JPH09249659A - 安定なジオキセタンおよびこれを含む発光組成物 - Google Patents
安定なジオキセタンおよびこれを含む発光組成物Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 酵素の作用によってトリガーされ化学発光す
る、優れた溶解性を有する安定した1,2−ジオキセタ
ンを提供する。 【解決手段】 その構造上に配置された、二以上の可水
溶化基で置換されたジオキセタンは、カプセル化学分析
システムで行なわれる検定に用いる際の試薬のキャリオ
ーバーの問題を排除する。また、このようなジオキセタ
ン、非ポリマー系界面活性剤エンハンサー、および随意
に蛍光物質を含む化学発光増強用組成物に関する。
る、優れた溶解性を有する安定した1,2−ジオキセタ
ンを提供する。 【解決手段】 その構造上に配置された、二以上の可水
溶化基で置換されたジオキセタンは、カプセル化学分析
システムで行なわれる検定に用いる際の試薬のキャリオ
ーバーの問題を排除する。また、このようなジオキセタ
ン、非ポリマー系界面活性剤エンハンサー、および随意
に蛍光物質を含む化学発光増強用組成物に関する。
Description
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、酵素含有化学試薬
によりトリガー(trigger)して、化学発光を生じ得る安
定な1,2−ジオキセタンおよび組成物に関する。ジオ
キセタンは、アルコキシ置換基の一部である一以上のイ
オン化可能基を含む。本発明を実施するために用いられ
る組成物は、上に述べた安定なジオキセタン、カチオン
界面活性剤、および随意に、生成される化学発光量を高
める蛍光物質を含む。本発明のジオキセタンおよび高度
化された組成物は、光を発生させる(化学発光の)方法
および分析生成物の存在および量を検出するための分析
方法に有用である。イオン化可能基は、より水溶性の高
いジオキセタンの実現を可能にし、カプセル化学分析シ
ステムの予期しない化学的キャリオーバー(carryover)
の問題を解決する点で重要である。
によりトリガー(trigger)して、化学発光を生じ得る安
定な1,2−ジオキセタンおよび組成物に関する。ジオ
キセタンは、アルコキシ置換基の一部である一以上のイ
オン化可能基を含む。本発明を実施するために用いられ
る組成物は、上に述べた安定なジオキセタン、カチオン
界面活性剤、および随意に、生成される化学発光量を高
める蛍光物質を含む。本発明のジオキセタンおよび高度
化された組成物は、光を発生させる(化学発光の)方法
および分析生成物の存在および量を検出するための分析
方法に有用である。イオン化可能基は、より水溶性の高
いジオキセタンの実現を可能にし、カプセル化学分析シ
ステムの予期しない化学的キャリオーバー(carryover)
の問題を解決する点で重要である。
【0002】
a.酵素によりトリガー可能なジオキセタン 酵素によりトリガー可能なジオキセタンの最初の諸例
が、アメリカ合衆国特許出願(A.P.シャープ、アメ
リカ合衆国特許出願一連番号第887139号)および
一連の論文(A.P.シャープ、R.S.ハンドリー、
B.P.ジリ、テトラヘドロン・レター、935(19
87)、A.P.シャープ、M.D.サンディソン、
R.S.ハンドリー、テトラヘドロン・レター、115
9(1987)、A.P.シャープ、フォトケミカル・
フォトバイオロジー、47S、50S(1988))に
記載されている。保護されたアリーロキシド置換基をも
つ高度に安定なアダマンティル置換ジオキセタンが酵素
と水性緩衝液の両方の作用でトリガーされると、分解し
て発光し、強く電子を出すアリーロキシド・アニオンを
生じ、これがジオキセタンの分解速度を劇的に高める。
その結果、保護された形のジオキセタンの遅い熱分解で
生じる場合より数桁高い強度の化学発光を生じる。シャ
ープのアメリカ合衆国特許第5068339号は、酵素
によりトリガー可能な共有結合の蛍光基をもつジオキセ
タンを開示しており、これが分解されると、蛍光物質へ
のエネルギー移転による高度な化学発光が生じる。ブロ
ンステインのアメリカ合衆国特許第5112960号お
よび第5220005号ならびにPCT出願(WO88
/00695)は、トリガー可能な置換されたアダマン
ティル基をもつジオキセタンを開示している。エドワー
ズのアメリカ合衆国特許第4952707号は、リン酸
塩置換ジオキセタンを開示している。ブロンステインの
PCT出願(WO94/26726)は、非共役位置で
酵素活性OX基およびアリール環上の付加基と置換した
フェニルまたはナフチル基をもつアダマンティル・ジオ
キセタンを開示している。
が、アメリカ合衆国特許出願(A.P.シャープ、アメ
リカ合衆国特許出願一連番号第887139号)および
一連の論文(A.P.シャープ、R.S.ハンドリー、
B.P.ジリ、テトラヘドロン・レター、935(19
87)、A.P.シャープ、M.D.サンディソン、
R.S.ハンドリー、テトラヘドロン・レター、115
9(1987)、A.P.シャープ、フォトケミカル・
フォトバイオロジー、47S、50S(1988))に
記載されている。保護されたアリーロキシド置換基をも
つ高度に安定なアダマンティル置換ジオキセタンが酵素
と水性緩衝液の両方の作用でトリガーされると、分解し
て発光し、強く電子を出すアリーロキシド・アニオンを
生じ、これがジオキセタンの分解速度を劇的に高める。
その結果、保護された形のジオキセタンの遅い熱分解で
生じる場合より数桁高い強度の化学発光を生じる。シャ
ープのアメリカ合衆国特許第5068339号は、酵素
によりトリガー可能な共有結合の蛍光基をもつジオキセ
タンを開示しており、これが分解されると、蛍光物質へ
のエネルギー移転による高度な化学発光が生じる。ブロ
ンステインのアメリカ合衆国特許第5112960号お
よび第5220005号ならびにPCT出願(WO88
