RU2237249C2 - Иммуноферментный способ определения растворимой формы hla-dr антигенов в сыворотке крови человека - Google Patents
Иммуноферментный способ определения растворимой формы hla-dr антигенов в сыворотке крови человека Download PDFInfo
- Publication number
- RU2237249C2 RU2237249C2 RU2002115475/15A RU2002115475A RU2237249C2 RU 2237249 C2 RU2237249 C2 RU 2237249C2 RU 2002115475/15 A RU2002115475/15 A RU 2002115475/15A RU 2002115475 A RU2002115475 A RU 2002115475A RU 2237249 C2 RU2237249 C2 RU 2237249C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- antibodies
- hla
- antigens
- soluble form
- blood serum
- Prior art date
Links
Abstract
Изобретение относится к области медицины, в частности к иммунологии. Сущность изобретения состоит в том, что на твердом носителе проводят иммобилизацию специфических антител на твердом носителе, последовательную инкубацию с исследуемой сывороткой и пероксидазным конъюгатом, при этом в качестве первых антител используют поликлональные антитела против поверхностных антигенов мононуклеарных клеток человека, а в качестве вторых антител применяют HLA-DR специфичные моноклональные антитела ИКО-1, конъюгированные с пероксидазой хрена. 2 з.п. ф-лы, 1 табл., 1 ил.
Description
Изобретение относится к области медицины, в частности к иммунологии. Содержание растворимых HLA-DR молекул является важным показателем в трансплантационной иммунологии. Содержание растворимых HLA-DR антигенов в сыворотке крови существенно повышается при ревматоидном артрите (Claus et al.//Cell Immunol, 2000, V.206, №2, Р.85-100; Verbruggen et al.//Tissue Antigens, 2000, V.56, №5, Р.436-440), аутоиммунном гепатите (Hagihara et al.//Autoimmunity, 1999, V.31, №2, Р.85-93). Отмечается прогностическое значение уровня молекул sHLA-DR в сыворотке крови больных гепатитом С при терапии интерфероном альфа (Hosoi et al.//Tokai. J. Exp. Clin. Med., 2000, v.25, №3, p.117-124). Известна корреляция между сывороточным уровнем sHLA-DR и активностью множественного склероза (Ott et al.//Tissue Antigens, 1998, v.51, №3, p.301-304). Таким образом, сывороточный уровень растворимых HLA-DR антигенов может применяться как прогностический показатель течения заболеваний различной природы.
Известны некоторые способы определения растворимых форм HLA-DR антигенов:
1) Метод ингибиции антител на основе микролимфоцитотоксической пробы, заключающийся в следующем: к тестовой моноспецифической антисыворотке добавляют различные исследуемые на HLA-DR образцы жидкости, после инкубации вносят лимфоциты, содержащие HLA, соответствующие антителам антисыворотки. Далее проводят микролимфоцитотоксический тест с применением комплемента (см. Terasaki P.J., Mc Glelland J.D. // Nature, 1964, v.204, p.998-1000; модификация Рагимов А.А. // Иммунология, 1982, №3, с.34-36). Однако этот способ имеет довольно низкую чувствительность, т.к. оценку интенсивности цитотоксической реакции производят по проценту гибели клеток.
2) Метод скоростной нефелометрии, основанный на зависимости скорости взаимодействия HLA-антигенов с моноклональными антителами от концентрации HLA-молекул (см. Коненков В.И., Наумов Ю.Н., Прокофьев В.Ф.//Иммунология, 1987, №6, с.61-63). Но при этом способе требуется дорогостоящее оборудование для регистрации изменения мутности исследуемых растворов (нефелометр).
Наиболее близким к предлагаемому изобретению является иммуноферментный метод определения растворимой формы HLA-DR молекул (см. Hausmann S., Claus R., Buchwald S., Kohler H., Hausmann D., Falk U., Wegener S.//J.Immunoassay, 1996, 17, 257-75). В данном способе иммунологические планшеты сорбируют HLA-DR-специфичными моноклональными антителами BL-Ia/5 при 4°С, затем инкубируют с образцами сыворотки и стандартом при 37°С в течение 90 мин. Следующий этап - последовательная инкубация с HLA-DR-специфичными моноклональными антителами L243 (1 ч), стрептавидином, конъюгированным с пероксидазой (30 мин) и о-фенилендиамином в качестве субстрата (30 мин). Реакцию останавливают серной кислотой, измеряют оптическую плотность при 492 нм и переводят по калибровочной кривой в нг. Этот способ характеризуется высокой чувствительностью и простотой постановки, но из-за применения моноклональных антител иностранного производства довольно дорог. Однако опосредованная связь вторых антител и фермента снижает специфичность реакции.
Целью изобретения является удешевление способа с сохранением высокой чувствительности и специфичности.
Сущность изобретения заключается в том, что для определения растворимых форм молекул HLA-DR в качестве первых антител применяют поликлональные антитела против поверхностных антигенов мононуклеарных клеток человека, а в качестве вторых антител используют HLA-DR-специфичные моноклональные антитела МКА ИКО-1, полученные в Онкологическом центре РАМН, конъюгированные непосредственно с пероксидазой хрена.
