JPH0389165A - 酵素免疫測定用試薬及びその調製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 Ａ、産業上の利用分野 本発明は抗原抗体反応の定量的測定性に用いる酵素免疫
測定用試薬及びその調製方法に関する。

Ｂ６発明の概要 本発明は抗原抗体反応の定量的測定法に用いる酵素免疫
測定用試薬において、 前記酵素標識体がβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ（以下、Ｂ
−Ｄ−ｇａ（！と略ず）１分子に抗原又は抗体が３分子
結合している酵素免疫測定用試薬を用いることにより酵
素免疫ｆｆ１ｌ＋定法の感度及び再現性を向上させるこ
とを可能とする。

また、本発明は酵素免疫測定用試薬の調製方法において
、 前記酵素がＢ−Ｄ−ｇａｆ２であり、該Ｂ−Ｄｇａ（７
１モルに対して、３ｎ倍（但し、ｎは１以上の整数であ
る。）の割合で抗原又は抗体を混合して調製することに
より前記酵素免疫測定用試薬を高収率で得ることを可能
とする。

Ｃ１従来の技術 臨床検査部門における高感度な微量分析法の開発は現在
盛んに行われており、酵素免疫測定法（以下ｒＥＩＡ法
」と略す）、化学発光分析法を組み合わせた測定方法も
多数報告されている。

この方法は抗原又は抗体に酵素を標識した酵素標識体を
被測定物質である抗原又は抗体と特異的に反応させ・た
後、標識酵素に基質を反応させ、このとき生成する物質
を化学発光法により検出し、間接的に被測定物質を測定
する方法である。

ところで、ＥＩＡ法の代表例であるサンドイツチ法につ
いて述べると、まず抗原、例えばα−フェトプロティン
（以下、ｒＡＦＰＪという）をウサギに定期的に皮下注
射により投入し、このウサギの血清から前記抗原にもと
づいて生じた免疫グロブリンを得、これを例えばポリス
チレンボールよりなる固相に吸着させて固相抗体を調製
する。

一方、前記免疫グロブリンに標識体、例えば酸化酵素で
あるグルコースオキシダーゼ（以下「ＣＯＤ」という。

）を結合させて酵素標識抗体を調製する。ここで、被測
定物質である人体内の前記抗原となるＡＦＰの量を調べ
るためには、先ず測定対象となる抗原を固相抗体に接触
させると、抗原は固相抗体に特異的に吸着される。次い
で、これに酵素標識抗体を作用させると、酵素標識抗体
は抗原に特異的に吸着される。即ち抗原は固相抗体と酵
素標識抗体に挟まれた状態になる。次いで、酵素標識抗
体のＣＯＤの量を測定する。この測定は、ＣＯＤにグル
コースを作用させて過酸化水素を発生させ、この過酸化
水素にルミノールを作用させて発光量を調べるいわゆる
化学発光法により行われ、被測定物質である抗原即ち、
ＡＦＰの固相抗体への吸着量はＣＯＤの測定量から間接
的に求まる。そのためＥＩＡ法の感度上昇を望むには、
優れた酵素標識抗体の調製が必要とされる。

一方、ＥＩＡ法に用いる酵素標識抗体を得る方法として
次のものがある。

（１）まず、第一に、酵素を架橋剤として反応させるこ
とによりアルデヒド基を導入し、このアルデヒド基と抗
体のもつアミノ基とを反応させて酵素を抗体に標識させ
る二段階グルタルアルデヒド広及び過ヨーソ酸法である
。

（２）第二に、酵素とマレイミド基を有する架橋剤とを
反応させることにより酵素にマレイミド基を導入し、こ
のマレイミド基と抗体のもつチオール基とを反応させて
、酵素を抗体に標識させるマレイミド法である。

（３）第三に、酵素とピリジルチオール基とを反応させ
ることにより酵素にピリジルチオール基を導入し、この
ピリジルチオール基と抗体のもつチオール基とを反応さ
せて、酵素を抗体に標識させるピリジルジスルフィド法
である。

現在、上記の方法の中でマレイミド法が最も広く使用さ
れている。これはマレイミド法が他の方法に比し高収率
で酵素標識抗体を得ることができ、しかも自己重合など
により高重合体が形成されないことから抗体活性の低下
を防止でき、さらに抗原抗体反応における非特異的吸着
も少ないためである。

しかしながら、上記マレイミド法により調製され、精製
して得られた酵素標識抗体は各ロット毎に性能に差が見
られ、そのためこの酵素標識抗体をＥＩＡ法に用いた場
合、その結果に再現性を得ることが困難であった。

