JPS62254055A - グルコシル化蛋白の測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業士ｑ札風分Ｉ 本発明は、免疫検定法によるグルコシル化蛋白の測定法
に関する。

従来の技術 近年、生理的条件下において、特に糖尿病患者において
糖と蛋白との非酵素的結合反応、即ら血中の高濃磨のグ
ルコースのアルデヒド基と、生体内の比較的半減期の長
い蛋白のＮ末端及び側鎖の／ミノ棋との非酵素的結合反
応が明らかにされ、この結合により生じるアルジミン（
シッフ塩基）は、更にアマトリ転位により安定したケ１
−アミンを生成し、グルコシル化蛋白となることが解明
されると共に、このグルコシル化蛋白の測定値が空腹時
の血糖値とよく相関し、しかも該値は糖尿病患者では健
常人と明確に１メ別される高値となり、従って、該グル
コシル化蛋白値が血糖二］ンｌ−［１１−ル指標として
有効で、その測定によれば糖尿病の診断、病態の解明、
予後の経過の究明答が可能で必ることが明らかにされた
。

しかして、下記グルコシル化蛋白の測定法としてｔよ、
従来Ｔ　Ｂ　Ａ法（Ｔ　１ｏｂａｒｂｉｔｕｒｉｃ　　
ａｃｉｄ）法、即ら血清に弱酸を加えて加熱して５−ビ
トロキシメチルフルフラール（５−ＨＭＦ）を遊離させ
、そのヂオバルビツール酸＜ＴＢＡ＞との結合による発
色を比色定量する方法や硼酸アフイニテイクロマトグラ
フイー、即ち蛋白に結合した糖のシス−ジオール基を利
用して、アミツノＪニル＠酸をセファロースＣＬ−６Ｂ
等の適当な担体に固定したゲルカラムにかけ、ゲルに吸
着したグルコシル化蛋白を溶出させて分離し、これを紫
外吸収又は口−り一法等により比色測定する方法等が知
られている。

また、操作の容易性や迅速な測定を行なうために、免疫
検定法（ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　＞による上記グルコ
シル化蛋白の測定技術も検討され、そのための抗体につ
いても幾つか提案されている。

しかしながら、既存の測定技術においては、操作の繁雑
さや測定に長時間を要する等の操作上の問題点に加え、
特に正確性、再現性の点等から、未だ斯界の要望に応え
るものはない（「臨床検査」ＭＯＯＫ、Ｎｏ、１８．ｐ
　６０−６８　（１９８４）、特開昭５９−１１９２６
４号公報参照）。

発註が解決しようとでる問題点 かかる現状にＪ５いて、既存のグルコシル化蛋白の測定
法に代り、より特異１１か高く、被検者１こｊ３１プる
非酵素的グルニ１シル化の的確な把握を可能とする正確
性、再現性に浸れ、また簡便で迅速なａｌす定を可能と
し、スクリーニング手段としてもりｆ］凶なわｉしい測
定技術の確立が斯界で切望されている。

本発明の目的は、上記斯界で切望されＣいるグルコシル
化蛋白の新しい免疫測定技術を提供することにある。

間　ウを解決するための手段 本発明によれば、還元処理した体液中の還元型グルコシ
ル化蛋白を、還元型グル：」シル化リジン残塁を認識す
る抗体を用いて、免疫検定法により測定することを特徴
とするグルコシル化蛋白の測定法が提供される。

蛋白とグルコースとの非酵素的結合反応によれば、蛋白
中のりジン残基のε−アミノ基がグルコシル化されてア
ルジミン及びクトンが形成され、かかる反応は生体内で
も生じていると考えられ、該ケトアミンと選択的に結合
する（り′トアミンを認識する）抗体の利用によるその
測定によれば、非酵素的グルコシル化の度合を知ること
ができる。

しかしながら、上記ケトアミンは、平衡状態で溶液中に
異なる立体配座、即ち、閉鎖ケトース並びに６員環ピラ
ノース及び５員環フラノース構造の両者のα−及びβ−
アノマーで存在することが知られている。従って、斯界
の要望に合致するｌう感度、高精度の免疫測定を実施す
るべく、ケトアミンを認識する七ツクローナル抗体を用
いる方法を採用しようとしても、該モノクローナル抗体
はその認識の面で極めて特異性の高い故に、所望の効果
は望み難い。

しかるに、本発明者らは、上記アルジミン及びケトアミ
ンの還元処理によれば、立体配座的にも安定なグルコシ
ル化リジンアダクト（グルコシル化蛋白）が生成し、還
元処理した体液を検体とし−（用いることにより、−Ｌ
ツクローナル抗体の有利性を充分に生かした測定技術を
提供できることを確認し、かくしてグルコシル化リジン
残基（還元型グルコシル化リジン残基）を認識する抗体
を用いた上記本発明免疫測定技術を確立した。

本発明の上記測定法は、糖尿病の診断や維持警理に極め
て有用である。

以下、本発明測定法に利用する還元型グルコシル化リジ
ン残基を認識する抗体につき、詳述する。

該抗体は、例えば還元型グルコシル化リジン残基を保有
する抗原で免疫された補７Ｌ動物の形質細胞（免疫細胞
）を、ｌＩｒ１ｔ５’ｌ、動物の形質細胞肝細胞と融合
させてハイブリドーマ（ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　）を作成
し、これより上記還元型グルコシル化リジン残基を認識
する所望抗体を産生づ゛るクローンを選択し、該クロー
ンより製造することができる。

上記において、用いられる抗原としては、還元型グルコ
シル残塁がリジンに、もしくはリジン残基を介して担体
蛋白に、結合した還元型グル」シル化リジン（グルシト
シルリジンンもしく（よ還元型グルコシル化蛋白（グル
シ１ヘシル蛋白）が一般に使用でき、還元型グル：１シ
ル化リジン＠造を保有する限り、各種のちのを使用でき
る。その代表例としては、例えば還元型グルコモル化β
−リボプ■ナイン（Ｇｌｃ−ＬＤＬ）、還元型グルコシ
ル化ポリリジン（ＧＩＣ−ＰＬ＞、還元型グルコシル化
ヒト血清アルブミン（Ｇ’１ｃ−１〜［ＳＡ）、還元り
１″！グルコシル化生血清アルブミン（Ｏｌｅ−ＢＳＡ
）、グルシトシルリジン（ＣＩＣ−１＞笠を例示できる
。

