TWI399381B - 克拉屈濱（ｃｌａｄｒｉｂｉｎｅ）的製備方法 - Google Patents

克拉屈濱（ｃｌａｄｒｉｂｉｎｅ）的製備方法 Download PDF

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Description

克拉屈濱(cladribine)的製備方法
本申請案請求之優先權基礎為於2009年8月18日申請之美國臨時專利申請案(案號為61/234,683)。該臨時申請案之內容已於此併入本文做為參考。
本發明涉及原料藥級(API)6-氨基-2-氯-9-(2'-去氧-β-D-呋喃核糖基)-嘌呤(或者稱為克拉屈濱(I)、CdA和2-氯-2'-去氧腺苷)的合成，其可用於製造規模上。
先前羅賓斯(Robins)和羅賓斯(Robins)(M. J.羅賓斯(Robins,M. J.)和R. K.羅賓斯(Robins,R. K.),美國化學會會志(J. Am. Chem. Soc. )1965, 87, 4934-4940)報導了1,3,5-三-O -乙醯基-2-去氧-D-呋喃核糖與2,6-二氯嘌呤的酸催化稠合產生65%產率的變旋異構體混合物2,6-二氯-9-(3',5'-二-O -乙醯基-2'-去氧-α -,β -D-呋喃核糖基)-嘌呤，通過從乙醇中分步結晶而從所述混合物中獲得產率為32%的呈純結晶產物形式的α-變旋異構體且等量β-變旋異構體保留在母液中(參見流程1)。並不進一步分離可用於合成克拉屈濱的β-變旋異構體。用甲醇氨溶液處理α-變旋異構體，導致同時發生去乙醯化和胺化反應，產生6-氨基-2-氯-9-(2'-去氧-α-D-呋喃核糖基)-嘌呤，其為克拉屈濱的非鏡像異構體。
流程1-羅賓斯1965年合成克拉屈濱的α-變旋異構體
布魯姆(Broom)等人(L. F.克莉絲汀森(Christensen,L. F.),A. D.布魯姆(Broom,A. D.),M. J.羅賓斯(Robins,M. J.)和A.布洛克(Bloch,A.),醫藥化學雜誌(J .Med .Chem .)1972 ,15, 735-739)修改了羅賓斯等人的方法，用液氨處理乙醯化混合物(即，2,6-二氯-9-(3',5'-二-O -乙醯基-2'-去氧-α ,β -D-呋喃核糖基)-嘌呤)且用對甲苯醯氯使所得2'-去氧-α -腺苷和2'-去氧-β -腺苷再醯化(參見流程2)。接著通過色譜分析法來分離所需2-氯-9-(3',5'-二-O -對甲苯醯基-2'-去氧-β -D-呋喃核糖基)-腺嘌呤且除去對甲苯醯基，產生基於1,3,5-三-O -乙醯基-2-去氧-D-呋喃核糖與2,6-二氯嘌呤的稠合的總產率為9%的克拉屈濱。
流程2-布魯姆1972年合成克拉屈濱
為增加有利於β -變旋異構體的立體選擇性，羅賓斯(Robins)等人(R. L.羅賓斯(Robins,R. L.)等人，美國化學會會志(J. Am. Chem. Soc. )1984 ,106 ,6379-6382，US4760137，EP0173059)提供一種改良方法，其中使2,6-二氯嘌呤的鈉鹽與1-氯-2-去氧-3,5-二-O -對甲苯醯基-α -D-呋喃核糖在乙腈(MeCN)中偶合，在色譜分析法和結晶法後，除13%的非所需N-7位置異構體外，產生分離產率為59%的受保護β -核苷(參見流程3)。這一偶合反應中的明顯較高的選擇性是歸因於通過嘌呤鈉鹽實現氯離子的直接SN 2置換。在100℃下用甲醇氨溶液處理受保護的N-9 2'-去氧-β -核苷，產生總產率為42%的克拉屈濱。這種方法的缺點是在SN 2反應中親核性7位氮與親核性9位競爭，產生N-7與N-9糖基異構體的混合物，以及需要進行色譜分析法和結晶法來獲得純的所需異構體。
流程3-羅賓斯的SN 2法
蓋茨伯格(Gerszberg)和阿朗索(Alonso)(S.蓋茨伯格(Gerszberg S.)和D.阿朗索(Alonso,D.) WO0064918，和US20020052491)也採用使用1-氯-2-去氧-3,5-二-O -對甲苯醯基-α-D-呋喃核糖的SN 2法，但改為使其與2-氯腺嘌呤的鈉鹽在丙酮中偶合，從乙醇中結晶，產生產率為60%的受保護克拉屈濱的所需β-變旋異構體(參見流程4)。在使用氨的甲醇(MeOH)溶液進行去保護的步驟之後，分離克拉屈濱的β -變旋異構體，基於1-氯糖的總產率為42%，且如果基於鈉鹽計算，那麼因為所述鈉鹽以2.3莫耳過量使用，所以總產率為30%。
流程4-蓋茨伯格(Gerszberg)和阿朗索(Alonso)的克拉屈濱合成
為增加針對N-9位的糖基化反應的位置選擇性，最近，庫普塔(Gupta)和蒙克(Munk)(P. K.庫普塔(Gupta,P. K.)和S. A.蒙克(Munk,S. A.)，US20040039190、WO2004018490和CA2493724)使用變旋異構純的α-變旋異構體，1-氯-2-去氧-3,5-二-O -對甲苯醯基-α -D-呋喃核糖進行SN 2反應，但使其與6-庚醯基醯胺基修飾的嘌呤的鉀鹽偶合(參見流程5)。龐大的烷基可能會在N-7位周圍賦予空間阻礙，從而產生所報導的位置選擇性改良。儘管如此，但在去保護後，基於1-氯糖的克拉屈濱的總產率為43%，這顯示對於相關方法來說總產率未得到實際改良。此外，2-氯腺嘌呤需要在高溫(130℃)下用庚酸酐預先醯化，產率為72%，且偶合需要低溫冷卻(-30℃)並使用強鹼六甲基二矽氮烷鉀且隨後進行柱色譜分析法以純化產物，即受保護的克拉屈濱。
流程5-庫普塔(Gupta)和蒙克(Munk)的克拉屈濱合成