/00695)は、トリガー可能な置換されたアダマン
ティル基をもつジオキセタンを開示している。エドワー
ズのアメリカ合衆国特許第4952707号は、リン酸
塩置換ジオキセタンを開示している。ブロンステインの
PCT出願(WO94/26726)は、非共役位置で
酵素活性OX基およびアリール環上の付加基と置換した
フェニルまたはナフチル基をもつアダマンティル・ジオ
キセタンを開示している。
【0003】ワンのPCT出願(WO94/1025
8)には、他のトリガー可能なジオキセタンが開示され
ている。ワンが開示したジオキセタンは、アルキル基
(これはモノ置換されたものでもよい)および置換フェ
ニル−O基を含み、トリガー可能なOX基に加えてベン
ゼン環置換基上に一以上の非水素基が存在するものであ
る。
8)には、他のトリガー可能なジオキセタンが開示され
ている。ワンが開示したジオキセタンは、アルキル基
(これはモノ置換されたものでもよい)および置換フェ
ニル−O基を含み、トリガー可能なOX基に加えてベン
ゼン環置換基上に一以上の非水素基が存在するものであ
る。
【0004】上記の文献に開示されているジオキセタン
は、すべて、芳香族カルボン酸のアルキルエステルを含
む発光カルボニル化合物を生成するもので、この芳香族
カルボン酸のアルキルエステルは、通常は、ヒドロキシ
安息香酸またはヒドロキシナフトエ酸のメチルエステル
あるいはヒドロキシアリールケトンである。
は、すべて、芳香族カルボン酸のアルキルエステルを含
む発光カルボニル化合物を生成するもので、この芳香族
カルボン酸のアルキルエステルは、通常は、ヒドロキシ
安息香酸またはヒドロキシナフトエ酸のメチルエステル
あるいはヒドロキシアリールケトンである。
【0005】b.トリガー可能なジオキセタンの化学発
光の界面活性剤による増強 酵素でトリガーされる安定な1,2−ジオキセタンの分
解から生じる化学発光のアンモニウム界面活性剤および
蛍光物質を含めて水溶性物資の存在下での増強も報告さ
れている(A.P.シャープ、H.アカヴァン、および
L.J.ロマノ、クリニカル・ケミストリー、35
(9)、1863(1989))。臭化セチルトリメチ
ルアンモニウム(CTAB)および5−(N−テトラデ
カノル)アミノ−フルオレセインからなる蛍光ミセル
は、中間のヒドロキシ置換ジオキセタンを捕捉し、励起
状態のアニオン系エステルからミセルの親水性環境内の
フルオレセイン化合物への効率的なエネルギー移転によ
って化学発光量子収量を400倍も増大させる。
光の界面活性剤による増強 酵素でトリガーされる安定な1,2−ジオキセタンの分
解から生じる化学発光のアンモニウム界面活性剤および
蛍光物質を含めて水溶性物資の存在下での増強も報告さ
れている(A.P.シャープ、H.アカヴァン、および
L.J.ロマノ、クリニカル・ケミストリー、35
(9)、1863(1989))。臭化セチルトリメチ
ルアンモニウム(CTAB)および5−(N−テトラデ
カノル)アミノ−フルオレセインからなる蛍光ミセル
は、中間のヒドロキシ置換ジオキセタンを捕捉し、励起
状態のアニオン系エステルからミセルの親水性環境内の
フルオレセイン化合物への効率的なエネルギー移転によ
って化学発光量子収量を400倍も増大させる。
【0006】シャープのアメリカ合衆国特許第4959
182号および5004565号は、化学的にまた酵素
でトリガーされて生じる安定なジオキセタンの化学発光
の、第四級アンモニウム界面活性剤CTABによって形
成されるミセルの存在下での増強の他の例を記載してい
る。蛍光ミセルは、また、塩基でトリガーされるヒドロ
キシおよびアセトキシ置換ジオキセタンの発光を増強す
る。
182号および5004565号は、化学的にまた酵素
でトリガーされて生じる安定なジオキセタンの化学発光
の、第四級アンモニウム界面活性剤CTABによって形
成されるミセルの存在下での増強の他の例を記載してい
る。蛍光ミセルは、また、塩基でトリガーされるヒドロ
キシおよびアセトキシ置換ジオキセタンの発光を増強す
る。
【0007】ヴォイタのアメリカ合衆国特許第5145
772号は、酵素で生じる1,2−ジオキセタンの化学
発光の、第四級アンモニウム基のペンダントのみまたは
フルオレセイン(fluorescein)が付加されたポリマーの
存在下での増強を開示している。化学発光を高めるもの
として報告されている他の物質には、ウシのアルブミン
等の球状タンパク質や第四級アンモニウム界面活性剤な
どがある。他のカチオン系ポリマー化合物は、化学発光
エンハンサー(enhancer)として限界的効果を示す。非イ
オン系ポリマー化合物は、通常、効果がなく、アニオン
系ポリマーは、発光を有意に減少させる。ブロンステイ
ンのPCT出願(WO94/21821)は、上に述べ
たポリマー第四級アンモニウム界面活性剤であるエンハ
ンサーの混合物を増強添加剤と共に使用することを記載
している。
772号は、酵素で生じる1,2−ジオキセタンの化学
発光の、第四級アンモニウム基のペンダントのみまたは
フルオレセイン(fluorescein)が付加されたポリマーの
存在下での増強を開示している。化学発光を高めるもの
として報告されている他の物質には、ウシのアルブミン
等の球状タンパク質や第四級アンモニウム界面活性剤な
どがある。他のカチオン系ポリマー化合物は、化学発光
エンハンサー(enhancer)として限界的効果を示す。非イ
オン系ポリマー化合物は、通常、効果がなく、アニオン
系ポリマーは、発光を有意に減少させる。ブロンステイ
ンのPCT出願(WO94/21821)は、上に述べ
たポリマー第四級アンモニウム界面活性剤であるエンハ
ンサーの混合物を増強添加剤と共に使用することを記載
している。
【0008】トリガー不能なジオキセタンのCTABの
存在下でのピラニンによる増強および触媒作用も記載さ
れている(マーチン・ジョッソ、Ph.D論文、ウェイ
ン州立大学(1992)、部内討論要約、53巻、第1
2B号、p6305)。アカヴァン−タフティのアメリ