また下記式（１） ％式％ で表される新規な還元型グルコシル化リジン誘導体も同
様に使用できる。

之等の抗原は、通常の方法に従い製造することができ、
例えばりジンヌ（５１担体蛋白とグルコースとの非酵素
的結合反応による結合物（アルジミンもしくはグ］−ア
ミン）を還元処理する方法により製造できる。Ｌ２非酵
素的結合反応は、常法、例えば通常の緩衝液等の適当な
溶媒中、約２０〜３７℃程度で約７２〜１８０時間程度
インギコベ−１へすることにより実施できる。また還元
処理は、上記非酵素的結合反応と同時に行なうのがよく
、これは、一般にシラノ塩塁の還元ちしくはカルボニル
基の水酸基への１１元に通常用いられている反応方法に
従い実施できる。その具体例としては、例えばＮ　ａ　
Ｂ　Ｈ４、Ｎ　ａ　ＣＮ　Ｂ　）ｌ　３等の水素化還元
剤を用いる還元法を例示できる。之等の還元剤は、通常
反応に使用したグルコースに対して笠モル量〜２倍モル
早稈度使用され、反応は約２０〜３７°ＣＴ−７２〜１
８０時間を要して実ｔＭされ得る。

また、上記方法においＣ抗原て゛免疫される浦ｆＬ動物
としでは、特に限定されないが、細胞融合に使用する形
質細胞肝細胞との適合性を考慮して選択するのが好まし
く、一般には、マウス、ラツに−等が有利に使用される
。

免疫は一般的方法により、例えば上記抗原を哺乳動物に
静脈内投与もしくは腹腔内注射等により投与することに
より行なわれる。より具体的には、抗原をＰＢＳ等で適
当濃度に希釈し、動物に２〜１４日毎に数回投与し、総
投与量が約１〜１００μｑ／マウス程度になるようにす
るのが好ましい。

免疫細胞としては、上記最終投与の約３日後に摘出した
牌細胞を好ましく使用できる。

上記免疫細胞と融合される他方の親細胞としての哺乳動
物の形質細胞腫細胞としては、既に公知の種々の細胞株
、例えばｐ３　（ｐ３／Ｘ６３−Ａｇ８）（Ｎａｔｕｒ
ｅ、２５６，４９５−４９７（”１９７５））、　Ｉ）
３−Ｕｌ　　（Ｃｕｒｒｅｎｔ丁ｏｐｉｅｓｉｎ　　Ｍ
ｉｃｒｏｂ、１ｏｌｏｏｙ　ａｎｄ　Ｘ　ｎ＋ｍｕｎｏ
ｌｏｇｙ、　８１．１−７　　（１９７８））、Ｎ５−
１　　（Ｅｕｒ、Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、、６．　５１１−５１９　　（１９７
６）　　）、ＭＰＣ−１１（Ｃｅｌｌ、旦、４０５−４
１５（１９７６））　、５Ｐ２１０　（Ｎａｔｕｒｅ、
２７６゜２６９−２７０　（１９７Ｂ））、ＦＯ（Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、　　Ｍｅｔｈ、、　　３５．　１−２
１　　（１９８０）　）Ｘ６３．６．５．３．　　（Ｊ
、　　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、’ｌ；）３゜１５４８−１５
５０（１９７９））、３１９４（Ｊ、　　ＦＸｐ、Ｍｅ
ｄ、、１４８，３１３−３２３（１９７Ｂ））等や、ラ
ットにおけるＲ２１０（Ｎａｔｕｒｅ、２７７．１３１
−１３３　（１９７９））等の骨髄肝細胞等を使用でき
る。

上記免疫細胞と形質細胞肝細胞との融合反応は、基本的
には、公知の方法例えばマイルスタインら（ＭｉｌＳｔ
ｅｉｎ　ｅｔ　ａｔ　＞の方法（Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎｌ
：＝ｎＺｙｍｏｌｏ（ｌ’／、ＶＯｌ、　　７３．　ｐ
ｐ３（１９８１）　）　’８に準じて行ない得る。より
具体的には上記融合反応は、例えば融合促進剤の存在下
に通常の栄養培地中で行なわれる。融合促進剤としては
、通常用いられるもの、例えばポリ丁チシングリー］−
ル（ＰＥＧ）　、センダ−イウイルス（ＨＶＪ）等が使
用され、更に所望により融合効率を高めるためにジメチ
ルスル小キシド等の補助剤を添加使用することもできる
。免疫細胞と形質細胞腫細胞との使用比は、通常の方法
と変りがなく、例えば形：ｉ４［胞肝細胞に対し、免疫
細胞を約１〜１０償程度用いればよい。上記融合時の培
地としては、例えば上記形質細胞腫細胞株の増殖に使用
されるようなＲＰＭＩ−１６４０培地、ＭＥＭ培肋、そ
の他この種の細胞培養に使用される通常の各種培ｊ内を
利用でき、通常は生１１１！７児血清（Ｆｅ２）等の面
詰補液を（友いておくのがよい。融合は、上記免疫細胞
と形質細胞腫細胞との所定量を上記培地内−（゛よく混
合し、予め３７℃程度に加温１〕たＰ　Ｅ　Ｇ溶液、例
えば平均分子量１０００〜６０００程度のものを、通常
培地に約３０〜６０Ｗ／Ｖ％の濃度で加えて）昆ぜ合せ
ることにより行なわれる。以後、込１当なｊ＆地を逐次
添加して遠心し、」とｂを陥入する操作を繰返ずことに
より所望のハイシリドーマが形成される。

ｉｌｌられる所望のハイゾリド・−ンの分離は、通出の
）π別用培地、例えばｔ−１Ａ　Ｉ培地（じボ４゛リー
ンノーン、アミノプテリン及びナミジンを含む培地）（
ｆｉ’＋　首−ｖることにより（１なわれる。該！−１
△−１１８地Ｃ・の培益（３１、目的とりるハイブリド
ーマ以外の細胞（未融合細胞等）が死滅す゛るのに光分
な１１）間、通常数［」〜数週間行なえばよい。かくし
て得られるハイブリドーマは、通常の限界希釈法に従い
、［］的とする抗体の産生株の検索及び甲−り１」−ン
化が（ｊなわれる。

該産生株の検索は、例えば＋Ｅ　ｔ−Ｉ　ＳＡ法（Ｌｎ
ｇｖａｌｌ、　　Ｅ、、Ｍｅｔｈ、ＬｎＺＶｍｏｌ、７
０．　４１９〜４３９　（１９８０））、プラーク法、
スメｒＣ’、’１〜法、凝集反応法、オフ５’　ｏ　二
、イー（０ｕＣｈｔｅｌ’１ＯｒｌＶ）法、ラジオイム
ノアッセイ（ＲＩΔ）法等の一般に抗体の検出に用いら
れている種々の方法〔「ハイブリドーマ法とモノクロー
ナル抗体」、（株）Ｒ＆Ｄプランニング発行、Ｉ）ｐ３
０〜５３．１１Ｆ１和５７年３月５日〕に従って行なわ
れる。該検索は、前記した抗原を使用して行なえばよく
、殊ｌご還元型グルコシル化リジン残塁以外の抗原決定
基と結合する可能性のある抗体を排除するために、免疫
原として使用した抗原とは異なる抗１京を使用するのが
望ましい。

かくして還元型グルコシル化リジン残基を認識する抗体
を産生ずる所望のハイブリドーマが得られる。これは、
通常の培地で継代培養て゛さ、また液体窒素中で容易に
長期間保存可能である。

