JP2003520588A - マクロファージ遊走阻害因子発現のアンチセンスモジュレーション - Google Patents

マクロファージ遊走阻害因子発現のアンチセンスモジュレーション

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Abstract

(57)【要約】 マクロファージ遊走阻害因子の発現をモジュレートするためのアンチセンス化合物、組成物および方法を提供する。組成物は、マクロファージ遊走阻害因子をコードする核酸を標的とするアンチセンス化合物、特にアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。マクロファージ遊走阻害因子発現のモジュレーションおよびマクロファージ遊走阻害因子の発現と関連した疾病の治療のためにこれらの化合物を使用する方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 発明の属する分野 本発明はマクロファージ遊走阻害因子発現をモジュレートするための組成物と
方法を提供する。特に、本発明はヒトマクロファージ遊走阻害因子をコードする
核酸と特異的にハイブリダイズ可能なアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオ
チドに関する。そのようなオリゴヌクレオチドは、マクロファージ遊走阻害因子
の発現をモジュレートすることが示された。
【０００２】 発明の背景 免疫および炎症反応の発達には、液性および細胞性経路の両方のバランスのと
れた活性化が必要である。これらの経路は、組織侵襲および抗原特異的反応を含
む配置プロセスを起動および調整する、サイトカインおよびホルモンなどの特異
的メディエーターの協調的な効果により制御される。さらに具体的には、炎症の
間、サイトカインは感染部位にさらなる免疫細胞を引きつけ、抗原提示分子の発
現を増加させて、B-およびT-細胞の活性化を亢進する。
【０００３】 マクロファージ遊走阻害因子（MIF、GIFおよびGLIFとしても知られる）は、モ
ルモットで発見された最初のT-細胞由来可溶性サイトカインであり、炎症反応の
間マクロファージ遊走を阻害することを示した（Bloom and Bennett, Science,
1966, 153, 80-82）。その時以来、Weiserらは、ヒトマクロファージ遊走阻害因
子を単離して（Weiser et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 1989, 86,
7522-7526）、遺伝子を染色体22q11に位置づけた（Paralkar and Wistow, Genom
ics, 1994, 19, 48-51）。さらに、ヒトマクロファージ遊走阻害因子のヌクレオ
チドおよびタンパク質配列は、PCT国際公開WO 90/11301および米国特許5,656,73
7に開示される（Clark and Weiser, 1990）および（Wistow, 1997）。眼球レン
ズからマクロファージ遊走阻害因子を単離する方法は、米国特許5,328,990に開
示される（Wistow, 1994）。
【０００４】 マクロファージ遊走阻害因子は、致死的な内毒素血症を悪化させる下垂体前葉
由来ホルモン（Bucala, Immunol. Lett., 1994, 43, 23-26；Bucala, Circ. Sho
ck, 1994, 44, 35-39）、炎症および免疫反応のグルココルチコイド媒介抑制を
無効にできる因子（Calandra and Bucala, Crit. Rev. Immunol., 1997, 17, 77
-88；Calandra and Bucala, J. Inflamm., 1995, 47, 39-51）、および有糸分裂
促進刺激あるいは抗原刺激後のT-細胞のアクチベーター（Bacher et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. U. S. A., 1996, 93, 7849-7854）として特徴付けられた。
【０００５】 このサイトカインは、免疫反応の制御ならびに創傷治癒および発癌の間の細胞
増殖および分化との関連の範囲内で複数の役割を有していることが示された。前
立腺腺癌（Arcuri et al., Prostate, 1999, 39, 159-165；Meyer-Siegler and
Hudson, Urology, 1996, 48, 448-452）、マウスの結腸癌（Takahashi et al.,
Mol. Med., 1998, 4, 707-714）, リポ多糖誘導H60細胞 (白血病細胞株)（Nishi
hira et al., Biochem. Mol. Biol. Int., 1996, 40, 861-869）、および紫外線
照射を用いた治療の際（Shimizu et al., J. Invest. Dermatol., 1999, 112, 2
10-215）において、発現が高められることが示された。従って、MIF活性および
／あるいは発現の薬理学的モジュレーションは、病理学的な状態における治療的
介入の適切なポイントでありうる。
【０００６】 より最近、発現はヒト妊娠期間の最初の3分の1（first trimester）の栄養膜
において高められ、ヒト絨毛ゴナドトロピンにより誘導されることが証明された
ことから、胚着床および妊娠における役割が示唆される（Arcuri et al., Biol.
Reprod., 1999, 60, 1299-1303；Wada et al., Hum. Reprod., 1999, 14, 395-
399）。E. coliにおけるベクター系を使用してヒトタンパク質を発現および精製
する方法は、PCT国際公開WO 96/09389に開示される（Mozetic Francky and Fran
cky, 1996）。
【０００７】 タンパク質は、慢性関節リウマチ（Onodera et al., Cytokine, 1999, 11, 16
3-167）およびブドウ膜炎（Kitaichi et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci.,
1999, 40, 247-250）を有する患者の滑液において検出され、炎症の部位および
マクロファージからのその発現は、宿主防御においてマクロファージ機能を制御
するというメディエーターに関する役割が示唆される（Calandra et al., J. Ex
p. Med., 1994, 179, 1895-1902）。マクロファージ遊走阻害因子の活性は、ヒ
トにおける遅延過敏症および細胞性免疫とよく相関することも見出された（Bern
hagen et al., J. Exp. Med., 1996, 183, 277-282；David, Proc. Natl. Acad.
Sci. U. S. A., 1966, 56, 72-77）。タンパク質は、齧歯類における神経機能
および発生にも関係していた（Bacher et al., Mol. Med., 1998, 4, 217-230；
Matsunaga et al., J. Biol. Chem., 1999, 274, 3268-3271；Nishio et al., B
iochim. Biophys. Acta., 1999, 1453, 74-82；Suzuki et al., Brain Res., 19
99, 816, 457-462）。
【０００８】 今までのところ、マクロファージ遊走阻害因子の機能をモジュレートすること
を目的とした研究ストラテジーは、抗体（Kobayashi et al., Hepatology, 1999
, 29, 1752-1759）、アンチセンス発現（Takahashi et al., Microbiol. Immuno
l., 1999, 43, 61-67；Waeber et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 199
7, 94, 4782-4787）およびマウスにおける遺伝子ノックアウト（Bozza et al.,
J. Exp. Med., 1999, 189, 341-346）の使用を含んでいた。
【０００９】 マクロファージ遊走阻害因子活性を阻害する化合物を同定するためのアッセイ
、およびモノクローナル抗体であるマクロファージ遊走阻害因子拮抗剤の治療的
な量の投与による疾患の予防あるいは治療の方法は、各々PCT国際公開WO 98/173
14およびWO 97/29635に開示される（Bucala et al., 1997；Bucala and Chesney
, 1998）。PCT国際公開WO 96/15242は、始動開始（initiation start）部位ある
いはイントロン／エクソン境界にハイブリダイズする阻害的核酸分子の使用を通
して、マウスにおけるマクロファージ遊走阻害因子を阻害するための方法を記載
する（Wistow and Paralkar, 1996）。
【００１０】 患者に効果的な量の抗-MIF抗体あるいはその抗原結合断片を投与することを含
む、サイトカイン-媒介毒性を含む状態を治療する方法は、米国特許6,080,407に
おいて開示および請求される。MIFを標的とするアンチセンスおよびリボザイムR
NAもまた、一般的に開示される。
【００１１】 アンチセンス技術は、特異的な遺伝子産物の発現を減らすための効果的な方法
として登場しており、従って、マクロファージ遊走阻害因子発現のモジュレーシ
ョンに関して多くの治療的、診断的、研究的な応用において唯一有用であること
が証明されるかもしれない。
【００１２】 本発明は、マクロファージ遊走阻害因子発現をモジュレートするための組成物
および方法を提供する。 発明の概要 本発明は、マクロファージ遊走阻害因子をコードする核酸を標的とし、そして
マクロファージ遊走阻害因子の発現をモジュレートする、アンチセンス化合物、
特にオリゴヌクレオチドに関する。本発明のアンチセンス化合物を含む医薬組成
物およびその他の組成物もまた、提供する。さらに、細胞または組織中でマクロ
ファージ遊走阻害因子の発現をモジュレートする方法であって、前記細胞または
組織を、1またはそれ以上の本発明のアンチセンス化合物または組成物と接触さ
せることを含む、前記方法を提供する。さらに、治療的または予防的有効量の1
またはそれ以上の本発明のアンチセンス化合物または組成物を投与することによ
り、マクロファージ遊走阻害因子の発現と関連する疾患または症状を有するか、
またはかかっている可能性があると疑われる動物、特にヒトを治療する方法を提
供する。
【００１３】 発明の詳細な説明 本発明は、マクロファージ遊走阻害因子をコードする核酸分子の機能をモジュ
レートする際に使用するための、究極的には産生されるマクロファージ遊走阻害
因子の量をモジュレートする際に使用するための、オリゴマーアンチセンス化合
物、とくにオリゴヌクレオチドを利用する。これは、マクロファージ遊走阻害因
子をコードする1またはそれ以上の核酸と特異的にハイブリダイズするアンチセ
ンス化合物を提供することにより達成される。本明細書中で使用する場合、用語
“標的核酸”および“マクロファージ遊走阻害因子をコードする核酸”は、マク
ロファージ遊走阻害因子をコードするDNA、このようなDNAから転写されるRNA（
プレ-mRNAおよびmRNAを含む）、およびこのようなRNAに由来するcDNAも含む。オ
リゴマー化合物のその標的核酸との特異的ハイブリダイゼーションは、核酸の正
常な機能を妨害する。標的核酸の機能のそれに特異的にハイブリダイズする化合
物によるこのモジュレーションは、一般的に“アンチセンス”といわれる。妨害
すべきDNAの機能には、複製および転写が含まれる。妨害されるべきRNAの機能に
は、すべての生存に必要な機能、たとえばRNAのタンパク質翻訳部位への転移（t
ranslocation）、RNAからタンパク質への翻訳、1またはそれ以上のmRNA種を得る
ためのRNAのスプライシング、およびRNAに含まれる触媒活性またはRNAにより促
進される触媒活性、が含まれる。標的核酸機能によるこのような妨害の全体的な
効果は、マクロファージ遊走阻害因子の発現のモジュレーションである。本発明
の文脈において、“モジュレーション”とは、遺伝子の発現における増加（刺激
）または減少（阻害）のいずれかを意味する。本発明の文脈において、阻害は遺
伝子発現のモジュレーションの好ましい形態であり、そしてmRNAは好ましい標的
である。
【００１４】 アンチセンスに対する特異的核酸を標的とすることが好ましい。特定の核酸に
対してアンチセンス化合物を“標的化する”とは、本発明の文脈において、複数
工程のプロセスである。プロセスは通常、その機能をモジュレートすべき核酸配
列の同定からはじめる。たとえば、このことは、その発現が特定の症状または疾
患状態と関連する細胞の遺伝子（あるいはその遺伝子から転写されるmRNA）、ま
たは感染性病原体に由来する核酸分子でありうる。本発明において、標的はマク
ロファージ遊走阻害因子をコードする核酸分子である。標的化のプロセスにはま
た、アンチセンス相互作用のためにこの遺伝子内部に1または複数の部位を決定
し、所望の効果、たとえばタンパク質の発現の検出またはモジュレーション、を
結果として生じるようにすることを含む。本発明の文脈において、好ましい遺伝
子内部部位は、遺伝子のオープンリーディングフレーム（ORF）の翻訳開始コド
ンあるいは終止コドンを含む領域である。当該技術分野において既知であるよう
に、翻訳開始コドンは、典型的には5'-AUG（転写されたmRNA分子において；対応
するDNA分子においては5'-ATG）であるので、翻訳開始コドンはまた、“AUGコド
ン”、“スタートコドン”または“AUGスタートコドン”とも呼ばれる。少数の
遺伝子は、RNA配列5'-GUG、5'-UUGまたは5'-CUGを有する翻訳開始コドンを有し
、そして5'-AUA、5'-ACGおよび5'-CUGが、in vivoで機能することが示された。
このように、それぞれの事例における開始アミノ酸は典型的にはメチオニン（真
核細胞において）またはホルミルメチオニン（原核細胞において）であるにもか
かわらず、用語“翻訳開始コドン”および“スタートコドン”は、多くのコドン
配列を含むことができる。真核細胞の遺伝子および原核細胞の遺伝子は、2また
はそれ以上の代わりのスタートコドンを有する場合があり、そのいずれもが好ま
しくは特定の細胞型または組織においてまたは特定の条件のセットのもとにおい
て、翻訳開始のために利用することができる、ということも、当該技術分野にお
いて既知である。本発明の文脈において、“スタートコドン”および“翻訳開始
コドン”は、そのようなコドンの1またはそれ以上の配列にかかわらず、in vivo
で使用して、マクロファージ遊走阻害因子をコードする遺伝子から転写されるmR
NA分子の翻訳を開始する、1またはそれ以上のコドンのことをいう。
【００１５】 遺伝子の翻訳終止コドン（または“停止コドン”）は、3つの配列、すなわち
、5'-UAA、5'-UAGおよび5'-UGA（対応するDNA配列は、それぞれ、5'-TAA、5'-TA
Gおよび5'-TGA）のうちの一つを有しうることも、当該技術分野において既知で
ある。用語“スタートコドン領域”および“翻訳開始コドン領域”は、翻訳開始
コドンからいずれかの方向（すなわち、5'または3'）に約25から約50の連続する
ヌクレオチドを含む、mRNAあるいは遺伝子の部分のことを言う。同様に、用語“
停止コドン領域”および“翻訳終止コドン領域”は、翻訳終止コドンからいずれ
かの方向（すなわち、5'または3'）に約25から約50の連続するヌクレオチドを含
む、mRNAまたは遺伝子の部分のことを言う。
【００１６】 翻訳開始コドンと翻訳終止コドンとのあいだの領域のことを言うと当該技術分
野において知られているオープンリーディングフレーム（ORF）または“コード
領域”はまた、効果的に標的化されうる領域でもある。その他の標的領域には、
翻訳開始コドンから5'方向におけるmRNAの部分、そしてしたがってmRNAの5'キャ
ップ部位と翻訳開始コドンとのあいだのヌクレオチドまたは遺伝子上の対応する
ヌクレオチドを含むもの、のことをいうと当該技術分野において知られている5'
非翻訳領域（5'UTR）、そして翻訳終止コドンから3'方向におけるmRNAの部分、
そしてしたがってmRNAの翻訳終止コドンと3'末端とのあいだのヌクレオチドまた
は遺伝子上の対応するヌクレオチドを含むもの、のことをいうと当該技術分野に
おいて知られている3'非翻訳領域（3'UTR）、が含まれる。mRNAの5'キャップに
は5'-5'三リン酸結合を介して、mRNAの最も5'側の残基と結合するN7-メチル化グ
アノシン残基を含む。mRNAの5'キャップ領域は、5'キャップ構造それ自体だけで
なく、キャップに隣接する最初の50ヌクレオチドも含むと考えられている。5'キ
ャップ領域もまた、好ましい標的領域でありうる。
【００１７】 いくつかの真核細胞mRNA転写物は直接的に翻訳されるが、多くは1またはそれ
以上の“イントロン”として知られる領域を含有し、それらは翻訳される前に転
写物から切り出される。残りの（そしてしたがって翻訳される）領域は、 “エ
クソン”として知られ、そして一緒にスプライシングされて連続的なmRNA配列を
形成する。mRNAスプライス部位、すなわち、イントロン-エクソン結合もまた、
好ましい標的領域である場合があり、そして特に異常なスプライシングが疾患に
関与しているか、あるいは特定のmRNAスプライス産物の過剰産生が疾患に関与し
ている状況において、特に有用である。再構成または欠損による異常な融合結合
もまた、好ましい標的である。イントロンも有効である場合があり、そしてした
がって、たとえばDNAまたはプレ-mRNAを標的とするアンチセンス化合物のための
標的領域が好ましい場合があることもまた、見出した。
【００１８】 いったん1またはそれ以上の標的部位を同定したら、標的に対して十分に相補
的な、すなわち、十分によくそして十分に特異的にハイブリダイズする、オリゴ
ヌクレオチドを選択し、所望の効果を得る。
【００１９】 本発明の文脈において、“ハイブリダイゼーション”とは、相補的ヌクレオシ
ドまたはヌクレオチド塩基間のワトソン-クリック水素結合、フーグスティーン
水素結合または逆フーグスティーン水素結合でありうる、水素結合を意味する。
たとえば、アデニンおよびチミンは相補的な核塩基であり、水素結合を形成する
ことを通じて対合する。本明細書中で使用する場合、“相補的”とは、2つのヌ
クレオチド間で正確に対合するための能力のことをいう。たとえば、オリゴヌク
レオチドの特定の位置のヌクレオチドがDNAまたはRNA分子の同一の位置でヌクレ
オチドと水素結合することができる場合、オリゴヌクレオチドおよびDNAまたはR
NAは、その位置において互いに相補的であると考えられる。オリゴヌクレオチド
およびDNAまたはRNA は、それぞれの分子中での十分な数の対応する位置が、互
いに水素結合することができるヌクレオチドにより占められている場合、互いに
相補的である。したがって、“特異的にハイブリダイズ可能”および“相補的”
は、安定でそして特異的な結合がオリゴヌクレオチドとDNAまたはRNA標的とのあ
いだで生じるような、十分な程度の相補性または正確な対合を示すために使用さ
れる用語である。アンチセンス化合物の配列は、特異的にハイブリダイズ可能で
あるために、その標的核酸の配列と100%の相同性がある必要はないことは、当該
技術分野において理解されている。アンチセンス化合物は、標的DNAまたはRNA分
子に対する化合物の結合が標的DNAまたはRNAの正常な機能を妨害して利用できな
いようにし、そして特異的な結合が所望される条件下、すなわち、in vivoアッ
セイまたは治療の場合には生理学的条件下、そしてin vitroアッセイの場合には
、アッセイを行う条件下にて、非-標的配列に対するアンチセンス化合物の非-特
異的結合を妨害するための十分な程度の相補性が存在する場合、特異的にハイブ
リダイズ可能である。
【００２０】 アンチセンス化合物は、一般的に、研究用試薬および診断薬として使用される
。たとえば、当業者はしばしば、正確な特異性により遺伝子発現を阻害すること
ができるアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用して、特定遺伝子の機能を解明
する。たとえば、アンチセンス化合物を使用して、生物学的経路の様々なメンバ
ーの機能どうしを区別することもある。アンチセンスモジュレーションは、した
がって、研究用途として使用された。
【００２１】 アンチセンスの特異性および感受性も、治療用途として当業者に利用される。
アンチセンスオリゴヌクレオチドを、動物およびヒトにおける疾患状態を治療す
る際の治療部分として使用した。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトに対
して安全にそして効果的に投与され、そして多くの臨床試験が現在進行中である
。したがって、オリゴヌクレオチドは、細胞、組織および動物、特にヒトの治療
のための治療計画において有用なものとして形成することができる、有用な治療
様式でありうることが確立される。本発明の文脈において、用語“オリゴヌクレ
オチド”とは、リボ核酸（RNA）またはデオキシリボ核酸（DNA）のオリゴマーま
たはポリマー、またはそれらの模倣体のことをいう。この用語には、天然に存在
する核塩基、糖および共有ヌクレオシド間（バックボーン）結合、および同様に
機能する非-天然に存在する部分を有するオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌ
クレオチドが含まれる。このような修飾されたまたは置換されたオリゴヌクレオ
チドは、たとえば、細胞取り込みの亢進、核酸標的に対する親和性の亢進、そし
てヌクレアーゼの存在下における安定性の増加などの望ましい特性のため、しば
しば天然の型より好ましい。
【００２２】 アンチセンスオリゴヌクレオチドは、アンチセンス化合物の好ましい形態であ
る一方、本発明は、以下に記載するようなオリゴヌクレオチド模倣体（しかし、
これらのものには限定されない）を含む、その他のオリゴマーアンチセンス化合
物を包含する。本発明に従うアンチセンス化合物は、好ましくは、約8〜約30核
塩基（すなわち、約8〜約30の連結したヌクレオシド）を含む。具体的な好まし
いアンチセンス化合物は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、さらに好ましくは
約12〜約25核塩基を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドである。当該技術分野
において知られているように、ヌクレオシドは塩基-糖の組み合わせである。ヌ
クレオシドの塩基部分は、通常はヘテロ環式塩基である。このようなヘテロ環式
塩基の2つの最も一般的なクラスは、プリンとピリミジンである。ヌクレオチド
は、ヌクレオシドの糖部分に共有結合したリン酸基をさらに含む、ヌクレオシド
である。ペントフラノシル糖を含むそれらのヌクレオシドに対して、リン酸基は
、糖の2'、3'または5'ヒドロキシル部分のいずれかに結合することができる。オ
リゴヌクレオチドを形成する際に、リン酸基が隣接するヌクレオシドと互いに共
有結合し、直鎖ポリマー化合物を形成する。引き続いて、この直鎖ポリマー化合
物のそれぞれの末端がさらに一緒になって、環状構造を形成することができるが
、しかしながら、開環直鎖構造が一般的には好ましい。オリゴヌクレオチド構造
中において、リン酸基とは、一般的には、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間
バックボーンを形成するものと言われる。RNAおよびDNAの正常な結合またはバッ
クボーンは、3'から5'のホスホジエステル結合である。
【００２３】 本発明において有用な好ましいアンチセンス化合物の具体的な例には、修飾バ
ックボーンまたは非-天然ヌクレオシド間結合を含有するオリゴヌクレオチドが
含まれる。本明細書中で定義する場合、修飾バックボーンを有するオリゴヌクレ
オチドには、バックボーン中にリン原子を保持するものや、バックボーン中にリ
ン原子を有さないものが含まれる。本明細書の目的のため、そして当該技術分野
において時々参照される場合、そのヌクレオシド間バックボーン中にリン原子を
有さない修飾オリゴヌクレオチドもまた、オリゴヌクレオシドであると考えるこ