近年來，羅賓斯(Robins)等人(M. J.羅賓斯(Robins,M. J.)等人，有機化學雜誌(J. Org. Chem. )2006, 71 ,7773-7779，US20080207891)公開了一種合成克拉屈濱的程式，其目的是實現用含1-氯-2-去氧-3,5-二-O -對甲苯醯基-α -D-呋喃核糖的MeCN/二氯甲烷(DCM)混合物對6-(經取代的咪唑-1-基)-嘌呤鈉鹽進行N-9位置選擇性糖基化以產生少量可檢測或無可檢測量的非所需α-變旋異構體的幾乎定量的產率(參見流程6)。實際上，這一情況僅在數毫克到數克規模下得到說明，且雖然在所需N-9-β-變旋異構體的色譜分析法後實際偶合產率較高(83%到定量)，但在再結晶後獲得產率為55%到76%的受保護6-(經取代的咪唑-1-基)-產物。在此之後，使用有毒苯甲基碘活化6-(咪唑-1-基)，隨後在60-80℃下在甲醇氨溶液中用氨取代，在離子交換色譜分析法和多次結晶後，或在用DCM萃取和結晶後，產生產率為59-70%的克拉屈濱。儘管顯示了高變旋異構和位置選擇性糖基化，但由於諸如對色譜分析法的依賴和在6-(咪唑-1-基)的取代中對壓力容器等要求，工藝時間比先前技術長，原子不經濟且不易應用於克拉屈濱的工業合成。
流程6-羅賓斯的基於6-(咪唑-1-基)的克拉屈濱合成
因此，需要更直接、更不費力的方法，其將以良好產率和高純度產生適用於工業規模的克拉屈濱。
根據本發明之概念，一種製備式I的克拉屈濱的方法
，其包含：
a)在有機溶劑溶液中使式II化合物
其中R1 ,R2 ,及R3 各自獨立為烷基、烯基、炔基或芳基，較佳的，R1 ,R2 ,及R3 各自獨立具有1到20個碳原子，更佳地，R1 ,R2,及R3 各自為甲基，x為0，1或2，y為2，1或0，且R4 為氫或SiR1 R2 R3 ，與具有式III的受保護的2-去氧-呋喃核糖偶合
其中R6 與R7 各自獨立為羥基保護基，且R5 為脫離基，以獲得包含式IV的β-變旋異構體的反應混合物
其中x'為0、1或2，y'為2、1或0；
b)在乙腈(MeCN)存在下，選擇性地從反應混合物使式IV的β-變旋異構體沉澱，獲得一非均質混合物；
c)將沈澱的式IV的β-變旋異構體從該非均質混合物中分離，獲得經分離且大體上富集的式IV的β-變旋異構體；和
d)將該經分離且大體上富集的式IV的β-變旋異構體轉變成克拉屈濱。
較佳地，羥基保護基可為醯基，諸如經取代或未經取代的苯甲醯基，較特定地係為4-氯-苯甲醯基。羥基保護基也可為矽烷基。R5 為一脫離基，其係在偶合反應中從式III化合物離開，以使得式II化合物和式III反應形成式IV化合物。舉例而言，該脫離基藉由被路易士酸(Lewis acid)或布朗斯特酸(BrΦ nsted acid)活化而離開式III化合物。舉例而言，該脫離基可為烷氧基、芳氧基或醯氧基(包含乙醯氧基、苯甲醯氧基(benzoyloxy)及經取代的苯甲醯氧基)，更佳地為乙醯氧基。
式II化合物可通過使用矽烷化劑的有機溶劑溶液或單純矽烷化劑使2-氯腺嘌呤矽烷化而被製備，其中x為0、1或2，對應地y為2、1或0，R4 為氫或SiR1 R2 R3 ，且當x為2，y為0時，R4 必為SiR1 R2 R3 。式II化合物較佳具有至少一個矽烷基，更佳至少兩個矽烷基。較佳地，該矽烷化反應係在有機溶劑中進行。該有機溶劑可為腈(nitrile)、乙醚、烴(諸如芳香烴或氯化烴)或矽烷化劑，包含乙腈(MeCN)、四氫呋喃(THF)、二氯甲烷(DCM)、二氯乙烷(DCE)、甲苯(PhMe)、六甲基二矽氮烷(HMDS)、N ,O -雙(三甲基矽烷基)三氟乙醯胺(BSTFA)、N ,O -雙(三甲基矽烷基)乙醯胺(BSA)或兩種或兩種以上之該等溶劑之混合物。更佳地，該有機溶劑為MeCN。較佳地，該溶劑與使用在偶合步驟(a)中的溶劑相同。矽烷化劑可為BSTFA、HMDS、BSA、三甲基氯矽烷(TMSCl)、N-甲基-N-(三甲基矽基)乙醯胺(MSA)、N-甲基-N-(三甲基矽基)三氟乙醯胺(MSTFA)或至少兩種溶劑之混合物。更佳地，該矽烷化劑為BSTFA。較佳地，矽烷化式II化合物不經分離而直接用於下一偶合反應中。
偶合步驟(a)係在路易士酸(Lewis acid)或布朗斯特酸(BrΦ nsted acid)存在下進行，較佳地在衍生自磺酸的路易士酸或布朗斯特酸存在下進行。較佳地，該衍生自磺酸的路易士酸為非金屬路易士酸。步驟(a)中所用的所述非金屬路易士酸或布朗斯特酸可為三氟甲磺酸(TfOH)、三氟甲磺酸三甲基矽酯(TMSOTf)、三乙基矽三氟甲磺酸酯(TESOTf)、三甲基碘矽烷(TMSI)、三氟甲磺酸叔丁基二甲基矽酯(TBSOTf)、對甲苯磺酸(TsOH)、甲磺酸(MsOH)、甲磺酸酐(Ms2 O)或兩種或兩種以上之該等酸之混合物。更佳地，該酸為TfOH。使用在偶合步驟(a)中的有機溶劑較佳為MeCN。偶合步驟(a)可在溫度約0℃到有機溶劑的回流溫度的範圍內進行，較佳為40℃至80℃，特定為約60℃，使得受保護的核苷產物IV的所需β-變旋異構體選擇性地從反應混合物中沉澱，所述產物幾乎不含非所需異構體和其他反應產物與雜質。
根據本發明之較佳態樣，在進行步驟(c)之前，如上述之方法進一步包含一步驟，將在步驟(b)中形成的非均質混合物富集(aging)，即，維持在步驟(b)中形成的非均質混合物在較高溫度下，較佳溫度40℃至80℃，更佳在60℃，歷時一段延長的時間，較佳不少於2小時，更佳從6至24小時。
該轉換步驟(d)可包含將式IV化合物去保護及/或除去矽烷基，如果存在的話，獲得克拉屈濱產品。
根據本發明之另一概念，一種製備具有增進純度的克拉屈濱的方法包含：
a)將粗品克拉屈濱在鹼存在下溶解在質子性溶劑以形成包含經溶解的粗品克拉屈濱溶液；
b)將該溶液維持在較高的溫度下(亦即，高於室溫，較佳在60℃到該質子性溶劑的回流溫度的範圍內)，以使得該溶液為均質直到在該溶液中受保護或部分受保護的核苷雜質的量減少到一預先決定的上限；
c)將步驟(b)中的溶液冷卻以形成且分離克拉屈濱的結晶。該較高溫度係指高於室溫，較佳在60℃到該質子性溶劑的回流溫度的範圍內。