該ハイブリドーマからの所望の七ツク■」−プル抗体の
採取は、該ハイブリドーマを常法に従って培養し、その
培谷上清として、或いはハイブリドーマをこれと適合性
のある噛５１Ｌ動物に投ｔ−ゴシて増殖させ、その腹水
として得る方法等が採用される。

前者の方法は、高純度の抗体を１７６のに適してあり、
後者の方法番よ、抗体の犬早１産に適している。

また上記で１けられろ抗体は更に、塩析、吸収法、ゲル
シン濾過法、アフイニブイクロマ１へグラノィー等の通
常の精製ｆ段により精製づることｆ−）ＴＳきる１゜か
くして得られる七ツクローナル抗体ｔよ、還元型グルコ
シル化リジン残基に極めて高い特異性を−４１し、従っ
て該抗体の利用によれば、被検菌における非酵素的グル
コシル化の度合を的確に把握（”きる。またこれにより
、より的確１．ｒ糖尿病の診断及び血糖コントロールが
可能でめる。

本発明方法は、上記特定抗体の使用と共に、被検サンプ
ル（検体）として還元処理した体液の使用を必須の要件
とし、その暴木的操作は、通常の免疫検定法、例えばＲ
ＩＡ法、耐糸免疫測定法（ＥＩＡ）等に従うことができ
る。之等各免疫検定法における操作、ｆ順等は一般に採
用されているそれらと特に責ならず、例えば公知の競合
法、サンドイツチ法等に準じることができ、また測定系
の抗原として一５前記した抗原を°採用シ２１７る。

本発明方法にｄ３けるＬ記還元処理し！、二体液として
は、例えば還元処理された血液、尿、細胞組織液、リン
パ液、胸水、腹水、羊水、胃液、膵液、髄液、唾液等を
例示できる。２等体液の還元処理は、既述の方法に準じ
ることができ、通常、還元剤を約１０〜１００ｍＭ濃度
程度使用して、３０分〜１８０時間程度を要して行ない
得る。２等検体は、またその還元処理に先立ち、予めぞ
の巾の蛋白性画分の採取（もしくはグルコースの除去）
を行なってから用いるのが最ち好ましい。該両分の採取
は、それ自体公知の方法、例えば７ｔｌ〜ン、メタノー
ル、エタノール、ブ［］パノール、ジメチルホルムアミ
ド＜ＤＭＦ＞等のｈ機溶媒等を蛋白沈澱剤として用いる
処理方法、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、リン酸
ブ１〜リウム等の塩析剤を用いろ処理方法、透析膜、平
板膜、中空域イ［膜等を用いる限外濾過処理方法等及び
之等の組合せにより実施て゛きる。尚、上記において公
知の方法に従って、フルプミンやリボプし］ティン分画
にまで精製した後、これを還元処理して検体として用い
るときには、非酵素的グルコシル化蛋白の総もうに代り
、特定の蛋白に特異的な非酵素的クリニ】シル化準をλ
ｌることがて−きる。

更に本発明方法において１．Ｌ記還元処理に先立つ蛋白
ｔｔ画分の採取は、より好ましくは適当な蛋白吸着用担
体を用いる吸首処理により実施される。

この蛋白吸着用担体としては、例えば抗ヒｊ・血清しフ
ルブミン抗体等の所望の蛋白に対する抗体や、蛋白吸容
性の色素等を・通常の不溶性担体に同相化したしのを使
用できる。上記色素としては、例えばクーマージ−ブリ
リアントブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ［３ｒｉｌｌｉａ
ｎｔ　　Ｂｌｕｅ　、　ＣＢＢ）　、クロ［」トリアジ
ン染料（Ｃｈｌｏｒｏｔｒｉａｚｉｎｅ　ｄｙｅ）９を
例示でき、ＣＢＢ−０２５０及びチバクロ〕／ブルー（
Ｃ１ｂａｃｒｏｎ　３１ｕｅ　）がより好ましい。

本発明方法において、不溶化法（不溶化抗原、不溶化抗
体、上記蛋白吸着用担体等の同相化された試薬を用いる
方法）を採用づる場合、抗原、抗体、色素等の試薬は、
常法に従い、不溶性担体に化苧的又は物理的に反応させ
ることにより製造される。ここで不溶性担体としては、
例えばセルロース、セファデックス、セファロース、ポ
リスチレン、メチルメタクリレート、アクリ日ニトリル
−ブタジェンースチレン共重合体＜ＡＢＳ＞　、スチレ
ン−無水マレイン酸共重合体、濾紙、カルボキシメチル
セルロース、イオン交換樹脂、デギス１〜ラン、プラス
チックフイ、ルム、プラスチックチューブ、ナイロン、
ガラスピーズ、絹、ポリ７７ミンーメチルビニルエーテ
ルーマレイン酸共手合体、アミノ酸共重合体、エチレン
−マレイン酸共弔合体等を使用できる。不溶化（固相化
）は、共有結合法としてのジアゾ法、ペプチド法（Ｍア
ミド誘導体法、カルホキシフ［Ｊリド樹脂法、カルボジ
イミド樹脂法、無水マレイン醇誘導体法、イソシアナー
ｉ〜誘導体法、臭化シアン活性化多糖体法、セルロース
カルボッ゛−１・誘導体法、縮合試薬を使用する方法等
）、アルキル化法、架橋試薬による担体結合法（架橋試
薬としてゲルタールアルデヒド、ヘキサメチレンイソシ
アナート等を用いる）、Ｕｇｉ反応による担体結合法等
の化学的反応；或いはイオン交換樹脂のような担体を用
いるイオン結合法；ガラスピーズ等の多孔性ガラスを担
体として用いる物理的吸着法等によって行なわれる。

標識性；京又は標識抗体としては、前記抗ＩＪ１又は前
記抗体を、通常の放射性物質、酵素標識物質、螢光物質
等の各種標識剤で標識化したちのが用いられる。該標識
剤としての放射性物質としては、１２５Ｉ等の放射性ヨ
ード等を、螢光物質としては、ノルオレツレイン・イソ
ヂオシアナー＋＝（Ｆ１丁Ｃ）、テ１〜ラメチル目−ダ
ミン・イソチオシアナート（ＴＲＩ丁Ｃ〉、置換ローダ
ミン・イソチオシアナート（ＸＲＩ丁Ｃ）、ローダミン
Ｂ・イソチオシアナート、ジクロ目トリアジンノルオレ
ツセイン（ＤＴＡＦ）等を、酵素標識物質としではシフ
シカリフ４スフ１ターゼ、β−ガラクトシダーゼ、パー
オキシダーゼ（ＰＯＸ＞　、マイクロバーオキシダーピ
、キモトリプシノーゲン、プロカルボキシペプチダーゼ
、グリ廿ロアルデヒドー３−リン酸脱水素酵素、アミラ
ーゼ、小スホリラーゼ、Ｄ−ナーゼ、Ｒ−ナーＬ１ウレ
ア−ぜ等をそれぞれ例示できる。これらによる標識り法
も常法に従うことができる（Ｊ、　３ｉｏ１．Ｃｈｅｍ
、。

