JP4326841B2 - 保護化２’−デオキシシチジン類の精製法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は保護化２’−デオキシシチジン類およびその水と複合体を形成した結晶に関する。さらに詳しくは、本発明は、５’位保護化２’−デオキシシチジン類の製造方法、精製方法に関する。
５’位保護化２’−デオキシシチジン類は、近年開発されつつあるアンチセンスＤＮＡなどの原料として有用な化合物である。
【０００２】
【従来の技術】
近年、ゲノム創薬の進展に伴い、アンチセンスＤＮＡ医薬などが急速に開発されている。それに伴い、原料となるＤＮＡオリゴマー、さらにオリゴマーの原料となる保護化デオキシヌクレオシド類の需要が増大している。一方で医薬品の用途には、含まれている不純物による副生成物の生成を極力抑制するため、非常に高純度の中間体製品を使用する必要がある。
【０００３】
これまで、５’位保護化デオキシヌクレオシド類は特開昭５８−１８０５００号公報、特開昭６３−１７９８８９号公報や特表平６−５０７８８３号公報等の例で明らかなとおり、カラムクロマトグラフィー法を用いて精製されてきた。この方法では、極性や構造が大きく異なる不純物の精製は比較的容易であるが、類似構造を有する不純物の除去は困難である。例えば、５’，３’位の両方の水酸基がジメトキシトリチル基の様なトリチル誘導体で保護された不純物や、必要な５’位ではなく３’位の水酸基がジメトキシトリチル基の様なトリチル誘導体で保護された不純物等は特に除去しにくく、更にこれらの不純物は医薬品の製造上、次工程以降に影響が大きい不純物であり、その混入は非常に問題である。更に、カラムクロマトグラフィー法は工業化において大掛かりな精製装置が必要であり、かつ大量の溶媒を必要とする事から、将来の大量生産、大量供給においては非常に問題があるといわざるを得ない。
【０００４】
また、これまでにも、カラムクロマトグラフィーを用いずに不純物を除くための検討がなされてきた。具体的には再沈殿法による精製について、特開昭６０−１５２４９５号公報やＰＣＴ出願ＷＯ２０００７５１５４公報およびＷＯ００３９１３８公報では開示されている。再沈殿による方法とは、予め粗化合物を可溶性溶媒に溶解した後で、不溶性溶媒を添加または不溶性溶媒に滴下することにより、強制的に再析出させる方法である。そのため基本的に精製能力は低く、前記で示したような不純物の除去は困難である。また、可溶性溶媒と不溶性溶媒の量比を適切に調整することは工業的には困難で、量比を誤ると容易にオイル化したり、粘性のある沈殿を生じて精製に失敗しやすい。実際、特開昭６０−１５２４９５公報の方法によれば、粘調なアメ状にて得られる場合があり、工業的には問題がある。これまでには再沈殿によるアモルファス化の方法は開示されてきたが、結晶化により結晶を得る方法については知られていなかった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
従来の問題点を鑑み、効率的かつ特別な設備を必要としない、非常に高純度の保護化２’−デオキシシチジン類の製造法を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題について鋭意検討した結果、保護化２’−デオキシシチジン類及び水を含む溶液から、水と複合体を形成した保護化２’−デオキシシチジン類の結晶化に成功した。この事により、従来技術では困難であった結晶化または再結晶による精製法での精製が可能であることを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
即ち、本発明は以下のとおりである。
［１］ 一般式（１）［化５］
【０００８】
【化５】
【０００９】
（式中、ｍおよびｎはそれぞれ独立して任意の整数、Ｒ１は４−メトキシトリチル基、４，４’−ジメトキシトリチル基又はトリフェニルメチル基を、はＢ１はアミノ基が保護されたシトシン基を表す。）で表される保護化２’−デオキシシチジン類の水と複合体を形成した結晶。
［２］ 一般式（１）で示される化合物が一般式（２）[化６]
【００１０】
【化６】
【００１１】
（式中、ｍおよびｎは前記と同義である。）で表される［１］に記載の水と複合体を形成した結晶。
［３］ Ｎ4−ベンゾイル−３’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジンの含有量が０．１％以下である［２］記載の水と複合体を形成した結晶。
［４］ 一般式（３）［化７］
【００１２】
【化７】
【００１３】
（式中、Ｒ１及びＢ１は前記と同義である。）で表される化合物及び水を含有する溶液から、一般式（３）で表される保護化２’−デオキシシチジン類を、水と複合体を形成した結晶として析出させ、これを回収することを特徴とする、保護化２’−デオキシシチジン類の精製法。
［５］ 溶液に含まれる水の量が一般式（３）に対し、０．５当量以上である事を特徴とする、［４］に記載の保護化２’−デオキシシチジン類の精製法。
［６］ 一般式（３）で示される化合物が式（４）［化８］
【００１４】
【化８】
【００１５】
である、［４］又は［５］に記載の保護化２’−デオキシシチジン類の精製法。
［７］ 得られた結晶中のＮ4−ベンゾイル−３’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジンの含有量が０．１％以下である［６］記載の保護化２’−デオキシシチジン類の精製法。
［８］ 一般式（１）または一般式（２）で示される保護化２’−デオキシシチジン類の水と複合体を形成した結晶を、大気圧以下の圧力で乾燥する事により、水と複合体を形成していない一般式（３）または式（４）で示される保護化２’−デオキシシチジン類の製造方法。
【００１６】
【発明実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１７】
本発明の一般式（１）又は一般式（３）のＢ１における、アミノ基が保護されたシトシン基の保護基としては、アルキル基、アルキルアシル基あるいは置換されてもよいベンゾイル基が挙げられる。
【００１８】
この場合、アルキル基は直鎖状でも分岐していてもよいし、さらに別の官能基（置換基）が結合していてもよい。該置換基としてはたとえばメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、２−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｉ−ブチル基等が挙げられる。
【００１９】
アルキルアシル基は直鎖状でも分岐していてもよく、環を形成していてもよく、さらに別の官能基（置換基）がついていてもよい。該置換基としては、例えばアセチル基、プロピオニル基、ｎ−ブチリル基、ｉ−ブチリル基、ピバロイル基、バレリル基、イソバレリル基、シクロプロピル基、フェニルアセチル基、フェノキシアセチル基、（イソプロピルフェノキシ）アセチル基等が挙げられる。
【００２０】
ベンゾイル基は無置換でも置換されていてもよく、また、フェニル基の２位、３位、４位いずれの位置に置換基があってもよい。また、複数の位置に置換基があってもよい。置換基としてはたとえばメチル基、エチル基、２−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｔ−ブチル基等のアルキル基、ヒドロキシル基、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロピルオキシ基、２−プロピルオキシ基、ｎ−ブチルオキシ基等のアルキルオキシ基、ニトロ基、フルオロ基、クロロ基、ブロモ基、ヨード基等のハロゲン基、アミノ基、メチルアミノ基、エチルアミノ基、ｎ−プロピルアミノ基、ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基、ジイソプロピルアミノ基等のアルキルアミノ基、アセチル基、プロピオニル基、ベンゾイル基等のアシル基、フェニル基、ピリジニル基等が挙げられる。
【００２１】
