WO2022124410A1 - シトシン型架橋型ヌクレオシドアミダイト結晶及びその製造方法 - Google Patents

シトシン型架橋型ヌクレオシドアミダイト結晶及びその製造方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2022124410A1
WO2022124410A1 PCT/JP2021/045679 JP2021045679W WO2022124410A1 WO 2022124410 A1 WO2022124410 A1 WO 2022124410A1 JP 2021045679 W JP2021045679 W JP 2021045679W WO 2022124410 A1 WO2022124410 A1 WO 2022124410A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
crystal
group
cytosine
nucleoside amidite
solvent
Prior art date
Application number
PCT/JP2021/045679
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
悟 向後
Original Assignee
ヤマサ醤油株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ヤマサ醤油株式会社 filed Critical ヤマサ醤油株式会社
Priority to KR1020237016149A priority Critical patent/KR20230118076A/ko
Priority to JP2022568357A priority patent/JPWO2022124410A1/ja
Priority to CN202180075896.8A priority patent/CN116472276A/zh
Priority to US18/265,880 priority patent/US20240083935A1/en
Priority to EP21903506.0A priority patent/EP4265627A1/en
Publication of WO2022124410A1 publication Critical patent/WO2022124410A1/ja

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/06—Pyrimidine radicals
    • C07H19/067—Pyrimidine radicals with ribosyl as the saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
    • C07H1/06—Separation; Purification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07B—GENERAL METHODS OF ORGANIC CHEMISTRY; APPARATUS THEREFOR
    • C07B2200/00—Indexing scheme relating to specific properties of organic compounds
    • C07B2200/13—Crystalline forms, e.g. polymorphs
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Definitions

