
（170 mL）を添加し、反応を停止した。HPLCは約70％の生成物の存在を示した。
溶媒を蒸発させ、CH₃CN（200 mL）で粉砕した。残渣をCHCl₃（1.5 L）に溶解し
、2×500 mLの飽和NaHCO₃および2×500 mLの飽和NaClで抽出した。有機相をNa₂S
O₄で乾燥、ろ過し、蒸発させた。残渣を0.5％Et₃NHを含むEtOAc／ヘキサン／ア
セトン（5：5：1）でパッキングした、3.5 kgシリカゲルカラムで精製した。純
粋な画分を蒸発させ、生成物164 gを得た。不純な画分からさらに約20 gを得て
、総収量183 g（57％）を得た。

【００７０】 3'-O-アセチル-2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルウリ
ジン 2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルウリジン（106 g、0
.167 M）、DMF／ピリジン（562 mL DMFおよび188 mLピリジンから調製した3：1
混合物750 mL）および無水酢酸（24.38 mL、0.258 M）を合わせ、室温で24時間
攪拌した。反応物はMeOHの添加によりtlcサンプルを初めに反応停止させること
により、tlcでモニターした。tlcで判断した反応完了時に、MeOH（50 mL）を添
加し、混合物を35℃で蒸発させた。残渣をCHCl₃（800 mL）に溶解し、2×200 mL
の飽和炭酸水素ナトリウムおよび2×200 mLの飽和NaClで抽出した。水相はCHCl₃ 200 mLで逆抽出した。合わせた有機相を硫酸ナトリウムで乾燥、蒸発させて残
渣122 g（約90％生成物）を得た。残渣を3.5 kgシリカゲルカラムで精製し、EtO
Ac／ヘキサン（4：1）を使用して溶出した。純生成物画分を蒸発させて96 g（84
％）を得た。その後の画分からさらに1.5 gを回収した。

【００７１】 3'-O-アセチル-2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチル-4-
トリアゾールウリジン 第一の溶液は3'-O-アセチル-2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-
5-メチルウリジン（96 g、0.144 M）をCH₃CN（700 mL）に溶解することにより調
製し、取っておく。トリエチルアミン（189 mL、1.44 M）をCH₃CN（1 L）中のト
リアゾール（90 g、1.3 M）溶液に添加し、-5℃に冷却し、オーバーヘッドスタ
ーラーを使用して0.5時間攪拌した。POCl₃を0〜10℃に保った攪拌溶液に30分か
けて滴下して加え、得られた混合物をさらに2時間攪拌した。第一の溶液を後者
の溶液に45分かけて滴下して加えた。得られた反応混合物は低温室に一晩置いた
。塩類を反応混合物からろ過し、溶液を蒸発させた。残渣をEtOAc（1 L）に溶解
し、不溶性の固体をろ過により除去した。ろ液を1×300 mLのNaHCO₃および2×30
0 mLの飽和NaClで洗浄、硫酸ナトリウムで乾燥、蒸発させた。残渣をEtOAcで粉
砕し、標題化合物を得た。

【００７２】 2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルシチジン ジオキサン（500 mL）およびNH₄OH（30 mL）中の3'-O-アセチル-2'-O-メトキ
シエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチル-4-トリアゾールウリジン（103 g
、0.141 M）溶液を室温で2時間攪拌した。ジオキサン溶液を蒸発させ、残渣をMe
OH（（2×200 mL）と共沸した。残渣をMeOH（300 mL）で溶解し、2 Lステンレス
製圧力容器に移した。NH₃ガスで飽和したMeOH（400 mL）を添加し、容器を100℃
で2時間加熱した（tlcは完全な変換を示した）。容器内容物を蒸発乾固し、残渣
をEtOAc（500 mL）に溶解し、飽和NaCl（200 mL）で1回洗浄した。有機物は硫酸
ナトリウムで乾燥し、溶媒を蒸発させて標題化合物85 g（95％）を得た。

【００７３】 N4-ベンゾイル-2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルシチ
ジン 2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルシチジン（85 g、0.
134 M）をDMF（800 mL）に溶解し、無水安息香酸（37.2 g、0.165 M）を攪拌し
ながら添加した。混合物は3時間攪拌した（tlcは反応の約95％完了を示した）。
溶媒を蒸発させ、残渣をMeOH（200 mL）とともに共沸した。続いて残渣をCHCl₃
（700 mL）に溶解し、飽和NaHCO₃（2×300 mL）および飽和NaCl（2×300 mL）で
抽出、MgSO₄で乾燥、蒸発させて、残渣（96 g）を得た。残渣は、溶離液として0
.5％Et₃NHを含むEtOAc／ヘキサン（1：1）を使用して1.5 kgシリカカラムのクロ
マトグラフィーにかけた。純粋な生成物画分を蒸発させ、標題化合物90 g（90％
）を得た。

【００７４】 N4-ベンゾイル-2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルシチ
ジン-3'-アミダイト N4-ベンゾイル-2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルシチ
ジン（74 g、0.10 M）はCH₂Cl₂（1 L）に溶解した。窒素雰囲気下で、テトラゾ
ールジイソプロピルアミン（7.1 g）および2-シアノエトキシ-テトラ-（イソプ
ロピル）亜リン酸塩（40.5 mL、0.123 M）を攪拌しながら添加した。得られた混
合物を室温で20時間攪拌した（tlcは反応が95％完了したことを示した）。反応
混合物は、飽和NaHCO₃（1×300 mL）および飽和NaCl（3×300 mL）で抽出した。
水性洗浄液をCH₂Cl₂（300 mL）で逆抽出し、抽出物を合わせ、MgSO₄で乾燥し、
濃縮した。得られた残渣を、溶離液としてEtOAc／ヘキサン（3：1）を使用した1
.5 kgシリカカラムのクロマトグラフィーにかけた。純粋な画分を合わせ、標題
化合物90.6 g（87％）を得た。

【００７５】 2'-（アミノオキシエチル）ヌクレオシドアミダイトおよび2'-（ジメチルアミ
ノオキシエチル）ヌクレオシドアミダイト アミノオキシエチルおよびジメチルアミノオキシエチルアミダイトは、本明細
書中に参照としてそれぞれ援用した、1998年、2月14日に出願された米国特許出
願第10／037,143号、および1998年1月30日に出願された第09／016,520に記載の
方法により製造する。

【００７６】 実施例2 オリゴヌクレオチド合成 非置換および置換ホスホジエステル（P＝O）オリゴヌクレオチドはヨウ素で酸
化する標準ホスホロアミダイト化学を使用して自動DNAシンセサイザー（Applied
Biosystems model 380B）で合成する。

【００７７】 ホスホロチオエート（P＝S）は、亜リン酸結合の逐次チア化のために、標準酸
化ボトルをアセトニトリル中の3H-1,2-ベンゾジチオール-3-オン1,1-ジオキシド
の0.2 M溶液に交換する以外はホスホジエステルオリゴヌクレオチドと同様に合
成した。チア化待ち工程を68秒に増加し、キャッピング工程を続けた。オリゴヌ
クレオチドをCPGカラムから切り離し、濃縮水酸化アンモニウム中、55℃（18時
間）で脱ブロック化後、0.5 M NaCl溶液から2.5容量のエタノールで2回沈殿させ
ることにより精製した。

【００７８】 ホスフィネートオリゴヌクレオチドは、本明細書中に参照として援用した、米
国特許第5,508,270号に記載の方法により製造する。 アルキルホスホネートオリゴヌクレオチドは、本明細書中に参照として援用し
た、米国特許第4,469,863号に記載の方法により製造する。

【００７９】 3'-デオキシ-3'-メチレンホスホネートオリゴヌクレオチドは、本明細書中に
参照として援用した、米国特許第5,610,289号または、第5,625,050号に記載の方
法により製造する。

【００８０】 ホスホロアミダイトオリゴヌクレオチドは、本明細書中に参照として援用した
、米国特許第5,256,775号または、第5,366,879号に記載の方法により製造する。 アルキルホスホールチオエートオリゴヌクレオチドは、本明細書中に参照とし
て援用した、国際公開されたPCT出願PCT／US94／00902およびPCT／US93／06976
（それぞれPCT公開公報WO94／17093およびWO94／0222499）に記載の方法により
製造する。

