DE60019946T2

DE60019946T2 - Antisense-modulation von x-verbundenen inhibitoren der apoptose-expression

Info

Publication number: DE60019946T2
Application number: DE60019946T
Authority: DE
Inventors: Frank C. Bennett; J. Elizabeth ACKERMANN; M. Lex COWSERT
Original assignee: Isis Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Ionis Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1999-09-09
Filing date: 2000-01-11
Publication date: 2006-04-27
Anticipated expiration: 2020-01-12
Also published as: AU2606000A; US6087173A; JP2003508090A; EP1218395B1; ATE294811T1; EP1218395A1; EP1218395A4; WO2001018024A1; DE60019946D1; CA2384456A1

Description

Die vorliegende Erfindung stellt Zusammensetzungen und Verfahren zum Modulieren der Expression des X-verknüpften Inhibitors der Apoptose bereit. Insbesondere betrifft diese Erfindung Antisense-Verbindungen, insbesondere Oligonukleotide, die spezifisch mit Nukleinsäuren hybridisierbar sind, die humanen X-verknüpften Inhibitor der Apoptose kodieren. Es wurde gezeigt, dass solche Oligonukleotide die Expression des X-verknüpften Inhibitors der Apoptose modulieren.
Die Apoptose, oder der programmierte Zelltod, ist ein natürlich vorkommender Prozess, der während der Evolution stark konserviert wurde, um eine unkontrollierte Zellproliferation zu verhindern. Diese Form von Zellsuizid spielt eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung und Aufrechterhaltung mehrzelliger Organismen durch die Beseitigung überflüssiger oder unerwünschter Zellen. Wenn dieser Prozess jedoch nicht funktioniert, führt eine übermäßige Apoptose zu einem Zellverlust und degenerativen Erkrankungen, während eine unzureichende Apoptose zur Entwicklung von Krebs, Autoimmunerkrankungen und viralen Infektionen beiträgt (Thompson, Science, 1995, 267, 1456–1462).
Obwohl mehrere Reize die Apoptose induzieren können, ist über die dazwischen liegenden Signalgebungsereignisse, einschließlich die Inhibierung, wenig bekannt, die das apoptotische Signal mit einem gewöhnlichen Weg des Zelltods verbinden, der über viele Arten hinweg konserviert ist. Kürzlich wurde im Menschen eine Familie von Apoptoseinhibitorproteinen identifiziert, die zu denjenigen, die durch Viren erzeugt werden, homolog sind.
Der X-verknüpfte Inhibitor der Apoptose oder XIAP (auch als hlLP und MIHA bekannt) ist ein Mitglied der Apoptoseinhibitorfamilie (IAP-Familie) anti-apoptotischer Proteine, welche die Übertragung der intrazellulären Zelltodsignale stören. Er wurde als erstes als Regulator der Apoptose unter Verwendung einer mit einer humanen genomischen X-Chromosom-Sequenz markierten Stelle kloniert, um Primer zum Screenen einer humanen Genombibliothek zu erzeugen (Uren et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93, 4974–4978). In diesen Studien wurde der X-verknüpfte Inhibitor der Apoptose als Faktor identifiziert, der die Apoptose inhibieren konnte, die durch die Überexpression von Interleukin 1 beta-umwandelndem Enzym (ICE) oder Caspase-1, einer Protease, die für die Apoptose in Säugern erforderlich ist, verursacht wird (Uren et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93, 4974–4978). Zusätzlich wurde gezeigt, dass die Expression von mRNA des X-verknüpften Inhibitors der Apoptose in der Lunge und im Gehirn am stärksten war (Uren et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93, 4974–4978).
Darüber hinaus wurde gezeigt, dass der X-verknüpfte Inhibitor der Apoptose andere Zelltodproteasen inhibiert, insbesondere die Verarbeitung der pro-Caspasen 3, 6 und 7, und zwar durch die Blockierung der Aktivierung von pro-Caspase 9 (Deveraux et al., Embo J., 1998, 17, 2215–2223; Deveraux et al., Nature, 1997, 388, 300–304; Roy et al., Embo J., 1997 16, 6914–6925).
Ferner wurde gezeigt, dass der X-verknüpfte Inhibitor der Apoptose eine Rolle bei den Signalgebungswegen spielt, die den apoptotischen Signalen, die durch Tumornekrosefaktor alpha (TNFα) während einer Entzündung erzeugt werden, entgegenwirken (Stehlik et al., J. Exp. Med., 1998, 188, 211–216). Es wurde auch gezeigt, dass der X-verknüpfte Inhibitor der Apoptose während der follikulären Entwicklung von ovarialen Granulosazellen und Thecazellen in Ratten reguliert wird, was eine Rolle des X-verknüpften Inhibitors der Apoptose bei der Kontrolle der stufenspezifischen follikulären Atresie nahe legt (Li et al., Endocrinology, 1998, 139, 1321–1328). In der PCT-Veröffentlichung WO 98/22131 sind Verfahren zur Verminderung einer Apoptose in Eierstockzellen durch Verabreichen einer Verbindung beschrieben, welche die biologische Aktivität eines IAP-Polypeptids zur Modulierung der Granulosazellapoptose, die zur follikulären Atresie führt, erhöht (Tsang und Korneluk, 1998).
In jüngerer Zeit wurde gezeigt, dass der X-verknüpfte Inhibitor der Apoptose am Signalgebungsweg von morphogenetischem Knochenprotein (BMP) als positiver Regulator beteiligt ist. Bei diesen Studien wurde gezeigt, dass der X-verknüpfte Inhibitor der Apoptose mit TAB1 in Wechselwirkung tritt, einem Aktivatormolekül für eine MAPKK-Kinase, die als TAK1 bekannt ist (Yamaguchi et al., Embo J., 1999, 18, 179–187).
Die strukturelle Charakterisierung des X-verknüpften Inhibitors der Apoptose zeigte, dass eine einzelne Domäne innerhalb des Proteins für dessen Caspase-Inhibitoreigenschaften verantwortlich ist (Takahashi et al., J. Biol. Chem., 1998, 273, 7787–7790). In der PCT-Veröffentlichung WO 97/06255 sind IAP-Proteine kodierende Nukleinsäuresequenzen, Polypeptide, welche die IAP-Proteine umfassen, die BIR-Domänen enthalten, und transgene Tiere und Zelllinien, welche die Mitglieder der IAP-Familie exprimieren, beschrieben (Korneluk et al., 1997).
Gegenwärtig gibt es keine bekannten Verbindungen, welche die Synthese des X-verknüpften Inhibitors der Apoptose effektiv inhibieren. In den PCT-Veröffentlichungen WO 97/40847 und WO 98/35693 sind jedoch Verfahren zur Inhibierung der biologischen Aktivität von Mitgliedern der IAP-Familie durch Verabreichen einer Verbindung an Zellen, die IAP-Polypeptide oder die Expression der Polypeptide inhibiert, zur Behandlung von neuronalen bzw. proliferativen Erkrankungen beschrieben (Korneluk et al., 1998; Korneluk et al., 1997). Antikörper, Antisense-Oligonukleotide und andere Inhibitoren von IAP's sind ebenfalls beschrieben (Korneluk et al., 1998).
Im Hinblick auf die Rolle, die der X-verknüpfte Inhibitor der Apoptose bei der Inhibierung der Zelltodwege und deren Verbindung mit dem metastatischen Potenzial von Zellen spielt, wird gegenwärtig angenommen, dass Mittel, welche die Funktion des X-verknüpften Inhibitors der Apoptose effektiv inhibieren können, als Therapeutika für Krebs und andere hyperproliferative Erkrankungen dienen könnten.
Zu diesem Zweck wird die Antisense-Technologie mehr und mehr als effektives Mittel zur Verminderung der Expression spezifischer Genprodukte eingesetzt und diese könnte sich daher zur Bereitstellung von Inhibitoren des X-verknüpften Inhibitors der Apoptose für eine Anzahl therapeutischer Anwendungen, diagnostischer Anwendungen und Forschungsanwendungen als hervorragend geeignet erweisen.
Die vorliegende Erfindung betrifft Antisense-Verbindungen, insbesondere Oligonukleotide, die gegen eine Nukleinsäure, die humanen X-verknüpften Inhibitor der Apoptose kodiert, gerichtet sind, und welche die Expression des X-verknüpften Inhibitors der Apoptose modulieren. Pharmazeutische Zusammensetzungen und andere Zusammensetzungen, welche die erfindungsgemäßen Antisense-Verbindungen umfassen, werden ebenfalls bereitgestellt. Ferner werden Verfahren zum Modulieren der Expression des X-verknüpften Inhibitors der Apoptose in Zellen oder Geweben bereitgestellt, die das Inkontaktbringen der Zellen oder Gewebe mit einer oder mehreren erfindungsgemäßen Antisense-Verbindungen) oder -Zusammensetzung(en) umfassen. Es werden ferner Verfahren zur Behandlung eines Tiers, insbesondere eines Menschen, bereitgestellt, von dem vermutet wird, dass es bzw. er eine Erkrankung oder einen Zustand aufweist oder zu einer Erkrankung oder einem Zustand neigt, die bzw. der mit der Expression des X-verknüpften Inhibitors der Apoptose zusammenhängt, und zwar durch Verabreichen einer therapeutisch oder prophylaktisch effektiven Menge einer erfindungsgemäßen oder mehrerer erfindungsgemäßer Antisense-Verbindung(en) oder -Zusammensetzung(en).
In der vorliegenden Erfindung werden oligomere Antisense-Verbindungen, insbesondere Oligonukleotide, zur Verwendung bei der Modulierung der Funktion von Nukleinsäuremolekü len, die den X-verknüpften Inhibitor der Apoptose kodieren, und letztendlich zur Modulierung der Menge des erzeugten X-verknüpften Inhibitors der Apoptose verwendet. Dies wird durch die Bereitstellung von Antisense-Verbindungen erreicht, die spezifisch mit einer oder mehreren Nukleinsäuren hybridisieren, die den X-verknüpften Inhibitor der Apoptose kodieren. Die hier verwendeten Ausdrücke „Zielnukleinsäure" und „Nukleinsäure, die den X-verknüpften Inhibitor der Apoptose kodiert" umfassen DNA, die den X-verknüpften Inhibitor der Apoptose kodiert, RNA (einschließlich prä-mRNA und mRNA), die von einer solchen DNA transkribiert worden ist, und auch cDNA, die von einer solchen DNA abgeleitet ist. Die spezifische Hybridisierung einer oligomeren Verbindung mit ihrer Zielnukleinsäure stört die normale Funktion der Nukleinsäure. Diese Modulierung der Funktion einer Zielnukleinsäure durch Verbindungen, die spezifisch an die Zielnukleinsäure hybridisieren, wird allgemein als „Antisense" bezeichnet. Die Funktionen von DNA, die gestört werden sollen, umfassen die Replikation und die Transkription. Die Funktionen von RNA, die gestört werden sollen, umfassen alle lebenswichtigen Funktionen wie z.B. die Translokation der RNA zu der Stelle der Proteintranslation, die Translation eines Proteins von der RNA, das Spleißen der RNA zur Erzeugung einer oder mehrerer mRNA-Spezies und die katalytische Aktivität, an der die RNA beteiligt ist oder die durch die RNA erleichtert wird. Der Gesamteffekt einer solchen Störung der Zielnukleinsäurefunktion ist die Modulierung der Expression des X-verknüpften Inhibitors der Apoptose. Im Kontext der vorliegenden Erfindung bedeutet „Modulierung" entweder eine Zunahme (Stimulierung) oder eine Abnahme (Inhibierung) der Expression eines Gens. Im Kontext der vorliegenden Erfindung ist die Inhibierung die bevorzugte Form der Modulierung der Genexpression und mRNA ist ein bevorzugtes Ziel.
Es ist bevorzugt, spezifische Nukleinsäuren für Antisense zielgesteuert einzusetzen. Eine „Zielsteuerung" einer Antisense-Verbindung zu einer speziellen Nukleinsäure ist im Kontext dieser Erfindung ein mehrstufiger Prozess. Der Prozess beginnt üblicherweise mit der Identifizierung einer Nukleinsäuresequenz, deren Funktion moduliert werden soll. Diese kann z.B. ein zelluläres Gen (oder von dem Gen transkribierte mRNA) sein, dessen Expression mit einem bestimmten Störungs- oder Krankheitszustand zusammenhängt, oder ein Nukleinsäuremolekül von einem infektiösen Mittel. In der vorliegenden Erfindung ist das Ziel ein Nukleinsäuremolekül, das den X-verknüpften Inhibitor der Apoptose kodiert. Der Zielsteuerungsprozess umfasst auch die Bestimmung einer Stelle oder von Stellen innerhalb dieses Gens für die Antisense-Wechselwirkung, so dass diese derart stattfindet, dass der gewünschte Effekt, z.B. der Nachweis oder die Modulierung der Expression des Proteins, resultiert. Im Kontext der vorliegenden Erfindung ist eine bevorzugte intragenetische Stelle die Region, die das Translationsstart- oder -terminationscodon des offenen Leserasters (ORF) des Gens umfasst. Da das Translationsstartcodon in bekannter Weise typischerweise 5'-AUG (in transkribierten mRNA-Molekülen; 5'-ATG in dem entsprechenden DNA-Molekül) ist, wird das Translationsstartcodon auch als „AUG-Codon", „Startcodon" oder „AUG-Startcodon" bezeichnet. Es wurde gezeigt, dass eine Minderheit von Genen, die ein Translationsstartcodon mit der RNA-Sequenz 5'-GUG, 5'-UUG oder 5'-CUG und 5'-AUA, 5'-ACG und 5'-CUG aufweisen, in vivo funktionieren. Folglich können die Begriffe „Translationsstartcodon" und „Startcodon" viele Codonsequenzen umfassen, obwohl die Start-Aminosäure in jedem Fall typischerweise Methionin (in Eukaryoten) oder Formylmethionin (in Prokaryoten) ist. Es ist auch bekannt, dass eukaryotische und prokaryotische Gene zwei oder mehr alternative Startcodons aufweisen können, von denen ein beliebiges für den Translationsstart in einem bestimmten Zelltyp oder Gewebe oder unter einem bestimmten Satz von Bedingungen vorzugsweise verwendet werden kann. Im Kontext der Erfindung beziehen sich „Startcodon" und „Translationsstartcodon" auf das Codon oder die Codons, das bzw. die in vivo zum Starten der Translation eines mRNA-Moleküls verwendet wird bzw. werden, das von einem Gen transkribiert worden ist, das den X-verknüpften Inhibitor der Apoptose kodiert, und zwar ungeachtet der Sequenzen) solcher Codons.
Es ist auch bekannt, dass ein Translationsterminationscodon (oder „Stopcodon") eines Gens eine von drei Sequenzen aufweisen kann, d.h. 5'-UAA, 5'-UAG und 5'-UGA (die entsprechenden DNA-Sequenzen sind 5'-TAA, 5'-TAG bzw. 5'-TGA). Die Begriffe „Startcodonregion" und „Translationsstartcodonregion" beziehen sich auf einen Abschnitt einer solchen mRNA oder eines solchen Gens, der etwa 25 bis etwa 50 angrenzende Nukleotide in jeder Richtung (d.h. 5' oder 3') ausgehend von einem Translationsstartcodon umfasst. Entsprechend beziehen sich die Begriffe „Stopcodonregion" und „Translationsterminationscodonregion" auf einen Abschnitt einer solchen mRNA oder eines solchen Gens, der etwa 25 bis etwa 50 angrenzende Nukleotide in jeder Richtung (d.h. 5' oder 3') ausgehend von einem Translationsterminationscodon umfasst.
Das offene Leseraster (ORF) oder die „codierende Region", das bzw. die sich bekanntermaßen auf die Region zwischen dem Translationsstartcodon und dem Translationsterminationscodon bezieht, ist ebenfalls eine Region, die effektiv durch eine Zielsteuerung erreicht werden kann. Andere Zielregionen umfassen die 5'-nichttranslatierte Region (5'UTR), von der bekannt ist, dass sie sich auf den Abschnitt einer mRNA in der 5'-Richtung von dem Translationsstartcodon bezieht und folglich Nukleotide zwischen der 5'-Cap-Stelle und dem Translationsstartcodon einer mRNA oder entsprechenden Nukleotiden auf dem Gen umfasst, und die 3'-nichttranslatierte Region (3'UTR), von der bekannt ist, dass sie sich auf den Abschnitt einer mRNA in der 3'-Richtung von dem Translationsterminationscodon bezieht und folglich Nukleotide zwischen dem Translationsterminationscodon und dem 3'-Ende einer mRNA oder entsprechenden Nukleotiden auf dem Gen umfasst. Die 5'-Cap einer mRNA umfasst einen N7-methylierten Guanosinrest, der mit dem am nächsten am 5'-Ende liegenden Rest der mRNA mittels einer 5'-5'-Triphosphatverknüpfung verbunden ist. Es wird angenommen, dass die 5'-Cap-Region einer mRNA sowohl die 5'-Cap-Struktur selbst als auch die ersten 50 Nukleotide angrenzend an die Cap umfasst. Die 5'-Cap-Region kann auch eine bevorzugte Zielregion sein.
Obwohl einige eukaryotische mRNA-Transkripte direkt translatiert werden, enthalten viele eine oder mehrere Regionen, die als „Introns" bekannt sind und vor der Translation eines Transkripts beseitigt werden. Die verbleibenden (und daher translatierten) Regionen sind als „Exons" bekannt und werden zur Bildung einer kontinuierlichen mRNA-Sequenz zusammengespleißt. mRNA-Spleißstellen, d.h. Intron-Exon-Verbindungen, können ebenfalls bevorzugte Zielbereiche sein und sind insbesondere in Situationen geeignet, bei denen bei der Erkrankung ein anomales Spleißen vorliegt, oder wenn bei einer Erkrankung eine Überproduktion eines bestimmten mRNA-Spleißprodukts vorliegt. Anomale Verschmelzungsverbindungen aufgrund von Umlagerungen oder Deletionen sind ebenfalls bevorzugte Ziele. Es wurde auch gefunden, dass Introns ebenfalls effektive und daher bevorzugte Zielregionen für Antisense-Verbindungen sein können, die z.B. zu DNA oder prä-mRNA zielgesteuert werden.
Sobald eine oder mehrere Zielstellen identifiziert worden ist bzw. sind, werden Oligonukleotide ausgewählt, die zu dem Ziel ausreichend komplementär sind, d.h. die ausreichend gut und mit einer ausreichenden Spezifität hybridisieren, um den gewünschten Effekt zu erhalten.
Im Kontext dieser Erfindung bedeutet „Hybridisierung" eine Wasserstoffbrückenbindung, bei der es sich um eine Watson-Crick-, Hoogsteen- oder umgekehrte Hoogsteen-Wasserstoffbrückenbindung handeln kann, zwischen komplementären Nukleosid- oder Nukleotidbasen. Beispielsweise sind Adenin und Thymin komplementäre Nukleobasen, die sich durch die Bildung von Wasserstoffbrückenbindungen paaren. Der hier verwendete Begriff „komplementär" bezieht sich auf das Vermögen zu einer präzisen Paarung zwischen zwei Nukleotiden. Wenn beispielsweise ein Nukleotid an einer bestimmten Position eines Oligonukleotids eine Wasserstoffbrückenbindung mit einem Nukleotid an der gleichen Position eines DNA- oder RNA-Moleküls bilden kann, dann werden das Oligonukleotid und die DNA oder RNA an dieser Position als zueinander komplementär erachtet. Das Oligonukleotid und die DNA oder die RNA sind komplementär zueinander, wenn eine ausreichende Anzahl entsprechender Positionen in jedem Molekül von Nukleotiden besetzt sind, die miteinander eine Wasserstoffbrückenbindung bilden können. Folglich sind „spezifisch hybridisierbar" und „komplementär" Begriffe, die verwendet werden, um ein ausreichendes Maß an Komplementarität oder präziser Paarung anzugeben, so dass zwischen dem Oligonukleotid und dem DNA- oder RNA-Ziel eine stabile und spezifische Bindung stattfindet. Es ist bekannt, dass die Sequenz einer Antisense-Verbindung nicht zu 100 % zu der Sequenz ihrer Zielnukleinsäure komplementär sein muss, um spezifisch hybridisierbar zu sein. Eine Antisense-Verbindung ist spezifisch hybridisierbar, wenn das Binden der Verbindung an das Ziel-DNA- oder -RNA-Molekül die normale Funktion der Ziel-DNA oder -RNA stört, so dass ein Verlust des Nutzens verursacht wird, und wenn ein Komplementaritätsgrad vorliegt, der ausreichend ist, um ein unspezifisches Binden der Antisense-Verbindung an nicht-Ziel-Sequenzen unter Bedingungen zu vermeiden, bei denen ein spezifisches Binden erwünscht ist, d.h. unter physiologischen Bedingungen im Fall von in vivo-Tests oder einer therapeutischen Behandlung, und im Fall von in vitro-Tests unter den Bedingungen, bei denen die Tests durchgeführt werden.
Antisense-Verbindungen werden gewöhnlich als Forschungsreagenzien und als Diagnostika verwendet. Beispielsweise werden Antisense-Oligonukleotide, welche die Genexpression mit einer hervorragenden Spezifität inhibieren können, vom Fachmann häufig zur Ermittlung der Funktion bestimmter Gene verwendet. Antisense-Verbindungen werden auch z.B. zur Unterscheidung zwischen den Funktionen verschiedener Elemente eines biologischen Stoffwechselwegs verwendet. Eine Antisense-Modulierung wurde daher für Forschungszwecke genutzt.
Die Spezifität und Empfindlichkeit von Antisense wird vom Fachmann auch für therapeutische Anwendungen genutzt. Antisense-Oligonukleotide wurden als therapeutische Elemente bei der Behandlung von Krankheitszuständen bei Tieren und Menschen verwendet. Antisense-Oligonukleotide wurden sicher und effektiv an Menschen verabreicht und gegenwärtig werden zahlreiche klinische Versuche durchgeführt. Es ist somit anerkannt, dass Oligonukleotide nützliche therapeutische Mittel sein können, die so konfiguriert werden können, dass sie in Behandlungsschemata für die Behandlung von Zellen, Geweben und Tieren, insbesondere Menschen, nützlich sind.
Im Kontext dieser Erfindung bezieht sich der Begriff „Oligonukleotid" auf ein Oligomer oder Polymer von Ribonukleinsäure (RNA) oder Desoxyribonukleinsäure (DNA) oder Mimetika davon. Dieser Begriff umfasst Oligonukleotide, die aus natürlich vorkommenden Nukleobasen, Zuckern und kovalenten Internukleosidverknüpfungen (Grundgerüstverknüpfungen) zusammengesetzt sind, sowie Oligonukleotide, die nicht-natürlich vorkommende Abschnitte aufweisen, die entsprechend wirken. Solche modifizierten oder substituierten Oligonukleotide werden gegenüber den natürlichen Formen aufgrund bevorzugter Eigenschaften, wie z.B. einer verstärkten zellulären Aufnahme, einer erhöhten Affinität für ein Nukleinsäureziel und einer erhöhten Stabilität in der Gegenwart von Nukleasen häufig bevorzugt.