  • the present invention relates to a cytosine-type crosslinked nucleoside amidite crystal and a method for producing the same.
  • antisense method antigene method, aptamer method, siRNA method, etc. as a treatment method for diseases by nucleic acid medicine.
  • the furanose ring of the nucleoside sugar moiety has a distorted conformation called N-type or S-type rather than a planar structure, and is biased to a specific conformation by a cyclic substituent.
  • N-type conformation becomes dominant. Imanishi et al. Succeeded in forcibly fixing the conformation of the nucleoside to the N-type by cross-linking the 4'-position and 2'-position hydroxyl groups of the nucleoside sugar moiety.
  • LNA Locked Nucleic Acids
  • LNA is generally synthesized by a solid-phase synthesis method using a crosslinked nucleoside amidite, which is called a phosphoramidite method (see Non-Patent Document 1).
  • LNA is synthesized by repeating the cycle of detritylation ⁇ coupling reaction of amidite compound ⁇ cap reaction ⁇ oxidation (or Sification) reaction until the target chain length is reached. That is, the amidite form of the crosslinked nucleoside is industrially useful because it is used as a raw material for LNA synthesis.
  • the present inventor has found that the amorphous stability of the amidite form of the crosslinked nucleoside is low while examining the synthesis of LNA.
  • An object of the present invention is to solve the above-mentioned amorphous problem existing in the amidite form of a crosslinked nucleoside.
  • the present inventor acquired the crystals of the amidite form of the cytosine-type cross-linked nucleoside for the first time while proceeding with diligent research. Then, it was found that the crystal could solve the above-mentioned problem of amorphous, and further studies were carried out to complete the present invention.
  • the cytosine-type cross-linked nucleoside amidite is referred to as "cytosine-type cross-linked nucleoside amidite”
  • the crystal thereof is referred to as “cytosine-type cross-linked nucleoside amidite crystal”
  • the amorphous cytosine-type cross-linked nucleoside amidite is referred to as "cytosine-type cross-linked nucleoside amidite”. It may be abbreviated as "cytosine type cross-linked nucleoside amidite amorphous”.
  • the present invention is a cytosine-type crosslinked nucleoside amidite crystal represented by the following structural formula.
  • R 1 and R 2 indicate a substituent
  • R 3 indicates a protecting group
  • the present invention is a method for producing a cytosine-type cross-linked nucleoside amidite crystal, which comprises a step of dissolving a cytosine-type cross-linked nucleoside amidite amorphous substance in a nitrile-based solvent to obtain a precipitated crystal.
  • the present invention is a method for producing a cytosine-type cross-linked nucleoside amidite crystal, which comprises a step of dissolving a cytosine-type cross-linked nucleoside amidite amorphous in an easily soluble solvent and then adding a sparingly soluble solvent.
  • the present invention it is possible to provide a cytosine-type crosslinked nucleoside amidite crystal and a method for producing the same, which solves the above-mentioned amorphous problem existing in the amidite form of the crosslinked nucleoside. That is, the cytosine-type crosslinked nucleoside amidite crystal of the present invention has excellent stability and can be stably stored even under a high temperature condition of 50 ° C.
  • FIG. 1 shows N 4 -benzoyl-5'-O- (4,4'-dimethoxytrityl) -2'-O-4'-C-methylene-5-methylcytidine-3'acquired in Example 1.
  • the appearance of the crystal A of —O— [O— (2-cyanoethyl) -N, N-diisopropylphosphoroamidite] is shown.
  • FIG. 2 shows N 4 -benzoyl-5'-O- (4,4'-dimethoxytrityl) -2'-O-4'-C-methylene-5-methylcytidine-3'acquired in Example 2.
  • FIG. 3 shows N 4 -benzoyl-5'-O- (4,4'-dimethoxytrityl) -2'-O-4'-C-methylene-5-methylcytidine-3'acquired in Example 3.
  • the appearance of the crystal C of —O— [O— (2-cyanoethyl) -N, N-diisopropylphosphoroamidite] is shown.
  • Example 4 shows N 4 -benzoyl-5'-O- (4,4'-dimethoxytrityl) -2'-O-4'-C-methylene-5-methylcytidine-3'acquired in Example 1.
  • the X-ray diffraction spectrum of the crystal A of -O- [O- (2-cyanoethyl) -N, N-diisopropylphosphoroamidite] is shown.
  • the vertical axis represents the diffraction intensity (CPS), and the horizontal axis represents the diffraction angle (2 ⁇ ).
  • Example 5 shows N 4 -benzoyl-5'-O- (4,4'-dimethoxytrityl) -2'-O-4'-C-methylene-5-methylcytidine-3'acquired in Example 2.
  • the X-ray diffraction spectrum of the crystal B of -O- [O- (2-cyanoethyl) -N, N-diisopropylphosphoroamidite] is shown.
  • the vertical axis represents the diffraction intensity (CPS), and the horizontal axis represents the diffraction angle (2 ⁇ ).
  • Example 7 shows N 4 -benzoyl-5'-O- (4,4'-dimethoxytrityl) -2'-O-4'-C-methylene-5-methylcytidine-3'acquired in Example 1.
  • the results of differential scanning calorimetry of crystal A of -O- [O- (2-cyanoethyl) -N, N-diisopropylphosphoroamidite] are shown.
  • “DSC mW" on the vertical axis represents a change in calorific value
  • Temp ° C on the horizontal axis represents a change in temperature.
  • the present invention provides, in one embodiment, a cytosine-type crosslinked nucleoside amidite crystal represented by the following structural formula.
  • R 1 and R 2 indicate a substituent
  • R 3 indicates a protecting group.
  • the substituent represented by R 1 is an amino group or an amino group protected by an acyl group such as an acetyl group, a propionyl group, an isobutyryl group or a benzoyl group or a dimethylaminomethylene group.
  • the substituent represented by R 2 is a methyl group or a hydrogen atom.
  • the protecting group represented by R 3 is a trityl group, a monomethoxytrityl group, a dimethoxytrityl group or a pixyl group.
  • R 1 is preferably a benzamide group
  • R 2 is preferably a methyl group
  • R 3 is preferably a dimethoxytrityl group.
  • the cytosine-type crosslinked nucleoside amidite crystal of the present invention can take different crystal forms depending on the difference in crystal acquisition conditions.
  • this polymorph is referred to as crystal A, crystal B and crystal C for convenience.
  • the cytosine-type crosslinked nucleoside amidite crystal of the present invention is obtained as a columnar or dendritic crystal.
  • a photograph of the appearance of the crystal A is shown in FIG. 1
  • a photograph of the appearance of the crystal B is shown in FIG. 2
  • a photograph of the appearance of the crystal C is shown in FIG.
  • crystals A and B having a diffraction angle (2 ⁇ ) shown below are shown below.
  • crystals A and B having a diffraction angle (2 ⁇ ) shown below are shown below.
  • crystal C Crystal A 7.96, 8.94, 9.50, 10.49, 11.000, 11.12, 13.45, 13.82, 16.79, 17.76, 18.22, 19.
  • the diffraction angle (2 ⁇ ) in powder X-ray diffraction may include an error range of less than 5%. Therefore, in addition to crystals in which the peak diffraction angles in powder X-ray diffraction completely match, the peak diffraction angle Crystals with an error of less than 5% are also included in the cytosine-type crosslinked nucleoside amidite crystals of the present invention.
  • the cytosine-type crosslinked nucleoside amidite crystal of the present invention has one of the characteristic peak patterns of crystal A, crystal B, and crystal C shown below as the diffraction angle (2 ⁇ ) of powder X-ray diffraction. Have.
  • powder X-ray diffraction shall be performed under the following conditions.
  • the citocin-type crosslinked nucleoside amidite crystal of the present invention was analyzed by a differential scanning calorimeter (manufactured by Shimadzu Corporation) (heating rate 5 ° C./min), the crystal A had 96, 176, as shown in FIG. Near 184 ° C (error of ⁇ 2 ° C), around 148 and 183 ° C (error of ⁇ 2 ° C) as shown in FIG. 8 for crystal B, and around 177 and 183 ° C ( ⁇ 2) as shown in FIG. 9 for crystal C.
  • the heat absorption peak due to melting is shown in (° C error).
  • no endothermic peak was shown as shown in FIG.
  • the cytosine-type crosslinked nucleoside amidite crystal of the present invention has extremely high stability, and as demonstrated in Examples described later, it decomposes even when stored for 20 days under the condition of, for example, 50 ° C. The degree can be suppressed to within 1%.
  • the "decomposition degree” is the purity after storage from the purity of the cytosine-type crosslinked nucleoside amidite crystal at the start of the stability test when the stability test is performed for a certain period under the following conditions. Defined as subtracted. Purity can be determined by HPLC. A large degree of decomposition means that the decomposition has progressed and the purity has decreased.
  • Stability test conditions Temperature: 50 ° C Storage conditions: 20 mg of crystals in a glass vial and sealed storage (HPLC conditions) Column: YMC-Triart C18, 150 ⁇ 4.6 mm I. D. (Made by YMC) Eluent: 5 mM triethylammonium acetate (pH 7.0) containing 80% by volume acetonitrile Detection method: Detection by UV280 nm
  • the present invention provides, in another embodiment, a method for producing a cytosine-type crosslinked nucleoside amidite crystal.
  • the cytosine-type crosslinked nucleoside amidite crystal of the present invention can be obtained by utilizing the low affinity of the phosphoramidite group for a nitrile-based solvent. That is, the cytosine-type crosslinked nucleoside amidite crystal of the present invention can be obtained by dissolving the cytosine-type crosslinked nucleoside amidite amorphous in a nitrile-based solvent and precipitating the crystals (method A). Alternatively, as another method, cytosine-type crosslinked nucleoside amidite crystals can be obtained by dissolving cytosine-type crosslinked nucleoside amidite amorphous in an easily soluble solvent and then adding a sparingly soluble solvent (method B).
  • Method A As a specific method of Method A, after the addition reaction of the phosphoramidite group shown in Chemical formula 3 below and a normal purification operation, the obtained cytosine-type crosslinked nucleoside amidite amorphous substance is once dissolved in a nitrile solvent. Then, a method of precipitating as crystals is exemplified. At this time, operations such as stirring and cooling are not particularly required, but these operations may be performed.
  • R 1 and R 2 indicate a substituent
  • R 3 indicates a protecting group
  • acetonitrile, propionitrile, butyronitrile, valeronitrile, benzonitrile and the like can be used as the nitrile-based solvent.
  • acetonitrile and propionitrile are preferable from the viewpoint of safety and handling, and acetonitrile is more preferable from the viewpoint of cost.
  • a protic protic solvent such as methanol or ethanol
  • a non-polar solvent such as dichloromethane, ethyl acetate, chloroform or tetrahydrofuran because the compound has high solubility. ..
  • a cytosine-type crosslinked nucleoside amidite amorphous obtained in the same manner as in the method A is once dissolved in an easily soluble solvent and then precipitated as crystals by adding a poorly soluble solvent.
  • the easily soluble solvent include alcohol solvents such as methanol, ethanol, isopropanol, tert-butanol and n-butanol, ketone solvents such as acetone and butanone, halogen solvents such as dichloromethane and chloroform, ethyl acetate and butyl acetate.
  • ester-based solvents ether-based solvents such as tetrahydrofuran and tert-butylmethyl ether can be used.
  • a hydrocarbon solvent such as pentane, hexane, or heptane can be used.
  • This synthesis step can be performed by those skilled in the art by appropriately referring to known documents (Tetrahedron 1998, 54, 3607-3630, etc.). Examples include combinations of 2-cyanoethyl-N, N, N', N'-tetraisopropylphosphoroamidite with tetrazole or substituted tetrazole in organic solvents such as acetonitrile or dichloromethane, or 2-cyanoethyl-N, N-diisopropyl.
  • a combination of chlorophosphoroamidite and diisopropylethylamine may be reacted at room temperature for 2 to 3 hours, and after confirming the disappearance of the raw material by thin layer chromatography (TLC) or HPLC, normal post-treatment may be performed.
  • TLC thin layer chromatography
  • HPLC HPLC
  • the cytosine-type crosslinked nucleoside amidite synthesized in this manner is purified by chromatography using silica gel or the like as a carrier and then dissolved in a nitrile-based solvent. It can be precipitated as crystals by adding operations such as addition, cooling, and stirring.
  • the cytosine-type crosslinked nucleoside amidite crystals obtained by the above production method can be made into a product by filtering by a filtration method such as pressure filtration, vacuum filtration, basket separation, filter press, and then drying.
  • a filtration method such as pressure filtration, vacuum filtration, basket separation, filter press, and then drying.
  • methods such as conical drying, vacuum drying including shelf drying, fluidized bed drying, ventilation drying including shelf drying, and spray drying can be appropriately used.
  • R 1 benzamide group
  • R 2 methyl group
  • R 3 dimethoxytrityl group
  • FIG. 2 shows an external photograph of the crystal B acquired in Example 2
  • FIG. 3 shows an external photograph of the crystal C acquired in Example 3.
  • the purity of the 5-methylcytosine-type cross-linked nucleoside nucleoside crystals B and C obtained in Examples 2 and 3 was measured under the same conditions, and the 5-methylcytosine-type cross-linking obtained in Example 2 was carried out.
  • the purity of the type nucleoside amidite crystal B was 98.7%
  • the purity of the 5-methylcytosine type crosslinked nucleoside amidite crystal C obtained in Example 3 was 98.6%.
  • a characteristic peak was shown in the vicinity.
  • a characteristic peak was shown in the vicinity.
  • Example 5 Stability comparison between 5-methylcytosine-type cross-linked nucleoside amidite crystals and known amorphous crystals
  • Example 1 (Crystal A)
  • Example 2 the 5-methylcytosine-type crosslinked nucleoside amidite
  • Example 2 Methyl group
  • Example 3 Dimethoxytrityl group
  • the HPLC purity of Crystal A after the corresponding number of days the column of “Example 2 (Crystal B)” is the 5-methylcytosine type cross-linking obtained in Example 2.
  • Column shows the HPLC purity of the amorphous used as a control after the corresponding number of days.
  • the cell described as "-" in the table indicates that the measurement has not been performed.
  • the “decomposition degree ( ⁇ %)" at the bottom shows the difference when the HPLC purity after 20 days has passed from the HPLC purity on the 0th day, and the larger this value is, the more decomposition has occurred. ing.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