従って、このことからＥＩＡ法による被測定物質の検出
限界も比較的高い濃度にとどまらざるを得ムいという問
題があった。

０１発明か解決しようとする課題 本発明は酵素標識抗体の性能が酵素標識抗体中の抗体数
のバラツキから生ずることに着目して創案されたもので
あって、酵素標識抗体がＢ−Ｄｇａｆ７１分子に抗原又
は抗体が３分子結合していることを特徴とする酵素免疫
測定用試薬、及び前記酵素がＢ−Ｄ−ｇａ（であり、該
Ｂ−Ｄ−ｇａ（１モルに対して、前記酵素標識に結合し
得る抗原数又は抗体数の３倍の割合で、抗原又は抗体と
混合することを特徴とする前記酵素免疫測定用試薬の調
製方法を提供するものである。

８１課題を解決する〕こめの手段及び作用即ち、本発明
は抗原抗体反応の定量的測定法に用いる酵素免疫測定用
試薬において、前記酵素標識体がＢ−Ｄ−ｇａ１２１分
子に抗原又は抗体が３分子結合していること及び酵素免
疫測定用試薬の調製方法において、前記酵素がＢ−Ｄ−
ｇａ（であり、該Ｂ−Ｄ−ｇａｆｌ！１モルに対して前
記酵素標識体に結合し得る抗原数又は抗体数の３倍の割
合で抗原又は抗体を混合することを、その解決手段とし
ている。

以下本発明をさらに詳細に説明する。

まず、本発明では標識抗体としてＢ−Ｄ−ｇａＱを用い
る。この酵素は大腸菌由来の酵素で分子量５０万であり
、抗体標識として用いた場合に安定性にすぐれるため、
従来から酔素抗体法に用いられている。また、この酵素
を標識する肢体は免疫反応の特質から抗原、抗体のいず
れでも使用することができるが通常抗体を用いる。従っ
て、本発明の酵素免疫測定用試薬においても酵素標識の
肢体として抗体を用いる場合のみ説明する。

そして、この抗体としては通常使用されるもの、例えば
、被測定物質である抗原を動物１例えばウサギ、ヤギ、
モルモットなどに免疫して得られる抗体、さらにこれら
の抗体にタンパク質分解酵素を作用させて得られる抗原
結合活性のあるフラグメント（Ｆａｂ）などを使用する
ことができる。

次に、Ｂ−Ｄ−ｇａＱを抗体に標識する際の架橋剤とし
ては、従来のマレイミド法で使用されているマレイミド
基をもつもの、例えばＮ−（ｒマレイミドブチリルオキ
ン）サクンンイミド（以下、ＣＭＢＳと略す。）、 ｔｌ−（ε−マレイミドカブロルオキシ）サクシンイミ
ド（以下、８ＭＣ９と略す。）、４−（マレイミドメチ
ル）シクロヘキサン−ｌカルボン酸すクシンイミドエス
テル（以下、ＣＨＭと略す。）などが挙げられる。

更に、酵素標識抗体は次のように調製、精製により得る
ことができる。

即ち、Ｂ−Ｄ−ｇａ＆１分子に導入される抗体数の３倍
の割合で酵素と抗体とを混合して調製する。例えば、抗
体数１．２．３の酵素標識抗体を得るには酵素と抗体と
をそれぞれｌ：３，１：６゜ｌ：９の割合（モル比）で
混合調製する。そして、この割合で調製することにより
、主として抗体数１．２．３の酵素標識抗体が高い収率
で、しかも再現性よく得られる。

なお、標識となる酵素に結合する抗体数が多いほど酵素
免疫測定法における検出感度及び再現性の向上を図るこ
とがてきることから、本発明の酵素免疫測定用試薬はＢ
−Ｄ−ｇａＱ１モルに対して９モルの抗体を混合して凋
製し、Ｂ−Ｄ−ｇａＱ１分子に対し、抗体が３分子結合
した酵素標識抗体を用いるのが望ましい。

このようにして抗体数３を有する調製された酵素標識抗
体は通常用いられている精製法、例えば高速ゲルクロマ
トグラフィー用カラム、好ましくは排除限界６０万以上
、理論段数１５，０００　以上の高速ゲルクロマトグラ
フィー用カラムを使用することにより未反応の抗体（分
子量４，５万）、さらに未反応の酵素や副反応として生
じる抗体数の異なる酵素標識抗体から分離される。なお
、高速ゲルクロマトグラフィー用カラムとしてＴＳＫＧ
−３０００ｓｗ（東ソー製）、スペロース（Ｓｕｐｅｒ
ｏｓｅ）６．ＨＲ１０／３０　（ファルマシア社製）、
Ｇ５−６２０　（旭化成社製）、プロティン（ＰＲＯＴ
ＥＩＮ）ｗｓ−８０３（昭和電工社製）を挙げることが
できる。