Während Antisense-Oligonukleotide eine bevorzugte Form von Antisense-Verbindungen sind, umfasst die vorliegende Erfindung auch andere oligomere Antisense-Verbindungen, einschließlich unter anderem Oligonukleotid-Mimetika, wie sie nachstehend beschrieben sind. Die erfindungsgemäßen Antisense-Verbindungen umfassen vorzugsweise etwa 8 bis etwa 30 Nukleobasen (d.h. etwa 8 bis etwa 30 verknüpfte Nukleoside). Besonders bevorzugte Antisense-Verbindungen sind Antisense-Oligonukleotide, mehr bevorzugt diejenigen, die etwa 12 bis etwa 25 Nukleobasen umfassen. Es ist bekannt, dass ein Nukleosid eine Base-Zucker-Kombination ist. Der Basenteil des Nukleosids ist gewöhnlich eine heterocyclische Base. Die beiden am meisten verbreiteten Klassen solcher heterocyclischer Basen sind die Purine und die Pyrimidine. Nukleotide sind Nukleoside, die ferner eine Phosphatgruppe umfassen, die kovalent an den Zuckerteil des Nukleosids gebunden ist. Für diejenigen Nukleoside, die einen Pentofuranosylzucker umfassen, kann die Phosphatgruppe an die 2'-, 3'- oder 5'-Hydroxylgruppe des Zuckers gebunden sein. Bei der Bildung von Oligonukleotiden verknüpfen die Phosphatgruppen angrenzende Nukleoside miteinander kovalent unter Bildung einer linearen polymeren Verbindung. Die jeweiligen Enden dieser linearen polymeren Struktur können wiederum weiter unter Bildung einer cyclischen Struktur verknüpft werden, wobei jedoch offene lineare Strukturen im Allgemeinen bevorzugt sind. Innerhalb der Oligonukleotidstruktur werden die Phosphatgruppen gewöhnlich so betrachtet, dass sie das Internukleosidgrundgerüst des Oligonukleotids bilden. Die normale Verknüpfung oder das normale Grundgerüst von RNA und DNA ist eine 3'-5'-Phosphodiesterverknüpfung.
Spezielle Beispiele bevorzugter Antisense-Verbindungen, die in dieser Erfindung geeignet sind, umfassen Oligonukleotide, die modifizierte Grundgerüste oder nicht-natürliche Internukleosidverknüpfungen enthalten. Gemäß der Definition in dieser Beschreibung umfassen Oligonukleotide mit modifizierten Grundgerüsten diejenigen, die ein Phosphoratom im Grundgerüst aufweisen und diejenigen, die kein Phosphoratom im Grundgerüst aufweisen. Für die Zwecke dieser Beschreibung und wie es manchmal in dem Fachgebiet üblich ist, können modifizierte Oligonukleotide, die kein Phosphoratom in ihrem Internukleosidgrundgerüst aufweisen, ebenfalls als Oligonukleoside betrachtet werden.
Bevorzugte modifizierte Oligonukleotidgrundgerüste umfassen z.B. Phosphorothioate, chirale Phosphorothioate, Phosphorodithioate, Phosphotriester, Aminoalkylphosphotriester, Methyl- und andere Alkylphosphonate, einschließlich 3'-Alkylenphosphonate und chirale Phosphonate, Phosphinate, Phosphoramidate, einschließlich 3'-Aminophosphoramidat und Aminoal kylphosphoramidate, Thionophosphoramidate, Thionoalkylphosphonate, Thionoalkylphosphotriester und Boranophosphate mit normalen 3'-5'-Verknüpfungen, 2'-5'-verknüpfte Analoga davon und solche mit einer invertierten Polarität, bei denen die angrenzenden Paare von Nukleosideinheiten 3'-5' zu 5'-3'oder 2'-5' zu 5'-2' verknüpft sind. Es sind auch verschiedene Salze, gemischte Salze und freie Säureformen umfasst.
Repräsentative US-Patente, welche die Herstellung der vorstehend genannten Phosphorenthaltenden Verknüpfungen lehren, umfassen unter anderem US 3,687,808 ; 4,469,863; 4,476,301; 5,023,243; 5,177,196; 5,188,897; 5,264,423; 5,276,019; 5,278,302; 5,286,717; 5,321,131; 5,399,676; 5,405,939; 5,453,496; 5,455,233; 5,466,677; 5,476,925; 5,519,126; 5,536,821; 5,541,306; 5,550,111; 5,563,253; 5,571,799; 5,587,361 und 5,625,050, von denen einige dem Inhaber dieser Anmeldung gehören, wobei jedes dieser US-Patente unter Bezugnahme einbezogen wird.
Bevorzugte modifizierte Oligonukleotidgrundgerüste, die kein Phosphoratom umfassen, weisen Grundgerüste auf, die durch kurzkettige Alkyl- oder Cycloalkyl-Internukleosidverknüpfungen, gemischte Heteroatom- und Alkyl- oder Cycloalkyl-Internukleosidverknüpfungen oder durch eine oder mehrere kurzkettige Heteroatom- oder heterocyclische Internukleosidverknüpfungen gebildet werden. Diese umfassen diejenigen, die Morpholino-Verknüpfungen (die zum Teil aus dem Zuckerteil eines Nukleosids gebildet werden); Siloxan-Grundgerüste, Sulfid-, Sulfoxid- und Sulfon-Grundgerüste, Formacetyl- und Thioformacetyl-Grundgerüste, Methylenformacetyl- und Thioformacetyl-Grundgerüste, Alkenenthaltende Grundgerüste, Sulfamat-Grundgerüste, Methylenimino- und Methylenhydrazino-Grundgerüste, Sulfonat- und Sulfonamid-Grundgerüste, Amid-Grundgerüste und andere Grundgerüste mit gemischten N-, O-, S- und CH₂-Komponententeilen aufweisen.
Repräsentative US-Patente, welche die Herstellung der vorstehend genannten Oligonukleoside lehren, umfassen unter anderem US 5,034,506 ; 5,166,315; 5,185,444; 5,214,134; 5,216,141; 5,235,033; 5,264,562; 5,264,564; 5,405,938; 5,434,257; 5,466,677; 5,470,967; 5,489,677; 5,541,307; 5,561,225; 5,596,086; 5,602,240; 5,610,289; 5,602,240; 5,608,046; 5,610,289; 5,618,704; 5,623,070; 5,663,312; 5,633,360; 5,677,437 und 5,677,439, von denen einige dem Inhaber dieser Anmeldung gehören, wobei jedes dieser US-Patente unter Bezugnahme einbezogen wird.
In anderen bevorzugten Oligonukleotidmimetika werden sowohl der Zucker als auch die Internukleosidverknüpfung, d.h. das Grundgerüst, der Nukleotideinheiten durch neue Gruppen ersetzt. Die Baseneinheiten werden zur Hybridisierung mit einer geeigneten Nukleinsäure zielverbindung beibehalten. Eine solche oligomere Verbindung, ein Oligonukleotidmimetikum, von dem gezeigt wurde, dass es hervorragende Hybridisierungseigenschaften aufweist, wird als Peptidnukleinsäure (PNA) bezeichnet. In PNA-Verbindungen ist das Zuckergrundgerüst eines Oligonukleotids durch ein Amid-enthaltendes Grundgerüst, insbesondere durch ein Aminoethylglycingrundgerüst, ersetzt. Die Nukleobasen werden beibehalten und direkt oder indirekt an Aza-Stickstoffatome des Amidteils des Grundgerüsts gebunden. Repräsentative US-Patente, welche die Herstellung von PNA-Verbindungen lehren, umfassen unter anderem US 5,539,082 ; 5,714,331 und 5,719,262, wobei jedes dieser US-Patente unter Bezugnahme einbezogen wird. Weitere Informationen bezüglich PNA-Verbindungen finden sich in Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497–1500.
Die am meisten bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung sind Oligonukleotide mit Phosphorothioat-Grundgerüsten und Oligonukleoside mit Heteroatom-Grundgerüsten, und insbesondere -CH₂-NH-O-CH₂-, -CH₂-N(CH₃)-O-CH₂- [als Methylen(methylimino) oder MMI-Grundgerüst bekannt], -CH₂-O-N(CH₃)-CH₂-, -CH₂-N(CH₃)-N(CH₃)-CH₂- und -O-N(CH₃)-CH₂-CH₂- [wobei das native Phosphodiester-Grundgerüst als -O-P-O-CH₂- dargestellt wird] des vorstehend genannten US-Patents 5,489,677, und die Amid-Grundgerüste des vorstehend genannten US-Patents 5,602,240. Es sind auch Oligonukleotide bevorzugt, welche die Morpholino-Grundgerüststrukturen des vorstehend genannten US-Patents 5,034,506 aufweisen.
Modifizierte Oligonukleotide können auch einen oder mehrere substituierte Zuckerrest(e) aufweisen. Bevorzugte Oligonukleotide umfassen einen der folgenden Reste an der 2'-Position: OH, F, O-, S- oder N-Alkyl, O-, S- oder N-Alkenyl, O-, S- oder N-Alkinyl, oder O-Alkyl-O-alkyl, wobei das Alkyl, Alkenyl und Alkinyl substituiertes oder unsubstituiertes C₁- bis C₁₀-Alkyl oder C₂- bis C₁₀-Alkenyl und Alkinyl sein kann. Besonders bevorzugt sind O[(CH₂)_nO]_mCH₃, O(CH₂)_nOCN₃, O(CH₂)_nNH₂, O(CH₂)_nCH₃, O(CH₂)_nONH₂ und O(CH₂)_nON[(CH₂)_nCH₃)]₂, wobei n und m einen Wert von 1 bis etwa 10 haben. Andere bevorzugte Oligonukleotide umfassen einen der folgenden Reste an der 2'-Position: C₁- bis C₁₀-Niederalkyl, substituiertes Niederalkyl, Alkaryl, Aralkyl, O-Alkaryl oder O-Aralkyl, SH, SCH₃, OCN, Cl, Br, CN, CF₃, OCF₃, SOCH₃, SO₂CH₃, ONO₂, NO₂, N₃, NH₂, Heterocycloalkyl, Heterocycloalkaryl, Aminoalkylamino, Polyalkylamino, substituiertes Silyl, eine RNA-spaltende Gruppe, eine Reportergruppe, ein Interkalator, eine Gruppe zur Verbesserung der pharmakokinetischen Eigenschaften eines Oligonukleotids oder eine Gruppe zur Verbesserung der pharmakodynamischen Eigenschaften eines Oligonukleotids, und andere Substituenten mit ähnlichen Eigenschaften. Eine bevorzugte Modifizierung umfasst 2'-Methoxyethoxy (2'-O-CH₂CH₂OCH₃, auch als 2'-O-(2-Methoxyethyl) oder 2'-MOE bekannt) (Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486–504), d.h. eine Alkoxyalkoxygruppe. Eine weitere bevorzugte Modifizierung umfasst 2'-Dimethylaminooxyethoxy, d.h. eine O(CH₂)₂ON(CH₃)₂-Gruppe, die auch als 2'-DMAOE bekannt und in den nachstehenden Beispielen beschrieben ist, und 2'-Dimethylaminoethoxyethoxy (auch als 2'-O-Dimethylaminoethoxyethyl oder 2'-DMAEOE bekannt), d.h. 2'-O-CH₂-O-CH₂-N(CH₂)₂, die ebenfalls in den nachstehenden Beispielen beschrieben ist.
Andere bevorzugte Modifizierungen umfassen 2'-Methoxy (2'-O-CH₃), 2'-Aminopropoxy (2'-OCH₂CH₂CH₂NH₂) und 2'-Fluor (2'-F). Ähnliche Modifizierungen können auch an anderen Positionen an dem Oligonukleotid durchgeführt werden, insbesondere an der 3'-Position des Zuckers am 3'-terminalen Nukleotid oder in 2'-5'-verknüpften Oligonukleotiden und der 5'-Position eines 5'-terminalen Nukleotids. Oligonukleotide können anstelle des Pentafuranosylzuckers auch Zuckermimetika wie z.B. Cyclobutylreste aufweisen. Repräsentative US-Patente, welche die Herstellung solcher modifizierten Zuckerstrukturen lehren, umfassen unter anderem US 4,981,957 ; 5,118,800; 5,319,080; 5,359,044; 5,393,878; 5,446,137; 5,466,786; 5,514,785; 5,519,134; 5,567,811; 5,576,427; 5,591,722; 5,597,909; 5,610,300; 5,627,053; 5,639,873; 5,646,265; 5,658,873; 5,670,633 und 5,700,920, von denen einige dem Inhaber dieser Anmeldung gehören, wobei jedes dieser US-Patente in seiner Gesamtheit unter Bezugnahme einbezogen wird.
Oligonukleotide können auch Nukleobase- (in dem Fachgebiet häufig als „Base" bezeichnet) -modifizierungen oder -substitutionen umfassen. Die hier verwendeten Begriffe „unmodifizierte" oder „natürliche" Nukleobasen umfassen die Purinbasen Adenin (A) und Guanin (G) und die Pyrimidinbasen Thymin (T), Cytosin (C) und Uracil (U). Modifizierte Nukleobasen umfassen andere synthetische und natürliche Nukleobasen wie z.B. 5-Methylcytosin (5-me-C), 5-Hydroxymethylcytosin, Xanthin, Hypoxanthin, 2-Aminoadenin, 6-Methyl- und andere Alkylderivate von Adenin und Guanin, 2-Propyl- und andere Alkylderivate von Adenin und Guanin, 2-Thiouracil, 2-Thiothymin und 2-Thiocytosin, 5-Halogenuracil und -cytosin, 5-Propinyluracil und -cytosin, 6-Azouracil, -cytosin und -thymin, 5-Uracil (Pseudouracil), 4-Thiouracil, 8-Halogen-, 8-Amino-, 8-Thiol-, 8-Thioalkyl-, 8-Hydroxyl- und andere 8-substituierte Adenine und Guanine, 5-Halogen-, insbesondere 5-Brom-, 5-Trifluormethyl- und andere 5-substituierte Uracile und Cytosine, 7-Methylguanin und 7-Methyladenin, 8-Azaguanin und 8-Azaadenin, 7-Desazaguanin und 7-Desazaadenin und 3-Desazaguanin und 3-Desazaadenin. Weitere Nukleobasen umfassen diejenigen, die im US-Patent 3,687,808 beschrieben sind, diejenigen, die in The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, Seiten 858–859, J.I. Kroschwitz, Hrsg., John Wiley & Sons, 1990, beschrieben sind, diejenigen, die von Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613, beschrieben worden sind, und diejenigen, die von Y.S. Sanghvi, Kapitel 15, Antisense Research and Applications, Seiten 289–302, S.T. Crooke und B. Lebleu, Hrsg., CRC Press, 1993, beschrieben worden sind. Bestimmte dieser Nukleobasen sind zur Erhöhung der Bindungsaffinität der oligomeren Verbindungen der Erfindung besonders gut geeignet. Diese umfassen 5-substituierte Pyrimidine, 6-Azapyrimidine und N-2-, N-6- und O-6-substituierte Purine, einschließlich 2-Aminopropyladenin, 5-Propinyluracil und 5-Propinylcytosin. Es wurde gezeigt, dass 5-Methylcytosin-Substitutionen die Nukleinsäureduplexstabilität um 0,6 bis 1,2°C erhöhen (Y.S. Sanghvi, S.T. Crooke und B. Lebleu, Hrsg., Antisense Research and Applications, Seiten 289–302, CRC Press, Boca Raton, 1993, Seiten 276–278), wobei es sich um die gegenwärtig bevorzugten Basensubstitutionen handelt, und zwar insbesondere dann, wenn sie mit 2'-O-Methoxyethyl-Zuckermodifizierungen kombiniert werden.
Repräsentative US-Patente, welche die Herstellung von bestimmten der vorstehend angegebenen modifizierten Nukleobasen sowie von anderen modifizierten Nukleobasen lehren, umfassen unter anderem das vorstehend angegebene US-Patent 3,687,808 sowie die US 4,845,205 ; 5,130,302; 5,134,066; 5,175,273; 5,367,066; 5,432,272; 5,457,187; 5,459,255; 5,484,908; 5,502,177; 5,525,711; 5,552,540; 5,587,469; 5,594,121, 5,596,091; 5,614,617 und 5,681,941, von denen einige dem Inhaber dieser Anmeldung gehören, wobei jedes dieser US-Patente unter Bezugnahme einbezogen wird, und das US-Patent 5,750,692, das dem Inhaber dieser Anmeldung gehört und ebenfalls unter Bezugnahme einbezogen wird.
Eine weitere Modifizierung der Oligonukleotide der Erfindung umfasst die chemische Verknüpfung eines Rests oder mehrerer Reste oder Konjugate, welche die Aktivität, die zelluläre Verteilung oder die zelluläre Aufnahme des Oligonukleotids verstärken, mit dem Oligonukleotid. Solche Reste umfassen unter anderem Lipidreste, wie z.B. einen Cholesterinrest (Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553–6556), Cholsäure (Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1994, 4, 1053–1060), einen Thioether, z.B. Hexyl-S-tritylthiol (Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660, 306–309; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765–2770), ein Thiocholesterin (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533–538), eine aliphatische Kette, z.B. Dodecandiol- oder Undecylreste (Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10, 1111–1118; Kabanovet al., FEBS Lett., 1990, 259, 327–330; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75, 49–54), ein Phospholipid, z.B. Dihexadecylrac-glycerin oder Triethylammonium-1,2-di-O-hexadecyl-rac-glycero-3-H-phosphonat (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651–3654; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777–3783), eine Polyamin- oder eine Polyethylenglykolkette (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969–973), oder Adamantanessigsäure (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651–3654), einen Palmitylrest (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229–237), oder einen Octadecylamin- oder Hexylaminocarbonyloxycholesterinrest (Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277, 923–937).
Repräsentative US-Patente, welche die Herstellung solcher Oligonukleotidkonjugate lehren, umfassen unter anderem US 4,828,979 ; 4,948,882; 5,218,105; 5,525,465; 5,541,313; 5,545,730; 5,552,538; 5,578,717, 5,580,731; 5,591,584; 5,109,124; 5,118,802; 5,138,045; 5,414,077; 5,486,603; 5,512,439; 5,578,718; 5,608,046; 4,587,044; 4,605,735; 4,667,025; 4,762,779; 4,789,737; 4,824,941; 4,835,263; 4,876,335; 4,904,582; 4,958,013; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,245,022; 5,254,469; 5,258,506; 5,262,536; 5,272,250; 5,292,873; 5,317,098; 5,371,241, 5,391,723; 5,416,203, 5,451,463; 5,510,475; 5,512,667; 5,514,785; 5,565,552; 5,567,810; 5,574,142; 5,585,481; 5,587,371; 5,595,726; 5,597,696; 5,599,923; 5,599,928 und 5,688,941, von denen einige dem Inhaber dieser Anmeldung gehören, wobei jedes dieser US-Patente unter Bezugnahme einbezogen wird.
Es ist nicht erforderlich, dass alle Positionen in einer gegebenen Verbindung einheitlich modifiziert sein müssen und tatsächlich kann in eine einzelne Verbindung oder sogar an einem einzelnen Nukleosid innerhalb eines Oligonukleotids mehr als eine der vorstehend genannten Modifizierungen einbezogen werden. Die vorliegende Erfindung umfasst auch Antisense-Verbindungen, bei denen es sich um chimäre Verbindungen handelt. „Chimäre" Antisense-Verbindungen oder „Chimären" sind im Kontext dieser Erfindung Antisense-Verbindungen, insbesondere Oligonukleotide, die zwei oder mehr chemisch unterschiedliche Regionen enthalten, die jeweils aus mindestens einer Monomereinheit, d.h. einem Nukleotid im Fall einer Oligonukleotidverbindung, aufgebaut sind. Diese Oligonukleotide enthalten typischerweise mindestens eine Region, in der das Oligonukleotid modifiziert ist, so dass dem Oligonukleotid eine erhöhte Beständigkeit gegen einen Nukleaseabbau, eine erhöhte zelluläre Aufnahme und/oder eine erhöhte Bindungsaffinität für die Zielnukleinsäure verliehen wird. Eine zusätzliche Region des Oligonukleotids kann als Substrat für Enzyme dienen, die RNA:DNA- oder RNA:DNA-Hybride spalten können. Beispielsweise ist RNase H eine zelluläre Endonuklease, die den RNA-Strang eines RNA:DNA-Duplex spaltet. Die Aktivierung von RNase H führt daher zu einer Spaltung des RNA-Ziels, wodurch die Effizienz der Oligonukleotidinhibierung der Genexpression stark erhöht wird. Folglich können vergleichbare Ergebnisse verglichen mit Phosphorothioatdesoxyoligonukleotiden, die an den gleichen Zielbereich hybridisieren, häufig mit kürzeren Oligonukleotiden erhalten werden, wenn chimäre Oligonukleotide verwendet werden. Die Spaltung des RNA-Targets kann routinemäßig mit einer Gelelektrophorese und gegebenenfalls mit dazugehörigen Nukleinsäurehybridisierungstechniken, die bekannt sind, nachgewiesen werden.
Erfindungsgemäße chimäre Antisense-Verbindungen können als Mischstruktur aus zwei oder mehr Oligonukleotiden, modifizierten Oligonukleotiden, Oligonukleosiden und/oder Oligonukieotidmimetika, die vorstehend beschrieben worden sind, gebildet werden. Solche Verbindungen werden in dem Fachgebiet auch als Hybride oder Gapmere bezeichnet. Repräsentative US-Patente, welche die Herstellung solcher Hybridstrukturen lehren, umfassen unter anderem US 5,013,830 ; 5,149,797; 5,220,007; 5,256,775; 5,366,878; 5,403,711; 5,491,133; 5,565,350; 5,623,065; 5,652,355; 5,652,356 und 5,700,922, von denen einige dem Inhaber dieser Anmeldung gehören, wobei jedes dieser US-Patente in seiner Gesamtheit unter Bezugnahme einbezogen wird.
Die erfindungsgemäß verwendeten Antisense-Verbindungen können zweckmäßig und routinemäßig mit bekannten Festphasensynthesetechniken hergestellt werden. Die Geräte für eine solche Synthese werden von mehreren Unternehmen verkauft, wie z.B. von Applied Biosystems (Foster City, CA). Jedwede andere bekannte Mittel für eine solche Synthese können zusätzlich oder alternativ eingesetzt werden. Es ist bekannt, entsprechende Techniken zur Herstellung von Oligonukleotiden wie z.B. der Phosphorothioate und der alkylierten Derivate zu verwenden.
Die erfindungsgemäßen Antisense-Verbindungen werden in vitro synthetisiert und umfassen keine Antisense-Zusammensetzungen biologischen Ursprungs oder genetische Vektorkonstrukte, die so gestaltet sind, dass sie die in vivo-Synthese von Antisense-Molekülen steuern.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können auch mit anderen Molekülen, Molekülstrukturen oder Gemischen von Verbindungen, wie z.B. Liposomen, auf einen Rezeptor gerichteten Molekülen, oralen, rektalen, topischen oder anderen Formulierungen zur Unterstützung bei der Aufnahme, der Verteilung und/oder Absorption gemischt, eingekapselt, konjugiert oder in anderer Weise assoziiert werden. Repräsentative US-Patente, welche die Herstellung solcher die Aufnahme, Verteilung und/oder Absorption unterstützender Formulierungen lehren, umfassen unter anderem US 5,108,921 ; 5,354,844; 5,416,016; 5,459,127; 5,521,291; 5,543,158; 5,547,932; 5,583,020; 5,591,721; 4,426,330; 4,534,899; 5,013,556; 5,108,921; 5,213,804; 5,227,170; 5,264,221; 5,356,633; 5,395,619; 5,416,016; 5,417,978; 5,462,854; 5,469,854; 5,512,295; 5,527,528; 5,534,259; 5,543,152; 5,556,948; 5,580,575 und 5,595,756, wobei jedes dieser US-Patente unter Bezugnahme einbezogen wird.
Die erfindungsgemäßen Antisense-Verbindungen umfassen jedwede pharmazeutisch verträgliche Salze, Ester oder Salze solcher Ester, oder jedwede andere Verbindung, die beim Verabreichen an ein Tier, einschließlich einen Menschen, den biologisch aktiven Metaboliten oder dessen Rest (direkt oder indirekt) bereitstellen können. Demgemäß umfasst die Offenbarung auch Prodrugs und pharmazeutisch verträgliche Salze der erfindungsgemäßen Verbindungen, pharmazeutisch verträgliche Salze solcher Prodrugs und andere Bioäquivalente.