下記構造式で示される、シトシン型架橋型ヌクレオシドアミダイト結晶である。 上記式中、Ｒ1、Ｒ2は置換基、Ｒ3は保護基を示す。

Description

シトシン型架橋型ヌクレオシドアミダイト結晶及びその製造方法
　本発明は、シトシン型架橋型ヌクレオシドアミダイト結晶及びその製造方法に関する。
　核酸医薬による疾病の治療法として、アンチセンス法、アンチジーン法、アプタマー法、ｓｉＲＮＡ法などがある。
　通常、ヌクレオシド糖部のフラノース環は平面構造ではなくＮ型又はＳ型と呼ばれる歪んだコンフォメーションを取っており、環状の置換基により特定の配座に偏っている。例として、２’位に水酸基を有するリボヌクレオシドの場合にはＮ型のコンフォメーションが優位となる。
　今西らは、ヌクレオシド糖部の４’位と２’位水酸基とを架橋することにより、ヌクレオシドのコンフォメーションを強制的にＮ型に固定することに成功した。結果として、この架橋型ヌクレオシドを含むＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ）は、相補的な配列の核酸と極めて安定な２重鎖を形成することが明らかとなった（特許文献１参照）。
　上記の特性等から、近年、核酸医薬の素材として、ＬＮＡに対する期待が高まっている。
　ＬＮＡの合成は、ホスホロアミダイト法と呼ばれる、架橋型ヌクレオシドのアミダイト体を用いた固相合成法を用いるのが一般的である（非特許文献１参照）。本方法では、脱トリチル化→アミダイト体のカップリング反応→キャップ反応→酸化（又はＳ化）反応というサイクルを目的の鎖長に達するまで繰り返すことで、ＬＮＡが合成される。すなわち、架橋型ヌクレオシドのアミダイト体は、ＬＮＡ合成の原料として用いられるため、産業上有用である。
　架橋型ヌクレオシドのアミダイト体は、泡状の非晶質（アモルファス）（非特許文献２，３，４参照）等の形態で流通している。一方で、架橋型ヌクレオシドのアミダイト体が結晶化するという報告はない。
特開平１０－３０４８８９号公報
T. Uemoto, 外8名, 「Direct and practical synthesis of 2’-O,4’-C-aminomethylene-bridged nucleic acid purine derivatives by transglycosylation」, Tetrahedron, 2017, vol.73, p.1211-1218 L. Takeshita, 外3名, 「Synthesis of Deoxypseudouridine 5’-Triphosphate Bearing the Photoremovable Protecting Group at the N1 Position Capable of Enzymatic Incorporation to DNA」, J. Org. Chem., 2020, vol.85, p.1861-1870 M. Horiba, 外2名, 「Synthesis of scpBNA-mC, -A, and -G Monomers and Evaluation of the Binding Affinities of scpBNA-Modified Oligonucleotides toward Complementary ssRNA and ssDNA」, J. Org. Chem., 2016, vol.81, p.11000-11008 C. Riml, 外1名, 「Synthesis of 5-Hydroxymethylcytidine- and 5-Hydroxymethyl-uridine-Modified RNA」, Synthesis, 2016, vol.48, p.1108-1116
　本発明者は、ＬＮＡの合成について検討する中で、架橋型ヌクレオシドのアミダイト体のアモルファスの安定性が低いことを見出した。本発明は、架橋型ヌクレオシドのアミダイト体に存在する上記アモルファスの課題を解決することを目的とする。
　本発明者は、鋭意研究を進める中で、シトシン型架橋型ヌクレオシドのアミダイト体の結晶を初めて取得した。そして、当該結晶が上記アモルファスの課題を解決できることを見出し、更なる検討を行うことで、本発明を完成させた。なお、本明細書において、シトシン型架橋型ヌクレオシドのアミダイト体を「シトシン型架橋型ヌクレオシドアミダイト」、その結晶を「シトシン型架橋型ヌクレオシドアミダイト結晶」、アモルファス状のシトシン型架橋型ヌクレオシドのアミダイト体を「シトシン型架橋型ヌクレオシドアミダイトアモルファス」と略すことがある。
　すなわち、本発明は、下記構造式で示される、シトシン型架橋型ヌクレオシドアミダイト結晶である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
 上記式中、Ｒ1、Ｒ2は置換基、Ｒ3は保護基を示す。
　また、本発明は、シトシン型架橋型ヌクレオシドアミダイトアモルファスをニトリル系溶媒に溶解し、析出する結晶を取得する工程を含む、シトシン型架橋型ヌクレオシドアミダイト結晶の製造方法である。
　さらに、本発明は、シトシン型架橋型ヌクレオシドアミダイトアモルファスを易溶性溶媒に溶解後、難溶性溶媒を添加する工程を含む、シトシン型架橋型ヌクレオシドアミダイト結晶の製造方法である。
　本発明によれば、架橋型ヌクレオシドのアミダイト体に存在する上記アモルファスの課題を解決したシトシン型架橋型ヌクレオシドアミダイト結晶及びその製造方法を提供することができる。すなわち、本発明のシトシン型架橋型ヌクレオシドアミダイト結晶は、安定性に優れ、５０℃という高温条件下であっても安定的に保管することができる。
図１は、実施例１において取得されたＮ4－ベンゾイル－５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－２’－Ｏ－４’－Ｃ－メチレン－５－メチルシチジン－３’－Ｏ－［Ｏ－（２－シアノエチル）－Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルホスホロアミダイト］の結晶Ａの外観を示す。 図２は、実施例２において取得されたＮ4－ベンゾイル－５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－２’－Ｏ－４’－Ｃ－メチレン－５－メチルシチジン－３’－Ｏ－［Ｏ－（２－シアノエチル）－Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルホスホロアミダイト］の結晶Ｂの外観を示す。 図３は、実施例３において取得されたＮ4－ベンゾイル－５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－２’－Ｏ－４’－Ｃ－メチレン－５－メチルシチジン－３’－Ｏ－［Ｏ－（２－シアノエチル）－Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルホスホロアミダイト］の結晶Ｃの外観を示す。 図４は、実施例１において取得されたＮ4－ベンゾイル－５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－２’－Ｏ－４’－Ｃ－メチレン－５－メチルシチジン－３’－Ｏ－［Ｏ－（２－シアノエチル）－Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルホスホロアミダイト］の結晶ＡのＸ線回折スペクトルを示す。縦軸は回折強度（ＣＰＳ）を表し、横軸は回折角度（２θ）を表す。 図５は、実施例２において取得されたＮ4－ベンゾイル－５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－２’－Ｏ－４’－Ｃ－メチレン－５－メチルシチジン－３’－Ｏ－［Ｏ－（２－シアノエチル）－Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルホスホロアミダイト］の結晶ＢのＸ線回折スペクトルを示す。縦軸は回折強度（ＣＰＳ）を表し、横軸は回折角度（２θ）を表す。 図６は、実施例３において取得されたＮ4－ベンゾイル－５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－２’－Ｏ－４’－Ｃ－メチレン－５－メチルシチジン－３’－Ｏ－［Ｏ－（２－シアノエチル）－Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルホスホロアミダイト］の結晶ＣのＸ線回折スペクトルを示す。