具体的には、ベンゾイル基、２−クロロベンゾイル基、３−クロロベンゾイル基、４−クロロベンゾイル基、２−ブロモベンゾイル基、３−ブロモベンゾイル基、４−ブロモベンゾイル基、２−フルオロベンゾイル基、３−フルオロベンゾイル基、４−フルオロベンゾイル基、２−メトキシベンゾイル基、３−メトキシベンゾイル基、４−メトキシベンゾイル基、２−ニトロベンゾイル基、３−ニトロベンゾイル基、４−ニトロベンゾイル基、２−アミノベンゾイル基、３−アミノベンゾイル基、４−アミノベンゾイル基、２−メチルアミノベンゾイル基、３−メチルアミノベンゾイル基、４−メチルアミノベンゾイル基、２−ジメチルアミノベンゾイル基、３−ジメチルアミノベンゾイル基、４−ジメチルアミノベンゾイル基、４−フェニルベンゾイル基、４−アセチルベンゾイル基等が挙げられる。
【００２２】
保護化２’−デオキシシチジン類及び水を含有する溶液は、それら２種の成分を含有する限りにおいて溶媒を含有してよい。この場合の溶媒は保護化２’−デオキシシチジン類を水と複合体を形成した結晶として析出可能な溶媒であれば特に限定はないが、例えばメタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、ペンタノール、シクロヘキサノール等のアルコール類、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン等のエーテル類、アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン等のケトン類、ペンタン、ヘキサン、メチルペンタン、シクロヘキサン、ヘプタン、ノナン、デカン等の飽和炭化水素類、ベンゼン、トルエン、クメン、キシレン、メシチレン、ジイソプロピルベンゼン、トリイソプロピルベンゼン等の芳香族炭化水素類、ジクロロメタン、クロロホルム、ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素類、ピリジン、ルチジン、キノリンなどのピリジン類、トリエチルアミン、トリブチルアミン等の３級アミン類、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド、ジメチルイミダゾリジノン、ジメチルスルホキシド等の極性溶媒等が挙げられる。これらの溶媒は単一または数種類混合して用いる事も可能である。
【００２３】
水と複合体を形成した結晶とは、結晶構造を形成するために水が補助的な役割を果たしている状態を指し、結晶格子に水を取り込んだ形で結晶を形成したり、水との弱い相互作用により複合体を形成したりするなど、何れの場合も含んでいる。水との複合体の形態と結晶構造については特に制限されない。
【００２４】
保護化２’−デオキシシチジン類の水と複合体を形成した結晶には、結晶化の際に使用される保護化２’−デオキシシチジン類及び水を含有する溶液に由来する溶媒を、結晶化を阻害しない範囲で微量含んでいてもよい。
【００２５】
結晶化の際の水の量は保護化２’−デオシキシチジン類に対し、０．５当量以上有れば良いが、好ましくは１当量以上である。
【００２６】
水と複合体を形成させる方法としては特に限定は無いが、例えば、保護化２’−デオシキシチジン類を含有する溶液に水を添加するか、または水を含有する溶媒に保護化２’−デオシキシチジン類を加える事でも得る事が出来る。
【００２７】
結晶化の際の保護化２’−デオシキシチジン類の濃度は結晶化出来る濃度であれば特に限定はないが、通常１％から５０％、好ましくは５％から４０％の範囲で行われる。
【００２８】
結晶化の際の温度は特に規定されないが、−１０℃から溶媒の沸点の範囲が望ましい。また、通常は１度の結晶化で十分精製可能であるが、さらに繰り返し再結晶を行うことでより高純度にすることもできる。また、再結晶の際は結晶種を接種してもよい。
【００２９】
この様にして得られた保護化２’−デオシキシチジン類の水と複合体を形成した結晶は、必要に応じて大気圧以下の圧力、好ましくは０．１ｍｍＨｇから１００ｍｍＨｇで乾燥する事により、水分含量の低下した保護化２’−デオシキシチジン類の水と複合体を形成した結晶、水と複合体を形成しない保護化２’−デオシキシチジン類の粉末、または保護化２’−デオシキシチジン類の粉末を得ることが可能である。
【００３０】
乾燥する時の温度としては、水を除去できれば特に限定はないが、通常、室温から２００℃の範囲で行われる。また、乾燥操作の際、窒素等の水分を含まない気体を流しながらの乾燥や、シリカゲル、五酸化二燐等の脱水剤を用いての脱水も可能である。
【００３１】
本発明の精製法により除去される不純物としては、Ｎ4−ベンゾイル−３’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジン、Ｎ4−ベンゾイル−３’，５’−Ｏ−ビス（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジン等が挙げられ、これら不純物のうちＮ4−ベンゾイル−３’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジンの保護化２’−デオシキシチジン類中の含有量は、水と複合体を形成しているかいないかに関係なく、０．１％以下、好ましくは０．０１％以下であり、Ｎ4−ベンゾイル−３’，５’−Ｏ−ビス（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジンの保護化２’−デオシキシチジン類中の含有量は、水と複合体を形成しているかいないかに関係なく、０．３％以下、好ましくは０．１％以下である。（この場合、％は試料を液体クロマトグラフィーにより測定した場合のチャートの面積比、Ａｒｅａ％を表す。）
以上本発明により、保護化２’−デオキシシチジン類の効率的な精製ができるようになった。
【００３２】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
【００３３】
実施例及び比較例のＨＰＬＣ条件−１（Ｎ4−ベンゾイル−２’−デオキシシチジン、Ｎ4−ベンゾイル−３’，５’−Ｏ−ビス（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジンの分析条件）
カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ ＴＭＳ−ＵＧ−５
１５０ｍｍ×直径４．６ｍｍ
流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ．
カラム温度：３５℃
検出波長：２５４ｎｍ
移動相：グラジェント条件
時間（ｍｉｎ．） Ｂ液（％）
０ ２０
３０ １００
３５ １００
３７ ２０
５０ ＳＴＯＰ
〔Ａ液〕
水（２９４０ｍｌ）にＮａＨ2ＰＯ4・２水和物（１．９２ｇ）、Ｎａ2ＨＰＯ4（２．４３ｇ）を溶解後、ＭｅＯＨ（６０ｍｌ）を加え混和し、脱気する。
〔Ｂ液〕
水（３００ｍｌ）にＮａＨ2ＰＯ4・２水和物（１９６ｍｇ）、Ｎａ2ＨＰＯ4（２４８ｍｇ）を溶解後、ＭｅＯＨ（２７００ｍｌ）を加え混和し、脱気する。
【００３４】
実施例及び比較例のＨＰＬＣ条件−２（Ｎ４−ベンゾイル−３’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジンの分析条件）
カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＣＮ Ａ−５１２
１５０ｍｍ×直径６．０ｍｍ
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ．
カラム温度：３５℃
検出波長：２３５ｎｍ
測定時間：８０ｍｉｎ．
注入量：１０μＬ
移動相：グラジェント条件
時間（ｍｉｎ．） Ｂ液（％）
０ １４
２５ ５０
６０ １００
８０ １００
８２ １４
１０２ ＳＴＯＰ
〔Ａ液〕
水（２０００ｍＬ）にＮＨ4Ｈ2ＰＯ4（１．１５ｇ）、（ＮＨ4）2ＨＰＯ4（０．９２ｇ）を溶解後、脱気する。
〔Ｂ液〕
アセトニトリル（１２００ｍＬ）とＡ液（４００ｍＬ）を混合後、脱気する。
【００３５】
実施例および比較例のＸＲＤ測定条件
機器：ＲＡＤ−１Ａ（（株）リガク）
Ｘ線ターゲット：Ｃｕ ３０ｋＶ １５ｍＡ
測定速度：２°／ｍｉｍ．
【００３６】