とができる。
【００２４】 好ましい修飾オリゴヌクレオチドバックボーンには、たとえば、ホスホロチオ
エート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステ
ル、アミノアルキルホスホトリエステル、3'-アルキレンホスホネートおよびキ
ラルホスホネートを含むメチルおよびその他のアルキルホスホネート、ホスフィ
ネート、3'-アミノホスホールアミデートおよびアミノアルキルホスホールアミ
デートを含むホスホールアミデート、チオノホスホールアミデート、チオノアル
キルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、および正常な3'-5'結
合を有するボラノホスホネート、2'-5'結合したこれらの類似体、そしてヌクレ
オシドユニットの隣接する塩基対が、5'-3'に対して3'-5'または5'-2'に対して2
'-5'に結合する、逆向きの極性を有するもの、が含まれる。様々な塩、混合塩、
そして遊離酸型も含まれる。
【００２５】 上述したリン-含有結合の調製を教示する代表的な米国特許には、U.S.: 3,687
,808；4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,196；5,188,897；5,264,423；
5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,
496；5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,306；5
,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361；および5,625,050が含まれるが、
これらには限定されず、それらの特定のものは、本出願により一般に所有される
ものであり、そして参考文献としてそのそれぞれを本明細書中に援用する。
【００２６】 リン原子を含まない好ましい修飾オリゴヌクレオチドバックボーンは、短鎖ア
ルキルあるいはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合へテロ原子そしてアル
キルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または1またはそれ以上の短鎖
へテロ原子またはヘテロ環式ヌクレオシド間結合により形成される、バックボー
ンを有する。これらには、モルホリノ結合（部分的にヌクレオシドの糖部分から
形成される）；シロキサンバックボーン；スルフィド、スルホキシドおよびスル
ホンバックボーン；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチルバックボーン；メ
チレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチルバックボーン；アルケン含有バ
ックボーン；スルファメートバックボーン；メチレンイミノおよびメチレンヒド
ラジノバックボーン；スルホネートおよびスルホンアミドバックボーン；アミド
バックボーン；および混合N、O、SおよびCH2構成要素部分を有するその他のもの
、を有するものが含まれる。
【００２７】 上記のオリゴヌクレオシドの調製を教示する代表的な米国特許には、U.S.: 5,
034,506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,264,56
2；5,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677；5,5
41,307；5,561,225；5,596,086；5,602,240；5,610,289；5,602,240；5,608,046
；5,610,289；5,618,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,677,437；およ
び5,677,439が含まれるが、これらには限定されず、それらの特定のものは、本
出願により一般に所有されるものであり、そして参考文献としてそのそれぞれを
本明細書中に援用する。
【００２８】 その他の好ましいオリゴヌクレオチド模倣体において、ヌクレオチドユニット
の糖およびヌクレオシド間結合の両方、すなわち、バックボーンを、新規の基に
より置換する。塩基ユニットは、適した核酸標的化合物とのハイブリダイゼーシ
ョンのための維持される。優れたハイブリダイゼーション特性を有すると示され
たそのようなオリゴマー化合物の一つであるオリゴヌクレオチド模倣体は、ペプ
チド核酸（PNA）とも呼ばれている。PNA化合物において、オリゴヌクレオチドの
糖-バックボーンは、アミド含有バックボーン、特にアミノエチルグリシンバッ
クボーンにより置換される。核塩基を保持し、そしてバックボーンのアミド部分
のアザ窒素原子に直接的または間接的に結合する。PNA化合物の調製を教示する
代表的な米国特許には、U.S.: 5,539,082；5,714,331；および5,719,262が含ま
れるが、これらだけには限定されず、そのそれぞれを本明細書中に参考文献とし
て援用する。PNA化合物のさらなる教示は、Nielsenら（Science, 1991, 254, 14
97-1500）中に見出すことができる。
【００２９】 本発明の最も好ましい態様は、ホスホロチオエートバックボーンを有するオリ
ゴヌクレオチドおよびヘテロ原子バックボーンを有するオリゴヌクレオシドであ
り、特に上述の米国特許5,489,677の-CH2-NH-O-CH2-、-CH2-N（CH3）-O-CH2-〔
メチレン（メチルイミノ）またはMMIバックボーン〕、-CH2-O-N（CH3）-CH2-、-
CH2-N（CH3）-N（CH3）-CH2-および-O-N（CH3）-CH2-CH2-〔ここで、天然のホス
ホジエステルバックボーンは-O-P-O-CH2-として示される〕そして上述の米国特
許5,602,240のアミドバックボーンである。上述した米国特許5,034,506のモルホ
リノバックボーン構造を有するオリゴヌクレオチドもまた好ましい。
【００３０】 修飾オリゴヌクレオチドは、1またはそれ以上の置換糖部分も含有する。好ま
しいオリゴヌクレオチドは、2'位で以下のものの一つを含む：OH；F；O-、S-、
またはN-アルキル；O-、S-、またはN-アルケニル；O-、S-またはN-アルキニル；
またはO-アルキル-O-アルキル、ここでアルキル、アルケニルおよびアルキニル
は、置換または非置換のC1〜C10アルキルまたはC2〜C10アルケニルおよびアルキ
ニルでありうる。O［（CH2）nO］mCH3、O（CH2）nOCH3、O（CH2）nNH2、O（CH2
）nCH3、O（CH2）nONH2、およびO（CH2）nON［（CH2）nCH3）］2、ここでnおよ
びmは1から約10である、が特に好ましい。その他の好ましいオリゴヌクレオチド
は、2'位に以下のものの一つを含む:C1〜C10の低級アルキル、置換低級アルキル
、アルカリール、アラルキル、O-アルカリールまたはO-アラルキル、SH、SCH3、
OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、ヘテロシ
クロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキ
ルアミノ、置換シリル、RNA切断基、リポーター基、インターカレーター、オリ
ゴヌクレオチドの薬物動態特性を向上するための基、またはオリゴヌクレオチド
の薬理特性を向上するための基、そして同様の特性を有するその他の置換基を含
む。好ましい修飾には、2'-メトキシエトキシ（2'-O-CH2CH2OCH3、2'-O-（2-メ
トキシエチル）または2'-MOEとしても知られる）（Martin et al., Helv. Chim.
Acta, 1995, 78, 486-504）、すなわち、アルコキシアルコキシ基が含まれる。
さらに好ましい修飾には、2'-ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、本明
細書の以下の実施例に記載する場合、2'-DMAOEとしても知られるO（CH2）2ON（C
H3）2基、そして2'-ジメチルアミノエトキシエトキシ（当該技術分野において2'
-O-ジメチルアミノエトキシエチルまたは2'-DMAEOEとしても知られる）、すなわ
ち、本明細書中の以下の実施例において2'-O-CH2-O-CH2-N（CH2）2とも記載され
る、が含まれる。
【００３１】 その他の好ましい修飾には、2'-メトキシ（2'-O-CH3）、2'-アミノプロポキシ
（2'-OCH2CH2CH2NH2）および2'-フルオロ（2'-F）が含まれる。同様の修飾もま
た、オリゴヌクレオチドのその他の位、特に3'末端ヌクレオチドまたは2'-5'結
合オリゴヌクレオチド中の糖の3'位および5'末端ヌクレオチドの5'位において作
製することもできる。オリゴヌクレオチドは、ペントフラノシル糖の代わりにシ
クロブチル部分などの糖模倣体を有する場合もある。このような修飾糖構造の調
製を教示する代表的な米国特許には、U.S.: 4,981,957；5,118,800；5,319,080
；5,359,044；5,393,878；5,446,137；5,466,786；5,514,785；5,519,134；5,56
7,811；5,576,427；5,591,722；5,597,909；5,610,300；5,627,053；5,639,873
；5,646,265；5,658,873；5,670,633；および5,700,920が含まれるが、これらに
は限定されず、それらの特定のものは、本出願により一般に所有されるものであ
り、そしてそのそれぞれはその全体を参考文献として本明細書中に援用する。
【００３２】 オリゴヌクレオチドには、核塩基（しばしば当該技術分野において単に“塩基
”としても呼ばれる）修飾または置換も含まれうる。本明細書中に使用される場
合、“非修飾”または“天然”核塩基には、プリン塩基、アデニン（A）および
グアニン（G）、そしてピリミジン塩基、チミン（T）、シトシン（C）およびウ
ラシル（U）が含まれる。修飾核塩基には、その他の合成および天然核塩基、た
とえば5-メチルシトシン（5-me-C）、5-ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン
、ヒポキサンチン、2-アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの6-メチルおよ
びその他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの2-プロピルおよびその他
のアルキル誘導体、2-チオウラシル、2-チオチミンおよび2-チオシトシン、5-ハ
ロウラシルおよびシトシン、5-プロピニルウラシルおよびシトシン、6-アゾのウ
ラシル、シトシンおよびチミン、5-ウラシル（シュードウラシル）、4-チオウラ
シル、8-ハロ、8-アミノ、8-チオール、8-チオアルキル、8-ヒドロキシルおよび
その他の8-置換アデニンおよびグアニン、5-ハロ、特に5-ブロモ、5-トリフルオ
ロメチルおよびその他の5-置換ウラシルおよびシトシン、7-メチルグアニンおよ
び7-メチルアデニン、8-アザグアニンおよび8-アザアデニン、7-デアザグアニン
および7-デアザアデニンおよび3-デアザグアニンおよび3-デアザアデニンが含ま
れる。さらなる核塩基には、米国特許No. 3,687,808に開示されたもの、Concise
Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858-859、Kroschw
itz, J.I., ed. John Wiley & Sons, 1990に開示されたもの、Englisch et al.,
Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613に開示されたもの
、そしてSanghvi, Y.S., Chapter 15, Antisense Research and Applications,
pages 289-302, Crooke, S.T. and Lebleu, B. , ed., CRC Press, 1993により
開示されたもの、が含まれる。これらの核塩基の特定のものは、本発明のオリゴ
マー化合物の結合親和性を増加させるために特に有用である。これらには、2-ア
ミノプロピルアデニン、5-プロピニルウラシルおよび5-プロピニルシトシンを含
む、5-置換ピリミジン、6-アザピリミジンおよびN-2、N-6およびO-6置換プリン
が含まれる。5-メチルシトシン置換は、核酸二重鎖安定性を0.6〜1.2℃増加させ
ることが示され（Sanghvi, Y.S., Crooke, S.T. and Lebleu, B., eds., Antise
nse Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278
）、そして現在は好ましい塩基置換であり、2'-O-メトキシエチル糖修飾と組み
合わせた場合にさらにより特に好ましい。
【００３３】 上述した修飾核塩基の特定のものおよびその他の修飾核塩基の調製を教示する
代表的な米国特許には、上述したU.S. 3,687,808、およびU.S.: 4,845,205；5,1
30,302；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,187；5,459,255
；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,594,121；5,59
6,091；5,614,617；および5,681,941が含まれるが、これらには限定されず、そ
れらの特定のものは、本出願により一般に所有されるものであり、そしてそのそ
れぞれは参考文献として本明細書中に援用し、そして米国特許5,750,692が含ま
れ、これは本出願により一般に所有されるものであり、そして参考文献として本
明細書中に援用する。
【００３４】 本発明のオリゴヌクレオチドのその他の修飾には、オリゴヌクレオチドの活性
、細胞分布、または細胞取り込みを向上する、化学的にオリゴヌクレオチドに結
合する1またはそれ以上の部分または複合体が含まれる。そのような部分には、
脂質部分、たとえばコレステロール部分（Letsinger et al., Proc. Natl. Acad
. Sci. USA, 1989, 86, 6553-6556）、コール酸（Manoharan et al., Bioorg. M
ed. Chem. Let., 1994, 4, 1053-1060）、チオエーテル、たとえば、ヘキシル-S
-トリチルチオール（Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660, 30
6-309；Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765-2770）、
チオコレステロール（Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533-5
38）、脂肪族鎖、たとえば、ドデカンジオールまたはウンデシル残基（Saison-B
ehmoaras et al., EMBO J., 1991, 10, 1111-1118；Kabanov et al., FEBS Lett
., 1990, 259, 327-330；Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75, 49-54）、
リン脂質、たとえば、ジ-ヘキサデシル-rac-グリセロールまたはトリエチルアン
モニウム1,2-ジ-O-ヘキサデシル-rac-グリセロ-3-H-ホスホネート（Manoharan e
t al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654；Shea et al., Nucl. Acids
Res., 1990, 18, 3777-3783）、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖（M
anoharan et al., Nucleosides & Nucleoside, 1995, 14, 969-973）、またはア
ダマンタン酢酸（Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654
）、パルミチル部分（Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 2
29-237）、またはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ-カルボニル-オキシ
コレステロール部分（Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277,
923-937）が含まれるが、これらには限定されない。
【００３５】 この様なオリゴヌクレオチド複合体の調製を教示する代表的な米国特許には、
U.S.: 4,828,979；4,948,882；5,218,105；5,525,465；5,541,313；5,545,730；
5,552,538；5,578,717, 5,580,731；5,580,731；5,591,584；5,109,124；5,118,
802；5,138,045；5,414,077；5,486,603；5,512,439；5,578,718；5,608,046；4
,587,044；4,605,735；4,667,025；4,762,779；4,789,737；4,824,941；4,835,2
63；4,876,335；4,904,582；4,958,013；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,
082,830；5,112,963；5,214,136；5,245,022；5,254,469；5,258,506；5,262,53
6；5,272,250；5,292,873；5,317,098；5,371,241, 5,391,723；5,416,203, 5,4
51,463；5,510,475；5,512,667；5,514,785；5,565,552；5,567,810；5,574,142
；5,585,481；5,587,371；5,595,726；5,597,696；5,599,923；5,599,928および
5,688,941が含まれるが、これらには限定されず、それらの特定のものは、本出
願により一般に所有されるものであり、そしてそのそれぞれは参考文献として本
明細書中に援用される。
【００３６】 所定の化合物中のすべての位置を均一に修飾されることが必要とはされず、そ
して実際に、一つ以上の上述した修飾を、単一の化合物中あるいはオリゴヌクレ
オチド中の単一のヌクレオシドにおいても組み込むことができる。本発明には、
キメラ化合物であるアンチセンス化合物も含まれる。本発明の文脈において、“
キメラ”アンチセンス化合物または“キメラ”は、2つまたはそれ以上の化学的
に特徴的な領域を含有するアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドであり
、それぞれが少なくとも一つのモノマーユニット、すなわち、オリゴヌクレオチ
ド化合物の場合にヌクレオチドから形成される。これらのオリゴヌクレオチドは
、典型的には少なくとも一つの領域を含有し、ここでオリゴヌクレオチドは、オ
リゴヌクレオチドに対して、増加したヌクレアーゼ分解耐性、増加した細胞取り
込みおよび／または標的核酸に対する増加した結合親和性を付与するように、修
飾される。オリゴヌクレオチドの追加の領域は、RNA:DNAまたはRNA:RNAハイブリ
ッドを切断することができる酵素に対する基質として働くことができる。例を挙
げると、RNase Hは、RNA:DNA二重鎖のRNA鎖を切断する、細胞性のエンドヌクレ
アーゼである。RNase Hの活性化により、したがって、結果としてRNA標的の切断
を引き起こし、それにより遺伝子発現のオリゴヌクレオチド阻害の効率を非常に
向上させる。結果として、キメラオリゴヌクレオチドを使用する場合に、同一の
標的領域に対してハイブリダイズするホスホロチオエートデオキシオリゴヌクレ
オチドの場合と比較して、しばしばより短いオリゴヌクレオチドにより匹敵する
結果を得ることができる。RNA標的の切断は、ゲル電気泳動により、そして必要
な場合には当該技術分野において既知の関連する核酸ハイブリダイゼーション技
術により、日常的に検出することができる。
【００３７】 本発明のキメラアンチセンス化合物は、2つまたはそれ以上のオリゴヌクレオ
チド、修飾オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシドおよび／または上述したオ
リゴヌクレオチド模倣体の混成の構造として形成することができる。このような
化合物は、 当該技術分野においてハイブリッドまたはギャップマーとも呼ばれ
ている。このようなハイブリッド構造の調製を教示する代表的な米国特許には、
U.S.: 5,013,830；5,149,797；5,220,007；5,256,775；5,366,878；5,403,711；
5,491,133；5,565,350；5,623,065；5,652,355；5,652,356；および5,700,922が
含まれるが、これらには限定されず、それらの特定のものは、本出願により一般
に所有されるものであり、そしてそのそれぞれは全体として参考文献として本明
細書中に援用される。
【００３８】 本発明に従って使用されるアンチセンス化合物は、周知の固相合成技術を介し
て、容易にそして日常的に作製することができる。このような合成のための装置
は、たとえばApplied Biosystems（Foster City, CA）を含むいくつかの供給者
により販売されている。このような合成のための当該技術分野において既知のい
ずれかその他の手段を、追加的にまたは代替的に使用することができる。同様な
技術を使用してホスホロチオエートおよびアルキル化誘導体などのオリゴヌクレ
オチドを調製することは周知である。
【００３９】 本発明のアンチセンス化合物は、in vitroで合成され、そして生物学的起源の
アンチセンス組成物またはアンチセンス分子のin vivo合成を指向するように設
計された遺伝子ベクター構築物を含まない。
【００４０】 本発明の化合物を、取り込み、分布および／または吸収を助けるために、たと
えば、リポソーム、受容体標的化分子、経口、直腸、局所またはその他の製剤と
して、混合し、カプセル化し、複合体化することができ、またはそうでなければ
、その他の分子、分子構造、または化合物の混合物と結合させてもよい。そのよ
うな取り込み、分布および／または吸収を助ける製剤の調製を教示する代表的な
米国特許には、U.S.: 5,108,921；5,354,844；5,416,016；5,459,127；5,521,29
1；5,543,158；5,547,932；5,583,020；5,591,721；4,426,330；4,534,899；5,0
13,556；5,108,921；5,213,804；5,227,170；5,264,221；5,356,633；5,395,619
；5,416,016；5,417,978；5,462,854；5,469,854；5,512,295；5,527,528；5,53
4,259；5,543,152；5,556,948；5,580,575；および5,595,756が含まれるが、そ
れらには限定されず、そのそれぞれを参考文献として本明細書中に援用する。
【００４１】 本発明のアンチセンス化合物は、いずれかの医薬的に許容可能な塩、エステル
、またはそのようなエステルの塩、またはヒトを含む動物に投与する際にその生
物学的に活性な代謝物または残留物を（直接的にまたは間接的に）提供すること
ができるいずれか他の化合物を包含する。したがって、たとえば、開示から、プ
ロドラッグおよび医薬的に許容可能な本発明の化合物の塩、そのプロドラッグの
医薬的に許容可能な塩、およびその他の生物学的等価物も導き出される。
【００４２】 用語“プロドラッグ”は、内在性の酵素またはその他の化学物質および／また
は条件の作用により、その体内または細胞内で活性化型（すなわち、薬物）に変