２５４．９３４９−９３５１　＜１９７９）：Ｎａｔｕ
ｒｅ　、１９４，４９５　（１９６２）：螢光抗体法、
医化学実験講座Ｎｏ、４，２６３−２７０：△ｃｔａ、
　Ｅ　ｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、３ｕｌ）Ｉ）１．１６８　
、２０６＜　１９７２　）　：　Ｐｒｏｅ、Ｎａｔ、　
Ａｅａｄ、Ｓｅｉ、、ＵＳＡ。

５７．７１３　（１９６７＞等参照〕。

本発明方法におりる検体中の被検物質（運丸型グルコシ
ル化すジン残基吊）の測定・定♀方法１ユ、上記した試
薬を用いて免疫反応させることにより実施される１、そ
の際測定系に利用される溶媒として【ま、反応に悪影響
を与え危い通常のもの、例えばり１丁ン酸泉妥函液、リ
ン酸緩衝液、ｌ−リス−塩酸緩衝液、酢酸Ｍ衝液等のｐ
Ｈ４〜８程度の緩衝液を好ましいものとして例示できる
。また測定の際の免疫反応条件は特ｔこ制限はなく、通
常のこのＩ’９測定法と同様のものとすることができる
。ｌ：！Ｉ］ち該免疫反応は一般に４５℃以下、好まし
くは約４・〜４０℃の温度条（’を下、１〜４０時間を
要して行なわれる。免疫反応終了後の結合体及び遊離体
（Ｂ−Ｆ　）の分離も公知の方法に従い、例え【ＪＫ不
）Ｈ化法を採用したとぎは、遠心分離、炉別、洗浄、デ
カンテーション等の分離手段により固相一液相を分離す
ることができる。その他の場合には例えばデキストラン
−活性炭法、第２抗体法等の常法に従えばよい。

以下、本発明方法を、操作の簡便な不溶化法を例にとり
説明すれば、該方法ｔよ （１）まず測定しようとする検体中の被検物質と一定量
の不溶化抗原とを、標識抗体の一定量と競合反応させ、
次いでＢ−Ｆ分離を行ない、そのいずれか一方の標識剤
活性を測定して被検物質量を定量する、 （２）まず検体中の被検物質と一定量の標識抗原とを、
一定量の不溶化抗体と競合反応さＵ、次いでＢ−Ｆ分離
し、そのいずれか−ｈの標識剤活性を測定して被検物質
量を定ｈ！覆゛る、（３）検体中の被検物質と不溶化抗
体とを反応させて免疫複合体を形成さぜ、この複合体に
標識抗体を反応させ、複合体に結合した標識抗体の標識
剤活性を測定して被検物質量を定量する、（４）検体に
、蛋白吸着用担体を加えて、被検物質を吸着させ、これ
に標識抗体を反応させ、担体に結合した標識抗体の標識
活性を測定する、（５）検体として予め蛋白吸着用担体
により吸着処理後、還元処理した体液を用い、該担体に
標識抗体を反応させ、担体に結合した標識抗体の標′ｔ
Ａ活性を測定する 等の方法により実施できる。

かくして、検体中の還元型グルコシル化すジン残塁早の
測定ができ、これは被検者におりる非酵素的グルコシル
化の度合を鋭敏に反映する。尚、上記（４）又は（５）
の方法によれば、体液中の特定の蛋白に特異的な上記測
定が可能である。例えば蛋白吸着用担体としてヂバクロ
ンブルー又ＩＪ：抗ヒトアルブミン抗体を同相化した担
体を用いる場合には、約２遍間以内における被検名の非
酵素的グルニ１シル化の度合を得ることができる。また
ＣＢＢ−０２５０及びチバクロンブルーは、吸着面で優
れたものでおり、之等の担体を用いた測定方法は、精度
の面で優れている。

以上の各種方法により測定される、非酵素的グルコシル
化の度合は、例えば単位蛋白量もしくは特定の、例えば
アルブミン分子中の、還元（ｖ（グルコシル化リジン残
基のモル数として表わすことができる。尚、式（１）で
表される誘導体は、スタンダードちしくは標識抗原とし
て、また反応量が不明な他のスタンダードのヒル教換算
の基準物として優れている。

本発明測定法を実施するのに特に便利な方法は、キット
を使用する方法であり、本発明はだかる１ツトをも提供
するものである。このキラｌ〜には、前記七ツク［］−
ナル抗体を抗体試薬として合イー１させることが重要で
おる。この抗体試薬には、グリセロールやウシ血清蛋白
のような安定化剤及び／又は保存剤を添加することがで
きる。好ましくは、この抗体試薬は凍結乾燥したもので
市り、キットには水溶性もしくは水と混和しつる＠媒を
含有させることかできる。更にこの抗体試薬には、再構
成された試薬系を一定のＤＨに保つための緩衝液及び／
又は使用前に試別が悪化するのを防ぐための保存剤及び
／又は安定剤を添加覆ることができる。緩衝液はキツｌ
〜試薬の必須成分とは考えられないが、本発明の測定法
を実施する際に、ＤＨを／１〜Ｂ　Ｖｉ度とするものを
用いるのが好ましい、、また内構成剤は好ましくは水を
含んだものであるが、水の一部又ｔは全部を水と混和し
得る溶媒で置さ換えることもできる。水と混和し得る溶
媒としては当業者に周知であり、例えばグリセリン、ア
ルコール類、グリコール類、グリコールエーテル類等を
使用できる。

発明の効果 本発明によれば、還元型グルコシル化リジン残基を！１
′４異的に認識する抗体を利用して免疫検定法により、
非酵素的グルコシル化の度合を的確に把握でき、被検者
にお（ブる糖尿病の診断及び血糖コントロールを良好に
行なうことが可能である。

実　　施　　　例 以下、本発明を更に詳しく説明するため実施例及び参考
例を挙げる。

参考例１　　抗原の製造 ■　β−リポプロティン（ＬＤＬ、シグマ社製）ｉｏｏ
ｍｇを、５０ｍＭ　　ＰＢＳ　（ｐＨ７，４）１０鵬に
溶解させ、これにＤ−グルコース７００ｍ□及びＮａＣ
ＮＢＨ３２００ＩＨを加え、至箭で４〜７日間保持した
。次いで反応系内に酢酸を加えて反応を停止させ、蒸留
水に対（）で透析した。透析液を凍結乾燥して、目的と
する還元型グルコシル化蛋白（Ｇｌｃ−ＬＤＬ）を得た
。

上記においてβ−リボプロティンに代え、ポリリジン（
ＰＬ、蛋白質研究奨励金）、ＢＳＡ、リジン（Ｌ）及び
ヒト血清アルブミン（Ｈ３Ａ）の各々を用い、同様にし
て還元型グルコシル化蛋白及び還元型グルコシル化アミ
ノ１（Ｇｌｃ−ＰＬ、Ｇｌｃ−ＢＳＡ、Ｇｌｃ−１及び
Ｇ　！ｃ−ＨＳ　Ａ　＞のそれぞれを得た。