【００８１】 3'-デオキシ-3'-アミノホスホールアミダイトオリゴヌクレオチドは、本明細
書中に参照として援用した、米国特許第5,476,925号に記載の方法により製造す
る。

【００８２】 ホスホトリエステルオリゴヌクレオチドは、本明細書中に参照として援用した
、米国特許第5,023,243号に記載の方法により製造する。 ボラノホスフェートオリゴヌクレオチドは、本明細書中に参照として援用した
、米国特許第5,130,302号または、第5,177,198号に記載の方法により製造する。

【００８３】 実施例3 オリゴヌクレオシド合成 メチレンメチルイミノ結合オリゴヌクレオシド（またはMMI結合オリゴヌクレ
オシドと同一）、メチレンジメチルヒドラゾ結合オリゴヌクレオシド（またはMD
Hオリゴヌクレオシドと同一）、メチレンカルボニルアミノ結合オリゴヌクレオ
シド（またはアミド-3結合オリゴヌクレオシドと同一）、およびメチレンアミノ
カルボニル結合オリゴヌクレオシド（またはアミド-4-結合オリゴヌクレオシド
と同一）は、例えばMMIおよびP＝OまたはP＝S結合を交互に持つ混合バックボー
ン化合物と同様に、すべてを本明細書中に参照として援用した、米国特許第5,37
8,825号、5,386,023号、5,489,677号、5,602,240号、および第5,610,289号に記
載の方法により製造する。

【００８４】 ホルムアセタールおよびチオホルムアセタール結合オリゴヌクレオシドは、本
明細書中に参照として援用した、米国特許第5,264,562号および、第5,264,564号
に記載の方法により製造する。

【００８５】 エチレンオキシド結合オリゴヌクレオシドは、本明細書中に参照として援用し
た、米国特許第5,223,618号に記載の方法により製造する。 実施例4 PNA合成 ペプチド核酸（PNAs）はPeptide Nucleic Acids（PNA）：Synthesis, Propert
ies and Potential Applications, Bioorganic＆Medicinal Chemistry, 1996, 4
, 5-23に引用された各種の方法のいずれかに従って製造する。それらはまた、本
明細書中に参照として援用した、米国特許第5,539,082号、第5,700,922号および
、第5,719,262号に記載の方法に従って製造できる。

【００８６】 実施例5 キメラオリゴヌクレオチドの合成 本発明のキメラオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシドまたは混合オリゴヌ
クレオチド／オリゴヌクレオシドはいくつかの異なるタイプであってもよい。こ
れらには、結合ヌクレオシドの“ギャップ”部分が結合ヌクレオシドの5'および
3'“ウイング”部分との間に位置する第一のタイプと、“ギャップ”部分がオリ
ゴマー化合物の3'または5'末端のいずれかに位置する第二の“オープンエンド”
タイプが含まれる。第一のタイプのオリゴヌクレオチドはまた、当技術分野では
“ギャップマー”またはギャップ化オリゴヌクレオチドとして知られている。第
二のタイプのオリゴヌクレオチドはまた、当技術分野では“へミマー”または“
ウイングマー”として知られている。

【００８７】 ［2'-O-Me］--［2'-デオキシ］--［2'-O-Me］キメラホスホロチオエートオリ
ゴヌクレオチド 2'-O-アルキルホスホロチオエートおよび2'-デオキシホスホロチオエートオリ
ゴヌクレオチド部分を持つキメラオリゴヌクレオチドは、上記記載のApplied Bi
osystems自動DNAシンセサイザーモデル380Bを使用して合成する。オリゴヌクレ
オチドは、自動シンセサイザーを使用して合成し、DNA部分のための2'-デオキシ
-5'-ジメトキシトリチル-3'-O-ホスホールアミダイトおよび、5'-および3'-ウィ
ングのための5'-ジメトキシトリチル-2'-O-メチル-3'-O-ホスホールアミダイト
を合成する。標準合成サイクルはテトラゾールおよび塩基送達後の待ち工程を60
0秒に増加することにより修整し、RNAのために4回、2'-O-メチルのために2回繰
り返した。完全に保護化したオリゴヌクレオチドを担体から切り離し、リン酸基
を室温で一晩、3：1のアンモニア／エタノールで脱保護化し、凍結乾燥して乾燥
する。続いて、メタノールアンモニアで24時間、室温で処理してすべての塩基を
脱保護化し、サンプルを再び凍結乾燥して乾燥した。ペレットをTHF中の1 M TBA
Fに室温で24時間再懸濁し、2'部位を脱保護化した。その後、反応を1 M TEAAで
停止し、ロトバック（rotobac）によりサンプルの容量を1／2に減少させ、G25サ
イズ排除カラムで脱塩した。回収したオリゴの収率および純度を、キャピラリー
電気泳動および質量分析法を使用して、分光測光学的に解析する。

【００８８】 ［2'-O-（2-メトキシエチル）］--［2'-デオキシ］--［2'-O-（メトキシエチ
ル）］キメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチド ［2'-O-（2-メトキシエチル）］--［2'-デオキシ］--［2'-O-（メトキシエチ
ル）］キメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、2'-O-メチルアミダイ
トを2'-O-（メトキシエチル）アミダイトで置換することにより、2'-O-メチルキ
メラオリゴヌクレオチドのための上記の方法により製造した。

【００８９】 ［2'-O-（2-メトキシエチル）ホスホジエステル］--［2'-デオキシホスホロチ
オエート］--［2'-O-（メトキシエチル）ホスホジエステル］キメラオリゴヌク
レオチド ［2'-O-（2-メトキシエチル）ホスホジエステル］--［2'-デオキシホスホロチ
オエート］--［2'-O-（メトキシエチル）ホスホジエステル］キメラオリゴヌク
レオチドは、2'-O-メチルアミダイトを2'-O-（メトキシエチル）アミダイトで置
換することによる2'-O-メチルキメラオリゴヌクレオチドのための上記の方法、
キメラ構造のウィング部分内にホスホジエステルヌクレオチド間結合を生成する
ためのヨウ素による酸化、およびセンターギャップのホスホロチオエートヌクレ
オチド間結合を生成するための3,H-1,2ベンゾジチオール-3-オン1,1ジオキシド
（Beaucage試薬）を使用した硫酸化により製造した。

【００９０】 他のキメラオリゴヌクレオチド、キメラオリゴヌクレオシドおよび混合キメラ
オリゴヌクレオチド／オリゴヌクレオシドは、本明細書中に参照として援用した
、米国特許第5,623,065号に記載された方法により製造する。

【００９１】 実施例6 オリゴヌクレオチド単離 調節孔ガラスカラム（Applied Biosystems）から切り離し、濃縮水酸化アンモ
ニウム中、55℃で、18時間脱保護化後、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレ
オシドを2.5容量のエタノールにより、0.5 M NaClから2回沈殿させた。合成した
オリゴヌクレオチドを変性ゲル上でポリアクリルアミドゲル電気泳動により解析
し、少なくとも完全長の85％の物質であると判断した。合成で得られたホスホロ
チオエートおよびホスホジエステル結合の相対量は、³¹P核磁気共鳴法により定
期的にチェックし、Chiang et al., J. Biol. Chem. 1991, 266, 18162-18171に
記載されたように、いくつかの研究のためにHPLCでオリゴヌクレオチドを精製す
る。HPLC精製物で得られた結果は非HPLC精製物で得られた結果と同様である。

【００９２】 実施例7 オリゴヌクレオチド合成-96ウェルプレートフォーマット オリゴヌクレオチドは、標準96ウェルプレートフォーマットに同時に96配列を
集めることができる自動シンセサイザー上で固相P（III）ホスホールアミダイト
化学により合成した。ホスホジエステルヌクレオチド間結合は水性ヨウ素による
酸化により得た。ホスホロチオエートヌクレオチド間結合は、無水アセトニトリ
ル中の3,H-1,2ベンゾジチオール-3-オン1,1ジオキシド（Beaucage試薬）を使用
した硫酸化により生成した。標準塩基保護化ベータ-シアノエチルジイソプロピ
ルホスホールアミダイトは市販品（例えば、PE-Applied Biosystems, Foster Ci
ty, CA, またはPharmacia, Piscataway, NJ）を購入した。非標準ヌクレオシド
は既知の文献の方法または特許に係る方法により合成した。それらを塩基保護化
ベータ-シアノエチルジイソプロピルホスホロアミダイトとして使用した。