換される、不活性型で調製される治療剤のことを示す。特に、本発明のオリゴヌ
クレオチドのプロドラッグ版は、GosselinらのWO 93/24510（1993年12月9日に発
行）またはImbachらのWO 94/26764に開示された方法に従うSATE［（S-アセチル-
2-チオエチル）ホスフェート］誘導体として調製される。
【００４３】 用語“医薬的に許容可能な塩”とは、生理学的または医薬的に許容可能な本発
明の化合物の塩：すなわち、親化合物の所望の生物学的活性を保持し、そしてそ
れについての所望しない毒性効果を与えない塩のことをいう。
【００４４】 医薬的に許容可能な塩基付加塩は、金属またはアミン、たとえばアルカリおよ
びアルカリ土類金属または有機アミンなどにより形成される。カチオンとして使
用される金属の例は、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどで
ある。適したアミンの例は、N,N'-ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカ
イン、コリン、ジエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、エチレンジアミ
ン、N-メチルグルカミン、およびプロカイン（たとえば、Berge et al., “Phar
maceutical Salts,” J. of Pharma Sci., 1977, 66, 1-19を参照）である。前
記酸性化合物の塩基付加塩は、遊離酸型を十分な量の所望の塩基と接触させて、
共有結合様式で塩を生成することにより、調製する。遊離酸型は、塩型を酸と接
触させることにより、そして遊離酸を従来の様式で単離することにより、再生す
ることができる。遊離酸型は、そのそれぞれの塩型とは、極性溶媒中への溶解性
などの特定の生理学的特性においていくらか異なっているが、しかしそれ以外は
、本発明の目的のためには、塩はそれらそれぞれの遊離酸と等価である。本明細
書中で使用される場合、“医薬的な付加塩”には、本発明の組成物の構成要素の
一つの酸型の医薬的に許容可能な塩が含まれる。これらには、アミンの有機酸塩
または無機酸塩が含まれる。好ましい酸塩は、塩酸塩、酢酸塩、サリチル酸塩、
硝酸塩およびリン酸塩である。その他の適した医薬的に許容可能な塩は、当業者
に周知であり、そして様々な無機酸および有機酸の塩基性塩が含まれ、たとえば
、無機酸を有するものとしては、たとえば塩酸、臭化水素酸、硫酸またはリン酸
など；有機酸を有するものとしてはカルボン酸、スルホン酸、スルホ酸またはリ
ン酸またはN-置換スルファミン酸、たとえば酢酸、プロピオン酸、グリコール酸
、コハク酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、メチルマレイン酸、フマル酸
、リンゴ酸、酒石酸、乳酸、シュウ酸、グルコン酸、グルカル酸、グルクロン酸
、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、サリチル酸、4-アミノサリチル
酸、2-フェノキシ安息香酸、2-アセトキシ安息香酸、エンボン酸（embonic acid
）、ニコチン酸またはイソニコチン酸；そしてアミノ酸を有するものとしては、
本来はタンパク質の合成に関連する20個のα-アミノ酸、たとえばグルタミン酸
、またはアスパラギン酸など、そしてまた、フェニル酢酸、メタンスルホン酸、
エタンスルホン酸、2-ヒドロキシエタンスルホン酸、エタン-1,2-ジスルホン酸
、ベンゼンスルホン酸、4-メチルベンゼンスルホン酸、ナフタレン-2-スルホン
酸、ナフタレン-1,5-ジスルホン酸、2-または3-ホスホグリセリン酸、グルコー
ス-6-ホスフェート、N-シクロヘキシルスルファミン酸（シクラメートの形成を
伴う）を有するもの、またはその他の酸有機化合物、たとえば、アスコルビン酸
などを有するものが含まれる。化合物の医薬的に許容可能な塩もまた、医薬的に
許容可能なカチオンにより調製することができる。適した医薬的に許容可能なカ
チオンは、当業者に周知であり、そしてアルカリ、アルカリ土類、アンモニウム
および第四アンモニウムカチオンが含まれる。炭酸塩または炭酸水素塩もまた可
能である。
【００４５】 オリゴヌクレオチドについて、医薬的に許容可能な塩の好ましい例には、（a
）ナトリウム、カリウム、アンモニウム、マグネシウム、カルシウム、スペルミ
ンおよびスペルミジンなどのポリアミンなどのカチオンにより形成される塩；（
b）無機酸、たとえば塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸などにより形成さ
れる酸付加塩；（c）有機酸、たとえば酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、マ
レイン酸、フマル酸、グルコン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息
香酸、タンニン酸、パルミチン酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレン
スルホン酸、メタンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、ナフタレンジスルホン
酸、ポリガラクツロン酸などにより形成される塩；そして（d）塩素、臭素、お
よびヨウ素などの元素アニオンから形成される塩；が含まれるが、これらには限
定されない。
【００４６】 本発明のアンチセンス化合物は、診断薬、治療薬、予防薬、そして研究用試薬
およびキットとして使用することができる。治療薬として、マクロファージ遊走
阻害因子の発現をモジュレートすることにより治療することができる疾患または
症状を有することが疑われる動物、好ましくはヒトを、本発明に従うアンチセン
ス化合物を投与することにより治療する。本発明の化合物を、有効量のアンチセ
ンス化合物を適した医薬的に許容可能な希釈剤または担体に添加することにより
、医薬組成物中で利用することができる。本発明のアンチセンス化合物および方
法の使用はまた、予防的、たとえば、感染、炎症または腫瘍形成を予防しまたは
遅延させるためにも有用である場合がある。
【００４７】 これらの化合物がマクロファージ遊走阻害因子をコードする核酸に対してハイ
ブリダイズし、この事実を探求するためにサンドイッチアッセイおよびその他の
アッセイを容易に構築することができるため、本発明のアンチセンス化合物は、
研究用としてそして診断薬として有用である。本発明のアンチセンスオリゴヌク
レオチドのマクロファージ遊走阻害因子をコードする核酸とのハイブリダイゼー
ションは、当該技術分野において既知の手段により検出することができる。この
ような手段には、オリゴヌクレオチドに対する酵素の複合化、オリゴヌクレオチ
ドの放射標識またはいずれかその他の適した検出手段を含むことができる。サン
プル中のマクロファージ遊走阻害因子のレベルを検出するためのこの様な検出手
段を使用するキットもまた、調製することができる。
【００４８】 本発明にはまた、本発明のアンチセンス化合物を含む医薬組成物および製剤が
含まれる。本発明の医薬組成物は、局所治療または全身治療が所望されるかどう
か、そして治療すべき領域に依存して、多数の方法により投与することができる
。投与は、局所（眼を含み、および膣および直腸送達を含む粘膜に対するものを
含む）、肺、たとえば、ネブライザーによるものを含む、粉末またはエアロゾル
の吸入または吹き込みによるもの；気管内、鼻内、表皮、および経皮）、経口ま
たは非経口により行うことができる。非経口投与には、静脈内、動脈内、皮下、
腹腔内または筋肉内の注射または注入；または頭蓋内、たとえば、くも膜下投与
または脳室内投与が含まれる。少なくとも一つの2'-O-メトキシエチル修飾を有
するオリゴヌクレオチドは、経口投与のために特に有用であると考えられている
。
【００４９】 局所投与のための医薬組成物および製剤には、経皮パッチ、軟膏、ローション
、クリーム、ゲル、ドロップ、滴剤、坐剤、スプレー剤、液剤、および粉剤が含
まれうる。従来からの医薬的な担体、液体、粉末または油状基材、増粘剤などは
、必要とされるかまたは所望される場合がある。コートしたコンドーム、手袋な
どもまた有用である。
【００５０】 経口投与のための組成物および製剤には、粉末または顆粒、懸濁剤または水溶
液または非水性媒体中溶液、カプセル、サシェ、または錠剤などが含まれる。増
粘剤、着香剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤または結合剤が好ましい場合がある。
【００５１】 非経口投与、くも膜下投与または脳室内投与のための組成物および製剤には、
バッファー、希釈剤およびその他の適した添加物、たとえば浸透亢進剤、担体化
合物、およびその他の医薬的に許容可能な担体または賦形剤もまた含有しうる、
滅菌水溶液が含まれうる。
【００５２】 本発明の医薬組成物には、溶液、エマルジョン、およびリポソーム含有製剤が
含まれるが、これらには限定されない。これらの組成物は、既成液体、自己乳化
性固体そして自己乳化性半固体が含まれる、様々な構成要素から生成することが
できるが、これらには限定されない。
【００５３】 単位用量剤形中に容易に提供ことができる本発明の医薬製剤は、医薬業界にお
いて周知の従来技術にしたがって調製することができる。このような技術には、
活性有効成分と1または複数の医薬的担体または1または複数の医薬的賦形剤とを
組み合わせる工程が含まれる。一般的には、均質にそして緊密に、活性有効成分
と液体担体または正確に分割した固体担体またはその両方と組み合わせ、その後
必要とされる場合には生成物を成型することにより、製剤を調製する。
【００５４】 本発明の組成物は、たとえば錠剤、カプセル、液体シロップ、軟ゲル、坐剤、
および浣腸剤などの、しかしこれらには限定されない、多くの可能性のある用量
剤形のいずれか中に製剤化することができる。本発明の組成物はまた、水性媒体
、非水性媒体または混合媒体中の懸濁剤として製剤化することもできる。水性懸
濁剤はさらに、たとえば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトー
ルおよび／またはデキストランを含む懸濁剤の粘度を上昇させる物質を含有して
もよい。懸濁剤はまた、安定化剤を含有していてもよい。
【００５５】 本発明の一態様において、医薬組成物を製剤化し、そして泡状物として使用す
ることができる。医薬的な泡状物には、エマルジョン、マイクロエマルジョン、
クリーム剤、ジェリー剤、およびリポソーム剤などの製剤を含むが、これらのも
のには限定されない。その性質において基本的に同様である一方、これらの製剤
は、最終生成物の構成要素および密度において変化する。このような組成物およ
び製剤の調製は、一般的に医薬および製剤の分野における当業者に知られており
、そして本発明の組成物の製剤に対して適用することができる。
【００５６】 エマルジョン 本発明の組成物は、エマルジョンとして調製しそして製剤化することができる
。エマルジョンは、通常は直径0.1μmを超える液滴の形状で、一つの液体を別の
液体中に分散させた典型的には不均質の系である（Idson, in Pharmaceutical D
osage Forms, Lieberman, Rieger and Banker（Eds.）, 1988, Marcel Dekker,
Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199；Rosoff, in Pharmaceutical Dosage
Forms, Lieberman, Rieger and Banker（Eds.）, 1988, Marcel Dekker, Inc.,
New York, N.Y., Volume 1, p. 245；Block in Pharmaceutical Dosage Forms,
Lieberman, Rieger and Banker（Eds.）, 1988, Marcel Dekker, Inc., New Yo
rk, N.Y., volume 2, p. 335；Higuchi et al., in Remington's Pharmaceutica
l Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1985, p. 301）。エマルジョ
ンは、しばしば、互いに十分に混合され分散された2種の不混和性の液体相を含
む二相システムである。一般的には、エマルジョンは、油中水型の種（w/o）ま
たは水中油型の種（o/w）のいずれかでありうる。液体相がバルクな油相中によ
く分離され微小滴として分散されている場合、得られた組成物を油中水型（w/o
）エマルジョンと呼ぶ。あるいは、油相がバルクな液体相中によく分離され微小
滴として分散されている場合、得られた組成物を水中油型（o/w）エマルジョン
と呼ぶ。エマルジョンは、分散相と、液体相、油相のいずれか中に溶液としてあ
るいは別々の相としてそれ自体として存在していてもよい活性な薬物と、に加え
て、さらに要素を包含していてもよい。乳化剤、安定化剤、色素、および抗酸化
剤などの医薬的な賦形剤が、必要に応じてエマルジョン中に存在していてもよい
。医薬的なエマルジョンは、たとえば、油中水中油型（o/w/o）および水中油中
水型（w/o/w）エマルジョンの場合のような、2種以上の相を含む、マルチエマル
ジョンであってもよい。このような複合製剤は、しばしば、単なる2成分のエマ
ルジョンでは得られない、特定の利点を提供する。o/wエマルジョンの個々の油
滴が小さな水滴を含むマルチエマルジョンは、w/o/wエマルジョンを構成する。
同様に、油性の連続相中に安定化された水の小球中に含まれる油滴のシステムは
、o/w/oエマルジョンを提供する。
【００５７】 エマルジョンは、熱力学的安定性をほとんど有さないかまたはまったく有さな
いことにより特徴付けられる。しばしば、エマルジョンの分散相または不連続相
が、外部相または連続相中に十分に分散され、そして乳化剤の手段または製剤の
粘性を介してこの形態に維持される。エマルジョンの相のいずれかは、エマルジ
ョン-型軟膏基材およびクリームの場合の様に、半固体または個体であってもよ
い。エマルジョンを安定化するその他の手段には、エマルジョンのいずれかの相
中に含まれてもよい、乳化剤を使用することが含まれる。乳化剤は、大きく4つ
のカテゴリーに分類される場合がある：合成サーファクタント、天然に存在する
乳化剤、吸着基材、そして精密に分散された固体、である（Idson, in Pharmace
utical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker（Eds.）, 1988, Marcel
Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199）。
【００５８】 合成サーファクタントは、界面活性剤としても知られているが、エマルジョン
の製剤化において幅広い有用性が見出されており、そして文献においてもレビュ
ーされている（Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger
and Banker（Eds.）, 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1,
p. 285； Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and B
anker（Eds.）, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, volume 1, p. 1
99）。サーファクタントは、典型的には、両親媒性であり、そして親水性部分と
疎水性部分とを含む。サーファクタントの疎水性の性質に対する親水性の性質の
比率は、親水性／親油性バランス（HLB）と呼ばれ、そして製剤の調製において
サーファクタントを分類しそして選択する際の貴重なツールである。サーファク
タントは、親水性基の性質に基づいて別のクラスに分類される場合がある：非イ
オン性、アニオン性、カチオン性、および両性（Rieger, in Pharmaceutical Do
sage Forms, Lieberman, Rieger and Banker（Eds.）, 1988, Marcel Dekker, I
nc., New York, N.Y., volume 1, p. 285）。
【００５９】 エマルジョン製剤中で使用される天然に存在する乳化剤には、ラノリン、密ロ
ウ、ホスファチド類、レシチンおよびアカシアが含まれる。吸着基材は、水を吸
収して、w/oエマルジョンを形成するが、それでもそれらの半固体の硬さを維持
するような、親水性特性を有し、たとえば無水ラノリンおよび親水性ワセリンが
ある。精密に分散された固体もまた、よい乳化剤として、特にサーファクタント
と組み合わせて、そして粘着性の調製物中で使用された。これらには、重金属水
酸化物；ベントナイト、アタパルガイト、ヘクトライト（hectorite）、カオリ
ン、モンモリロン石、コロイド状ケイ酸アルミニウムおよびコロイド状ケイ酸ア
ルミニウムマグネシウムなどの非膨張性クレー；色素；および炭素またはトリス
テアリン酸グリセリンなどの非極性固体；などの極性の無機固体が含まれる。
【００６０】 非常に様々な非-乳化性物質もまた、エマルジョン製剤中に含まれ、そしてエ
マルジョンの特性に寄与する。これらには、脂質、油、ロウ、脂肪酸、脂肪アル
コール、脂肪エステル、保水剤（humectants）、親水性コロイド、保存剤および
抗酸化剤が含まれる（Block, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Ri
eger and Banker（Eds.）, 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., vol
ume 1, p. 335；Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger
and Banker（Eds.）, 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1,
p. 199）。
【００６１】 親水性コロイドまたは親水コロイドには、多糖類（たとえば、アカシア、寒天
、アルギン酸、カラギーナン、グアルガム（guar gum）、インドゴム（karaya g
um）、そしてトラガカント）、セルロース誘導体（たとえば、カルボキシメチル
セルロースおよびカルボキシプロピルセルロース）、そして合成ポリマー（たと
えば、カルボマー（carbomers）、セルロースエーテル、およびカルボキシビニ
ルポリマー）などの、天然に存在するガムおよび合成のポリマーが含まれる。こ
れらは、水中で分散しあるいは膨張して、強力な界面フィルムを分散相の滴の周
囲に形成し、そして外部相の粘性を増大させることにより、エマルジョンを安定
化させるコロイド溶液を形成する。
【００６２】 エマルジョンはしばしば、微生物の増殖をすぐにサポートすることができる、
炭水化物、タンパク質、ステロール、およびホスファチドなどの多数の活性物質
を含有するため、これらの製剤はしばしば保存剤を含む。エマルジョン製剤中に
含まれる一般的に使用される保存剤には、メチルパラベン、プロピルパラベン、
第4アンモニウム塩、塩化ベンザルコニウム、p-ヒドロキシ安息香酸のエステル
、そしてホウ酸が含まれる。抗酸化剤もまた、一般的にエマルジョン製剤に添加
して、製剤の変質を防止する。使用される抗酸化剤は、トコフェロール、没食子
酸アルキル（alkyl gallates）、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒド
ロキシトルエン、またはアスコルビン酸およびメタ重亜硫酸ナトリウムなどの還
元剤などのフリーラジカルスカベンジャー、およびクエン酸、酒石酸、およびレ
シチンなどの抗酸化剤シナージストであってもよい。
【００６３】 外皮経路、経口経路、および非経口経路を介するエマルジョン製剤の使用およ
びそれらの製造のための方法は、文献中でレビューされてきた（Idson, in Phar
maceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker（Eds.）, 1988, Mar
cel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199）。経口送達のためのエ
マルジョン製剤は、製剤化が容易であり吸収および生物学的適合性の観点から効
率的であるため、非常に幅広く使用されてきた（Rosoff, in Pharmaceutical Do
sage Forms, Lieberman, Rieger and Banker（Eds.）, 1988, Marcel Dekker, I
nc., New York, N.Y., volume 1, p. 245；Idson, in Pharmaceutical Dosage F
orms, Lieberman, Rieger and Banker（Eds.）, 1988, Marcel Dekker, Inc., N
ew York, N.Y., volume 1, p. 199）。ミネラル油-ベースの緩下剤、油溶性ビタ
ミンおよび高脂肪栄養調製物は、一般的に、o/wエマルジョンとして経口的に投
与される物質に含まれる。
【００６４】 本発明の一態様において、オリゴヌクレオチドと核酸の組成物は、マイクロエ
マルジョンとして製剤化される。マイクロエマルジョンは、水、油および単一の
、光学的に等方性な、そして熱力学的に安定な液体溶液である両親媒性物質、の
システムとして定義されうる（Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieb
erman, Rieger and Banker（Eds.）, 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N
.Y., volume 1, p. 245）。典型的には、マイクロエマルジョンは、まず油を水
溶性サーファクタント溶液中に分散させ、そしてついで一般的には中間鎖長アル
コールである十分量の第4の構成要素を添加して、透明なシステムを形成するこ
とにより、調製されるシステムである。したがって、マイクロエマルジョンは、
界面活性分子の界面フィルムにより安定化される2種の不混和性の液体の、熱力
学的に安定で、等方性な、透明の分散物質としても記載された（Leung and Shah
, in: Controlled Release of Drugs: Polymers and Aggregate Systems, Rosof
f, M., Ed., 1989, VCH Publishers, New York, pages 185-215）。マイクロエ
マルジョンは、一般的には、油、水、サーファクタント、コサーファクタントお
よび電解質を含む、3〜5種の構成要素を組み合わせることにより調製される。マ
イクロエマルジョンが油中水型（w/o）であるかあるいは水中油型（o/w）である
かは、使用される油およびサーファクタントの特性に依存し、そしてサーファク
タント分子の構造のその極性頭部と炭化水素尾部の幾何学的な畳み込みに依存す
る（Schott, in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co.,
Easton, PA, 1985, p. 271）。
【００６５】 相ダイアグラムを使用した現象学的アプローチが広く研究され、そしてマイク
ロエマルジョンを製剤化するための方法についての、当業者に対する、包括的な
知識が得られた（Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Riege
r and Banker（Eds.）, 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume
1, p. 245；Block, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and
Banker（Eds.）, 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p.