該質子性溶劑可為脂肪醇(例如，C1 -C6 )，諸如甲醇(MeOH)及乙醇(EtOH)或脂肪醇與水的混合物。較佳地，該質子性溶劑為脂肪醇與水的混合物。此處使用的質子性溶劑可為兩種或兩種以上質子性溶劑的混合物。鹼可為烷氧化物、氫氧化物、碳酸鹼、銨鹽或胺，較佳地為甲醇鈉。
較佳地，該溶液中受保護或部分受保護的核苷雜質的量的預先決定的上限係通過HPLC分析該溶液可為0.10%。
上述經分離的克拉屈濱可進一步從例如脂肪醇與水中再結晶。
根據本發明之另一個概念，一種製備具有增進純度的式IV化合物的方法
，其中R1 、R2 及R3 各自獨立為烷基、烯基、炔基或芳基(例如，C1 至C20 )，x'為0、1或2，y'為2、1或0，R6 與R7 各自獨立為羥基保護基，該方法包含：
a)在矽烷化劑的存在下，以在有機溶劑中的衍生自磺酸的路易士酸或布朗斯特酸處理包含式IV化合物及至少一種非所需的異構體的混合物，以使得該至少一種非所需的異構體異構化且轉變成式IV化合物；和
b)從步驟(a)中的混合物分離出式IV化合物。
有機溶劑可為腈、乙醚、烴、芳香烴、氯化烴、或矽烷化劑，包含MeCN、THF、DCM、DCE、PhMe、HMDS、BSTFA、BSA或兩種或兩種以上之該等溶劑之混合物。更佳地，該有機溶劑為MeCN。
催化劑較佳為TfOH或TMSOTf。將被純化的式IV化合物可被非所需的α-變旋異構體(例如，如下所示之式V化合物)及/或N-7位置異構體(例如，如下所示之式VI及VII化合物)污染。
該包含式IV化合物之混合物可通過在有機溶劑中(較佳為MeCN)以矽烷化劑(較佳為BSTFA)處理非矽烷化式衍生式IV化合物(即其中x'為2且y'為0)而獲得，較佳係使用相對於非矽烷化式衍生式IV化合物莫耳過量之矽烷化劑，較佳地隨後不從有機溶劑中分離式IV化合物。
根據本發明所獲得之具有增進純度的式IV化合物可進一步被轉變成克拉屈濱，例如通過去除保護及/或矽烷基，如果存在的話。
根據本發明之另一概念，一種製備如前所定義之式IV化合物(即，R1 、R2 及R3 各自獨立為烷基、烯基、炔基或芳基，x'為0、1或2，y'為2、1或0，且R6 與R7 各自獨立為羥基保護基)的方法，該方法包含在衍生自磺酸的路易士酸或布朗斯特酸存在下，使如前所定義之式III的受保護的2-去氧-呋喃核糖在有機溶劑中與如前所定義的式II化合物偶合，以得到式IV化合物，其可以進一步轉變成克拉屈濱。該有機溶劑可為有機腈、芳香族化合物、氯化化合物、乙醚、烴或兩種或兩種以上之該等化合物之混合物。較佳地，該有機溶劑可為MeCN、PhMe、DCM、THF或兩種或兩種以上之該等化合物之混合物。
本發明之各種不同的新穎性特徵係特定地敘述於所附之申請專利範圍中且形成本發明揭露之一部分。為了更瞭解本發明，其操作好處及通其使用所獲得之特定意旨，可參考描述於本文中各實施例。
於本文中所使用之術語「富集之β-變旋異構體」係指包含超過1：1，較佳至少2：1，更佳至少3：1之β-變旋異構體/其相對應　-變旋異構體之核苷產品。
於本文中所使用之術語「大體上富集的式IV的β-變旋異構體」係指包含超過10：1，較佳至少20：1，更佳至少40：1之β-變旋異構體/其相對應　-變旋異構體之核苷產品。
於本文中所使用之術語「富集」係指維持反應混合物歷時一段延長的時間，例如至少2小時，較佳從6至24小時，在較高溫度下(即，高於室溫)，較佳溫度約40℃至約80℃，更佳在約60℃。更佳地，在富集中，在立即地前反應完成後，反應混合物係維持在相同或大體上相同的立即地前反應(即，如上討論之偶合反應)的條件下(例如，溫度、溶質濃度、催化劑量)。舉例而言，立即地前反應在富集步驟中不被妨礙或改變。如下所討論，富集將產生相較於其他不使用富集步驟更高的經分離所需β-變旋異構體的產率。
本發明涉及克拉屈濱(I)的合成(參見流程7)。
流程7-根據本發明之較佳態樣的克拉屈濱合成
克拉屈濱係通過使三-氧受保護的2-去氧-呋喃核糖III與矽烷化，較佳為雙矽烷化，2-氯腺嘌呤(II，矽烷化2-氯-6-氨基嘌呤)的由主要優選地衍生自磺酸的布朗斯特酸(BrΦ nstead acid)或更佳地衍生自磺酸的非金屬路易士酸(Lewis acid)(諸如磺酸的三甲基矽酯)催化的直接偶合所製備。在偶合反應步驟期間及完成富集步驟後，生成總體富集一定量的N-9糖基化產物的所需β-變旋異構體，相信這是歸因於未報到的非所需的N-9糖基化產物的α-變旋異構體轉V化為所需的N-9糖基化的β-變旋異構體IV的異構化作用(該等化合物之化學式如下所示)，以及異構化後從反應混合物中沉澱出來。矽烷化反應、偶合和富集步驟可在一個反應容器中進行，使工藝方法非常有效。偶合反應是由亞化學計量的催化劑催化，且由於催化劑的性質、其量少和受保護的N-9糖基化產物的所需β-變旋異構體IV從反應混合物中沉澱，因此不需要隨後催化劑失活步驟。此不需催化劑失活的步驟係製造克拉屈濱的好處，原因在於避免需要水性處理(aqueous work-up)，因為水性處理會增加工廠的操作時間。在另一步驟中，將分離的N -矽烷基、雙-O -醯基保護的產物Iva去保護，以良好產率和高純度產生克拉屈濱。高變旋異構和位置選擇性的受保護產物IV表示不需要純化步驟。偶合階段通過將僅三-O 上受保護的2-去氧-呋喃核糖III和催化劑添加到矽烷化2-氯腺嘌呤II中而無需其他處理步驟(即，無後處理、水性處理、催化劑失活/終止、蒸餾或試劑轉移)來進行。可通過過濾，以高純度和高產率將N-9糖基化核苷的所需受保護的β-變旋異構體IV以固體形式從偶合反應混合物中直接分離，且其不需要後續純化。β-變旋異構體IV分離產率比預期的產率高，且具有非常少量的α-變旋異構體。此係好的結果，因為催化數據顯示偶合變旋異構選擇性低。