【００９３】 オリゴヌクレオチドは支持体から切り離し、温度を上げて（55〜60℃）12〜16
時間、濃縮NH₄OHで脱保護化し、遊離した生成物を真空で乾燥した。続いて、乾
燥生成物を滅菌水で再懸濁してマスタープレートを得て、そこからロボットピペ
ッターを使用してすべての解析用および試験用プレートサンプルを希釈した。

【００９４】 実施例8 オリゴヌクレオチド解析-96ウェルプレートフォーマット 各ウェルのオリゴヌクレオチド濃度はサンプルの希釈およびUV吸収により評価
した。個々の生成物の全長完全性は、96ウェルプレートフォーマット（Beckman
P／ACE（登録商標）MDQ）でのキャピラリー電気泳動（CE）により、または個々
に調製したサンプルは市販のCE装置（例えば、Beckman P／ACE（登録商標）5000
, ABI 270）により評価した。塩基およびバックボーン成分はエレクトロスプレ
ー質量分析を使用した化合物の質量分析により確かめた。全アッセイ試験プレー
トは、シングルおよびマルチチャネルロボットピペッターを使用して、マスター
プレートから希釈した。プレート上の化合物の少なくとも85％が少なくとも全長
の85％であるとき、プレートを採用できると判断した。

【００９５】 実施例9 細胞培養およびオリゴヌクレオチド処理 標的核酸発現に対するアンチセンス化合物の作用は、標的核酸が測定可能なレ
ベルで存在すれば、各種細胞のいずれでも試験することができる。これは、例え
ば、PCR、RNase保護試験（RPA）またはノーザンブロット解析により、慣例的に
測定できる。以下の4種の細胞型を説明のために提供するが、他の細胞型も慣例
的に使用する。

【００９６】 T-24細胞： 移行細胞膀胱癌細胞系T-24はAmerican Type Culture Collection（ATCC）（Ma
nassas, VA）から得る。T-24細胞は10％ウシ胎仔血清（Gibco／Life Technologi
es, Gaithersburg, MD）、ペニシリン100ユニット／mL、およびストレプトマイ
シン100μg／mL（Gibco／Life Technologies, Gaithersburg, MD）を補足した完
全McCoy 5A基礎培地で慣例的に培養する。細胞は90％コンフルエントに達したと
き、トリプシン処理および希釈により慣例的に継代する。細胞は、RT-PCR解析の
ために7000細胞／ウェルの密度で、96ウェルプレート（Falcon-Primaria＃3872
）に接種する。

【００９７】 ノーザンブロット法または他の解析のために、細胞を適切な容量の培地および
オリゴヌクレオチドを使用して、100 mmまたは他の標準組織培養平板に接種し、
同様に処理することができる。

【００９８】 A549細胞： ヒト肺癌細胞系A549はAmerican Type Culture Collection（ATCC）（Manassas
, VA）から得る。A549は10％ウシ胎仔血清（Gibco／Life Technologies, Gaithe
rsburg, MD）、ペニシリン100ユニット／mL、およびストレプトマイシン100μg
／mL（Gibco／Life Technologies, Gaithersburg, MD）を補足したDMEM基礎培地
（Gibco／Life Technologies, Gaithersburg, MD）で慣例的に培養する。細胞は
90％コンフルエントに達したとき、トリプシン処理および希釈により継代する。

【００９９】 NHDF細胞： ヒト新生児皮膚線維芽細胞（NHDF）はClonetics Corporation（Walkersville
MD）から得る。NHDFは取り扱い説明書に従って添加したFibroblast Glowth Medi
um（Clonetics Corporation、Walkersville MD）で維持する。細胞は取り扱い説
明書に従って10継代まで維持する。

【０１００】 HEK細胞： ヒト胎児ケラチン生成細胞（HEK）はClonetics Corporation（Walkersville M
D）から得る。HEKsは取り扱い説明書に従って調製したKeratinocyte Glowth Med
ium（Clonetics Corporation、Walkersville MD）で維持する。細胞は取り扱い
説明書に従って10継代まで維持する。

【０１０１】 アンチセンス化合物での処理 細胞は80％コンフルエントに達したとき、オリゴヌクレオチドで処理する。96
-ウェルプレートで増殖した細胞のウェルは、200μL OPTI-MEM（登録商標）-1還
元-血清培地（Gibco BRL）で一度洗浄し、続いて3.75μg／mL LIPOFECTIN（登録
商標）（Gibco BRL）および最終濃度150 nMの所望するオリゴヌクレオチドを含
む130μL OPTI-MEM（登録商標）-1で処理する。処理4時間後、培地を新鮮な培地
と交換する。細胞はオリゴヌクレオチド処理後16時間で回収する。

【０１０２】 実施例10 TRAF発現のオリゴヌクレオチド阻害の解析 TRAF発現のアンチセンスモジュレーションは当技術分野で既知の各種方法によ
りアッセイすることができる。例えば、TRAF mRNAレベルは、例えばノーザンブ
ロット法、RNase保護アッセイ（RPA）、競合的ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、
またはリアルタイムPCR（RT-PCR）により定量することができる。RNA解析は、全
細胞RNAまたはポリ（A）＋mRNAで行うことができる。RNA単離法は例えば、Ausub
el, et al., Current Protocols in Molecular Biology, 第1巻, John Wiley＆S
ons, Inc., 1993, 4.1.1〜4.2.9および4.5.1〜4.5.3ページに記載されている。
ノーザンブロット法は当技術分野で慣例であり、例えば、Ausubel, et al., Cur
rent Protocols in Molecular Biology, 第1巻, John Wiley＆Sons, Inc., 1996
, 4.2.1〜4.2.9に記載されている。リアルタイム定量的（PCR）は、好都合にはP
E-Applied Biosystems, Foster City, CAから市販されているABI PRISM（登録商
標）7700 Sequence Detection Systemを使用して行うことができ、取り扱い説明
書に従って使用できる。他のPCR法も当技術分野で周知である。

【０１０３】 TRAFタンパク質レベルは当技術分野で周知の、例えば、免疫沈降、ウエスタン
ブロット解析（イムノブロッティング）、ELISAまたは蛍光活性セルソーティン
グ（FACS）などの各種方法により定量することができる。TRAFの抗体は同定する
ことが可能で、例えば抗体のMSRSカタログ（Aerie Corporation, Birmingham, M
I）のような各種入手元から得ることができ、または慣用の抗体作製法により調
製できる。ポリクローナル抗血清の調製法は例えば、、Ausubel, et al., Curre
nt Protocols in Molecular Biology, 第2巻, John Wiley＆Sons, Inc., 1997,
11.12.1〜11.12.9ページに記載されている。モノクローナル抗体の調製について
は、Ausubel, et al., Current Protocols in Molecular Biology, 第2巻, John
Wiley＆Sons, Inc., 1997, 11.4.1〜11.11.5ページに記載されている。

【０１０４】 免疫沈降法は当技術分野で標準的であり、例えば、Ausubel, et al., Current
Protocols in Molecular Biology, 第2巻, John Wiley＆Sons, Inc., 1998, 11
.4.1〜11.11.5ページに記載されている。ウエスタンブロット（イムノブロット
）解析は当技術分野で標準的であり、例えば、、Ausubel, et al., Current Pro
tocols in Molecular Biology, 第2巻, John Wiley＆Sons, Inc., 1997, 10.8.1
〜10.8.21ページに記載されている。酵素結合イムノソルベントアッセイ（ELISA
）は当技術分野で標準的であり、例えば、、Ausubel, et al., Current Protoco
ls in Molecular Biology, 第2巻, John Wiley＆Sons, Inc., 1991, 11.2.1〜11
.2.22ージに記載されている。