実施例及び比較例のＤＳＣ分析条件
機器：ＤＳＣ８２１e（ＭＥＴＴＬＥＲ ＴＯＬＥＤＯ）
容器材質：アルミニウム製
温度上昇速度：５℃／ｍｉｎ．
窒素気流下で測定
【００３７】
参考例１
Ｎ4−ベンゾイル−５’−O−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジンの製造
Ｎ4−ベンゾイル−２’−デオキシシチジン１１９．０ｇをピリジン１．５Ｌに溶解した。４，４’−ジメトキシトリチルクロリド１１３．５ｇを室温で２時間かけて添加した後、室温で４時間攪拌した。重曹３３．８ｇを加えた後、さらに２時間撹拌後、反応液を濃縮した。残留物に酢酸エチル１．２Ｌ、水３００ｍＬを加えて撹拌した。少量の飽和食塩水を加えて分液し、有機層を同様に再度水洗した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。ろ過後、溶媒を留去したのち、酢酸エチル溶媒を用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製した。目的物を含むフラクションをジイソプロピルエーテル２．０Ｌ中に激しく攪拌しながら滴下した後、２時間室温で攪拌した。ろ過して得られた固体を５０℃で減圧乾燥して、Ｎ4−ベンゾイル−５’−O−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジンのフリー体１５３．３ｇを得た。このフリー体はＸＲＤ測定でアモルファスであった。また、このフリー体中には、原料であるＮ4−ベンゾイル−２’−デオキシシチジン、副生物であるＮ4−ベンゾイル−３’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジン及びＮ4−ベンゾイル−３’，５’−Ｏ−ビス（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジンが各々１．０Ａｒｅａ％、０．１５Ａｒｅａ％、２．２Ａｒｅａ％含まれていた。
【００３８】
実施例１
Ｎ4−ベンゾイル−５’−O−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジンの水と複合体を形成した結晶の合成
参考例１にて合成したＮ4−ベンゾイル−５’−O−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジンのフリー体（２．０ｇ）を１，２−ジクロロエタン（５ｍＬ）に溶解し、水（０．１ｇ）を加え、−２４℃で１日間晶析した。得られた結晶をろ取後、５０℃で減圧乾燥して、Ｎ4−ベンゾイル−５’−O−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジンの水と複合体を形成した結晶（０．８ｇ）を得た。水分値はカールフィッシャー分析では２．７％であった。尚、この結晶はＸＲＤ測定において明確な結晶性ピークを有し、特に５．６°、７°、１０．３°にシャープな吸収を有していた。また、ＤＳＣ測定により１０９℃に結晶融解に伴う吸熱ピークを有していた。
【００３９】
この複合体に含まれていたＮ4−ベンゾイル−２’−デオキシシチジン、Ｎ4−ベンゾイル−３’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジン及びＮ4−ベンゾイル−３’，５’−Ｏ−ビス（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジンは各々０．０５Ａｒｅａ％、検出限界（０．０１％）以下、０．０５Ａｒｅａ％含まれていた。
ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ８．７（ｓ，１Ｈ）、８．３（ｄ，１Ｈ）、７．９（ｄ，２Ｈ）、７．２−７．６（ｍ，１３Ｈ）、６．８−６．９（ｍ，４Ｈ）、６．３（ｍ，１Ｈ）、４．５（ｍ、１Ｈ）、４．２（ｍ、１Ｈ）、３．８（ｓ，６Ｈ）、３．４−３．５（ｍ，２Ｈ）、２．７−２．９（ｍ，２Ｈ）、２．３（ｍ，１Ｈ）
【００４０】
実施例２
Ｎ4−ベンゾイル−５’−O−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジンの水と複合体を形成した結晶の合成
参考例１にて合成したＮ4−ベンゾイル−５’−O−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジンのフリー体（２．０ｇ）を酢酸ブチル（５ｍＬ）に溶解し、ヘキサン（０．５ｍｌ）を滴下後、水（０．１ｇ）及び実施例１で得られたＮ4−ベンゾイル−５’−O−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジンの水と複合体を形成した結晶（10ｍｇ）を加え、氷冷化で１日間晶析した。得られた結晶をろ取後、５０℃で減圧乾燥して、Ｎ4−ベンゾイル−５’−O−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジンの水と複合体を形成した結晶（１．３ｇ）を得た。水分値はカールフィッシャー分析では２．２％であった。尚、この結晶はＸＲＤ測定において明確な結晶性ピークを有し、特に５．６°、７°、１０．３°にシャープな吸収を有していた。また、ＤＳＣ測定により１１２℃に結晶融解に伴う吸熱ピークを有していた。
【００４１】
この複合体に含まれていたＮ4−ベンゾイル−２’−デオキシシチジン、Ｎ4−ベンゾイル−３’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジン及びＮ4−ベンゾイル−３’，５’−Ｏ−ビス（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジンは各々０．１２Ａｒｅａ％、検出限界（０．０１％）以下、０．０７Ａｒｅａ％含まれていた。
【００４２】
実施例３
Ｎ4−ベンゾイル−５’−O−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジンの水と複合体を形成した結晶の合成
参考例１て合成したＮ4−ベンゾイル−５’−O−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジンのフリー体（２．０ｇ）をアセトニトリル（５ｍＬ）に溶解し、水（７ｍｌ）を滴下後、実施例１で得られたＮ4−ベンゾイル−５’−O−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジンの水と複合体を形成した結晶（10ｍｇ）を加え、氷冷化で５時間晶析した。得られた結晶をろ取後、５０℃で減圧乾燥して、Ｎ4−ベンゾイル−５’−O−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジンの水と複合体を形成した結晶（１．３ｇ）を得た。尚、この結晶はＤＳＣ測定により１１２℃に結晶融解に伴う吸熱ピークを有していた。
【００４３】
この複合体に含まれていたＮ4−ベンゾイル−２’−デオキシシチジン、Ｎ4−ベンゾイル−３’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジン及びＮ4−ベンゾイル−３’，５’−Ｏ−ビス（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジンは各々０．１Ａｒｅａ％、検出限界（０．０１％）以下、０．０４Ａｒｅａ％含まれていた。
【００４４】
実施例４
Ｎ4−ベンゾイル−５’−O−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジンの水と複合体を形成した結晶の合成
参考例１にて合成したＮ4−ベンゾイル−５’−O−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジンのフリー体（２．０ｇ）をアセトン（５ｍＬ）に溶解し、水（８ｍｌ）を滴下後、実施例１で得られたＮ4−ベンゾイル−５’−O−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジンの水と複合体を形成した結晶（10ｍｇ）を加え、氷冷化で５時間晶析した。得られた結晶をろ取後、５０℃で減圧乾燥して、Ｎ4−ベンゾイル−５’−O−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジンの水と複合体を形成した結晶（１．４ｇ）を得た。尚、この結晶はＤＳＣ測定により１１４℃に結晶融解に伴う吸熱ピークを有していた。