上記した調製法により、Ｂ−Ｄ−ｇａｆｆを標識酵素と
しこのＢ−Ｄ−ｇａ（１分子に抗体が３分子結合した酵
素標識抗体を得ることができ、得られる酵素標識抗体は
溶液又は粉末状いずれでも使用しうるが、ｐＨ２〜８の
緩衝液例えば、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩
衝液、コハク緩衝液などに適当な濃度に調製して使用す
るのか好ましい。

このようにして得られる本発明の酵素免疫測定用試薬は
、ユツト法などの均−法又はサンドイツチ法、二抗体法
などの不均一法のいずれの酵素免疫測定法にも使用する
ことができ、また酵素反応により生じた被検出物は化学
発光法、生物発光法、比色法、蛍光法など通常の方法に
より容易に検出することができる。

なお、本発明の酵素免疫測定用試薬により検出できる被
測定物質である抗原としてはＡＦＰ、カルヂノエンプリ
オニック抗原などのいわゆるガンマ−カーが挙げられる
。

Ｆ、実施例 以下、本発明に係る酵素免疫測定用試薬及びその調製方
法の詳細な説明を実施例に基づいて説明する。

実施例１ （１）マレイミド化Ｂ−Ｄ−ｇａＱの調製及びその精製 ５０ＲｙのＢ−Ｄ−ｇａ（を含む０，１Ｍリン酸緩衝液
（ｐ）［７，０）Ｉｘ＆に６．７５１１ｇのＧＭＢＳを
含むジメヂルホルムアミド溶液６０μＱを加え、３０°
Ｃで１時間撹拌した。次にその混合物をセファデックス
Ｇ−２５（ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５）を充てんしたＰ
ｏ−１０カラム（ファルマシア社製）で脱塩、濃縮した
。

（２）マレイミド化Ｂ−Ｄ−ｇａ（の調製及びその精製 ＧＭＢＳに代えてＥＭＣ８を用いる以外は実施例１　（
＋）と同様の方法でマレイミド化１３−Ｄｇａの調製及
びその精製を行った。

（３）マレイミド化Ｂ−Ｄ−ｇａｊの調製及びその精製 ＧＭＢＳに代えてＣＨＭを用いる以外は実施例１（１）
と同様の方法でマレイミド化Ｂ−Ｄ−ｇａＱの調製及び
その精製を行った。

実施例２ （１）ウサギ抗ＡＦＰＦａｂ’　の調製８１１９のウサ
ギ抗ＡＦＰＦ（ａｂ’）ｔを含む０．１Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ６，０）ｌｚｌＪにβ−メルカプトエチルアミン
１　、１　ｍｇ及び５ｍＭＥＤＴＡを含ム０　、　Ｉ　
Ｍ　’Ｊ　：／酸緩衝液（ｐＨ６，０）５０１１＆を加
え、３７°Ｃで１．５時間撹拌した。次に、その混合物
をセファデックスＧ−２５（ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５
）を充てんしたＰｏ−１０カラム（ファルマシア製）で
脱塩、ａ縮した。

（２）　Ｂ−Ｄ−ｇａ１２標識ウサギ抗ＡＦＰＦａｂ′
の調製 実施例１（１）、（２）及び（３）で得られた３ｍｇの
マレイミド化Ｂ−Ｄ−ｇａｉ７を含む０．１Ｍリン酸緩
衝液ＣｐＨｅｒ、０）０．２ｘ（ｌに実施例２で得られ
たウサギ抗ＡＰＰＦａｂ’を含むＯ，１Ｍリン酸緩衝１
（ｐ　Ｈ６、Ｏ）　０．５ｘＩ２とＯ、ｌ　Ｍ　’）　
：／酸緩衝液（ｐＨ６，０）３ａｔ（とを加え、３０℃
で１時間撹拌した。その混合物を４０℃で一昼夜静置し
た後、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、沈澱を除
去し、表−１に示す条件で高速肢体クロマトグラフィー
により精製した。

（以下余白） 表 高速液体クロマトグラフィーによる精製Ａは、 Ｂは、 　００ Ｃは、 −３４ ＴＳＫＧ３０００ＳＷ（東ソー製）、 セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙ　１）Ｓ（ファルマシ
ア社製）、 アルトラゲル（Ｕｌｔｒａｇｅｌ）Ａｃ（ＬＫＢ社製）
をそれぞれ示す。