因此，通過選擇α-變旋異構體溶解於溶液中但所需β-變旋異構體不溶解，以及在溶液中α-變旋異構體V異構化而損耗且使所得所需β-變旋異構體沉澱的條件，觀察到總體選擇性高。以這種方式，偶合反應中所形成的一些α-變旋異構體V可轉化為所需β-變旋異構體。通過富集步驟的結束，相較於β-變旋異構體，α-變旋異構體在反應的固相及液相中的量較少。N-7位置異構體VI和VII不是問題，因為在反應條件下其易異構化為熱力學更穩定的N-9異構體。將核苷的分離受保護的β-變旋異構體去保護，產生具有良好純度和高產率的克拉屈濱粗品。用於人類使用的純克拉屈濱可通過另一個結晶步驟來獲得。原料藥級產物的(HPLC純度>99.5%且無個別雜質>0.1%)總產率為約55%
R1 =4-氯苯甲醯基；x=0或1，y=2或1 受保護的核苷異構體
此處討論之矽烷化反應、偶合反應、富集反應及沈澱反應可以在一鍋中進行。所述偶合及富集後後，通過過濾，以高純度和高產率將所需核苷N-9糖基化β-變旋異構體(IV)以固體形式從偶合反應混合物中直接分離(通常不少於95%HPLC純度)，且其不需要純化。將這受保護核苷去保護，以高產率產生具有良好純度的克拉屈濱粗品。用於人類用途的純克拉屈濱可通過另一個結晶步驟來獲得。總產率可為約55%(除非另外明確地規定，否則此處和以下所述的產率是由起始物質的莫耳數和產物的莫耳數計算，即產率=(產物的莫耳數/起始物質的莫耳數)*100)。
我們驚訝地發現，在本發明的偶合條件下，α-變旋異構體對β-變旋異構體的立體化學異構化會發生。更重要地，我們發現該異構化程序可能會被控制，相較於通過適當選擇所需β-變旋異構體可被從反應溶液中沈澱出但非所需α-變旋異構體大體上不沈澱的條件，以提供更高產率的所需產品IV和在反應產品混合物中更高的β-變旋異構體對α-變旋異構體比率。通過選擇使得所需之異構體從反應液中顯著地沉澱出來，而不需之異構體不大量沉澱的條件，相較於另外可能出現的偶合反應，利用這個異構化及沈澱過程可提供更高產率的所需產物IV。這一異構化和沉澱所提供之N-9-β-變旋異構體的產率，且當富集步驟在偶合步驟後亦同，和純度比通過i)直接後處理完整產品混合物(亦即固相及液相)或ii)在採用均質條件進行偶合反應的條件下可能實現的高。
亦發現形成在偶合反應中的N-7位置異構體VI和VII不是問題，因為在反應條件下其易異構化為熱力學更穩定的N-9異構體。這意味著反應產率未因這些非所需異構體而降低。在這種「一鍋法」順序後是通過過濾僅受少量α-變旋異構體污染的受保護核苷IV的高度富集所需之N-9糖基化β-變旋異構體來進行極簡單的產品分離。通過去保護和結晶方法來獲得純克拉屈濱，含有極少量的異構體和關鍵反應序列中產生的雜質，並不影響最終原料藥品質。
在本發明中，不需要獨立進行色譜分析法或分步結晶反應法來獲得高度富集的受保護核苷IV的所需高度富集的N-9糖基化β-變旋端基異構體，因為所需β-變旋端基異構體在偶合和富集反應期間從糖基化反應產物混合物中以相當純的形式選擇性沉澱。本發明的優異體現在，通過HPLC的分析沈澱的IVa的純度高於90%，典型的高於95%。此外，產物IVa也在反應後從反應溫度冷卻到室溫期間在特定條件下從反應混合物中沉澱。此外，產物也在反應後從反應溫度冷卻到室溫期間在特定條件下從反應混合物中沉澱。由於在反應和富集期間α-變旋端基異構體的端基變旋異構立體中心立體異構化為可溶性較小的β-變旋端基異構體(其沉澱出)，因此相較於另外可能出現的情況偶合反應本身，形成更多β-變旋端基異構體。即，儘管初始實際上在本發明所揭露的反應條件下變旋端基異構選擇性可能相當低(約1:1到約2:1)，但這一沉澱和異構化導致總體富集β-變旋端基異構體，根據總反應系統計算，其比率大於約2.4：1，甚至高於約3：1或更高。經分離沈澱產品IV中β-變旋異構體對α-變旋異構體的比率高至約40：1。此外，當核苷起始材料III消耗在偶合步驟時，將混合物在較高溫度下加熱較長時間係較佳的，此時我們稱為富集步驟，較佳在約60℃，以改善所需β-變旋異構體的整體產率。停止富集步驟的時間可以靠測量測試(重量百分比)非所需α-變旋異構體V在產品混合物的溶液相。典型地，富集步驟需進行至少6個小時，至多約24小時，但針對最佳產率所需的時間長度需視反應條件而定(例如，溶質濃度、溫度及催化劑量)，其可透過監視在液相中非所需α-變旋異構體的量而決定。
溶劑的選擇對這一工藝方法很關健。雖然許多有機溶劑可為有效的，但最優選的是乙腈。乙腈的用量在相對於核苷鹼II和2-去氧核糖衍生物III在一定範圍內，優選為約12到20倍(體積、重量比)，更優選為約12-14倍。如果乙腈量太少，2-氯腺嘌呤並不全部溶解。如果所選擇的溶劑並不具有乙腈所具有的物理特徵，富集β-變旋異構體，以及通過過濾方便分離β-變旋異構體是很困難的及/或無效的。
因此，在研究開始階段，發明者並沒期望開發出這個非常方便的工藝方法。即使可能在偶合反應期間形成四種異構體(即，N-7糖基化產物的α-變旋異構體和β-變旋異構體以及N-9糖基化產物的α-變旋異構體和β-變旋異構體)，這一方法對於所需β-異構體IV仍極具選擇性。溫度超過約0℃，特定在60℃，對於偶合反應係較佳的。
可用諸如以下等矽烷化劑使2-氯腺嘌呤矽烷化：N ,O -雙(三甲基矽烷基)三氟乙醯胺(BSTFA)、N ,O -雙(三甲基矽烷基)乙醯胺(BSA)、三甲基氯矽烷(TMSCl)、第三丁基-二甲基氯矽烷(TBSCl)、TMSOTf、三氟甲磺酸第三丁基二甲基矽酯(TBSOTf)和六甲基二矽氮烷(HMDS)、硫酸二(三甲基矽脂)、丁基二甲基氯矽烷、1-(第三丁基二甲基矽基)-咪唑、第三丁基二苯基氯矽烷、N-第三丁基二甲基矽-N-甲基-三氟乙醯胺、1，3-二甲基-1，1，3，3-四苯基二矽氮烷、1，1，3，3-四甲基-1，3-二苯基二矽氮烷，1，1，3，3-四甲基-二(乙烯基)二矽氮烷、N-甲基-N-三甲基矽烷基乙醯胺(MSA)、N-甲基-N-三甲基矽烷基-三氟乙醯胺(MSTFA)、三異丙基氯矽烷、三乙基氯矽烷、N-三甲基矽烷基-乙醯胺，但當反應在乙腈中進行時BSTFA為優選，且在乙腈中相對於2-氯腺嘌呤過量使用。儘管BSTFA可以多於2莫耳當量，但是約3當量是優選。當BSTFA或BSA在乙腈中被用來矽化2-氯腺嘌呤，GC-MS分析發現2-氯腺嘌呤被雙矽烷化且總離子流圖譜表明僅有一種雙矽烷化2-氯腺嘌呤異構體存在。