Der Begriff „Prodrug" steht für ein therapeutisches Mittel, das in einer inaktiven Form hergestellt wird, die innerhalb des Körpers oder innerhalb von Körperzellen durch die Einwirkung endogener Enzyme oder anderer Chemikalien und/oder Zustände in eine aktive Form (d.h. den Arzneistoff) umgewandelt wird. Insbesondere werden Prodrug-Versionen der erfindungsgemäßen Oligonukleotide als SATE-Derivate [(S-Acetyl-2-thioethyl)phosphat-Derivate] gemäß den in WO 93/24510 (Gosselin et al., veröffentlicht am 9. Dezember 1993) oder WO 94/26764 (Imbach et al.) beschriebenen Verfahren hergestellt.
Der Ausdruck „pharmazeutisch verträgliche Salze" bezieht sich auf physiologisch und pharmazeutisch verträgliche Salze der erfindungsgemäßen Verbindungen, d.h. auf Salze, weiche die gewünschte biologische Aktivität der Stammverbindung bewahren und dieser keine unerwünschten toxikologischen Effekte verleihen.
Mit Metallen oder Aminen, wie z.B. Alkali- und Erdalkalimetallen oder organischen Aminen, werden pharmazeutisch verträgliche Baseadditionssalze gebildet. Beispiele für Metalle, die als Kationen verwendet werden, sind Natrium, Kalium, Magnesium, Calcium und dergleichen. Beispiele für geeignete Amine sind N,N'-Dibenzylethylendiamin, Chlorprocain, Cholin, Diethanolamin, Dicyclohexylamin, Ethylendiamin, N-Methylglucamin und Procain (vgl. z.B. Berge et al., „Pharmaceutical Salts", J. of Pharma Sci., 1977, 66, 1–19). Die Baseadditionssalze der sauren Verbindungen werden durch Inkontaktbringen der freien Säureform mit einer ausreichenden Menge der gewünschten Base zur Erzeugung des Salzes in der herkömmlichen Weise hergestellt. Die freie Säureform kann durch Inkontaktbringen der Salzform mit einer Säure und Isolieren der freien Säure in der herkömmlichen Weise regeneriert werden. Die freien Säureformen unterscheiden sich von ihren jeweiligen Salzformen etwas bezüglich bestimmter physikalischer Eigenschaften wie z.B. der Löslichkeit in polaren Lösungsmitteln, jedoch sind die Salze für die Zwecke der vorliegenden Erfindung ansonsten zu der jeweiligen freien Säure äquivalent. Der hier verwendete Ausdruck „pharmazeutisches Additionssalz" umfasst ein pharmazeutisch verträgliches Salz einer Säureform einer der Komponenten der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen. Diese umfassen organische oder anorganische Säuresalze der Amine. Bevorzugte Säuresalze sind die Hydrochloride, Acetate, Salicylate, Nitrate und Phosphate. Andere geeignete pharmazeutisch verträgliche Salze sind dem Fachmann bekannt und umfassen basische Salze verschiedener anorgani scher und organischer Säuren, wie z.B. mit anorganischen Säuren wie z.B. Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure oder Phosphorsäure, mit organischen Carbon-, Sulfon-, Sulfo- oder Phosphosäuren oder N-substituierten Sulfaminsäuren, wie z.B. Essigsäure, Propionsäure, Glykolsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure, Hydroxymaleinsäure, Methylmaleinsäure, Fumarsäure, Äpfelsäure, Weinsäure, Milchsäure, Oxalsäure, Glukonsäure, Glukarsäure, Glukuronsäure, Citronensäure, Benzoesäure, Zimtsäure, Mandelsäure, Salicylsäure, 4-Aminosalicylsäure, 2-Phenoxybenzoesäure, 2-Acetoxybenzoesäure, Embonsäure, Nikotinsäure oder Isonicotinsäure, und mit Aminosäuren, wie z.B. den 20 alpha-Aminosäuren, die an der Synthese von Proteinen in der Natur beteiligt sind, wie z.B. Glutaminsäure oder Asparaginsäure, und auch mit Phenylessigsäure, Methansulfonsäure, Ethansulfonsäure, 2-Hydroxyethansulfonsäure, Ethan-1,2-disulfonsäure, Benzolsulfonsäure, 4-Methylbenzol-sulfonsäure, Naphthalin-2-sulfonsäure, Naphthalin-1,5-disulfonsäure, 2- oder 3-Phosphoglycerat, Glucose-6-phosphat, N-Cyclohexylsulfaminsäure (unter Bildung von Cyclamaten) oder mit anderen organischen Säureverbindungen, wie z.B. Ascorbinsäure. Pharmazeutisch verträgliche Salze können auch mit einem pharmazeutisch verträglichen Kation hergestellt werden. Geeignete pharmazeutisch verträgliche Kationen sind dem Fachmann bekannt und umfassen Alkali-, Erdalkali-, Ammonium- und quartäre Ammoniumkationen. Carbonate oder Hydrogencarbonate sind ebenfalls möglich.
Für Oligonukleotide umfassen bevorzugte Beispiele pharmazeutisch verträglicher Salze unter anderem (a) Salze, die mit Kationen wie z.B. Natrium, Kalium, Ammonium, Magnesium, Calcium, Polyaminen, wie z.B. Spermin und Spermidin, usw., gebildet werden, (b) Säureadditionssalze, die mit anorganischen Säuren wie z.B. Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Salpetersäure und dergleichen gebildet werden, (c) Salze, die mit organischen Säuren wie z.B. Essigsäure, Oxalsäure, Weinsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Glukonsäure, Citronensäure, Äpfelsäure, Ascorbinsäure, Benzoesäure, Gerbsäure, Palmitinsäure, Alginsäure, Polyglutaminsäure, Naphthalinsulfonsäure, Methansulfonsäure, p-Toluolsulfonsäure, Naphthalindisulfonsäure, Polygalacturonsäure und dergleichen gebildet werden, und (d) Salze, die aus Elementanionen wie z.B. Chlor, Brom und Iod gebildet werden.
Die erfindungsgemäßen Antisense-Verbindungen können zur Diagnose, zur Therapie, zur Prophylaxe und als Forschungsreagenzien und für Kits verwendet werden. Bei einer Therapie wird ein Tier, vorzugsweise ein Mensch, von dem vermutet wird, dass es bzw. er eine Erkrankung oder Störung aufweist, die durch Modulieren der Expression von X-verknüpftem Inhibitor der Apoptose behandelt werden kann, durch Verabreichen von erfindungsgemäßen Antisense-Verbindungen behandelt. Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in phar mazeutischen Zusammensetzungen durch Zugeben einer wirksamen Menge einer Antisense-Verbindung zu einem geeigneten pharmazeutisch verträglichen Verdünnungsmittel oder Träger verwendet werden. Die Verwendung der erfindungsgemäßen Antisense-Verbindungen und Verfahren kann auch prophylaktisch nützlich sein, d.h. z.B. zur Verhinderung oder Verzögerung einer Infektion, einer Entzündung oder einer Tumorbildung.
Die erfindungsgemäßen Antisense-Verbindungen sind für die Forschung und zur Diagnose nützlich, da diese Verbindungen an Nukleinsäuren hybridisieren, die den X-verknüpften Inhibitor der Apoptose kodieren, wodurch Sandwichtests und andere Tests zur Nutzung dieser Tatsache einfach entwickelt werden können. Die Hybridisierung der erfindungsgemäßen Antisense-Oligonukleotide mit einer Nukleinsäure, die den X-verknüpften Inhibitor der Apoptose kodiert, kann mit bekannten Mitteln nachgewiesen werden. Solche Mittel können die Konjugation eines Enzyms an das Oligonukleotid, eine Radiomarkierung des Oligonukleotids oder jedwedes andere geeignete Nachweismittel umfassen. Es können auch Kits hergestellt werden, die ein solches Nachweismittel zum Nachweisen der Konzentration des X-verknüpften Inhibitors der Apoptose in einer Probe nutzen.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch pharmazeutische Zusammensetzungen und Formulierungen, welche die erfindungsgemäßen Antisense-Verbindungen umfassen. Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen können auf verschiedenartige Weise verabreicht werden, und zwar abhängig davon, ob eine lokale oder systemische Behandlung erwünscht ist, und von dem zu behandelnden Bereich. Die Verabreichung kann topisch (einschließlich ophthalmisch und an Schleimhautmembranen, einschließlich einer vaginalen und rektalen Verabreichung), pulmonal, z.B. durch Einatmen oder Einblasen von Pulvern oder Aerosolen, einschließlich durch Vernebelungsgeräte, intratracheal, intranasal, epidermal und transdermal, oral oder parenteral erfolgen. Eine parenterale Verabreichung umfasst eine intravenöse, intraarterielle, subkutane, intraperitoneale oder intramuskuläre Injektion oder Infusion, oder eine intrakraniale, z.B. eine intrathekale, oder intraventrikuläre Verabreichung. Es wird angenommen, dass Oligonukleotide mit mindestens einer 2'-O-Methoxyethyl-Modifizierung zur oralen Verabreichung besonders gut geeignet sind.
Pharmazeutische Zusammensetzungen und Formulierungen für eine topische Verabreichung können Transdermalpflaster, Salben, Lotionen, Cremes, Gele, Tropfen, Zäpfchen, Sprays, Flüssigkeiten und Pulver umfassen. Herkömmliche pharmazeutische Träger, wässrige Grundlagen, Pulvergrundlagen oder ölige Grundlagen, Verdickungsmittel und dergleichen können erforderlich oder bevorzugt sein. Beschichtete Kondome, Handschuhe und dergleichen können ebenfalls geeignet sein.
Zusammensetzungen und Formulierungen für eine orale Verabreichung umfassen Pulver oder Körnchen, Suspensionen oder Lösungen in Wasser oder nicht-wässrigen Medien, Kapseln, Portionsbeutel oder Tabletten. Verdickungsmittel, Geschmacksstoffe, Verdünnungsmittel, Emulgatoren, Dispergiermittel oder Bindemittel können bevorzugt sein.
Zusammensetzungen und Formulierungen für eine parenterale, intrathekale oder intraventrikuläre Verabreichung können sterile wässrige Lösungen umfassen, die auch Puffer, Verdünnungsmittel und andere geeignete Zusätze wie z.B. unter anderem Penetrationsverstärker, Trägerverbindungen und andere pharmazeutisch verträgliche Träger oder Vehikel enthalten können.
Erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzungen umfassen unter anderem Lösungen, Emulsionen und Liposomen-enthaltende Formulierungen. Diese Zusammensetzungen können aus vielen verschiedenen Komponenten erzeugt werden, die unter anderem im Vorhinein hergestellte Flüssigkeiten, selbstemulgierende Feststoffe und selbstemulgierende halbfeste Stoffe umfassen.
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Formulierungen, die zweckmäßig in einer Einheitsdosierungsform bereitgestellt werden können, können mit herkömmlichen Techniken hergestellt werden, die in der pharmazeutischen Industrie bekannt sind. Solche Techniken umfassen den Schritt des Zusammenbringens der Wirkstoffe mit dem bzw. den pharmazeutischen Träger(n) oder Vehikel(n). Im Allgemeinen werden die Formulierungen durch einheitliches und inniges Zusammenbringen der Wirkstoffe mit flüssigen Trägern oder fein verteilten festen Trägern oder beiden und dann gegebenenfalls Formen des Produkts hergestellt.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können in eine beliebige vieler möglicher Dosierungsformen gebracht werden, wie z.B. unter anderem in Form von Tabletten, Kapseln, flüssigen Sirups, weichen Gelen, Zäpfchen und Klistieren. Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können auch als Suspensionen in wässrigen, nicht-wässrigen oder gemischten Medien formuliert werden. Wässrige Suspensionen können ferner Substanzen enthalten, welche die Viskosität der Suspension erhöhen, einschließlich z.B. Natriumcarboxymethylcellulose, Sorbit und/oder Dextran. Die Suspension kann auch Stabilisatoren enthalten.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können die pharmazeutischen Zusammensetzungen als Schäume formuliert und verwendet werden. Pharmazeutische Schäume umfassen Formulierungen wie z.B. unter anderem Emulsionen, Mikroemulsionen, Cremes, Gelees und Liposomen. Während diese Formulierungen im Wesentlichen von ähnlicher Natur sind, variieren diese Formulierungen bezüglich der Komponenten und der Konsistenz des Endprodukts. Die Herstellung solcher Zusammensetzungen und Formulierungen ist dem Fachmann der Pharmazie und des Formulierens allgemein bekannt und diese kann auf die Formulierung der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen angewandt werden.
Emulsionen
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können als Emulsionen hergestellt und formuliert werden. Emulsionen sind typischerweise heterogene Systeme einer Flüssigkeit, die in einer anderen Flüssigkeit in Form von Tröpfchen dispergiert ist, die einen Durchmesser von gewöhnlich mehr als 0,1 μm aufweisen (Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger und Banker (Hrsg.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Band 1, Seite 199; Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger und Banker (Hrsg.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Band 1, Seite 245; Block, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger und Banker (Hrsg.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Band 2, Seite 335; Higuchi et al., in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1985, Seite 301). Emulsionen sind häufig zweiphasige Systeme, die aus zwei unmischbaren Flüssigkeitsphasen bestehen, die innig miteinander gemischt und dispergiert sind. Im Allgemeinen können Emulsionen entweder vom Wasser-in-Öl-Typ (w/o) oder vom Öl-in-Wasser-Typ (o/w) sein. Wenn eine wässrige Phase in einer Masse einer Ölphase fein verteilt und darin in Form kleiner Tröpfchen dispergiert wird, wird die resultierende Zusammensetzung als Wasser-in-Öl-Emulsion (w/o-Emulsion) bezeichnet. Alternativ wird dann, wenn eine ölige Phase in einer Masse einer wässrigen Phase fein verteilt und darin in Form kleiner Tröpfchen dispergiert wird, die resultierende Zusammensetzung als Öl-in-Wasser-Emulsion (o/w-Emulsion) bezeichnet. Emulsionen können zusätzlich zu den dispergierten Phasen und dem Arzneistoff zusätzliche Komponenten enthalten, die als Lösung entweder in der wässrigen Phase, der Ölphase oder selbst als separate Phase vorliegen können. Pharmazeutische Vehikel wie z.B. Emulgatoren, Stabilisatoren, Farbstoffe und Antioxidationsmittel können je nach Bedarf ebenfalls in Emulsionen vorliegen. Pharmazeutische Emulsionen können auch Mehrfachemulsionen sein, die mehr als zwei Phasen umfassen, wie z.B. im Fall von Öl-in-Wasser-in-Öl- (o/w/o) und Wasser-in-Öl-in-Wasser- (w/o/w) Emulsionen. Solche komplexen Formulierungen bieten häufig bestimmte Vorteile, die einfache binäre Emulsionen nicht aufweisen. Mehrfachemulsionen, in denen einzelne Öltröpfchen einer o/w-Emulsion kleine Wassertröpfchen einschließen, bilden eine w/o/w-Emulsion. Entsprechend stellt ein System von Öltröpfchen, die in Wasserkügelchen eingeschlossen sind, die in einer kontinuierlichen Ölphase stabilisiert sind, eine o/w/o-Emulsion bereit.
Emulsionen sind durch eine geringe oder keine thermodynamische Stabilität gekennzeichnet. Häufig ist die dispergierte oder diskontinuierliche Phase der Emulsion gut in der externen oder kontinuierlichen Phase dispergiert und wird in dieser Form durch Emulgatoren oder die Viskosität der Formulierung aufrechterhalten. Jede der Phasen der Emulsion kann ein halbfester Stoff oder ein Feststoff sein, wie dies bei emulsionsartigen Salbengrundlagen und Cremes der Fall ist. Andere Mittel zur Stabilisierung von Emulsionen umfassen die Verwendung von Emulgatoren, die in jede Phase der Emulsion einbezogen werden können. Emulgatoren können grob in vier Kategorien eingeteilt werden: Synthetische grenzflächenaktive Mittel, natürlich vorkommende Emulgatoren, Absorptionsgrundlagen und fein verteilte Feststoffe (Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger und Banker (Hrsg.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Band 1, Seite 199).
Synthetische grenzflächenaktive Mittel, die auch als oberflächenaktive Mittel bekannt sind, werden bei der Formulierung von Emulsionen verbreitet angewandt und sind in der Literatur beschrieben worden (Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger und Banker (Hrsg.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Band 1, Seite 285; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger und Banker (Hrsg.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Band 1, Seite 199). Grenzflächenaktive Mittel sind typischerweise amphiphil und umfassen einen hydrophilen und einen hydrophoben Abschnitt. Das Verhältnis der hydrophilen zur hydrophoben Natur des grenzflächenaktiven Mittels wird als hydrophillipophiles Gleichgewicht (HLB) bezeichnet und ist ein wertvolles Werkzeug bei der Kategorisierung und der Auswahl grenzflächenaktiver Mittel bei der Herstellung von Formulierungen. Grenzflächenaktive Mittel können auf der Basis der Natur der hydrophilen Gruppe in verschiedene Klassen eingeteilt werden: Nichtionisch, anionisch, kationisch und amphoter (Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger und Banker (Hrsg.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Band 1, Seite 285).
Natürlich vorkommende Emulgatoren, die in Emulsionsformulierungen verwendet werden, umfassen Lanolin, Bienenwachs, Phosphatide, Lecithin und Akaziengummi. Absorptionsgrundlagen weisen hydrophile Eigenschaften auf, so dass sie Wasser zur Bildung von w/o-Emulsionen aufsaugen können und dennoch ihre halbfeste Konsistenz beibehalten, wie z.B. wasserfreies Lanolin und hydrophile Rohvaseline. Fein verteilte Feststoffe wurden insbesondere in einer Kombination mit grenzflächenaktiven Mitteln und in viskosen Präparaten auch als gute Emulgatoren verwendet. Die fein verteilten Feststoffe umfassen polare anorganische Feststoffe, wie z.B. Schwermetallhydroxide, nicht-quellende Tone wie z.B. Bentonit, Attapulgit, Hectorit, Kaolin, Montmorillonit, kolloidales Aluminiumsilikat und kolloidales Magnesium aluminiumsilikat, Pigmente und unpolare Feststoffe wie z.B. Kohlenstoff oder Glycerintristearat.
In Emulsionsformulierungen werden auch viele verschiedene nicht-emulgierende Materialien einbezogen und tragen zu den Eigenschaften der Emulsionen bei. Diese Materialien umfassen Fette, Öle, Wachse, Fettsäuren, Fettalkohole, Fettester, Feuchthaltemittel, hydrophile Kolloide, Konservierungsmittel und Antioxidationsmittel (Block, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger und Banker (Hrsg.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Band 1, Seite 335; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger und Banker (Hrsg.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Band 1, Seite 199).
Hydrophile Kolloide oder Hydrokolloide umfassen natürlich vorkommende Gummis und synthetische Polymere wie z.B. Polysaccharide (beispielsweise Akaziengummi, Agar-Agar, Alginsäure, Carragen, Guargummi, Karayagummi und Tragant), Cellulosederivate (beispielsweise Carboxymethylcellulose und Carboxypropylcellulose) und synthetische Polymere (z.B. Carbomere, Celluloseether und Carboxyvinylpolymere). Diese werden gut in Wasser dispergiert oder quellen gut in Wasser unter Bildung kolloidaler Lösungen, die Emulsionen durch die Bildung fester Grenzflächenfilme um die Tröpfchen der dispergierten Phase und durch Erhöhen der Viskosität der externen Phase stabilisieren.
Da Emulsionen häufig eine Anzahl von Bestandteilen wie z.B. Kohlenhydrate, Proteine, Sterole und Phosphatide enthalten, die das Mikrobenwachstum leicht unterstützen können, werden in diese Formulierungen häufig Konservierungsmittel einbezogen. Gewöhnlich verwendete Konservierungsmittel, die in Emulsionsformulierungen einbezogen werden, umfassen Methylparaben, Propylparaben, quaternäre Ammoniumsalze, Benzalkoniumchlorid, Ester von p-Hydroxybenzoesäure und Borsäure. Emulsionsformulierungen werden üblicherweise auch Antioxidationsmittel zugesetzt, um eine Zersetzung der Formulierung zu verhindern. Die verwendeten Antioxidationsmittel können Radikalfänger wie z.B. Tocopherole, Alkylgallate, butyliertes Hydroxyanisol, butyliertes Hydroxytoluol, oder Reduktionsmittel wie z.B. Ascorbinsäure und Natriummetahydrogensulfit und Antioxidationsmittel-Synergisten wie z.B. Citronensäure, Weinsäure und Lecithin sein.
Die Anwendung von Emulsionsformulierungen über dermatologische, orale und parenterale Routen und Verfahren zu deren Herstellung sind in der Literatur beschrieben worden (Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger und Banker (Hrsg.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Band 1, Seite 199). Emulsionsformulierungen für eine orale Verabreichung wurden aufgrund einer einfachen Formulierung und der Effizienz im Hinblick auf die Absorption und die Bioverfügbarkeit sehr verbreitet verwendet (Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger und Banker (Hrsg.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Band 1, Seite 245; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger und Banker (Hrsg.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Band 1, Seite 199). Abführmittel auf Mineralölbasis, öllösliche Vitamine und Nährpräparate mit hohem Fettgehalt sind unter den Materialien, die üblicherweise oral als o/w-Emulsionen verabreicht worden sind.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die Zusammensetzungen von Oligonukleotiden und Nukleinsäuren als Mikroemulsionen formuliert. Eine Mikroemulsion kann als System aus Wasser, Öl und einer amphiphilen Substanz beschrieben werden, bei der es sich um eine einzelne, optisch isotrope und thermodynamisch stabile flüssige Lösung handelt (Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger und Banker (Hrsg.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Band 1, Seite 245). Typischerweise sind Mikroemulsionen Systeme, die durch zuerst Dispergieren eines Öls in einer wässrigen Lösung eines grenzflächenaktiven Mitels und dann Zugeben einer ausreichenden Menge einer vierten Komponente, bei der es sich im Allgemeinen um einen Alkohol mit mittlerer Kettenlänge handelt, zur Bildung eines transparenten Systems. Daher wurden Mikroemulsionen auch als thermodynamisch stabile, isotrope klare Dispersionen von zwei unmischbaren Flüssigkeiten beschrieben, die durch Grenzflächenfilme oberflächenaktiver Moleküle stabilisiert werden (Leung und Shah, in: Controlled Release of Drugs: Polymers and Aggregate Systems, M. Rosoff, Hrsg., 1989, VCH Publishers, New York, Seiten 185–215). Mikroemulsionen werden üblicherweise durch Vereinigen von drei bis fünf Komponenten hergestellt, die Öl, Wasser, ein grenzflächenaktives Mittel, ein grenzfächenaktives Hilfsmittel und einen Elektrolyten umfassen. Ob die Mikroemulsion vom Wasser-in-Öl-Typ (w/o) oder vom Öl-in-Wasser-Typ (o/w) ist, hängt von den Eigenschaften des verwendeten Öls und des grenzflächenaktiven Mittels und von der Struktur und der geometrischen Packung der polaren Köpfe und der Kohlenwasserstoffschwänze der Moleküle des grenzflächenaktiven Mittels ab (Schott, in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1985, Seite 271).
Der phänomenologische Ansatz unter Verwendung von Phasendiagrammen wurde umfangreich untersucht und führte zu einem umfangreichen Wissen des Fachmanns, wie Mikroemulsionen zu formulieren sind (Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger und Banker (Hrsg.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Band 1, Seite 245; Block, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger und Banker (Hrsg.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Band 1, Seite 335). Verglichen mit herkömmlichen Emulsionen bieten Mikroemulsionen den Vorteil der Solubilisierung wasserunlöslicher Arzneistoffe in einer Formulierung aus thermodynamisch stabilen Tröpfchen, die spontan gebildet werden.