335）。従来のエマルジョンと比較して、マイクロエマルジョンは、自発的に形
成される熱力学的に安定な小滴の製剤において、水-不溶性薬物を可溶化すると
いう利点を提供する。
【００６６】 マイクロエマルジョンの調製に使用されるサーファクタントには、イオン性サ
ーファクタント、非-イオン性サーファクタント、Brij 96、ポリオキシエチレン
オレイルエーテル、ポリグリセロール脂肪酸エステル、テトラグリセロールモノ
ラウレート（ML310）、テトラグリセロールモノオレエート（MO310）、ヘキサグ
リセロールモノオレエート（PO310）、ヘキサグリセロールペンタオレエート（P
O500）、デカグリセロールモノカプレート（MCA750）、デカグリセロールモノオ
レエート（MO750）、デカグリセロールセクイオレエート（sequi oleate）（SO7
50）、デカグリセロールデカオレエート（DAO750）、が、単独であるいはコサー
ファクタントと組み合わせて含まれるが、これらには限定されない。コサーファ
クタントは、通常はエタノール、1-プロパノール、および1-ブタノールなどの短
鎖アルコールであるが、サーファクタントフィルム中に浸透し、そして結果的に
はサーファクタント分子のあいだで生成される空隙スペースのために不規則なフ
ィルムを作製することにより、界面流動度を増大させるために働く。しかしなが
ら、マイクロエマルジョンは、コサーファクタントを使用することなく調製する
ことができ、そしてアルコールフリーの自己乳化マイクロエマルジョンシステム
が当該技術分野において知られている。水相は、典型的には、水、薬物の水性溶
液、グリセロール、PEG300、PEG400、ポリグリセロール、プロピレングリコール
およびエチレングリコールの誘導体であってもよいが、これらのものには限定さ
れない。油相には、Captex 300、Captex 355、Capmul MCM、脂肪酸エステル、中
間鎖（C8-C12）モノ、ジ、およびトリ-グリセリド、ポリオキシエチル化グリセ
リル脂肪酸エステル、脂肪アルコール、ポリ糖化（glycolized）グリセリド、飽
和ポリ糖化（glycolized）C8-C10グリセリド、植物油およびシリコーン油などの
物質が含まれうるが、これらのものには限定されない。
【００６７】 マイクロエマルジョンは、薬物溶解性および薬物の吸収亢進の観点から、特に
興味深いものである。脂質ベースのマイクロエマルジョン（o/wおよびw/oの両方
）は、ペプチドを含む薬物の経口生物学的適合性を亢進させると提唱された（Co
nstantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385-1390；Ritsc
hel, Meth. Find. Exp. Clin. Pharmacol., 1993, 13, 205）。マイクロエマル
ジョンは、薬物溶解性の向上、酵素的加水分解からの薬物の保護、膜流動度およ
び膜透過性におけるサーファクタント-誘導性変化による薬物吸収の亢進の可能
性、調製の容易性、固体用量剤形を超える経口投与の容易性、臨床的可能性の向
上、および毒性の低減といった利点を提供する（Constantinides et al., Pharm
aceutical Research, 1994, 11, 1385；Ho et al., J. Pharm. Sci., 1996, 85,
138-143）。それらの構成要素を周囲温度において一緒にしておくと、しばしば
、マイクロエマルジョンが自発的に形成される場合がある。このことは、易熱性
（熱不安定性）薬物、ペプチドまたはオリゴヌクレオチドを製剤化する際に、特
に利点でありうる。マイクロエマルジョンは、美容用途および医薬用との両方に
おいて、活性構成要素の経皮的送達においても有効であった。本発明のマイクロ
エマルジョン組成物および製剤は、胃腸管からのオリゴヌクレオチドおよび核酸
の全身性吸収の増加を促進し、および胃腸管、膣、口腔（buccal cavity）およ
びその他の投与領域中で、オリゴヌクレオチドおよび核酸の局所的細胞取り込み
を向上させることができる。
【００６８】 本発明のマイクロエマルジョンはまた、ソルビタンモノステアレート（Grill
3）、ラブラゾル（Labrasol）、および浸透亢進剤などの追加の構成要素および
添加剤を含有して、製剤の特性を向上させ、そして本発明のオリゴヌクレオチド
および核酸の吸収を亢進させることもできる。本発明のマイクロエマルジョン中
で使用される浸透亢進剤は、5つの幅広いカテゴリーのうちの一つに属するもの
として分類することができる：サーファクタント、脂肪酸、胆汁酸、キレート剤
、および非-キレート非-サーファクタント（Lee et al., Critical Reviews in
Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92）。これらのクラスのそれぞ
れは、上述した。
【００６９】 リポソーム マイクロエマルジョン以外に、薬物の製剤化のために研究されそして使用され
た、多くの有機（organized）サーファクタント構造が存在する。これらには、
単層、ミセル、二重層および小胞が含まれる。小胞、たとえばリポソーム、は、
薬物送達の観点からそれらが提供する、その特異性および作用期間により、大き
な興味をひきつけた。本明細書中で使用される場合、“リポソーム”という用語
は、球状の1または複数の二重層中に配置された、両親媒性脂質からなる小胞を
意味する。
【００７０】 リポソームは、親油性物質から形成される膜および水性の内部を有する、単一
ラメラ小胞またはマルチラメラ小胞である。水性部分には、送達すべき組成物が
含有される。カチオン性リポソームは、細胞壁と融合することができるという利
点を有する。非-カチオン性リポソームは、細胞壁とは効率的に融合することが
できないものの、マクロファージによりin vivoにおいて取り込まれる。
【００７１】 無傷のほ乳動物皮膚を通過するために、脂質小胞は、適切な経皮的勾配の影響
のもと、それぞれが直径50 nm未満であるような一連の微細な孔を通過しなけれ
ばならない。したがって、高度に変形しやすくそしてそのような微細な孔を通過
することができるリポソームを使用することが好ましい。
【００７２】 リポソームのさらなる利点には、以下のものが含まれる；天然のリン脂質から
得られたリポソームは、生物学的適合性であり、そして生体分解性なものである
；リポソームは、幅広い水溶性薬物および脂質可溶性薬物を含むことができる；
リポソームは、その内部コンパートメント中のカプセル化した薬物を代謝および
分解から保護することができる（Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Li
eberman, Rieger and Banker（Eds.）, 1988, Marcel Dekker, Inc., New York,
N.Y., volume 1, p. 245）。リポソーム製剤の調製において考慮すべき重要事
項は、脂質表面荷電、小胞サイズ、そしてリポソームの水容積である。
【００７３】 リポソームは、活性成分を作用部位に移送および送達するために有用である。
リポソーム膜は、構造的に生体膜と類似しているため、リポソームを組織に使用
する場合には、リポソームを細胞膜に溶け込ませるようにはじめる。リポソーム
と細胞の溶融が進行するにつれて、リポソーム内容物は、活性剤が作用すること
ができる細胞中へ移る。
【００７４】 リポソーム製剤は、多くの薬物についての送達様式として、幅広い研究の焦点
である。局所投与のために、リポソームは、他の製剤を超えるいくつかの利点を
提供するという証拠がますます多くなっている。このような利点には、投与され
た薬物の高い全身性吸収に関連した副作用の減少、所望される標的での投与され
た薬物の蓄積の増加、そして親水性および疎水性の両方の様々な薬物を皮膚中に
投与する能力、が含まれる。
【００７５】 いくつかの報告は、リポソームが高分子量DNAを含む薬剤を皮膚中に送達する
能力について詳細に説明した。鎮痛剤、抗体、ホルモンおよび高分子量DNAを含
む化合物を、皮膚に投与した。投与の多くは、結果として外皮の上部を標的とし
た。
【００７６】 リポソームは、2つの幅広いクラスに分けられる。カチオン性リポソームは、
マイナス（-）に荷電したDNA分子と相互作用して、安定な複合体を形成する、プ
ラス（+）に荷電したリポソームである。プラスに荷電したDNA/リポソーム複合
体は、マイナスに荷電した細胞表面に結合し、そしてエンドソーム中に内部化さ
れる。エンドソーム中の酸性pHにより、リポソームは破裂し、その内容物を細胞
質中に放出する（Wang et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1987, 147,
980-985）。
【００７７】 pH-感受性あるいはマイナスに荷電したリポソームは、DNAと複合体を形成する
というよりは、DNAを捕捉する。DNAおよび脂質の両方が同様に荷電するため、複
合体の形成ではなく反発（repulsion）が生じる。それにもかかわらず、いくつ
かのDNAは、これらのリポソームの水性内部中に捕捉される。pH-感受性リポソー
ムを使用して、チミジンキナーゼ遺伝子をコードするDNAを培養中の細胞単層に
送達させた。外来性遺伝子の発現が、標的細胞中で検出された（Zhou et al., J
ournal of Controlled Release, 1992, 19, 269-274）。
【００７８】 リポソーム組成物の1つの主要な型には、天然由来のホスファチジルコリン以
外のリン脂質が含まれる。天然のリポソーム組成物は、たとえば、ジミリストイ
ルホスファチジルコリン（DMPC）またはジパルミトイルホスファチジルコリン（
DPPC）から形成することができる。アニオン性リポソーム組成物は、一般的に、
ジミリストイルホスファチジルグリセロールから形成されるが、一方でアニオン
性フソジェニックな（fusogenic）リポソームは、主として、ジオレオイルホス
ファチジルエタノールアミン（DOPE）から形成される。リポソーム組成物の別の
型は、たとえば、ダイズホスファチジルコリン（PC）、およびタマゴPCなどのPC
から形成される。別の型は、リン脂質および／またはホスファチジルコリンおよ
び／またはコレステロールの混合物から形成される。
【００７９】 いくつかの研究では、皮膚へのリポソーム薬剤製剤の局所投与が評価された。
インターフェロンを含有するリポソームをモルモット皮膚に対して使用すると、
結果として皮膚のヘルペス潰瘍が減少したが、その他の手段（たとえば溶液また
はエマルジョン）を介してインターフェロンの送達をしても有効ではなかった（
Weiner et al., Journal of Drug Targeting, 1992, 2, 405-410）。さらに、別
の研究は、水性システムを用いたインターフェロンの投与に対する、リポソーム
製剤の一部として投与したインターフェロンの効率を試験し、そしてリポソーム
製剤は水性投与よりも優れていると結論付けた（du Plessis et al., Antiviral
Research, 1992, 18, 259-265）. 薬物の皮膚への送達におけるその有用性を決定するために、非-イオン性リポ
ソームシステム、特に、非-イオン性サーファクタントおよびコレステロールを
含むシステムを調べた。NovasomeTM I（グリセリルジラウレート／コレステロー
ル／ポリオキシエチレン-10-ステアリルエーテル）およびNovasomeTM II（グリ
セリルジステアレート／コレステロール／ポリオキシエチレン-10-ステアリルエ
ーテル）を含む非-イオン性リポソーム製剤を使用して、シクロスポリン-Aをマ
ウス皮膚の真皮中に送達した。結果から、このような非-イオン性リポソームシ
ステムは、シクロスポリン-Aが皮膚の別の層中に沈着することを促進する際に効
果的であることが示された（Hu et al. S.T.P.Pharma. Sci., 1994, 4, 6, 466
）。
【００８０】 リポソームには、“立体化学的に安定な”リポソームも含まれるが、この用語
は本明細書中で使用される場合、1またはそれ以上の特殊な（specialized）脂質
であって、リポソーム中に取り込まれた場合、そのような特殊な脂質を含まない
リポソームと比較して、循環血中での寿命が長くなる脂質、を含むリポソームの
ことをいう。立体化学的に安定なリポソームの例は、リポソームの小胞-形成性
脂質部分の一部分が、（A）モノシアロガングリオシドGM1などの1またはそれ以
上の糖脂質を含むか、または（B）ポリエチレングリコール（PEG）部分などの1
またはそれ以上の親水性ポリマーにより誘導体化されている、ものがある。いず
れかの具体的な理論に縛られることを望むわけではないが、当該技術分野におい
ては、ガングリオシド、スフィンゴミエリン、またはPEG-誘導体化脂質を含有す
る少なくとも立体化学的に安定なリポソームについて、これらの立体化学的に安
定なリポソームの循環系での半減期が増加しているのは、細網内皮系（RES）の
細胞中への取り込みが減少したことに由来すると考えられている（Allen et al.
, FEBS Letters, 1987, 223, 42；Wu et al., Cancer Research, 1993, 53, 376
5）。1またはそれ以上の糖脂質を含む様々なリポソームが、当該技術分野におい
て既知である。Papahadjopoulosら（Ann. N.Y. Acad. Sci., 1987, 507, 64）
は、モノシアロガングリオシドGM1、硫酸ガラクトセレブロシドおよびホスファ
チジルイノシトールがリポソームの血中半減期を向上させる能力を報告した。こ
れらの知見は、Gabizonら（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1988, 85, 6949）
により述べられた。米国特許No. 4,837,028およびWO 88/04924は、両方ともAlle
nらによるものであるが、（1）スフィンゴミエリンおよび（2）ガングリオシドG M1 または硫酸ガラクトセレブロシドエステル、を含むリポソームを開示する。米
国特許No. 5,543,152（Webbら）は、スフィンゴミエリンを含むリポソームを開
示する。1,2-sn-ジミリストイルホスファチジルコリンを含むリポソームは、WO
97/13499（Limら）中に開示されている。
【００８１】 1またはそれ以上の親水性ポリマーにより誘導体化された脂質を含む多くのリ
ポソーム、およびその製造方法は、当該技術分野において既知である。Sunamoto
ら（Bull. Chem. Soc. Jpn., 1980, 53, 2778）は、PEG部分を含有する非イオン
性界面活性剤、2C1215G、を含むリポソームを記載した。Illumら（FEBS Lett.,
1984, 167, 79）は、ポリスチレン粒子のポリマーグリコールによる親水性コー
ティングが、血中半減期の顕著な増加を引き起こすことに注目した。ポリアルキ
レングリコール（たとえば、PEG）のカルボン酸（carboxylic）基の結合により
修飾された合成リン脂質は、Searsにより記載されている（米国特許Nos. 4,426,
330および4,534,899）。Klibanovら（FEBS Lett., 1990, 268, 235）は、PEGま
たはステアリン酸PEGにより誘導体化されたホスファチジルエタノールアミン（P
E）を含むリポソームは、血液循環中での半減期が顕著に増加することを示す実
験を記載した。Blumeら（Biochimica et Biophysica Acta, 1990, 1029, 91）は
、そのような知見をその他のPEG-誘導体化リン脂質、たとえば、ジステアロイル
ホスファチジルエタノールアミン（DSPE）およびPEGの組み合わせから形成され
るDSPE-PEG、に拡張した。共有結合したPEG部分をその外側表面に有するリポソ
ームは、Fisherに対する欧州特許No. EP 0 445 131 B1およびWO 90/04384中に記
載される。PEGにより誘導体化された1〜20モル％のPEを含有するリポソーム組成
物、およびその使用方法は、Woodleら（米国特許Nos. 5,013,556および5,356,63
3）およびMartinら（米国特許No. 5,213,804および欧州特許No. EP 0 496 813 B
1）により記載される。多数のその他の脂質-ポリマー複合体を含むリポソームは
、WO 91/05545および米国特許No. 5,225,212（両方ともMartinら）およびWO 94/
20073（Zalipskyら）において記載される。PEG-修飾セラミド脂質を含むリポソ
ームは、WO 96/10391（Choiら）に記載される。米国特許Nos. 5,540,935（Miyaz
akiら）および5,556,948（Tagawaら）は、その表面に対して官能基部分をさらに
誘導体化することができる、PEG-含有リポソームを記載する。
【００８２】 核酸を含む限定的な数のリポソームが当該技術分野において既知である。Thie
rryらに対するWO 96/40062は、高分子量の核酸をリポソーム中にカプセル化する
ための方法を開示する。Tagawaらに対する米国特許No. 5,264,221は、タンパク
質-結合リポソームを開示し、そしてそのようなリポソームの内容物にはアンチ
センスRNAが含まれうることを明らかにしている。Rahmanらに対する米国特許No.
5,665,710は、オリゴデオキシヌクレオチドをリポソーム中にカプセル化する特
定の方法を記載する。Loveらに対するWO 97/04787は、raf遺伝子を標的とするア
ンチセンスオリゴヌクレオチドを含むリポソームを開示する。
【００８３】 トランスファーソーム（transfersome）は、リポソームのさらに別の型であり
、そして非常に変形可能な脂質集合物であり、薬物送達ビヒクルの魅力的な候補
物である。トランスファーソームは、非常に変形可能であるため、小滴よりも小
さな孔を介して容易に浸透することができる、脂質小滴として記載することがで
きる。トランスファーソームは、それらを使用する環境に適応することができ、
たとえばそれらは、自己-最適性（皮膚の孔の形状に適応する）であり、自己-修
復性であり、しばしば断片化されることなくそれらの標的に到達し、そしてしば
しば自己-負荷性（self-loading）である。トランスファーソームを作製するた
め、標準的なリポソーム組成物に対して、表面強力アクチベーター（edge-activ
ators）、通常はサーファクタント、を添加することができる。トランスファー
ソームを使用して、皮膚に対して血清アルブミンを送達した。血清アルブミンの
トランスファーソーム-媒介性送達は、血清アルブミンを含有する溶液を皮下に
注入する方法と同様に効率的であることが示された。
【００８４】 サーファクタントは、エマルジョン（マイクロエマルジョンを含む）およびリ
ポソームなどの製剤において、幅広い用途が見いだされる。多くの様々なタイプ
のサーファクタントの特性を、天然のサーファクタントおよび合成のサーファク
タントの両方ともについて分類しそしてランク付けする最も一般的な方法は、親
水性／親油性バランス（HLB）の使用によるものである。親水性基（“ヘッド”
としても知られる）の性質は、製剤に使用する様々なサーファクタントをカテゴ
リー化に対して最も有用な手段を提供する（Rieger, in Pharmaceutical Dosage
Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, NY, 1988, p. 285）。
【００８５】 サーファクタント分子がイオン化されていない場合、非イオン性サーファクタ
ントとして分類される。非イオン性サーファクタントは、医薬生成物および化粧
用生成物において幅広い用途を見いだされ、そして幅広いpH値にわたって使用す
ることができる。一般的には、それらのHLB値は、その構造に依存して、2〜約18
の範囲にわたる。非イオン性サーファクタントには、エチレングリコールエステ
ル、プロピレングリコールエステル、グリセリルエステル、ポリグリセリルエス
テル、ソルビタンエステル、スクロースエステル、そしてエトキシ化（ethoxyla
ted）エステルなどの非イオン性エステルが含まれる。脂肪アルコールエトキシ
化物（ethoxylates）、プロポキシ化（propoxylated）アルコール、およびエト
キシ化／プロポキシ化ブロックポリマーなどの非イオン性アルカノールアミドお
よびエーテルもまた、このクラスに含まれる。ポリオキシエチレンサーファクタ
ントは、非イオン性サーファクタントのクラスの最も一般的な構成物質である。
【００８６】 サーファクタント分子が、水中に溶解しまたは分散させる場合に負（-）の荷
電を有する場合、サーファクタントはアニオン性と分類される。アニオン性サー
ファクタントには、石けんなどのカルボン酸エステル、アシルラクチレート（la
ctylates）、アミノ酸のアシルアミド、アルキル硫酸塩およびエトキシ化アルキ
ル硫酸塩などの硫酸のエステル、アルキルベンゼンスルホン酸エステル、アシル
イセチオネート（isethionates）、アシルタウレート（taurates）およびスルホ
コハク酸塩などのスルホン酸エステル、およびホスフェートが含まれる。アニオ
ン性サーファクタントのクラスの最も重要な構成物質は、アルキル硫酸塩および
石けんである。
【００８７】 サーファクタント分子が、水中に溶解されまたは分散される場合に正（+）の
荷電を有する場合、サーファクタントはカチオン性と分類される。カチオン性サ
ーファクタントには、第四アンモニウム塩およびエトキシ化アミンが含まれる。
第四アンモニウム塩は、このクラスの最も使用される構成物質である。
【００８８】 サーファクタント分子が正（+）の荷電または負（-）の荷電のいずれをも有す
る能力を有する場合、サーファクタントは両性として分類される。両性サーファ
クタントには、アクリル酸誘導体、置換アルキルアミド類、N-アルキルベタイン
類およびホスファチド類が含まれる。
【００８９】 薬剤生成物、製剤およびエマルジョン中でのサーファクタントの使用は、以下
にレビューされている（Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dek
ker, Inc., New York, NY, 1988, p. 285）。
【００９０】 浸透亢進剤 一態様において、本発明は、様々な浸透亢進剤を使用して、核酸、特にオリゴ
ヌクレオチドの、動物の皮膚に対する効率的な送達を達成する。ほとんどの薬剤
は、イオン化型および非イオン化型の両方において溶液中に存在する。しかしな
がら、通常は、脂質可溶性あるいは親油性薬物のみが容易に細胞膜を通過する。
非-親油性薬物でさえも、通過すべき膜を浸透亢進剤により処理される場合には
、細胞膜を通過することができることを見出した。非-親油性薬物の細胞膜を通
じた拡散を補助することに加えて、浸透亢進剤はまた、親油性薬物の透過性も向
上させる。
【００９１】 浸透亢進剤は、5つの幅広いカテゴリー、すなわち、サーファクタント、脂肪
酸、胆汁酸塩、キレート剤、そして非-キレート非-サーファクタント、の一つに
属するものとして分類することができる（Lee et al., Critical Reviews in Th
erapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92）。浸透亢進剤の上述したクラス
のそれぞれは、以下にさらに詳細に記載される。
【００９２】 サーファクタント：本発明に関連して、サーファクタント（あるいは“表面-
活性剤”）は、水溶液中に溶解した場合に、溶液の表面張力または水溶液と別の
液体とのあいだの界面張力を減少する化学的単位であり、粘膜を介するオリゴヌ
クレオチドの吸収が亢進されるという結果を伴う。胆汁酸塩および脂肪酸に加え
て、これらの浸透亢進剤には、たとえば、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシ
エチレン-9-ラウリルエーテルおよびポリオキシエチレン-20-セチルエーテル（L
ee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p
.92）；およびFC-43などのパーフルオロ化学物質エマルジョン（Takahashi et a
l., J. Pharm. Pharmacol., 1988, 40, 252）が含まれる。
【００９３】 脂肪酸：浸透亢進剤として機能する様々な脂肪酸およびその誘導体には、たと
えば、オレイン酸、ラウリン酸、カプリン酸（n-デカン酸）、ミリスチン酸、パ
ルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプ
レート、モノオレイン（1-モノオレイル-rac-グリセロール）、ジラウリン、カ
プリル酸、アラキドン酸、グリセロール1-モノカプレート、1-ドデシルアザシク
ロヘプタン-2-オン、アシルカルニチン、アシルコリン、それらのC1-10アルキル
エステル（たとえば、メチル、イソプロピルおよびt-ブチル）、およびそれらの
モノ-およびジ-グリセリド（すなわち、オレエート、ラウレート、カプレート、
ミリステート、パルミテート、ステアレート、リノレエートなど）が含まれる（
Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991,
p.92；Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1
990, 7, 1-33；El Hariri et al., J. Pharm. Pharmacol., 1992, 44, 651-654
）。
【００９４】 胆汁酸塩：胆汁の生理学的役割には、脂質および脂肪可溶性ビタミンの分散お
よび吸収を促進することが含まれる（Brunton, Chapter 38 in: Goodman & Gilm
an's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9th Ed., Hardman et al.