為了方便和有效，矽烷化反應可在與偶合反應步驟中所用相同的溶劑中進行，儘管這些步驟可以在不同的反應溶劑或混合溶劑中進行，矽烷化和偶合可以在同一相同反應器中進行，或如果矽烷化後過濾操作需要，兩反應可在不同容器中進行。如果矽化試劑不是BSTFA，反應生成的副產物妨礙偶合完成，那麼矽化產物II可以使用已有先前技藝方法進行分離純化，包括結晶、沉澱或脫溶提供殘餘物。多種溶劑可用於偶合步驟中，諸如四氫呋喃(THF)、甲苯(PhMe)、二氯乙烷(DCE)、HMDS和DCM，但MeCN為優選的。
在有機溶劑中且在衍生自磺酸的非金屬路易士酸或布朗斯特酸(諸如包括TMSOTf、TBSOTf、TfOH、MsOH、TsOH、Tf2 O和Ms2 O，但優選為TfOH)存在下，使矽烷化2-氯腺嘌呤與受保護的2-去氧-呋喃核糖偶合。其他的路易士酸或布朗斯特酸，諸如已知在核苷偶合反應現有經驗中使用的，也可在本發明中使用，但是並不是優選的。本發明優選地使用低亞化學計量量的偶合催化劑和最優選相對於受保護的2-去氧-呋喃核糖III為約0.2莫耳當量來進行。
不受理論限制，一般相信偶合反應通過SN 1反應機制進行，產生受保護的核苷產物的變旋異構混合物，因為受保護核苷變旋異構產物IV及V的比率與受保護的2-去氧-呋喃核糖III的最初變旋異構混合物比率無關。因此，對原料III異構體純度無特殊的需求，這相對於其他現有技藝方法中使用異構體純的起始原料(如流程3至6所示)合成克拉屈濱，是一個優勢，因為非變旋純起始原料III可以被更便宜地製造。
在本發明的另一個實施例中，可通過如本發明中所描述的矽烷化和異構化/沉澱反應，隨後去保護，使通過另一種方法獲得的偶合產物的混合物轉化為克拉屈濱。為對此進行說明，取50 g粗非矽烷化核苷混合物IV的樣品(即x=2，y=0)，其含有58.6%(相當於29.3 g)N-9糖基化α-變旋異構體Vb和34.3%(相當於17.15 g)N-9糖基化β-變旋異構體IVb，且在60℃下在MeCN中用3莫耳當量BSTFA將其處理3小時，隨後立即在60℃加熱下添加0.2莫耳當量TfOH，歷時15小時。過濾沉澱的固體且乾燥，產生24.0 g 95%純度的沉澱IV，其最大程度地經矽烷化(即IVa)，其組成相當於20.55 g非矽烷化IVb。在母液中檢測到更多IV。因此，獲得比進入異構化反應中多24%的N-9糖基化β-變旋異構體IV，其中比進入異構化反應中多16%的N-9糖基化β-變旋異構體在沉澱和過濾過程中分離。
因此，雖然本發明可能使用各種條件，但最優選條件是使用MeCN作為反應溶劑，BSTFA作為矽烷化劑且TfOH作為催化劑，並且矽烷化、偶合反應及富集步驟是在約60℃下在同一容器中進行。在規模化生產人類使用的克拉屈濱時，優選為矽烷化產物在過濾器下過濾，但無其他操作需要。這一反應系統有利於N-9-β-變旋異構體IV而不利於N-9-α-變旋異構體V，這是歸因於所需N-9-β-變旋異構體從偶合反應混合物中沉澱，同時非所需N-9-α-變旋異構體當場異構化為所需N-9-β-變旋異構體。此矽烷化、偶合和富集反應在克級到公斤級生產規模產生約60-65%產率(由受保護的2-去氧-核糖起始物質III計算)的相當令人滿意的純N-9-β-變旋異構體的分離固體。
通過HPLC分析反應溶液顯示實際反應產生約<1:1到2:1莫耳比的N-9-β-變旋異構體IV/N-9-α-變旋異構體V，這取決於反應條件。當使用非優選矽烷化劑和不同催化劑(諸如BSA和三氟甲磺酸酐(Tf2 O))時，發現選擇性可能較低，甚至非所需的α-變旋異構體會多於所需的β-變旋異構體。發現當使用BSTFA(高達約2:1莫耳比的N-9-β-變旋異構體/N-9-α-變旋異構體)而非BSA(約1:1莫耳比的N-9-β-變旋異構體/N-9-α-變旋異構體)作為矽烷化劑，且在MeCN中矽烷化反應產物沒有被分離產物II或進行處理，直接用於偶合反應，TfOH作為催化劑偶合反應中的選擇性較高。在富集步驟後，總體反應系統中β-變旋異構體對α-變旋異構體的比率可大於約2.6：1，甚至高於3：1或更高，且經分離沈澱產品IV中β-變旋異構體對α-變旋異構體的比率高至約40：1。
在本發明中，一個優選的實例是：IV的脫保護在約25℃甲醇中使用烷氧基鹼，優選為甲醇鈉，以非均相反應進行。優選為克拉屈濱粗品通過過濾而直接分離，典型的化學純度約96%-99%。不受理論限制，相信克拉屈濱的高純度歸因於反應過程中克拉屈濱的結晶行為，X光粉末衍射分析(XRPD)支持這一觀點。溶劑甲醇的用量可以變化不同，但優選為相對於式IV化合物的5倍(體積/重量比)。
發明者發現，脫保護反應在本發明優選的條件下進行，可以獲得約96%-99%(HPLC)的高化學純度。然而，也發現克拉屈濱粗品有時被少量殘留IVb、Vb以及部分脫保護的中間體和雜質污染。發明者發現這些雜質很難通過使用醇或醇與水的混合物經過單一的結晶步驟而有效地移除，有時分離的克拉屈濱的純度並不滿足ICH指導原則對雜質的要求。因此，發明者設計出一個有效地移除雜質的方案。這一方案同結晶方法結合起來，比起獨立的操作，在生產規模，這一聯合方案更方便、更有效地獲得純的克拉屈濱。這一聯合方案是本發明的優選實例，其包括：溶解克拉屈濱粗品於甲醇與水的溶液中，溶液中含有少量的水溶性鹼，優選為甲醇鈉，鹼的用量同上述提及的殘留中間體、異構體、雜質和部分脫保護中間體相關；混合物被加熱至回流，溶解全部固體，任選冷卻到約70℃或保持在回流溫度，在相同溫度下攪拌，直到上述提及的殘留化合物被消耗至小於或低於0.10% HPLC純度；克拉屈濱被允許從溶液中結晶，過濾分離，洗滌，乾燥，給出高純度的克拉屈濱。在純化結晶步驟中，甲醇與水的比例可以在某個重量比例範圍內，優選為重量比約4:5，總體上，溶劑混合物相對克拉屈濱粗品的重量比約為9:1。這一方案可以在一個反應器中方便進行。本發明的另一實例是，任選為上述聯合方案之後，克拉屈濱可以在甲醇與水混合溶劑中再結晶。