次に、 上記精製条件による再現性を表 ２に示 す。

表 この再現性（％）は精製剤の試料をカラムに添加してか
ら酵素標識抗体が溶出されるまでの液量を各場合につい
て求め、３回の標準偏差を平均値で除して、１００を乗
じて算出した値である。

更に、上記精製条件で精製後、各フラクション（試験管
）の吸光度を測定した。その結果を第１図に試料添加後
の時間と吸光度の関係で示した。

この図ではＡとＢ、Ｃとではカラムサイズ、流速が５ｚ
なるのてグラフの横軸が異なっている。また、Ａでは５
〜１５分に酵素標識抗体が抗体数ごとに溶出されている
。更に１７分に未反応［３−Ｄ−ｇａＱが、３５分には
未反応Ｆａｂ’が溶出されている。一方、Ｂ、Ｃでは２
５０〜４００分に酵素標識抗体と未反応のＢ−Ｄ−ｇａ
Ｑが、５００分付近に未反応のＦａｂ′が溶出されてい
る。従って、これらのことからＡはＢ及びＣに比し分離
能が大きく、また精製に要する時間ら短いことがわかる
。なお、架橋剤の種類の違いにかかわらず、吸光度はほ
ぼ同一であったので、架橋剤としてＧＭＢＳを使用した
ものについての測定結果を第１図に示した。　次いで、
第１図の溶出時間と吸光度のグラフ中、最も吸光度の大
きいフラクション（↓のとこる）の純度をＴＳＫＧ３０
００ＳＷｘＬカラム（分析用カラムで純度検定等に使用
されるゲル濾適用のカラム、東ソー製０．７８ｘ　３０
ｃｍ。

理論段数３０４４０）により０．２Ｍリン酸緩衝／＆（
ｐＨ６，９）、流速１ｊＩ１２／分の溶出条件で検定し
た。

その結果を第２図に示す。

第２図に示される溶出時間６．２分に見られるピークは
Ｂ−Ｄ−ｇａ１分子に３分子の抗体が結合した酵素標識
抗体である。ＴＳＫＧ３０００ＳＷで精製した第２図（
ａ）で認められるピークはこの６．１分のピークのみで
他には認められないことからこのフラクションにはかな
り純度の高い抗体数３の酵素標識抗体が溶出されたこと
がわかる。これに対し、セファクリルＳ−３００で精製
した第２図（ｂ）及びアルトラゲルＡｃＡ−３４で精製
した第２図（ｃ）では溶出時間６．１分の他にもピーク
が認められろ。即ち、６．３分、６゜７分のピークはそ
れぞれ抗体数が３．２の酵素標識抗体で、７．５分のピ
ークは未反応のＢ−Ｄ−ｇａであると考えられる。従っ
てこれらの使用カラムはいずれも抗体数の異なる酵素標
識抗体を抗体数ごとに分取することはできず、未反応の
Ｂ−Ｄ−ｇａｆ２も分離できなかった。なお未反応の抗
体は１０．５分にピークがあるが、第２図（ａ）、（ｂ
）。

（ｃ）のいずれもの場合しこのピークは見られず未反応
の抗体は分離できたと思われる。

第２図からＴＳＫＧ３０００ＳＷて精製した抗体数３の
酵素標識抗体が最も純度が高いことがわかる。従って、
このことは理論段数の大きいカラムを使用することで分
離能を上げることが可能であることを示している。

なお、純度検定の場合ら架橋剤の相違にかかわらず、吸
光度の波形はほぼ同一であったので、架橋剤としてＣＭ
ＢＳを使用したものについての測定結果を第２図に示し
た。

（３）ＡＲＰ−ＥＩＡの検量域 実施例２（２）で得られた第１図で示される溶出時間と
吸光度のグラフ中量も吸光度の大きいフラクション（↓
のとこる）の酵素標識抗体を用い、濃度０，０．０＋、
０．０５，０．１，０．５．ｌ。

５．１０．２５ｎｇ／ｚ（のＡＦＰ１００μＣをプレー
トプラスチック製のウェルに入れ、０．１％ＢＳＡ、５
ｍＭ　ＥＤＴＡを含む０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８，
５）（以下、ホウ酸−ＢＳＡと略す）２００μＱとヤギ
抗体ＡＦＰ　Ｉ　ｇＧ被覆ビーズ１ｇｌを加え、室温に
て６時間静置した。次ぎに、固相を蒸留水にて３回洗浄
し、至適濃度に希釈した酵素標識抗体３００μＱを加え
、室温にて一晩静置した。更に、固相を蒸留水にて３回
浣浄後、試験管に移し、０．３ｍＭ４−メヂルウンベリ
フエリルβ−Ｄ−ガラクトシドを含む０．１Ｍ　グリシ
ンＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９，５）３００μ（ｌを加え、
３０℃で１００分反応させた。