Eds., McGraw-Hill, New York, 1996, pp. 934-935）。様々な天然の胆汁酸塩、
およびその合成誘導体は、浸透亢進剤として機能する。このように、用語“胆汁
酸塩”には、胆汁の天然に存在する構成成分のいずれかだけでなく、それらの合
成誘導体のいずれかが含まれる。本発明の胆汁酸塩には、たとえば、コール酸（
あるいはその医薬的に許容可能なナトリウム塩、コール酸ナトリウム）、デヒド
ロコール酸（デヒドロコール酸ナトリウム）、デオキシコール酸（デオキシコー
ル酸ナトリウム）、グルココール酸（glucholic acid）（グルココール酸（gluc
holate）ナトリウム）、グリココール酸（グリココール酸ナトリウム）、グリコ
デオキシコール酸（グリコデオキシコール酸ナトリウム）、タウロコール酸（タ
ウロコール酸ナトリウム）、タウロデオキシコール酸（タウロデオキシコール酸
ナトリウム）、ケノデオキシコール酸（ケノデオキシコール酸ナトリウム）、ウ
ルソデオキシコール酸（UDCA）、タウロ-24,25-ジヒドロ-フシジン酸ナトリウム
（STDHF）、グリコジヒドロフシジン酸ナトリウムおよびポリオキシエチレン-9-
ラウリルエーテル（POE）が含まれる（Lee et al., Critical Reviews in Thera
peutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92；Swinyard, Chapter 39 In: Rem
ington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Gennaro, ed., Mack Publishin
g Co., Easton, PA, 1990, pages 782-783；Muranishi, Critical Reviews in T
herapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33；Yamamoto et al., J. Phar
m. Exp. Ther., 1992, 263, 25；Yamashita et al., J. Pharm. Sci., 1990, 79
, 579-583）。
【００９５】 キレート剤：本発明と関連して使用される場合、キレート剤は、それとともに
複合体を形成することにより、金属イオンを溶液から取り除く化合物として定義
することができ、粘膜を介したオリゴヌクレオチドの吸収を向上させるという結
果を伴う。本発明における浸透亢進剤としてのその使用に関して、キレート剤は
、最も特性決定されたDNAヌクレアーゼがその触媒のために二価の金属イオンを
必要としそしてしたがってキレート剤により阻害されることから、DNase阻害剤
としても機能するという追加の利点を有する（Jarrett, J. Chromatogr., 1993,
618, 315-339）。本発明のキレート剤には、エチレンジアミンテトラ酢酸ジナ
トリウム（EDTA）、クエン酸、サリチル酸塩（たとえば、サリチル酸ナトリウム
、5-メトキシサリチル酸塩およびホモバニリン酸塩）、コラーゲンのN-アシル誘
導体、ラウレス-9およびβ-ジケトンのN-アミノアシル誘導体（エナミン）が含
まれるが、これらには限定されない（Lee et al., Critical Reviews in Therap
eutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92；Muranishi, Critical Reviews i
n Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33；Buur et al., J. Contr
ol Rel., 1990, 14, 43-51）。
【００９６】 非-キレート非-サーファクタント：本明細書中で使用する場合、非-キレート
非-サーファクタント浸透亢進性化合物は、キレート剤としてあるいはサーファ
クタントとしてわずかな活性しか示さないが、それにもかかわらず栄養粘膜を介
してオリゴヌクレオチドの吸収を亢進する、化合物として定義することができる
（Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990,
7, 1-33）。浸透亢進剤のこのクラスには、たとえば、不飽和環状ウレア、1-ア
ルキル-および1-アルケニルアザシクロ-アルカノン誘導体（Lee et al., Critic
al Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92）；および
ジクロフェナクナトリウム、インドメタシンおよびフェニルブタゾンなどの非-
ステロイド性抗炎症性薬剤（Yamashita et al., J. Pharm. Pharmacol., 1987,
39, 621-626）が含まれる。
【００９７】 細胞レベルでオリゴヌクレオチドの取り込みを亢進する薬剤を、本発明の医薬
組成物およびその他の組成物に添加することもできる。たとえば、リポフェクチ
ンなどのカチオン性脂質（Junichi et al, 米国特許No. 5,705,188）、カチオン
性グリセロール誘導体、およびポリリジンなどのポリカチオン性分子（Lollo et
al., PCT Application WO 97/30731）も、オリゴヌクレオチドの細胞性取り込
みを亢進することが知られている。
【００９８】 エチレングリコールおよびプロピレングリコールなどのグリコール、2-ピロー
ルなどのピロール、アゾン（azone）、およびリモネンおよびメントンなどのテ
ルペンを含むその他の薬剤を使用して、投与される核酸の浸透を亢進することが
できる。
【００９９】 担体 本発明の特定の組成物は、製剤中に担体化合物も組み込む。本明細書中で使用
する場合、“担体化合物”または“担体”は、不活性である（すなわち、それ自
体生物学的活性を有さない）が、しかし、たとえば、生物学的に活性な核酸を分
解しまたはその循環からの除去を促進することにより生物学的活性を有する核酸
の生物学的利用性を減少するin vivoプロセスにより、核酸として認識される、
核酸、またはその類似体のことをいうことができる。核酸と担体化合物（典型的
には担体化合物を過剰量）の共投与により、おそらくは担体化合物と核酸との、
一般的な受容体に対する競合により、結果として、肝臓、腎臓、またはその他の
循環外レゼルボア中で回収される核酸の量の実質的な減少が引き起こされる。た
とえば、ポリイノシン酸、硫酸デキストラン、ポリシチジン酸あるいは4-アセト
アミド-4'イソチオシアノ-スチルベン-2,2'-ジスルホン酸とともに共投与する場
合、肝臓組織中での部分的ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの回収を減少
することができる（Miyao et al., Antisense Res. Dev., 1995, 5, 115-121；T
akakura et al., Antisense & Nucl. Acid Drug Dev., 1996, 6, 177-183）。
【０１００】 賦形剤 担体化合物と対照的に、“医薬的な担体”または“賦形剤”は、医薬的に許容
可能な溶媒、懸濁剤または動物に対して1またはそれ以上の核酸を送達するため
のいずれかその他の医薬的に不活性なビヒクルである。賦形剤は液体であっても
あるいは固体であってもよく、そして、想定した計画された様式の投与により、
所定の医薬組成物の核酸およびその他の構成要素と組み合わせた場合、所望のバ
ルク、粘度などを提供するように選択される。典型的な医薬的な担体には、結合
剤（たとえば、α化コーンスターチ、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプ
ロピルメチルセルロースなど）；充填剤（たとえば、ラクトースおよびその他の
糖、微結晶セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロー
ス、ポリアクリル酸またはリン酸水素カルシウムなど）；潤滑剤（たとえば、ス
テアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド状シリコンジオキシド、ス
テアリン酸、金属性ステアリン酸、硬化植物油、コーンスターチ、ポリエチレン
グリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなど）；崩壊剤（たとえば、
スターチ、スターチグリコール酸ナトリウムなど）；および湿潤剤（たとえば、
ラウリル硫酸ナトリウムなど）が含まれるが、これらには限定されない。
【０１０１】 核酸と心身に有害には反応しない非-非経口性投与に適した医薬的に許容可能
な有機賦形剤または無機賦形剤を使用して、本発明の組成物を製剤化することも
できる。適した医薬的に許容可能な担体には、水、塩溶液、アルコール、ポリエ
チレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシ
ウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビ
ニルピロリドンなどが含まれるが、これらには限定されない。
【０１０２】 核酸の局所投与のための製剤には、滅菌水溶液および非-滅菌水溶液、アルコ
ールなどの一般的溶媒中での非-水溶液、または液体または固体油状基剤中の核
酸の溶液が含まれてもよい。溶液には、バッファー、希釈剤およびその他の適し
た添加剤を含有してもよい。核酸と心身に有害には反応しない非-非経口性投与
に適した医薬的に許容可能な有機賦形剤あるいは無機賦形剤を使用することがで
きる。
【０１０３】 適した医薬的に許容可能な賦形剤には、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレ
ングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム
、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニル
ピロリドンなどが含まれるが、これらには限定されない。
【０１０４】 その他の構成要素 本発明の組成物にはさらに、医薬組成物中に従来から見出されるその他の補助
剤構成要素を、当該技術分野で確立した使用レベルで含有することができる。こ
のように、たとえば、組成物には、たとえば鎮痒薬、収斂剤、局所麻酔薬または
抗炎症剤などの追加的で適合性な医薬的に活性な物質を含有することができ、ま
たは本発明の組成物の様々な用量剤形を物理的に製剤化する際に有用な追加の物
質、たとえば色素、着香剤、保存剤、抗酸化剤、乳白剤、増粘剤および安定化剤
など、を含有することができる。しかしながら、このような物質は、添加される
場合、本発明の組成物の構成要素の生物学的活性を過度に妨害すべきではない。
製剤を滅菌することができ、そして所望の場合には、製剤の（1またはそれ以上
の）核酸と心身に有害に相互作用しない補助剤、たとえば、潤滑剤、保存剤、安
定化剤、湿潤剤、乳化剤、オスモル圧に影響を与える塩、バッファー、着色剤、
着香料および／または芳香性物質などと混合することができる。
【０１０５】 水性懸濁液には、たとえば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビ
トールおよび／またはデキストランを含む、懸濁疫の粘度を増加する物質を含有
することができる。懸濁疫には、安定化剤を含有してもよい。
【０１０６】 本発明の特定の態様は、（a）1またはそれ以上のアンチセンス化合物、および
（b）非-アンチセンスメカニズムにより機能する1またはそれ以上のその他の化
学療法剤、を含有する医薬組成物を提供する。このような化学療法剤の例には、
ダウノルビシン、ダクチノマイシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、マイト
マイシン、ナイトロジェンマスタード、クロラムブシル、メルファラン、シクロ
ホスファミド、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、シタラビン（CA）、5-フ
ルオロウラシル（5-FU）、フロキシウリジン（5-FUdR）、メトトレキセート（MT
X）、コルヒチン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド、テニポシド
、シスプラチンおよびジエチルスチルベストロール（DES）などの抗ガン薬物を
含むが、これらには限定されない（一般的には、The Merck Manual of Diagnosi
s and Therapy, 15th Ed., Berkow et al., eds., 1987, Rahway, N.J., pages
1206-1228を参照）。非ステロイド性抗炎症性薬物およびコルチコステロイドを
含む抗炎症性薬物（しかしこれらには限定されない）、およびリビビリン（ribi
virin）、ビダラビン（vidarabine）、アシクロビルおよびガンシクロバーを含
む抗ウィルス性薬物（しかしこれらには限定されない）を、本発明の組成物中に
組み合わせることができる（一般的には、The Merck Manual of Diagnosis and
Therapy, 15th Ed., Berkow et al., eds., 1987, Rahway, N.J., pages 2499-2
506 and 46-49, respectivelyを参照）。その他の非-アンチセンス化学療法剤も
、本発明の範囲に含まれる。2つまたはそれ以上の組み合わせ化合物を、一緒に
あるいは連続的に使用することができる。
【０１０７】 別の関連する態様において、本発明の組成物には第一の核酸を標的とする、1
またはそれ以上のアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチド、および第二の
核酸標的を標的とする1またはそれ以上の追加のアンチセンス化合物、特にオリ
ゴヌクレオチドを含有することができる。数多くのアンチセンス化合物の例が当
該技術分野で知られている。2つまたはそれ以上の組み合わせ化合物を、一緒に
あるいは連続的に使用することができる。
【０１０８】 治療用組成物の製剤化およびそれに引き続く投与は、当該技術分野の範囲内の
ものであると考えられる。用量は、治療すべき疾患状態の重症度および反応性に
依存し、数日間から数ヶ月間持続する治療経過、あるいは治癒が得られるかまた
は疾患の減退が得られるまでの治療経過を伴う。最適な用量スケジュールは、患
者体内での薬物の蓄積を測定することから算出することができる。当業者であれ
ば、最適用量、投与方法、および反復頻度を容易に決定することができる。最適
な用量は、個々のオリゴヌクレオチドの比効力に依存して変更することができ、
そして一般的には、in vitroおよびin vivo動物モデルにおいて効果的であるこ
とが見いだされるEC50に基づいて見積もることができる。一般的には、用量は、
0.01 ug〜100 g/kg体重であり、そして1日、1週間、1ヶ月、あるいは1年に一度
またはそれ以上与えることができ、あるいは2〜20年ごとに1度であってもよい。
当業者は、体液あるいは組織における薬物の滞留時間および濃度に基づいて、投
与のための反復頻度を容易に見積もることができる。継続的な治療により、患者
に維持療法を受けさせて、疾患状態の再発を防止することが好ましく、ここでオ
リゴヌクレオチドは、1日に1回またはそれ以上〜20年間ごとに1回で、0.01 ug〜
100 g/kg体重の範囲で、維持用量で投与する。
【０１０９】 本発明特定のその好ましい態様にしたがって、具体的に記載されるが、以下の
実施例は、本発明の説明のためにのみ提供し、そして本発明を限定することを意
図するものではない。
【０１１０】
【実施例】
実施例1 オリゴヌクレオチド合成のためのヌクレオシドホスホールアミダイト デオキシ及び2'-アルコキシアミダイト 2'-デオキシ及び2'-メトキシβ-シアノエチルジイソプロピルホスホールアミ
ダイトを販売元（例えば、Chemgenes, Needham MA またはGlen Research, Inc.
Sterling VA）より購入した。他の2'-O-アルコキシ置換ヌクレオシドアミダイト
は、本明細書中で参考文献として援用される、アメリカ合衆国特許5,506,351に
記載の通り調製する。2'-アルコキシアミダイトを用いてオリゴヌクレオチドを
合成するために、テトラゾール及び塩基のパルスデリバリー後の待機段階を360
秒に増加した以外は、非修飾オリゴヌクレオチドのための標準サイクルを使用し
た。
【０１１１】 5-メチル-2'-デオキシシチジン（5-Me-C）ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオ
チドは、市販のホスホールアミダイト（Glen Research, Sterling VAまたはChem
Genes, Needham MA）を用いて公表された方法〔Sanghvi ら、Nucleic Acids Res
earch, 1993, 21, 3197-3203〕に従って合成した。
【０１１２】 2'-フルオロアミダイト 2'-フルオロデオキシアデノシンアミダイト 2'-フルオロオリゴヌクレオチドは、本明細書中で参考文献として援用される
以前に記載の通り〔Kawasakiら、 J. Med. Chem., 1993, 36, 831-841〕、及び
、アメリカ合衆国特許5,670,633に記載の通り合成した。簡潔には、保護された
ヌクレオシドであるN6-ベンゾイル-2'-デオキシ-2'-フルオロアデノシンは、市
販の9-β-D-アラビノフラノシルアデニンを出発物質として使用し、そして文献
手法を修正して、2'-α-フルオロ原子を2'-β-トリチル基のSN2-置換により導入
することより、合成した。このようにN6-ベンゾイル-9-β-D-アラビノフラノシ
ルアデニンは中程度の収量で3',5'-ジテトラヒドロピラニル（THP）中間体とし
て選択的に保護した。THP及びN6-ベンゾイル基の脱保護は標準的な手法論を用い
て成され、そして標準手法を用いて5'-ジメトキシトリチル-（DMT）及び5'-DMT-
3'-ホスホールアミダイト中間体を得た。
【０１１３】 2'-フルオロデオキシグアノシン 2'-デオキシ-2'-フルオログアノシンの合成はテトライソプロピルジシロキサ
ニル（TPDS）で保護した9-β-D-アラビノフラノシルグアニンを出発物質として
用い、そして、中間体であるジイソブチリルアラビノフラノシルグアノシンへの
変換により成された。TPDS基の脱保護に続いて水酸基のTHPによる保護によりジ
イソブチリルジ-THP保護アラビノフラノシルグアニンを得た。選択的なO-脱アシ
ル化及びトリフラート化に続き、フルオリドによる粗生成物の処理をし、その後
THP基の脱保護をした。標準的な方法論を使用し、5'-DMT-及び5'-DMT-3'-ホスホ
ールアミダイトを得た。
【０１１４】 2'-フルオロウリジン 2'-デオキシ-2'-フルオロウリジンの合成は、2,2'-アンヒドロ-1-β-D-アラビ
ノフラノシルウラシルを70％フッ化水素-ピリジン（hydrogen fluoride-pyridin
e）で処理する、文献手法の修正により成された。標準的な手法を用いて5'-DMT
及び5'-DMT-3'ホスホールアミダイトを得た。
【０１１５】 2'-フルオロデオキシシチジン 2'-デオキシ-2'-フルオロシチジンは2'-デオキシ-2'-フルオロウリジンのアミ
ノ化を介して合成され、次に選択的な保護によりN4-ベンゾイル-2'-デオキシ-2'
-フルオロシチジンを得た。標準的な手法を用いて、5'-DMT及び5'-DMT-3'ホスホ
ールアミダイトを得た。
【０１１６】 2'-O-（2-メトキシエチル）修飾アミダイト 2'-O-メトキシエチル-置換ヌクレオシドアミダイトは、次の通り、あるいは、
Martin, P.（Helvetica Chimica Acta, 1995, 78, 486-504）の方法に従って調
製した。
【０１１７】 2,2'-アンヒドロ〔1-（β-D-アラビノフラノシル）-5-メチルウリジン〕 5-メチルウリジン（Yamasa, Choshi, Japanにより市販され入手可能な、リボ
シルチミン）（72.0 g、0.279 M）、ジフェニルカーボネート（90.0 g、0.420 M
）及び炭酸水素ナトリウム（2.0 g、0.024 M）をDMF（300 mL）に加えた。混合
物を熱して攪拌しながら還流し、発生する二酸化炭素ガスを制御された方法で放
出させた。1時間後、わずかに黒ずんだ溶液を、低圧下、濃縮した。得られたシ
ロップを攪拌しながらジエチルエーテル（2.5 L）中に注いだ。産物はガム状物
を形成した。エーテルをデカントし、そして、残渣を最小量のメタノール（約40
0 mL）に溶解した。溶液をフレッシュなエーテル（2.5 L）に注ぎ入れ、硬いガ
ム状物を得た。エーテルをデカントし、ガム状物を減圧オーブンで乾燥させ（60
℃、1 mm Hgで24時間）、得られた固体を砕いて淡い黄褐色の粉末にした（57 g
、85％粗収率）。NMRスペクトルは、そのナトリウム塩としてフェノールが混じ
った（約5％）構造と一致した。その物質はさらに続く反応に用いられた（ある
いはに酢酸エチル中のメタノールの勾配（10-25％）を利用したカラムクロマト
グラフィーにより、さらに精製して融点222-4℃の白色の固体を得ることができ
る）。
【０１１８】 2'-O-メトキシエチル-5-メチルウリジン 2,2'-アンヒドロ-5-メチルウリジン（195 g、0.81 M）、トリス（2-メトキシ
エチル）ホウ酸（231 g、0.98 M）及び2-メトキシエタノール（1.2 L）を、2 L
ステンレススチール圧力容器に加え、160℃に予熱した油浴中に設置した。155-1
60℃で48時間熱した後、容器を開き、そして、溶液を蒸発させて乾燥させ、次に
メタノール（200 mL）中で磨砕した。残渣を熱したアセトン（1 L）中に懸濁し
た。不溶の塩を濾過し、アセトン（150 mL）で洗浄し、そして、濾過物を蒸発さ
せた。残渣を（280 g）をCH3CN（600 mL）に溶解させ、次に、蒸発させた。シリ
カゲルカラム（3 kg）を0.5％Et3NHを含むCH2Cl2/アセトン/MeOH（20:5:3）中に
充填した。残渣をCH2Cl2（250 mL）中に溶解し、そして、シリカ（150 g）に吸
着させた後、カラムにロードした。生成物は充填溶媒とともに溶出され、160 g
（63％）の産物を得た。不純な分画をやり直すことにより、追加の物質を得た。
【０１１９】 2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルウリジン 2'-O-メトキシエチル-5-メチルウリジン（160 g、0.506 M）をピリジン（250
mL）と共に蒸発させ、次に、乾燥させた残渣をピリジン（1.3 L）に溶解した。
ジメトキシトリチルクロリドの一番目のアリコート（94.3 g、0.278 M）を加え
、そして、混合液を室温で1時間攪拌した。ジメトキシトリチルクロリドの二番
目のアリコート（94.3 g、0.278 M）を加え、そして、反応液をさらに1時間攪拌
した。メタノール（170 mL）を次に加え、反応を停止した。HPLCにより、約70％
の産物の存在が示された。溶媒を蒸発させ、そして、CH3CN（200 mL）中で磨砕
した。残渣をCHCl3（1.5 L）に溶解し、次に、2×500 mLの飽和NaHCO3及び2×50
0 mLの飽和NaClにより抽出した。有機層をNa2SO4上で乾燥させ、濾過し、そして
、蒸発させた。275 gの残渣が得られた。残渣を3.5 kgシリカゲルカラムで精製
し、充填し、そして、0.5％Et3NHを含むEtOAc/ヘキサン/アセトン（5:5:1）で溶
出した。純粋な分画を蒸発させ、164 gの生成物を得た。さらに約20 gが不純な
分画より得られ、全収量183 g（57％）を得た。
【０１２０】 3'-O-アセチル-2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルウリ
ジン 2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルウリジン（106 g、0
.167 M）、DMF/ピリジン（562 mLのDMFと188 mLのピリジンから調製された3:1の
混合液750 mL）、及び、無水酢酸（24.38 mL、0.258 M）を混合し、そして、室
温で24時間攪拌した。反応は、TLC試料にMeOHを添加し初めに急冷すること（que
nching）によりTLCによりモニターした。TLCにより判断した反応の終了時に、Me
OH（50 mL）を加え、混合物を35℃で蒸発させた。残渣をCHCl3（800 mL）に溶解
し、次に、2×200 mLの飽和炭酸水素ナトリウム及び2×200 mLの飽和NaClにより
抽出した。水層を200 mLのCHCl3で逆抽出した。合わせた有機層を硫酸ナトリウ
ムで乾燥させ、そして、蒸発させ、122 g（約90％生成物）の残渣を得た。残渣
を3.5 kgシリカゲルカラムで精製し、そして、EtOAc/ヘキサン（4:1）で溶出し
た。純粋な生成物分画を蒸発させ、96 g（84％）を得た。後の分画より追加の1.