【００４５】
この複合体に含まれていたＮ4−ベンゾイル−２’−デオキシシチジン、Ｎ4−ベンゾイル−３’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジン及びＮ4−ベンゾイル−３’，５’−Ｏ−ビス（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジンは各々０．０７Ａｒｅａ％、検出限界（０．０１％）以下、０．１Ａｒｅａ％含まれていた。
【００４６】
実施例５
Ｎ4−ベンゾイル−５’−O−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジンの水と複合体を形成した結晶の合成
Ｎ4−ベンゾイル−２’−デオキシシチジン（４０．３ｇ）をピリジン（３０２．４ｇ）に懸濁し、１０℃まで冷却した。４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（４７．５ｇ）を同温で添加した後、１０℃で４時間攪拌した。反応終了後、重曹（１２．９ｇ）を加えた後、室温で２時間撹拌後、反応液を濃縮した。残留物に酢酸ブチル（４７３ｇ）を加え、室温で１時間攪拌後、不溶物をろ過した。得られた有機層に、室温でヘキサン（１４０ｇ）を滴下し、次いで水（３．３ｇ）及び実施例１で得られたＮ4−ベンゾイル−５’−O−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジンの水と複合体を形成した結晶（０．１ｇ）を加え、室温で一日間晶析後、再度ヘキサン（９３ｇ）を滴下して、室温で５時間晶析した。
【００４７】
得られた結晶をろ取後、５０℃で減圧乾燥して、Ｎ4−ベンゾイル−５’−O−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジンの水と複合体を形成した結晶（６３．７ｇ）を得た。尚、この結晶はＤＳＣ測定により１１０℃に結晶融解に伴う吸熱ピークを有していた。
また、この複合体中には、原料であるＮ4−ベンゾイル−２’−デオキシシチジン、副生物であるＮ4−ベンゾイル−３’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジン及びＮ4−ベンゾイル−３’，５’−Ｏ−ビス（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジンが各々０．０５Ａｒｅａ％、検出限界（０．０１％）以下、０．１５Ａｒｅａ％含まれていた。
【００４８】
実施例６
Ｎ4−ベンゾイル−５’−O−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジンの水と複合体を形成した結晶の精製
実施例５で得られたＮ4−ベンゾイル−５’−O−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジンの水と複合体を形成した結晶（６０ｇ）、活性炭（３ｇ）をアセトニトリル（３００ｇ）に加え、５５℃で１時間処理を行った。不溶物を濾別後、水（２４０ｇ）を滴下し、Ｎ4−ベンゾイル−５’−O−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジンの水と複合体を形成した結晶（０．１ｇ）を加え、２時間室温で晶析後、再度水（２４０ｇ）を滴下、室温で２時間晶析した。得られた結晶をろ取後、５０℃で減圧乾燥して、Ｎ4−ベンゾイル−５’−O−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジン の水と複合体を形成した結晶（５５．８ｇ）を得た。水分値はカールフィッシャー分析では２．３％であった。
【００４９】
尚、この結晶はＤＳＣ測定により１１４℃に結晶融解に伴う吸熱ピークを有していた。
また、この複合体中には、原料であるＮ4−ベンゾイル−２’−デオキシシチジン、副生物であるＮ4−ベンゾイル−３’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジン及びＮ4−ベンゾイル−３’，５’−Ｏ−ビス（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジンが各々検出限界（０．０１％）以下、検出限界（０．０１％）以下、０．０５Ａｒｅａ％含まれていた。
【００５０】
実施例７
Ｎ4−ベンゾイル−５’−O−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジンの合成
Ｎ4−ベンゾイル−５’−O−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジンの水と複合体を形成した結晶（４０ｇ）を棚段乾燥機を用い、減圧下（１０ｍｍＨｇ）、６５℃で窒素を流しながら４０時間乾燥した。乾燥後、目的物であるＮ4−ベンゾイル−５’−O−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジン（３９．１ｇ）の白色の粉末を得た。尚、得られた粉末中に含まれる水分値は０．１％であった。ＸＲＤ測定において、本粉末は明確な結晶性ピークは観察されず、アモルファス化していた。ＤＳＣ測定においても結晶融解に伴う吸熱ピークが消失していた。
【００５１】
比較例１
ＷＯ ００／７５１５４を参考にした。すなわち、２．００ｇのＮ4−ベンゾイル−５’−O−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジンのフリー体〔Ｎ4−ベンゾイル−２’−デオキシシチジン、Ｎ4−ベンゾイル−３’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジン及びＮ4−ベンゾイル−３’，５’−Ｏ−ビス（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジンが各々１．０Ａｒｅａ％、０．１５Ａｒｅａ％、２．２Ａｒｅａ％含有。〕を２．３ｍＬのアセトニトリルに溶解した。この溶液を、水４１ｍＬ中に激しく撹拌しつつ滴下後、１時間撹拌した。析出した白色固体を濾取、水で２回洗浄した。５０℃で減圧乾燥して１．８２ｇのＮ4−ベンゾイル−５’−O−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジンを得た。尚、この固体はＸＲＤ及びＤＳＣ測定において結晶に伴う吸収ピークまたは吸熱ピークを有しておらず、結晶化していない事が判明した。また、この複合体に含まれていたＮ4−ベンゾイル−２’−デオキシシチジン、Ｎ4−ベンゾイル−３’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジン及びＮ4−ベンゾイル−３’，５’−O−ビス（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジンは各々０．９Ａｒｅａ％、０．１３Ａｒｅａ％、１．８Ａｒｅａ％であり、本法による精製効果は殆ど確認されなかった。
【００５２】
【発明の効果】
本発明により、大量製造可能な方法を用いて、従来の方法に比べ効率的に高純度の保護化２’−デオキシシチジン類を製造することができるようになった。
【発明の属する技術分野】
本発明は保護化２’−デオキシシチジン類およびその水と複合体を形成した結晶に関する。さらに詳しくは、本発明は、５’位保護化２’−デオキシシチジン類の製造方法、精製方法に関する。
５’位保護化２’−デオキシシチジン類は、近年開発されつつあるアンチセンスＤＮＡなどの原料として有用な化合物である。
【０００２】
【従来の技術】