カ合衆国特許第5393469号は、酵素で生成された
1,2−ジオキセタンの化学発光の、ポリマー第四級ホ
スホニウム塩を随意に蛍光エネルギー・アクセプターで
置換したものの存在下での増強を開示している。
存在下でのピラニンによる増強および触媒作用も記載さ
れている(マーチン・ジョッソ、Ph.D論文、ウェイ
ン州立大学(1992)、部内討論要約、53巻、第1
2B号、p6305)。アカヴァン−タフティのアメリ
カ合衆国特許第5393469号は、酵素で生成された
1,2−ジオキセタンの化学発光の、ポリマー第四級ホ
スホニウム塩を随意に蛍光エネルギー・アクセプターで
置換したものの存在下での増強を開示している。
【0009】ヨーロッパ特許出願一連番号第94108
100.2号は、酵素で生じた1,2−ジオキセタンの
化学発光の、ジカチオン・ホスホニウム塩の存在下での
増強を開示している。トリガー可能なジオキセタンの化
学発光を増強するために、アニオン系蛍光物質とジカチ
オン系エンハンサーを組み合わせることを開示した資料
は存在しない。本発明の種類の置換ジオキセタンの増強
例は、報告されていない。
100.2号は、酵素で生じた1,2−ジオキセタンの
化学発光の、ジカチオン・ホスホニウム塩の存在下での
増強を開示している。トリガー可能なジオキセタンの化
学発光を増強するために、アニオン系蛍光物質とジカチ
オン系エンハンサーを組み合わせることを開示した資料
は存在しない。本発明の種類の置換ジオキセタンの増強
例は、報告されていない。
【0010】c.水溶性が改良されたトリガー可能なジ
オキセタン 酵素がトリガー可能なジオキセタンは、現在、多くの用
途でマーカー酵素用基質として広く使用されており、用
途としては、免疫学的検定、遺伝子発現の研究、ウエス
タンブロット法、サザンブロット法、DNA配列、感染
因子内の核酸セグメントの識別等が含まれる。この種の
化合物の使用が増加しているにもかかわらず、検定法に
よってはその使用が限定されるものもある。より水溶性
の高いトリガー可能なジオキセタンがのぞまれている。
下の構造式に示されるように、ホスフェートジオキセタ
ンのアルカリ性ホスファターゼによる脱リン酸によって
形成されるヒドロキシ・ジオキセタンが、水および緩衝
化液内で、また化学発光エンハンサーを含む組成物内で
高い溶解性を保つことがとくに望ましい。このようなジ
オキセタンおよび組成物は、加水分解酵素または加水分
解酵素の複合体を検出するためのある種の検定法で重要
である。
オキセタン 酵素がトリガー可能なジオキセタンは、現在、多くの用
途でマーカー酵素用基質として広く使用されており、用
途としては、免疫学的検定、遺伝子発現の研究、ウエス
タンブロット法、サザンブロット法、DNA配列、感染
因子内の核酸セグメントの識別等が含まれる。この種の
化合物の使用が増加しているにもかかわらず、検定法に
よってはその使用が限定されるものもある。より水溶性
の高いトリガー可能なジオキセタンがのぞまれている。
下の構造式に示されるように、ホスフェートジオキセタ
ンのアルカリ性ホスファターゼによる脱リン酸によって
形成されるヒドロキシ・ジオキセタンが、水および緩衝
化液内で、また化学発光エンハンサーを含む組成物内で
高い溶解性を保つことがとくに望ましい。このようなジ
オキセタンおよび組成物は、加水分解酵素または加水分
解酵素の複合体を検出するためのある種の検定法で重要
である。
【0011】本発明の他の背景として、以下の例の説明
からより十分に理解されることになるであろうが、カプ
セル化学分析の原理にもとづく自動計測で行なわれる検
定で、従来の化学発光ジオキセタン試薬を使用すると、
一つの流体セグメントから他の流体セグメントへの試薬
のキャリオーバーが生じ、不正確な測定が行なわれるお
それがあり、誤った結果が得られ、非再現性にもとづく
不明確性が生じることが明らかにされている。カプセル
化学分析は、アメリカ合衆国特許第5399497号に
記載されており、参考としてその全文を本出願に添付し
てある。キャリオーバーの問題を克服するための可能な
手段として、とくに、ヒドロキシ・ジオキセタンの水溶
性を改良することによって、この発光反応がカプセル化
学分析システムの隣接する流体セグメントの中へキャリ
オーバーされることを排除あるいは最小化できる可能性
のあることが明記されている。
からより十分に理解されることになるであろうが、カプ
セル化学分析の原理にもとづく自動計測で行なわれる検
定で、従来の化学発光ジオキセタン試薬を使用すると、
一つの流体セグメントから他の流体セグメントへの試薬
のキャリオーバーが生じ、不正確な測定が行なわれるお
それがあり、誤った結果が得られ、非再現性にもとづく
不明確性が生じることが明らかにされている。カプセル
化学分析は、アメリカ合衆国特許第5399497号に
記載されており、参考としてその全文を本出願に添付し
てある。キャリオーバーの問題を克服するための可能な
手段として、とくに、ヒドロキシ・ジオキセタンの水溶
性を改良することによって、この発光反応がカプセル化
学分析システムの隣接する流体セグメントの中へキャリ
オーバーされることを排除あるいは最小化できる可能性
のあることが明記されている。
【0012】コマーシャル・ベースで使用されるジオキ
セタン化合物には、アルコキシ基に付加される可溶化基
が組み込まれていない。したがって、この種のジオキセ
タンは、キャリオーバー・ゼロを必要とする検定法に使
用するのに適していない。ジオキセタンに可溶化基を組
み込む提案も行なわれている(アメリカ合衆国特許第5
220005号)。アダマンティル置換基の上で置換さ
れたカルボキシル基をもつジオキセタンを主張する資料
もあるが、そのようなジオキセタンの調製は記載されて
いない。重要なことであるが、ジオキセタンの水溶性お
よび他の性質にカルボキシル基を添加するとどのような
効果があるのかの開示は存在しない。当該技術において
どれだけ多くの可溶化基が必要かあるいはどのような具
体的な効果が得られるかの報告はなにもない。発光を起