縦軸は回折強度（ＣＰＳ）を表し、横軸は回折角度（２θ）を表す。 図７は、実施例１において取得されたＮ4－ベンゾイル－５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－２’－Ｏ－４’－Ｃ－メチレン－５－メチルシチジン－３’－Ｏ－［Ｏ－（２－シアノエチル）－Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルホスホロアミダイト］の結晶Ａの示差走査熱量分析結果を示す。図中、縦軸の「ＤＳＣ　ｍＷ」は熱量変化を表し、横軸の「Ｔｅｍｐ　℃」は温度変化を示す。 図８は、実施例２において取得されたＮ4－ベンゾイル－５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－２’－Ｏ－４’－Ｃ－メチレン－５－メチルシチジン－３’－Ｏ－［Ｏ－（２－シアノエチル）－Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルホスホロアミダイト］の結晶Ｂの示差走査熱量分析結果を示す。図中、縦軸の「ＤＳＣ　ｍＷ」は熱量変化を表し、横軸の「Ｔｅｍｐ　℃」は温度変化を示す。 図９は、実施例３において取得されたＮ4－ベンゾイル－５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－２’－Ｏ－４’－Ｃ－メチレン－５－メチルシチジン－３’－Ｏ－［Ｏ－（２－シアノエチル）－Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルホスホロアミダイト］の結晶Ｃの示差走査熱量分析結果を示す。図中、縦軸の「ＤＳＣ　ｍＷ」は熱量変化を表し、横軸の「Ｔｅｍｐ　℃」は温度変化を示す。 図１０は、比較例において取得されたＮ4－ベンゾイル－５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－２’－Ｏ－４’－Ｃ－メチレン－５－メチルシチジン－３’－Ｏ－［Ｏ－（２－シアノエチル）－Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルホスホロアミダイト］のアモルファスの示差走査熱量分析結果を示す。図中、縦軸の「ＤＳＣ　ｍＷ」は熱量変化を表し、横軸の「Ｔｅｍｐ　℃」は温度変化を示す。 図１１は、実施例１～３において取得されたＮ4－ベンゾイル－５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－２’－Ｏ－４’－Ｃ－メチレン－５－メチルシチジン－３’－Ｏ－［Ｏ－（２－シアノエチル）－Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルホスホロアミダイト］結晶Ａ～Ｃ及び対照のアモルファスの安定性試験の結果を示す。図中、縦軸はＨＰＬＣ（％）を、横軸は経過日数を表す。
　本発明は、一態様において、下記の構造式で示すシトシン型架橋型ヌクレオシドアミダイト結晶を提供する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
　上記式中、Ｒ1、Ｒ2は置換基、Ｒ3は保護基を示す。Ｒ1で示す置換基は、アセチル基、プロピオニル基、イソブチリル基、ベンゾイル基などのアシル基やジメチルアミノメチレン基で保護されたアミノ基、又はアミノ基である。Ｒ2で示す置換基は、メチル基又は水素原子である。Ｒ3で示す保護基は、トリチル基、モノメトキシトリチル基、ジメトキシトリチル基又はピキシル基である。これらの中でも、汎用性の点からＲ1はベンズアミド基、Ｒ2はメチル基、Ｒ3はジメトキシトリチル基が好ましい。
　本発明のシトシン型架橋型ヌクレオシドアミダイト結晶は、結晶取得条件の違いにより、異なる結晶形をとりうる。本明細書においては、この結晶多形を結晶Ａ、結晶Ｂ及び結晶Ｃと便宜上記載する。
　本発明のシトシン型架橋型ヌクレオシドアミダイト結晶は、柱状又は樹枝状結晶として得られる。結晶Ａの外観写真を図１に、結晶Ｂの外観写真を図２に、結晶Ｃの外観写真を図３に示す。
　本発明のシトシン型架橋型ヌクレオシドアミダイト結晶は、Ｃｕ－Ｋα線を用いた粉末Ｘ線回折装置で分析すると、後述実施例に示すように、回折角（２θ）が下記に示す結晶Ａ、結晶Ｂ及び結晶Ｃの特徴的なピークパターンのうちいずれか１つを有する。
（結晶Ａ）７．９６，８．９４，９．５０，１０．４９，１１．００，１１．１２，１３．４５，１３．８２，１６．７９，１７．７６，１８．２２，１９．１４，１９．２７，１９．８４，２０．３１，２０．６０，２１．３８，２２．６５，２４．９９，２５．３３，２６．４２（°）
（結晶Ｂ）８．０９，１０．２８，１０．５９，１１．０７，１１．３８，１２．９３，１３．５０，１５．０１，１６．７３，１６．９２，１７．４３，１７．７４，１８．７７，１９．７１，２０．５１，２１．５０，２１．７４，２２．００，２２．２２，２２．７２，２３．４３，２３．８０，２４．１３，２４．７８，２８．１０（°）
（結晶Ｃ）８．０６，１０．２０，１０．５２，１１．０１，１１．３５，１１．６３，１２．９２，１３．４８，１４．９３，１５．９５，１６．６８，１６．８９，１７．３３，１７．６１，１８．５０，１８．７２，１９．７０，１９．９０，２０．４９，２１．４３，２１．８５，２２．１６，２２．５７，２３．７６，２７．９６（°）
　結晶Ａのピークパターンを図４に、結晶Ｂのピークパターンを図５に、結晶Ｃのピークパターンを図６に示す。
　一般に、粉末Ｘ線回折における回折角（２θ）は、５％未満の誤差範囲を含む場合があることから、粉末Ｘ線回折におけるピークの回折角が完全に一致する結晶のほか、ピークの回折角が５％未満の誤差で一致する結晶も、本発明のシトシン型架橋型ヌクレオシドアミダイト結晶に包含される。例えば、本発明のシトシン型架橋型ヌクレオシドアミダイト結晶は、粉末Ｘ線回折の回折角（２θ）として、下記に示す結晶Ａ、結晶Ｂ及び結晶Ｃの特徴的なピークパターンのうちいずれか１つを有する。
（結晶Ａ）７．９６±０．４０，８．９４±０．４５，９．５０±０．４８，１０．４９±０．５２，１１．００±０．５５，１１．１２±０．５６，１３．４５±０．６７，１３．８２±０．６９，１６．７９±０．８４，１７．７６±０．８９，１８．２２±０．９１，１９．１４±０．９６，１９．２７±０．９６，１９．８４±０．９９，２０．３１±１．０２，２０．６０±１．０３，２１．３８±１．０７，２２．６５±１．１３，２４．９９±１．２５，２５．３３±１．２７，２６．４２±１．３２（°）
（結晶Ｂ）８．０９±０．４１，１０．２８±０．５１，１０．５９±０．５３，１１．０７±０．５５，１１．３８±０．５７，１２．９３±０．６５，１３．５０±０．６８，１５．０１±０．７５，１６．７３±０．８４，１６．９２±０．８５，１７．４３±０．８７，１７．７４±０．８９，１８．７７±０．９４，１９．７１±０．９９，２０．５１±１．０３，２１．５０±１．０８，２１．７４±１．０９，２２．００±１．１０，２２．２２±１．１１，２２．７２±１．１４，２３．４３±１．１７，２３．８０±１．１９，２４．１３±１．２１，２４．７８±１．２４，２８．１０±１．４１（°）
（結晶Ｃ）８．０６±０．４０，１０．２０±０．５１，１０．５２±０．５３，１１．０１±０．５５，１１．３５±０．５７，１１．６３±０．５８，１２．９２±０．６５，１３．４８±０．６７，１４．９３±０．７５，１５．９５±０．８０，１６．６８±０．８３，１６．８９±０．８５，１７．３３±０．８７，１７．６１±０．８８，１８．５０±０．９３，１８．７２±０．９４，１９．７０±０．９９，１９．９０±１．００，２０．４９±１．０２，２１．４３±１．０７，２１．８５±１．０９，２２．１６±１．１１，２２．５７±１．１３，２３．７６±１．１９，２７．９６±１．４０（°）
　なお、本明細書において、粉末Ｘ線回折は以下の条件で行うものとする。
　使用機器：Ｘ線回折装置Ｘ’Ｐｅｒｔ ＰＲＯ ＭＰＤ（スペクトリス）
　ターゲット：Ｃｕ
　Ｘ線管電流：４０ｍＡ
　Ｘ線管電圧：４５ｋＶ
　走査範囲：２θ＝４．０～４０．０°
　本発明のシトシン型架橋型ヌクレオシドアミダイト結晶は、示差走査熱量分析装置（島津製作所社製）（昇温速度５℃／分）で分析したとき、結晶Ａでは図７に示すように９６、１７６、１８４℃付近（±２℃の誤差）、結晶Ｂでは図８に示すように１４８、１８３℃付近（±２℃の誤差）、結晶Ｃでは図９に示すように１７７、１８３℃付近（±２℃の誤差）に融解による吸熱ピークを示す。一方、アモルファスでは、図１０に示すように吸熱ピークを示さなかった。