5 gを回収した。
【０１２１】 3'-O-アセチル-2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチル-4-
トリアゾールウリジン はじめの溶液は、3'-O-アセチル-2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリ
チル-5-メチルウリジン（96 g、0.144 M）をCH3CN（700 mL）に溶かすことによ
り調製し、そして、とり置いた。トリエチルアミン（189 mL、1.44 M）をCH3CN
（1 L）中トリアゾール（90 g、1.3 M）溶液に加えて、-5℃に冷却し、そして、
オーバーヘッドスターラーを使用して0.5時間攪拌した。0-10℃に維持した攪拌
溶液に、30分間、POCl3を滴下して加え、そして得られた混合液をさらに2時間攪
拌した。はじめの溶液を後者の溶液に、45分間をかけて滴下して加えた。得られ
た反応混合物をコールドルームに一晩保存した。反応混合物から塩を濾過し、そ
して、溶液を蒸発させた。残渣をEtOAc（1 L）に溶解し、次に、不溶の固体を濾
過により除去した。濾過物を1×300 mLのNaHCO3及び2×300 mLの飽和NaClで洗浄
し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、そして、蒸発させた。残渣をEtOAc中で磨砕し
、表題の化合物を得た。
【０１２２】 2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルシチジン ジオキサン（500 mL）及びNH4OH（30 mL）中3'-O-アセチル-2'-O-メトキシエ
チル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチル-4-トリアゾールウリジン（103 g、0.1
41 M）溶液を、室温で2時間攪拌した。ジオキサン溶液を蒸発させ、残渣をMeOH
（2×200 mL）と共沸させた。残渣をMeOH（300 mL）に溶解し、2リットルステン
レススチール圧力容器に移した。NH3ガスで飽和させたMeOH（400 mL）を加え、
その容器を100℃、2時間熱した（完全な変換がTLCにより示された）。容器の内
容物を蒸発させて乾燥し、そして、残渣をEtOAc（500 mL）に溶解し、次に、飽
和NaCl（200 mL）で1回洗浄した。有機物を硫酸ナトリウムで乾燥させ、そして
、溶媒を蒸発させて85 g（95％）の表題の化合物を得た。
【０１２３】 N4-ベンゾイル-2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルシチ
ジン 2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチル-シチジン（85 g、0
.134 M）をDMF（800 mL）に溶解し、次に、無水安息香酸（37.2 g、0.165 M）を
攪拌しながら加えた。3時間攪拌後、反応が約95％終了したことをTLCが示した。
溶媒を蒸発させ、そして、残渣をMeOH（200 mL）と共沸させた。残渣をCHCl3（7
00 mL）に溶解し、飽和NaHCO3（2×300 mL）及び飽和NaCl（2×300 mL）で抽出
し、MgSO4で乾燥させ、次に、蒸発させて残渣（96 g）を得た。残渣を、溶出溶
媒として0.5％Et3NHを含むEtOAc/ヘキサン（1:1）を使用して、1.5 kgシリカカ
ラムでクロマトグラフィーにより分離した。純粋な生成物画分を蒸発させて、90
g（90％）の表題化合物を得た。
【０１２４】 N4-ベンゾイル-2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルシチ
ジン-3'-アミダイト N4-ベンゾイル-2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルシチ
ジン（74 g、0.10 M）をCH2Cl2（1 L）に溶解した。テトラゾールジイソプロピ
ルアミン（7.1 g）及び2-シアノエトキシ-テトラ-（イソプロピル）亜リン酸塩
（40.5 mL、0.123 M）を窒素気体条件下、攪拌しながら加えた。得られた混合物
は室温で20時間攪拌した（反応が95％終了したことをTLCが示した）。反応混合
物を飽和NaHCO3（1×300 mL）及び飽和NaCl（3×300 mL）で抽出した。水層洗浄
液をCH2Cl2（300 mL）で逆抽出し、次に抽出物を合わせ、MgSO4で乾燥させそし
て濃縮した。得られた残渣は、溶出溶媒としてEtOAc/ヘキサン（3:1）を使用し
て、1.5 kgシリカカラムでクロマトグラフィーにより分離した。純粋な分画を合
わせて、90.6 g（87％）の表題化合物を得た。
【０１２５】 2'-O-（アミノオキシエチル）ヌクレオシドアミダイト及び2'-O-（ジメチルア
ミノオキシエチル）ヌクレオシドアミダイト 2'-（ジメチルアミノオキシエトキシ）ヌクレオシドアミダイト 2'-（ジメチルアミノオキシエトキシ）ヌクレオシドアミダイト［当該技術分
野において2'-O-（ジメチルアミノオキシエチル）ヌクレオシドアミダイトとし
ても知られる］は次の段落で記載される通り、調製される。アデノシン、シチジ
ン及びグアノシンヌクレオシドアミダイトは、環外のアミンがアデノシン及びシ
チジンの場合はベンゾイル基により保護され、また、グアノシンの場合はイソブ
チリルにより保護されることを除いては、チミジン（5-メチルウリジン）と同様
に調製される。
【０１２６】 5'-O-tert-ブチルジフェニルシリル-O2-2'-アンヒドロ-5-メチルウリジン O2-2'-アンヒドロ-5-メチルウリジン（Pro. Bio. Sint., Varese, Italy, 100
.0 g、0.416 mmol）、ジメチルアミノピリジン（0.66 g、0.013 eq、0.0054 mmo
l）を、アルゴン気体条件下、周囲温度で、また、機械的に攪拌しながら、無水
ピリジン（500 ml）に溶解した。tert-ブチルジフェニルクロロシラン（125.8 g
、119.0 mL、1.1 eq、0.458 mmol）を一度に加えた。反応物は周囲温度で16時間
攪拌した。TLC（Rf 0.22、酢酸エチル）により反応が終了したことが示された。
溶液を減圧下、濃縮して濃厚な油状物にした。これを、ジクロロメタン（1 L）
、及び、飽和炭酸水素ナトリウム（2×1 L）及びブライン（1 L）間で分配させ
た。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、そして、減圧下、濃縮して濃厚な油状
物にした。油を酢酸エチルとエチルエーテルの1:1の混合液（600 mL）に溶解し
、次に、溶液を-10℃に冷却した。得られた結晶生成物は、濾過により集めて、
エチルエーテル（3×200 mL）で洗浄し、さらに、乾燥して（40℃、1 mm Hg,、2
4 時間）、149 g（74.8％）の白色の固体にした。TLC及びNMRは純粋な生成物と
一致した。
【０１２７】 5'-O-tert-ブチルジフェニルシリル-2'-O-（2-ヒドロキシエチル）-5-メチル
ウリジン 2 Lステンレススチール、非攪拌圧力反応器にテトラヒドロフラン中のボラン
（1.0 M、2.0 eq、622 mL）を加えた。換気フード内で、手動で攪拌しながらエ
チレングリコール（350 mL、過剰量）を、水素ガスの発生がおさまるまで、はじ
めは注意深く加えた。5'-O-tert-ブチルジフェニルシリル-O2-2'-アンヒドロ-5-
メチルウリジン（149 g、0.311 mol）及び炭酸水素ナトリウム（0.074 g、0.003
eq）を手動で攪拌しながら加えた。反応器を密閉し、そして、内部温度が160℃
に達するまで油浴中で熱し、そして次に16時間維持した（圧力< 100 psig）。反
応容器を周囲温度まで冷却し、そして、開けた。TLC（望ましい生成物はRf 0.67
及びara-T副生成物はRf 0.82、酢酸エチル）は約70％が生成物に変換したこと
を示した。さらに副生成物ができるのを避けるため、反応を停止し、減圧下（10
から1 mm Hg）、湯浴中（40-100℃）で、エチレングリコールを除くために使わ
れるより極度の条件で、濃縮した。［あるいは、一度低沸点溶媒がなくなったら
、残りの溶液を酢酸エチルと水の間で分配し得る。生成物は有機相にあるだろう
。］残渣をカラムクロマトグラフィー（2 kgシリカゲル、酢酸エチル-ヘキサン
勾配1:1から4:1）により精製した。適切な分画を合わせ、除き、そして、乾燥さ
せて、白色のカリカリ（crisp）した泡状物（84 g、50％）、混在した出発物質
（17.4 g）、及び、純粋な再利用できる出発物質20 gを得た。出発物質、純度の
低い回収した出発物質をもとにした収率は58％だった。TLC及びNMRは、99％の純
度の生成物と一致した。
【０１２８】 2'-O-（〔2-フタルイミドオキシ）エチル〕-5'-t-ブチルジフェニルシリル-5-
メチルウリジン 5'-O-tert-ブチルジフェニルシリル-2'-O-（2-ヒドロキシエチル）-5-メチル
ウリジン（20 g、36.98 mmol）を、トリフェニルホスフィン（11.63 g、44.36 m
mol）及びN-ヒドロキシフタルイミド（7.24 g、44.36 mmol）と混ぜた。その後
、強い減圧条件下、40℃、2日間、P2O5で乾燥させた。反応混合液をアルゴンを
フラッシュし（flushed）そして、無水THF（369.8 mL、Aldrich、確実に密閉さ
せた瓶）を加えて、透明な液体を得た。ジエチルーアゾジカルボン酸塩（6.98 mL
、44.36 mmol）を反応混合液に滴下して加えた。添加する速度は、生じる深い赤
い色が次の滴を加える前にちょうど消えるように維持した。添加が終了した後、
反応物を4時間攪拌した。その頃までに、TLCにより反応の終了が示された（酢酸
エチル:ヘキサン、60:40）。減圧下、溶媒を蒸発させた。得られた残渣をフラッ
シュカラムにのせ、そして、酢酸エチル:ヘキサン（60:40）で溶出し、2'-O-（
〔2-フタルイミドオキシ）エチル〕-5'-t-ブチルジフェニルシリル-5-メチルウ
リジンを白色の泡状物（21.819 g、86％）として得た。
【０１２９】 5'-O-tert-ブチルジフェニルシリル-2'-O-〔（2-ホルムアドキシイミノオキシ
）エチル〕-5-メチルウリジン 2'-O-（〔2-フタルイミドオキシ）エチル〕-5'-t-ブチルジフェニルシリル-5-
メチルウリジン（3.1 g、4.5 mmol）を無水CH2Cl2（4.5 mL）に溶解し、そして
、メチルヒドラジン（300 mL、4.64 mmol）を-10℃から0℃において滴下して加
えた。1時間後、混合物を濾過し、濾過物を氷冷CH2Cl2で洗浄し、そして、合わ
せた有機相を水、ブラインで洗浄して、次に、無水Na2SO4で乾燥させた。溶液を
濃縮して2'-O-（アミノオキシエチル）チミジンを得て、それを次にMeOH（67.5
mL）に溶解した。これにホルムアルデヒド（20％水溶液、w/w、1.1 eq.）を加え
、そして、得られた混合物を1時間攪拌した。溶媒を減圧下で除き；残渣をクロ
マトグラフィーで分離して、5'-O-tert-ブチルジフェニルシリル-2'-O-〔（2-ホ
ルムアドキシイミノオキシ）エチル〕-5-メチルウリジンを白色の泡（1.95 g、7
8％）として得た。
【０１３０】 5'-O-tert-ブチルジフェニルシリル-2'-O-〔N,N-ジチルアミノオキシエチル〕
-5-メチルウリジン 5'-O-tert-ブチルジフェニルシリル-2'-O-〔（2-ホルムアドキシイミノオキシ
）エチル〕-5-メチルウリジン（1.77 g、3.12 mmol）を1 M p-トルエンスルホン
酸ピリジニウム（PPTS）の溶液に溶解した。シアノホウ化水素ナトリウム（Sodi
um cyanoborohydride）（0.39 g、6.13 mmol）を、10℃、不活性気体条件下で、
この溶液に加えた。反応混合物を10℃、10分間攪拌した。その後、反応容器を氷
浴から取り出し、室温で2時間攪拌し、反応をTLCでモニターした（CH2Cl2中5％M
eOH）。NaHCO3水溶液（5％、10 mL）を加え、そして、酢酸エチルで抽出した（2
×20 mL）。酢酸エチル相を無水Na2SO4で乾燥させ、蒸発させて乾燥状態にした
。残渣を、MeOH（30.6 mL）中の1 M PPTS溶液に溶解した。ホルムアルデヒド（2
0％w/w、30 mL、3.37 mmol）を加え、反応混合物を室温で10分間攪拌した。反応
混合液を氷浴中で10℃に冷却し、シアノホウ化水素ナトリウム（0.39 g、6.13 m
mol）を加え、そして、反応混合物を10℃、10分間攪拌した。10分後、反応混合
液を氷浴から取り出し、そして、室温で2時間攪拌した。反応混合液に5％NaHCO3 （25 mL）溶液を加え、そして、酢酸エチル（2×25 mL）で抽出した。酢酸エチ
ル層を無水Na2SO4で乾燥させ、次に、蒸発させて乾燥状態にした。得られた残渣
をフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製し、そして、CH2Cl2中5％MeOHで
溶出し、5'-O-tert-ブチルジフェニルシリル-2'-O-〔N,N-ジメチルアミノオキシ
エチル〕-5-メチルウリジンを白色の泡状物（14.6 g、80％）として得た。
【０１３１】 2'-O-（ジメチルアミノオキシエチル）-5-メチルウリジン トリエチルアミントリヒドロフルオリド（3.91 mL、24.0 mmol）を無水THF及
びトリエチルアミン（1.67 mL、12 mmol、無水KOHで維持）に溶解した。このト
リエチルアミン-2HFの混合物を、次に、5'-O-tert-ブチルジフェニルシリル-2'-
O-〔N,N-ジメチルアミノオキシエチル〕-5-メチルウリジン（1.40 g、2.4 mmol
）に加えて、そして、室温で24時間攪拌した。反応をTLC（CH2Cl2中5％MeOH）に
よりモニターした。溶媒を減圧下、取り除き、そして、残渣をフラッシュカラム
にのせ、そして、CH2Cl2中10％MeOHで溶出して、2'-O-（ジメチルアミノオキシ
エチル）-5-メチルウリジン（766 mg、92.5％）を得た。
【０１３２】 5'-O-DMT-2'-O-（ジメチルアミノオキシエチル）-5-メチルウリジン 2'-O-（ジメチルアミノオキシエチル）-5-メチルウリジン（750 mg、2.17 mmo
l）を、強い減圧条件下、40℃で一晩、P2O5で乾燥させた。その後、無水ピリジ
ン（20 mL）と共に蒸発させた。得られた残渣をアルゴン気体条件下、ピリジン
（11 mL）に溶解した。4-ジメチルアミノピリジン（26.5 mg、2.60 mmol）、4,4
'-ジメトキシトリチルクロリド（880 mg、2.60 mmol）を混合液に加え、そして
、反応混合物を室温で、出発物質の全量がなくなるまで攪拌した。ピリジンを減
圧下取り除き、次に、残渣をクロマトグラフィーで分離し、そして、CH2Cl2中10
％MeOH（ピリジンを数滴含む）で溶出し、5'-O-DMT-2'-O-（ジメチルアミノ-オ
キシエチル）-5-メチルウリジン（1.13 g、80％）を得た。
【０１３３】 5'-O-DMT-2'-O-（2-N,N-ジメチルアミノオキシエチル）-5-メチルウリジン-3'
-〔（2-シアノエチル）-N,N-ジイソプロピルホスホールアミダイト〕 5'-O-DMT-2'-O-（ジメチルアミノオキシエチル）-5-メチルウリジン（1.08 g
、1.67 mmol）をトルエン（20 mL）と共に蒸発させる。残渣にN,N-ジイソプロピ
ルアミンテトラゾニド（0.29 g、1.67 mmol）を加えて、次に、強い減圧条件下
、40℃で一晩、P2O5で乾燥させた。その後、反応混合物を無水アセトニトリル（
8.4 mL）に溶解し、そして、2-シアノエチル-N,N,N1,N1-テトライソプロピルホ
スホールアミダイト（2.12 mL、6.08 mmol）を加えた。反応混合物を周囲温度で
4時間、不活性気体条件下で攪拌した。反応の進行を、TLC（ヘキサン:酢酸エチ
ル 1:1）でモニターした。溶媒を蒸発させ、次に、残渣を酢酸エチル（70 mL）
に溶解し、そして、5％NaHCO3水溶液（40 mL）で洗浄した。酢酸エチル層を無水
Na2SO4で乾燥させ、また、濃縮した。得られた残渣をクロマトグラフィーにより
分離し（溶出溶媒としては酢酸エチル）、5'-O-DMT-2'-O-（2-N,N-ジメチルアミ
ノオキシエチル）-5-メチルウリジン-3'-〔（2-シアノエチル）-N,N-ジイソプロ
ピルホスホールアミダイト〕（1.04 g、74.9％）を泡状物として得た。
【０１３４】 2'-（アミノオキシエトキシ）ヌクレオシドアミダイト 2'-（アミノオキシエトキシ）ヌクレオシドアミダイト〔当該技術分野におい
て、2'-O-（アミノオキシエチル）ヌクレオシドアミダイトとしても知られる〕
は、次の段落で記載される通り、調製する。アデノシン、シチジン及びチミジン
ヌクレオシドアミダイトは同様に調製する。
【０１３５】 N2-イソブチリル-6-O-ジフェニルカルバモイル-2'-O-（2-エチルアセチル）-5
'-O-（4,4'-ジメトキシトリチル）グアノシン-3'-〔（2-シアノエチル）-N,N-ジ
イソプロピルホスホールアミダイト〕 2'-O-アミノオキシエチルグアノシン類似体は、ジアミノプリンリボシドの選
択的2'-O-アルキル化により得ることができる。多様な重量のジアミノプリンリ
ボシドは、Schering AG（Berlin）から購入することが可能であり、2'-O-（2-エ
チルアセチル）ジアミノプリンリボシドを、少量の3'-O-異性体と共に提供する
。2'-O-（2-エチルアセチル）ジアミノプリンリボシドは、アデノシンデアミナ
ーゼ処理により分解され、そして、2'-O-（2-エチルアセチル）グアノシンに変
換され得る（McGee, D. P. C., Cook, P. D., Guinosso, C. J., WO 94/02501 A
1 940203.）。標準的な保護の手法は2'-O-（2-エチルアセチル）-5'-O-（4,4'-
ジメトキシトリチル）グアノシン及び2-N-イソブチリル-6-O-ジフェニルカルバ
モイル-2'-O-（2-エチルアセチル）-5'-O-（4,4'-ジメトキシトリチル）グアノ
シンを与えるに違いなく、それは、還元され、2-N-イソブチリル-6-O-ジフェニ
ルカルバモイル-2'-O-（2-エチルアセチル）-5'-O-（4,4'-ジメトキシトリチル
）グアノシンを提供し得る。前のように、水酸基はMitsunobu反応によってN-ヒ
ドロキシフタルイミドにより置換することができ、そして、保護されたヌクレオ
シドは通常通り、ホスフィチル（phosphityl）化して、2-N-イソブチリル-6-O-
ジフェニルカルバモイル-2'-O-（2-エチルアセチル）-5'-O-（4,4'-ジメトキシ
トリチル）グアノシン-3'-〔（2-シアノエチル）-N,N-ジイソプロピルホスホー
ルアミダイト〕を得ることができる。
【０１３６】 2'-ジメチルアミノエトキシエトキシ（2'-DMAEOE）ヌクレオシドアミダイト 2'-ジメチルアミノエトキシエトキシヌクレオシドアミダイト（当該技術分野
において2'-O-ジメチルアミノエトキシエチル、即ち、2'-O-CH2-O-CH2-N（CH2） 2 、あるいは2'-DMAEOEヌクレオシドアミダイトとしても知られる）は、以下のよ
うに調製される。他のヌクレオシドアミダイトは同様に調製される。
【０１３７】 2'-O-〔2（2-N,N-ジメチルアミノエトキシ）エチル〕-5-メチルウリジン 100 mLボンベ中で、テトラヒドロフラン中のボラン（1 M、10 mL、10 mmol）
の溶液に、2〔2-（ジメチルアミノ）エトキシ〕エタノール（Aldrich、6.66 g、
50 mmol）を攪拌しながらゆっくりと加える。固体が溶解するにつれて水素ガス
が発生する。O2-,2'-アンヒドロ-5-メチルウリジン（1.2 g、5 mmol）、及び、
炭酸水素ナトリウム（2.5 mg）を加え、そして、ボンベを密閉し、油浴中に入れ
、そして、155℃にて、26時間加熱する。ボンベは室温まで冷却し、そして、開
封する。粗溶液を濃縮し、そして、残渣を水（200 mL）およびヘキサン（200 mL
）の間で分配した。過剰量のフェノールを、ヘキサン層中で抽出した。水層を酢
酸エチル（3×200 mL）により抽出し、そして合わせた有機層を水で1回洗浄し、
無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、そして、濃縮する。残渣を、溶出溶媒としてメ
タノール／塩化メチレン1:20（2％トリエチルアミンを含む）を使用したシリカ
ゲルカラムにかける。カラム分画が濃縮されるにつれて、無色の固体が形成され
、集められて、表題の化合物を白色の固体として得る。
【０１３８】 5'-O-ジメトキシトリチル-2'-O-〔2（2-N,N-ジメチルアミノエトキシ）エチル
）〕-5-メチルウリジン 無水ピリジン（8 mL）中0.5 g（1.3 mmol）の2'-O-〔2（2-N,N-ジメチルアミ
ノ-エトキシ）エチル）〕-5-メチルウリジン溶液に、トリエチルアミン（0.36 m
L）及びジメトキシトリチルクロリド（DMT-Cl、0.87 g、2 eq.）を加えて、そし
て、1時間攪拌する。反応混合物を水（200 mL）に注ぎいれ、そして、CH2Cl2（2
×200 mL）で抽出する。合わせたCH2Cl2層を飽和NaHCO3溶液、続いて飽和NaCl溶
液で洗浄し、次に、無水硫酸ナトリウムで乾燥させる。溶媒の蒸発に続いて、Me
OH:CH2Cl2:Et3N（20:1、v/v、1％トリエチルアミンを含む）を用いるシリカゲル
クロマトグラフィーにより、表題化合物を得る。
【０１３９】 5'-O-ジメトキシトリチル-2'-O-〔2（2-N,N-ジメチルアミノエトキシ）エチル
）〕-5-メチルウリジン-3'-O-（シアノエチル-N,N-ジイソプロピル）ホスホール
アミダイト ジイソプロピルアミノテトラゾリド（0.6 g）及び2-シアノエトキシ-N,N-ジイ
ソプロピルホスホールアミダイト（1.1 mL、2 eq.）を、アルゴン気体条件下、C
H2Cl2（20 mL）に溶解した5'-O-ジメトキシトリチル-2'-O-〔2（2-N,N-ジメチル
アミノエトキシ）エチル）〕-5-メチルウリジン（2.17 g、3 mmol）に加える。
反応混合液を一晩攪拌し、そして、溶媒を蒸発させる。得られた残渣を、酢酸エ