【０１０５】 実施例11 ポリ（A）＋mRNA単離 ポリ（A）＋mRNAはMiura et al., Clin. Chem., 1996, 42, 1758-1764に従っ
て単離する。ポリ（A）＋mRNA単離のための他の方法は、例えばAusubel, et al.
, Current Protocols in Molecular Biology, 第1巻, John Wiley＆Sons, Inc.,
1993, 4.5.1〜4.5.3ページに記載されている。簡単に述べると、96ウェルプレ
ートで増殖した細胞の場合は、増殖培地を細胞から取り除き、各ウェルを200μl
冷PBSで洗浄する。60μL溶解バッファー（10 mM Tris-HCl、pH7.6、1 mM EDTA、
0.5 M NaCl、0.5％NP-40、20 mMバナジルリボヌクレオシド複合体）を各ウェル
に加え、プレートを穏やかにゆすり、その後室温で5分間インキュベートする。5
5μlの溶解物をオリゴd（T）被覆96ウェルプレート（AGCT Inc., Irvine, CA）
に移す。プレートは室温で60分間インキュベートし、洗浄バッファー（10 mM Tr
is-HCl、pH7.6、1 mM EDTA、0.3 M NaCl）200μLで3回洗浄する。最後の洗浄後
、プレートをペーパータオル上でブロットして過剰な洗浄バッファーを除去し、
その後5分間風乾する。70℃に予熱した60μLの溶出バッファー（5 mM Tris-HCl
、pH7.6）を各ウェルに添加し、プレートを90℃のホットプレートで5分間インキ
ュベートし、溶離液を新鮮な96ウェルプレートに移す。

【０１０６】 100 mmまたは他の標準プレート上で増殖した細胞は、適切な容量のすべての溶
液を使用して、同様に処理することができる。 実施例12 全RNA単離 全RNAはQiagen Inc.（Valencia, CA）から購入したRNEASY 96（登録商標）キ
ットおよびバッファーを使用して、取り扱い説明書に従って単離した。簡単に述
べると、96ウェルプレートで増殖した細胞の増殖培地を細胞から取り除き、各ウ
ェルを200μL冷PBSで洗浄した。100μLバッファーRLTを各ウェルに加え、プレー
トを激しく20秒間ゆすった。70％エタノール100μLを各ウェルに添加し、内容物
を3回のピペット操作で上下させることにより混合した。サンプルを廃棄物収集
トレーが付いたQIAVAC（登録商標）マニホールドに接続し、真空装置に接続した
RNEASY 96（登録商標）ウェルプレートに移した。15秒間真空にした。1 mLのバ
ッファーRW1をRNEASY 96（登録商標）プレートの各ウェルに加え、再び15秒間真
空にした。次いで、バッファーRPEをRNEASY 96（登録商標）の各ウェルに添加し
、15秒間真空にした。次いで、バッファーRPE洗浄を繰り返し、さらに10分間真
空にした。その後、プレートをQIAVAC（登録商標）マニホールドからはずし、ペ
ーパータオル上でブロットして乾燥した。次いで、1.2 mL試験管を含有する試験
管ラックがついたQIAVAC（登録商標）マニホールドにプレートを再び接続した。
その後、各ウェルに水60μLをピペットで加えてRNAを溶出、1分間インキュベー
トし、30秒間真空にした。さらに水60μLで溶出工程を繰り返した。

【０１０７】 実施例13 TRAF mRNAレベルのリアルタイム定量的PCR解析 TRAF mRNAレベルの定量は、ABI PRISM（登録商標）7700 Sequence Detection
System（PE-Applied Biosystems, Foster City, CA）を使用して取り扱い説明書
に従い、リアルタイム定量的PCRにより行う。この方法は閉鎖試験管を用いた、
ゲルを使用しない、蛍光検出システムで、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）生成物
のハイスループット定量がリアルタイムで行える。増幅生成物をPCR完了後に定
量する標準PCRと反対に、リアルタイム定量的PCRでは生成物を蓄積しながら定量
する。この方法は、PCR反応物中にフォワードおよびリバースPCRプライマーとの
間で特異的にアニーリングするオリゴヌクレオチドプローブを含むことによって
達成され、2種の蛍光色素を含有する。レポーター色素（例えば、Operon Techno
logies Inc., Alameda, CAまたはPE-Applied Biosystems, Foster City, CAのど
ちらかから得られるJOEまたはFAM）をプローブの5'末端につけ、クエンチャー色
素（例えば、Operon Technologies Inc., Alameda, CAまたはPE-Applied Biosys
tems, Foster City, CAのどちらかから得られるTAMRA）をプローブの3'末端につ
ける。プローブおよび色素が無傷のとき、レポーター色素発光は3'クエンチャー
色素の接近により停止する。増幅中、標的配列へのプローブのアニーリングはTa
qポリメラーゼの5'-エキソヌクレアーゼ活性により切断可能な基質を作り出す。
PCR増幅サイクルの伸長反応中、Taqポリメラーゼによりプローブが切断されると
、プローブの残りから（従ってクエンチャー部分から）レポーター色素が遊離し
、配列特異的蛍光シグナルを発生する。各サイクル毎に、別のレポーター色素分
子がそれぞれのプローブから切断され、蛍光強度はABI PRISM（登録商標）7700
Sequence Detection Systemのレーザー工学系により一定間隔でモニターする。
各アッセイにおいて、非処理対照サンプルのmRNAの連続希釈物を含有する一連の
平行反応物から、標準曲線を作製し、試験サンプルのアンチセンスオリゴヌクレ
オチド処理後の阻害率を定量化するために使用する。

【０１０８】 PCR試薬はPE-Applied Biosystems, Foster City, CAから得る。RT-PCR反応は
、25μL PCRカクテル（1×TAQMAN（登録商標）バッファーA、5.5 mM MgCl₂、そ
れぞれ300μMのdATP、dCTPおよびdGTP、600μM dUTP、それぞれ100 nMのフォワ
ードプライマー、リバースプライマーおよびプローブ、20 Units RNase阻害剤、
1.25 Units AMPLITAQ GOLD（登録商標）および12.5 Units MuLV逆転写酵素）を2
5μLポリ（A）mRNA溶液を含有する96ウェルプレートに添加することにより行う
。RT反応は48℃での30分間のインキュベーションにより行う。AMPLITAQ GOLD（
登録商標）を活性化するために95℃で10分間のインキュベーション後、2工程PCR
プロトコールを40サイクル行う：95℃で15分間（変性）、続いて60℃で1.5分間
（アニーリング／伸長）。TRAFプローブおよびプライマーは刊行物に記載された
配列情報を使用して、ヒトTRAF配列にハイブリダイズするようにデザインする。
例えば、GenBank受託番号U19261、遺伝子座名“HSU19261”SEQ ID NO：1；GenBa
nk受託番号U12597、遺伝子座名“HSU12597”SEQ ID NO：2；GenBank受託番号U21
092、遺伝子座名“HSU21092”SEQ ID NO：3；GenBank受託番号X80200、遺伝子座
名“HSMLN62”SEQ ID NO：4；GenBank受託番号AB000509、遺伝子座名“AB000509
”SEQ ID NO：5；GenBank受託番号U78798、遺伝子座名“HSU78798”SEQ ID NO：
6。

【０１０９】 実施例14 TRAF-1発現のアンチセンス阻害-ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオ
チド 本発明に従い、一連のオリゴヌクレオチドを刊行物に記載された配列（本明細
書中にSEQ ID NO：1として援用した、GenBank受託番号U19261）を使用してTRAF-
1 RNAの異なる領域を標的とするようにデザインした。該オリゴヌクレオチドを
表1に示す。オリゴヌクレオチドが結合する標的部位は、配列の出所の参照（Gen
Bank受託番号U19261）中で与えられたヌクレオチド番号により示す。表1の全化
合物は、すべてにホスホロチオエートバックボーン（ヌクレオシド間結合）を持
つオリゴデオキシヌクレオチドである。

【０１１０】 表１ ヒトTRAF-1ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列

【０１１１】

【表１】

【０１１２】

【０１１３】¹ すべてのシチジンは5-メチル-シチジンである；すべての結合はホスホロチオエ
ート結合である。² GenBank受託番号U19261、遺伝子座名“HSU19261”SEQ ID NO. 1の座標。

【０１１４】 実施例15： TRAF-1発現のアンチセンス阻害-ホスホロチオエート2'-MOEギャップマーオリ
ゴヌクレオチド 本発明に従い、ヒトTRAF-1を標的とした第2の一連のオリゴヌクレオチドを合
成した。オリゴヌクレオチド配列は表2に示す。オリゴヌクレオチドが結合する
標的部位は、配列の出所の参照（GenBank受託番号U19261）中で与えられたヌク
レオチド番号により示す。