　本発明のシトシン型架橋型ヌクレオシドアミダイト結晶は、極めて安定性が高く、後述する実施例にて実証されているように、例えば５０℃の条件下で２０日間保管された場合であっても、分解度を１％以内に抑えることができる。
　なお、本明細書において、「分解度」とは、以下の条件により安定性試験を一定期間行った場合の、安定性試験開始時のシトシン型架橋型ヌクレオシドアミダイト結晶の純度から保管後の純度を減算したものと定義する。純度は、ＨＰＬＣによって求めることができる。分解度が大きいことは分解が進行して純度が低下したことを意味する。
（安定性試験条件）
　温度：５０℃
　保管条件：結晶をガラスバイアル中に２０ｍｇ入れ密閉保管
（ＨＰＬＣ条件）
　カラム：ＹＭＣ－Ｔｒｉａｒｔ　Ｃ１８，１５０×４．６ｍｍＩ．Ｄ．（ＹＭＣ社製）
　溶出液：８０体積％アセトニトリルを含む５ｍＭ トリエチルアンモニウムアセテート（ｐＨ７．０）
　検出法：ＵＶ２８０ｎｍによる検出
　本発明は、別の態様において、シトシン型架橋型ヌクレオシドアミダイト結晶の製造方法を提供する。
　本発明のシトシン型架橋型ヌクレオシドアミダイト結晶は、ニトリル系溶媒に対するホスホロアミダイト基の親和性の低さを利用して取得することができる。すなわち、本発明のシトシン型架橋型ヌクレオシドアミダイト結晶は、シトシン型架橋型ヌクレオシドアミダイトアモルファスをニトリル系溶媒に溶解し、結晶を析出させることによって取得することができる（方法Ａ）。或いは、別の方法として、易溶性溶媒にシトシン型架橋型ヌクレオシドアミダイトアモルファスを溶解後、難溶性溶媒を添加することでもシトシン型架橋型ヌクレオシドアミダイト結晶を取得することができる（方法Ｂ）。
　方法Ａの具体的な方法としては、下記化３にて示されるホスホロアミダイト基の付加反応、及び通常の精製操作の後、得られたシトシン型架橋型ヌクレオシドアミダイトアモルファスをニトリル系溶媒に一度溶解し、その後、結晶として析出させる方法が例示される。この際、撹拌、冷却といった操作は特に必要ないが、これらの操作を実施しても良い。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 上記式中、Ｒ1、Ｒ2は置換基、Ｒ3は保護基を示す。
　このとき、ニトリル系溶媒としては、アセトニトリル、プロピオニトリル、ブチロニトリル、バレロニトリル、ベンゾニトリル等を利用することができる。中でも、安全性、取扱いの点からアセトニトリルやプロピオニトリルが好ましく、コストの点からアセトニトリルがより好ましい。一方で、この方法Ａでは、当該化合物の溶解性が高いといった理由から、メタノール、エタノールといったプロトン性極性溶媒、ジクロロメタン、酢酸エチル、クロロホルム、テトラヒドロフランのような非極性溶媒を含有させないことが重要である。
　方法Ｂの具体的な方法としては、方法Ａと同様にして得られたシトシン型架橋型ヌクレオシドアミダイトアモルファスを易溶性溶媒に一度溶解し、その後、難溶性溶媒を添加することで結晶として析出させる方法が例示される。易溶性溶媒としては、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｔｅｒｔ－ブタノール、ｎ－ブタノールのようなアルコール系溶媒、アセトン、ブタノンのようなケトン系溶媒、ジクロロメタン、クロロホルムといったハロゲン系溶媒、酢酸エチル、酢酸ブチルのようなエステル系溶媒、テトラヒドロフラン、ｔｅｒｔ－ブチルメチルエーテルのようなエーテル系溶媒等を利用することができる。難溶性溶媒としては、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン等の炭化水素系溶媒を利用することができる。
　上記の結晶取得工程においては、より効率的に結晶を取得するために、溶液の冷却、種結晶の添加、超音波照射といった操作を加えても良い。
　本合成工程は、公知の文献（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　１９９８，５４，３６０７－３６３０等）を適宜参照することでも、当業者であれば行うことができる。例としては、アセトニトリル又はジクロロメタンといった有機溶媒中、２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトライソプロピルホスホロアミダイトとテトラゾール若しくは置換テトラゾールとの組み合わせ、又は２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルクロロホスホロアミダイトとジイソプロピルエチルアミンとの組み合わせを用いて、室温で２～３時間反応させ、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）やＨＰＬＣにより原料の消失を確認後、通常の後処理を行えばよい。
　このようにして合成されたシトシン型架橋型ヌクレオシドアミダイトは、シリカゲル等を担体としたクロマトグラフィーによる精製後、ニトリル系溶媒に溶解すること、さらに状況に応じて、難溶性溶媒の添加、種結晶の添加、冷却、撹拌といった操作を加えることにより結晶として析出させることができる。
　上記製法によって得られたシトシン型架橋型ヌクレオシドアミダイト結晶は、加圧濾過、減圧濾過、バスケット分離、フィルタープレス、といった濾過法により濾取した後、乾燥させることで、製品とすることができる。乾燥させる際には、コニカル乾燥、棚乾燥を含む減圧乾燥、流動層乾燥、棚乾燥を含む通風乾燥、及び噴霧乾燥等の方法を適宜利用することができる。
　以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明がこれに限定されないのは明らかである。
（実施例１：結晶Ａ）５－メチルシトシン型架橋型ヌクレオシドアミダイト（Ｒ1＝ベンズアミド基、Ｒ2＝メチル基、Ｒ3＝ジメトキシトリチル基）結晶の調製
　公知の文献（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　１９９８，５４，３６０７－３６３０）に記載の方法に従い、５－メチルシトシン型架橋型ヌクレオシドアミダイト（Ｒ1＝ベンズアミド基、Ｒ2＝メチル基、Ｒ3＝ジメトキシトリチル基）を調製した。
　得られたアモルファス状の５－メチルシトシン型架橋型ヌクレオシドアミダイト（Ｒ1＝ベンズアミド基、Ｒ2＝メチル基、Ｒ3＝ジメトキシトリチル基）０．６５ｇを、アセトニトリル　５ｍＬに溶解し、－２０℃で７日間静置することで結晶が析出した。
　得られた結晶を、吸引濾取後、真空乾燥することにより、５－メチルシトシン型架橋型ヌクレオシドアミダイト（Ｒ1＝ベンズアミド基、Ｒ2＝メチル基、Ｒ3＝ジメトキシトリチル基）の結晶を取得した（０．３５ｇ）。
（実施例２：結晶Ｂ）５－メチルシトシン型架橋型ヌクレオシドアミダイト（Ｒ1＝ベンズアミド基、Ｒ2＝メチル基、Ｒ3＝ジメトキシトリチル基）結晶の調製
　公知の文献（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　１９９８，５４，３６０７－３６３０）に記載の方法に従い、５－メチルシトシン型架橋型ヌクレオシドアミダイト（Ｒ1＝ベンズアミド基、Ｒ2＝メチル基、Ｒ3＝ジメトキシトリチル基）を調製した。
　得られたアモルファス状の５－メチルシトシン型架橋型ヌクレオシドアミダイト（Ｒ1＝ベンズアミド基、Ｒ2＝メチル基、Ｒ3＝ジメトキシトリチル基）１．００ｇを、ジクロロメタン　１ｍＬに溶解後、ヘキサン　１５ｍＬを徐々に添加した。この溶液に超音波を照射することで結晶が析出した。この溶液に、ヘキサンをさらに１０ｍＬ添加後、３時間静置した。溶液中に析出した結晶を、吸引濾取後、真空乾燥することにより、５－メチルシトシン型架橋型ヌクレオシドアミダイト（Ｒ1＝ベンズアミド基、Ｒ2＝メチル基、Ｒ3＝ジメトキシトリチル基）の結晶を取得した（０．８１ｇ）。
（実施例３：結晶Ｃ）５－メチルシトシン型架橋型ヌクレオシドアミダイト（Ｒ1＝ベンズアミド基、Ｒ2＝メチル基、Ｒ3＝ジメトキシトリチル基）結晶の調製
　公知の文献（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　１９９８，５４，３６０７－３６３０）に記載の方法に従い、５－メチルシトシン型架橋型ヌクレオシドアミダイト（Ｒ1＝ベンズアミド基、Ｒ2＝メチル基、Ｒ3＝ジメトキシトリチル基）を調製した。
　得られたアモルファス状の５－メチルシトシン型架橋型ヌクレオシドアミダイト（Ｒ1＝ベンズアミド基、Ｒ2＝メチル基、Ｒ3＝ジメトキシトリチル基）１．００ｇを、アセトニトリル　１ｍＬに溶解し、－２０℃で２時間静置することで結晶が析出した（０．８０ｇ）。