上記でｇ７だ各グルコシル化蛋白を６Ｎ　　ＨＣＱを用
い−（加水分解（１２０℃、２０時間）後、アミノ酸ア
ナライザーによりアミノ酸分析を行ない、全リジン（Ｌ
ｙｓｉｒｉｅ　）に対するＧｌｃ−Ｌの○行止率を求め
た結果、Ｇ！ｃ　−ＬＤＬでは２９．８９％で、Ｇｌｃ
−ＰＬでは２４．１０％で、Ｇｌｃ−［３３八では１５
．５６％で、Ｇｌｅ−＝ｆ−１ｓ△でｔよ約１０％（こ
れを［１０％Ｇｌ（、−Ｈ３△」とする）であった。尚
、上記と同様にして同含有比率が６１．６％のＯｌ　ｅ
−１〜ＩＳＡ　（これをｒ６１．６％Ｑｌｃ−ト−ＩＳ
ＡＪとする）も得た。

■　Ｎ−２ｉＮ−ベンゾイルグリシル）−り一リジン（
？５白質研究奨励会）２００ｍ（Ｊ及びＤ−グルコース
１２９ｍｏを、水及びジオキサン（１：１）混液１０ｍ
Ｇに溶解させ、これにＮ　ａＢ　ＣＮ　ｌ−１３１００
１１１ｇをｈ日え、室温で３〜４日間保持した。次いで
反応系内に酢酸を加えて反応を停止させ、蒸留後、メタ
ノールを加えて蒸留した。

これを、ＴＳＫ１２０Ｔカラム（東洋曹達社製）を用い
たカラムクし一１マトグラノイー〔溶媒Ａ；９０％ア廿
トニｊ〜リル、内部様ｔ７＝５０ｍＭＴＦ△、溶媒８２
５％アセトニトリル、グラジＪントＡ１０％十Ｂ９０％
−→Δ６０％ＦＢ４０％〕により精製して、リデンショ
ンタイムが９．９３分（２鵬／分）にＮ２−　（Ｎ−ベ
ンゾイルグリシル）−Ｎ６−Ｄ−グルシド−ルーし一リ
ジンを得た。収率５８．２％。

得られた化合物のＰＭＲ分析図を第１図に示−丈。

主なピークは次の通りである。

ＰＭＲ（ＤＭＳ○−ｄｓ　、２．５０１）ｌ）ＩＩＩ　
）　：δ（ｐｐｍ　）（４００ＭＨ）＝ ８．６９　（ｔ　、Ｊ＝６．０）　、８．３０（ｍ　”
）８．１５　（ｄ　、Ｊ＝７．９＞ ７．８７（ｄ、、ノー　７．６） ７．５４　　（ｔ　、Ｊ＝７．６＞ ７、　　４８　　（ｔ　　、　　　、〕　・・・　７　
、　６　）４、　２３　（ｄｄｄ、Ｊ＝８．３，７．９
，４．．６）３、　９８　　（ｄｄ、　　、）　−　１
６．　７．　６．　０）３、ε３７　　（ｄｆｊ、Ｊ−
１６，７，６，０＞３．６７　　（ｄｄ、Ｊ＝／１．８
．’１．２ン３．６０　　（ｄｄ、Ｊ−１０，／ｌ、２
．８ン３．１０〜３．５１（ＩＩＩ） ３．０７　　（ｄｌｊ、　　Ｊ−１２，５，３，７）２
．９４　　（ｄｄ、Ｊ＝１２．５．８．０＞２．８８　
（ｍ　）、１．７４，１．６１　　（ｍ　）、１、　３
４　　＜ｍ　） また−［二記で冑た誘導体を、６　Ｎ−１−Ｉ　ＣＱを
用い一〇加水分解（１２０℃、２０時間）俊、アミノ酸
ア犬うイリ゛−（日立８３５）によりアミノ酸分析を行
なった。

その結果グリシン及びグルシトールリジンがほぼ等モル
吊にてｉ認された。

参考例２　　モノクローナル抗体の製造■　前記参考例
１の■で１９たＧ　ｌ　ｃ　　Ｌ、、　Ｄ　Ｉ−を、Ｂ
ａ１ｂ　／ｃ系マウスに５μｇ／マウスの投与量で皮下
投与した。隔遊に５回上記投りを繰返して免疫し、最終
免疫の３目俊に牌臓を摘出Ｌノ、稗細胞をＲＰＭＩ−１
６４０培地で３回洗浄した。

マウス告髄腫細胞株Ｐ　３−　Ｕｌ（ＣｕｒｒｅｎｔＴ
ｏｐｉｃｓ　ｉｎ　　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎ
ｄ　Ｉ　ｕｕｎｏｌｏｇｙ　。

８１．１−７　（１９７８））を同様に洗浄ｊ支、その
ｌＸ１０３個と上記牌細胞１Ｘ１０’個どを５０戒遠心
管に入れ混合した。２００ＸＯ，５分遠心俊、上清をバ
スツールピペツｌ−て一除去し２だ。

３７℃に保温したポリ−エチレングリコール２０００（
和光紬薬社製＞３５Ｗ／ｖ％のＲＰ　Ｍ　Ｉ　−１６４
０溶液１回を滴下し、１０分間かりでゆ）くり混合し、
３７℃に保温した１５％Ｆ　ＣＳ及び１ｍＭピルベート
を含有するＲＰＭＩ−１６４０（以下、これを［完全Ｒ
ＰＭ１ｊという）５ｍＱを加え１０分間、更に完全ＲＰ
ＭＩの同型を加え４分間、次いで完全ＲＩ）Ｍｌの５ｍ
ｌを滴下して１分間それぞれゆっくりと撹拌した。２０
０Ｘｇで５分聞遠心後、上清を除去し、この操作を再度
繰返した後、３７℃に保温した完全ＲＰＭＩに、細胞ｌ
Ｘ１０’個／ｌｌ１１２となるように懸濁し、２４穴の
プレート（ファルコン社）に１１１１０ずつ接種し、３
７°Ｃ１５％炭酸ガスインキ、］ベーター内で培養した
。２４時間後１．０Ｘ１０”−’Ｍヒポ４ザンチン、４
．０ＸｌＯ−７Ｍアミツブｉリン、１．６Ｘ１０−５Ｍ
チミジンを○む完全ＲＰＭＩ培地（以下ｒ　）−Ｉ　Ａ
　Ｔ培地」という）１四を各つＴルＩＪ添加し・た。以
後、上清の半分を第３．４及び５日ト１にそれぞれ新し
いＨＡＩ培地に代え、第６目目に同様に上清の半分を、
１．０Ｘ１０””Ｍヒポ１ザンヂン及び１．６Ｘ１０−
５Ｍデミジンを含む完全Ｒ１０Ｍｌ培地（以下「「」丁
培地」という）に代えた１、同様に、第６．７及び９日
日に上清の半分をＨＴ培地に代え、第１０目目に上清の
半分を完全ＲＰＭＨ８地に代えた。以後、この完全ＲＰ
ＭＩ培地で増殖維持した。