【０１１５】 表2のすべての化合物は長さが18ヌクレオチドのキメラオリゴヌクレオチド（
“ギャップマー”）で、10の2'-デオキシヌクレオチドからなる中心の”ギャッ
プ”領域から構成され、4ヌクレオチド“ウィング”が両側（5'および3'方向）
に並ぶ。ウィングは2'-メトキシエチル（2'-MOE）ヌクレオチドからなる。ヌク
レオシド間（バックボーン）結合はオリゴヌクレオチドすべてでホスホロチオエ
ート（P＝S）である。すべてのシチジン残基は5-メチルシチジンである。

【０１１６】 表２ ヒトTRAF-1ギャップマーオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列

【０１１７】

【表２】

【０１１８】

【０１１９】¹ 太字の残基は2'-メトキシエトキシ残基（他は2'-デオキシ-）である。すべての
2'-メトキシエトキシシチジンおよび2'-デオキシシチジンは5-メチル-シチジン
である；すべての結合はホスホロチオエート結合である。² GenBank受託番号U19261、遺伝子座名“HSU19261”SEQ ID NO. 1の座標。

【０１２０】 実施例16： TRAF-2発現のアンチセンス阻害-ホスホロチオエート2'-MOEギャップマーオリ
ゴヌクレオチド 本発明に従って、ヒトTRAF-2を標的とした一連のオリゴヌクレオチドを合成し
た。オリゴヌクレオチド配列は表3に示す。オリゴヌクレオチドが結合する標的
部位は、配列の出所の参照（GenBank受託番号U12597）中で与えられたヌクレオ
チド番号により示す。

【０１２１】 表3のすべての化合物は長さが20ヌクレオチドのキメラオリゴヌクレオチド（
“ギャップマー”）で、8の2'-デオキシヌクレオチドからなる中心の”ギャップ
”領域から構成され、6ヌクレオチド“ウィング”が両側（5'および3'方向）に
並ぶ。ウィングは2'-メトキシエチル（2'-MOE）ヌクレオチドから構成される。
ヌクレオシド間（バックボーン）結合は中心の“デオキシギャップ”ではホスホ
ロチオエート（P＝S）、およびウィングではホスホジエステル（P＝O）である。
2'-MOEウィングのシチジン残基は5-メチルシチジンである。

【０１２２】 表３： TRAF-2ギャップマーオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列

【０１２３】

【表３】

【０１２４】

【０１２５】¹ 太字の残基は2'-メトキシエトキシ残基（他は2'-デオキシ-）である。すべての
2'-メトキシエトキシシチジンは5-メチル-シチジンであり、下線をひいた“C”
残基は5-メチル-シチジンである；“s”結合はホスホロチオエート結合であり、
“o”結合はホスホジエステル結合である。² GenBank受託番号U12597、遺伝子座名“HSU12597”SEQ ID NO. 2の座標。

【０１２６】 HMVEC（ヒト皮膚微小血管）細胞はClonetics（San Diego CA）から購入し、10
％ウシ胎仔血清（HyClone, Logan UT）を補足した内皮基礎培地（EBM）で培養し
た。細胞は70〜80％コンフルエントになるまで100 mmペトリ皿で増殖させ、続い
てカチオン脂質存在下でオリゴヌクレオチドにより処理した。簡単に述べると、
細胞はPBSおよびOPTI-MEM（登録商標）で洗浄した。10μg／mL LIPOFECTIN（登
録商標）を含むOPTI-MEM（登録商標）を細胞に添加し、続いてオリゴヌクレオチ
ドを添加した。細胞は37℃で3〜4時間インキュベートし、EBM／1％FBSで1回洗浄
し、回復させた。ノーザンブロットによるmRNAレベルの解析のために、全RNAは
グアニジニウムイソチオシアネート法またはQiagen RNEASY（登録商標）法（Qia
gen, Valencia, CA）により細胞から調製した。ノーザンブロットによる解析は
標準法（例えば、Ausubel, et al., Current Protocols in Molecular Biology,
第1巻、John Wiley＆Sons, Inc., 1996, 4.2.1〜4.2.9ページ）により行った。
プローブはBednarczuk et al., Biotechniques, 1991, 10, 478の方法に従ってR
T-PCRにより増幅したTRAF-2のPCR標識1-kbフラグメントであった。RNAは定量し
、取り扱い説明書に従ってMolecular Dynamics（Sunnyvale, CA）PhosphorImage
rを使用してG3PDH mRNAレベルに標準化した。

【０１２７】 結果は表4に示す。オリゴヌクレオチド16834（SEQ ID NO. 54）によるTRAF-2
mRNAレベルの低下は、1〜100 nMの範囲で用量依存的であることが明らかになっ
た。IC₅₀は約10 nMであった。TRAF-6アンチセンスオリゴヌクレオチドはTRAF-2
mRNA発現に影響を与えなかった。

【０１２８】 TRAF-2タンパク質レベルに対するオリゴヌクレオチド16834（SEQ ID NO. 54）
の作用についても検討した。細胞はオリゴヌクレオチドで処理し、回収する前48
〜72時間回復させた。タンパク質レベルはウエスタンブロット解析を使用して行
った。TRAF-2タンパク質発現の用量依存的低下は処理後48時間検出可能であり、
TRAF-2タンパク質レベルの最大低下は100 nMオリゴヌクレオチド処理後72時間で
得られた。

【０１２９】 表４ TRAF-2ギャップマーオリゴヌクレオチドの活性

【０１３０】

【表４】

【０１３１】 ISIS 27693（SEQ ID NO：54）もまたヒト初代線維芽細胞様滑膜細胞（外科的
／生検標本から得た）のTRAF-2 mRNAレベルを低下させることを示した。LIPOFEC
TIN（登録商標）は3μg／mlであった。IC₅₀が約25 nMの用量-反応効果が見られ
、オリゴヌクレオチド濃度100 nMにおいて、TRAF-2 mRNAは約90％低下した。

【０１３２】 実施例17： TRAF-3発現のアンチセンス阻害-ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオ
チド 本発明に従い、刊行物に記載された配列（GenBank受託番号HSU21092、SEQ ID
NO：3）を使用して、ヒトTRAF-3 RNAを標的とした一連のオリゴヌクレオチドを
デザインした。オリゴデオキシヌクレオチドは表5に示す。標的部位は、TRAF-3
mRNA標的上のヌクレオチド番号として示す（SEQ ID NO：3）。

【０１３３】 表５ ヒトTRAF-3ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列

【０１３４】

【表５】

【０１３５】

【０１３６】¹ すべてのシチジンは5-メチル-シチジンである；すべての結合はホスホロチオエ
ート結合である。² GenBank受託番号U21092、遺伝子座名“HSU21092”SEQ ID NO. 3の座標。

【０１３７】 実施例18： TRAF-3発現のアンチセンス阻害-ホスホロチオエート2'-MOEギャップマーオリ
ゴヌクレオチド 本発明に従って、ヒトTRAF-3を標的とした第2の一連のオリゴヌクレオチドを
合成した。オリゴヌクレオチド配列は表6に示す。オリゴヌクレオチドが結合す
る標的部位は、配列の出所の参照（GenBank受託番号U21092）中で与えられたヌ
クレオチド番号により示す。

【０１３８】 表6のすべての化合物は長さが18ヌクレオチドのキメラオリゴヌクレオチド（
“ギャップマー”）で、10の2'-デオキシヌクレオチドからなる中心の”ギャッ
プ”領域から構成され、4ヌクレオチド“ウィング”が両側（5'および3'方向）
に並ぶ。ウィングは2'-メトキシエチル（2'-MOE）ヌクレオチドからなる。ヌク
レオシド間（バックボーン）結合はオリゴヌクレオチドすべてでホスホロチオエ
ート（P＝S）である。すべてのシチジン残基は5-メチルシチジンである。

【０１３９】 表６ ヒトTRAF-3ギャップマーオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列

【０１４０】

【表６】

【０１４１】

【０１４２】

【０１４３】¹ 太字の残基は2'-メトキシエトキシ残基（他は2'-デオキシ-）である。すべての
2'-メトキシエトキシシチジンおよび2'-デオキシシチジンは5-メチル-シチジン
である；すべての結合はホスホロチオエート結合である。² GenBank受託番号U21092、遺伝子座名“HSU21092”SEQ ID NO. 3の座標。