次に、０．１Ｍグリシン−Ｎ　ａ　ＯＨ緩衝液（ｐＨ１
０，３）３ｍ（を加え、励起波長３６０ｎｍ、蛍光波長
４５０ｎｍの蛍光を測定し、検量線を作成した。

この検量線に基づいて検量下限から検出限界を、直線領
域の上限から検量上限をそれぞれ求め、検量域を定めた
。その結果を表−３に示す。表−３に示すように検量域
が最も広いのはＴＳＫＧ３０ｏｏｓｗで精製した酵素標
識抗体であり、これが検出限界も最も低かった。

また、検量線の傾きも、ＴＳＫＧ３０００ＳＷの方か他
の２種のカラムを用いた場合よりも大きかった。

従って、このことからＴＳＫＧ３０００ＳＷ＋、：て精
製を行うことにより未反応Ｂ−Ｄ−ｇａ＆を取り除くこ
とができ、良い検量線を得ることができた。

表−３酵素標識抗体の検量域 （４）検出限界 実施例２（３）と同様の酵素標識抗体及び方法によりＦ
検定を行い検出限界を求めた。ＡＦＰｆｉ度は０．００
１，０．０２５，０．０５，０．１ｍｇ／ｘ（ｌとしｎ
＝７で行った。酵素標識抗体はＴＳＫＧ３０００ＳＷで
精製したものを２００倍、セファクリルＳ−３００及び
アルトラゲルＡｃＡ−３４で精製したものを５００倍に
それぞれ希釈して使用した。なお、この測定は計３回行
ったか、いずれも再現性は良かった。その結果を表−４
に示す。表−４に示すように精製手段により検出限界に
差が見られ、最も低いのはＴＳＫＧ３０００ＳＷで精製
したもので０．０５　ｎ　ｇ／ｙ（ｌであった。

これに対しセファクリルＳ−３００及びアルトラゲルＡ
ｃＡ−３４で精製したものはいずれも０．２５ｎｇ／ｉ
（であった。

以上の結果から、未反応のＢ−Ｄ−ｇａ（ｌや種々の抗
体数の酵素標識抗体が混合しているセファクリルＳ−３
００及びアルトラゲルＡｃＡ−３４で精製したものより
も、同じ抗体数の酵素標識抗体のみのＴＳＫＧ３０００
ＳＷで精製したものの方が検出限界が低かった。再現性
も良好で純度の高い至適抗体数の酵素標識抗体の使用に
より検出限界を改善することが可能である。

表−４酵素標識抗体の検出限界 （５）非特異的吸着率 ウサギ抗ＡＦＰＩｇＧ彼美ポリスチレンボールに酵素標
識抗体を非特異的に吸着させ、固相に吸着した酵素標識
抗体と添加した酵素標識抗体のＢＤ−ｇａ（活性を測定
した。なお固相吸着量を添加量で除して、＋００を乗じ
た値を非特異的吸着率とした。この測定は３回行ったが
いずれら再現性は良かった。その結果を表−５に示す。

表５に示すようにＴＳＫＧ３０００ＳＷで精製した純度
の高い酵素標識抗体では、非特異的吸着率は約Ｏ０１％
であったが未反応Ｂ−Ｄ−ｇａｇや種々の抗体数の酵素
標識抗体が混合しているセファクリルＳ−３００及びア
ルトラゲルＡｃＡ−３４により精製したものは、ＴＳＫ
Ｇ３０００ＳＷにより精製したものに比し非特異的吸着
が大きく、また調製ロットによる差も見られた。

なお、ここでは結果を示さなかったがＴＳＫＧａ　ｏ　
ｏ　ｏ　ｓｗによる精製の際に抗体数３の酵素標識抗体
と共に得られた抗体数１および２の酵素標識抗体の非特
異的吸着率は抗体数３のそれとほぼ同じであった。