Grenzflächenaktive Mittel, die bei der Herstellung von Mikroemulsionen verwendet werden, umfassen unter anderem ionische grenzflächenaktive Mittel, nichtionische grenzflächenaktive Mittel, Brij 96, Polyoxyethylenoleylether, Polyglycerinfettsäureester, Tetraglycerinmonolaurat (ML310), Tetraglycerinmonooleat (MO310), Hexaglycerinmonooleat (PO310), Hexaglycerinpentaoleat (PO500), Decaglycerinmonocaprat (MCA750), Decaglycerinmonooleat (MO750), Decaglycerinsesquioleat (SO750), Decaglycerindecaoleat (DAO750) allein oder in Kombination mit grenzflächenaktiven Hilfsmitteln. Das grenzflächenaktive Hilfsmittel, bei dem es sich gewöhnlich um einen kurzkettigen Alkohol wie z.B. Ethanol, 1-Propanol und 1-Butanol handelt, dient zur Erhöhung der Grenzflächenfluidität durch das Eindringen in den Film des grenzflächenaktiven Mittels und folglich zur Erzeugung eines ungeordneten Films aufgrund des unter den Molekülen des grenzflächenaktiven Mittels erzeugten Hohlraums. Mikroemulsionen können jedoch ohne die Verwendung von grenzflächenaktiven Hilfsmitteln hergestellt werden und Alkohol-freie, selbstemulgierende Mikroemulsionssysteme sind bekannt. Bei der wässrigen Phase kann es sich typischerweise unter anderem um Wasser, eine wässrige Lösung des Arzneistoffs, Glycerin, PEG300, PEG400, Polyglycerine, Propylenglykole und Derivate von Ethylenglykol handeln. Die Ölphase kann unter anderem Materialien wie z.B. Captex 300, Captex 355, Capmul MCM, Fettsäureester, Mono-, Di- und Triglyceride mit mittlerer Kettenlänge (C8-C12), polyoxyethylierte Glycerylfettsäureester, Fettalkohole, polyglykolierte Glyceride, gesättigte polyglykolierte C8-C10-Glyceride, pflanzliche Öle und Silikonöl umfassen.
Mikroemulsionen sind im Hinblick auf die Arzneistoffsolubilisierung und die verstärkte Absorption von Arzneistoffen von besonderem Interesse. Mikroemulsionen auf Lipidbasis (sowohl o/w als auch w/o) wurden zur Verstärkung der oralen Bioverfügbarkeit von Arzneistoffen, einschließlich Peptiden, vorgeschlagen (Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385–1390; Ritschel, Meth. Find. Exp. Clin. Pharmacol., 1993, 13, 205). Mikroemulsionen bieten die Vorteile einer verbesserten Arzneistoffsolubilisierung, eines Schutzes des Arzneistoffs vor einer enzymatischen Hydrolyse, einer möglichen Verstärkung der Arzneistoffabsorption aufgrund durch das grenzflächenaktive Mittel induzierter Veränderungen der Membranfluidität und -permeabilität, einer einfachen Herstellung und einer einfachen oralen Verabreichung gegenüber festen Dosierungsformen, einer verbesserten klinischen Wirksamkeit und einer verminderten Toxizität (Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385; Ho et al., J. Pharm. Sci., 1996, 85, 138–143). Häufig können sich Mikroemulsionen spontan bilden, wenn deren Komponenten bei Umgebungstemperatur zusammengebracht werden. Dies kann besonders vorteilhaft sein, wenn thermolabile Arzneistoffe, Peptide oder Oligonukleotide formuliert werden. Mikroemulsionen waren auch bei der transdermalen Verabreichung aktiver Komponenten sowohl bei kosmetischen als auch bei pharmazeutischen Anwendungen effektiv. Es wird erwartet, dass die Mikroemulsionszusammensetzungen und -formulierungen der vorliegenden Erfindung eine erhöhte systemische Absorption von Oligonukleotiden und Nukleinsäuren durch den Gastrointestinaltrakt erleichtern und die lokale zelluläre Aufnahme von Oligonukleotiden und Nukleinsäuren innerhalb des Gastrointestinaltrakts, der Vagina, der Mundhöhle und anderen Bereichen der Verabreichung verbessern.
Die Mikroemulsionen der vorliegenden Erfindung können auch zusätzliche Komponenten und Zusätze enthalten, wie z.B. Sorbitanmonostearat (Grill 3), Labrasol und Penetrationsverstärker, um die Eigenschaften der Formulierung zu verbessern und die Absorption der Oligonukleotide und Nukleinsäuren der vorliegenden Erfindung zu verstärken. Die Penetrationsverstärker, die in den Mikroemulsionen der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können in fünf umfangreiche Kategorien eingeteilt werden: Grenzflächenaktive Mittel, Fettsäuren, Gallensalze, Komplexbildner und nicht-komplexbildende, nicht-grenzflächenaktive Verbindungen (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, Seite 92). Jede dieser Klassen ist vorstehend diskutiert worden.
Liposomen
Neben Mikroemulsionen gibt es viele organisierte Strukturen grenzflächenaktiver Mittel, die studiert und zur Formulierung von Arzneistoffen verwendet worden sind. Diese umfassen Monoschichten, Mizellen, Doppelschichten und Vesikel. Vesikel, wie z.B. Liposomen, haben aufgrund ihrer Spezifität und der Wirkungsdauer, die sie im Hinblick auf eine Arzneistoffverabreichung bieten, große Aufmerksamkeit erlangt. Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Begriff „Liposom" steht für ein Vesikel, das aus amphiphilen Lipiden zusammengesetzt ist, die in (einer) kugelförmigen Doppelschicht oder Doppelschichten angeordnet sind.
Liposomen sind unilamellare oder multilamellare Vesikel, die eine Membran, die aus einem lipophilen Material ausgebildet ist, und ein wässriges Inneres aufweisen. Der wässrige Teil enthält die zu verabreichende Zusammensetzung. Kationische Liposomen haben den Vorteil, dass sie mit der Zellwand verschmelzen können. Nicht-kationische Liposomen werden, obwohl sie nicht so effizient mit einer Zellwand verschmelzen können, in vivo durch Makrophagen aufgenommen.
Um eine intakte Säugerhaut zu durchdringen, müssen Lipidvesikel unter dem Einfluss eines geeigneten transdermalen Gradienten durch eine Reihe feiner Poren hindurchtreten, die je weils einen Durchmesser von weniger als 50 nm aufweisen. Daher ist es bevorzugt, ein Liposom zu verwenden, das stark verformbar ist und durch solche feinen Poren hindurchtreten kann.
Weitere Vorteile von Liposomen umfassen: Liposomen, die von natürlichen Phospholipiden erhalten werden, sind biologisch verträglich und biologisch abbaubar; Liposomen können viele verschiedene wasser- und lipidlösliche Arzneistoffe einschließen; Liposomen können eingekapselte Arzneistoffe in ihren inneren Kompartimenten vor dem Stoffwechsel und einem Abbau schützen (Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger und Banker (Hrsg.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Band 1, Seite 245). Wichtige Erwägungen bei der Herstellung von Liposomenformulierungen sind die Lipidoberflächenladung, die Vesikelgröße und das wässrige Volumen der Liposomen.
Liposomen sind zum Transfer und zur Abgabe von Wirkstoffen an die Wirkungsstelle geeignet. Da die liposomale Membran biologischen Membranen strukturell ähnlich ist, beginnen Liposomen dann, wenn sie auf ein Gewebe aufgebracht werden, sich mit den Zellmembranen zu vereinigen. Mit fortschreitender Vereinigung von Liposom und Zelle wird der liposomale Inhalt in die Zelle entleert, wo der Wirkstoff wirken kann.
Liposomale Formulierungen standen im Mittelpunkt umfangreicher Untersuchungen als Verabreichungsmodus für viele Arzneistoffe. Es gibt mehr und mehr Beweise dafür, dass Liposomen für eine topische Verabreichung bezüglich anderer Formulierungen mehrere Vorteile aufweisen. Solche Vorteile umfassen verminderte Nebenwirkungen, was mit der hohen systemischen Absorption des verabreichten Arzneistoffs zusammenhängt, eine erhöhte Ansammlung des verabreichten Arzneistoffs an dem gewünschten Ziel und das Vermögen zur Verabreichung vieler verschiedener, sowohl hydrophiler als auch hydrophober Arzneistoffe in die Haut.
Mehrere Berichte haben das Vermögen von Liposomen zur Abgabe von Mitteln, die DNA mit hohem Molekulargewicht umfassen, in die Haut detailliert dargestellt. An die Haut wurden Verbindungen einschließlich Analgetika, Antikörper, Hormone und DNA mit hohem Molekulargewicht verabreicht. Der größte Teil der Anwendungen führte zu einer Zielsteuerung in die obere Epidermis.
Liposomen lassen sich in zwei umfangreiche Klassen einteilen. Kationische Liposomen sind positiv geladene Liposomen, die mit den negativ geladenen DNA-Molekülen unter Bildung eines stabilen Komplexes in Wechselwirkung treten. Der positiv geladene DNA/Liposom- Komplex bindet an die negativ geladene Zelloberfläche und wird in einem Endosom aufgenommen. Aufgrund des sauren pH-Werts innerhalb des Endosoms werden die Liposomen zerrissen und setzen ihren Inhalt in das Zellcytoplasma frei (Wang et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1987, 147, 980–985).
Liposomen, die pH-empfindlich oder negativ geladen sind, schließen DNA ein, anstatt damit einen Komplex zu bilden. Da sowohl die DNA als auch das Lipid ähnlich geladen sind, findet anstelle einer Komplexbildung eine Abstoßung statt. Trotzdem wird eine gewisse DNA-Menge innerhalb des wässrigen Inneren dieser Liposomen eingeschlossen. pH-empfindliche Liposomen wurden verwendet, um DNA, die das Thymidinkinasegen codiert, in einer Kultur zu Zellmonoschichten zu transportieren. In den Zielzellen wurde die Expression des exogenen Gens nachgewiesen (Zhou et al., Journal of Controlled Release, 1992, 19, 269–274).
Ein Haupttyp einer liposomalen Zusammensetzung umfasst Phospholipide, die von natürlich vorkommendem Phosphatidylcholin verschieden sind. Neutrale Liposomenzusammensetzungen beispielsweise können aus Dimyristoylphosphatidylcholin (DMPC) oder Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC) gebildet werden. Anionische Liposomenzusammensetzungen werden im Allgemeinen aus Dimyristoylphosphatidylglycerin gebildet, während anionische fusogene Liposomen in erster Linie aus Dioleoylphosphatidylethanolamin (DOPE) gebildet werden. Ein anderer Typ einer liposomalen Zusammensetzung wird aus Phosphatidylcholin (PC) gebildet, wie z.B. aus Sojabohnen-PC und Ei-PC. Ein anderer Typ wird aus Gemischen von Phospholipid und/oder Phosphatidylcholin und/oder Cholesterin gebildet.
Mehrere Studien haben die topische Verabreichung liposomaler Arzneistoffformulierungen an die Haut bewertet. Das Aufbringen von Interferon-enthaltenden Liposomen auf Meerschweinchenhaut führte zu einer Verminderung von Hautherpeswunden, während die Verabreichung von Interferon mit anderen Mitteln (z.B. als Lösung oder als Emulsion) ineffektiv war (Weiner et al., Journal of Drug Targeting, 1992, 2, 405–410). Ferner wurde in einer weiteren Studie die Wirksamkeit von Interferon, das als Teil einer liposomalen Formulierung verabreicht wurde, im Vergleich zur Verabreichung von Interferon unter Verwendung eines wässrigen Systems getestet, und es wurde festgestellt, dass die liposomale Formulierung gegenüber der wässrigen Verabreichung überlegen war (du Plessis et al., Antiviral Research, 1992, 18, 259–265).
Nichtionische liposomale Systeme wurden ebenfalls untersucht, um ihren Nutzen bei der Verabreichung von Arzneistoffen an die Haut zu bestimmen, insbesondere Systeme, die ein nichtionisches grenzflächenaktives Mittel und Cholesterin umfassen. Nichtionische liposoma le Formulierungen, die Novasome^TM I (Glyceryldilaurat/Cholesterin/Polyoxyethylen-10-stearylether) und Novasome^TM II (Glyceryldistearat/Cholesterin/Polyoxyethylen-10-stearylether) umfassen, wurden zum Verabreichen von Cyclosporin-A in die Lederhaut von Mäusehaut verwendet. Die Ergebnisse zeigten, dass solche nichtionischen liposomalen Systeme zur Erleichterung der Abscheidung von Cyclosporin-A in verschiedene Schichten der Haut effektiv waren (Hu et al., S.T.P. Pharma. Sci., 1994, 4, 6, 466).
Liposomen umfassen auch „sterisch stabilisierte" Liposomen, ein Ausdruck, der sich hier auf Liposomen bezieht, die ein oder mehrere spezialisiertes) Lipide) umfassen, das bzw. die, wenn es bzw. sie in Liposomen eingebaut wird bzw. werden, bezogen auf Liposomen, die solche spezialisierten Lipide nicht aufweisen, zu verlängerten Zirkulationszeiträumen führt bzw. führen. Beispiele für sterisch stabilisierte Liposomen sind diejenigen, bei denen ein Teil des Vesikel-bildenden Lipidabschnitts des Liposoms (A) ein oder mehrere Glykolipid(e) umfasst, wie z.B. Monosialogangliosid G_M1, oder (B) mit einem oder mehreren hydrophilen Polymer(en) derivatisiert ist, wie z.B. einem Polyethylenglykolrest (PEG-Rest). Während eine Festlegung auf eine bestimmte Theorie nicht beabsichtigt ist, wird von der Fachwelt angenommen, dass sich zumindest für die sterisch stabilisierten Liposomen, die Ganglioside, Sphingomyelin oder PEG-derivatisierte Lipide enthalten, die erhöhte Zirkulationshalbwertszeit dieser sterisch stabilisierten Liposomen von einer verminderten Aufnahme in Zellen des retikuloendothelialen Systems (RES) ableitet (Allen et al., FEBS Letters, 1987, 223, 42; Wu et al., Cancer Research, 1993, 53, 3765). Es sind verschiedene Liposomen bekannt, die ein oder mehrere Glykolipid(e) umfassen. Papahadjopoulos et al. (Ann. N.Y. Acad. Sci., 1987, 507, 64) haben das Vermögen von Monosialogangliosid G_M1, Galactocerebrosidsulfat und Phosphatidylinosit zur Verbesserung der Bluthalbwertszeiten von Liposomen beschrieben. Diese Erkenntnisse wurden von Gabizon et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988, 85, 6949) erläutert. Das US-Patent 4,837,028 und die WO 88/04924 (beide Allen et al.) beschreiben Liposomen, die (1) Sphingomyelin und (2) das Gangliosid G_M1 oder einen Galactocerebrosidsulfatester umfassen. Das US-Patent 5,543,152 (Webb et al.) beschreibt Liposomen, die Sphingomyelin umfassen. Liposomen, die 1,2-sn-Dimyristoylphosphatidylcholin umfassen, sind in der WO 97/13499 (Lim et al.) beschrieben.
Viele Liposomen, die Lipide umfassen, die mit einem oder mehreren hydrophilen Polymer(en) derivatisiert sind, und Verfahren zu deren Herstellung sind bekannt. Sunamoto et al. (Bull. Chem. Soc. Jpn., 1980, 53, 2778) beschreiben Liposomen, die ein nichtionisches Detergenz, 2C₁₂15G, umfassen, das einen PEG-Rest enthält. Illum et al. (FEBS Lett., 1984, 167, 79) haben beschrieben, dass eine hydrophile Beschichtung von Polystyrolteilchen mit polymeren Glykolen zu signifikant erhöhten Bluthalbwertszeiten führt. Synthetische Phospho lipide, die durch das Binden von Carboxylgruppen von Polyalkylenglykolen (z.B. PEG) modifiziert worden sind, werden von Sears (US-Patente 4,426,330 und 4,534,899) beschrieben. Klibanov et al. (FEBS Lett., 1990, 268, 235) haben Experimente beschrieben, die zeigen, dass Liposomen, die Phosphatidylethanolamin (PE) umfassen, das mit PEG oder PEG-Stearat derivatisiert worden ist, signifikante Zunahmen bei den Blutzirkulationshalbwertszeiten aufweisen. Blume et al. (Biochimica et Biophysica Acta, 1990, 1029, 91) haben solche Betrachtungen auf andere PEG-derivatisierte Phospholipide ausgedehnt, wie z.B. auf DSPE-PEG, das durch die Kombination von Distearoylphosphatidylethanolamin (DSPE) und PEG gebildet wird. Liposomen, die kovalent gebundene PEG-Reste an ihrer Außenoberfläche aufweisen, sind in dem Europäischen Patent EP 0 445 131 B1 und der WO 90/04384 (Fisher) beschrieben. Liposomenzusammensetzungen, die 1 bis 20 Mol-% PE, das mit PEG derivatisiert ist, enthalten, und Verfahren zu deren Anwendung werden von Woodle et al. (US-Patente 5,013,556 und 5,356,633) und Martin et al. (US-Patent 5,213,804 und Europäisches Patent EP 0 496 813 B1 ) beschrieben. Liposomen, die eine Anzahl anderer Lipid-Polymer-Konjugate umfassen, sind in der WO 91/05545 und dem US-Patent 5,225,212 (beide Martin et al.) und in der WO 94/20073 (Zalipsky et al.) beschrieben. Liposomen, die PEG-modifizierte Ceramid-Lipide umfassen, sind in der WO 96/10391 (Choi et al.) beschrieben. Das US-Patent 5,540,935 (Miyazaki et al.) und das US-Patent 5,556,948 (Tagawa et al.) beschreiben PEG-enthaltende Liposomen, die auf ihren Oberflächen mit funktionellen Resten weiter derivatisiert werden können.
Es ist eine begrenzte Anzahl von Liposomen bekannt, die Nukleinsäuren umfassen. Die WO 96/40062 (Thierry et al.) beschreibt Verfahren zur Einkapselung von Nukleinsäuren mit hohem Molekulargewicht in Liposomen. Das US-Patent 5,264,221 (Tagawa et al.) beschreibt Protein-gebundene Liposomen und darin ist angegeben, dass der Inhalt solcher Liposomen eine Antisense-RNA umfassen kann. Das US-Patent 5,665,710 (Rahman et al.) beschreibt bestimmte Verfahren zur Einkapselung von Oligodesoxynukleotiden in Liposomen. Die WO 97/04787 (Love et al.) beschreibt Liposomen, die Antisense-Oligonukleotide umfassen, die auf das raf-Gen gerichtet sind.
Transfersome sind ein weiterer Liposomentyp und dabei handelt es sich um stark verformbare Lipidaggregate, die attraktive Kandidaten für Arzneistoffverabreichungsvehikel sind. Transfersome können als Lipidtröpfchen beschrieben werden, die so stark verformbar sind, dass sie leicht durch Poren dringen können, die kleiner als das Tröpfchen sind. Transfersome können an die Umgebung, in der sie verwendet werden, angepasst werden. Beispielsweise sind sie selbstoptimierend (sie passen sich an die Form der Poren in der Haut an), selbstreparierend, erreichen häufig ihr Ziel, ohne zu Fragmentieren, und sind häufig selbst beladend. Zur Herstellung von Transfersomen können Oberflächenaktivatoren, üblicherweise grenzflächenaktive Mittel, einer liposomalen Standardzusammensetzung zugesetzt werden. Transfersome sind zum Verabreichen von Serumalbumin an die Haut verwendet worden. Es wurde gezeigt, dass die Transfersom-vermittelte Verabreichung von Serumalbumin so effektiv ist wie die subkutane Injektion einer Lösung, die Serumalbumin enthält.
Grenzflächenaktive Mittel finden vielfältige Anwendung in Formulierungen wie z.B. Emulsionen (einschließlich Mikroemulsionen) und Liposomen. Der gebräuchlichste Weg zur Klassifizierung und Bewertung der Eigenschaften der vielen verschiedenen Arten von grenzflächenaktiven Mitteln, und zwar sowohl von natürlichen als auch synthetischen grenzflächenaktiven Mitteln, ist die Verwendung des hydrophil-lipophilen Gleichgewichts (HLB). Die Natur der hydrophilen Gruppe (auch als „Kopf" bekannt) stellt das nützlichste Mittel zur Kategorisierung der verschiedenen grenzflächenaktiven Mittel bereit, die in Formulierungen verwendet werden (Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, NY, 1988, Seite 285).
Wenn das Molekül des grenzflächenaktiven Mittels nicht ionisiert ist, wird es als nichtionisches grenzflächenaktives Mittel klassifiziert. Nichtionische grenzflächenaktive Mittel werden in pharmazeutischen und kosmetischen Produkten vielfältig angewandt und sind in einem breiten Bereich von pH-Werten anwendbar. Im Allgemeinen liegen ihre HLB-Werte abhängig von ihrer Struktur im Bereich von 2 bis etwa 18. Nichtionische grenzflächenaktive Mittel umfassen nichtionische Ester wie z.B. Ethylenglykolester, Propylenglykolester, Glycerinester, Polyglycerylester, Sorbitanester, Saccharoseester und ethoxylierte Ester. Nichtionische Alkanolamide und -ether wie z.B. Fettalkoholethoxylate, propoxylierte Alkohole und ethoxylierte/propoxylierte Blockpolymere sind ebenfalls in dieser Klasse enthalten. Die grenzflächenaktiven Polyoxyethylene sind die populärsten Mitglieder der Klasse der nichtionischen grenzflächenaktiven Mittel.
Wenn das Molekül des grenzflächenaktiven Mittels eine negative Ladung trägt, wenn es in Wasser gelöst oder dispergiert wird, wird das grenzflächenaktive Mittel als anionisch klassifiziert. Anionische grenzflächenaktive Mittel umfassen Carboxylate wie z.B. Seifen, Acyllactylate, Acylamide von Aminosäuren, Schwefelsäureester wie z.B. Alkylsulfate und ethoxylierte Alkylsulfate, Sulfonate wie z.B. Alkylbenzolsulfonate, Acylisethionate, Acyltaurate und -sulfosuccinate und Phosphate. Die wichtigsten Mitglieder der Klasse der anionischen grenzflächenaktiven Mittel sind die Alkylsulfate und die Seifen.
Wenn das Molekül des grenzflächenaktiven Mittels eine positive Ladung trägt, wenn es in Wasser gelöst oder dispergiert wird, wird das grenzflächenaktive Mittel als kationisch klassifiziert. Kationische grenzflächenaktive Mittel umfassen quarternäre Ammoniumsalze und ethoxylierte Amine. Die quarternären Ammoniumsalze sind die am häufigsten verwendeten Mitglieder dieser Klasse.
Wenn das Molekül des grenzflächenaktiven Mittels sowohl eine positive als auch eine negative Ladung tragen kann, wird das grenzflächenaktive Mittel als amphoter klassifiziert. Amphotere grenzflächenaktive Mittel umfassen Acrylsäurederivate, substituierte Alkylamide, N-Alkylbetaine und Phosphatide.
Die Verwendung grenzflächenaktiver Mittel in Arzneistoffprodukten, -formulierungen und -emulsionen wurde beschrieben (Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, NY, 1988, Seite 285).