【０１４４】 実施例19 TRAF-4発現のアンチセンス阻害-ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオ
チド 本発明に従い、刊行物に記載された配列（本明細書中にSEQ ID NO：4として援
用した、GenBank受託番号X80200）を使用して、ヒトTRAF-4 RNAの異なる領域を
標的とした一連のオリゴヌクレオチドをデザインした。オリゴヌクレオチドは表
7に示す。オリゴヌクレオチドが結合する標的部位は、配列の出所の参照中で与
えられたヌクレオチド番号（GenBank受託番号X80200）により示す。表7のすべて
の化合物はすべてにホスホロチオエートバックボーン（ヌクレオシド間結合）を
持つオリゴデオキシヌクレオチドである。本明細書中の他の実施例で記載した定
量的リアルタイムPCRにより、該化合物のTRAF mRNAレベルに対する作用を解析す
る。

【０１４５】 表７ ヒトTRAF-4ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列

【０１４６】

【表７】

【０１４７】

【０１４８】¹ すべてのシチジンは5-メチル-シチジンである；すべての結合はホスホロチオエ
ート結合である。² GenBank受託番号X80200、遺伝子座名“HSMLN62”SEQ ID NO. 4の座標。

【０１４９】 実施例20： TRAF-4発現のアンチセンス阻害-ホスホロチオエート2'-MOEギャップマーオリ
ゴヌクレオチド 本発明に従い、ヒトTRAF-4を標的とした第2の一連のオリゴヌクレオチドを合
成した。オリゴヌクレオチド配列は表8に示す。オリゴヌクレオチドが結合する
標的部位は、配列の出所の参照中で与えられたヌクレオチド番号（GenBank受託
番号X80200）により示す。

【０１５０】 表8のすべての化合物は長さが18ヌクレオチドのキメラオリゴヌクレオチド（
“ギャップマー”）で、10の2'-デオキシヌクレオチドからなる中心の”ギャッ
プ”領域から構成され、4ヌクレオチド“ウィング”が両側（5'および3'方向）
に並ぶ。ウィングは2'-メトキシエチル（2'-MOE）ヌクレオチドからなる。ヌク
レオシド間（バックボーン）結合はオリゴヌクレオチドすべてでホスホロチオエ
ート（P＝S）である。すべてのシチジン残基は5-メチルシチジンである。

【０１５１】 データは本明細書の他の実施例で記載したようにリアルタイム定量的PCRによ
り得る。 表８ ヒトTRAF-4ギャップマーオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列

【０１５２】

【表８】

【０１５３】

【０１５４】¹ 太字の残基は2'-メトキシエトキシ残基（他は2'-デオキシ-）である。すべての
2'-メトキシエトキシシチジンおよび2'-デオキシシチジンは5-メチル-シチジン
である；すべての結合はホスホロチオエート結合である。² GenBank受託番号X80200、遺伝子座名“HSMLN62”SEQ ID NO. 4の座標。

【０１５５】 実施例21 TRAF-5発現のアンチセンス阻害-ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオ
チド 本発明に従い、刊行物に記載された配列（本明細書中にSEQ ID NO：5として援
用した、GenBank受託番号AB000509）を使用して、ヒトTRAF-5 RNAの異なる領域
を標的とした一連のオリゴヌクレオチドをデザインした。オリゴデオキシヌクレ
オチドは表9に示す。オリゴヌクレオチドが結合する標的部位は、配列の出所の
参照として与えられたヌクレオチド番号（GenBank受託番号AB000509）により示
す。表9のすべての化合物はすべてにホスホロチオエートバックボーン（ヌクレ
オシド間結合）を持つオリゴデオキシヌクレオチドである。

【０１５６】 表９ ヒトTRAF-5ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列

【０１５７】

【表９】

【０１５８】

【０１５９】

【０１６０】¹ すべてのシチジンは5-メチル-シチジンである；すべての結合はホスホロチオエ
ート結合である。² GenBank受託番号AB000509、遺伝子座名“AB000509”SEQ ID NO. 5の座標。

【０１６１】 実施例22： TRAF-5発現のアンチセンス阻害-ホスホロチオエート2'-MOEギャップマーオリ
ゴヌクレオチド 本発明に従い、ヒトTRAF-5を標的とした第2の一連のオリゴヌクレオチドを合
成した。オリゴヌクレオチド配列は表10に示す。オリゴヌクレオチドが結合する
標的部位は、配列の出所の参照中で与えられたヌクレオチド番号（GenBank受託
番号AB000509）により示す。

【０１６２】 表10のすべての化合物は長さが18ヌクレオチドのキメラオリゴヌクレオチド（
“ギャップマー”）で、10の2'-デオキシヌクレオチドからなる中心の”ギャッ
プ”領域から構成され、4ヌクレオチド“ウィング”が両側（5'および3'方向）
に並ぶ。ウィングは2'-メトキシエチル（2'-MOE）ヌクレオチドからなる。ヌク
レオシド間（バックボーン）結合はオリゴヌクレオチドすべてでホスホロチオエ
ート（P＝S）である。すべてのシチジン残基は5-メチルシチジンである。

【０１６３】 表１０ ヒトTRAF-5ギャップマーオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列

【０１６４】

【表１０】

【０１６５】

【０１６６】

【０１６７】¹ 太字の残基は2'-メトキシエトキシ残基（他は2'-デオキシ-）である。すべての
2'-メトキシエトキシシチジンおよび2'-デオキシシチジンは5-メチル-シチジン
である；すべての結合はホスホロチオエート結合である。² GenBank受託番号AB000509、遺伝子座名“AB000509”SEQ ID NO. 5の座標。

【０１６８】 実施例23： TRAF-6発現のアンチセンス阻害-ホスホロチオエート2'-MOEギャップマーオリ
ゴヌクレオチド 本発明に従って、ヒトTRAF-6を標的とした一連のオリゴヌクレオチドを合成し
た。オリゴヌクレオチド配列は表11に示す。オリゴヌクレオチドが結合する標的
部位は、配列の出所の参照中で与えられたヌクレオチド番号（GenBank受託番号U
78798）により示す。

【０１６９】 表11のすべての化合物は長さが20ヌクレオチドのキメラオリゴヌクレオチド（
“ギャップマー”）で、8の2'-デオキシヌクレオチドからなる中心の”ギャップ
”領域から構成され、6ヌクレオチド“ウィング”が両側（5'および3'方向）に
並ぶ。ウィングは2'-メトキシエチル（2'-MOE）ヌクレオチドからなる。ヌクレ
オシド間（バックボーン）結合は“デオキシギャップ”ではホスホロチオエート
（P＝S）で、ウィングではホスホジエステル（P＝O）である。2'-MOEウィングの
シチジン残基は5-メチルシチジンである。

【０１７０】 表１１： TRAF-6ギャップマーオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列

【０１７１】

【表１１】

【０１７２】

【０１７３】

【０１７４】¹ 太字の残基は2'-メトキシエトキシ残基（他は2'-デオキシ-）である。すべての
2'-メトキシエトキシシチジンは5-メチル-シチジンであり、下線をひいた“C”
残基は5-メチル-シチジンである；“s”結合はホスホロチオエート結合であり、
“o”結合はホスホジエステル結合である。² GenBank受託番号U78798、遺伝子座名“HSU78798”SEQ ID NO. 6の座標。

【０１７５】 HMVEC細胞は70〜80％コンフルエントになるまで100 mmペトリ皿で増殖させ、
続いてカチオン脂質存在下でオリゴヌクレオチドにより処理した。簡単に述べる
と、細胞はPBSおよびOPTI-MEM（登録商標）で洗浄した。10μg／mL LIPOFECTIN
（登録商標）を含むOPTI-MEM（登録商標）を細胞に添加し、続いてオリゴヌクレ
オチドを添加した。細胞は37℃で3〜4時間インキュベートし、EBM／1％FBSで1回
洗浄し、回復させた。ノーザンブロットによるmRNAレベル解析のために、グアニ
ジニウムイソチオシアネート法またはQiagen RNEASY（登録商標）法（Qiagen, V
alencia, CA）により全RNAを細胞から調製した。ノーザンブロットによる解析は
標準法（例えば、Ausubel, et al., Current Protocols in Molecular Biology,
第1巻、John Wiley＆Sons, Inc., 1996, 4.2.1〜4.2.9ページ）により行った。
プローブはBednarczuk et al., 1991, Biotechniques 10, 478の方法に従ってRT
-PCRにより増幅したTRAF-6のPCR-標識1-kbフラグメントであった。RNAは、定量
し、取り扱い説明書に従ってMolecular Dynamics（Sunnyvale, CA）PhosphorIma
gerを使用してG3PDH mRNAに標準化した。