近年、ゲノム創薬の進展に伴い、アンチセンスＤＮＡ医薬などが急速に開発されている。それに伴い、原料となるＤＮＡオリゴマー、さらにオリゴマーの原料となる保護化デオキシヌクレオシド類の需要が増大している。一方で医薬品の用途には、含まれている不純物による副生成物の生成を極力抑制するため、非常に高純度の中間体製品を使用する必要がある。
【０００３】
これまで、５’位保護化デオキシヌクレオシド類は特開昭５８−１８０５００号公報、特開昭６３−１７９８８９号公報や特表平６−５０７８８３号公報等の例で明らかなとおり、カラムクロマトグラフィー法を用いて精製されてきた。この方法では、極性や構造が大きく異なる不純物の精製は比較的容易であるが、類似構造を有する不純物の除去は困難である。例えば、５’，３’位の両方の水酸基がジメトキシトリチル基の様なトリチル誘導体で保護された不純物や、必要な５’位ではなく３’位の水酸基がジメトキシトリチル基の様なトリチル誘導体で保護された不純物等は特に除去しにくく、更にこれらの不純物は医薬品の製造上、次工程以降に影響が大きい不純物であり、その混入は非常に問題である。更に、カラムクロマトグラフィー法は工業化において大掛かりな精製装置が必要であり、かつ大量の溶媒を必要とする事から、将来の大量生産、大量供給においては非常に問題があるといわざるを得ない。
【０００４】
また、これまでにも、カラムクロマトグラフィーを用いずに不純物を除くための検討がなされてきた。具体的には再沈殿法による精製について、特開昭６０−１５２４９５号公報やＰＣＴ出願ＷＯ２０００７５１５４公報およびＷＯ００３９１３８公報では開示されている。再沈殿による方法とは、予め粗化合物を可溶性溶媒に溶解した後で、不溶性溶媒を添加または不溶性溶媒に滴下することにより、強制的に再析出させる方法である。そのため基本的に精製能力は低く、前記で示したような不純物の除去は困難である。また、可溶性溶媒と不溶性溶媒の量比を適切に調整することは工業的には困難で、量比を誤ると容易にオイル化したり、粘性のある沈殿を生じて精製に失敗しやすい。実際、特開昭６０−１５２４９５公報の方法によれば、粘調なアメ状にて得られる場合があり、工業的には問題がある。これまでには再沈殿によるアモルファス化の方法は開示されてきたが、結晶化により結晶を得る方法については知られていなかった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
従来の問題点を鑑み、効率的かつ特別な設備を必要としない、非常に高純度の保護化２’−デオキシシチジン類の製造法を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題について鋭意検討した結果、保護化２’−デオキシシチジン類及び水を含む溶液から、水と複合体を形成した保護化２’−デオキシシチジン類の結晶化に成功した。この事により、従来技術では困難であった結晶化または再結晶による精製法での精製が可能であることを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
即ち、本発明は以下のとおりである。
［１］ 一般式（１）［化５］
【０００８】
【化５】
（式中、ｍおよびｎはそれぞれ独立して任意の整数、Ｒ１は４−メトキシトリチル基、４，４’−ジメトキシトリチル基又はトリフェニルメチル基を、はＢ１はアミノ基が保護されたシトシン基を表す。）で表される保護化２’−デオキシシチジン類の水と複合体を形成した結晶。
［２］ 一般式（１）で示される化合物が一般式（２）[化６]
【００１０】
【化６】
（式中、ｍおよびｎは前記と同義である。）で表される［１］に記載の水と複合体を形成した結晶。
［３］ Ｎ4−ベンゾイル−３’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジンの含有量が０．１％以下である［２］記載の水と複合体を形成した結晶。
［４］ 一般式（３）［化７］
【００１２】
【化７】
（式中、Ｒ１及びＢ１は前記と同義である。）で表される化合物及び水を含有する溶液から、一般式（３）で表される保護化２’−デオキシシチジン類を、水と複合体を形成した結晶として析出させ、これを回収することを特徴とする、保護化２’−デオキシシチジン類の精製法。
［５］ 溶液に含まれる水の量が一般式（３）に対し、０．５当量以上である事を特徴とする、［４］に記載の保護化２’−デオキシシチジン類の精製法。
［６］ 一般式（３）で示される化合物が式（４）［化８］
【００１４】
【化８】
である、［４］又は［５］に記載の保護化２’−デオキシシチジン類の精製法。
［７］ 得られた結晶中のＮ4−ベンゾイル−３’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジンの含有量が０．１％以下である［６］記載の保護化２’−デオキシシチジン類の精製法。
［８］ 一般式（１）または一般式（２）で示される保護化２’−デオキシシチジン類の水と複合体を形成した結晶を、大気圧以下の圧力で乾燥する事により、水と複合体を形成していない一般式（３）または式（４）で示される保護化２’−デオキシシチジン類の製造方法。
【００１６】
【発明実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１７】
本発明の一般式（１）又は一般式（３）のＢ１における、アミノ基が保護されたシトシン基の保護基としては、アルキル基、アルキルアシル基あるいは置換されてもよいベンゾイル基が挙げられる。
【００１８】
この場合、アルキル基は直鎖状でも分岐していてもよいし、さらに別の官能基（置換基）が結合していてもよい。該置換基としてはたとえばメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、２−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｉ−ブチル基等が挙げられる。
【００１９】
アルキルアシル基は直鎖状でも分岐していてもよく、環を形成していてもよく、さらに別の官能基（置換基）がついていてもよい。該置換基としては、例えばアセチル基、プロピオニル基、ｎ−ブチリル基、ｉ−ブチリル基、ピバロイル基、バレリル基、イソバレリル基、シクロプロピル基、フェニルアセチル基、フェノキシアセチル基、（イソプロピルフェノキシ）アセチル基等が挙げられる。
【００２０】
ベンゾイル基は無置換でも置換されていてもよく、また、フェニル基の２位、３位、４位いずれの位置に置換基があってもよい。また、複数の位置に置換基があってもよい。置換基としてはたとえばメチル基、エチル基、２−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｔ−ブチル基等のアルキル基、ヒドロキシル基、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロピルオキシ基、２−プロピルオキシ基、ｎ−ブチルオキシ基等のアルキルオキシ基、ニトロ基、フルオロ基、クロロ基、ブロモ基、ヨード基等のハロゲン基、アミノ基、メチルアミノ基、エチルアミノ基、ｎ−プロピルアミノ基、ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基、ジイソプロピルアミノ基等のアルキルアミノ基、アセチル基、プロピオニル基、ベンゾイル基等のアシル基、フェニル基、ピリジニル基等が挙げられる。
【００２１】
具体的には、ベンゾイル基、２−クロロベンゾイル基、３−クロロベンゾイル基、４−クロロベンゾイル基、２−ブロモベンゾイル基、３−ブロモベンゾイル基、４−ブロモベンゾイル基、２−フルオロベンゾイル基、３−フルオロベンゾイル基、４−フルオロベンゾイル基、２−メトキシベンゾイル基、３−メトキシベンゾイル基、４−メトキシベンゾイル基、２−ニトロベンゾイル基、３−ニトロベンゾイル基、４−ニトロベンゾイル基、２−アミノベンゾイル基、３−アミノベンゾイル基、４−アミノベンゾイル基、２−メチルアミノベンゾイル基、３−メチルアミノベンゾイル基、４−メチルアミノベンゾイル基、２−ジメチルアミノベンゾイル基、３−ジメチルアミノベンゾイル基、４−ジメチルアミノベンゾイル基、４−フェニルベンゾイル基、４−アセチルベンゾイル基等が挙げられる。
【００２２】