Penetrationsverstärker
In einer Ausführungsform werden in der vorliegenden Erfindung verschiedene Penetrationsverstärker verwendet, um eine effiziente Verabreichung von Nukleinsäuren, insbesondere von Oligonukleotiden, an die Haut von Tieren zu bewirken. Die meisten Arzneistoffe liegen in Lösung sowohl in ionisierten als auch in nichtionisierten Formen vor. Gewöhnlich durchdringen jedoch nur lipidlösliche oder lipophile Arzneistoffe Zellmembranen leicht. Es wurde gefunden, dass selbst nicht-lipophile Arzneistoffe Zellmembranen durchdringen können, wenn die zu durchdringende Membran mit einem Penetrationsverstärker behandelt wird. Zusätzlich zur Unterstützung der Diffusion nicht-lipophiler Arzneistoffe durch Zellmembranen verstärken Penetrationsverstärker auch die Permeabilität lipophiler Arzneistoffe.
Penetrationsverstärker können einer von fünf umfangreichen Kategorien klassifizierend zugeordnet werden, d.h. grenzflächenaktiven Mitteln, Fettsäuren, Gallensalzen, Komplexbildnern und nicht-komplexbildenden, nicht-grenzflächenaktiven Verbindungen (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, Seite 92). Jede der vorstehend genannten Klassen von Penetrationsverstärkern wird nachstehend detaillierter beschrieben.
Grenzflächenaktive Mittel: Im Kontext der vorliegenden Erfindung sind grenzflächenaktive Mittel (oder „oberflächenaktive Mittel") chemische Einheiten, die beim Lösen in einer wässrigen Lösung die Oberflächenspannung der Lösung oder die Grenzflächenspannung zwischen der wässrigen Lösung und einer anderen Flüssigkeit vermindern, mit dem Ergebnis, dass die Absorption von Oligonukleotiden durch die Schleimhaut verstärkt wird. Zusätzlich zu Gallensalzen und Fettsäuren umfassen diese Penetrationsverstärker z.B. Natriumlaurylsulfat, Polyoxyethylen-9-laurylether und Polyoxyethylen-20-cetylether) (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, Seite 92), und Perfluorchemikalienemulsionen wie z.B. FC-43 (Takahashi et al., J. Pharm. Pharmacol., 1988, 40, 252).
Fettsäuren: Verschiedene Fettsäuren und deren Derivate, die als Penetrationsverstärker wirken, umfassen z.B. Ölsäure, Laurinsäure, Caprinsäure (n-Decansäure), Myristinsäure, Palmitinsäure, Stearinsäure, Linolsäure, Linolensäure, Dicaprat, Tricaprat, Monoolein (1-Monooleyl-rac-glycerin), Dilaurin, Caprylsäure, Arachidonsäure, Glycerin-1-monocaprat, 1-Dodecylazacycloheptan-2-on, Acylcarnitine, Acylcholine, C_1-10-Alkylester davon (z.B. Methyl, Isopropyl und t-Butyl), und Mono- und Diglyceride davon (d.h. Oleat, Laurat, Caprat, Myristat, Palmitat, Stearat, Linoleat, usw.) (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, Seite 92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1–33; EI Hariri et al., J. Pharm. Pharmacol., 1992, 44, 651–654).
Gallensalze: Die physiologische Rolle von Galle umfasst die Erleichterung der Dispersion und Absorption von Lipiden und fettlöslichen Vitaminen (Brunton, Kapitel 38 in: Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9. Auflage, Hardman et al., Hrsg., McGraw-Hill, New York, 1996, Seiten 934–935). Verschiedene natürliche Gallensalze und deren synthetische Derivate wirken als Penetrationsverstärker. Folglich umfasst der Begriff „Gallensalze" jedwede der natürlich vorkommenden Komponenten von Galle sowie jedwede synthetische Derivate davon. Die Gallensalze der Erfindung umfassen z.B. Cholsäure (oder deren pharmazeutisch verträgliches Natriumsalz Natriumcholat), Dehydrocholsäure (Natriumdehydrocholat), Desoxycholsäure (Natriumdesoxycholat), Glucholsäure (Natriumglucholat), Glycholsäure (Natriumglycocholat), Glycodesoxycholsäure (Natriumglycodesoxycholat), Taurocholsäure (Natriumtaurocholat), Taurodesoxycholsäure (Natriumtaurodesoxycholat), Chenodesoxycholsäure (Natriumchenodesoxycholat), Ursodesoxycholsäure (UDCA), Natriumtauro-24,25-dihydrofusidat (STDHF), Natriumglycodihydrofusidat und Polyoxyethylen-9-laurylether (POE) (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, Seite 92; Swinyard, Kapitel 39 in: Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. Auflage, Gennaro, Hrsg., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990, Seiten 782–783; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1–33; Yamamoto et al., J. Pharm. Exp. Ther., 1992, 263, 25; Yamashita et al., J. Pharm. Sci., 1990, 79, 579–583).
Komplexbildner: Komplexbildner, wie sie im Kontext der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können als Verbindungen definiert werden, die Metallionen durch Bilden von Kom plexen mit den Metallionen aus einer Lösung entfernen, mit dem Ergebnis, dass die Absorption von Oligonukleotiden durch die Schleimhaut verstärkt wird. Bezüglich ihrer Verwendung als Penetrationsverstärker in der vorliegenden Erfindung haben Komplexbildner den zusätzlichen Vorteil, dass sie auch als DNase-Inhibitoren wirken, da die meisten charakterisierten DNA-Nukleasen ein zweiwertiges Metallion für die Katalyse benötigen und folglich durch Komplexbildner inhibiert werden (Jarrett, J. Chromatogr., 1993, 618, 315–339). Komplexbildner der Erfindung umfassen unter anderem Dinatriumethylendiamintetraacetat (EDTA), Citronensäure, Salicylate (z.B. Natriumsalicylat, 5-Methoxysalicylat und Homovanilat), N-Acylderivate von Kollagen, Laureth-9 und N-Aminoacylderivate von beta-Diketonen (Enamine) (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, Seite 92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1–33; Buur et al., J. Control Rel., 1990, 14, 43–51).
Nicht-komplexbildende, nicht-grenzflächenaktive Verbindungen: Nicht-komplexbildende, nicht-grenzflächenaktive penetrationsverstärkende Verbindungen können als Verbindungen definiert werden, die eine nicht signifikante Aktivität als Komplexbildner oder als grenzflächenaktive Mittel zeigen, die jedoch trotzdem die Absorption von Oligonukleotiden durch die alimentäre Schleimhaut verstärken (Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1–33). Diese Klasse von Penetrationsverstärkern umfasst z.B. ungesättigte cyclische Harnstoffe, 1-Alkyl- und 1-Alkenylazacycloalkanonderivate (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, Seite 92) und nicht-steroide entzündungshemmende Mittel wie z.B. Diclofenac-Natrium, Indomethacin und Phenylbutazon (Yamashita et al., J. Pharm. Pharmacol., 1987, 39, 621–626).
Mittel, welche die Aufnahme von Oligonukleotiden auf einem zellulären Niveau verstärken, können ebenfalls den pharmazeutischen und anderen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung zugesetzt werden. Beispielsweise ist auch von kationischen Lipiden, wie z.B. Lipofectin (Junichi et al., US-Patent 5,705,188), kationischen Glycerinderivaten und polykationischen Molekülen, wie z.B. Polylysin (Lollo et al., PCT-Anmeldung WO 97/30731) bekannt, dass sie die zelluläre Aufnahme von Oligonukleotiden verstärken.
Es können auch andere Mittel verwendet werden, um die Penetration der verabreichten Nukleinsäuren zu verstärken, einschließlich Glykole wie z.B. Ethylenglykol und Propylenglykol, Pyrrole wie z.B. 2-Pyrrol, Azone und Terpene wie z.B. Limonen und Menthon.
Träger
Bestimmte Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung umfassen auch Trägerverbindungen in der Formulierung. "Trägerverbindung" oder "Träger" kann sich hier auf eine Nukleinsäure oder ein Analogon davon beziehen, das inert ist (d.h. keine biologische Aktivität per se aufweist), jedoch von in vivo-Prozessen, welche die Bioverfügbarkeit einer Nukleinsäure mit einer biologischen Aktivität z.B. durch den Abbau der biologisch aktiven Nukleinsäure oder durch die Förderung der Entfernung der biologisch aktiven Nukleinsäure aus der Zirkulation vermindern, als Nukleinsäure erkannt wird. Die gemeinsame Verabreichung einer Nukleinsäure und einer Trägerverbindung, typischerweise mit einem Überschuss der letztgenannten Substanz, kann zu einer wesentlichen Verminderung der Nukleinsäuremenge führen, die in der Leber, der Niere oder anderen extrazirkulatorischen Reservoirs wiedergefunden wird, und zwar vermutlich aufgrund einer Konkurrenz zwischen der Trägerverbindung und der Nukleinsäure um einen gemeinsamen Rezeptor. Beispielsweise kann die Wiederfindung eines partiellen Phosphorothioat-Oligonukleotids in Lebergewebe vermindert werden, wenn es zusammen mit Polyinosinsäure, Dextransulfat, Polycytidylsäure oder 4-Acetamido-4'-isothiocyanostilben-2,2'-disulfonsäure verabreicht wird (Miyao et al., Antisense Res. Dev., 1995, 5, 115–121; Takakura et al., Antisense & Nucl. Acid Drug Dev., 1996, 6, 177–183).
Vehikel
Im Gegensatz zu einer Trägerverbindung ist ein "pharmazeutischer Träger" oder "Vehikel" ein pharmazeutisch verträgliches Lösungsmittel, Suspendiermittel oder ein beliebiges anderes pharmakologisch inertes Vehikel zur Verabreichung einer oder mehrerer Nukleinsäuren an ein Tier. Das Vehikel kann flüssig oder fest sein und wird unter Berücksichtigung der vorgesehenen Verabreichungsart so ausgewählt, dass das gewünschte Volumen, die gewünschte Konsistenz, usw., bereitgestellt wird, wenn es mit einer Nukleinsäure und den anderen Komponenten einer gegebenen pharmazeutischen Zusammensetzung kombiniert wird. Typische pharmazeutische Träger umfassen unter anderem Bindemittel (z.B. vorgelatinierte Maisstärke, Polyvinylpyrrolidon oder Hydroxypropylmethylcellulose, usw.), Füllstoffe (z.B. Lactose und andere Zucker, mikrokristalline Cellulose, Pektin, Gelatine, Calciumsulfat, Ethylcellulose, Polyacrylate oder Calciumhydrogenphosphat, usw.), Gleitmittel (z.B. Magnesiumstearat, Talk, Silica, kolloidales Siliziumdioxid, Stearinsäure, Metallstearate, hydrierte Pflanzenöle, Maisstärke, Polyethylenglykole, Natriumbenzoat, Natriumacetat, usw.), Sprengmittel (z.B. Stärke, Natriumstärkeglykolat, usw.) und Benetzungsmittel (z.B. Natriumlaurylsulfat, usw.).
Pharmazeutisch verträgliche organische oder anorganische Vehikel, die für eine nicht-parenterale Verabreichung geeignet sind und nicht in schädlicher Weise mit Nukleinsäuren reagieren, können ebenfalls zum Formulieren der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen verwendet werden. Geeignete pharmazeutisch verträgliche Träger umfassen unter anderem Wasser, Salzlösungen, Alkohole, Polyethylenglykole, Gelatine, Laktose, Amylose, Magnesiumstearat, Talk, Kieselsäure, viskoses Paraffin, Hydroxymethylcellulose, Polyvinylpyrrolidon und dergleichen.
Formulierungen für eine topische Verabreichung von Nukleinsäuren können sterile und nicht-sterile wässrige Lösungen, nicht-wässrige Lösungen in üblichen Lösungsmitteln wie z.B. Alkoholen oder Lösungen der Nukleinsäuren in flüssigen oder festen Ölgrundlagen umfassen. Die Lösungen können auch Puffer, Verdünnungsmittel und andere geeignete Zusätze enthalten. Es können pharmazeutisch verträgliche organische oder anorganische Vehikel, die zur nicht-parenteralen Verabreichung geeignet sind und nicht in schädlicher Weise mit Nukleinsäuren reagieren, verwendet werden.
Geeignete pharmazeutisch verträgliche Vehikel umfassen unter anderem Wasser, Salzlösungen, Alkohole, Polyethylenglykole, Gelatine, Laktose, Amylose, Magnesiumstearat, Talk, Kieselsäure, viskoses Paraffin, Hydroxymethylcellulose, Polyvinylpyrrolidon und dergleichen.
Andere Komponenten
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können zusätzlich andere Zusatzkomponenten, die üblicherweise in pharmazeutischen Zusammensetzungen vorliegen, in den in dem Fachgebiet üblichen Anwendungskonzentrationen enthalten. Folglich können die Zusammensetzungen beispielsweise zusätzliche, verträgliche pharmazeutisch aktive Materialien wie z.B. Antipruriginosa, Adstringentien, Lokalanästhetika oder entzündungshemmende Mittel oder zusätzliche Materialien enthalten, die bei der physikalischen Formulierung verschiedener Dosierungsformen der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen geeignet sind, wie z.B. Farbstoffe, Geschmacksstoffe, Konservierungsmittel, Antioxidationsmittel, Trübungsmittel, Verdickungsmittel und Stabilisatoren. Solche Materialien sollten jedoch, wenn sie zugesetzt werden, die biologischen Aktivitäten der Komponenten der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen nicht übermäßig stören. Die Formulierungen können sterilisiert und gegebenenfalls mit Hilfsstoffen gemischt werden, wie z.B. mit Gleitmitteln, Konservierungsmitteln, Stabilisatoren, Benetzungsmitteln, Emulgatoren, Salzen zur Beeinflussung des osmotischen Drucks, Puffern, Farbmitteln, Geschmacksstoffen und/oder aromatischen Substanzen und dergleichen, die mit der oder den Nukleinsäure(n) der Formulierung nicht in schädlicher Weise in Wechselwirkung treten.
Wässrige Suspensionen können Substanzen enthalten, welche die Viskosität der Suspension erhöhen, einschließlich z.B. Natriumcarboxymethylcellulose, Sorbit und/oder Dextran. Die Suspension kann auch Stabilisatoren enthalten.
Bestimmte Ausführungsformen der Erfindung stellen pharmazeutische Zusammensetzungen bereit, die (a) eine oder mehrere Antisense-Verbindungen) und (b) ein oder mehrere chemotherapeutisches) Mittel enthalten, die durch einen nicht-Antisense-Mechanismus wirken. Beispiele für solche chemotherapeutischen Mittel umfassen unter anderem Antikrebsarzneistoffe wie Daunorubicin, Dactinomycin, Doxorubicin, Bleomycin, Mitomycin, Stickstoff-Lost, Chlorambucil, Melphalan, Cyclophosphamid, 6-Mercaptopurin, 6-Thioguanin, Cytarabin (CA), 5-Fluoruracil (5-FU), Floxuridin (5-FUdR), Methotrexat (MTX), Colchicin, Vincristin, Vinblastin, Etoposid, Teniposid, Cisplatin und Diethylstilbestrol (DES) (vgl. allgemein The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 15. Auflage, Berkow et al., Hrsg., 1987, Rahway, N.J., Seiten 1206–1228). Entzündungshemmende Arzneistoffe, die unter anderem nicht-steroide entzündungshemmende Arzneistoffe und Corticosteroide, sowie antivirale Arzneistoffe, einschließlich unter anderem Ribivirin, Vidarabin, Acyclovir und Ganciclovir umfassen, können ebenfalls in erfindungsgemäßen Zusammensetzungen kombiniert werden (vgl. allgemein The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 15. Auflage, Berkow et al., Hrsg., 1987, Rahway, N.J., Seiten 2499–2506 bzw. 46–49). Andere chemotherapeutische Mittel des nicht-Antisense-Typs liegen ebenfalls im Bereich dieser Erfindung. Zwei oder mehr kombinierte Verbindungen können zusammen oder aufeinander folgend verwendet werden.
In einer weiteren verwandten Ausführungsform können erfindungsgemäße Zusammensetzungen eine oder mehrere Antisense-Verbindung(en), insbesondere Oligonukleotide, die auf eine erste Nukleinsäure gerichtet ist bzw. sind, und eine oder mehrere zusätzliche Antisense-Verbindung(en), die auf ein zweites Nukleinsäureziel gerichtet sind, enthalten. In dem Fachgebiet sind zahlreiche Beispiele für Antisense-Verbindungen bekannt. Zwei oder mehr kombinierte Verbindungen können zusammen oder aufeinander folgend verwendet werden.
Es wird davon ausgegangen, dass die Formulierung therapeutischer Zusammensetzungen und deren anschließende Verabreichung für den Fachmann geläufig sind. Die Dosierung hängt von der Schwere und dem Ansprechen des zu behandelnden Krankheitszustands ab, wobei die Behandlung mehrere Tage bis mehrere Monate andauern kann, bis eine Heilung bewirkt oder eine Linderung des Krankheitszustands erreicht worden ist. Optimale Dosierungsvorschriften können aus Messungen der Arzneistoffakkumulation im Körper des Patienten berechnet werden. Der Fachmann kann optimale Dosierungen, Dosierungsverfahren und Wiederholungsraten einfach bestimmen. Die optimalen Dosierungen können abhängig von der relativen Wirksamkeit der einzelnen Oligonukleotide variieren und im Allgemeinen auf der Basis der EC₅₀-Werte abgeschätzt werden, bei denen gefunden wurde, dass sie in in vitro-Modellen und in in vivo-Tiermodellen wirksam sind. Im Allgemeinen beträgt die Dosierung 0,01 μg bis 100 g pro kg Körpergewicht und die Dosierung kann einmal oder mehrmals täglich, wöchentlich, monatlich oder jährlich oder sogar alle 2 bis 20 Jahre verabreicht werden. Der Fachmann kann die Wiederholungsraten für die Dosierung auf der Basis der gemessenen Verweilzeiten und Konzentrationen des Arzneistoffs in Körperfluiden oder -geweben einfach abschätzen. Nach einer erfolgreichen Behandlung kann es bevorzugt sein, dass mit dem Patienten eine Erhaltungstherapie durchgeführt wird, um das Wiederauftreten des Krankheitszustands zu verhindern, wobei das Oligonukleotid in Erhaltungsdosen im Bereich von 0,01 μg bis 100 g pro kg Körpergewicht einmal oder mehrmals täglich bis zu einmal alle 20 Jahre verabreicht wird.
Während die vorliegende Erfindung spezifisch gemäß bestimmter bevorzugter Ausführungsformen beschrieben worden ist, dienen die nachstehenden Beispiele lediglich zur Veranschaulichung der Erfindung und sind nicht beschränkend aufzufassen.
Beispiele
Beispiel 1
Nukleosidphosphoramidite für die Oligonukleotidsynthese
Desoxy- und 2'-Alkoxyamidite
2'-Desoxy- und 2'-Methoxy-beta-cyanoethyldiisopropylphosphoramidite wurden von kommerziellen Quellen erworben (z.B. ChemGenes, Needham, MA, oder Glen Research, Inc., Sterling, VA). Andere 2'-O-Alkoxy-substituierte Nukleosidamidite werden gemäß dem US-Patent 5,506,351, das unter Bezugnahme einbezogen wird, hergestellt. Für Oligonukleotide, die unter Verwendung von 2'-Alkoxyamiditen synthetisiert worden sind, wurde der Standardzyklus für unmodifizierte Oligonukleotide verwendet, jedoch wurde der Warteschritt nach der Pulsabgabe von Tetrazol und Base auf 360 s verlängert.
Oligonukleotide, die 5-Methyl-2'-desoxycytidin-Nukleotide (5-Me-C-Nukleotide) enthalten, wurden gemäß veröffentlichter Verfahren (Sanghvi et al., Nucleic Acids Research, 1993, 21, 3197–3203) unter Verwendung käuflicher Phosphoramidite (Glen Research, Sterling, VA, oder ChemGenes, Needham, MA) synthetisiert.
2'-Fluoramidite
2'-Fluordesoxyadenosinamidite
2-Fluoroligonukleotide wurden so, wie es bereits beschrieben worden ist (Kawasakik et al., J. Med. Chem., 1993, 36, 831–841) und gemäß US-Patent 5,670,633, das unter Bezugnahme einbezogen wird, synthetisiert. Insbesondere wurde das geschützte Nukleosid N6-Benzoyl-2'-desoxy-2'-fluoradenosin unter Verwendung von käuflichem 9-beta-D-Arabinofuranosyladenin als Ausgangsmaterial und durch Modifizieren von Literaturverfahren synthetisiert, wodurch das 2'-alpha-Fluoratom durch eine S_N2-Substitution einer 2'-beta-Tritylgruppe eingeführt wird. Folglich wurde das N6-Benzoyl-9-beta-D-arabinofuranosyladenin in einer mäßigen Ausbeute als 3',5'-Ditetrahydropyranyl-Zwischenprodukt (THP-Zwischenprodukt) selektiv geschützt. Das Entschützen der THP- und N6-Benzoylgruppen wurde unter Verwendung von Standardmethoden erreicht und Standardverfahren wurden verwendet, um die 5'-Dimethoxytrityl- (DMT) und 5'-DMT-3'-phosphoramidit-Zwischenprodukte zu erhalten.
2'-Fluordesoxyguanosin
Die Synthese von 2'-Desoxy-2'-fluorguanosin wurde unter Verwendung von Tetraisopropyldisiloxanyl- (TPDS) geschütztem 9-beta-D-Arabinofuranosylguanin als Ausgangsmaterial und Umwandeln in das Zwischenprodukt Diisobutyrylarabinofuranosylguanosin erreicht. Nach dem Entschützen der TPDS-Gruppe wurde die Hydroxylgruppe mit THP geschützt, wodurch Diisobutyryl-di-THP-geschütztes Arabinofuranosylguanin erhalten wurde. Nach einer selektiven O-Deacylierung und Triflatbildung wurde das Rohprodukt mit Fluorid behandelt und dann wurden die THP-Gruppen entschützt. Es wurden Standardmethoden verwendet, um die 5'-DMT- und 5'-DMT-3'-phosphoramidite zu erhalten.
2'-Fluoruridin
Die Synthese von 2'-Desoxy-2'-fluoruridin wurde durch die Modifizierung eines Literaturverfahrens erreicht, bei dem 2,2'-Anhydro-1-beta-D-arabinofuranosyluracil mit 70 % Fluorwasserstoff-Pyridin behandelt wurde. Es wurden Standardmethoden verwendet, um die 5'-DMT- und 5'-DMT-3'-phosphoramidite zu erhalten.
2'-Fluordesoxycytidin
2'-Desoxy-2'-fluorcytidin wurde durch eine Aminierung von 2'-Desoxy-2'-fluoruridin und anschließendem selektiven Schützen synthetisiert, wobei N4-Benzoyl-2'-desoxy-2'-fluorcytidin erhalten wurde. Es wurden Standardmethoden verwendet, um die 5'-DMT- und 5'-DMT-3'-phosphoramidite zu erhalten.
2'-O-(2-Methoxyethyl)-modifizierte Amidite
2'-O-Methoxyethyl-substituierte Nukleosidamidite werden in der folgenden Weise oder alternativ gemäß den Verfahren von P. Martin, Helvetica Chimica Acta, 1995, 78, 486–504 hergestellt.