かくして得られるハイブリドーマを、限界希釈法により
クローニングした。叩らハイブリドーマ２．５Ｘ１０個
／ｍＱ、　Ｂａ１ｂ　／ｅ系７１クス胸腺細胞４Ｘ１０
６個／ｍＱとなるように完全ＲＰＭＩ培地［ご調製し、
これをハイブリドーマ５１固／ウエルとなるように２０
０つ丁ルのプレートに播き、培養した。増殖してくるハ
イブリドーマを更に同様にハイブリドーマ０．２５個／
ウェルとして夕日−ニングした。

目的の抗体を産生するクローンの検索は、前記抗原（Ｇ
ＩＣ−ＢＳΔ）を固定したプレートもしくはビーズを用
い、　　　■もしくは酵素で標識したＡ７ギ抗マウス免
疫グロブリン（カッペル社）を使用した固定法により行
なった。

かくしてクローンＮｏ、ＯＡＬ−Ｍ−１０で表わされ、
後述の特異反応性を首するＬツクローナル抗体を産生す
る所望のハイブリドーマを１１？だ。

このハイシリドーマＯＡＬ−Ｍ−１０は、アメリカン　
タイプ　カルブ−１７−二］レクシｊン（ＡＴＣＣ：１
２３０１　　Ｐｃｒｋｌａｗｎ　　Ｄｒｉｖｅ　　　Ｒ
ｏｅｋｖｉｌｌｅ。

ＨＤ２０８５２．　Ｕ　ＳＡ）に１９８６イ１１２月１
９日に寄託されており、その寄託番号はＡ　’Ｔ　ＣＣ
Ｎ　０１１−１Ｂ９２９７である。

■　上記■で得られたり日−ンＮＯ，ＯＡＬ−Ｍ−１０
を、完全ＲＰＭＩ培地にで５％炭酸ガスインキコベータ
ー中で、３７°Ｃにて４８時間培肴した。

！８養液を遠心力ｍ　（３０００ｒｐｍ　、１０分）し
て、所望の七ツク■−プル抗体を○む培養上清を１１に
、。

尚、上記抗体は、■ｇＧ２ａリグクラスに属していた。

これは各種マウス免疫グＬ］ゾリンクラスに対するウサ
ギ抗体＜　Ｌ　１ｔｔｏｎ、　Ｂ　１Ｏｎｅｔｉｃｏ、
　　１　ｎｃ。

Ｋｅｎｓｉｎｇｔｏｎ、Ｍ　Ｄ　２０７９５　＞及び１
２５Ｉ標識プロデイン八を使用したイエ−（Ｙｅｈ）ら
の方法（Ｍｉｎｇ−Ｙａｎｇ　Ｙｅｈ　ｅｔ　ａｌ、、
Ｐｒｏｅ、Ｎａｔ！、Δｅａｄ。

Ｓｃｉ、、ＵＳＡ、Ｖｏｌ、７６、Ｎｏ、６．２９２７
−２９３１　（１９７９））に準じた試験により確認さ
れた。

■　上記■で得たクローンＮｏ、ＯＡ　Ｌ−Ｍ−１０（
７）１Ｘ’１０８個を、ＲＰＭＩ１６４０培地０．５−
に懸濁させ、Ｂａ１ｂ　／ｃ系マウスに腹腔内投与した
。２〜３週間俊、蓄積した腹水を採取し、目的抗体を含
む腹水２〜５鴫／マウスを１９だ。

この抗体の濃度は約０．２〜１ｍｇ、／ｍａであった。

この腹水５−にＰＢＳ５ｍＱ及び飽和硫安１０ＴＩＩＩ
２を加え、０℃下にゆるやかに撹拌した。遠心分離（１
００００ｒｐｌＩｌｘ３０分、４℃＞してｎた沈渣を、
０．０５Ｍトリス塩酸（ｐＨ８，６）で平衡化したセフ
ァデックスｑ−２５カラム（ファルマシア社製）のゲル
か過に付した。ボイドボリウム付近に溶出された分画を
同上緩衝液で平衡化したプロティン△−セフ／ロースＣ
Ｌ−４Ｂ　（ファルマシア社製）に付し、ＩＱＧ分画を
吸着させた後、ｐＨ５，５の５０ｍＭクエンＩ！！２緩
衝液で充分洗浄後、ＤＨ４，３の酢酸Ｍ衝液でＩＱＧ２
ａを溶出させ、精製抗体ＯＡＩ−Ｍ−’ｔｏを１７だ。

参考例３　　不溶化抗体の調製 参考例２の■で得た精製抗体を、０．１５ＭＮａＣ９及
び０．０５％ＮａＮ３を含む５０ｍＭＰＢＳ　（ＩＩ）
Ｈ＝７．４＞にて２０μ９蛋白、Φ／四に調製した。

ポリスヂレンビーズ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ　　Ｐｌａｓ
ｔｉｃＣｏ、Ｌｔｄ、、ＵＳＡ、直径６．４１１１ｍ）
　１ｂ個を、希釈した「ママレーＬン」　（ライオン株
式会社、原液１．５回／Ｑ蒸留水〉て゛よく洗浄し、更
に蒸、留水で洗浄した。次いでこれを０．５．Ｍ苛性ソ
ーダ水溶液中に３日間浸漬し）た後、洗浄液がｐ目的６
になるまで蒸留水で洗浄した。

上記抗体溶液１００ｍＧに、このビーズ８００個を加え
、２１ｉ間減圧下に時々撹拌（）ながら放置し、次いで
４℃下で一晩放置した。ビーズを濾過し、生理食塩水で
洗浄後、０．５％血漿ＢＳΔ（生化学工業社）を含む５
０ｍＭＰＢＳ　（ＤＨ＝７．４＞中に減圧下２時間、更
に４℃下−晩装置した。ビーズを枦取し、充分に洗浄し
て不溶化抗体を得た。

参考例４　　標識抗原の調製 ■　参考例１で得た免疫抗原Ｇｌｃ−ＢＳＡ５０μｇを
０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐ　Ｈ＝　８゜２）２００ｔＩ
Ｑに溶かした溶液に、Ｎａ１２５１（ＮＥＮ社）の１ｍ
Ｃ１を加えた。ヨードゲン（Ｉ　ｏｄｏｏｃｎ　：　Ｐ
　１ｅｒｃｅ社＞　４０μｇ／２０ｕＱ（７）ジクロル
メタン溶液をガラス試験管に入れ、窒素ガス気流下に溶
媒をとばして乾燥し、この試験管に、上記抗原溶液を加
え、０℃下に５分間、かるく撹拌しながら反応させた。

この反応物を別の試験管に移し、反応を停止させた後、
ゲル濾過（セファクリール３２００．１Ｘ３３ｃＩ１１
．溶出液−〇、２％ゼラチン含有５０ｍＭ　　ＰＢＳ　
（ｐＩ−（７、／１））により、放射活性のピークに一
致するアルジミン分画を採取して、　　　■−標識抗原
を得た。