Способ определения растворимых HLA-DR молекул с помощью твердофазного иммуноферментного анализа осуществляют следующим образом.
Поликлональные антитела против поверхностных антигенов мононуклеарных клеток человека выделяют с помощью сульфата аммония и ионообменной хроматографии на ДЕАЕ-целлюлозе и сорбируют в разведении 1:1000 по 100 мкл в лунки полистироловых планшетов для иммуноферментного анализа в течение 16-18 ч при 4-8°С. После отмывания не связавшихся антител в лунки вносят образцы исследуемых сывороток. Планшеты инкубируют при комнатной температуре в течение 16-18 ч с последующим отмыванием не связавшихся белков. Затем лунки планшетов обрабатывают рабочим раствором очищенных моноклональных антител МКА ИКО-1, конъюгированных с пероксидазой хрена (Иммунологические методы /Под ред. Г. Фримеля, с.438) в разведении 1:400 и инкубируют в течение 1 часа при 37°С. После отмывки не связавшихся меченых антител в лунки планшетов вносят субстрат: на 10 мл цитратного буфера - 3 мг о-фенилендиамина с последующей инкубацией в течение 15-20 мин при комнатной температуре. Реакцию останавливают внесением 0,5 М H2SО4. Снимают показания с помощью иммуноферментного фотометра. Концентрацию растворимых HLA-DR антигенов оценивают, переводя единицы оптической плотности в условные единицы (U/ml) по калибровочному графику с использованием стандарта, представляющего собой хранящиеся при -60°С образцы сыворотки крови, содержащие растворимые HLA-DR в одних и тех же концентрациях.
Оптимальные концентрации поликлональных антител для сорбции планшетов определяли, измеряя оптическую плотность при различных разведениях от 1:100 до 1:1500. Максимальная разница между опытным и фоновым значениями наблюдалась при тысячекратном разведении поликлональных антител (см. фиг. 1А). Наиболее эффективную концентрацию моноклональных антител, конъюгированных с пероксидазой хрена, также определяли, используя разведения конъюгата от 1:50 до 1:800. Оптимальным явилось разведение в 400 раз (чертеж, В).
Пример практического применения
При исследовании уровня растворимой формы HLA-DR молекул в сыворотке крови 198 здоровых доноров было показано, что ее содержание в норме составляет 115,9±14,61 U/ml. Образцы сыворотки были получены также от 22 пациентов с ревматоидным артритом (18 женщин и 4 мужчины). Средний возраст больных составил 44,2±2,3 года, средняя продолжительность болезни 7,7±1,6 года. У одного больного установлена II рентгенологическая стадия заболевания, у остальных - II-III стадии. Активность заболевания у 6 больных соответствовала I, у остальных - II-III степени. Ревматоидный фактор был обнаружен у 18 больных. В исследованной группе было выявлено статистически достоверное увеличение сывороточного содержания sHLA-DR, средний уровень которого составил 227±19 U/ml (р<0,01). Была отмечена достоверная корреляция между сывороточным уровнем sHLA-DR и параметрами активности заболевания пациентов: скоростью оседания эритроцитов, ревматоидным фактором, С-реактивным белком (см. таблицу). Таким образом, определение сывороточной концентрации sHLA-DR молекул позволяет судить об активности течения ревматоидного артрита.
К достоинствам разработанного метода относится простота в применении, отсутствие сложной аппаратуры, дорогостоящих реактивов, высокая специфичность, возможность определять минимальные концентрации вещества (нанограммы/мл). Конъюгирование вторых антител непосредственно с ферментом позволяет сократить этап работы.
В связи с тем, что молекулы главного комплекса гистосовместимости играют центральную роль в иммунном ответе, определяя выраженность реакции иммунной системы индивида на каждое антигенное воздействие, исследование уровня растворимой формы HLA-DR антигенов в сыворотке человека важно как диагностический и прогностический маркер течения различных заболеваний вирусной, аутоиммунной и другой природы, а также при трансплантации различных органов.
Способ разработан и осуществлен в лаборатории молекулярной иммунологии бактериальных и вирусных инфекций НИИ эпидемиологии и микробиологии им. акад. И.Н.Блохиной, г. Н. Новгород.