以上の結果より、ＴＳＫＧ３０００ＳＷで精製した酵素
標識抗体の使用により非特異的吸着率が低減されたこと
がわかる。

なお、未反応Ｂ−Ｄ−ｇａＱ等を分離し、純度を高くす
ることで非特異的吸着率を下げることも可能である。

表 酵素標識抗体の非特異的吸着率 標識酵素としてＢ−Ｄ−ｇａＱ、抗体としてウサギ抗Ａ
ＦＰＰ（ａｂ′）−を用い、表−６に示す割合で混合し
て酵素標識抗体を調製した。なお調製した試料＋１ＴＳ
ＫＧ３０００ＳＷｘＬ力ラムチ分析した。その結果を第
３図に示す。

第３図において、５，９分、６．３分、６．８分のピー
クはそれぞれ抗体数３．２．１の酵素標識抗体を、８．
１分、１０．３分のピークはそれぞれ未反応Ｂ−Ｄ−ｇ
ａ（！、未反応Ｆａｂ’を示す。

抗体数３の酵素標識抗体は混合モル比ｌ：６．１：９　
１：１２で得られ、その中で最も効率よく得られたのは
混合モル比ｌ：９の場合であった。

また、抗体数２の酵素標識抗体は混合モル比ｌ：１、ｌ
：３．ｌ：６で得られ、特に効率よく得られたのは混合
モル比ｌ：６の場合であった。更に抗体数１の酵素標識
抗体は混合モル比１：１，１：３，１：６で得られ、そ
の中で最も効率よく得られたのはｌ：３の場合であった
。

以上のことから、１分子あたり　２．９〜３．２分子の
マレイミド基をもつＢ−Ｄ−ｇａ（！を用いた場合、抗
体数と最適混合モル比は表−７のようになる。

表 ｇａ＆とＦａｂ′の混合モル比 表−７ 最適混合モル比 なお、 架橋剤の相違にかかわらず、 分析結果は ほぼ同一であったので第３図には架橋剤としてＧＭＢＳ
を使用したものについての結果を示した。

実施例３Ｂ−Ｄ−ｇａＱの活性測定 実施例２（６）で得られた抗体数３．２．ｌの酵素標識
抗体及びそれらの酵素標識抗体と未反応のＢ−Ｄ−ｇａ
１２との混合物のＢ−Ｄ−ｇａ（ｌ活性を次の方法によ
り測定した。

まず、各酵素標識抗体を０．ＩＭ　Ｎａｃｌ、１ｍＭ　
Ｍｇ　ｃ　ｌ　！、　　１９／Ｑウソ血清アルブミンを
含む０．０１Ｍ　リン酸緩衝液（ｐＨ７，０）（以下、
酵素希釈液と略す）でｌＯ万倍に希釈し、１００μＱを
試験管に加えた。

次に、Ｂ−Ｄ−ｇａ（！　１００μｇを含む酵素希釈液
１００μＱを別の試験管に加えた。

更に、０．３ｍＭ４−メチルランへりフェリルーβ−Ｄ
−ガラクシドを含む酵素希釈液３００μＱをそれぞれの
試験管に加え、３０℃で１００分間インキュベートした
。つぎに０．５Ｍ　グリンンＮａＯＨ’Ｊ衝液（ｐＨＩ
　０．３）２．５＋＋ｆ２をそれぞれの試験管に加え、
励起波長３６０ｎｍ、蛍光波長４５０ｎｍで蛍光を測定
した。このようにしてＢ−Ｄ−ｇａｆ２活性をそれぞれ
測定し、標識していない未処理のＢ−Ｄ−ｇａ＆活性を
１として、各々の酵素標識抗体の比活性を求めた。その
結果を表−８に示す。表−８に示すように抗体数の違い
によるＢ−Ｄ−ｇａｃ活性の差は見られず、またセファ
クリルＳ−３００により精製した各種抗体数を含む場合
のものとの差も見られなかった。

従って、この結果から抗体数増大に伴う酵素活性の低下
は見られず、抗体数が違っても酵素活性に差がないこと
がわかった。

表 ８ −Ｄ ｇａＱ活性 実施例３と同一の試料を用いて二抗体法による力価検定
を次の方法により行った。

まず、１％正常ウサギ血清、０．０５Ｍエチレンジアミ
ン四酢酸四ナトリウム０．１５Ｍ　ナトリウムを含む０
．０ＩＭリン酸緩衝肢（ｐＨ７，５）で酵素標識抗体を
１０〜１０００倍に希釈した。

次に、上記抗体昂釈肢０　、　Ｉ　ｍ（１，１２Ｊ標識
ＡＦＰＯ，Ｉｘ（！（１，５ＸＩＯ’ｃｐｍに相当）と
、１％ＢＳＡ、０．１５Ｍナトリウムを含む０．１Ｍリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７，５）０．２ｘ（ｌを試験管に加え
、４℃で一晩放置した。