如上述式(II)及(IV)，x及x'，及y與y'，並不需要相同。α-變旋異構體V可容易地藉分離失去矽烷基。水處理或酸水處理或其他去矽烷化條件也可導致矽烷基的去除。相較於其他保護基，矽烷基沒有很牢固地附接於化合物上。舉例而言，x'=1與y'=1，當分離係為直接過濾時，經分離的式(IV)化合物可能保持相同。如果水接觸步驟或其他去矽烷化條件導入在沈澱步驟之前或期間，具有x'=1與y'=1的式(IV)化合物可能初始地被後續分離為具有x'=2與y'=0的式(IV)化合物。
本發明的合成優點包括適合人類使用的原料藥級克拉屈濱的生產規模的合成應用。相較於先前技藝的競爭技術，本發明的合成方法有效地獲得高的總體收率，方法在實驗室和生產規模很方便操作，在下面例子中顯示有幾公斤的例證。像本發明優選實例所描述的合成方法不需要立體純的受保護2-去氧-核糖III，因為這個原料的立體純度與偶合核苷的立體純度無關，這減少原料輸入費用。矽烷化、偶合及富集步驟可以在同一反應器中進行，或如果矽烷化後需要過濾，則不多於兩個反應器，這是很大的優勢。選擇合適的反應條件，即所需β-變旋異構體從反應液中沉澱出來而不需α-變旋異構體留在溶液中，利用受保護克拉屈濱的差向異構，提高克拉屈濱的產率。而且，合適的反應條件允許受保護的克拉屈濱β-變旋異構體以很高的純度從溶液中析出，通過過濾分離的固體直接用於製備API等級克拉屈濱而不需純化。選擇非金屬路易士酸例如TMSOTf或布朗斯特酸避免API產物受金屬殘餘物污染，因為當某些金屬催化劑使用於核苷合成可能會造成問題。因為偶合及富集步驟的產品係直接透過過濾產品混合物分離，無需直接處理，因此可改善整體程序的時間效率。
在本發明最優選的實例中，原料藥級的克拉屈濱應用在生產規模的合成方法如下：
i)　在乙腈中於回流溫度下，2-氯腺嘌呤被過量的BSTFA矽烷化，接著任選地，反應液被熱過濾(約55℃)。
ii)　低於化學當量的TfOH被直接加入到步驟i)反應液中，接著加入1-O -乙醯基-3,5-二-O -(4-氯苯甲醯基)-2-去氧-D-核糖，混合物在約60℃被加熱數小時。
iii)　1-O -乙醯基-3,5-二-O -(4-氯苯甲醯基)-2-去氧-D-核糖被消耗完後，混合物在與步驟ii)中相同反應條件下繼續攪拌，直到在溶液中被偵測為其非矽烷化衍生物的2-氯-6-氨基-9-[3,5-二-O -(4-氯苯甲醯基)-2’-去氧-α-D-核糖基嘌呤(Vb，即α-變旋異構體)的重量百分比低於或等於3%。
iv)　產品混合物被冷卻到約15-30℃，然後攪拌不少於2小時，過濾收集固體產品，任選用乙腈洗滌，固體被乾燥，給出相當純的2-氯-6-氨基-9-[3,5-二-O-(4-氯苯甲醯基)-2’-去氧-β-D-核糖基嘌呤(IVa)。
v)　步驟iv)中乾燥固體被甲醇鈉在甲醇溶液中脫保護，優選為在約20-30℃非均相混合物中進行。
vi)　在步驟v)中產品混合物被過濾，收集固體產品，用甲醇洗滌，乾燥，給出克拉屈濱粗品。
vii)　步驟vi)中克拉屈濱粗品通過加入甲醇、水和甲醇鈉(甲醇鈉用量取決於來自脫保護時殘留的IVb，Vb和部分脫保護的中間體及雜質量)，加熱到約回流，以致固體溶解，任選為溶液冷卻到約70℃，在相同溫度下攪拌，直到殘留雜質被消耗到低於或等於0.10%。
viii)步驟vii)中純化的產品混合物任選用活性炭在65℃脫色處理，熱過濾，用預熱甲醇和水潤洗。步驟vii)中純化的產品或活性炭處理後的產品被冷卻析晶。結晶中形成的懸濁液被冷卻到約10-20℃，攪拌不短於2小時，然後過濾，甲醇洗滌，乾燥，給出高純度的克拉屈濱。
ix)　任選地，步驟viii)中分離的克拉屈濱可以通過在回流溫度下溶解於甲醇與水的混合物中進行再結晶，冷卻析晶。結晶過程中形成的懸濁液被冷卻到約15℃，攪拌不短於2小時，然後過濾，甲醇洗滌，乾燥，給出高純的克拉屈濱。
僅出於進一步說明的目的提供以下反應流程或實例且不希望對所揭示的本發明加以限制。
實例1 製備2-氯-6-三甲基矽烷基氨基-9-[3,5-二-O -(4-氯苯甲醯基)-2-去氧-β-D-呋喃核糖基]-嘌呤
將2-氯腺嘌呤(75 g，0.44 mol，1.0當量)、MeCN(900 mL，12 P)和BSTFA(343.5 g，1.33 mol，3.0當量)在回流下攪拌且加熱直到混合物幾乎變澄清為止。使所述混合物冷卻到60℃且依序將TfOH(7.9 mL，0.089 mol，0.2當量)和1-O-乙醯基-3,5-二-O -(4-氯苯甲醯基)-2-去氧-D-呋喃核糖(III；200.6 g，1.0當量)添加到混合物中，並接著在60℃下攪拌混合物。1小時後，一些固體從溶液中沉澱且將混合物再加熱至少10小時。使混合物冷卻到室溫且攪拌2小時。過濾固體且在60℃下真空乾燥，產生180.6 g具有95.4% HPLC純度的2-氯-6-三甲基矽烷基氨基-9-[3,5-二-O -(4-氯苯甲醯基)-2-去氧-β-D-呋喃核糖基]-嘌呤(IV )與其具有1.1% HPLC純度的非矽烷化衍生物2-氯-6-氨基-9-[3,5-二-O -(4-氯苯甲醯基)-2'-去氧-β-D-呋喃核糖基]-嘌呤的混合物，產率為64%。
實例2 通過使2-氯-6-氨基-9-[3,5-二-O -(4-氯苯甲醯基)-2-去氧-α,β-D-呋喃核糖基]-嘌呤混合物的混合物異構化來製備2-氯-6-三甲基矽烷基氨基-9-[3,5-二-O -(4-氯苯甲醯基)-2-去氧-β-D-呋喃核糖基]-嘌呤