（比較例）結晶化溶媒としてジクロロメタンのみ、またはジクロロメタン－アセトニトリル（１：１）を用いた場合
　実施例１に記載の方法でアモルファス状の５－メチルシトシン型架橋型ヌクレオシドアミダイトを取得した。溶解させる溶媒をアセトニトリルからジクロロメタンのみ、又はジクロロメタン－アセトニトリル（１：１）に替え、その他の条件は実施例１と同条件として結晶化検討を行ったが、結晶は析出しなかった。
（実施例４）結晶の各種物性分析
　実施例１，２，３にて取得された５－メチルシトシン型架橋型ヌクレオシドアミダイト（Ｒ1＝ベンズアミド基、Ｒ2＝メチル基、Ｒ3＝ジメトキシトリチル基）結晶の各種物性分析を行った。
（ア）結晶形
　実施例１にて取得された５－メチルシトシン型架橋型ヌクレオシドアミダイト（Ｒ1＝ベンズアミド基、Ｒ2＝メチル基、Ｒ3＝ジメトキシトリチル基）結晶Ａの外観写真を図１に示す。図１に示すように、５－メチルシトシン型架橋型ヌクレオシドアミダイト結晶は柱状の結晶形を示すことが明らかとなった。
　実施例２及び３にて取得された５－メチルシトシン型架橋型ヌクレオシドアミダイトも、結晶の大きさは異なるものの、同様に柱状、又は樹枝状の外観を示した。実施例２にて取得された結晶Ｂの外観写真を図２に、実施例３にて取得された結晶Ｃの外観写真を図３に示す。
（イ）純度測定
　上記実施例１にて取得された５－メチルシトシン型架橋型ヌクレオシドアミダイト（Ｒ1＝ベンズアミド基、Ｒ2＝メチル基、Ｒ3＝ジメトキシトリチル基）結晶Ａの純度を、ＨＰＬＣ法で分析した結果、５－メチルシトシン型架橋型ヌクレオシドアミダイト結晶Ａの純度は９８．８％であった。なお、ＨＰＬＣ法は以下の条件で行った。
（ＨＰＬＣ条件）
　カラム：ＹＭＣ－Ｔｒｉａｒｔ　Ｃ１８，１５０×４．６ｍｍＩ．Ｄ．（ＹＭＣ社製）
　溶出液：８０体積％アセトニトリルを含む５ｍＭ トリエチルアンモニウムアセテート（ｐＨ７．０）
　検出法：ＵＶ２８０ｎｍによる検出
　上記実施例２及び３にて取得された５－メチルシトシン型架橋型ヌクレオシドアミダイト結晶Ｂ及びＣも、同様の条件で純度を測定したところ、実施例２にて取得された５－メチルシトシン型架橋型ヌクレオシドアミダイト結晶Ｂの純度は９８．７％、実施例３にて取得された５－メチルシトシン型架橋型ヌクレオシドアミダイト結晶Ｃの純度は９８．６％であった。
（ウ）粉末Ｘ線回折
　実施例１～３にて取得された５－メチルシトシン型架橋型ヌクレオシドアミダイト（Ｒ1＝ベンズアミド基、Ｒ2＝メチル基、Ｒ3＝ジメトキシトリチル基）結晶Ａ、Ｂ及びＣについて、Ｘ線回折装置Ｘ’Ｐｅｒｔ ＰＲＯ ＭＰＤ（スペクトリス）を用い、下記の測定条件でＸ線回折スペクトルを測定した。
（測定条件）
　ターゲット：Ｃｕ
　Ｘ線管電流：４０ｍＡ
　Ｘ線管電圧：４５ｋＶ
　走査範囲：２θ＝４．０～４０．０°
　図４及び表１に示すように、５－メチルシトシン型架橋型ヌクレオシドアミダイト（Ｒ1＝ベンズアミド基、Ｒ2＝メチル基、Ｒ3＝ジメトキシトリチル基）結晶Ａは、回折角（２θ）が、
（結晶Ａ）７．９６，８．９４，９．５０，１０．４９，１１．００，１１．１２，１３．４５，１３．８２，１６．７９，１７．７６，１８．２２，１９．１４，１９．２７，１９．８４，２０．３１，２０．６０，２１．３８，２２．６５，２４．９９，２５．３３，２６．４２（°）付近にピークを示し、特に７．９６，１１．００，１３．４５，１３．８２，１６．７９，１７．７６，２０．６０（°）
付近に特徴的なピークを示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　図５及び表２に示すように、実施例２にて取得された５－メチルシトシン型架橋型ヌクレオシドアミダイト（Ｒ1＝ベンズアミド基、Ｒ2＝メチル基、Ｒ3＝ジメトキシトリチル基）結晶Ｂは、回折角（２θ）が、
（結晶Ｂ）８．０９，１０．２８，１０．５９，１１．０７，１１．３８，１２．９３，１３．５０，１５．０１，１６．７３，１６．９２，１７．４３，１７．７４，１８．７７，１９．７１，２０．５１，２１．５０，２１．７４，２２．００，２２．２２，２２．７２，２３．４３，２３．８０，２４．１３，２４．７８，２８．１０（°）
付近に特徴的なピークを示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　図６及び表３に示すように、実施例３にて取得された５－メチルシトシン型架橋型ヌクレオシドアミダイト（Ｒ1＝ベンズアミド基、Ｒ2＝メチル基、Ｒ3＝ジメトキシトリチル基）結晶Ｃは、回折角（２θ）が、
（結晶Ｃ）８．０６，１０．２０，１０．５２，１１．０１，１１．３５，１１．６３，１２．９２，１３．４８，１４．９３，１５．９５，１６．６８，１６．８９，１７．３３，１７．６１，１８．５０，１８．７２，１９．７０，１９．９０，２０．４９，２１．４３，２１．８５，２２．１６，２２．５７，２３．７６，２７．９６（°）
付近に特徴的なピークを示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
（エ）示差走査熱量分析
　５－メチルシトシン型架橋型ヌクレオシドアミダイト（Ｒ1＝ベンズアミド基、Ｒ2＝メチル基、Ｒ3＝ジメトキシトリチル基）結晶Ａ～Ｃを、示差走査熱量分析（ＤＳＣ）装置（昇温速度５℃／分）で分析した。結晶Ａは図７に示すように９６、１７６、１８４℃付近（±２℃の誤差）、結晶Ｂは図８に示すように１４８、１８３℃付近（±２℃の誤差）、結晶Ｃは図９に示すように１７７、１８３℃付近（±２℃の誤差）に、融解による吸熱ピークを示した。一方、アモルファスは図１０に示すように吸熱ピークを有さなかった。
（実施例５）５－メチルシトシン型架橋型ヌクレオシドアミダイト結晶と公知アモルファスとの安定性比較
　実施例１、実施例２、実施例３にて取得された５－メチルシトシン型架橋型ヌクレオシドアミダイト（Ｒ1＝ベンズアミド基、Ｒ2＝メチル基、Ｒ3＝ジメトキシトリチル基）結晶Ａ～Ｃと、比較例にて取得されたアモルファスの安定性を、以下に記載する方法にて比較した。
（安定性試験条件）
　温度：５０℃
　保管条件：結晶Ａ～Ｃ又はアモルファスをガラスバイアル中に２０ｍｇ入れ密閉保管
　サンプリング時間：１、２、３、４、６、２０（日）経過後、それぞれの検体をサンプリングし、ＨＰＬＣ分析に供した。
（ＨＰＬＣ条件）
　カラム：ＹＭＣ－Ｔｒｉａｒｔ　Ｃ１８，１５０×４．６ｍｍＩ．Ｄ．（ＹＭＣ社製）
　溶出液：８０体積％アセトニトリルを含む５ｍＭ トリエチルアンモニウムアセテート（ｐＨ７．０）　
　検出法：ＵＶ２８０ｎｍによる検出
　安定性試験の結果を、図１１及び表４に示す。なお、表中左端の列は経過日数を、「実施例１（結晶Ａ）」の列は実施例１にて取得された５－メチルシトシン型架橋型ヌクレオシドアミダイト（Ｒ1＝ベンズアミド基、Ｒ2＝メチル基、Ｒ3＝ジメトキシトリチル基）結晶Ａの対応する日数経過後のＨＰＬＣ純度を、「実施例２（結晶Ｂ）」の列は実施例２にて取得された５－メチルシトシン型架橋型ヌクレオシドアミダイト（Ｒ1＝ベンズアミド基、Ｒ2＝メチル基、Ｒ3＝ジメトキシトリチル基）結晶Ｂの対応する日数経過後のＨＰＬＣ純度を、「実施例３（結晶Ｃ）」の列は実施例３にて取得された５－メチルシトシン型架橋型ヌクレオシドアミダイト（Ｒ1＝ベンズアミド基、Ｒ2＝メチル基、Ｒ3＝ジメトキシトリチル基）結晶Ｃの対応する日数経過後のＨＰＬＣ純度を、「対照」の列は対照として用いたアモルファスの対応する日数経過後のＨＰＬＣ純度を示している。表中「－」と記載されているセルは、測定を実施していないことを表す。最下段の「分解度（Δ％）」は０日目のＨＰＬＣ純度から２０日経過後のＨＰＬＣ純度を減じたときの差分を示しており、この数値が大きいほどより分解が生じたことを意味している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　上記結果より、実施例１～３にて取得された５－メチルシトシン型架橋型ヌクレオシドアミダイト（Ｒ1＝ベンズアミド基、Ｒ2＝メチル基、Ｒ3＝ジメトキシトリチル基）結晶Ａ～Ｃは、５０℃条件下にて２０日間保管した後であっても、ＨＰＬＣ純度で１％以上の分解は見られず、極めて安定性が高いことが分かった。また、対照としたアモルファスでは分解度が６．６％であったことから、本発明の５－メチルシトシン型架橋型ヌクレオシドアミダイト結晶の安定性は、既存の５－メチルシトシン型架橋型ヌクレオシドアミダイト製品に比べて顕著に高いものであることが理解された。