チルを溶出溶媒として用いるシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーに
より精製し、表題の化合物を得る。
【０１４０】 実施例2 オリゴヌクレオチド合成 未置換及び置換ホスホジエステル（P=O）オリゴヌクレオチドを、自動DNAシン
セサイザー（Applied Biosystems model 380B）で、ヨウ素による酸化を用いる
標準的なホスホールアミダイト化学を使用して、合成する。
【０１４１】 亜リン酸塩結合の段階的チア化のため、標準的な酸化瓶を、アセトニトリル中
0.2 M 3H-1,2-ベンゾジチオール-3-オン1,1-ジオキシド溶液に置き換えた以外は
、ホスホロチオエート（P=S）は、ホスホジエステルオリゴヌクレオチドのため
と同様に合成される。チア化待機段階を68秒に増加し、そして、引き続いてキャ
ッピング段階を行った。CPGカラムからの分離、及び、55℃で（18時間）濃縮さ
れた水酸化アンモニウム中の脱ブロック化した後、2.5倍量のエタノールで2回沈
殿することにより、オリゴヌクレオチドを0.5 M NaCl溶液から精製した。ホスフ
ィネートオリゴヌクレオチドを、本明細書中で参考文献として援用される、アメ
リカ合衆国特許5,508,270に記載の通り、調製する。
【０１４２】 アルキルホスホネートオリゴヌクレオチドは、本明細書中で参考文献として援
用される、アメリカ合衆国特許4,469,863に記載の通り、調製する。 3'-デオキシ-3'-メチレンホスホネートオリゴヌクレオチドは、本明細書中で
参考文献として援用される、アメリカ合衆国特許5,610,289あるいは5,625,050に
記載の通り、調製する。
【０１４３】 ホスホールアミダイトオリゴヌクレオチドは、本明細書中で参考文献として援
用される、アメリカ合衆国特許5,256,775あるいはアメリカ合衆国特許5,366,878
に記載の通り、調製する。
【０１４４】 アルキルホスホノチオエートオリゴヌクレオチドは、本明細書中で参考文献と
して援用される、公開されたPCT出願PCT/US94/00902及びPCT/US93/06976（それ
ぞれWO 94/17093及びWO 94/02499として公開）に記載の通り、調製する。
【０１４５】 3'-デオキシ-3'-アミノホスホールアミデートオリゴヌクレオチドは、本明細
書中で参考文献として援用される、アメリカ合衆国特許5,023,243に記載の通り
、調製する。
【０１４６】 ホスホトリエステルオリゴヌクレオチドは、本明細書中に参考文献として援用
されるアメリカ合衆国特許5,023,234に記載の通り、調製する。 ボランリン酸オリゴヌクレオチドは、共に本明細書中で参考文献として援用さ
れる、アメリカ合衆国特許5,130,302及び5,177,198に記載の通り、調製する。
【０１４７】 実施例3 オリゴヌクレオシド合成 MMI結合オリゴヌクレオシドとも同一であるメチレンメチルイミノ結合オリゴ
ヌクレオシド、MDH結合オリゴヌクレオシドとも同一であるメチレンジメチルヒ
ドラゾ結合オリゴヌクレオシド、及び、アミド-3結合オリゴヌクレオシドとも同
一であるメチレンカルボニルアミノ結合オリゴヌクレオシド、及び、アミド-4結
合オリゴヌクレオシドとも同一であるメチレンアミノカルボニル結合オリゴヌク
レオシド、そして、例えば、MMIとP=OあるいはP=S結合とを換えたものを有する
混合バックボーン化合物は、そのすべてが本明細書中で参考文献として援用され
る、アメリカ合衆国特許5,378,825、5,386,023、5,489,677、5,602,240及び5,61
0,289,に記載の通り、調製する。
【０１４８】 ホルムアセタール及びチオホルムアセタール結合オリゴヌクレオシドは、本明
細書中で参考文献として援用される、アメリカ合衆国特許5,264,562及び5,264,5
64に記載の通り、調製する。
【０１４９】 エチレンオキシド結合オリゴヌクレオシドは、本明細書中で参考文献として援
用される、アメリカ合衆国特許5,223,618に記載の通り、調製する。 実施例4 PNA合成 ペプチド核酸（PNAs）は、ペプチド核酸（PNA）に関する様々な方法：Synthes
is, Properties and Potential Applications, Bioorganic & Medicinal Chemis
try, 1996, 4, 5-23のいずれかに従って、調製される。それらはまた、本明細書
中で参考文献として援用される、アメリカ合衆国特許5,539,082、5,700,922,、
及び、5,719,262に従ってもまた、調製され得る。
【０１５０】 実施例5 キメラオリゴヌクレオチドの合成 本発明のキメラオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、または、混合オリ
ゴヌクレオチド/オリゴヌクレオシドは、いくつかの異なる型でありうる。これ
らは、結合ヌクレオシドの“ギャップ”セグメントが結合ヌクレオシドの5'ある
いは3'“ウィング”セグメントの間に位置する第一の型、及び、“ギャップ”セ
グメントがオリゴマー化合物の3'あるいは5'端のどちらかに位置する、第二の“
オープンエンド”型を含む。第一の型のオリゴヌクレオチドは、当該技術分野に
おいて、“ギャップマー”あるいはギャップ化オリゴヌクレオチドとしても知ら
れる。第二の型のオリゴヌクレオチドは、当該技術分野において、“ヘミマー”
あるいは“ウィングマー”としても知られる。
【０１５１】 〔2'-O-Me〕--〔2'-デオキシ〕--〔2'-O-Me〕キメラホスホロチオエートオリ
ゴヌクレオチド 2'-O-アルキルホスホロチオエートを有するキメラオリゴヌクレオチド及び2'-
デオキシホスホロチオエートオリゴヌクレオチドセグメントを、上記の通り、Ap
plied Biosystems自動DNAシンセサイザーModel 380Bを使用して合成する。オリ
ゴヌクレオチドは、自動シンセサイザーを用い、及び、DNA部分には2'-デオキシ
-5'-ジメトキシトリチル-3'-O-ホスホールアミダイトを、そして、5'及び3'ウィ
ングには5'-ジメトキシトリチル-2'-O-メチル-3'-O-ホスホールアミダイトを使
用して、合成する。標準的な合成サイクルを、テトラゾール及び塩基のデリバリ
ー後の待機段階を600秒に増加することにより修正し、RNAについては4回、2'-O-
メチルについては2回繰り返した。完全に保護されたオリゴヌクレオチドを支持
体から解離し、そして、室温で一晩、3:1アンモニア/エタノール中で、リン酸基
を脱保護し、その後、凍結乾燥により乾燥させる。その後、室温で24時間、メタ
ノールアンモニア中で処理することによりすべての塩基を脱保護し、そして、試
料を再び凍結乾燥により乾燥させる。ペレットをTHF中1 M TBAFに、室温で24時
間懸濁し、2'位を脱保護する。次に、反応を1 M TEAAで停止し、そして次に試料
をrotovacにより1/2量に減少させ、G25サイズ排除カラムにより脱塩する。回収
したオリゴは次に、キャピラリー電気泳動により、また、質量分析により、収量
について、また、純度について、分光光度的に分析される。
【０１５２】 〔2'-O-（2-メトキシエチル）〕--〔2'-デオキシ〕--〔2'-O-（メトキシエチ
ル）〕キメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチド 〔2'-O-（2-メトキシエチル）〕--〔2'-デオキシ〕--〔2'-O-（メトキシエチ
ル）〕キメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、2'-O-（メトキシエチ
ル）アミダイトを2'-O-メチルアミダイトに置き換えた2'-O-メチルキメラオリゴ
ヌクレオチドのための上記の方法に従って、調製した。
【０１５３】 〔2'-O-（2-メトキシエチル）ホスホジエステル〕--〔2'-デオキシホスホロチ
オエート〕--〔2'-O-（2-メトキシエチル）ホスホジエステル〕キメラオリゴヌ
クレオチド 〔2'-O-（2-メトキシエチル）ホスホジエステル〕--〔2'-デオキシホスホロチ
オエート〕--〔2'-O-（2-メトキシエチル）ホスホジエステル〕キメラオリゴヌ
クレオチドは、2'-O-（メトキシエチル）アミダイトを2'-O-メチルアミダイトに
置き換えた、2'-O-メチルキメラオリゴヌクレオチドについての上記の方法、キ
メラ構造のウィング部分中のホスホジエステルヌクレオチド間結合を作るための
ヨウ素を用いる酸化、中央ギャップのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を
作るための3,H-1,2ベンゾジチオール-3-オン1,1ジオキシド（Beaucage Reagent
）を使用する硫化に従って、調製する。
【０１５４】 他のキメラオリゴヌクレオチド、キメラオリゴヌクレオシド及び混合キメラオ
リゴヌクレオチド/オリゴヌクレオシドは、本明細書中で参考文献として援用さ
れる、アメリカ合衆国特許5,623,065に従って合成される。
【０１５５】 実施例6 オリゴヌクレオチドの単離 制御孔ガラスカラム（Applied Biosystems）から分離し、そして、濃縮された
水酸化アンモニウム中、55℃、18時間、脱ブロック化した後、オリゴヌクレオチ
ドまたはオリゴヌクレオシドは、0.5 M NaClから2.5倍量のエタノールを用いた2
回の沈殿により精製する。合成されたオリゴヌクレオチドは、変性ゲル上でのポ
リアクリルアミドゲル電気泳動により分析され、そして、少なくとも85％の全長
物質であると判断された。合成により得られたホスホロチオエート及びホスホジ
エステル結合の相対的な量は、定期的に31P核磁気共鳴分光器により検査され、
そして、いくつかの研究のため、オリゴヌクレオチドをChiangら（J. Biol. Che
m. 1991, 266, 18162-18171）により記載の通り、HPLCで精製した。HPLC精製産
物を用いて得られた結果は、非HPLC精製産物から得られたものと同様だった。
【０１５６】 実施例7 オリゴヌクレオチド合成−96ウェルプレート型 オリゴヌクレオチドを、固相P（III）ホスホールアミダイト化学により、標準
的な96ウェル型に同時に96配列を構築することができる自動シンセサイザーで合
成した。ホスホロジエステルヌクレオチド間結合はヨウ素水溶液を用いる酸化に
よって得られた。ホスホロチオエートヌクレオチド間結合は、無水アセトニトリ
ル中3,H-1,2ベンゾジチオール-3-オン1,1ジオキシド（Beaucage Reagent）を使
用した硫化により、生成した。標準的な塩基保護β-シアノエチルジイソプロピ
ルホスホールアミダイトは、商業販売者（例えば、PE-Applied Biosystems, Fos
ter City, CAまたはPharmacia, Piscataway, NJ）から購入した。非標準ヌクレ
オシドは、既知の文献、あるいは、特許の方法の通り、合成する。それらは、塩
基保護β-シアノエチルジイソプロピルホスホールアミダイトとして使用される
。
【０１５７】 オリゴヌクレオチドを支持体から解離し、そして、高温度（55-60℃）にて、1
2−16時間、濃縮NH4OHにより脱保護し、そして放出された生成物を次に減圧下で
乾燥した。乾燥した生成物を次に滅菌水に再懸濁して、マスタープレートを得て
、そこからすべての分析及び試験プレート試料をロボットピペッターを使用して
希釈する。
【０１５８】 実施例8 オリゴヌクレオチド分析−96ウェルプレート型 各ウェルのオリゴヌクレオチドの濃度を、試料の希釈及びUV吸収分光器により
調査した。個々の生成物の全長の完全性を、キャピラリー電気泳動（CE）により
、96ウェル型（Beckman P/ACETM MDQ）で、あるいは、個々に調製した試料につ
いては、市販のCE器具（例えば、Beckman P/ACETM 5000, ABI 270）で、評価し
た。塩基及びバックボーン構成は、エレクトロスプレー質量分光計を使用する化
合物の質量分析により、確かめられた。すべてのアッセイ検査プレートは、マス
タープレートから、シングルあるいはマルチチャネルのロボットピペッターを使
用して希釈した。プレートは、プレート上の化合物の少なくとも85％が、少なく
とも全長の85％であれば、許容可能であると判断した。
【０１５９】 実施例9 細胞培養及びオリゴヌクレオチド処理 標的核酸発現に対するアンチセンス化合物の効果は、測定可能なレベルで標的
核酸が存在する場合、様々な細胞タイプのいずれにおいても、試験することがで
きる。これは、例えば、PCRあるいはノザンブロット分析を使って日常的に決定
され得る。以下の4つの細胞タイプは説明するために提供されるが、標的が選択
された細胞タイプ中において発現される場合には、他の細胞タイプを日常的に使
用することができる。これは、当該技術分野において日常的な方法、たとえばノ
ザンブロット解析、リボヌクレアーゼ保護アッセイ、あるいはRT-PCR、により容
易に確認することができる。
【０１６０】 T-24細胞： 移行上皮細胞（transitional cell）膀胱癌細胞株T-24細胞はAmerican Type C
ulture Collection（ATCC）（Manassas, VA）より入手した。T-24細胞は、日常
的に、10％ウシ胎児血清（Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD）、100
u/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン（Gibco/Life Technologies, G
aithersburg, MD）を加えた、完全McCoy's 5A基本培地（Gibco/Life Technologi
es, Gaithersburg, MD）で、培養した。細胞は、日常的に、それが90％コンフル
エンスに達したら、トリプシン処理及び希釈により継代した。RT-PCR分析におい
て使用するため、細胞を96ウェルプレート（Falcon-Primaria #3872）に7000細
胞/ウェルの濃度でまいた。
【０１６１】 ノザンブロットあるいは他の分析のため、細胞を100 mmあるいは他の標準的な
組織培養プレートにまき、そして、適切な量の培地及びオリゴヌクレオチドを使
用して、同様の処理をすることができる。
【０１６２】 A549細胞： ヒト肺癌細胞株A549は、American Type Culture Collection（ATCC）（Manass
as, VA）より入手した。A549は、日常的に、10％ウシ胎児血清（Gibco/Life Tec
hnologies, Gaithersburg, MD）、100 u/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマ
イシン（Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD）を加えた、DMEM基本培
地（Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD）で培養した。細胞は、日常
的に、それが90％コンフルエンスに達したら、トリプシン処理及び希釈により継
代した。
【０１６３】 NHDF細胞： ヒト新生児皮膚線維芽細胞（NHDF）は、Clonetics Corporation（Walkersvill
e MD）より入手した。NHDFは日常的に、提供者により推奨される通り添加した線
維芽細胞成長培地（Clonetics Corporation, Walkersville MD）で維持した。細
胞は提供者により推奨される通り、10継代まで維持した。
【０１６４】 HEK細胞： ヒト胎児ケラチノサイト（HEK）はClonetics Corporation（Walkersville MD
）より入手した。HEK細胞は、日常的に、提供者により推奨される通り製剤化さ
れたケラチノサイト成長培地（Clonetics Corporation, Walkersville MD）で維
持した。細胞は、日常的に、提供者により推奨される通り、10継代まで維持した
。
【０１６５】 アンチセンス化合物の処理： 細胞が80％コンフルエンスに達したとき、オリゴヌクレオチドにより処理した
。96ウェルプレートで生育した細胞について、ウェルを200μLのOPTI-MEMTM-1減
少血清培地（Gibco BRL）で一度洗浄し、次に3.75μg/mL LIPOFECTINTM（Gibco
BRL）及び望ましい濃度のオリゴヌクレオチドを含む、130μLのOPTI-MEMTM -1で
処理した。4〜7時間処理後、培地をフレッシュな培地に交換した。オリゴヌクレ
オチド処理後16〜24時間後に細胞を回収した。
【０１６６】 使用したオリゴヌクレオチドの濃度は、細胞株ごとに変化させる。特定の細胞
株に対する最適オリゴヌクレオチド濃度を決定するため、細胞をある濃度範囲の
陽性対照オリゴヌクレオチドにより処理する。ヒト細胞については、陽性対照オ
リゴヌクレオチドは、ヒトH-rasを標的とし、ホスホロチオエートバックボーン
を有する2'-O-メトキシエチルギャップマー（2'-O-メトキシエチルは太字で示し
た）である、ISIS 13920、
【０１６７】
【化１】
【０１６８】 である。マウスまたはラット細胞については、陽性対照オリゴヌクレオチドは、
マウスc-rafおよびラットc-rafの両方を標的とし、ホスホロチオエートバックボ
ーンを有する2'-O-メトキシエチルギャップマー（2'-O-メトキシエチルは太字で
示した）である、ISIS 15770、
【０１６９】
【化２】
【０１７０】 である。c-Ha-ras（ISIS 13920）mRNAまたはc-raf（ISIS 15770）mRNAの80％の
阻害を引き起こす陽性対照オリゴヌクレオチドの濃度を、その細胞株について引
き続いて実験する際に利用する。80％の阻害が達成されない場合、H-rasまたはc
-raf mRNAの60％の阻害を引き起こす陽性対照オリゴヌクレオチドの最低濃度を
、その細胞株について引き続いて実験する際に、オリゴヌクレオチドスクリーニ
ング濃度として利用する。60％の阻害が達成されない場合、その特定の細胞株は
オリゴヌクレオチドトランスフェクション実験については適していないものと判
断する。
【０１７１】 実施例10 マクロファージ遊走阻害因子発現のオリゴヌクレオチド阻害の分析 マクロファージ遊走阻害因子発現のアンチセンスモジュレーションは、当該技
術分野において知られる様々な方法でアッセイすることができる。例えば、マク
ロファージ遊走阻害因子 mRNAレベルは、例えばノザンブロット分析、競合的ポ
リメラーゼ連鎖反応（PCR）、あるいは、リアルタイムPCR（RT-PCR）により、定
量され得る。リアルタイム定量PCRが現在のところ好ましい。RNA分析は、全細胞
内RNA、あるいは、ポリ（A）+ mRNAについて行うことができる。RNA単離の方法
は、例えば、Ausubel, F.M. ら（Current Protocols in Molecular Biology, Vo
lume 1, pp. 4.1.1-4.2.9 及び4.5.1-4.5.3, John Wiley & Sons, Inc., 1993）
に教示される。ノザンブロット分析は、当該技術分野においては、日常的な方法
であり、また、例えば、Ausubel, F.M.ら（Current Protocols in Molecular Bi
ology, Volume 1, pp. 4.2.1-4.2.9, John Wiley & Sons, Inc., 1996）に教示
される。リアルタイム定量（PCR）は、PE-Applied Biosystems（Foster City, C
A）から入手可能な、市販のABI PRISMTM 7700 Sequence Detection Systemを使
用することにより、都合よく成し遂げられ、そして、製造者の指示に従って使用
される。定量的PCR解析の前に、測定される標的遺伝子に対して特異的なプライ
マー-プローブセットを、GAPDH増幅反応とともに“多重化される”能力について
評価する。多重化において、標的遺伝子および内部標準遺伝子GAPDHの両方を、
単一サンプル中で同時に増幅する。この解析において、非処理細胞から単離され
るmRNAは、階段希釈される。それぞれの希釈物は、GAPDHのみまたは標的遺伝子
のみに特異的なプライマー-プローブセットの存在下（“単一反応性（single-pl
exing）”）、もしくは両方に特異的なプライマー-プローブセットの存在下（多
重性）において増幅させる。PCR増幅の後、GAPDHおよび標的mRNAシグナルの標準
曲線を、希釈の関数として単一反応性サンプルおよび多重反応性サンプルの両方
から作成する。多重反応性サンプルから作成されたGAPDHシグナルおよび標的シ
グナルの傾きおよび相関係数が、単一反応性サンプルから作成されたそれらの対
応する値の10％以内に収まる場合には、その標的に対して特異的なプライマー-
プローブセットは、多重性であるとみなされる。PCRの他の手法もまた、当該技
術分野において、既知である。
【０１７２】 マクロファージ遊走阻害因子タンパク質レベルは、免疫沈降、ウエスタンブロ
ット分析（イムノブロット）、ELISA、あるいは、蛍光活性化細胞分取器（FACS
）といった、当該技術分野において既知である様々な手法により定量され得る。
マクロファージ遊走阻害因子に対する抗体は同定され、そして、MSRSの抗体カタ
ログ（Aerie Corporation, Birmingham, MI）といった、様々な供給者から入手
することが可能であり、または、従来からの抗体作成方法により調製し得る。ポ
リクローナル抗血清の調製方法は、例えば、Ausubel, F.M.ら（Current Protoco
ls in Molecular Biology, Volume 2, pp. 11.12.1-11.12.9, John Wiley & Son
s, Inc., 1997）に教示される。モノクローナル抗血清の調製方法は、例えば、A
usubel, F.M.ら（Current Protocols in Molecular Biology, Volume 2, pp. 11
.4.1-11.11.5, John Wiley & Sons, Inc., 1997）に教示される。
【０１７３】 免疫沈降方法は、当該技術分野において標準的であり、また、例えば、Ausube
l, F.M. ら（Current Protocols in Molecular Biology, Volume 2, pp. 10.16.