2,2'-Anhydro[1-(beta-D-arabinofuranosyl)-5-methyluridin]
5-Methyluridin (Ribosylthymin, von Yamasa, Choshi, Japan, erhältlich) (72,0 g, 0,279 M), Diphenylcarbonat (90,0 g, 0,420 M) und Natriumhydrogencarbonat (2,0 g, 0,024 M) wurden DMF (300 ml) zugesetzt. Das Gemisch wurde unter Rühren zum Rückfluss erhitzt, wobei eine kontrollierte Freisetzung des entwickelten Kohlendioxidgases ermöglicht wurde. Nach einer Stunde wurde die etwas dunkel gewordene Lösung unter vermindertem Druck konzentriert. Der resultierende Sirup wurde unter Rühren in Diethylether (2,5 Liter) gegossen. Das Produkt bildete einen Gummi. Der Ether wurde abdekantiert und der Rückstand wurde in einer minimalen Methanolmenge (etwa 400 ml) gelöst. Die Lösung wurde in frischen Ether gegossen, wobei ein steifer Gummi erhalten wurde. Der Ether wurde dekantiert und der Gummi wurde in einem Vakuumofen (60°C bei 1 mmHg für 24 Stunden) getrocknet, wobei ein Feststoff erhalten wurde, der zu einem hellgelben Pulver zerkleinert wurde (57 g, 85 Rohausbeute). Das NMR-Spektrum stimmte mit der Struktur überein und war mit Phenol als Natriumsalz verunreinigt (etwa 5 %). Das Material wurde als solches für weitere Reaktionen verwendet (oder es kann mittels Säulenchromatographie unter Verwendung eines Gradienten von Methanol in Ethylacetat (10 bis 25 %) gereinigt werden, wobei ein weißer Feststoff erhalten wird, Schmp.: 222–224°C).
2'-O-Methoxyethyl-5-methyluridin
2,2'-Anhydro-5-methyluridin (195 g, 0,81 M), Tris(2-methoxyethyl)borat (231 g, 0,98 M) und 2-Methoxyethanol (1,2 Liter) wurden in einen 2 Liter-Edelstahl-Druckbehälter eingebracht und dieser wurde in ein auf 160°C vorgeheiztes Ölbad eingesetzt. Nach 48-stündigem Erhitzen bei 155 bis 160°C wurde der Behälter geöffnet und die Lösung zur Trockne eingedampft und mit MeOH (200 ml) zerrieben. Der Rückstand wurde in heißem Aceton (1 Liter) suspen diert. Die unlöslichen Salze wurden abfiltriert, mit Aceton (150 ml) gewaschen und das Filtrat wurde eingedampft. Der Rückstand (280 g) wurde in CH₃CN (600 ml) gelöst und die Lösung wurde eingedampft. Eine Silicagelsäule (3 kg) wurde in CH₂Cl₂/Aceton/MeOH (20:5:3), das 0,5 % Et₃NH enthielt, gepackt. Der Rückstand wurde in CH₂Cl₂ (250 ml) gelöst und vor dem Aufbringen auf die Säule auf Silica (150 g) adsorbiert. Das Produkt wurde mit dem Packlösungsmittel eluiert, wobei 160 g (63 %) Produkt erhalten wurden. Zusätzliches Material wurde durch Aufarbeiten verunreinigter Fraktionen erhalten.
2'-O-Methoxyethyl-5'-O-dimethoxytrityl-5-methyluridin
2'-O-Methoxyethyl-5-methyluridin (160 g, 0,506 M) wurde zusammen mit Pyridin (250 ml) verdampft und der getrocknete Rückstand wurde in Pyridin (1,3 Liter) gelöst. Ein erstes Aliquot von Dimethoxytritylchlorid (94,3 g, 0,278 M) wurde zugesetzt und das Gemisch wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Ein zweites Aliquot von Dimethoxytritylchlorid (94,3 g, 0,278 M) wurde zugesetzt und das Reaktionsgemisch wurde eine weitere Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde Methanol (170 ml) zugesetzt, um die Reaktion zu beenden. Eine HPLC zeigte die Gegenwart von etwa 70 % Produkt. Das Lösungsmittel wurde verdampft und mit CH₃CN (200 ml) zerrieben. Der Rückstand wurde in CHCl₃ (1,5 Liter) gelöst und mit 2 × 500 ml gesättigter NaHCO₃-Lösung und 2 × 500 ml gesättigter NaCl-Lösung extrahiert. Die organische Phase wurde über Na₂SO₄ getrocknet, filtriert und eingedampft. Es wurden 275 g Rückstand erhalten. Der Rückstand wurde auf einer 3,5 kg-Silicagelsäule gereinigt, die mit EtOAc/Hexan/Aceton (5:5:1), das 0,5 % Et₃NH enthielt, gepackt und eluiert wurde. Die reinen Fraktionen wurden eingedampft, wobei 164 g Produkt erhalten wurden. Aus den verunreinigten Fraktionen wurden zusätzlich etwa 20 g erhalten, so dass eine Gesamtausbeute von 183 g (57 %) erhalten wurde.
3'-O-Acetyl-2'-O-methoxyethyl-5'-O-dimethoxytrityl-5-methyluridin
2'-O-Methoxyethyl-5'-O-dimethoxytrityl-5-methyluridin (106 g, 0,167 M), DMF/Pyridin (750 ml eines 3:1-Gemischs, das aus 562 ml DMF und 188 ml Pyridin hergestellt worden ist) und Essigsäureanhydrid (24,38 ml, 0,258 M) wurden vereinigt und 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktion wurde mittels DC durch zuerst Quenchen der DC-Probe durch die Zugabe von MeOH überwacht. Nach dem Ende der Reaktion gemäß DC wurde MeOH (50 ml) zugesetzt und das Gemisch wurde bei 35°C eingedampft. Der Rückstand wurde in CHCl₃ (800 ml) gelöst und mit 2 × 200 ml gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung und 2 × 200 ml gesättigter NaCl-Lösung extrahiert. Die Wasserschichten wurden mit 200 ml CHCl₃ rückextrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit Natriumsulfat getrocknet und eingedampft, wobei 122 g eines Rückstands erhalten wurden (etwa 90 % Produkt). Der Rückstand wurde auf einer 3,5 kg-Silicagelsäule gereinigt und unter Verwendung von EtOAc/Hexan (4:1) eluiert. Reine Produktfraktionen wurden eingedampft, wobei eine Ausbeute von 96 g (84 %) erhalten wurde. Zusätzliche 1,5 g wurden aus späteren Fraktionen gewonnen.
3'-O-Acetyl-2'-O-methoxyethyl-5'-O-dimethoxytrityl-5-methyl-4-triazoluridin
Eine erste Lösung wurde durch Lösen von 3'-O-Acetyl-2'-O-methoxyethyl-5'-O-dimethoxytrityl-5-methyluridin (96 g, 0,144 M) in CH₃CN (700 ml) hergestellt und die Lösung wurde beiseite gestellt. Triethylamin (189 ml, 1,44 M) wurde einer Lösung von Triazol (90 g, 1,3 M) in CH₃CN (1 Liter) zugesetzt, auf –5°C gekühlt und unter Verwendung eines Rührwerks von oben 0,5 Stunden gerührt. POCl₃ wurde tropfenweise während eines Zeitraums von 30 min der bei 0 bis 10°C gehaltenen Lösung zugesetzt und das resultierende Gemisch wurde zusätzliche 2 Stunden gerührt. Die erste Lösung wurde tropfenweise während eines Zeitraums von 45 min der letztgenannten Lösung zugesetzt. Das resultierende Reaktionsgemisch wurde über Nacht in einem kalten Raum gelagert. Salze wurden von dem Reaktionsgemisch abfiltriert und die Lösung wurde eingedampft. Der Rückstand wurde in EtOAc (1 Liter) gelöst und die unlöslichen Feststoffe wurden mittels Filtration entfernt. Das Filtrat wurde mit 1 × 300 ml NaHCO₃-Lösung und 2 × 300 ml gesättigter NaCl-Lösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wurde mit EtOAc zerrieben, wobei die Titelverbindung erhalten wurde.
2'-O-Methoxyethyl-5'-O-dimethoxytrityl-5-methylcytidin
Eine Lösung von 3'-O-Acetyl-2'-O-methoxyethyl-5'-O-dimethoxytrityl-5-methyl-4-triazoluridin (103 g, 0,141 M) in Dioxan (500 ml) und NH₄OH (30 ml) wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Dioxanlösung wurde eingedampft und der Rückstand wurde mit MeOH (2 × 200 ml) azeotrop behandelt. Der Rückstand wurde in MeOH (300 ml) gelöst und in einen 2-Liter-Edelstahl-Druckbehälter überführt. MeOH (400 ml), das mit NH₃-Gas gesättigt worden ist, wurde zugesetzt und der Behälter wurde 2 Stunden auf 100°C erhitzt (ein DC zeigte eine vollständige Umwandlung). Der Behälterinhalt wurde zur Trockne eingedampft und der Rückstand wurde in EtOAc (500 ml) gelöst und einmal mit gesättigter NaCl-Lösung (200 ml) gewaschen. Die organische Schicht wurde über Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel wurde verdampft, wobei 85 g (95 %) der Titelverbindung erhalten wurden.
N4-Benzoyl-2'-O-methoxyethyl-5'-O-dimethoxytrityl-5-methylcytidin
2'-O-Methoxyethyl-5'-O-dimethoxytrityl-5-methylcytidin (85 g, 0,134 M) wurde in DMF (800 ml) gelöst und Benzoesäureanhydrid (37,2 g, 0,165 M) wurde unter Rühren zugesetzt. Nach 3 Stunden Rühren zeigte ein DC, dass die Reaktion etwa zu 95 % abgeschlossen war. Das Lösungsmittel wurde verdampft und der Rückstand wurde mit MeOH (200 ml) azeotrop behandelt. Der Rückstand wurde in CHCl₃ (700 ml) gelöst und mit gesättigter NaHCO₃-Lösung (2 × 300 ml) und gesättigter NaCl-Lösung (2 × 300 ml) extrahiert, über MgSO₄ getrocknet und die Lösung wurde eingedampft, wobei ein Rückstand erhalten wurde (96 g). Der Rückstand wurde auf einer 1,5 kg-Silicasäule unter Verwendung von EtOAc/Hexan (1:1), das 0,5 % Et₃NH enthielt, als Elutionslösungsmittel chromatographiert. Die reinen Produktfraktionen wurden eingedampft, wobei 90 g (90 %) der Titelverbindung erhalten wurden.
N4-Benzoyl-2'-O-methoxyethyl-5'-O-dimethoxytrityl-5-methylcytidin-3'-amidit
N4-Benzoyl-2'-O-methoxyethyl-5'-O-dimethoxytrityl-5-methylcytidin (74 g, 0,10 M) wurde in CH₂Cl₂ (1 Liter) gelöst. Tetrazoldiisopropylamin (7,1 g) und 2-Cyanoethoxytetra(isopropyl)phosphit (40,5 ml, 0,123 M) wurden unter Rühren unter einer Stickstoffatmosphäre zugesetzt. Das resultierende Gemisch wurde 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt (ein DC zeigte, dass die Reaktion zu 95 % abgeschlossen war). Das Reaktionsgemisch wurde mit gesättigter NaHCO₃-Lösung (1 × 300 ml) und gesättigter NaCl-Lösung (3 × 300 ml) extrahiert. Die wässrigen Waschlösungen wurden mit CH₂Cl₂ (300 ml) rückextrahiert und die Extrakte wurden vereinigt, über MgSO₄ getrocknet und konzentriert. Der erhaltene Rückstand wurde auf einer 1,5 kg-Silicasäule unter Verwendung von EtOAc/Hexan (3:1) als Elutionslösungsmittel chromatographiert. Die reinen Fraktionen wurden vereinigt, wobei 90,6 g (87 %) der Titelverbindung erhalten wurden.
2'-O-(Aminooxyethyl)-Nukleosidamidite und 2'-O-(Dimethylaminooxyethyl)-Nukleosidamidite
2'-(Dimethylaminooxyethoxy)-Nukleosidamidite
2'-(Dimethylaminooxyethoxy)-Nukleosidamidite (die in dem Fachgebiet auch als 2'-O-(Dimethylaminooxyethyl)-Nukleosidamidite bekannt sind) wurden gemäß der folgenden Beschreibung hergestellt. Adenosin-, Cytidin- und Guanosin-Nukleosidamidite werden entsprechend dem Thymidin (5-Methyluridin) hergestellt, jedoch werden die exocyclischen Amine im Fall von Adenosin und Cytidin mit einem Benzoylrest und im Fall von Guanosin mit Isobutyryl geschützt.
5'-O-tert-Butyldiphenylsilyl-O²-2'-anhydro-5-methyluridin
O²-2'-Anhydro-5-methyluridin (Pro. Bio. Sint., Varese, Italien, 100,0 g, 0,416 mmol) und Dimethylaminopyridin (0,66 g, 0,013 Äqu., 0,0054 mmol) wurden bei Umgebungstemperatur unter einer Argonatmosphäre und unter mechanischem Rühren in trockenem Pyridin (500 ml) gelöst. tert-Butyldiphenylchlorsilan (125,8 g, 119,0 ml, 1,1 Äqu., 0,458 mmol) wurde in einer Portion zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 16 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Ein DC (Rf 0,22, Ethylacetat) zeigte eine vollständige Reaktion. Die Lösung wurde unter vermindertem Druck zu einem dickflüssigen Öl konzentriert. Dieses wurde zwischen Dichlormethan (1 Liter) und gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung (2 × 1 Liter) und Kochsalzlösung (1 Liter) verteilt. Die organische Schicht wurde über Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck zu einem dickflüssigen Öl konzentriert. Das Öl wurde in einem 1:1-Gemisch von Ethylacetat und Ethylether (600 ml) gelöst und die Lösung wurde auf –10°C gekühlt. Das resultierende kristalline Produkt wurde mittels Filtration gesammelt, mit Ethylether (3 × 200 ml) gewaschen und getrocknet (40°C, 1 mm Hg, 24 Stunden), wobei 149 g (74,8 %) eines weißen Feststoffs erhalten wurden. Ein DC und ein NMR waren mit einem reinen Produkt konsistent.
5'-O-tert-Butyldiphenylsilyl-2'-O-(2-hydroxyethyl)-5-methyluridin
In einen nicht gerührten 2 Liter-Edelstahl-Druckreaktor wurde Boran in Tetrahydrofuran (1,0 M, 2,0 Äqu., 622 ml) eingebracht. Im Abzug und unter manuellem Rühren wurde Ethylenglykol (350 ml, Überschuss) zunächst vorsichtig zugegeben, bis die Entwicklung von Wasserstoffgas endete. 5'-O-tert-Butyldiphenylsilyl-O²-2'-anhydro-5-methyluridin (149 g, 0,311 mol) und Natriumhydrogencarbonat (0,074 g, 0,003 Äqu.) wurden unter manuellem Rühren zugesetzt. Der Reaktor wurde verschlossen und in einem Ölbad erhitzt, bis eine Innentemperatur von 160°C erreicht wurde, die dann für 16 Stunden gehalten wurde (Druck < 100 psig). Der Reaktionsbehälter wurde auf Umgebungstemperatur gekühlt und geöffnet. Ein DC (Rf 0,67 für das gewünschte Produkt und Rf 0,82 für das ara-T-Nebenprodukt, Ethylacetat) zeigte eine etwa 70 %ige Umwandlung in das Produkt. Um die Bildung weiterer Nebenprodukte zu vermeiden, wurde die Reaktion beendet, und das Reaktionsgemisch wurde unter vermindertem Druck (10 bis 1 mm Hg) in einem warmen Wasserbad (40 bis 100°C) konzentriert, wobei die extremeren Bedingungen zur Entfernung des Ethylenglykols eingesetzt wurden. [Alternativ kann, sobald das niedrigsiedende Lösungsmittel entfernt worden ist, die verbleibende Lösung zwischen Ethylacetat und Wasser verteilt werden. Das Produkt wird stärker in der organischen Phase vorliegen.] Der Rückstand wurde mittels Säulenchromatographie gereinigt (2 kg Silicagel, Ethylacetat-Hexane-Gradient 1:1 bis 4:1). Die geeigneten Fraktionen wurden vereinigt, abgestrippt und getrocknet, wobei das Produkt als weißer brüchiger Schaum (84 g, 50 %), verunreinigtes Ausgangsmaterial (17,4 g) und 20 g reines wieder verwendbares Ausgangsmaterial erhalten wurden. Die Ausbeute bezogen auf das Ausgangsmaterial, vermindert um das reine rückgewonnene Ausgangsmaterial, betrug 58 %. Ein DC und ein NMR waren mit 99 % reinem Produkt konsistent.
2'-O-([2-Phthalimidoxy)ethyl]-5'-t-butyldiphenylsilyl-5-methyluridin
5'-O-tert-Butyldiphenylsilyl-2'-O-(2-hydroxyethyl)-5-methyluridin (20 g, 36,98 mmol) wurde mit Triphenylphosphin (11,63 g, 44,36 mmol) und N-Hydroxyphthalimid (7,24 g, 44,36 mmol) gemischt. Das Gemisch wurde dann über P₂O₅ unter Hochvakuum für 2 Tage bei 40°C getrocknet. Das Reaktionsgemisch wurde mit Argon gespült und trockenes THF (369,8 ml, Aldrich, Sure-Seal-Flasche) wurde zugesetzt, wobei eine klare Lösung erhalten wurde. Diethylazodicarboxylat (6,98 ml, 44,36 mmol) wurde dem Reaktionsgemisch tropfenweise zugesetzt. Die Zugabegeschwindigkeit wurde derart aufrechterhalten, dass die resultierende tiefrote Färbung vor der Zugabe des nächsten Tropfens gerade verschwand. Nach der vollständigen Zugabe wurde das Reaktionsgemisch 4 Stunden gerührt. Danach zeigte ein DC die Vollständigkeit der Reaktion (Ethylacetat:Hexan, 60:40). Das Lösungsmittel wurde im Vakuum verdampft. Der erhaltene Rückstand wurde auf eine Flashsäule aufgebracht und mit Ethylacetat:Hexan (60:40) eluiert, wobei 2'-O-([2-Phthalimidoxy)ethyl]-5'-t-butyldiphenylsilyl-5-methyluridin als weißer Schaum erhalten wurde (21,819 g, 86 %).
5'-O-tert-Butyldiphenylsilyl-2'-O-[(2-formadoximinooxy)ethyl]-5-methyluridin
2'-O-([2-Phthalimidoxy)ethyl]-5'-t-butyldiphenylsilyl-5-methyluridin (3,1 g, 4,5 mmol) wurde in trockenem CH₂Cl₂ (4,5 ml) gelöst und Methylhydrazin (300 ml, 4,64 mmol) wurde tropfenweise bei –10°C bis 0°C zugesetzt. Nach 1 Stunde wurde das Gemisch filtriert, das Filtrat wurde mit eiskaltem CH₂Cl₂ gewaschen und die vereinigten organischen Phasen wurden mit Wasser und Kochsalzlösung gewaschen und über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet. Die Lösung wurde konzentriert, um 2-O-(Aminooxyethyl)thymidin zu erhalten, das dann in MeOH (67,5 ml) gelöst wurde. Dieser Lösung wurde Formaldehyd (20 %ige wässrige Lösung, w/w, 1,1 Äqu.) zugesetzt und das resultierende Gemisch wurde 1 Stunde gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand wurde chromatographiert, wobei 5'-O-tert-Butyldiphenylsilyl-2'-O-[(2-formadoximinooxy)ethyl]-5-methyluridin als weißer Schaum erhalten wurde (1,95 g, 78 %).
5'-O-tert-Butyldiphenylsilyl-2'-O-(N,N-dimethylaminooxyethyl]-5-methyluridin
5'-O-tert-Butyldiphenylsilyl-2'-O-[(2-formadoximinooxy)ethyl]-5-methyluridin (1,77 g, 3,12 mmol) wurde in einer Lösung von 1 M Pyridinium-p-toluolsulfonat (PPTS) in trockenem MeOH (30,6 ml) gelöst. Natriumcyanoborhydrid (0,39 g, 6,13 mmol) wurde dieser Lösung bei 10°C unter einer inerten Atmosphäre zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 10 min bei 10°C gerührt. Danach wurde der Reaktionsbehälter aus dem Eisbad entfernt und 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und die Reaktion wurde mittels DC überwacht (5 % MeOH in CH₂Cl₂). Es wurde eine wässrige NaHCO₃-Lösung (5 %, 10 ml) zugesetzt und es wurde mit Ethylacetat (2 × 20 ml) extrahiert. Die Ethylacetatphase wurde über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde in einer Lösung von 1 M PPTS in MeOH (30,6 ml) gelöst. Formaldehyd (20 % w/w, 30 ml, 3,37 mmol) wurde zugesetzt und das Reaktionsgemisch wurde 10 min bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde in einem Eisbad auf 10°C gekühlt, Natriumcyanoborhydrid (0,39 g, 6,13 mmol) wurde zugesetzt und das Reaktionsgemisch wurde 10 min bei 10°C gerührt. Nach 10 min wurde das Reaktionsgemisch aus dem Eisbad entfernt und 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Dem Reaktionsgemisch wurde 5 %ige NaHCO₃-Lösung (25 ml) zugesetzt und es wurde mit Ethylacetat (2 × 25 ml) extrahiert. Die Ethylacetatschicht wurde über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und zur Trockne eingedampft. Der erhaltene Rückstand wurde mittels Flashsäulenchromatographie gereinigt und mit 5 % MeOH in CH₂Cl₂ eluiert, wobei 5'-O-tert-Butyldiphenylsilyl-2'-O-[N,N-dimethylaminooxyethyl]-5-methyluridin als weißer Schaum erhalten wurde (14,6 g, 80 %).
2'-O-(Dimethylaminooxyethyl)-5-methyluridin
Triethylamintrihydrofluorid (3,91 ml, 24,0 mmol) wurde in trockenem THF und Triethylamin (1,67 ml, 12 mmol, trocken, über KOH aufbewahrt) gelöst. Dieses Gemisch aus Triethylamin-2HF wurde dann 5'-O-tert-Butyldiphenylsilyl-2'-O-[N,N-dimethylaminooxyethyl]-5-methyluridin (1,40 g, 2,4 mmol) zugesetzt und es wurde 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mittels DC (5 % MeOH in CH₂Cl₂) überwacht. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand wurde auf eine Flashsäule aufgebracht und mit 10 % MeOH in CH₂Cl₂ eluiert, wobei 2'-O-(Dimethylaminooxyethyl)-5-methyluridin (766 mg, 92,5 %) erhalten wurde.
5'-O-DMT-2'-O-(dimethylaminooxyethyl)-5-methyluridin
2'-O-(Dimethylaminooxyethyl)-5-methyluridin (750 mg, 2,17 mmol) wurde über P₂O₅ unter Hochvakuum über Nacht bei 40°C getrocknet. Es wurde dann zusammen mit wasserfreiem Pyridin (20 ml) eingedampft. Der erhaltene Rückstand wurde unter einer Argonatmosphäre in Pyridin (11 ml) gelöst. 4-Dimethylaminopyridin (26,5 mg, 2,60 mmol) und 4,4'-Dimethoxytritylchlorid (880 mg, 2,60 mmol) wurden dem Gemisch zugesetzt und das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur gerührt, bis das gesamte Ausgangsmaterial verschwunden war. Das Pyridin wurde unter Vakuum entfernt und der Rückstand wurde mit 10 % MeOH in CH₂Cl₂ (das wenige Tropfen Pyridin enthielt) chromatographiert und eluiert, wobei 5'-O-DMT-2'-O-(dimethylaminooxyethyl)-5-methyluridin (1,13 g, 80 %) erhalten wurde.
5'-O-DMT-2'-O-(2-N,N-dimethylaminooxyethyl)-5-methyluridin-3'-[(2-cyanoethyl)-N,N-diisopropylphosphoramidit]
5'-O-DMT-2'-O-(dimethylaminooxyethyl)-5-methyluridin (1,08 g, 1,67 mmol) wurde zusammen mit Toluol (20 ml) eingedampft. Dem Rückstand wurde N,N-Diisopropylamintetrazonid (0,29 g, 1,67 mmol) zugesetzt und das Gemisch wurde über P₂O₅ unter Hochvakuum über Nacht bei 40°C getrocknet. Dann wurde das Reaktionsgemisch in wasserfreiem Acetonitril (8,4 ml) gelöst und 2-Cyanoethyl-N,N,N¹,N¹-tetraisopropylphosphoramidit (2,12 ml, 6,08 mmol) wurde zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 4 Stunden unter einer inerten Atmosphäre bei Umgebungstemperatur gerührt. Der Reaktionsfortschritt wurde mittels DC (Hexan:Ethylacetat 1:1) überwacht. Das Lösungsmittel wurde verdampft und dann wurde der Rückstand in Ethylacetat (70 ml) gelöst und mit 5 %iger wässriger NaHCO₃-Lösung (40 ml) gewaschen. Die Ethylacetatschicht wurde über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und konzentriert. Der erhaltene Rückstand wurde chromatographiert (Ethylacetat als Elutionsmittel), wobei 5'-O-DMT-2'-O-(2-N,N-dimethylaminooxyethyl)-5-methyluridin-3'-[(2-cyanoethyl)-N,N-diisopropylphosphoramidit] als Schaum erhalten wurde (1,04 g, 74,9 %).