こさせる保護基の除去を妨げる、あるいは他の方法で発
光を妨げるような可溶化基の使用は価値がないであろ
う。同様に、発光反応中に除去されるような可溶化基も
有用でないであろう。
セタン化合物には、アルコキシ基に付加される可溶化基
が組み込まれていない。したがって、この種のジオキセ
タンは、キャリオーバー・ゼロを必要とする検定法に使
用するのに適していない。ジオキセタンに可溶化基を組
み込む提案も行なわれている(アメリカ合衆国特許第5
220005号)。アダマンティル置換基の上で置換さ
れたカルボキシル基をもつジオキセタンを主張する資料
もあるが、そのようなジオキセタンの調製は記載されて
いない。重要なことであるが、ジオキセタンの水溶性お
よび他の性質にカルボキシル基を添加するとどのような
効果があるのかの開示は存在しない。当該技術において
どれだけ多くの可溶化基が必要かあるいはどのような具
体的な効果が得られるかの報告はなにもない。発光を起
こさせる保護基の除去を妨げる、あるいは他の方法で発
光を妨げるような可溶化基の使用は価値がないであろ
う。同様に、発光反応中に除去されるような可溶化基も
有用でないであろう。
【0013】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、おどろくこ
とに、ホスフェートジオキセタンの脱リン酸によって生
成されるヒドロキシ・ジオキセタンに関連するキャリオ
ーバーの問題をなくすためには、一つの可溶化基を組み
込むだけでは不十分であることを示すものである。この
問題を解決するために、そのヒドロキシ・ジオキセタン
生成物が高い水溶性を保つホスフェートジオキセタンを
提供するものである。さらに、そのようなホスフェート
ジオキセタンを含み、検定においてトリガー試剤と反応
させると効率的な化学発光を行なう増強された組成物を
提供するものである。
とに、ホスフェートジオキセタンの脱リン酸によって生
成されるヒドロキシ・ジオキセタンに関連するキャリオ
ーバーの問題をなくすためには、一つの可溶化基を組み
込むだけでは不十分であることを示すものである。この
問題を解決するために、そのヒドロキシ・ジオキセタン
生成物が高い水溶性を保つホスフェートジオキセタンを
提供するものである。さらに、そのようなホスフェート
ジオキセタンを含み、検定においてトリガー試剤と反応
させると効率的な化学発光を行なう増強された組成物を
提供するものである。
【0014】本発明の第一の目的は、酵素の作用によっ
て化学発光を生成するために、酵素でトリガーされ水溶
液への可溶性が改良された安定した1,2−ジオキセタ
ンを提供することにある。本発明の第二の目的は、さら
にジオキセタン構造上に配置された二以上の可水溶化基
で置換された1,2−ジオキセタンを提供することにあ
る。本発明の他の目的は、増強された化学発光を得るた
めに二以上の可水溶化基をもつジオキセタン、非ポリマ
ー・カチオン系エンハンサー、および随意に蛍光物質を
含む組成物を提供することにある。本発明のさらに他の
目的は、カプセル化学分析システムで行なわれる検定に
用いる際に試薬のキャリオーバーの問題を排除するジオ
キセタンおよび組成物を提供することである。
て化学発光を生成するために、酵素でトリガーされ水溶
液への可溶性が改良された安定した1,2−ジオキセタ
ンを提供することにある。本発明の第二の目的は、さら
にジオキセタン構造上に配置された二以上の可水溶化基
で置換された1,2−ジオキセタンを提供することにあ
る。本発明の他の目的は、増強された化学発光を得るた
めに二以上の可水溶化基をもつジオキセタン、非ポリマ
ー・カチオン系エンハンサー、および随意に蛍光物質を
含む組成物を提供することにある。本発明のさらに他の
目的は、カプセル化学分析システムで行なわれる検定に
用いる際に試薬のキャリオーバーの問題を排除するジオ
キセタンおよび組成物を提供することである。
【0015】
【課題を解決するための手段】本発明は、水溶性が改良
されたトリガー可能なジオキセタンに関する。この種の
トリガー可能なジオキセタンは、カプセル化学分析シス
テムにおける隣接するセグメントへの発光ヒドロキシ・
ジオキセタンのキャリオーバーを排除しまたは最小化す
るものである。キャリオーバーは、水溶性の低い発光材
料が、カプセル化学分析システムにおいて分離用流体と
して用いられるフルオロカーボンオイルの中で溶化、堆
積、または沈殿するときに生じ得る。試薬のキャリオー
バーは、不正確な測定、誤った結果、および非再現性に
もとづく不明確性につながる。
されたトリガー可能なジオキセタンに関する。この種の
トリガー可能なジオキセタンは、カプセル化学分析シス
テムにおける隣接するセグメントへの発光ヒドロキシ・
ジオキセタンのキャリオーバーを排除しまたは最小化す
るものである。キャリオーバーは、水溶性の低い発光材
料が、カプセル化学分析システムにおいて分離用流体と
して用いられるフルオロカーボンオイルの中で溶化、堆
積、または沈殿するときに生じ得る。試薬のキャリオー
バーは、不正確な測定、誤った結果、および非再現性に
もとづく不明確性につながる。
【0016】本発明は、かかる課題を解決するために、
夫々下記の構成よりなる。 (1)下記式、 (式中、R1は、1ないし20の炭素原子を有する、置
換されたアルキル、ヘテロアルキル、アルケニルまたは
アルキニル基、少なくとも二つの水溶液への可溶性を高
める基、および随意に少なくとも1個の酸素原子を含む
親水性有機基であり、R3およびR4は、各々が、随意
にヘテロ原子で置換することができ、またジオキセタン
環にスピロ融合(spiro-fused)した環式または多環式有
機環基を組み合わされて随意に形成し得る非環式、環式
または多環式有機基であり、R2は、付加的な置換基を
含むことができるフェニルおよびナフチル基からなる群
から選ばれるアリ−ル環基であり、Xは、活性化試剤に
よって除去され光を生ずることのできる保護基である)
で表される安定なジオキセタンである。