保護化２’−デオキシシチジン類及び水を含有する溶液は、それら２種の成分を含有する限りにおいて溶媒を含有してよい。この場合の溶媒は保護化２’−デオキシシチジン類を水と複合体を形成した結晶として析出可能な溶媒であれば特に限定はないが、例えばメタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、ペンタノール、シクロヘキサノール等のアルコール類、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン等のエーテル類、アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン等のケトン類、ペンタン、ヘキサン、メチルペンタン、シクロヘキサン、ヘプタン、ノナン、デカン等の飽和炭化水素類、ベンゼン、トルエン、クメン、キシレン、メシチレン、ジイソプロピルベンゼン、トリイソプロピルベンゼン等の芳香族炭化水素類、ジクロロメタン、クロロホルム、ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素類、ピリジン、ルチジン、キノリンなどのピリジン類、トリエチルアミン、トリブチルアミン等の３級アミン類、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド、ジメチルイミダゾリジノン、ジメチルスルホキシド等の極性溶媒等が挙げられる。これらの溶媒は単一または数種類混合して用いる事も可能である。
【００２３】
水と複合体を形成した結晶とは、結晶構造を形成するために水が補助的な役割を果たしている状態を指し、結晶格子に水を取り込んだ形で結晶を形成したり、水との弱い相互作用により複合体を形成したりするなど、何れの場合も含んでいる。水との複合体の形態と結晶構造については特に制限されない。
【００２４】
保護化２’−デオキシシチジン類の水と複合体を形成した結晶には、結晶化の際に使用される保護化２’−デオキシシチジン類及び水を含有する溶液に由来する溶媒を、結晶化を阻害しない範囲で微量含んでいてもよい。
【００２５】
結晶化の際の水の量は保護化２’−デオシキシチジン類に対し、０．５当量以上有れば良いが、好ましくは１当量以上である。
【００２６】
水と複合体を形成させる方法としては特に限定は無いが、例えば、保護化２’−デオシキシチジン類を含有する溶液に水を添加するか、または水を含有する溶媒に保護化２’−デオシキシチジン類を加える事でも得る事が出来る。
【００２７】
結晶化の際の保護化２’−デオシキシチジン類の濃度は結晶化出来る濃度であれば特に限定はないが、通常１％から５０％、好ましくは５％から４０％の範囲で行われる。
【００２８】
結晶化の際の温度は特に規定されないが、−１０℃から溶媒の沸点の範囲が望ましい。また、通常は１度の結晶化で十分精製可能であるが、さらに繰り返し再結晶を行うことでより高純度にすることもできる。また、再結晶の際は結晶種を接種してもよい。
【００２９】
この様にして得られた保護化２’−デオシキシチジン類の水と複合体を形成した結晶は、必要に応じて大気圧以下の圧力、好ましくは０．１ｍｍＨｇから１００ｍｍＨｇで乾燥する事により、水分含量の低下した保護化２’−デオシキシチジン類の水と複合体を形成した結晶、水と複合体を形成しない保護化２’−デオシキシチジン類の粉末、または保護化２’−デオシキシチジン類の粉末を得ることが可能である。
【００３０】
乾燥する時の温度としては、水を除去できれば特に限定はないが、通常、室温から２００℃の範囲で行われる。また、乾燥操作の際、窒素等の水分を含まない気体を流しながらの乾燥や、シリカゲル、五酸化二燐等の脱水剤を用いての脱水も可能である。
【００３１】
本発明の精製法により除去される不純物としては、Ｎ4−ベンゾイル−３’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジン、Ｎ4−ベンゾイル−３’，５’−Ｏ−ビス（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジン等が挙げられ、これら不純物のうちＮ4−ベンゾイル−３’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジンの保護化２’−デオシキシチジン類中の含有量は、水と複合体を形成しているかいないかに関係なく、０．１％以下、好ましくは０．０１％以下であり、Ｎ4−ベンゾイル−３’，５’−Ｏ−ビス（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジンの保護化２’−デオシキシチジン類中の含有量は、水と複合体を形成しているかいないかに関係なく、０．３％以下、好ましくは０．１％以下である。（この場合、％は試料を液体クロマトグラフィーにより測定した場合のチャートの面積比、Ａｒｅａ％を表す。）
以上本発明により、保護化２’−デオキシシチジン類の効率的な精製ができるようになった。
【００３２】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
【００３３】
実施例及び比較例のＨＰＬＣ条件−１（Ｎ4−ベンゾイル−２’−デオキシシチジン、Ｎ4−ベンゾイル−３’，５’−Ｏ−ビス（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジンの分析条件）
カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ ＴＭＳ−ＵＧ−５
１５０ｍｍ×直径４．６ｍｍ
流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ．
カラム温度：３５℃
検出波長：２５４ｎｍ
移動相：グラジェント条件
時間（ｍｉｎ．） Ｂ液（％）
０ ２０
３０ １００
３５ １００
３７ ２０
５０ ＳＴＯＰ
〔Ａ液〕
水（２９４０ｍｌ）にＮａＨ2ＰＯ4・２水和物（１．９２ｇ）、Ｎａ2ＨＰＯ4（２．４３ｇ）を溶解後、ＭｅＯＨ（６０ｍｌ）を加え混和し、脱気する。
〔Ｂ液〕
水（３００ｍｌ）にＮａＨ2ＰＯ4・２水和物（１９６ｍｇ）、Ｎａ2ＨＰＯ4（２４８ｍｇ）を溶解後、ＭｅＯＨ（２７００ｍｌ）を加え混和し、脱気する。
【００３４】
実施例及び比較例のＨＰＬＣ条件−２（Ｎ４−ベンゾイル−３’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジンの分析条件）
カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＣＮ Ａ−５１２
１５０ｍｍ×直径６．０ｍｍ
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ．
カラム温度：３５℃
検出波長：２３５ｎｍ
測定時間：８０ｍｉｎ．
注入量：１０μＬ
移動相：グラジェント条件
時間（ｍｉｎ．） Ｂ液（％）
０ １４
２５ ５０
６０ １００
８０ １００
８２ １４
１０２ ＳＴＯＰ
〔Ａ液〕
水（２０００ｍＬ）にＮＨ4Ｈ2ＰＯ4（１．１５ｇ）、（ＮＨ4）2ＨＰＯ4（０．９２ｇ）を溶解後、脱気する。
〔Ｂ液〕
アセトニトリル（１２００ｍＬ）とＡ液（４００ｍＬ）を混合後、脱気する。
【００３５】
実施例および比較例のＸＲＤ測定条件
機器：ＲＡＤ−１Ａ（（株）リガク）
Ｘ線ターゲット：Ｃｕ ３０ｋＶ １５ｍＡ
測定速度：２°／ｍｉｍ．
【００３６】
実施例及び比較例のＤＳＣ分析条件
機器：ＤＳＣ８２１e（ＭＥＴＴＬＥＲ ＴＯＬＥＤＯ）
容器材質：アルミニウム製
温度上昇速度：５℃／ｍｉｎ．
窒素気流下で測定
【００３７】
参考例１
Ｎ4−ベンゾイル−５’−O−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジンの製造