更に、ヤギ抗つサギγ−グロブリン血清を０．０５Ｍエ
チレンジアミン四酢酸四ナトリウム０．１５Ｍナトリウ
ムを含む０．０１Ｍリン酸綬衝１（ｐＨ７，５）で２倍
に希釈し、ソノ０　、１　ｔｔｔＱを前記試験管に加え
、４℃で一晩放置した。次に３０００ｒｐｍで１５分間
遠心分離し、沈澱物の放射能を測定した。この際、最大
カウントをＢＯ１各濃度のカウントをＢとし、Ｂ　／　
Ｂ　ｏと酵素標識抗体の濃度との関係をグラフに描き、
Ｂ／Ｂｏ＝０．５　となる酵素標識抗体濃度を求めた。

この濃度が抗体力価である。その結果を表−９に示す。

表−９に示すように抗体数の相違から抗体力価に差が見
られ、抗体数２．３の酵素標識抗体の力価は抗体［１の
それの力価のそれぞれ約２倍、約３倍であった。なおセ
ファクリルＳ−３００で精製した混合物の力価は抗体数
ｌの力価とほぼ同一であった。これらのことから、抗体
数により抗体力価に差が見られ、抗体数が多いほど力価
も太きかった。

表−９二抗体法による抗体力価の評価 実施例５　特異的結合の評価 実施例３と同一の試料を用いて抗原抗体反応による特異
的結合の評価を次のように行った。

まず０，１，１０．２５ｎｇ／ｘｌＪのＡＦＰ　１００
μＱをプラスチック製のプレートのウェルに入れ、０１
％Ｂ　Ｓ　Ａ　、　５　ｍ　Ｍ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａを含む
０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８，５）（以下、ホウ酸−
ＢＳＡと略す）３００μｇとヤギ抗ＡＦＰ　Ｉ　ｇＧ被
覆ビーズ１個とを加え、室温で６時間インキュベーショ
ンした。

次に得られた固相を蒸留水で３回洗浄した。更にこれに
至適濃度に希釈したＢ−１）　−ｇ　ａ　Ｑ標識ウサギ
抗ＡＦＰＦ（ａｂ′）２３００μｍ２を加え、室温にて
一晩インキユベートした。次に固相を蒸留水で３回洗浄
し、試験管に移した。この試験管に０．３ｍＭ４−メチ
ルランへりフェリルーβ−Ｄガラクトシドを含む酵素希
釈液３００μＱを加え、３０℃で１００分インキュベー
ションした。

次に、０．５Ｍグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０，
３）２．５１１（７を加え、励起波長３６０ｎｍ。

蛍光波長４５０ｎｍで蛍光を測定した。その結果を表−
１Ｏに示す。表−１０に示すように各ＡＦＰ濃度におけ
るＳ／Ｎは抗体数により異なり抗体数が多いほど大きか
った。また、セファクリル５３００で精製した各種抗体
数を含む混合物は比較例５で示す抗体数１のものと同様
な値を示した。

なお、日向再現性は抗体数による差は見られず、いずれ
も１０％以下であった。

これらのことから特異的結合は抗体数によって異なり、
抗体数が多いほど大きいことがわかる。

また、 至適抗体数の酵素標識抗体の使用により特異的結合を増
太さ仕ることが可能である。

表−１０ 特異的結合 ※ Ｓ／ＮはＯｎｇ／ｘＱの化学発光量をノイズ（Ｎ）、 ｌ　。

１０゜ ２５　ｎｇ／　ｘ（ｌの化学発光量をシグナル（Ｓ）と
し、各々のシグナル（Ｓ）をノイズ（Ｎ）で除して求め
た。また日内再現性は各測定点（ｎ＝５）の標準偏差を
平均値で除して１００を乗じた値とした。

実施例６　非特異的吸着率の評価 実施例３と同一の試料を用いて次の方法により非特異的
吸着率を評価した。

まず、０．０１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５，１）でｌＯ万倍
あるいは１万倍に希釈した酵素標識抗体１００μＱを試
験管に入れた。次に実施例３と同様な方法でＢ−Ｄ−ｇ
ａ（！活性を求めた。更に、固相に吸着した抗体標識抗
体のＢ−Ｄ−ｇａｆ２活性を添加した酵素標識抗体のＢ
−Ｄ−ｇａ＆活性で除して、非特異的吸着率を求めた。