夫々下記の構成よりなる。 (1)下記式、 (式中、R1は、1ないし20の炭素原子を有する、置
換されたアルキル、ヘテロアルキル、アルケニルまたは
アルキニル基、少なくとも二つの水溶液への可溶性を高
める基、および随意に少なくとも1個の酸素原子を含む
親水性有機基であり、R3およびR4は、各々が、随意
にヘテロ原子で置換することができ、またジオキセタン
環にスピロ融合(spiro-fused)した環式または多環式有
機環基を組み合わされて随意に形成し得る非環式、環式
または多環式有機基であり、R2は、付加的な置換基を
含むことができるフェニルおよびナフチル基からなる群
から選ばれるアリ−ル環基であり、Xは、活性化試剤に
よって除去され光を生ずることのできる保護基である)
で表される安定なジオキセタンである。
【0017】(2)下記式、 (式中、R1は、1ないし8の炭素原子を有する、置換
されたアルキル、ヘテロアルキル、アルケニルまたはア
ルキニル基、少なくとも二つの水溶液への可溶性を高め
る基、および随意に少なくとも1個の酸素原子を含む親
水性有機基であり、R5は、ジオキセタン環にスピロ融
合した環式および多環式アルキル基からなる群から選ば
れ、6から30の炭素原子を有し、場合により付加的な
置換基を含有し得るものであり、R2は、場合により付
加的な置換基を含むことができるフェニルおよびナフチ
ル基からなる群から選ばれるアリール環基であり、X
は、活性化試剤によって除去され光を生じることのでき
る保護基である)で表される安定なジオキセタンであ
る。
されたアルキル、ヘテロアルキル、アルケニルまたはア
ルキニル基、少なくとも二つの水溶液への可溶性を高め
る基、および随意に少なくとも1個の酸素原子を含む親
水性有機基であり、R5は、ジオキセタン環にスピロ融
合した環式および多環式アルキル基からなる群から選ば
れ、6から30の炭素原子を有し、場合により付加的な
置換基を含有し得るものであり、R2は、場合により付
加的な置換基を含むことができるフェニルおよびナフチ
ル基からなる群から選ばれるアリール環基であり、X
は、活性化試剤によって除去され光を生じることのでき
る保護基である)で表される安定なジオキセタンであ
る。
【0018】(3)前記(2)記載のジオキセタンにお
いて、下記式、 で表されるジオキセタンである。
いて、下記式、 で表されるジオキセタンである。
【0019】(4)前記(1)、(2)または(3)記
載のジオキセタンにおいて、可溶性を高める基が、カル
ボキシレート、スルフォネート、サルフェート、ホスフ
ェート、ホスフォネート、ニトレート、トリアルキルア
ンモニウム、トリアルキルホスフォニウム、ジアルキル
スルフォニウム、およびグアニジニウム基からなる群か
ら選ばれるジオキセタンである。
載のジオキセタンにおいて、可溶性を高める基が、カル
ボキシレート、スルフォネート、サルフェート、ホスフ
ェート、ホスフォネート、ニトレート、トリアルキルア
ンモニウム、トリアルキルホスフォニウム、ジアルキル
スルフォニウム、およびグアニジニウム基からなる群か
ら選ばれるジオキセタンである。
【0020】(5)前記(1)、(2)または(3)記
載のジオキセタンにおいて、可溶性を高める基がカルボ
キシレート基であるジオキセタンである。
載のジオキセタンにおいて、可溶性を高める基がカルボ
キシレート基であるジオキセタンである。
【0021】(6)前記(5)記載のジオキセタンにお
いて、OX基が、O−M+基(ただし、Mは水素原子、
アルカリ金属イオン、第四級アンモニウムおよび第四級
ホスフォニウム・イオンからなる群から選ばれる)、O
OCR8基(ただし、R8は、2ないし8の炭素原子を
有し、かつ随意にヘテロ原子を含有するアルキルおよび
アリール基からなる群から選ばれる)、OPO
3 −2塩、OSO3 −塩、β−D−ガラクトシドキシ、
およびβ−D−グルクロニジロキシ基からなる群から選
ばれるジオキセタンである。
いて、OX基が、O−M+基(ただし、Mは水素原子、
アルカリ金属イオン、第四級アンモニウムおよび第四級
ホスフォニウム・イオンからなる群から選ばれる)、O
OCR8基(ただし、R8は、2ないし8の炭素原子を
有し、かつ随意にヘテロ原子を含有するアルキルおよび
アリール基からなる群から選ばれる)、OPO
3 −2塩、OSO3 −塩、β−D−ガラクトシドキシ、
およびβ−D−グルクロニジロキシ基からなる群から選
ばれるジオキセタンである。
【0022】(7)下記式、 で表されるジオキセタン化合物である。
【0023】(8)水溶液中に、(a)下記式、 (式中、R1は、1ないし20の炭素原子を有する、置
換されたアルキル、ヘテロアルキル、アルケニルまたは
アルキニル基、少なくとも二つの水溶液への可溶性を高
める基、および随意に少なくとも1個の酸素原子を含む
親水性有機基であり、R3およびR4は、各々が、随意
にヘテロ原子で置換することができ、またジオキセタン
環にスピロ融合した環式または多環式環基を組み合わさ
れて随意に形成し得る非環式、環式または多環式有機基
であり、R2は、付加的な置換基を含むことができるフ
ェニルおよびナフチル基からなる群から選ばれるアリ−
ル環基であり、Xは、活性化試剤によって除去され光を
生ずることのできる保護基である)で表される安定なジ
オキセタンと、(b)ジオキセタンと活性化試剤との反
応により、エンハンサーなしで発生する光の量に比し
て、発生する光の量を増大させる非ポリマー系でかつカ
チオン系のエンハンサー物質と、を含む光発生組成物で
ある。
換されたアルキル、ヘテロアルキル、アルケニルまたは
アルキニル基、少なくとも二つの水溶液への可溶性を高
める基、および随意に少なくとも1個の酸素原子を含む
親水性有機基であり、R3およびR4は、各々が、随意
にヘテロ原子で置換することができ、またジオキセタン
環にスピロ融合した環式または多環式環基を組み合わさ
れて随意に形成し得る非環式、環式または多環式有機基
であり、R2は、付加的な置換基を含むことができるフ