Claims (7)

  1. 　下記構造式で示される、シトシン型架橋型ヌクレオシドアミダイト結晶。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     上記式中、Ｒ1、Ｒ2は置換基、Ｒ3は保護基を示す。
  2. 　Ｒ1がアシル基で保護されたアミノ基、ジメチルアミノメチレン基で保護されたアミノ基、又はアミノ基であり、Ｒ2がメチル基又は水素原子であり、Ｒ3がトリチル基、モノメトキシトリチル基、ジメトキシトリチル基又はピキシル基である、請求項１に記載のシトシン型架橋型ヌクレオシドアミダイト結晶。
  3. 　Ｒ1がベンズアミド基であり、Ｒ2がメチル基であり、Ｒ3がジメトキシトリチル基である、請求項１又は２に記載のシトシン型架橋型ヌクレオシドアミダイト結晶。
  4. 　Ｃｕ－Ｋα線を用いた粉末Ｘ線回折の回折角（２θ）として、下記に示す結晶Ａ、結晶Ｂ、及び結晶Ｃの特徴的なピークパターンのうちいずれか１つを有する、請求項１から３のいずれか１項に記載のシトシン型架橋型ヌクレオシドアミダイト結晶。
    （結晶Ａ）７．９６±０．４０，８．９４±０．４５，９．５０±０．４８，１０．４９±０．５２，１１．００±０．５５，１１．１２±０．５６，１３．４５±０．６７，１３．８２±０．６９，１６．７９±０．８４，１７．７６±０．８９，１８．２２±０．９１，１９．１４±０．９６，１９．２７±０．９６，１９．８４±０．９９，２０．３１±１．０２，２０．６０±１．０３，２１．３８±１．０７，２２．６５±１．１３，２４．９９±１．２５，２５．３３±１．２７，２６．４２±１．３２（°）
    （結晶Ｂ）８．０９±０．４１，１０．２８±０．５１，１０．５９±０．５３，１１．０７±０．５５，１１．３８±０．５７，１２．９３±０．６５，１３．５０±０．６８，１５．０１±０．７５，１６．７３±０．８４，１６．９２±０．８５，１７．４３±０．８７，１７．７４±０．８９，１８．７７±０．９４，１９．７１±０．９９，２０．５１±１．０３，２１．５０±１．０８，２１．７４±１．０９，２２．００±１．１０，２２．２２±１．１１，２２．７２±１．１４，２３．４３±１．１７，２３．８０±１．１９，２４．１３±１．２１，２４．７８±１．２４，２８．１０±１．４１（°）
    （結晶Ｃ）８．０６±０．４０，１０．２０±０．５１，１０．５２±０．５３，１１．０１±０．５５，１１．３５±０．５７，１１．６３±０．５８，１２．９２±０．６５，１３．４８±０．６７，１４．９３±０．７５，１５．９５±０．８０，１６．６８±０．８３，１６．８９±０．８５，１７．３３±０．８７，１７．６１±０．８８，１８．５０±０．９３，１８．７２±０．９４，１９．７０±０．９９，１９．９０±１．００，２０．４９±１．０２，２１．４３±１．０７，２１．８５±１．０９，２２．１６±１．１１，２２．５７±１．１３，２３．７６±１．１９，２７．９６±１．４０（°）
  5. 　シトシン型架橋型ヌクレオシドアミダイトアモルファスをニトリル系溶媒に溶解し、析出する結晶を取得する工程を含む、シトシン型架橋型ヌクレオシドアミダイト結晶の製造方法。
  6. 　シトシン型架橋型ヌクレオシドアミダイトアモルファスを易溶性溶媒に溶解後、難溶性溶媒を添加する工程を含む、シトシン型架橋型ヌクレオシドアミダイト結晶の製造方法。
  7. 　前記易溶性溶媒が、アルコール系溶媒、ケトン系溶媒、ハロゲン系溶媒、エステル系溶媒、エーテル系溶媒より選択されるいずれか１種以上の溶媒であり、前記難溶性溶媒が炭化水素系溶媒である、請求項６に記載のシトシン型架橋型ヌクレオシドアミダイト結晶の製造方法。
PCT/JP2021/045679 2020-12-11 2021-12-10 シトシン型架橋型ヌクレオシドアミダイト結晶及びその製造方法 WO2022124410A1 (ja)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020237016149A KR20230118076A (ko) 2020-12-11 2021-12-10 시토신형 가교형 뉴클레오시드 아미다이트 결정 및 그 제조 방법
JP2022568357A JPWO2022124410A1 (ja) 2020-12-11 2021-12-10
CN202180075896.8A CN116472276A (zh) 2020-12-11 2021-12-10 胞嘧啶型交联型核苷亚磷酰胺晶体及其制造方法
US18/265,880 US20240083935A1 (en) 2020-12-11 2021-12-10 Cytosine-type bridged nucleoside amidite crystals and method for producing same
EP21903506.0A EP4265627A1 (en) 2020-12-11 2021-12-10 Cytosine-type crosslinked nucleoside amidite crystals and method for producing same

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2020205688 2020-12-11
JP2020-205688 2020-12-11

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2022124410A1 true WO2022124410A1 (ja) 2022-06-16

Family

ID=81974587

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2021/045679 WO2022124410A1 (ja) 2020-12-11 2021-12-10 シトシン型架橋型ヌクレオシドアミダイト結晶及びその製造方法