【０１７６】 結果は表12に示す。オリゴヌクレオチド15910（SEQ ID NO. 224）によるTRAF-
6 mRNAレベルの低下は1〜100 nMの範囲で用量依存的であった。IC₅₀は約2.5 nM
であった。TRAF-2アンチセンスオリゴヌクレオチドはTRAF-6 mRNA発現に影響を
与えなかった。

【０１７７】 表１２ TRAF-6ギャップマーオリゴヌクレオチドの活性

【０１７８】

【表１２】

【０１７９】

【０１８０】

【０１８１】 実施例24 E-セレクチン誘導に対するTRAF遺伝子発現阻害の効果 TNFαまたはIL-1βによるE-セレクチン誘導に対するTRAFアンチセンスオリゴ
ヌクレオチドの作用を検討した。HMVEC細胞は用量-反応条件下で、ISIS 16834ま
たはISIS 15910のいずれかで処理し、続いてTNFαまたはIL-1βにより5時間、E-
セレクチン発現を刺激した。E-セレクチンの細胞表面発現はフローサイトメトリ
ーにより測定した。予期したように、TNFαによるE-セレクチン細胞表面誘導の
用量-依存的阻害はTRAF-2アンチセンスオリゴヌクレオチドISIS 16834で処理し
た細胞で見られた。驚くべきことに、TRAF-6アンチセンス化合物、ISIS 15910が
同じように、特により高濃度で、TNFα媒介E-セレクチン表面発現を阻害するこ
とができた。低用量（20〜50 nM）では、ISIS 15910と比較してISIS 16834はTNF
α媒介E-セレクチン誘導のより効果的な阻害剤であった。両アンチセンス化合物
によるE-セレクチン誘導の最大阻害は100 nMで約70％であった。対照オリゴヌク
レオチドはE-セレクチン誘導にほとんど、または全く作用を示さなかった。しか
し、IL-1βを刺激剤として使用すると、ISIS 16834と比較してISIS 15910は、特
に比較的低用量において、E-セレクチン誘導のより特異的および強力な阻害剤で
あった。

【０１８２】 実施例25 IκBαリン酸化および分解に対するTRAFアンチセンスオリゴヌクレオチドの作
用 E-セレクチンの誘導を促進するためにサイトカインにより多数の転写因子が活
性化される。E-セレクチン活性化の制御に関与する最も重要で、最も研究されて
いる転写因子にはNF-κB、c-JunおよびATF-2が含まれる。サイトカインによるNF
-κBの活性化におけるTRAFタンパク質の役割を明らかにするために、アンチセン
スオリゴヌクレオチド処理細胞でIκBαリン酸化および分解アッセイを行った。
細胞はISIS 16834またはISIS 15910のいずれかで処理し、48〜72時間回復させた
。細胞を回収する前に、腫瘍壊死因子-α（TNF-α）またはインターロイキン-1-
β（IL-1β）を5〜30分間添加した。IκBαのリン酸化を研究するために、ホス
ホ-IκBα特異的抗体によるウエスタンブロット解析を行った。次に、ブロット
を切り取り、IκBαの分解を調べるためにIκBαの抗体で再ブロットした。いず
れかのサイトカイン添加5分後には、IκBαはかなりリン酸化されていた。30分
までには、おそらくIκBα分解の結果として、IκBαは減少した。TNFα刺激細
胞では、IκBαの大部分は刺激5分後に分解していた。30分までには、IκBαは
ほとんど消失した。対照的に、30分までに分解されるIκBαの大部分で、IL-1β
刺激細胞でのIκBαの分解はより遅かった。ISIS 16834またはISIS 15910のどち
らもTNFαにより誘導されるIκBαのリン酸化および分解に影響を与えなかった
。ISIS 15910はIL-1β媒介IκBαリン酸化および分解にほとんど作用が見られな
かった。IκBαの高リン酸化は、ISIS 16834処理した、IL-1β誘導細胞で見られ
た。まとめると、アンチセンスオリゴヌクレオチドはIκBαのリン酸化および分
解を阻害しなかった。

【０１８３】 実施例26 JNK活性に対するTRAFアンチセンスオリゴヌクレオチドの作用 MAPキナーゼは、細胞接着分子誘導に重要な、特異的転写因子の活性化におい
て中心的役割を果たす。JNK活性に対するTRAFアンチセンスオリゴヌクレオチド
の作用を検討するために、TRAFアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理した細胞
由来の抽出物に対し、in vitroキナーゼアッセイを行った。細胞はTRAF-2または
TRAF-6アンチセンス化合物、（それぞれISIS 16834またはISIS 15910）で処理し
、48〜72時間回復させ、その時、細胞溶解およびキナーゼアッセイの開始15分前
に、TNFを添加した。特異的なc-Junコンジュゲートアガロースビーズを使用して
、JNKを沈降させた。免疫沈降したキナーゼ複合体にATPを添加し、反応混合物を
SDS-PAGEで解析した。相対的キナーゼ活性を測定するために、リン酸化c-Jun特
異的抗体でウエスタンブロット法を行った。c-Junがかなりリン酸化されている
ことが示すように、JNKは15分間インキュベーション後、TNFαにより活性化され
た。ISIS 16834はTNFα処理細胞においてJNK活性を低下させたが、IL-1β処理細
胞では低下させなかった。ISIS 16834処理細胞ではIL-1β誘導c-Junのかなりの
高リン酸化が見られた。ISIS 15910は、IL-1βおよびTNFαの両方により媒介さ
れるc-Junリン酸化を減少させた。JNK活性に対するISIS 15910のかなりの阻害作
用もTNFα-誘導細胞で見られた。この結果は、E-セレクチンの表面発現に対する
TRAFアンチセンスオリゴヌクレオチドの阻害作用と一致する。

【０１８４】 実施例27 TRAF-2を標的としたアンチセンスオリゴヌクレオチドによる細胞増殖の阻害 HeLa細胞をISIS 16834（200 nM）で処理し、48時間後に計数した。細胞はトリ
プシン処理し、トリパンブルーで染色、計数した（浮遊細胞を含む）。ISIS 168
34処理培養物の細胞数は非処理対照培養物に比べ61％低下した。

【０１８５】 実施例28 TRAF-2を標的としたアンチセンスオリゴヌクレオチドによるアポトーシスの誘
導 HeLa細胞をISIS 16834（200 nM）で処理し、48時間後にトリパンブルー排除に
より死亡細胞数を計数した。オリゴヌクレオチド非処理培養物では、わずか5％
の細胞が死亡した。ISIS 16834処理培養物では、44％の細胞が死亡した。

【０１８６】 実施例29 TRAF-2を標的としたISIS 16834に反応したアポトーシスの用量反応 HeLa細胞を各種濃度のISIS 16834で処理し、100、200および300 nMのISIS 168
34処理48時間後に、ヨウ化プロピジウムおよびFACSを使用して、サブ-G1アポト
ーシス細胞数を計数した。培養上清および浮遊細胞はFACSチューブに移した。細
胞をPBSで洗浄、トリプシン処理、PBSで洗浄し、続いてフリーザー中、12〜15時
間氷冷70％エタノール中で固定した。細胞を遠心し、FACS解析前に、室温で1時
間、暗所でヨウ化プロピジウム（PI）混合物（50μg／ml PI、5μg／ml RNAseカ
クテル、カタログ番号2286, Ambion, Austin TX）で再懸濁した。100、200およ
び300 nMで処理後のアポトーシス細胞の割合は非処理細胞の5％と比較して、そ
れぞれ約29％、46％および58％であった。