ェニルおよびナフチル基からなる群から選ばれるアリ−
ル環基であり、Xは、活性化試剤によって除去され光を
生ずることのできる保護基である)で表される安定なジ
オキセタンと、(b)ジオキセタンと活性化試剤との反
応により、エンハンサーなしで発生する光の量に比し
て、発生する光の量を増大させる非ポリマー系でかつカ
チオン系のエンハンサー物質と、を含む光発生組成物で
ある。
【0024】(9)前記(8)記載の光発生組成物にお
いて、前記エンハンサー物質が下記式、 (式中、各Aは、PおよびN原子からなる群から独立に
選ばれ、Linkは、置換および未置換アリール、アル
キル、アルケニルおよびアルキニル基からなる群から選
ばれる少なくとも二つの炭素原子を含む有機結合基であ
り、また、Linkは場合によりヘテロ原子を含有して
もよく、Rは1ないし20の炭素原子を含む低級アルキ
ルまたはアラルキル基から選ばれ、Yはアニオンであ
る)で表される光発生組成物である。
いて、前記エンハンサー物質が下記式、 (式中、各Aは、PおよびN原子からなる群から独立に
選ばれ、Linkは、置換および未置換アリール、アル
キル、アルケニルおよびアルキニル基からなる群から選
ばれる少なくとも二つの炭素原子を含む有機結合基であ
り、また、Linkは場合によりヘテロ原子を含有して
もよく、Rは1ないし20の炭素原子を含む低級アルキ
ルまたはアラルキル基から選ばれ、Yはアニオンであ
る)で表される光発生組成物である。
【0025】(10)前記(8)記載の光発生組成物に
おいて、前記エンハンサー物質が下記式、 (式中、Linkはフェニレン基である)で表されるジ
カチオン系界面活性剤である光発生組成物である。
おいて、前記エンハンサー物質が下記式、 (式中、Linkはフェニレン基である)で表されるジ
カチオン系界面活性剤である光発生組成物である。
【0026】(11)前記(8)、(9)または(1
0)記載の光発生組成物において、ジオキセタンが下記
式、 (式中、R5はジオキセタン環にスピロ融合され、6な
いし30の炭素原子を含み、また随意に付加的置換基を
含み得る環式または多環式アルキル基からなる群から選
ばれる)で表される光発生組成物である。
0)記載の光発生組成物において、ジオキセタンが下記
式、 (式中、R5はジオキセタン環にスピロ融合され、6な
いし30の炭素原子を含み、また随意に付加的置換基を
含み得る環式または多環式アルキル基からなる群から選
ばれる)で表される光発生組成物である。
【0027】(12)前記(11)記載の光発生組成物
において、R5は、アダマンティル基および置換アダマ
ンティル基からなる群から選ばれる光発生組成物であ
る。
において、R5は、アダマンティル基および置換アダマ
ンティル基からなる群から選ばれる光発生組成物であ
る。
【0028】(13)前記(11)記載の光発生組成物
において、ジオキセタンが、下記式、 で表される光発生組成物である。
において、ジオキセタンが、下記式、 で表される光発生組成物である。
【0029】(14)前記(8)記載の光発生組成物に
おいて、ジオキセタンが、下記式、 で表され、また、エンハンサー物質が1−トリオクチル
ホスフォニウムメチル−4−トリブチルホスフォニウム
メチルベンゼン・ジクロライドである光発生組成物であ
る。
おいて、ジオキセタンが、下記式、 で表され、また、エンハンサー物質が1−トリオクチル
ホスフォニウムメチル−4−トリブチルホスフォニウム
メチルベンゼン・ジクロライドである光発生組成物であ
る。
【0030】(15)下記式、 で表される化合物である。
【0031】(16)下記式、 で表される化合物である。
【0032】(17)下記式、 で表される化合物である。
【0033】
【発明の実施の形態】本発明は、酵素含有試薬によって
トリガーし、化学発光を起こさせることのできる、1,
2−ジオキセタンに関する。本発明を実施するにあたっ
て有用な安定したジオキセタンは、下記式で表わすこと
ができる。 ただし、R1は、1ないし20の炭素原子を有する一つ
の置換アルキル、ヘテロアルキル、アルケニルまたはア
ルキニル基、少なくとも二つの水溶液への可溶性を高め
る基、および随意に酸素、窒素、イオウ、リン、ハロゲ
ンおよびアルカリ金属からなる群から選ばれる1以上の
原子を含む親水性有機基であり、R3およびR4は、各
々が、随意にヘテロ原子で置換することができ、またジ
オキセタンに安定性を与える非環式、環式、多環式有機
基であり、R2は、付加的な置換基を含むことができる
フェニルおよびナフチル基からなる群から選ばれるアリ
ール環基であり、Xは、活性化試剤によって除去できる
保護基であり、不安定な酸化中間ジオキセタン化合物を
形成し、それが分解して電子エネルギーを放出して光と
二つのカルボニル含有化合物を生成し、該化合物の一つ
は、反応に応じて可溶性増大基を含むオキシアニオン置
換エステルである。
トリガーし、化学発光を起こさせることのできる、1,
2−ジオキセタンに関する。本発明を実施するにあたっ
て有用な安定したジオキセタンは、下記式で表わすこと
ができる。 ただし、R1は、1ないし20の炭素原子を有する一つ
の置換アルキル、ヘテロアルキル、アルケニルまたはア
ルキニル基、少なくとも二つの水溶液への可溶性を高め
る基、および随意に酸素、窒素、イオウ、リン、ハロゲ
ンおよびアルカリ金属からなる群から選ばれる1以上の
原子を含む親水性有機基であり、R3およびR4は、各
々が、随意にヘテロ原子で置換することができ、またジ
オキセタンに安定性を与える非環式、環式、多環式有機
基であり、R2は、付加的な置換基を含むことができる
フェニルおよびナフチル基からなる群から選ばれるアリ
ール環基であり、Xは、活性化試剤によって除去できる
保護基であり、不安定な酸化中間ジオキセタン化合物を
形成し、それが分解して電子エネルギーを放出して光と
二つのカルボニル含有化合物を生成し、該化合物の一つ
は、反応に応じて可溶性増大基を含むオキシアニオン置
換エステルである。