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20240083935A1 (ja)
EP (1) EP4265627A1 (ja)
JP (1) JPWO2022124410A1 (ja)
KR (1) KR20230118076A (ja)
CN (1) CN116472276A (ja)
WO (1) WO2022124410A1 (ja)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH10304889A (ja) 1997-03-07 1998-11-17 Takeshi Imanishi 新規ビシクロヌクレオシド及びオリゴヌクレオチド類縁体
JP2002521310A (ja) * 1997-09-12 2002-07-16 エクシコン エ／エス オリゴヌクレオチド類似体
JP2004536125A (ja) * 2001-07-12 2004-12-02 サンタリス・ファルマ・アクティーゼルスカブ Ｌｎａホスホラミダイトの製造法
WO2019224172A1 (en) * 2018-05-25 2019-11-28 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Novel process for making allofuranose from glucofuranose
WO2020099533A1 (en) * 2018-11-16 2020-05-22 F. Hoffmann-La Roche Ag Streptavidin-coated solid phases with a member of a binding pair

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH10304889A (ja) 1997-03-07 1998-11-17 Takeshi Imanishi 新規ビシクロヌクレオシド及びオリゴヌクレオチド類縁体
JP2002521310A (ja) * 1997-09-12 2002-07-16 エクシコン エ／エス オリゴヌクレオチド類似体
JP2004536125A (ja) * 2001-07-12 2004-12-02 サンタリス・ファルマ・アクティーゼルスカブ Ｌｎａホスホラミダイトの製造法
WO2019224172A1 (en) * 2018-05-25 2019-11-28 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Novel process for making allofuranose from glucofuranose
WO2020099533A1 (en) * 2018-11-16 2020-05-22 F. Hoffmann-La Roche Ag Streptavidin-coated solid phases with a member of a binding pair

Non-Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
C. RIML ET AL.: "Synthesis of 5-Hydroxymethylcytidine- and 5-Hydroxymethyl-uridine-Modified RNA", SYNTHESIS, vol. 48, 2016, pages 1108 - 1116
KAORU : "Recrystallization method and precipitation method", EXPERIMENTAL CHEMISTRY COURSE (CONTINUED) 2 SEPARATION AND PURIFICATION, 25 January 1967 (1967-01-25), pages 159-178, 186 - 187, XP009509740 *
KOSHKIN, A.A. SINGH, S.K. NIELSEN, P. RAJWANSHI, V.K. KUMAR, R. MELDGAARD, M. OLSEN, C.E. WENGEL, J.: "LNA (Locked Nucleic Acids): Synthesis of the Adenine, Cytosine, Guanine, 5-Methylcytosine, Thymine and Uracil Bicyclonucleoside Monomers, Oligomerisation, and Unprecedented Nucleic Acid Recognition", TETRAHEDRON, ELSEVIER SIENCE PUBLISHERS, AMSTERDAM, NL, vol. 54, no. 14, 2 April 1998 (1998-04-02), AMSTERDAM, NL , pages 3607 - 3630, XP004110505, ISSN: 0040-4020, DOI: 10.1016/S0040-4020(98)00094-5 *
L. TAKESHITA ET AL.: "Synthesis of Deoxypseudouridine 5'-Triphosphate Bearing the Photoremovable Protecting Group at the N1 Position Capable of Enzymatic Incorporation to DNA", J. ORG. CHEM., vol. 85, 2020, pages 1861 - 1870
M. HORIBA ET AL.: "Synthesis of scpBNA-mC, -A, and -G Monomers and Evaluation of the Binding Affinities of scpBNA-Modified Oligonucleotides toward Complementary ssRNA and ssDNA", J. ORG. CHEM., vol. 81, 2016, pages 11000 - 11008, XP055376695, DOI: 10.1021/acs.joc.6b02036
NIELSEN POUL, ET AL.: "α-LNA (locked nucleic acid with α-D-configuration): synthesis and selective parallel recognition of RNA", CHEMISTRY-A EUROPEAN JOURNAL, vol. 8, no. 3, 2 February 2002 (2002-02-02), pages 712 - 722, XP055940870, DOI: 10.1002/1521-3765(20020201)8:3<712::AID-CHEM712>3.0.CO;2-0 *
SORENSEN M D,ET AL: "alpha-L-ribo-configured locked nucleic acid (alpha-L-LNA): Synthesis and properties", JOURNAL OF THE AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, vol. 124, no. 10, 13 March 2002 (2002-03-13), pages 2164 - 2176, XP002281373, ISSN: 0002-7863, DOI: 10.1021/ja0168763 *
T. UEMOTO ET AL.: "Direct and practical synthesis of 2'-O,4'-C-aminomethylene-bridged nucleic acid purine derivatives by transglycosylation", TETRAHEDRON, vol. 73, 2017, pages 1211 - 1218
TETRAHEDRON, vol. 54, 1998, pages 3607 - 3630

Also Published As

Publication number Publication date
KR20230118076A (ko) 2023-08-10
US20240083935A1 (en) 2024-03-14
CN116472276A (zh) 2023-07-21
JPWO2022124410A1 (ja) 2022-06-16
EP4265627A1 (en) 2023-10-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7296882B2 (ja) ホスホラミダイト及びオリゴヌクレオチド合成のための組成物及び方法
JP5714490B2 (ja) Ｒｎａ合成、リバース方向での合成ｒｎａためのホスホラミダイト、及びｒｎａオリゴマーの合成のための５’から３’方向に対する結合形成によるオリゴヌクレオチドを調製する方法
US9624258B2 (en) Polymorph of regadenoson
CN110914278B (zh) 在可见光区能进行光交联的光响应性核苷酸类似物
WO2014068589A2 (en) Novel process for the preparation of (1-{9-[(4s, 2r, 3r, 5r)-3, 4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl) oxolan-2-yl)-6-aminopurin-2-yl} pyrazole-4-yl)-n-methylcarboxamide
WO2022124410A1 (ja) シトシン型架橋型ヌクレオシドアミダイト結晶及びその製造方法
JP7475056B2 (ja) 光応答性ヌクレオチドアナログの製造方法
EP1253154B1 (en) Method for purifying 5&#39;-protected 2&#39;-deoxypurine nucleosides
JP4326841B2 (ja) 保護化２’−デオキシシチジン類の精製法
JP5192807B2 (ja) シュードウリジン保護体の安定結晶
WO2020256084A1 (ja) 架橋型ヌクレオシド中間体の結晶及びその製造方法、並びに架橋型ヌクレオシドアミダイトの製造方法
KR100741310B1 (ko) 젬시타빈의 합성에 유용한 신규한나프탈렌-2-카르복실레이트 유도체와 그의 제조방법
JP2019508438A (ja) 核配列に組み込むための５−（ｎ−保護−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジンホスホロアミダイトの化合物及び合成方法
TWI399381B (zh) 克拉屈濱（ｃｌａｄｒｉｂｉｎｅ）的製備方法
WO2022005988A2 (en) Solid support for synthesizing nucleic acid sequences and methods for making and using
JP2009519325A (ja) ２’、２’−ジフルオロヌクレオシドと中間体の製造プロセス
EP2948467A1 (en) Method for the solid-phase based synthesis of phosphate-bridged nucleoside conjugates
JP5105404B2 (ja) 水素結合性置換基を有する８−置換グアノシン誘導体及びそれを含むオリゴヌクレオチド
RU2135512C1 (ru) Способ получения 3&#39;-азидо- 2&#39;, 3&#39;-дидезокситимидина
JP3983085B2 (ja) ５’位保護化２’−デオキシプリンヌクレオシド類の包接化合物の製法
JPH0272191A (ja) ２′，３′―ジデオキシヌクレオシドの製造方法
JP2000264897A (ja) ５’−ｏ−トリチルヌクレオシド類の製造法
JP2004131434A (ja) ５’位保護化プリンヌクレオシド誘導体の単離精製法
WO2005021571A1 (ja) Ｎ４−ベンゾイルシチジン誘導体の製造法

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 21903506

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 202180075896.8

Country of ref document: CN

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2022568357

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 18265880

Country of ref document: US

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2021903506

Country of ref document: EP

Effective date: 20230711