その結果を表１１に示す。表−２に示すように抗体数か
増加すると非特異的吸着がわずかながら上昇した。また
セファクリルＳ−３００で精製した各種抗体数を含むも
のは、ＴＳＫＧ３０００ＳＷで精製した抗体数２及びｌ
のものと同程度の非特異性を示した。このことから、抗
体数により非特異的吸着にわずかな差は見られるがいず
れらＥＩＡに大きく影響を与えるほど大きな値ではなく
、問題にはならないことがわかる。

表−１！　　非特異的吸着 実施例７　化学発光法による検出限界 実施例３と同一の試料を用いて実施例５と同様の方法に
より化学発光法による検出限界を評価した。

０．０．１，０．２５，０．２ｎｇ／ｚ（のＡＦＰ（実
施例７）及び０，０．１，０．２，０．０２５ｎｇ／ｍ
（ｌのＡＦＰ　（比較例）を用いた。また、酵素標識抗
体は実施例７．比較例２の０．０２５゜ｏ　、　ｌ　、
　ｎｇ／ｍｃは２００倍希釈し、比較例５の０゜２　　
ｎｇ／ｍＱ、は３０００倍に希釈して使用した。その結
果を表−１２に示す。表−１２に示すように抗体数によ
り検出限界に差が見られ、抗体数３が最も低く、次いで
抗体数２．１の順であった。また抗体数３の酵素標識抗
体を使用した実施例７の検出限界は０．０２５　ｇ／ｍ
Ｑ、で、セファクリル５３００で精製した混合物（比較
例）の検出限界０．２ｎｇ／ｍ（２よりも低濃度であっ
た。

これらのことから、抗体数が多いほど検出限界は低いこ
とがわかる。即ち、抗体数３の酵素標識抗体の使用によ
り検出限界は従来の０　、２　ｎｇ／　ｍ（１（比較例
）から０．０２５　ｇ／ｙｔ（ｌとなり、ＥＩＡの感度
が著しく上昇した。また、至適な抗体数の酵素標識抗体
の使用により検出限界を改善することができる。なお、
架橋剤の種類の違いにかかわらず、同一の結果を得たの
で、架橋剤としてＣＭＢＳを使用したものについての測
定結果を表−１２に示した。

以下余白 表 ２ 検出限界 Ｇ１発明の効果 本発明の酵素免疫測定用試薬は、酵素に至適抗体数があ
り、至適抗体数の酵素標識体を酵素免疫測定用試薬とし
て使用することにより、酵素免疫測定法の感度及び再現
性を向上さ仕ることができ、これにより臨床検査部門に
おけるガンマ−カーなどを高感度に微量分析できガンの
早期発見、早期治療に役立つ。

また、本発明は上記酵素標識体を調製する際、酵素１モ
ルに対して、抗原又は抗体を酵素標識抗体中の抗体数の
３倍となる割合で混合することにより、酵素標識中の抗
原又は抗体数を制御することができ、これにより所望の
抗原又は抗体数をもつ酵素標識抗体を収率よく調製する
ことができる。

更に本発明の調製方法で得られる酵素標識体は、Ｂ−Ｄ
−ｇａＬ　Ｐａｂ’　の分子量がそれぞれ５０万、４．
５万であることから、抗体数３．２゜■の酵素標識体抗
体の分子量はそれぞれ６５万。

６０万、５５万となり、分子量マーカーとしてゲル濾過
、電気泳動等に使用することらできる。

【図面の簡単な説明】

第１図は精製された酵素標識抗体の吸光度を示すグラフ
、第２図は精製された酵素標識抗体の純度を示すグラフ
、第３図は抗体数の異なる酵素標識抗体を示すグラフで
ある。 外２名 〈口〉 時間（分）□ （ハ〉 時間（分）□

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）抗原又は抗体に酵素を標識した酵素標識体を利用
   した抗原抗体反応の定量的測定法に用いられる酵素免疫
   測定用試薬において、 前記酵素標識体がβ−Ｄ−ガラクトシターゼ１分子に抗
   原又は抗体が３分子結合していることを特徴とする前記
   酵素免疫測定用試薬。
2. （２）酵素にマレイミド基を導入し、該マレイミド基と
   抗原又は抗体のもつチオール基とを反応させて、抗原又
   は抗体に酵素を標識した酵素標識体を利用した抗原抗体
   反応の定量的測定法に用いる酵素免疫測定用試薬の調製
   方法において、 前記酵素がβ−Ｄ−ガラクトシダーゼであり、該β−Ｄ
   −ガラクトシダーゼ１モルに対して、３ｎ倍（但し、ｎ
   は１以上の整数である）の割合で、抗原又は抗体を混合
   することを特徴とする前記酵素免疫測定用試薬の調製方
   法。