また上記の他に、クロラミンＴ法（Ｎ　ａｔｕｒｅ　。

１９／Ｉ、４９６　（１９６２））及びポル１−シーハ
ンター法（［３ｉｏｅｈｅｍ、　Ｊ、、８９．コ１４（
１９６３））に従っても、それぞれ良好な１２５Ｉ−標
識抗原を得た。

■　パーオキシダーゼのリジン残塁を利用して酵素標識
抗原を作成した。即ち、１０１１１１０１ｌ１バーオ↑
シダーゼを５０ｍＭリン酸塩緩衝液に溶かし、これにグ
ル１−スフ０町及びＮａＢＨ３２０ｍｇを加え、４℃で
７日間反応させた。透析後、ゲル濾過及びアフイニテイ
クロマトグラフイーにより請賀して所望の標識抗原を得
た。

参考例５　　標識抗体の調製 参考例２の■で得た精製抗体を用い、参考例４の■と同
様にして、　　　■−標識抗体を１２？た。

参考例６　　不溶化抗原の調製 参考例１の■で得た免疫抗原Ｇ　ＩＣ−Ｐ　Ｌを用い、
参考例３と同様にして不溶化抗原を得た。

参考例７　　蛋白吸着用ビーズの調製 ■　参考例３と同様にしてポリスチレンビーズ（Ｐｒｅ
ｃｉｓｉｏｎ　　ＰＩａｓｔｉｃＣｏ、Ｌｔｄ、、ＵＳ
Ａ１直径６．４ｍｍ）５０００個を、クーマージ−ブリ
リアントブルー（ＣＢＢ）Ｇ−２５０（レルバ社製）の
１ｇを入れた８０％エタノール７００ｍＱ中に４〜７日
間浸漬した後、蒸留水で洗浄して目的とする蛋白吸容用
ビーズを調製した。

■　チバクロンブルー（Ｃｉｂａｃｒｏｎ　Ｂｌｕｅ　
３ＧＡ。

ＦＬＵＫＡ　ＡＧ、　）　１　、　ＯＣＪの蒸留水溶液
１００１１を調製した。

一方、スヂレンーマレイン酸共重合体（無水マレイン故
含有量約２４モル％）から製したビーズ〔アミン化グイ
ラークビーズ＃８０、直径約６．３５ｍｍ、積水化学社
製）６００個をｇｌ水３００ｍとテトラヒドロフラン５
０ｍＧとの混合液に混合、分散させ、これと上記溶液と
を加え合わせて、５分聞緩かに撹拌した。ＮａＣＱ　ｌ
０ＣＩの蒸留水溶液５０戒を添加して、３０分聞撹拌後
、５Ｎ　　ＮａＯＨ２，５−を添加して、更に３日局撹
拌した。反応液を除き、蒸留水、１ＭＮａＣＱ水溶液、
５Ｍ尿素水溶液、蒸留水の順で充分にビーズを洗浄後、
０．０１％グラヂンによりブロックして、目的とする蛋
白吸着用ビーズを調製した。

実施例１ ■　抗体の特異性試験 参考例１で１９だ抗原のうち、可溶性のＧｌｅ−ＢＳ△
、Ｇｌｅ−ＬＤＬ及びＧＩＣｉ−をスタンダードとして
使用した。対照としてβ−リボプロｊイン、Ｄ−グルコ
ース、Ｄ−ソルビトール、リジン及びポリリジンを使用
した。

参考例２の■で１７だ抗体の１２倍希釈液１００μＱ、
段階希釈系列の上記スタンダード又は対照１００μＱ及
び参考例４の■で得た１２５Ｉ−標識抗原１００μＱ（
約２００００ｃｐｍ）を、アッセイバッファー（０，１
５Ｍ　　ＮａＣ９，Ｏ，’１％ゼラチン及び０．０２％
ＮａＮ３を含む５０ｍＭソジウムホスフエートバツファ
ー、ｐＨ７，４＞３００．１に加え、４℃下に一晩イン
キユベートした。抗マウスＩＣ２Ｇヤギ抗体（×４０、
株式会社日本抗体研究所Ｍ＞１００μＱ、正常マウス血
清（Ｘ４００）１００μＱ及び１２．５％ポリエチレン
グリコール２００μＱを加えて、窄温下に３０分聞イン
キュベートシた。遠心分離＜３０００ｒｐｍ　ｘ　３０
分）及びデカンテーションにより、Ｂ−Ｆ分離を行ない
、両者の放射能を測定した。

結果を第２図に示す。図中、［軸はＢ　／　Ｂ　。

（％）を、下段横軸はスタンダードの濃度（μ９／―）
及び上段横軸は対照の濃度（μｇ／鵬）を各々示す。ま
た図において（１〉はＱｌ’ｅ−ＢＳＡ。

（２）！；Ｊ：ＧＩＣ−１−ＤＬ、（３）はＧ！ｃ−Ｌ
、（４）はβ−リボプロ゛アイン、（５）μＤ−グルコ
ース、（６）は１）−ソルビＩヘール、（７）はリジン
及び（８）はポリリジンのそれぞれを示している。

上記第２図より、上記抗体は、還元型グルコシル化すジ
ン残）Ｊに極めて高い特異反応性をイｊすることが明ら
かである。

■　標γＡ（曲線（検量線）の作成 上記■において、参考例１の■で製造したグルシ！・−
ルリジン誘導体をスタンダードとして用いて作成された
標準曲線を第３図に示す。図中、縦軸はＢ／Ｂｏ（％）
を、横軸はスタンダードの濃度（ｎＭｌｔ’＞を示す。

また図において（１）は上記誘導体をスタンダードとし
た結果を、（２）は６１．６％Ｇｌｃ−Ｈ３Ａを同様に
スタンダードとした結果をそれぞれ示している。

上記より、６１．６％Ｇｌｃ−’Ｈ３Ａは、曲屈アミノ
酸分析の結果から、６１．６％のリジン残塁がグルコシ
ル化されているが、上記誘導体を基準物とすることによ
り、６１．６％ＧＩＣ−Ｈ３への免疫反応に関与するＧ
ＩＣ−ｔｙｓ残括は、全リジン残枯の２８．６％でめる
ことが確認された。

実施例２ ■　糖尿病患者及び正常人より、血清を採取分離した。

この血清各５０ｔｌＱに８０％エタノール２鵬を加えて
混合し、遠心分離（３０００ｒｐｍ　ｘ１５分）して沈
漬を得た。これをコＯｍ　Ｍ　　Ｎ　ａ　Ｂ　Ｈ４を含
む５０ｍＭ　　ＰＢＳ５００μＱに溶解し、３０分間放
置した。５％酢酸１０μＱを加えて反応を停止させ、更
に０．１％ゲラヂンを含む５０ｍＭｆ）　Ｂ　Ｓ　５０
０μＱを加え、以下かくして調製したものを「検体」と
して使用した。