【0034】
【0035】一つの実施形態にあっては、基R1は、水
溶液への可溶性を高める少なくとも二つの基で置換され
たC1ないしC20の直鎖または分岐アルキル基であ
る。好ましい可溶化基は、使用条件下で実質的にイオン
化される基からなり、カルボキシレート、スルフォネー
ト、サルフェート、ホスフェート、ホスフォネート、ニ
トレート、トリアルキルアンモニウム、トリアルキルホ
スフォニウム、ジアルキルスルフォニウム、およびグア
ニジニウム基を含むがこれらに限定されるものではな
い。
溶液への可溶性を高める少なくとも二つの基で置換され
たC1ないしC20の直鎖または分岐アルキル基であ
る。好ましい可溶化基は、使用条件下で実質的にイオン
化される基からなり、カルボキシレート、スルフォネー
ト、サルフェート、ホスフェート、ホスフォネート、ニ
トレート、トリアルキルアンモニウム、トリアルキルホ
スフォニウム、ジアルキルスルフォニウム、およびグア
ニジニウム基を含むがこれらに限定されるものではな
い。
【0036】好ましい一実施形態にあっては、R1は、
少なくとも二つのカルボン酸またはカルボン酸塩の基で
置換されたC1ないしC20の直鎖または分岐アルキル
基であり、これらの置換基には、例えば次式で表わされ
る構造の基が含まれる。
少なくとも二つのカルボン酸またはカルボン酸塩の基で
置換されたC1ないしC20の直鎖または分岐アルキル
基であり、これらの置換基には、例えば次式で表わされ
る構造の基が含まれる。
【0037】
【0038】ただし、Mは、水素原子、アルカリ金属イ
オン、または第四級アンモニウム若しくはホスフォニウ
ム・イオンから選ばれる。MがHである場合には、それ
ぞれのジオキセタン化合物が、カルボン酸の官能がイオ
ン化されるpH、すなわちpH≧約7の条件下でのみ使
用されることが好ましいことが明かとなっている。
オン、または第四級アンモニウム若しくはホスフォニウ
ム・イオンから選ばれる。MがHである場合には、それ
ぞれのジオキセタン化合物が、カルボン酸の官能がイオ
ン化されるpH、すなわちpH≧約7の条件下でのみ使
用されることが好ましいことが明かとなっている。
【0039】他の一実施形態にあっては、R1は、例え
ば下に示す構造の少なくとも二つのカルボン酸またはカ
ルボン酸塩の基で置換された直鎖または分岐ヘテロアル
キル基であり、 ただし、Mは上に定義した通りである。
ば下に示す構造の少なくとも二つのカルボン酸またはカ
ルボン酸塩の基で置換された直鎖または分岐ヘテロアル
キル基であり、 ただし、Mは上に定義した通りである。
【0040】他の実施形態にあっては、基R3およびR
4は、環式または多環式アルキル基R5の中で共に組み
合わされており、該基R5は、6ないし30の炭素原子
を含み、ジオキセタン環にスピロ融合され、それが熱安
定性を与え、また、他の非水素置換基を含むことができ
る。
4は、環式または多環式アルキル基R5の中で共に組み
合わされており、該基R5は、6ないし30の炭素原子
を含み、ジオキセタン環にスピロ融合され、それが熱安
定性を与え、また、他の非水素置換基を含むことができ
る。
【0041】基R5は、より好ましくは、多環基、好ま
しくはアダマンティル基または置換アダマンティル基で
あって、それに共有結合されたハロゲン、アルキル、置
換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、カルボニ
ル、カルボキシ、フェニル、置換フェニル、アミノ、お
よびアルキルアミノ基から選ばれる一以上の置換基R6
を有するものである。
しくはアダマンティル基または置換アダマンティル基で
あって、それに共有結合されたハロゲン、アルキル、置
換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、カルボニ
ル、カルボキシ、フェニル、置換フェニル、アミノ、お
よびアルキルアミノ基から選ばれる一以上の置換基R6
を有するものである。
【0042】他の好ましい実施形態にあっては、R
2は、フェニルまたはナフチル基である。とくに好まし
くは、R2は、その中のOX基が下に示すようにジオキ
セタン環基に対しメタ位にあるフェニル基である。フェ
ニル環は、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、アルコ
キシ、置換アルコキシ、カルボニル、カルボキシ、アミ
ノ、およびアルキルアミノ基から独立して選ばれる他の
環置換基R7を含んでもよい。若干の構造例を以下に示
す。
2は、フェニルまたはナフチル基である。とくに好まし
くは、R2は、その中のOX基が下に示すようにジオキ
セタン環基に対しメタ位にあるフェニル基である。フェ
ニル環は、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、アルコ
キシ、置換アルコキシ、カルボニル、カルボキシ、アミ
ノ、およびアルキルアミノ基から独立して選ばれる他の
環置換基R7を含んでもよい。若干の構造例を以下に示
す。
【0043】
【0044】OX基は、水酸基、O−M+基(ただし、
Mは水素原子、アルカリ金属イオン、第四級アンモニウ
ムおよび第四級ホスフォニウム・イオンからなる群から
選ばれる)、OOCR8基(ただし、R8は、2ないし
8の炭素原子を有し、かつ随意にヘテロ原子を含有する
アルキルおよびアリール基からなる群から選ばれる)、
OPO3 −2塩、OSO3 −塩、β−D−ガラクトシド
キシ、およびβ−D−グルクロニジロキシ基からなる群
から選ばれる。OX基がOPO3 ー2塩またはOSO3 ー塩
のようなイオン系の基である場合には、R1における水
溶性増加基もこの基であってはならない。水溶液中のア
ルカリ性ホスファターゼの化学発光検出用として特に有
効なジオキセタン化合物は、下に示すジオキセタン1で
ある。ジオキセタン1の脱リン酸によって、下に示すヒ
ドロキシ・ジオキセタン2が得られる。
Mは水素原子、アルカリ金属イオン、第四級アンモニウ