將50.0 g呈β-變旋異構體與α-變旋異構體的0.6:1.0混合物形式的2-氯-6-氨基-9-[3,5-二-O -(4-氯苯甲醯基)-2-去氧-α,β-D-呋喃核糖基]-嘌呤(83.16 mmol，α-變旋異構體測定為58.6%(52.06 mmol)且β-變旋異構體為34.3%(31.10 mmol，17.15 g))、68.6 g BSTFA(266.5 mmol)和180 mL MeCN(3.6 P)裝入乾燥的4頸燒瓶中。在N2 下加熱混合物至60℃持續約3小時且接著添加2.67 g TfOH(17.8 mmol)。在60℃下攪拌混合物15小時且接著冷卻到室溫(25℃)並再攪拌2小時，且接著過濾。用MeCN(每次20 mL)洗滌濾餅兩次且在60℃下真空乾燥6小時，產生24 g灰白色固體(2-氯-6-氨基-9-[3,5-二-O -(4-氯苯甲醯基)-2-去氧-α-D-呋喃核糖基]-嘌呤測定為1.4%(0.60 mmol，0.34 g)，2-氯-6-氨基-9-[3,5-二-O -(4-氯苯甲醯基)-2-去氧-β-D-呋喃核糖基]-嘌呤為8.4%(3.18 mmol，2.02 g)且2-氯-6-三甲基矽烷基氨基-9-[3,5-二-O -(4-氯苯甲醯基)-2-去氧-β-D-呋喃核糖基]-嘌呤為86.6%(32.73 mmol，20.78 g))。
通過測定分析274.8 g母液顯示其由5.7%(15.66 g，27.83 mmol)2-氯-6-氨基-9-[3,5-二-O -(4-氯苯甲醯基)-2-去氧-α-D-呋喃核糖基]-嘌呤、0.5%(1.37 g，2.43 mmol)2-氯-6-氨基-9-[3,5-二-O -(4-氯苯甲醯基)-2-去氧-β-D-呋喃核糖基]-嘌呤和0.01%(0.027 g，0.05 mmol)2-氯-6-三甲基矽烷基氨基-9-[3,5-二-O -(4-氯苯甲醯基)-2-去氧-β-D-呋喃核糖基]-嘌呤構成。
實例3 製備2-氯-2'-去氧-腺苷(克拉屈濱)
在20-30℃下向以上製備的含2-氯-6-三甲基矽烷基氨基-9-[3,5-二-O -(4-氯苯甲醯基)-2-去氧-β-D-呋喃核糖基]-嘌呤(IV )2-氯-6-氨基-9-[3,5-二-O -(4-氯苯甲醯基)-2'-去氧-β-D-呋喃核糖基]-嘌呤的混合物(179 g，>95.4% HPLC純度)的MeOH(895 mL，5 P)溶液中添加29% MeONa/MeOH溶液(5.25 g，0.1當量)。在20-30℃下攪拌混合物6小時，過濾固體，用MeOH(60 mL，0.34 P)洗滌且接著在50℃下真空乾燥6小時，產生72 g具有98.9% HPLC純度和約93%產率的白色到灰白色粗克拉屈濱。
實例4 再結晶
將粗克拉屈濱(70 g)、H2 O(350 mL，5 P)、MeOH(350 mL，5 P)和29% MeONa/MeOH溶液(0.17 g)在回流下攪拌且加熱直到混合物變澄清為止。攪拌混合物3小時且接著在74-78℃下過濾以除去沉澱物。在回流下攪拌且加熱混合物直到混合物變澄清並接著冷卻。在約45℃下開始形成晶體。在混濁點攪拌漿液2小時。以5℃/0.5小時的速率緩慢冷卻所述漿液。在10-20℃下攪拌漿液4-8小時且接著過濾。用MeOH(50 mL×3)洗滌濾餅且在50℃下真空乾燥6小時，產生62.7 g 99.9% HPLC純且產率為約90%的克拉屈濱。
實例5
製備2-氯-6-三甲基矽烷基氨基-9-[3,5-二-O -(4-氯苯甲醯基)-2-去氧-β-D-呋喃核糖基]-嘌
將2-氯腺嘌呤(2.2 Kg，13.0 mol，1.0當量)、MeCN(20.7 Kg，12 P)和BSTFA(10.0 Kg，38.9 mol，3.0 eq.)在回流下攪拌且加熱3小時。然後，通過矽藻土過濾。使所述混合物冷卻到60℃且依序將TfOH(0.40 Kg，2.6 mol，0.2 eq.)和1-O -乙醯基-3,5-二-O -(4-氯苯甲醯基)-2-去氧-D-呋喃核糖(III；5.87 Kg，1.0 eq.)添加到濾液中，並接著在約60℃下攪拌混合物29.5小時。使混合物冷卻到約20℃且攪拌2小時。過濾固體，用乙腈(2.8 Kg)洗滌兩次，且在60℃下真空乾燥，產生5.17 Kg具有96.5% HPLC純度的2-氯-6-三甲基矽烷基氨基-9-[3,5-二-O -(4-氯苯甲醯基)-2-去氧-β-D-呋喃核糖基]-嘌呤(IVa )與2-氯-6-氨基-9-[3,5-二-O -(4-氯苯甲醯基)-2'-去氧-β-D-呋喃核糖基]-嘌呤(IVb)的混合物，產率為62%。
實例6 製備2-氯-2'-去氧-腺苷(克拉屈濱)
在約25℃向以上製備的含2-氯-6-三甲基矽烷基氨基-9-[3,5-二-O -(4-氯苯甲醯基)-2-去氧-β-D-呋喃核糖基]-嘌呤(IVa )和2-氯-6-氨基-9-[3,5-二-O -(4-氯苯甲醯基)-2'-去氧-β-D-呋喃核糖基]-嘌呤的混合物(IVb)(3.70 Kg，>96.3% HPLC純度)的MeOH(14.8 Kg，5 P)溶液中添加25% MeONa/MeOH溶液(0.11 Kg，0.1 eq.)。在約25℃下攪拌混合物2小時，過濾固體，用MeOH(1.11 Kg，0.4 P)洗滌且接著在60℃下真空乾燥4小時，產生1.43 Kg具有97.8% HPLC純度和約87%產率粗克拉屈濱。
實例7 克拉屈濱粗品再結晶
將粗克拉屈濱(1.94 Kg，>96% HPLC純度)、H2 O(9.67 Kg，5 P)、MeOH(7.77 Kg，5 P)和25% MeONa/MeOH溶液(32 g，0.15 mol)在回流下攪拌且加熱直到混合物變澄清為止。溶液被冷卻到約70℃，在約70℃下用活性炭(0.16 Kg)和矽藻土處理1小時，趁熱過濾，用預熱的甲醇和水(1:1.25，1.75 Kg)潤洗，濾液被冷卻至約45℃且維持溫度1小時，然後冷卻到約15℃，在此溫度下攪拌漿液2小時。固體被過濾，用MeOH(1.0 Kg，0.7 P)洗滌濾餅三次，然後在60℃下真空乾燥4小時，產生API等級(1.5 Kg，5.2mol)99.84% HPLC純且產率為80%的克拉屈濱。
實例8 克拉屈濱粗品再結晶