2'-(Aminooxyethoxy)nukleosidamidite
2'-(Aminooxyethoxy)nukleosidamidite (in dem Fachgebiet auch als 2'-O-(Aminooxyethyl)nukleosidamidite bekannt) werden gemäß der folgenden Beschreibung hergestellt. Adenosin-, Cytidin- und Thymidinnukleosidamidite werden entsprechend hergestellt.
N2-Isobutyryl-6-O-diphenylcarbamoyl-2'-O-(2-ethylacetyl)-5'-O-(4,4'-di methoxytrityl)guanosin-3'-[(2-cyanoethyl)-N,N-diisopropylphosphoramidit]
Das 2'-O-Aminooxyethylguanosin-Analogon kann durch eine selektive 2'-O-Alkylierung von Diaminopurinribosid erhalten werden. Multigrammmengen von Diaminopurinribosid können von der Schering AG (Berlin) erworben werden, um 2'-O-(2-Ethylacetyl)diaminopurinribosid zusammen mit einer geringeren Menge des 3'-O-Isomers bereitzustellen. 2'-O-(2-Ethylacetyl)diaminopurinribosid kann durch Behandeln mit Adenosindeaminase abgetrennt und in 2'-O-(2-Ethylacetyl)guanosin umgewandelt werden (D.P.C. McGee, P.D. Cook, C.J. Guinosso, WO 94/02501 A1 940203). Standardschutzverfahren führen zu 2'-O-(2-Ethylacetyl)-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)guanosin und 2-N-Isobutyryl-6-O-diphenylcarbamoyl-2'-O-(2-ethylacetyl)-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)guanosin, das reduziert werden kann, um 2-N-Isobutyryl-6-O-diphenylcarbamoyl-2'-O-(2-ethylacetyl)-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)guanosin bereitzustellen. Wie vorher kann die Hydroxylgruppe mittels einer Mitsunobu-Reaktion durch N-Hydroxyphthalimid substituiert werden, und das geschützte Nukleosid kann in üblicher Weise phosphityliert werden, wobei N2-Isobutyryl-6-O-diphenylcarbamoyl-2'-O-(2-ethylacetyl)-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)guanosin-3'-[(2-cyanoethyl)-N,N-diisopropylphosphoramidit]erhalten wird.
2'-Dimethylaminoethoxyethoxy-Nukleosidamidite(2'-DMAEOE-Nukleosidamidite)
2'-Dimethylaminoethoxyethoxy-Nukleosidamidite (die in dem Fachgebiet auch als 2'-O-Dimethylaminoethoxyethyl-, d.h. 2'-O-CH₂-O-CH₂-N(CH₂)₂-, oder 2'-DMAEOE-Nukleosidamidite bekannt sind) werden wie folgt hergestellt. Andere Nukleosidamidite werden entsprechend hergestellt.
2'-O-[2(2-N,N,-Dimethylaminoethoxy)ethyl]-5-methyluridin
2[2-(Dimethylamino)ethoxy]ethanol (Aldrich, 6,66 g, 50 mmol) wird langsam unter Rühren in einer 100 ml-Bombe einer Lösung von Boran in Tetrahydrofuran (1 M, 10 ml, 10 mmol) zugesetzt. Während der Auflösung des Feststoffs entwickelt sich Wasserstoffgas. O²-2'-Anhydro-5-methyluridin (1,2 g, 5 mmol) und Natriumhydrogencarbonat (2,5 mg) werden zugesetzt und die Bombe wird verschlossen, in ein Ölbad eingebracht und 26 Stunden auf 155°C erhitzt. Die Bombe wird auf Raumtemperatur abgekühlt und geöffnet. Die rohe Lösung wird konzentriert und der Rückstand zwischen Wasser (200 ml) und Hexanen (200 ml) verteilt. Das überschüssige Phenol wird in die Hexanschicht extrahiert. Die wässrige Schicht wird mit Ethylacetat (3 × 200 ml) extrahiert und die vereinigten organischen Schichten werden einmal mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und konzentriert. Der Rückstand wird einer Säulenchromatographie mit Silicagel unter Verwendung von Methanol/Methylenchlorid 1:20 (das 2 % Triethylamin aufweist) als Elutionsmittel unterworfen. Wenn die Säulenfraktionen konzentriert werden, bildet sich ein farbloser Feststoff, der gesammelt wird, wobei die Titelverbindung als weißer Feststoff erhalten wird.
5'-O-Dimethoxytrityl-2'-O-[2(2-N,N-dimethylaminoethoxy)ethyl)]-5-methyluridin
0,5 g (1,3 mmol) 2'-O-[2(2-N,N-dimethylaminoethoxy)ethyl)]-5-methyluridin in wasserfreiem Pyridin (8 ml) werden Triethylamin (0,36 ml) und Dimethoxytritylchlorid (DMT-Cl, 0,87 g, 2 Äqu.) zugesetzt und es wird 1 Stunde gerührt. Das Reaktionsgemisch wird in Wasser (200 ml) gegossen und mit CH₂Cl₂ (2 × 200 ml) extrahiert. Die vereinigten CH₂Cl₂-Schichten werden mit gesättigter NaHCO₃-Lösung und anschließend mit gesättigter NaCl-Lösung gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Das Verdampfen des Lösungsmittels und eine anschließende Silicagelchromatographie unter Verwendung von MeOH:CH₂Cl₂:Et₃N (20:1, v/v, mit 1 % Triethylamin) ergibt die Titelverbindung.
5'-O-Dimethoxytrityl-2'-O-[2(2-N,N-dimethylaminoethoxy)ethyl)]-5-methyluridin-3 '-O-(cyanoethyl-N,N-diisopropyl)phosphoramidit
Diisopropylaminotetrazolid (0,6 g) und 2-Cyanoethoxy-N,N-diisopropylphosphoramidit (1,1 ml, 2 Äqu.) werden einer Lösung von 5'-O-Dimethoxytrityl-2'-O-[2(2-N,N-dimethylaminoethoxy)ethyl)]-5-methyluridin (2,17 g, 3 mmol), das in CH₂Cl₂ (20 ml) gelöst ist, unter einer Argonatmosphäre zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird über Nacht gerührt und das Lösungsmittel wird verdampft. Der resultierende Rückstand wird mittels Silicagel-Flashsäulenchromatographie mit Ethylacetat als Elutionsmittel gereinigt, wobei die Titelverbindung erhalten wird.
Beispiel 2
Oligonukleotidsynthese
Unsubstituierte und substituierte Phosphodiester-Oligonukleotide (P=O-Oligonukleotide) werden auf einem automatisierten DNA-Synthesizer (Applied Biosystems Modell 380B) unter Verwendung von Standard-Phosphoramiditchemie mit Oxidation durch Iod synthetisiert.
Phosphorothioate (P=S) werden wie die Phosphodiesteroligonukleotide synthetisiert, mit der Ausnahme, dass die Standard-Oxidationsflasche durch eine 0,2 M-Lösung von 3H-1,2-Benzodithiol-3-on-1,1-dioxid in Acetonitril für die schrittweise Schwefelung der Phosphitbindungen ersetzt wurde. Der Schwefelungswarteschritt wurde auf 68 s verlängert und nach diesem folgte der Capping-Schritt. Nach der Abspaltung von der CPG-Säule und dem Entschützen in konzentriertem Ammoniumhydroxid bei 55°C (18 Stunden) wurden die Oligonukleotide durch zweimaliges Ausfällen mit 2,5 Volumina Ethanol aus einer 0,5 M NaCl- Lösung gereinigt. Phosphinatoligonukleotide werden gemäß der Beschreibung in dem US-Patent 5,508,270, das unter Bezugnahme einbezogen wird, hergestellt.
Alkylphosphonatoligonukleotide werden gemäß der Beschreibung in dem US-Patent 4,469,863, das unter Bezugnahme einbezogen wird, hergestellt.
3'-Desoxy-3'-methylenphosphonatoligonukleotide werden gemäß der Beschreibung in den US-Patenten 5,610,289 oder 5,625,050, die unter Bezugnahme einbezogen werden, hergestellt.
Phosphoramiditoligonukleotide werden gemäß der Beschreibung im US-Patent 5,256,775 oder im US-Patent 5,366,878, die unter Bezugnahme einbezogen werden, hergestellt.
Alkylphosphonothioatoligonukleotide werden gemäß der Beschreibung in den veröffentlichten PCT-Anmeldungen PCT/US94/00902 und PCT/US93/06976 (als WO 94/17093 bzw. WO 94/02499 veröffentlicht), die unter Bezugnahme einbezogen werden, hergestellt.
3'-Desoxy-3'-aminophosphoramidatoligonukleotide werden gemäß der Beschreibung in dem US-Patent 5,476,925, das unter Bezugnahme einbezogen wird, hergestellt.
Phosphotriesteroligonukleotide werden gemäß der Beschreibung in dem US-Patent 5,023,243, das unter Bezugnahme einbezogen wird, hergestellt.
Boranophosphatoligonukleotide werden gemäß der Beschreibung in den US-Patenten 5,130,302 und 5,177,198, die beide unter Bezugnahme einbezogen werden, hergestellt.
Beispiel 3
Oligonukleosidsynthese
Methylenmethylimino-verknüpfte Oligonukleoside, die auch als MMI-verknüpfte Oligonukleoside bezeichnet werden, Methylendimethylhydrazo-verknüpfte Oligonukleoside, die auch als MDH-verknüpfte Oligonukleoside bezeichnet werden, und Methylencarbonylaminoverknüpfte Oligonukleoside, die auch als Amid-3-verknüpfte Oligonukleoside bezeichnet werden, und Methylenaminocarbonyl-verknüpfte Oligonukleoside, die auch als Amid-4-verknüpfte Oligonukleoside bezeichnet werden, sowie Verbindungen mit gemischtem Grundgerüst, die z.B. alternierende MMI- und P=O- oder P=S-Bindungen aufweisen, werden ge mäß der Beschreibung in den US-Patenten 5,378,825, 5,386,023, 5,489,677, 5,602,240 und 5,610,289, die alle unter Bezugnahme einbezogen werden, hergestellt.
Formacetal- und Thioformacetal-verknüpfte Oligonukleoside werden gemäß der Beschreibung in den US-Patenten 5,264,562 und 5,264,564, die unter Bezugnahme einbezogen werden, hergestellt.
Ethylenoxid-verknüpfte Oligonukleoside werden gemäß der Beschreibung in dem US-Patent 5,223,618, das unter Bezugnahme einbezogen wird, hergestellt.
Beispiel 4
PNA-Synthese
Peptidnukleinsäuren (PNA's) werden gemäß einem beliebigen der Verfahren hergestellt, die in Peptide Nucleic Acids (PNA): Synthesis, Properties and Potential Applications, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 1996, 4, 5–23, beschrieben sind. Sie können auch gemäß den US-Patenten 5,539,082, 5,700,922 und 5,719,262, die unter Bezugnahme einbezogen werden, hergestellt werden.
Beispiel 5
Synthese von chimären Oligonukleotiden
Bei chimären Oligonukleotiden, Oligonukleosiden oder gemischten Oligonukleotiden/Oligonukleosiden der Erfindung kann es sich um mehrere verschiedenartige Typen handeln. Diese umfassen einen ersten Typ, bei dem das „Gap"-Segment verknüpfter Nukleoside zwischen den 5'- und 3'-„Wing"-Segmenten verknüpfter Nukleoside angeordnet ist, und einen zweiten Typ mit „offenem Ende", bei dem das „Gap"-Segment entweder an dem 3'- oder dem 5'-Ende der oligomeren Verbindung angeordnet ist. Oligonukleotide des ersten Typs sind in dem Fachgebiet auch als „Gapmere" oder Gapped-Oligonukleotide bekannt. Oligonukleotide des zweiten Typs sind in dem Fachgebiet auch als „Hemimere" oder „Wingmere" bekannt.
Chimäre [2'-O-Me]--[2'-desoxy]--[2'-O-Me]-Phosphorothioat-Oligonukleotide
Chimäre Oligonukleotide mit 2'-O-Alkylphosphorothioat- und 2'-Desoxyphosphorothioat-Oligonukleotidsegmenten werden wie oben unter Verwendung eines automatisierten DNA-Synthesizers Modell 380B von Applied Biosystems synthetisiert. Oligonukleotide werden mit dem automatisierten Synthesizer und 2'-Desoxy-5'-dimethoxytrityl-3'-O-phosphoramidit für den DNA-Teil und 5'-Dimethoxytrityl-2'-O-methyl-3'-O-phosphoramidit für 5'- und 3'-Wings synthetisiert. Der Standardsynthesezyklus wird durch Verlängern des Warteschritts nach der Abgabe von Tetrazol und Base auf 600 s, der für RNA viermal und für 2'-O-Methyl zweimal wiederholt wird, modifiziert. Das vollständig geschützte Oligonukleotid wird von dem Träger abgespalten und die Phosphatgruppe wird bei Raumtemperatur über Nacht in 3:1 Ammoniak/Ethanol entschützt und dann zur Trockne lyophilisiert. Dann wird eine Behandlung in methanolischem Ammoniak für 24 Stunden bei Raumtemperatur duchgeführt, um alle Basen zu entschützen, und die Probe wird erneut zur Trockne lyophilisiert. Das Pellet wird in 1 M TBAF in THF für 24 Stunden bei Raumtemperatur resuspendiert, um die 2'-Positionen zu entschützen. Die Reaktion wird dann mit 1 M TEAA gequencht und die Probe wird dann mittels eines Rotovac auf die Hälfte des Volumens vermindert, bevor sie auf einer G25-Größenausschlusssäule entsalzt wird. Das gewonnene Oligonukleotid wird dann bezüglich der Ausbeute und der Reinheit mittels Kapillarelektrophorese und mittels Massenspektrometrie spektrophotometrisch analysiert.
Chimäre [2'-O-(2-Methoxyethyl)]--[2'-desoxy]--[2'-O-(methoxyethyl)]-Phosphorothioat-Oligonukleotide
Chimäre [2'-O-(2-Methoxyethyl)]--[2'-desoxy]--[2'-O-(methoxyethyl)]-Phosphorothioat-Oligonukleotide wurden mit dem vorstehenden Verfahren für das chimäre 2'-O-Methyloligonukleotid hergestellt, wobei die 2'-O-Methylamidite durch 2'-O-(Methoxyethyl)amidite ersetzt wurden.
Chimäre [2'-O-(2-Methoxyethyl)phosphodiester]--[2'-desoxyphosphorothioat]--[2'-O-(2-methoxyethyl)phosphodiester]-Oligonukleotide
Chimäre [2'-O-(2-Methoxyethyl)phosphodiester]--[2'-desoxyphosphorothioat]--[2'-O-(methoxyethyl)phosphodiester]-Oligonukleotide wurden mit dem vorstehenden Verfahren für das chimäre 2'-O-Methyloligonukleotid hergestellt, wobei die 2'-O-Methylamidite durch 2'-O-(Methoxyethyl)amidite ersetzt wurden, eine Oxidation mit Iod zur Erzeugung der Phosphodiester-Internukleotidverknüpfungen innerhalb der Wing-Abschnitte der chimären Strukturen und eine Schwefelung unter Verwendung von 3,H-1,2-Benzodithiol-3-on-1,1-dioxid(Beaucage-Reagenz) zur Erzeugung der Phosphorothioat-Internukleotidverknüpfungen für das zentrale Gap durchgeführt wurden.
Andere chimäre Oligonukleotide, chimäre Oligonukleoside und gemischte Chimäre Oligonukleotide/Oligonukleoside werden gemäß dem US-Patent 5,623,065, das unter Bezugnahme einbezogen wird, synthetisiert.
Beispiel 6
Oligonukleotidisolierung
Nach der Abspaltung von der Controlled Pore Glass-Säule (Applied Biosystems) und Entschützen in konzentriertem Ammoniumhydroxid bei 55°C für 18 Stunden werden die Oligonukleotide oder Oligonukleoside durch zweimaliges Ausfällen aus 0,5 M NaCl mit 2,5 Volumina Ethanol gereinigt. Synthetisierte Oligonukleotide wurden mittels Polyacrylamid-Gelelektrophorese auf denaturierenden Gelen analysiert und so beurteilt, dass es sich um mindestens 85 % des Volllängenmaterials handelt. Die relativen Mengen von Phosphorothioat- und Phosphodiesterverknüpfungen, die bei der Synthese erhalten worden sind, wurden mittels ³¹P-NMR-Spektroskopie periodisch geprüft und für einige Studien wurden Oligonukleotide mittels HPLC gereinigt, wie es von Chiang et al., J. Biol. Chem. 1991, 266, 18162–18171 beschrieben worden ist. Die mit HPLC-gereinigtem Material erhaltenen Ergebnisse waren denjenigen ähnlich, die mit nicht-HPLC-gereinigtem Material erhalten worden sind.
Beispiel 7
Oligonukleotidsynthese – 96-Well-Plattenformat
Oligonukleotide wurden mittels Festphasen-P(III)-Phosphoramiditchemie auf einem automatisierten Synthesizer synthetisiert, der 96 Sequenzen gleichzeitig in einem 96-Well-Standardformat synthetisieren konnte. Phosphodiester-Internukleotidbindungen wurden durch Oxidation mit wässrigem Iod erhalten. Phosphorothioat-Internukleotidbindungen wurden mittels Schwefelung unter Verwendung von 3,H-1,2-Benzodithiol-3-on-1,1-dioxid (Beaucage-Reagenz) in wasserfreiem Acetonitril erzeugt. Base-geschützte beta-Cyanoethyldiisopropyl-Standard-Phosphoramidite wurden von kommerziellen Erzeugern erworben (z.B. PE-Applied Biosystems, Foster City, CA, oder Pharmacia, Piscataway, NJ). Nicht-Standard-Nukleoside werden gemäß bekannter Literaturverfahren oder patentierter Verfahren synthetisiert. Sie werden als Base-geschützte beta-Cyanoethyldiisopropylphos-phoramidite verwendet.
Oligonukleotide wurden vom Träger abgespalten und mit konzentriertem NH₄OH bei erhöhter Temperatur (55 bis 60°C) für 12 bis 16 Stunden entschützt und das freigesetzte Produkt wurde dann unter Vakuum getrocknet. Das getrocknete Produkt wurde dann in sterilem Wasser resuspendiert, um eine Masterplatte zu erhalten, von der alle analytischen Proben und Testplattenproben dann unter Verwendung von Pipettierrobotern verdünnt werden.
Beispiel 8
Oligonukleotidanalyse – 96-Well-Plattenformat
Die Oligonukleotidkonzentration in jedem Well wurde durch Verdünnen der Proben und mit UV-Absorptionsspektroskopie bewertet. Die Volllängenintegrität der einzelnen Produkte wurde durch Kapillarelektrophorese (CE) entweder im 96 Well-Format (Beckman P/ACE^TM MDQ) oder für individuell hergestellte Proben auf einer käuflichen CE-Vorrichtung (z.B. Beckman P/ACE^TM 5000, ABI 270) bewertet. Die Base- und Grundgerüstzusammensetzung wurde mittels Massenanalyse der Verbindungen unter Verwendung von Elektrospray-Massenspektroskopie bestätigt. Alle Testplatten wurden von der Masterplatte unter Verwendung von automatischen Ein- und Mehrkanal-Pipettierrobotern verdünnt. Die Platten wurden als akzeptabel beurteilt, wenn mindestens 85 % der Verbindungen auf der Platte mindestens 85 % der Volllänge entsprachen.
Beispiel 9
Zellkultur und Oligonukleotidbehandlung
Der Effekt von Antisense-Verbindungen auf die Zielnukleinsäureexpression kann in jedwedem von verschiedenen Zelltypen getestet werden, mit der Maßgabe, dass die Zielnukleinsäure in messbaren Konzentrationen vorliegt. Dies kann routinemäßig unter Verwendung von z.B. PCR oder Northern-Blot-Analyse bestimmt werden. Die folgenden vier Zelltypen werden für Veranschaulichungszwecke bereitgestellt, jedoch können auch andere Zelltypen routinemäßig verwendet werden.
T24-Zellen:
Die Übergangszellen-Blasenkarzinomzelllinie T-24 wurde von der American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, VA) erhalten. T-24-Zellen wurden routinemäßig in vollständigen McCoy's 5A-Basalmedien (Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD), die mit 10 fetalem Kälberserum (Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD), 100 Einheiten/ml Penicillin und 100 Mikrogramm pro ml Streptomycin (Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD) ergänzt waren, kultiviert. Die Zellen wurden routinemäßig durch Trypsinisierung und Verdünnung einer Passage unterworfen, wenn sie 90 % Konfluenz erreicht hatten. Die Zellen wur den zur Verwendung in der RT-PCR-Analyse in 96 Well-Platten (Falcon-Primaria #3872) mit einer Dichte von 7000 Zellen/Well ausgesät.
Für das Northern-Blotting oder eine andere Analyse können Zellen auf 100 mm- oder andere Standard-Gewebekulturplatten ausgesät und unter Verwendung geeigneter Volumina an Medium und Oligonukleotid entsprechend behandelt werden.
A549-Zellen:
Die menschliche Lungenkarzinomzelllinie A549 wurde von der American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, VA) erhalten. A549-Zellen wurden routinemäßig in DMEM-Basalmedien (Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD), die mit 10 % fetalem Kälberserum (Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD), 100 Einheiten/ml Penicillin und 100 Mikrogramm pro ml Streptomycin (Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD) ergänzt waren, kultiviert. Die Zellen wurden routinemäßig durch Trypsinisierung und Verdünnung einer Passage unterworfen, wenn sie 90 % Konfluenz erreicht hatten.
NHDF-Zellen:
Menschliche neonatale dermale Fibroblasten (NHDF) wurden von der Clonetics Corporation (Walkersville, MD) erhalten. NHDF's wurden routinemäßig in Fibroblastenwachstumsmedium (Clonetics Corporation, Walkersville, MD) gehalten, das gemäß der Empfehlung des Lieferanten ergänzt worden war. Die Zellen wurden gemäß den Empfehlungen des Lieferanten für bis zu 10 Passagen aufrechterhalten.
HEK-Zellen:
Menschliche embrionale Keratinocyten (HEK) wurden von der Clonetics Corporation (Walkersville, MD) erhalten. HEK's wurden routinemäßig in Keratinocytenwachstumsmedium (Clonetics Corporation, Walkersville, MD) gehalten, das gemäß der Empfehlung des Lieferanten formuliert worden war. Die Zellen wurden gemäß den Empfehlungen des Lieferanten routinemäßig für bis zu 10 Passagen aufrechterhalten.
Behandlung mit Antisense-Verbindungen:
Wenn Zellen eine Konfluenz von 80 % erreicht hatten, wurden sie mit Oligonukleotid behandelt. Für Zellen, die in 96 Well-Platten wachsen gelassen worden sind, wurden die Wells einmal mit 200 μl OPTI-MEM^TM-1 reduziertem Serum-Medium (Gibco BRL) gewaschen und dann mit 130 μl OPTI-MEM^TM-1, das 3,75 μg/ml LIPOFECTIN^TM (Gibco BRL) enthielt, und dem gewünschten Oligonukleotid bei einer Endkonzentration von 150 nM behandelt. Nach 4 Stunden Behandlung wurde das Medium durch frisches Medium ersetzt. Die Zellen wurden 16 Stunden nach der Oligonukleotidbehandlung geerntet.