■　上記各検体の１００μＱ及び参考例５で冑た１２５
１Ｂ識抗体の１００ｕＱ（約４００００ｃｐｍ）を３７
℃下に１時間インキュベートした。これに参考例６で１
ｑた不溶化抗原（ビーズ）１個を加え、更に３７°Ｃ下
で１時間インキコベートした。ビーズを蒸預水で洗浄後
、その放射能を測定した。

その結果、正常人と糖尿病患者とは、明確に区別され、
糖尿病患者においては、非酵素的グルコモル化Ｑ月立合
が高いことが確認された。

■　上記検体の２５０μＱに、不溶化抗ヒ１〜血清アル
ブミン抗体（ビーズ）１個を加え、３７℃下に１時間イ
ンキュベー；へした。蒸留水で洗浄後、参考例５で１ｑ
た１２５■−標識抗体の約４００００Ｃｐｍを加えて、
３７℃下で１時間インキュベートした。蒸留水で洗浄後
、その放射能を測定した。

尚、上記検体の代りに、曲屈参考例１の■で得た抗原１
０％Ｇｌｃ−Ｈ８Δをスタンダードとして使用して、上
記と同様にして標【Ｗ曲線を作成した。

該標準曲線を第４図に示ず。図に１１１５いて縦軸は結
合数！１−Ｉ能（ｃｐｍ）を、横軸はスタンダードの濃
度ＣｎＭ脱）を示す。

また、上記検体につい一′（の測定結果を第す図に示す
。第５図において縦軸は第４図の標準曲線から求めた１
０％Ｇｌｃ−１−Ｉ　ＳΔ換換部濃度　ｎｏ／　ｍＱ＞
を示す。尚、この結果は、前記参考例１の■で製造した
グリシドールリジン誘導体を基準とすることにより、グ
リシドールリジン残基の一゛しル数として評価すること
ができる。

実施例３ ■　参考例１の■と同様にしてＧＩＣ−１−（Ｓ△を製
造し、アフィゲルブルーカラムを用いたアフィニティー
クロマトグラフィーにより精製し、これをスタンダード
とした。

該（３１ｃｍｔ−１ｓΔは、アミノ酸分析の結果から６
０．６％のりジン残基がグルコシル化されており、参考
例１の■で％ｊＢしたグリシドールリジン誘導体を基準
とすることにより、免疫反応に関与するＧＩＣ−ＬＶＳ
残基は全リジン残基の４０．５％て′めった。

該Ｇ　ｌｔ、−１−Ｉ　Ｓ　Ａのスタンダードの希釈系
夕１１［Ｏ−ブランク、０．３９．０．７８．１．５６
．３．１２２５．６゜２５．１２“、５．２５．５０ピ
コ１ｆニル（免疫反応に関与するＧＩＣ−ＬｙＳ残阜換
粋弔Ｊを２０μＱづつチューブにリンプリングし、各ヂ
コーーブに３０ｒｎＭレミカルバジドの１０ｍＭアニリ
ン水溶液（Ｄｉ１５）２００ｕ、Ｑづつを加えて、軽く
振培した。

参考例７の■及び■で調製した蛋白量る用ビーズ及び抗
ヒト血清アルブミン抗体ビーズのいずれか各１個づつを
上記チューブに加え、３０分間、室Ｕ（２０〜３０℃）
でインキュベージ」ンした。

その後、反応液をアスピレータ−で吸引瀘過し、生理食
塩水１〜２前を入れ、ビーズを洗浄し、洗液を完全に除
去した。この操作を２回繰返した。

一方、ＮａＢＨａ　０．３ｇを０．０１Ｎ水酸化ナトリ
ウム水溶＠３ｍに加えで溶解させ、この０、５１１１Ｑ
をよく冷却したＯ、ＩＭトリス塩酎耐衝液（ｐＨ８，２
）２５鵬に加えて軽く撹拌して、還元用溶液を製造した
。

この２５０μＱづつを上記チューブに分注し、３０分間
、室温で放置し、その後、反応液を７スビレーターで吸
引濾過し、すべてのチューブに生理含塩水１〜２ｒ！ｆ
！を入れてビーズを洗浄し、洗液を除去した。この操作
を２回繰返した後、ビーズを別のチューブに移しかえた
。

上記ビーズ洗浄後、参考例５で調製した１２５■椋識抗
体溶液２００μＱづつをブユーブに加えた。

室温で２時間インキュベーションを行なった後、反応液
をアスピレータ−で吸引除去し、すべてのチューブに生
理食塩水溶液１〜２戒を入れ、ビーズを洗浄）麦、洗液
を除去した。この操作を２回繰返した後、ビーズを別の
チューブに移しかえ、放射能を測定した。

かくして得られた標準曲線を第６図に示す。第６図中、
横ｌＩｇｌＩはスタンダードの濃度（免疫反応に関与す
るＧｌｃ−ＬＶｓ残基換算爵／チューブ）を、縦軸はビ
ーズの放射能（ｃｐｍ）　（ブランク値を引いた値）を
示し、曲線（１）はＣＢＢ−Ｇ２５０担体を、曲線（２
）はチバクロン担体を、曲線（３）は抗ヒト血清アルブ
ミン抗体の担体をそれぞれ用いた結果を示す。

■　上記■に′ａ３いて、スタンダードの代りに被検者
の血清２０μＱを用いて同様に試験した。

ＣＢＢ−０２５０の蛋白吸着用担体を用いた結果を下記
第１表に示す。

尚、還元型グルコシル化すジン残基借は、第６図より、
ビーズ１個当り（吸着蛋白量は、ＨＳΔで平均２μｇ／
ビーズ）の免疫反応性ＧＩＣ−ＬＶＳ残、ｌ１％ｉのモ
ル数（ｐ　ｍｏｌｅｓピ］ｔル）で示１．。

第１表

【図面の簡単な説明】

第１図は参考例１の■で冑た還元型グル」シル化リジン
誘導体のｒ’）　Ｍ　Ｒ分析図である。 第２図は本発明実施例１に従う測定法におεノる抗体の
特異性を求めたグラフでおる。 第３図は同実施例１に記載の本発明測定方法における標
準曲線を示す。 第４図は実ｍ例２に記載の本発明測定方法における標準
曲線を示す。 ｍ５図は同実施例２に従う測定法におい゛（標１！・曲
線から換停される各検体の免疫反応性を示す図である。 第６図は実施例３に記載の本発明測定方法にＪ３ける標
べ【−曲線を示す。 く以　上） 第４図 第５図 正常人　　　縣Ｌ１ｈ ｎ＝５Ｏｎ＝２３

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）還元処理した体液中の還元型グルコシル化蛋白を
   、還元型グルコシル化リジン残基を認識する抗体を用い
   て、免疫検定法により測定することを特徴とするグルコ
   シル化蛋白の測定法。
2. （２）還元処理した体液が、予め蛋白吸着用担体を用い
   て吸着処理後、還元処理された体液である特許請求の範
   囲第１項に記載の方法。