將粗克拉屈濱(1.92 Kg，>95.7% HPLC純度)、H2 O(9.67 Kg，5 P)、MeOH(7.76 Kg，5 P)和25%MeONa/MeOH溶液(36 g，0.17 mol)在回流下攪拌且加熱直到混合物變澄清為止。溶液被冷卻到約70℃，在約約70℃下用活性炭(0.15 Kg)和矽藻土處理1小時，趁熱過濾，用預熱的甲醇和水(1:1.25，1.74 Kg)潤洗，濾液被冷卻至約45℃且維持溫度1小時，然後冷卻到約15℃，在此溫度下攪拌漿液2小時。固體被過濾，用MeOH(1.0 Kg，0.7 P)洗滌濾餅三次，給出濕的克拉屈濱(1.83 Kg)。此濕的克拉屈濱(1.83 Kg)、甲醇(7.33 Kg,5 P)和水(9.11 Kg，5 P)混合物在回流下攪拌且加熱直到混合物變澄清為止，然後冷卻到約45℃且維持溫度1小時，懸濁液進一步冷卻到約15℃，在此溫度下攪拌漿液2小時。固體被過濾，用MeOH(0.9 Kg，0.7 P)洗滌濾餅三次，然後在60℃下真空乾燥4小時，產生API等級(1.38 Kg，4.8mol)99.86% HPLC純且產率為75%的克拉屈濱。
圖1展示根據本發明的實施例製備克拉屈濱的流程。
(無元件符號說明)

Claims (19)

  1. 一種製備式I的克拉屈濱的方法，其包含：a)在有機溶劑溶液中使式II化合物 其中R1 ,R2 ，及R3 各自獨立為烷基、烯基、炔基或芳基，x為0、1或2，y為2、1或0，且R4 為氫或SiR1 R2 R3 ，與具有以下式III的受保護的2-去氧-呋喃核糖偶合 其中R6 與R7 各自獨立為羥基保護基，且R5 為脫離基，以獲得包含具有下式IV的β-變旋異構體的反應混合物 其中x'為0、1或2，y'為2、1或0；b)在乙腈(MeCN)存在下，選擇性地從反應混合物使式IV的β-變旋異構體沉澱，獲得一非均質混合物；c)將沈澱的式IV的β-變旋異構體從該非均質混合物中分離，獲得經分離且大體上富集的式IV的β-變旋異構體；和d)將該經分離且大體上富集的式IV的β-變旋異構體轉變成克拉屈濱。
  2. 根據申請專利範圍第1項所述的方法，其中式II化合物是通過使用矽烷化劑的有機溶劑溶液或單純矽烷化劑使2-氯腺嘌呤矽烷化所得到，其中x為0、1或2，y為2、1或0，R4 為氫或SiR1 R2 R3 ，且當x為2，y為0時，R4 為SiR1 R2 R3 。
  3. 根據申請專利範圍第2項所述的方法，其中矽烷化劑為N ,O -雙(三甲基矽烷基)三氟乙醯胺(BSTFA)。
  4. 根據申請專利範圍第1項所述的方法，其中該偶合步驟係在矽烷化劑存在下進行。
  5. 根據申請專利範圍第1項所述的方法，其中該羥基保護基為經鹵素取代的芳醯基。
  6. 根據申請專利範圍第1項所述的方法，其中脫離基為乙醯氧基。
  7. 根據申請專利範圍第1項所述的方法，其中有機溶劑係選自由下列成分所組成之群組：乙腈(MeCN)、四氫呋喃(THF)、二氯甲烷(DCM)、二氯乙烷(DCE)、甲苯(PhMe) 、六甲基二矽氮烷(HMDS)、N ,O -雙(三甲基矽烷基)三氟乙醯胺(BSTFA)、N ,O -雙(三甲基矽烷基)乙醯胺(BSA)及其組合。
  8. 根據申請專利範圍第1項所述的方法，其中有機溶劑為乙腈(MeCN)。
  9. 根據申請專利範圍第1項所述的方法，其中該偶合步驟(a)係在衍生自磺酸的路易士酸(Lewis acid)或布朗斯特酸(Brønsted acid)存在下進行。
  10. 根據申請專利範圍第1項所述的方法，其中在進行步驟(c)之前，該方法進一步包含另一步驟，將在步驟(b)中形成的非均質混合物維持在溫度40℃至85℃的範圍內歷時至少2小時。
  11. 根據申請專利範圍第1項所述的方法，其中該偶合步驟係在溫度約0℃到有機溶劑的回流溫度的範圍內進行。
  12. 一種製備具有增進純度的克拉屈濱的方法，其包含：a)將粗品克拉屈濱在鹼存在下溶解在質子性溶劑以形成包含經溶解的粗品克拉屈濱溶液；b)將該溶液維持在較高的溫度下，以使得該溶液為均質直到在該溶液中受保護或部分受保護的核苷雜質的量減少到一預先決定的上限；c)將步驟(b)中的溶液冷卻以形成且分離克拉屈濱的結晶。
  13. 根據申請專利範圍第12項所述的方法，其中該質子性溶劑係為水與甲醇的混合物，且該鹼為甲醇鈉(NaOMe)。
  14. 根據申請專利範圍第12項所述的方法，其中通過高效能液相層析儀(HPLC)分析該預先決定的上限為0.10%。
  15. 一種製備具有增進純度的式IV化合物的方法，其中R1 ,R2 ，及R3 各自獨立為烷基、烯基、炔基或芳基，x'為0、1或2，y'為2、1或0，R6 與R7 各自獨立為羥基保護基，該方法包含：a)在矽烷化劑的存在下，以在有機溶劑中的衍生自磺酸的路易士酸或布朗斯特酸處理包含式IV化合物及至少一種非所需的異構體的混合物，以使得該至少一種非所需的異構體異構化且轉變成式IV化合物；和b)從步驟(a)中的混合物分離出式IV化合物。
  16. 根據申請專利範圍第15項所述的方法，其中有機溶劑為乙腈(MeCN)。
  17. 根據申請專利範圍第15項所述的方法，該方法包含另一步驟，將具有增進純度的式IV化合物轉變成克拉屈濱。
  18. 一種製備式IV化合物的方法，其中R6 與R7 各自獨立為 羥基保護基，R1 ,R2 ，及R3 各自獨立為烷基、烯基、炔基或芳基，x'為0、1或2，y'為2、1或0，該方法包含：a)在衍生自磺酸的路易士酸(Lewis acid)或布朗斯特酸(Brønsted acid)存在下，在有機溶劑溶液中使式II化合物 其中R4 為氫或SiR1 R2 R3 ，x為0、1或2，對應地y為2、1或0，且當R4 為氫時，y為2或1，與式III的受保護的2-去氧-呋喃核糖偶合 其中R5 為脫離基，以獲得式IV化合物。
  19. 根據申請專利範圍第18項所述的方法，該方法包含另一步驟，將式IV化合物轉變成克拉屈濱。
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