Ｎ4−ベンゾイル−２’−デオキシシチジン１１９．０ｇをピリジン１．５Ｌに溶解した。４，４’−ジメトキシトリチルクロリド１１３．５ｇを室温で２時間かけて添加した後、室温で４時間攪拌した。重曹３３．８ｇを加えた後、さらに２時間撹拌後、反応液を濃縮した。残留物に酢酸エチル１．２Ｌ、水３００ｍＬを加えて撹拌した。少量の飽和食塩水を加えて分液し、有機層を同様に再度水洗した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。ろ過後、溶媒を留去したのち、酢酸エチル溶媒を用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製した。目的物を含むフラクションをジイソプロピルエーテル２．０Ｌ中に激しく攪拌しながら滴下した後、２時間室温で攪拌した。ろ過して得られた固体を５０℃で減圧乾燥して、Ｎ4−ベンゾイル−５’−O−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジンのフリー体１５３．３ｇを得た。このフリー体はＸＲＤ測定でアモルファスであった。また、このフリー体中には、原料であるＮ4−ベンゾイル−２’−デオキシシチジン、副生物であるＮ4−ベンゾイル−３’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジン及びＮ4−ベンゾイル−３’，５’−Ｏ−ビス（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジンが各々１．０Ａｒｅａ％、０．１５Ａｒｅａ％、２．２Ａｒｅａ％含まれていた。
【００３８】
実施例１
Ｎ4−ベンゾイル−５’−O−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジンの水と複合体を形成した結晶の合成
参考例１にて合成したＮ4−ベンゾイル−５’−O−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジンのフリー体（２．０ｇ）を１，２−ジクロロエタン（５ｍＬ）に溶解し、水（０．１ｇ）を加え、−２４℃で１日間晶析した。得られた結晶をろ取後、５０℃で減圧乾燥して、Ｎ4−ベンゾイル−５’−O−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジンの水と複合体を形成した結晶（０．８ｇ）を得た。水分値はカールフィッシャー分析では２．７％であった。尚、この結晶はＸＲＤ測定において明確な結晶性ピークを有し、特に５．６°、７°、１０．３°にシャープな吸収を有していた。また、ＤＳＣ測定により１０９℃に結晶融解に伴う吸熱ピークを有していた。
【００３９】
この複合体に含まれていたＮ4−ベンゾイル−２’−デオキシシチジン、Ｎ4−ベンゾイル−３’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジン及びＮ4−ベンゾイル−３’，５’−Ｏ−ビス（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジンは各々０．０５Ａｒｅａ％、検出限界（０．０１％）以下、０．０５Ａｒｅａ％含まれていた。
ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ８．７（ｓ，１Ｈ）、８．３（ｄ，１Ｈ）、７．９（ｄ，２Ｈ）、７．２−７．６（ｍ，１３Ｈ）、６．８−６．９（ｍ，４Ｈ）、６．３（ｍ，１Ｈ）、４．５（ｍ、１Ｈ）、４．２（ｍ、１Ｈ）、３．８（ｓ，６Ｈ）、３．４−３．５（ｍ，２Ｈ）、２．７−２．９（ｍ，２Ｈ）、２．３（ｍ，１Ｈ）
【００４０】
実施例２
Ｎ4−ベンゾイル−５’−O−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジンの水と複合体を形成した結晶の合成
参考例１にて合成したＮ4−ベンゾイル−５’−O−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジンのフリー体（２．０ｇ）を酢酸ブチル（５ｍＬ）に溶解し、ヘキサン（０．５ｍｌ）を滴下後、水（０．１ｇ）及び実施例１で得られたＮ4−ベンゾイル−５’−O−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジンの水と複合体を形成した結晶（10ｍｇ）を加え、氷冷化で１日間晶析した。得られた結晶をろ取後、５０℃で減圧乾燥して、Ｎ4−ベンゾイル−５’−O−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジンの水と複合体を形成した結晶（１．３ｇ）を得た。水分値はカールフィッシャー分析では２．２％であった。尚、この結晶はＸＲＤ測定において明確な結晶性ピークを有し、特に５．６°、７°、１０．３°にシャープな吸収を有していた。また、ＤＳＣ測定により１１２℃に結晶融解に伴う吸熱ピークを有していた。
【００４１】
この複合体に含まれていたＮ4−ベンゾイル−２’−デオキシシチジン、Ｎ4−ベンゾイル−３’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジン及びＮ4−ベンゾイル−３’，５’−Ｏ−ビス（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジンは各々０．１２Ａｒｅａ％、検出限界（０．０１％）以下、０．０７Ａｒｅａ％含まれていた。
【００４２】
実施例３
Ｎ4−ベンゾイル−５’−O−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジンの水と複合体を形成した結晶の合成
参考例１て合成したＮ4−ベンゾイル−５’−O−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジンのフリー体（２．０ｇ）をアセトニトリル（５ｍＬ）に溶解し、水（７ｍｌ）を滴下後、実施例１で得られたＮ4−ベンゾイル−５’−O−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジンの水と複合体を形成した結晶（10ｍｇ）を加え、氷冷化で５時間晶析した。得られた結晶をろ取後、５０℃で減圧乾燥して、Ｎ4−ベンゾイル−５’−O−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジンの水と複合体を形成した結晶（１．３ｇ）を得た。尚、この結晶はＤＳＣ測定により１１２℃に結晶融解に伴う吸熱ピークを有していた。
【００４３】
この複合体に含まれていたＮ4−ベンゾイル−２’−デオキシシチジン、Ｎ4−ベンゾイル−３’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジン及びＮ4−ベンゾイル−３’，５’−Ｏ−ビス（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジンは各々０．１Ａｒｅａ％、検出限界（０．０１％）以下、０．０４Ａｒｅａ％含まれていた。
【００４４】
実施例４
Ｎ4−ベンゾイル−５’−O−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジンの水と複合体を形成した結晶の合成
参考例１にて合成したＮ4−ベンゾイル−５’−O−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジンのフリー体（２．０ｇ）をアセトン（５ｍＬ）に溶解し、水（８ｍｌ）を滴下後、実施例１で得られたＮ4−ベンゾイル−５’−O−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジンの水と複合体を形成した結晶（10ｍｇ）を加え、氷冷化で５時間晶析した。得られた結晶をろ取後、５０℃で減圧乾燥して、Ｎ4−ベンゾイル−５’−O−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジンの水と複合体を形成した結晶（１．４ｇ）を得た。尚、この結晶はＤＳＣ測定により１１４℃に結晶融解に伴う吸熱ピークを有していた。
【００４５】
この複合体に含まれていたＮ4−ベンゾイル−２’−デオキシシチジン、Ｎ4−ベンゾイル−３’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジン及びＮ4−ベンゾイル−３’，５’−Ｏ−ビス（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジンは各々０．０７Ａｒｅａ％、検出限界（０．０１％）以下、０．１Ａｒｅａ％含まれていた。