Beispiel 10
Analyse der Oligonukleotidinhibierung der Expression von X-verknüpftem Inhibitor der Apoptose
Eine Antisense-Modulierung der Expression von X-verknüpftem Inhibitor der Apoptose kann mit verschiedenen bekannten Verfahren getestet werden. Beispielsweise können die mRNA-Konzentrationen von X-verknüpftem Inhibitor der Apoptose z.B. mit einer Northern-Blot-Analyse, einer kompetetiven Polymerasekettenreaktion (PCR) oder einer Echtzeit-PCR (RT-PCR) quantifiziert werden. Eine quantitative Echtzeit-PCR ist gegenwärtig bevorzugt. Die RNA-Analyse kann mit der gesamten zellulären RNA oder poly(A) + mRNA durchgeführt werden. Verfahren zur RNA-Isolierung sind z.B. in F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Band 1, Seiten 4.1.1–4.2.9 und 4.5.1–4.5.3, John Wiley & Sons, Inc., 1993, beschrieben. Eine Northern-Blot-Analyse ist in dem Fachgebiet Routine und ist z.B. in F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Band 1, Seiten 4.2.1–4.2.9, John Wiley & Sons, Inc., 1996, beschrieben. Eine quantitative Echtzeit-PCR kann zweckmäßig unter Verwendung des käuflichen ABI PRISM^TM 7700-Sequenznachweissystems, das von PE-Applied Biosystems, Foster City, CA, erhältlich ist und gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet wird, erreicht werden. Andere PCR-Verfahren sind ebenfalls bekannt.
Die Proteinkonzentrationen von X-verknüpftem Inhibitor der Apoptose können mit verschiedenen bekannten Verfahren quantifiziert werden, wie Immunpräzipitation, Western-Blot-Analyse (Immunoblotting), ELISA oder Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS). Antikörper, die gegen den X-verknüpften Inhibitor der Apoptose gerichtet sind, können von verschiedenen Quellen identifiziert und erhalten werden, wie z.B. dem MSRS-Antikörperkatalog (Aerie Corporation, Birmingham, MI), oder sie können mittels herkömmlicher Antikörpererzeugungsverfahren hergestellt werden. Verfahren zur Herstellung polyklonaler Antiseren sind z.B. in F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Band 2, Seiten 11.12.1–11.12.9, John Wiley & Sons, Inc., 1997, beschrieben. Die Herstellung monoklonaler Antikörper ist z.B. in F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Band 2, Seiten 11.4.1–11.11.5, John Wiley & Sons, Inc., 1997, beschrieben.
Immunpräzipitationsverfahren sind in dem Fachgebiet Standard und finden sich z.B. in F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Band 2, Seiten 10.16.1–10.16.11, John Wiley & Sons, Inc., 1998. Western-Blot-Analysen (Immunoblot-Analysen) sind in dem Fachgebiet Standard und finden sich z.B. in F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Band 2, Seiten 10.8.1–10.8.21, John Wiley & Sons, Inc., 1997. Enzymimmuntests (ELISA) sind in dem Fachgebiet Standard und finden sich z.B. in F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Band 2, Seiten 11.2.1–11.2.22, John Wiley & Sons, Inc., 1991.
Beispiel 11
Poly(A) + mRNA-Isolierung
Poly(A) + mRNA wurde gemäß Miura et al., Clin. Chem., 1996, 42, 1758–1764, isoliert. Andere Verfahren zur Isolierung von poly(A) + mRNA sind z.B. in F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Band 1, Seiten 4.5.1–4.5.3, John Wiley & Sons, Inc., 1993, beschrieben. Dabei wurde bei Zellen, die auf 96 Well-Platten wachsen gelassen worden sind, das Wachstumsmedium von den Zellen entfernt und jeder Well wurde mit 200 μl kaltem PBS gewaschen. 60 μl Lysepuffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,6, 1 mM EDTA, 0,5 M NaCl, 0,5 % NP-40, 20 mM Vanadyl-Ribonukleosidkomplex) wurden jedem Well zugesetzt, die Platte wurde schwach bewegt und dann 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. 55 μl des Lysats wurden auf Oligo d(T)-beschichtete 96 Well-Platten (AGCT Inc., Irvine, CA) übertragen. Die Platten wurden 60 min bei Raumtemperatur inkubiert und dreimal mit 200 μl Waschpuffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,6, 1 mM EDTA, 0,3 M NaCl) gewaschen. Nach dem letzten Waschvorgang wurde die Platte mit Papierhandtüchern abgetupft, um überschüssigen Waschpuffer zu entfernen, und dann 5 min luftgetrocknet. 60 μl Elutionspuffer (5 mM Tris-HCl, pH 7,6), der auf 70°C vorgewärmt worden war, wurden jedem Well zugesetzt und die Platte wurde auf einer 90°C heißen Platte 5 min inkubiert, und das Eluat wurde dann auf eine frische 96 Well-Platte überführt.
Zellen, die auf 100 mm-Standardplatten oder anderen Standardplatten wachsen gelassen worden sind, können unter Verwendung entsprechender Volumina aller Lösungen entsprechend behandelt werden.
Beispiel 12
Gesamt-RNA-Isolierung
Die Gesamt-RNA wurde unter Verwendung eines RNEASY 96^TM-Kits und von Puffern, die von Qiagen Inc. (Valencia, CA) erhalten worden waren, gemäß den empfohlenen Verfahren des Herstellers isoliert. Dabei wurde bei Zellen, die auf 96 Well-Platten wachsen gelassen worden sind, das Wachstumsmedium von den Zellen entfernt und jeder Well wurde mit 200 μl kaltem PBS gewaschen. Jedem Well wurden 100 μl Puffer-RLT zugesetzt und die Platte wurde 20 s heftig bewegt. Jedem Well wurden dann 100 μl 70 %iges Ethanol zugesetzt und der Inhalt wurde durch dreimaliges Auf- und Ab-Pipettieren gemischt. Die Proben wurden dann in die RNEASY 96^TM-Well-Platte, die an einem QIAVAC^TM-Verteiler angebracht war, der mit einer Abfallsammelplatte ausgestattet war, überführt und an eine Vakuumquelle angeschlossen. Das Vakuum wurde 15 s angelegt. 1 ml Puffer RW1 wurde jedem Well der RNEASY 96^TM-Platte zugesetzt und das Vakuum wurde erneut für 15 s angelegt. Dann wurde jedem Well der RNEASY 96^TM-Platte 1 ml Puffer RPE zugesetzt und das Vakuum wurde für einen Zeitraum von 15 s angelegt. Der Puffer RPE-Waschvorgang wurde dann wiederholt und das Vakuum wurde für zusätzliche 10 min angelegt. Die Platte wurde dann von dem QIAVAC^TM-Verteiler entfernt und auf Papierhandtüchern trockengetupft. Die Platte wurde dann wieder an dem QIAVAC^TM-Verteiler, der mit einem Sammelröhrchengestell ausgestattet war, das 1,2 ml-Sammelröhrchen enthielt, angebracht. Die RNA wurde dann durch Pipettieren von 60 μl Wasser in jeden Well, Inkubieren für 1 min und dann Anlegen des Vakuums für 30 s eluiert. Der Elutionsschritt wurde mit zusätzlichen 60 μl Wasser wiederholt.
Die wiederholten Pipettier- und Elutionsschritte können unter Verwendung eines QIAGEN Bio-Roboter 9604 (Qiagen, Inc., Valencia, CA) automatisiert werden. Im Wesentlichen nach dem Lysieren der Zellen auf der Kulturplatte wird die Platte auf die Auflage des Roboters überführt, wo die Pipettier-, DNase-Behandlungs- und Elutionsschritte durchgeführt werden.
Beispiel 13
Quantitative Echtzeit-PCR-Analyse der mRNA-Konzentrationen von X-verknüpftem Inhibitor der Apoptose
Die Quantifizierung der mRNA-Konzentrationen von X-verknüpftem Inhibitor der Apoptose wurde mittels quantitativer Echtzeit-PCR unter Verwendung des ABI PRISM^TM 7700 Sequenznachweissystems (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) gemäß den Anweisungen des Herstellers bestimmt. Dabei handelt es sich um ein Fluoreszenznachweissystem auf nicht-Gel-Basis mit geschlossenen Röhrchen, das eine Quantifizierung von Produkten der Polymerasekettenreaktion (PCR) mit hohem Durchsatz in Echtzeit ermöglicht. Im Gegensatz zu einer Standard-PCR, bei der die Amplifizierungsprodukte nach dem Abschluss der PCR quantifiziert werden, werden die Produkte bei der quantitativen Echtzeit-PCR so quantifiziert, wie sie sich ansammeln. Dies wird durch Einbringen einer Oligonukleotidsonde in die PCR-Reaktion erreicht, die spezifisch zwischen den Vorwärts- und Rückwärtsprimern der PCR hybridisiert und zwei Fluoreszenzfarbstoffe enthält. Ein Reporterfarbstoff (z.B. JOE oder FAM, der entweder von Operon Technologies Inc., Alameda, CA, oder PE-Applied Biosystems, Foster City, CA, erhalten worden ist) wird an das 5'-Ende der Sonde gebunden und ein Quencher-Farbstoff (z.B. TAMRA, der entweder von Operon Technologies Inc., Alameda, CA, oder PE-Applied Biosystems, Foster City, CA, erhalten worden ist) wird an das 3'-Ende der Sonde gebunden. Wenn die Sonde und die Farbstoffe intakt sind, wird die Emission des Reporterfarbstoffs durch die Nähe des 3'-Quencherfarbstoffs gequencht. Während der Amplifizierung erzeugt die Hybridisierung der Sonde an die Zielsequenz ein Substrat, das durch die 5'-Exonukleaseaktivität der Taq-Polymerase gespalten werden kann. Während der Verlängerungsphase des PCR-Amplifizierungszyklus setzt die Spaltung der Sonde durch die Taq-Polymerase den Reporterfarbstoff von dem Rest der Sonde (und somit von dem Quencherrest) frei und ein sequenzspezifisches Fluoreszenzsignal wird erzeugt. Bei jedem Zyklus werden zusätzliche Reporterfarbstoffmoleküle von ihren jeweiligen Sonden abgespalten und die Fluoreszenzintensität wird in regelmäßigen Abständen durch eine Laseroptik überwacht, die in das ABI PRISM^TM 7700 Sequenznachweissystem eingebaut ist. Bei jedem Test erzeugt eine Reihe von parallelen Reaktionen, die Reihenverdünnungen von mRNA von unbehandelten Kontrollproben enthalten, eine Standardkurve, die zur Quantifizierung der prozentualen Inhibierung nach der Antisense-Oligonukleotidbehandlung von Testproben verwendet wird.
PCR-Reagenzien wurden von PE-Applied Biosystems, Foster City, CA, erhalten. RT-PCR-Reaktionen wurden durch Zugeben von 25 μl PCR-Cocktail (1× TAQMAN^TM-Puffer A, 5,5 mM MgCl₂, jeweils 300 μM dATP, dCTP und dGTP, 600 μM dUTP, jeweils 100 nM Vorwärtsprimer, Rückwärtsprimer und Sonde, 20 Einheiten RNAse-Inhibitor, 1,25 Einheiten AMPLITAQ GOLD^TM und 12,5 Einheiten MuLV reverse Transkriptase) zu 96 Well-Platten durchgeführt, die 25 μl poly(A)-mRNA-Lösung enthielten. Die RT-Reaktion wurde durch Inkubieren für 30 min bei 48°C durchgeführt. Nach 10 min Inkubieren bei 95°C zur Aktivierung von AMPLITAQ GOLD^TM wurden 40 Zyklen eines zweistufigen PCR-Protokolls durchgeführt: 95°C für 15 s (Denaturierung) und anschließend 60°C für 1,5 min (Hybridisierung/Verlängerung). Sonden und Primer des X-verknüpften Inhibitors der Apoptose wurden so gestaltet, dass sie an die menschliche Sequenz des X-verknüpften Inhibitors der Apoptose hybridisieren, und zwar unter Verwendung einer veröffentlichten Sequenzinformation (GenBank-Zugangsnummer U45880, hier als SEQ ID NO:1 einbezogen).
Für den X-verknüpften Inhibitor der Apoptose waren die PCR-Primer:
Vorwärtsprimer: TTCCAAGTGGTAGTCCTGTTTCAG (SEQ ID NO: 2),
Rückwärtsprimer: GCACGGTATCTCCTTCACCAGTA (SEQ ID NO: 3), und die PCR-Sonde war: FAM-CAACACTGGCACGAGCAGGGTTTCTTT-TAMRA (SEQ ID NO: 4), wobei FAM (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) der fluoreszierende Reporterfarbstoff ist und TAMRA (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) der Quencher-Farbstoff ist.
Für GAPDH waren die PCR-Primer:
Vorwärtsprimer: GAAGGTGAAGGTCGGAGTC (SEQ ID NO: 5),
Rückwärtsprimer: GAAGATGGTGATGGGATTTC (SEQ ID NO: 6), und die PCR-Sonde war: 5'-JOE-CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC-TAMRA-3' (SEQ ID NO: 7), wobei JOE (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) der fluoreszierende Reporterfarbstoff ist und TAMRA (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) der Quencher-Farbstoff ist.
Beispiel 14
Northern-Blot-Analyse der mRNA-Konzentrationen des X-verknüpften Inhibitors der Apoptose
18 Stunden nach der Antisense-Behandlung wurden Zellmonoschichten zweimal mit kaltem PBS gewaschen und in 1 ml RNAZOL^TM (TEL-TEST „B" Inc., Friendswood, TX) lysiert. Die Gesamt-RNA wurde gemäß den vom Hersteller empfohlenen Protokollen hergestellt. 20 μg Gesamt-RNA wurden mittels Elektrophorese durch 1,2 % Agarosegele, die 1,1 % Formaldehyd enthielten, unter Verwendung eines MOPS-Puffersystems (AMRESCO, Inc., Solon, OH) fraktioniert. Die RNA wurde von dem Gel auf HYBOND^TM-N+-Nylonmembranen (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) durch eine Kapillarübertragung über Nacht unter Verwendung eines Northern/Southern-Übertragungspuffersystems (TEL-TEST „B" Inc., Friendswood, TX) übertragen. Die RNA-Übertragung wurde durch eine Sichtbarmachung mit UV bestätigt. Die Membranen wurden durch eine UV-Vernetzung unter Verwendung eines STRATALINKER^TM-UV-Vernetzers 2400 (Stratagene, Inc., La Jolla, CA) fixiert.
Membranen wurden unter Verwendung einer QUICKHYB^TM-Hybridisierungslösung (Stratagene, La Jolla, CA) unter Verwendung der Empfehlungen des Herstellers für stringente Bedingungen mit einer für den X-verknüpften Inhibitor der Apoptose spezifischen Sonde, die mittels PCR unter Verwendung des Vorwärtsprimers TTCCAAGTGGTAGTCCTGTTTCAG (SEQ ID NO: 2) und des Rückwärtsprimers GCACGGTATCTCCTTCACCAGTA (SEQ ID NO: 3) hergestellt worden ist, versehen. Um Variationen bei der Beladung und der Übertragungseffizienz zu normalisieren, wurden Membranen abgestrippt und bezüglich Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH)-RNA (Clontech, Palo Alto, CA) mit einer Sonde verse hen. Hybridisierte Membranen wurden unter Verwendung eines PHOSPHORIMAGER^TM und IMAGEQUANT^TM-Software V3.3 (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) visualisiert und quantifiziert. Die Daten wurden bezüglich GAPDH-Konzentrationen in unbehandelten Kontrollen normalisiert.
Beispiel 15
Antisense-Inhibierung der Expression von Phosphorothioat-Oligodesoxynukleotiden von X-verknüpftem Inhibitor der Apoptose
Erfindungsgemäß wurde eine Reihe von Oligonukleotiden unter Verwendung veröffentlichter Sequenzen (GenBank-Zugangsnummer U45880, hier als SEQ ID NO: 1 einbezogen) so gestaltet, dass sie verschiedene Regionen der RNA des menschlichen X-verknüpften Inhibitors der Apoptose als Ziel ansteuern. Die Oligonukleotide sind in der Tabelle 1 gezeigt. Die Zielstellen werden durch die Nummern der Nukleotide angegeben, wie sie in der Sequenzquellenreferenz angegeben sind (GenBank-Zugangsnummer U45880), an die das Oligonukleotid bindet. Alle Verbindungen in der Tabelle 1 sind Oligodesoxynukleotide mit durchgängigen Phosphorothioatgrundgerüsten (Internukleosidbindungen). Die Verbindungen wurden bezüglich des Effekts auf die mRNA-Konzentrationen des X-verknüpften Inhibitors der Apoptose mittels quantitativer Echtzeit-PCR, wie sie hier in anderen Beispielen beschrieben wird, analysiert. Die Daten sind Mittelwerte aus zwei Experimenten. Gegebenenfalls steht „N.D." für „keine Daten".
Tabelle 1 Inhibierung der mRNA-Konzentrationen des X-verknüpften Inhibitors der Apoptose durch Phosphorothioat-Oligodesoxynukleotide
Gemäß der Tabelle 1 zeigten die SEQ ID NOs 8, 12, 13, 15, 21, 23, 25, 26, 27, 28, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 40, 41, 42, 43 und 44 in diesem Test eine mindestens 20 %ige Inhibierung der Expression des X-verknüpften Inhibitors der Apoptose und sind daher bevorzugt.
Beispiel 16
Antisense-Inhibierung der Expression von Phosphorothioat-2'-MOE-gapmer-Oligonukleotiden des X-verknüpften Inhibitors der Apoptose
Erfindungsgemäß wurde eine zweite Reihe von Oligonukleotiden synthetisiert, die auf den menschlichen X-verknüpften Inhibitor der Apoptose gerichtet sind. Die Oligonukleotidsequenzen sind in der Tabelle 2 gezeigt. Die Zielstellen werden durch die Nummern der Nukleotide angegeben, wie sie in der Sequenzquellenreferenz angegeben sind (GenBank-Zugangsnum-mer U45880), an die das Oligonukleotid bindet.
Alle Verbindungen in der Tabelle 2 sind chimäre Oligonukleotide („Gapmere"), die eine Länge von 20 Nukleotiden aufweisen und aus einer zentralen „Gap"-Region bestehen, die aus zehn 2'-Desoxynukleotiden zusammengesetzt ist, und die auf beiden Seiten (5'- und 3'-Richtung) von Fünf-Nukleotid-„Wings" flankiert sind. Die Wings sind aus 2'-Methoxyethyl-Nukleotiden (2'-MOE-Nukleotiden) zusammengesetzt. Die Internukleosid-Verknüpfungen (Grundgerüst-Verknüpfungen) sind im gesamten Oligonukleotid Phosphorothioat (P=S). Cytidinreste in den 2'-MOE-Wings sind 5-Methylcytidine.
Die Daten wurden mittels quantitativer Echtzeit-PCR erhalten, wie es hier in anderen Beispielen beschrieben ist, und stellen den Durchschnitt von zwei Experimenten dar. Gegebenenfalls steht „N.D." für „keine Daten".
Tabelle 2 Inhibierung der mRNA-Konzentrationen des X-verknüpften Inhibitors der Apoptose durch chimäre Phosphorothioat-Oligonukleotide, die 2'-MOE-Wings und ein Desoxy-Gap aufweisen
Gemäß der Tabelle 2 zeigten die SEQ ID NOs 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 und 45 in diesem Experiment eine mindestens 20 %ige Inhibierung der Expression des X-verknüpften Inhibitors der Apoptose und sind daher bevorzugt.
Beispiel 17
Western-Blot-Analyse der Proteinkonzentrationen des X-verknüpften Inhibitors der Apoptose
Eine Western-Blot-Analyse (Immunoblot-Analyse) wird unter Verwendung von Standardverfahren durchgeführt. Zellen werden 16 bis 20 Stunden nach der Oligonukleotidbehandlung geerntet, einmal mit PBS gewaschen, in Laemmli-Puffer (100 μl/Well) suspendiert, 5 min gekocht und auf ein 16 % SDS-PAGE-Ge) aufgebracht. Die Gele werden 1,5 Stunden bei 150 V laufen gelassen und auf eine Membran für das Western-Blotting übertragen. Es wird ein geeigneter primärer Antikörper, der gegen den X-verknüpften Inhibitor der Apoptose gerichtet ist, mit einem radiomarkierten oder fluoreszierend markierten sekundären Antikörper, der gegen die primäre Antikörperspezies gerichtet ist, verwendet. Die Banden werden unter Verwendung eines PHOSPHORIMAGER^TM (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) sichtbar gemacht.

Claims

Antisense-Oligonukleotid-Verbindung mit einer Länge von 20 bis 30 Nukleobasen, die gegen ein Nukleinsäuremolekül, das humanen X-verbundenen Inhibitor der Apoptose kodiert, gerichtet ist, und SEQ ID NR. 8, 12, 13, 14, 21, 23, 25, 26, 27, 28, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 40, 41, 42, 43, 44, 9, 10, 11, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 24, 29, 39 oder 45 umfaßt, wobei die Antisense-Oligonukleotid-Verbindung spezifisch mit dem humanen X-verbundenen Inhibitor der Apoptose hybridisiert und dessen Expression inhibiert.
Antisense-Verbindung nach Anspruch 1, wobei das Antisense-Oligonukleotid mindestens eine modifizierte Internukleosid-Verknüpfung umfaßt.
Antisense-Verbindung nach Anspruch 2, wobei die modifizierte Internukleosid-Verknüpfung eine Phosphorothioat-Verknüpfung ist.
Antisense-Verbindung nach Anspruch 1, wobei das Antisense-Oligonukleotid mindestens eine modifizierte Zuckereinheit umfaßt.
Antisense-Verbindung nach Anspruch 4, wobei die modifizierte Zuckereinheit eine 2'-O-Methoxyethyl-Zuckereinheit ist.
Antisense-Verbindung nach Anspruch 1, wobei das Antisense-Oligonukleotid mindestens eine modifizierte Nukleobase umfaßt.
Antisense-Verbindung nach Anspruch 6, wobei die modifizierte Nukleobase ein 5-Methylcytosin ist.
Antisense-Verbindung nach Anspruch 1, wobei das Antisense-Oligonukleotid ein chimäres Oligonukleotid ist.
Antisense-Verbindung nach Anspruch 8, wobei das Antisense-Oligonukleotid eine Sequenz aufweist, die SEQ ID NR: 8, 12, 13, 14, 21, 23, 25, 26, 27, 28, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 40, 41, 42, 43 oder 44 umfaßt.
Zusammensetzung, die eine Antisense-Verbindung nach Anspruch 1 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder ein Verdünnungsmittel umfaßt.
Zusammensetzung nach Anspruch 10, die weiter ein kolloidales Dispersionssystem umfaßt.
Verfahren zum Inhibieren der Expression des X-verknüpften Inhibitors der Apoptose in humanen Zellen oder Geweben ex vivo, welches das Inkontaktbringen der Zellen oder der Gewebe mit der Antisense-Verbindung nach Anspruch 1 umfaßt, so daß die Expression des X-verknüpften Inhibitors der Apoptose inhibiert wird.
Verwendung der Antisense-Verbindung nach Anspruch 1 in der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Menschen, der eine(n) mit dem X-verknüpften Inhibitor der Apoptose in Verbindung gebrachte(n) Krankheit oder Zustand aufweist, wobei die Krankheit oder der Zustand Krebs, follikuläre Atresie oder eine entzündliche Erkrankung ist.