1-10.16.11, John Wiley & Sons, Inc., 1998）において見いだすことができる
。ウェスタンブロット（イムノブロット）分析は、当該技術分野において標準的
であり、例えば、Ausubel, F.M.ら（Current Protocols in Molecular Biology,
Volume 2, pp. 10.8.1-10.8.21, John Wiley & Sons, Inc., 1998）において見
いだすことができる。酵素免疫吸着測定法（ELISA）は、当該技術分野において
標準的であり、また、例えば、Ausubel, F.M. ら（Current Protocols in Molec
ular Biology, Volume 2, pp. 11.2.1-11.2.22, John Wiley & Sons, Inc., 199
1）において見つけることができる。
【０１７４】 実施例11 ポリ（A）+ mRNA単離 ポリ（A）+ mRNAは、Miuraら（Clin. Chem., 1996, 42, 1758-1764）に従って
、単離された。ポリ（A）+ mRNA単離のための他の方法は、例えば、Ausubel, F.
M.ら（Current Protocols in Molecular Biology, Volume 1, pp. 4.5.1-4.5.3,
John Wiley & Sons, Inc., 1993）に教示される。簡潔には、96ウェルプレート
上で培養した細胞において、細胞から増殖培地を除き、そして、各ウェルを200
μL冷PBSで洗浄した。60μL溶解バッファー（10 mM Tris-HCl、pH 7.6、1 mM ED
TA、0.5 M NaCl、0.5％NP-40、20 mMバナジル-リボヌクレオシド複合体）を各ウ
ェルに加え、プレートをゆっくり揺り動かし、そして次に、室温で5分間インキ
ュベートした。溶解物55μLをオリゴd（T）をコートした96ウェルプレート（AGC
T Inc., Irvine CA）に移した。プレートを、60分、室温でインキュベートし、
洗浄バッファー（10 mM Tris-HCl pH 7.6、1 mM EDTA、0.3 M NaCl）200μLで3
回洗浄した。最後の洗浄の後、プレートをペーパータオルに当てて、余分な洗浄
バッファーを取り除き、そしてその後、5分間風乾した。70℃に前もって熱した
、溶出バッファー（5 mM Tris-HCl pH 7.6）60μLを、各ウェルに加え、プレー
トを90℃ホットプレートで5分間インキュベートし、そして、次に溶出物を新し
い96ウェルプレートに移した。
【０１７５】 100 mmあるいは他の標準的なプレートに培養した細胞は、適する容量のすべて
の溶液を用いて、同様に処理し得る。 実施例12 全RNA単離 全mRNAは、Qiagen Inc.（Valencia CA）より購入したRNEASY 96TMキット及び
バッファーを用い、製造者の推薦する方法に従って単離した。簡潔には、96ウェ
ルプレート上で培養した細胞において、増殖培地を細胞から除き、そして、各ウ
ェルを200μL冷PBSで洗浄した。100μLのバッファーRLTを各ウェルに加え、そし
て、プレートを20秒間激しく揺り動かした。70％エタノール100μLを次に各ウェ
ルに加え、内容物を3回上下にピペッティングして混ぜた。次に試料を排水回収
トレイに合わせたQIAVACTMマニホルドに取り付け、そして減圧装置に取り付けた
、RNEASY 96TMウェルプレートに移した。減圧は15秒間行われた。1 mLのバッフ
ァーRW1をRNEASY 96TMプレートの各ウェルに加え、そして、再び減圧を15秒間行
った。その後、1 mLのバッファーRPEをRNEASY 96TMプレートの各ウェルの添加し
、そして減圧を15秒間行った。バッファーRPE洗浄を次に繰り返し、さらに10分
間減圧を行った。プレートをQIAVACTMマニホルドから取り外し、そしてペーパー
タオルにあてて乾燥させた。プレートを次に、1.2 mL回収チューブを含む、回収
チューブラックに合わせたQIAVACTMマニホルドにもう一度取り付けた。RNAを次
に各ウェル中の60μLの水をピペッティングすることにより溶出し、1分間インキ
ュベートし、そして次に、30秒間減圧を行った。さらに60μLの水を用いて、溶
出段階を繰り返した。
【０１７６】 繰り返しのピペッティング及び溶出段階を、QIAGEN Bio-Robot 9604（Qiagen,
Inc., Valencia CA）を用いて、自動化することができる。本質的には、培養プ
レート上で細胞を溶解した後、プレートをロボットデッキに移し、そこで、ピペ
ッティング、DNase処理、及び、溶出段階が実行される。
【０１７７】 実施例13 マクロファージ遊走阻害因子 mRNAレベルのリアルタイム定量PCR分析 マクロファージ遊走阻害因子 mRNAレベルの定量は、ABI PRISM 7700 Sequence
Detection System（PE-Applied Biosystems, Foster City, CA）を製造者の指
示に従って使用して、リアルタイム定量PCRにより決定された。これは、閉じら
れたチューブで、ゲルに基づいてなく、リアルタイムにポリメラーゼ連鎖反応（
PCR）産物のハイスループット定量ができる蛍光検出システムである。PCRが終了
した後に、増幅産物が定量される標準的なPCRとは対照的に、リアルタイム定量P
CR産物はそれが蓄積するに従って定量される。これは、PCR反応にフォワード及
びリバースPCRプライマーの間に特異的にアニールし、そして2つの蛍光色素を含
むオリゴヌクレオチドを含むことにより達せられる。レポーター色素（例えば、
Operon Technologies Inc., Alameda, CA またはPE-Applied Biosystems, Foste
r City, CAのどちらかから入手可能なJOE、FAMあるいはVIC）は、プローブの5'
端に結合し、そして、クエンチャー色素（例えば、Operon Technologies Inc.,
Alameda, CAまたはPE-Applied Biosystems, Foster City, CAのどちらかから入
手可能なTAMRA）は、プローブの3'端に結合する。プローブ及び色素が完全なと
き、レポーター色素の発光は3'クエンチャー色素の近接により消失される。増幅
の間、プローブの標的配列へのアニーリングはTaqポリメラーゼの5'-エキソヌク
レアーゼ活性により切断されうる基質を作り出す。PCR増幅サイクルの伸長相の
間、Taqポリメラーゼによるプローブの切断はプローブの残りから（そしてつま
りクエンチャー部分から）レポーター色素を放出し、そして、配列特異的な蛍光
シグナルが生み出される。各サイクルで、さらなるレポーター色素分子はその対
応するプローブから解離され、そして、蛍光強度は、ABI PRISMTM 7700 Sequenc
e Detection Systemに組み込まれるレーザー光により、一定のインターバルでモ
ニターされる。各アッセイにおいて、未処理の対照試料由来mRNAの希釈系列を含
む、並行した一連の反応は、試験試料の、アンチセンスオリゴヌクレオチド処理
後の阻害パーセントを定量するのに用いられる、標準曲線を生み出す。
【０１７８】 PCR試薬はPE-Applied Biosystems（Foster City, CA）より入手した。RT-PCR
反応は、25μLポリ（A）mRNA溶液を含む96ウェルプレートに、25μL PCRカクテ
ル（1×TAQMANTM バッファーA、5.5 mM MgCl2、各300μMのdATP、dCTP及びdGTP
を、600μMのdUTP、フォワードプライマー、リバースプライマー、及び、プロー
ブを各100 nM、20 U RNAseインヒビター、1.25 U AMPLITAQ GOLDTM及び12.5 U M
uLV逆転写酵素）を加えることにより実行した。RT反応は48℃で30分のインキュ
ベーションにより実行された。AMPLITAQ GOLDTMを活性化するために95℃にて10
分間のインキュベーションした後、40サイクルの2段階PCRプロトコールを実行し
た：95℃15秒間（変性）続いて60℃1.5分間（アニーリング/伸長）。
【０１７９】 刊行物に記載された配列情報（本明細書中でSEQ ID NO:3として援用されるGen
Bankアクセッション番号1411 76）を使用して、ヒトマクロファージ遊走阻害因
子に対するプローブおよびプライマーを、ヒトマクロファージ遊走阻害因子配列
にハイブリダイズするように設計した。
【０１８０】 ヒトマクロファージ遊走阻害因子について、PCRプライマーは： フォワードプライマー：CAGCCCGGACAGGGTCTAC（SEQ ID NO: 4）、 リバースプライマー：GCGAAGGTGGAGTTGTTCCA（SEQ ID NO: 5）、および PCRプローブ：FAM-TCAACTATTACGACATGAACGCGGCCA-TAMRA（SEQ ID NO: 6）、 であり、ここでFAM（PE-Applied Biosystems, Foster City, CA）は蛍光レポー
ター色素であり、そして、TAMRA（PE-Applied Biosystems, Foster City, CA）
はクエンチャー色素である。
【０１８１】 ヒトGAPDH用のPCRプライマーは： フォワードプライマー：GAAGGTGAAGGTCGGAGTC（SEQ ID NO: 7） リバースプライマー：GAAGATGGTGATGGGATTTC（SEQ ID NO: 8）であり、及び PCRプローブは：5' JOE-CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC- TAMRA 3'（SEQ ID NO: 9）であ
り、JOE（PE-Applied Biosystems, Foster City, CA）は蛍光レポーター色素で
あり、そして、TAMRA（PE-Applied Biosystems, Foster City, CA）はクエンチ
ャー色素である。
【０１８２】 実施例14 マクロファージ遊走阻害因子 mRNAレベルのノザンブロット分析 アンチセンス処理の18時間後、単層の細胞を冷PBSで2回洗浄し、そして、1 mL
RNAZOLTM（TEL-TEST “B” Inc., Friendswood, TX）に溶解した。全RNAは製造
者が推薦するプロトコルに従って調製した。MOPSバッファーシステム（AMRESCO,
Inc. Solon, OH）を用い、1.1％ホルムアルデヒドを含む1.2％アガロースゲル
による電気泳動により、20マイクログラムの全RNAを分離した。Northern/Southe
rn Transferバッファーシステム（TEL-TEST “B” Inc., Friendswood, TX）を
使用して、一晩キャピラリートランスファーすることによって、RNAをゲルからH
YBONDTM-N+ ナイロンメンブレン（Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, N
J）に移した。RNAのトランスファーは、UV可視化により確認した。メンブレンを
STRATALINKERTM UV Crosslinker 2400（Stratagene, Inc, La Jolla, CA）を使
用して、UV架橋により固定し、次いでQUICKHYBTMハイブリダイゼーション溶液（
Stratagene, La Jolla, CA）を使用し、ストリンジェントな条件についての製造
者の推奨を用いて、プローブ化した。
【０１８３】 ヒトマクロファージ遊走阻害因子を検出するため、ヒトマクロファージ遊走阻
害因子特異的プローブを、フォワードプライマーCAGCCCGGACAGGGTCTAC（SEQ ID
NO: 4）およびリバースプライマーGCGAAGGTGGAGTTGTTCCA（SEQ ID NO: 5）を使
用したPCRにより調製した。ロード効率及びトランスファー効率における多様性
を標準化するため、メンブレンをストリップ化し、そして、ヒトグリセルアルデ
ヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ（GAPDH）RNA（Clontech, Palo Alto, CA
）についてプローブ化した。
【０１８４】 PHOSPHORIMAGERTMおよびIMAGEQUANTTM Software V3.3（Molecular Dynamics,
Sunnyvale, CA）を用いて、ハイブリダイズしたメンブレンを可視化し、そして
、定量した。データは未処理対照におけるGAPDHレベルに標準化した。
【０１８５】 実施例15 2'-MOEウィングおよびデオキシギャップを有するキメラホスホロチオエートオ
リゴヌクレオチドによるヒトマクロファージ遊走阻害因子のアンチセンス阻害 本発明に従って、一連のオリゴヌクレオチドを、刊行物に記載された配列（そ
こから誘導されたcDNAに5'および3'プライム側面領域のおよそ100ヌクレオチド
を付加したものを本明細書中でSEQ ID NO: 3として援用する、ゲノム配列である
、GenBankアクセッション番号L19686、およびSEQ ID NO: 10として援用されるGe
nBankアクセッション番号L19686）を用いて、ヒトマクロファージ遊走阻害因子
RNAの異なる領域を標的とするように設計した。オリゴヌクレオチドは表1に示す
。“標的部位”は、オリゴヌクレオチドが結合する特定の標的配列上の最初（最
も5'-端）のヌクレオチド番号を示す。表1中のすべての化合物は、両方の端（5'
及び3'方向）を5-ヌクレオチドの“ウィング”によって挟まれた、10個の2'-デ
オキシヌクレオチドからなる中央“ギャップ”領域から構成される、長さが20ヌ
クレオチドの、キメラオリゴヌクレオチド（“ギャップマー”）である。ウィン
グは、2'-メトキシエチル（2'-MOE）ヌクレオチドからなる。ヌクレオシド間（
バックボーン）結合はオリゴヌクレオチド全体にわたりホスホロチオエート（P=
S）である。全てのシチジン残基は5-メチルシチジンである。化合物を、ヒトマ
クロファージ遊走阻害因子 mRNAレベルに対するそれらの効果について、本明細
書中の他の実施例に記載の通り、定量的リアルタイムPCRにより分析した。デー
タは2回の実験からの平均である。存在する場合、“N.D.”は“データなし”を
示す。
【０１８６】
【表１】
【０１８７】
【０１８８】 表1に示されるように、SEQ ID NO: 13、14、15、16、17、18、19、20、21、22
、23、24、25、26、29、30、31、32、33、35、36、37、38、40、41、42、43、44
、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62
、63、64、65、66、67、68、69、70、71、73、74、75、76、77、83、85および86
は、このアッセイにおいて、少なくとも25％のヒトマクロファージ遊走阻害因子
の発現の阻害が証明され、そして、それゆえ好ましい。
【０１８９】 実施例16 マクロファージ遊走阻害因子タンパク質レベルのウエスタンブロット分析 ウエスタンブロット（イムノブロット分析）は標準的な方法を用いて行われる
。細胞をオリゴヌクレオチド処理の16-20時間後に回収し、PBSで1回洗浄し、Lae
mmliバッファー（100 ul/well）に懸濁し、5分間煮沸し、そして、16％SDS-PAGE
ゲルにロードする。ゲルを1.5時間、150 Vで泳動し、そして、ウエスタンブロッ
トのために、メンブレンにトランスファーする。マクロファージ遊走阻害因子に
対する適する第一抗体を、第一抗体の種に対する放射ラベルした、あるいは、蛍
光ラベルした第二抗体とともに使用する。バンドをPHOSPHORIMAGERTM（Molecula
r Dynamics, Sunnyvale CA）を使用して、可視化する。
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】平成１４年９月９日（２００２．９．９）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 5/00 Ａ６１Ｐ 25/00 25/00 29/00 29/00 35/00 35/00 37/00 37/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｎ 5/10 5/00 Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 カウサート，レックス・エム アメリカ合衆国カリフォルニア州92008， カールズバッド，ニューシャイア・ストリ ート 3008 (72)発明者 ワイアット，ジャクリーン・アール アメリカ合衆国カリフォルニア州92024， エンシニタス，ハイメタス・アヴェニュー 1065 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 CA01 CA11 CA20 DA03 GA11 HA17 4B065 AA93X AB01 AC20 BA01 CA44 4C084 AA13 MA17 MA22 MA24 MA28 MA31 MA32 MA35 MA37 MA43 MA52 MA59 MA60 MA63 MA66 NA14 ZA012 ZB012 ZB112 ZB262 ZC032 4C086 AA01 EA16 MA01 MA04 NA14 ZA01 ZB01 ZB11 ZB26 ZC03

Claims (20)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 マクロファージ遊走阻害因子をコードする核酸分子を標的と
    する長さ8〜30の核塩基のアンチセンス化合物であって、マクロファージ遊走阻
    害因子に特異的にハイブリダイズし、そしてその発現を阻害する、前記アンチセ
    ンス化合物。
  2. 【請求項２】 アンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項1に記載の
    アンチセンス化合物。
  3. 【請求項３】 アンチセンスオリゴヌクレオチドがSEQ ID NO: 13、14、15
    、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、29、30、31、32、33、35、36
    、37、38、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55
    、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、73、74
    、75、76、77、83、85または86を含む配列を有する、請求項2に記載のアンチセ
    ンス化合物。
  4. 【請求項４】 アンチセンスオリゴヌクレオチドが少なくとも一つの修飾ヌ
    クレオシド間結合を含む、請求項2に記載のアンチセンス化合物。
  5. 【請求項５】 修飾ヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である、
    請求項4に記載のアンチセンス化合物。
  6. 【請求項６】 アンチセンスオリゴヌクレオチドが、少なくとも一つの修飾
    糖部分を含む、請求項2に記載のアンチセンス化合物。
  7. 【請求項７】 修飾糖部分が2'-O-メトキシエチル糖部分である、請求項6に
    記載のアンチセンス化合物。
  8. 【請求項８】 アンチセンスオリゴヌクレオチドが少なくとも一つの修飾核
    塩基を含む、請求項2に記載のアンチセンス化合物。
  9. 【請求項９】 修飾核塩基が5-メチルシトシンである、請求項8に記載のア
    ンチセンス化合物。
  10. 【請求項１０】 アンチセンスオリゴヌクレオチドがキメラオリゴヌクレオ
    チドである、請求項2に記載のアンチセンス化合物。
  11. 【請求項１１】 請求項1に記載のアンチセンス化合物および医薬的に許容
    可能な担体または希釈剤を含む、組成物。
  12. 【請求項１２】 コロイド分散システムをさらに含む、請求項11に記載の組
    成物。
  13. 【請求項１３】 アンチセンス化合物がアンチセンスオリゴヌクレオチドで
    ある、請求項11に記載の組成物。
  14. 【請求項１４】 細胞または組織においてマクロファージ遊走阻害因子の発
    現を阻害する方法であって、前記細胞または組織と請求項1に記載のアンチセン
    ス化合物とを接触させ、それによりマクロファージ遊走阻害因子の発現を阻害す
    ることを含む、前記方法。
  15. 【請求項１５】 マクロファージ遊走阻害因子と関連する疾患または症状を
    有するヒトを治療する方法であって、前記動物に対して、治療的または予防的有
    効量の請求項1に記載のアンチセンス化合物を投与し、それによりマクロファー
    ジ遊走阻害因子の発現を阻害することを含む、前記方法。
  16. 【請求項１６】 疾患または症状が神経学的障害である、請求項15に記載の
    方法。
  17. 【請求項１７】 疾患または症状がホルモン障害である、請求項15に記載の
    方法。
  18. 【請求項１８】 疾患または症状が免疫障害である、請求項15に記載の方法
    。
  19. 【請求項１９】 疾患または症状が炎症性障害である、請求項15に記載の方
    法。
  20. 【請求項２０】 疾患または症状が過剰増殖性障害である、請求項15に記載
    の方法。
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