Claims (3)
1. Способ определения растворимой формы HLA-DR антигенов в сыворотке крови человека, включающий иммобилизицию специфичных антител на твердом носителе, последовательную инкубацию с исследуемой сывороткой и пероксидазным конъюгатом, отличающийся тем, что в качестве первых антител используют поликлональные антитела против поверхностных антигенов мононуклеарных клеток человека в разведении от 1:100 до 1:1500, а в качестве вторых антител применяют HLA-DR специфичные моноклональные антитела ИКО-1, конъюгированные с пероксидазой хрена в разведении от 1:50 до 1:800.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что оптимальное разведение поликлональных антител против поверхностных антигенов мононуклеарных клеток человека составляет 1:1000.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что оптимальное разведение HLA-DR специфичных моноклональных антител ИКО-1, конъюгированных с пероксидазой хрена, составляет 1:400.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2002115475/15A RU2237249C2 (ru) | 2002-06-10 | 2002-06-10 | Иммуноферментный способ определения растворимой формы hla-dr антигенов в сыворотке крови человека |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2002115475/15A RU2237249C2 (ru) | 2002-06-10 | 2002-06-10 | Иммуноферментный способ определения растворимой формы hla-dr антигенов в сыворотке крови человека |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2002115475A RU2002115475A (ru) | 2004-01-10 |
RU2237249C2 true RU2237249C2 (ru) | 2004-09-27 |
Family
ID=33432840
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2002115475/15A RU2237249C2 (ru) | 2002-06-10 | 2002-06-10 | Иммуноферментный способ определения растворимой формы hla-dr антигенов в сыворотке крови человека |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2237249C2 (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2800470C1 (ru) * | 2022-08-29 | 2023-07-21 | Федеральное казенное учреждение здравоохранения "Ростовский-на-Дону ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Способ получения моноклонального пероксидазного конъюгата для идентификации типичных и атипичных штаммов Vibrio cholerae O1, включая и R-варианты в дот-ИФА |
-
2002
- 2002-06-10 RU RU2002115475/15A patent/RU2237249C2/ru not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
HAUSMANN S. et al. Influence of anticoagulants on the level of soluble HLA class I and class II antigens measured in blood samples. Journal of immunology, 1996, 17(3), p.257-275. HAUSMANN S. et al. Quantitation of soluble HLA-DR antigens in human serum and other body fluids. Beitr Infusionsther Transfusionsmed, 1994, 32, p.281-287. КОНЕНКОВ В.И. и др. Уровень экспрессии HLA-антигенов I и II классов на поверхностной мембране субпопуляций лимфоцитов периферической крови здоровых людей. - Иммунология, 1987, №6, с.61-63. * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2800470C1 (ru) * | 2022-08-29 | 2023-07-21 | Федеральное казенное учреждение здравоохранения "Ростовский-на-Дону ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Способ получения моноклонального пероксидазного конъюгата для идентификации типичных и атипичных штаммов Vibrio cholerae O1, включая и R-варианты в дот-ИФА |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
RU2002115475A (ru) | 2004-01-10 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Viitala et al. | Serum IgA, IgG, and IgM antibodies directed against acetaldehyde‐derived epitopes: relationship to liver disease severity and alcohol consumption | |
Rao et al. | An avidin-biotin microELISA for rapid measurement of total and allergen-specific human IgE | |
EP0315364A2 (en) | Simultaneous immunoassay for the determination of antigens and antibodies | |
Srikanta et al. | Assay for islet cell antibodies: protein A—monoclonal antibody method | |
JP3630689B2 (ja) | 抗ポリマー抗体の検出方法およびシリコーン関連疾患(srd)の診断を援助するのに有用な診断試験キット | |
JPH01500367A (ja) | 可溶性t細胞表面分子を使用した治療および診断 | |
US5484707A (en) | Assay for free secretory component and methods for monitoring organ rejection | |
JPS6120867A (ja) | 抗体‐レクチンのサンドイツチ検定 | |
AU601455B2 (en) | Method of detecting or estimating biological material | |
Nyland et al. | Immunological characterization of surd nerve biopsies from patients with Guillain‐Barré syndrome | |
JP2656776B2 (ja) | 安定なグリコシル化ヘモグロビンの新規な免疫化学的アッセイ方法 | |
Silvestris et al. | Discrepancy in the expression of autoantibodies in healthy aged individuals | |
CN101957365B (zh) | 检测抗环瓜氨酸肽和抗免疫球蛋白g双特异性抗体的试剂盒 | |
McLaren et al. | Preliminary investigation on the use of the enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) in the serodiagnosis of mycetoma | |
Durand et al. | A new enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for measuring immunoconglutinins directed against the third component of human complement. Findings in systemic lupus erythematosus | |
RU2237249C2 (ru) | Иммуноферментный способ определения растворимой формы hla-dr антигенов в сыворотке крови человека | |
JP4274693B2 (ja) | クローン病の検査方法及び検査用キット | |
Aarli | Binding of γ-globulin fragments to muscle tissue | |
JP3998245B2 (ja) | 酸化アポリポタンパク質ai及びそれを含有する酸化リポタンパク質の測定法及びキット | |
RU2210074C2 (ru) | Иммунологический анализ человеческого медуллазина и диагностика рассеянного склероза с его помощью | |
US4402934A (en) | Diagnostic technique for rheumatoid arthritis | |
CN110018156A (zh) | 抗CarP抗体作为系统性红斑狼疮诊断标志物的应用 | |
JP2000214163A (ja) | 測定試薬 | |
JP4588053B2 (ja) | 酸化アポリポタンパク質ai及びそれを含有する酸化リポタンパク質の測定法及びキット | |
JP2670498B2 (ja) | 免疫複合体の測定法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20060611 |