【０１８７】 実施例30 TRAF-2を標的としたISIS 16834に反応したアポトーシスの時間経過 先の実施例で記載した方法を使用して、200 nMのISIS 16834で処理1、2および
3日後にサブ-G1アポトーシスHeLa細胞数を計数した。これらの時点で処理後のア
ポトーシス細胞の割合は、非処理細胞の3日後の5％と比較して、それぞれ約10％
、46％および53％であった。

【０１８８】 実施例31 TRAF-3発現のアンチセンス阻害 表5および6で示したアンチセンスオリゴヌクレオチドの、ヒトTRAF-3発現を阻
害する能力についてT-24細胞でスクリーニングした。結果は表13および14にそれ
ぞれ示す。

【０１８９】 表１３ ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドによるTRAF-3 mRNAレベルの
阻害

【０１９０】

【表１３】

【０１９１】

【０１９２】¹ 本明細書中にSEQ ID NO: 3として援用した、GenBank受託番号HSU21092の標的部
位の初めのヌクレオチドの位置。 表１４ 2'-MOEウィングおよびデオキシギャップを有するキメラホスホロチオエートオ
リゴヌクレオチドによるTRAF-3 mRNAレベルの阻害

【０１９３】

【表１４】

【０１９４】

【０１９５】

【０１９６】¹ 本明細書中にSEQ ID NO: 3として援用した、GenBank受託番号HSU21092の標的部
位の初めのヌクレオチドの位置。 実施例32 TRAF-4発現のアンチセンス阻害 表7および8で示したアンチセンスオリゴヌクレオチドの、ヒトTRAF-4発現を阻
害する能力についてT-24細胞でスクリーニングした。結果は表15および16にそれ
ぞれ示す。

【０１９７】 表１５ ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドによるTRAF-4 mRNAレベルの
阻害

【０１９８】

【表１５】

【０１９９】

【０２００】¹ GenBank受託番号X80200、遺伝子座名“HSMLN62” SEQ ID NO. 4の標的部位の初
めのヌクレオチドの位置。 表１６ 2'-MOEウィングおよびデオキシギャップを有するキメラホスホロチオエートオ
リゴヌクレオチドによるTRAF-4 mRNAレベルの阻害

【０２０１】

【表１６】

【０２０２】

【０２０３】

【０２０４】¹ GenBank受託番号X80200、遺伝子座名“HSMLN62” SEQID NO．4の標的部位の初
めのヌクレオチドの位置。 実施例32 TRAF-5発現のアンチセンス阻害 表9および10で示したアンチセンスオリゴヌクレオチドの、ヒトTRAF-5発現を
阻害する能力についてT-24細胞でスクリーニングした。結果は表17および18にそ
れぞれ示す。

【０２０５】 表１７ ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドによるTRAF-5 mRNAレベルの
阻害

【０２０６】

【表１７】

【０２０７】

【０２０８】

【０２０９】¹ GenBank受託番号AB000509、遺伝子座名“AB000509” SEQ ID NO: 5の標的部位
の初めのヌクレオチドの位置。 表１８ 2'-MOEウィングおよびデオキシギャップを有するキメラホスホロチオエートオ
リゴヌクレオチドによるTRAF-5 mRNAレベルの阻害

【０２１０】

【表１８】

【０２１１】

【０２１２】

【０２１３】¹ GenBank受託番号AB000509、遺伝子座名“AB000509” SEQ ID NO. 5の標的部位
の初めのヌクレオチドの位置。 実施例33 TRAF-1を標的とした別のオリゴヌクレオチド TRAF-1を標的とした別のアンチセンスオリゴヌクレオチドをデザインし、合成
した。すべての化合物は太字で示した2'-MOEヌクレオチドを持つ2'-MOEギャップ
マーである。バックボーンはすべてホスホロチオエートである。すべてのCは5-
メチルCである。化合物は上記の実施例13で記載したように試験した。化合物と
結果を表19に示す。

【０２１４】 表１９ TRAF-1発現のアンチセンス阻害

【０２１５】

【表１９】

【０２１６】

【０２１７】

【０２１８】¹ GenBank受託番号U19261、遺伝子座名“HSU19261” SEQ ID NO: 1の標的部位の
初めのヌクレオチドの位置。

【配列表】

【手続補正書】

【提出日】平成１３年５月２日（２００１．５．２）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｕ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ， ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，Ｌ Ｋ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ， ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，Ｔ Ｍ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 カウサート，レックス・エム アメリカ合衆国カリフォルニア州92008， カールズバッド，ニューシャイア・ストリ ート 3008 (72)発明者 モニア，ブレット・ピー アメリカ合衆国カリフォルニア州92009， ラ・コスタ，ヌエバ・カスティーリャ・ウ ェイ 7605 (72)発明者 チュー，ジアオジン・エス アメリカ合衆国ニュージャージー州07940， マディソン，メイン・ストリート 18，ナ ンバー ３ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA80 CA01 HA20 4C084 AA02 AA07 AA13 BA35 BA44 CA18 CA56 NA14 ZB112 ZB262 ZC202 4C086 AA01 AA02 EA16 MA01 MA04 NA14 ZB11 ZB26

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒト腫瘍壊死因子受容体関連因子をコードする核酸分子を標
   的とする8〜30ヌクレオチド長さのアンチセンス化合物であって、ヒト腫瘍壊死
   因子受容体関連因子の発現を阻止する該アンチセンス化合物。
2. 【請求項２】 アンチセンスオリゴヌクレオチドである請求項1に記載のア
   ンチセンス化合物。
3. 【請求項３】 少なくとも一つの修飾されたヌクレオシド間結合を含む請求
   項2に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
4. 【請求項４】 修飾されたヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合で
   ある請求項3に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
5. 【請求項５】 少なくとも一つの修飾糖残基を含む請求項2に記載のアンチ
   センスオリゴヌクレオチド。
6. 【請求項６】 修飾糖残基が2'-O-メトキシエチル糖残基である請求項5に記
   載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
7. 【請求項７】 少なくとも一つの修飾核塩基を含む請求項2に記載のアンチ
   センスオリゴヌクレオチド。
8. 【請求項８】 修飾核塩基が5-メチルシトシンである請求項7に記載のアン
   チセンスオリゴヌクレオチド。
9. 【請求項９】 キメラオリゴヌクレオチドである請求項2に記載のアンチセ
   ンス化合物。
10. 【請求項１０】 ヒトTRAFがTRAF-2またはTRAF-6である請求項1に記載のア
    ンチセンス化合物。
11. 【請求項１１】 請求項1に記載のアンチセンス化合物および薬学的に許容
    しうる担体または希釈剤を含む組成物。
12. 【請求項１２】 コロイド分散系を含む請求項11に記載の組成物。
13. 【請求項１３】 アンチセンス化合物がアンチセンスオリゴヌクレオチドで
    ある請求項11に記載の組成物。
14. 【請求項１４】 ヒト細胞または組織中での腫瘍壊死因子受容体関連因子の
    発現を阻止する方法であって、腫瘍壊死因子受容体関連因子の発現を阻止するよ
    うに、請求項1に記載のアンチセンス化合物と該細胞または組織を接触させるこ
    とを含む上記方法。
15. 【請求項１５】 腫瘍壊死因子受容体関連因子に関係した疾患または状態を
    有するヒトを治療する方法であって、腫瘍壊死因子受容体関連因子の発現を阻止
    するように、請求項1に記載のアンチセンス化合物の治療的または予防的有効量
    を該動物に投与することを含む上記方法。
16. 【請求項１６】 疾患または状態が、高増殖性または炎症性の疾患または状
    態である請求項15に記載の方法。
17. 【請求項１７】 細胞または組織中でのjunキナーゼ活性化を腫瘍壊死因子
    αによって減少させる方法であって、TRAF-2を標的とするアンチセンス化合物と
    該細胞または組織を接触させることを含む上記方法。
18. 【請求項１８】 細胞または組織中でのjunキナーゼ活性化を減少させる方
    法であって、TRAF-6を標的とするアンチセンス化合物と該細胞または組織を接触
    させることを含む上記方法。
19. 【請求項１９】 細胞または組織中でのEセレクチン発現を減少させる方法
    であって、TRAF-2またはTRAF-6を標的とするアンチセンス化合物と該細胞または
    組織を接触させることを含む上記方法。