【００４６】
実施例５
Ｎ4−ベンゾイル−５’−O−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジンの水と複合体を形成した結晶の合成
Ｎ4−ベンゾイル−２’−デオキシシチジン（４０．３ｇ）をピリジン（３０２．４ｇ）に懸濁し、１０℃まで冷却した。４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（４７．５ｇ）を同温で添加した後、１０℃で４時間攪拌した。反応終了後、重曹（１２．９ｇ）を加えた後、室温で２時間撹拌後、反応液を濃縮した。残留物に酢酸ブチル（４７３ｇ）を加え、室温で１時間攪拌後、不溶物をろ過した。得られた有機層に、室温でヘキサン（１４０ｇ）を滴下し、次いで水（３．３ｇ）及び実施例１で得られたＮ4−ベンゾイル−５’−O−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジンの水と複合体を形成した結晶（０．１ｇ）を加え、室温で一日間晶析後、再度ヘキサン（９３ｇ）を滴下して、室温で５時間晶析した。
【００４７】
得られた結晶をろ取後、５０℃で減圧乾燥して、Ｎ4−ベンゾイル−５’−O−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジンの水と複合体を形成した結晶（６３．７ｇ）を得た。尚、この結晶はＤＳＣ測定により１１０℃に結晶融解に伴う吸熱ピークを有していた。
また、この複合体中には、原料であるＮ4−ベンゾイル−２’−デオキシシチジン、副生物であるＮ4−ベンゾイル−３’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジン及びＮ4−ベンゾイル−３’，５’−Ｏ−ビス（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジンが各々０．０５Ａｒｅａ％、検出限界（０．０１％）以下、０．１５Ａｒｅａ％含まれていた。
【００４８】
実施例６
Ｎ4−ベンゾイル−５’−O−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジンの水と複合体を形成した結晶の精製
実施例５で得られたＮ4−ベンゾイル−５’−O−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジンの水と複合体を形成した結晶（６０ｇ）、活性炭（３ｇ）をアセトニトリル（３００ｇ）に加え、５５℃で１時間処理を行った。不溶物を濾別後、水（２４０ｇ）を滴下し、Ｎ4−ベンゾイル−５’−O−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジンの水と複合体を形成した結晶（０．１ｇ）を加え、２時間室温で晶析後、再度水（２４０ｇ）を滴下、室温で２時間晶析した。得られた結晶をろ取後、５０℃で減圧乾燥して、Ｎ4−ベンゾイル−５’−O−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジン の水と複合体を形成した結晶（５５．８ｇ）を得た。水分値はカールフィッシャー分析では２．３％であった。
【００４９】
尚、この結晶はＤＳＣ測定により１１４℃に結晶融解に伴う吸熱ピークを有していた。
また、この複合体中には、原料であるＮ4−ベンゾイル−２’−デオキシシチジン、副生物であるＮ4−ベンゾイル−３’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジン及びＮ4−ベンゾイル−３’，５’−Ｏ−ビス（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジンが各々検出限界（０．０１％）以下、検出限界（０．０１％）以下、０．０５Ａｒｅａ％含まれていた。
【００５０】
実施例７
Ｎ4−ベンゾイル−５’−O−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジンの合成
Ｎ4−ベンゾイル−５’−O−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジンの水と複合体を形成した結晶（４０ｇ）を棚段乾燥機を用い、減圧下（１０ｍｍＨｇ）、６５℃で窒素を流しながら４０時間乾燥した。乾燥後、目的物であるＮ4−ベンゾイル−５’−O−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジン（３９．１ｇ）の白色の粉末を得た。尚、得られた粉末中に含まれる水分値は０．１％であった。ＸＲＤ測定において、本粉末は明確な結晶性ピークは観察されず、アモルファス化していた。ＤＳＣ測定においても結晶融解に伴う吸熱ピークが消失していた。
【００５１】
比較例１
ＷＯ ００／７５１５４を参考にした。すなわち、２．００ｇのＮ4−ベンゾイル−５’−O−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジンのフリー体〔Ｎ4−ベンゾイル−２’−デオキシシチジン、Ｎ4−ベンゾイル−３’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジン及びＮ4−ベンゾイル−３’，５’−Ｏ−ビス（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジンが各々１．０Ａｒｅａ％、０．１５Ａｒｅａ％、２．２Ａｒｅａ％含有。〕を２．３ｍＬのアセトニトリルに溶解した。この溶液を、水４１ｍＬ中に激しく撹拌しつつ滴下後、１時間撹拌した。析出した白色固体を濾取、水で２回洗浄した。５０℃で減圧乾燥して１．８２ｇのＮ4−ベンゾイル−５’−O−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジンを得た。尚、この固体はＸＲＤ及びＤＳＣ測定において結晶に伴う吸収ピークまたは吸熱ピークを有しておらず、結晶化していない事が判明した。また、この複合体に含まれていたＮ4−ベンゾイル−２’−デオキシシチジン、Ｎ4−ベンゾイル−３’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジン及びＮ4−ベンゾイル−３’，５’−O−ビス（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジンは各々０．９Ａｒｅａ％、０．１３Ａｒｅａ％、１．８Ａｒｅａ％であり、本法による精製効果は殆ど確認されなかった。
【００５２】
【発明の効果】
本発明により、大量製造可能な方法を用いて、従来の方法に比べ効率的に高純度の保護化２’−デオキシシチジン類を製造することができるようになった。
Claims (8)
- 一般式（１）［化１］
- 一般式（１）で示される化合物が一般式（２）[化２]
- Ｎ4−ベンゾイル−３’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジンの含有量が０．１％以下である請求項２記載の水と複合体を形成した結晶。
- 一般式（３）［化３］
- 溶液に含まれる水の量が一般式（３）示される化合物に対し、０．５当量以上である事を特徴とする、請求項４に記載の保護化２’−デオキシシチジン類の精製法。
- 一般式（３）で示される化合物が式（４）［化４］
- 得られた結晶中のＮ4−ベンゾイル−３’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジンの含有量が０．１％以下である請求項６記載の保護化２’−デオキシシチジン類の精製法。
- 一般式（１）または一般式（２）で示される保護化２’−デオキシシチジン類の水と複合体を形成した結晶を、大気圧以下の圧力で乾燥する事により、水と複合体を形成していない一般式（３）または式（４）で示される保護化２’−デオキシシチジン類の製造方法。
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