ムおよび第四級ホスフォニウム・イオンからなる群から
選ばれる)、OOCR8基(ただし、R8は、2ないし
8の炭素原子を有し、かつ随意にヘテロ原子を含有する
アルキルおよびアリール基からなる群から選ばれる)、
OPO3 −2塩、OSO3 −塩、β−D−ガラクトシド
キシ、およびβ−D−グルクロニジロキシ基からなる群
から選ばれる。OX基がOPO3 ー2塩またはOSO3 ー塩
のようなイオン系の基である場合には、R1における水
溶性増加基もこの基であってはならない。水溶液中のア
ルカリ性ホスファターゼの化学発光検出用として特に有
効なジオキセタン化合物は、下に示すジオキセタン1で
ある。ジオキセタン1の脱リン酸によって、下に示すヒ
ドロキシ・ジオキセタン2が得られる。
【0045】比較のために、イオン化可能な基を一つだ
け組み込んだ下式のジオキセタン3を調製した。このジ
オキセタンは、上に述べたキャリオーバーの問題を解決
できなかった。
け組み込んだ下式のジオキセタン3を調製した。このジ
オキセタンは、上に述べたキャリオーバーの問題を解決
できなかった。
【0046】本発明の他面にあっては、増強された化学
発光が得られる組成物を提供する。増強された組成物
は、最高の分析感度が求められる検定にあって効果を発
揮する。自然のジオキセタン分解による外因性の発光を
維持または減少させながら、このジオキセタン組成物反
応の化学発光効率を高めることが、感度を高めあるいは
改善し得る一つの方法である。
発光が得られる組成物を提供する。増強された組成物
は、最高の分析感度が求められる検定にあって効果を発
揮する。自然のジオキセタン分解による外因性の発光を
維持または減少させながら、このジオキセタン組成物反
応の化学発光効率を高めることが、感度を高めあるいは
改善し得る一つの方法である。
【0047】本発明は、また、トリガーされて化学発光
を生じ得る安定した1,2−ジオキセタンおよびエンハ
ンサーを含む組成物に関する。高度化された化学発光を
得るための組成物は、水溶液中に上で述べたジオキセタ
ンを含み、また、エンハンサーの不在の場合に生成され
る量に比較してジオキセタンを活性化試剤と反応させて
生成される光の量を増大させる非ポリマー・カチオン系
エンハンサー物質を含むものである。該エンハンサー物
質は、下の式のジカチオン系界面活性剤であることが好
ましい。 ただし、各Aは、PおよびN原子から独立に選ばれ、L
inkは、置換および未置換アリール、アルキル、アル
ケニル、アルキニル基から成る群から選ばれる少なくと
も二つの炭素原子を含む有機結合基で、ヘテロ原子を含
むことができ、Rは、1ないし20の炭素原子を含むア
ラルキルまたは低級アルキルから選ばれ、Yは、アニオ
ンである。とくに好ましくは、該エンハンサー物質は、
下の式をもつジカチオン系界面活性剤である。 ただし、Linkは、フェニレンである。
を生じ得る安定した1,2−ジオキセタンおよびエンハ
ンサーを含む組成物に関する。高度化された化学発光を
得るための組成物は、水溶液中に上で述べたジオキセタ
ンを含み、また、エンハンサーの不在の場合に生成され
る量に比較してジオキセタンを活性化試剤と反応させて
生成される光の量を増大させる非ポリマー・カチオン系
エンハンサー物質を含むものである。該エンハンサー物
質は、下の式のジカチオン系界面活性剤であることが好
ましい。 ただし、各Aは、PおよびN原子から独立に選ばれ、L
inkは、置換および未置換アリール、アルキル、アル
ケニル、アルキニル基から成る群から選ばれる少なくと
も二つの炭素原子を含む有機結合基で、ヘテロ原子を含
むことができ、Rは、1ないし20の炭素原子を含むア
ラルキルまたは低級アルキルから選ばれ、Yは、アニオ
ンである。とくに好ましくは、該エンハンサー物質は、
下の式をもつジカチオン系界面活性剤である。 ただし、Linkは、フェニレンである。
【0048】増強された化学発光を得るための本発明の
組成物は、随意に少なくとも一つの蛍光物質を補足的エ
ンハンサーとして含むことができる。有用な蛍光物質
は、エネルギー移転によって生成される光の量を増大さ
せることのできる化合物である。アニオン系蛍光物質
は、カチオン系エンハンサーとの好ましい静電相互作用
のためにとくに有効であると考えられる。とくに好まし
い蛍光物質としては、ピラニンおよびフルオレセインが
挙げられるが、これらに限られるものではない。
組成物は、随意に少なくとも一つの蛍光物質を補足的エ
ンハンサーとして含むことができる。有用な蛍光物質
は、エネルギー移転によって生成される光の量を増大さ
せることのできる化合物である。アニオン系蛍光物質
は、カチオン系エンハンサーとの好ましい静電相互作用
のためにとくに有効であると考えられる。とくに好まし
い蛍光物質としては、ピラニンおよびフルオレセインが
挙げられるが、これらに限られるものではない。
【0049】
【実施例】以下、本発明を実施例に基づき説明する。例1. ジオキセタン1の調製 このジオキセタンは、以下で説明する一連の反応によっ
て調製された。中間のアルケン[(3−ヒドロキシフェ
ニル)−(2−ヨードエトキシ)メチレン]トリシクロ
[3,3,1,13,7 ]デカンまでの合成は、基本的
に、アメリカ合衆国特許第5013827号および第5
068339号に記載のとおりに行なった。
て調製された。中間のアルケン[(3−ヒドロキシフェ
ニル)−(2−ヨードエトキシ)メチレン]トリシクロ
[3,3,1,13,7 ]デカンまでの合成は、基本的
に、アメリカ合衆国特許第5013827号および第5
068339号に記載のとおりに行なった。
【0050】 (a)2−クロロエチル3−ヒドロキシベンゾエートの
合成 3−ヒドロキシ安息香酸(0.47モル)65gを50
0mLの2−クロロエタノールと3mLのH2SO4に
溶かした溶液を4時間還流させた。冷却した溶液を50
0mLの水で希釈し、酢酸エチル(3×250mL)で
抽出した。酢酸エチルは、NaHCO3で二度抽出した
後水で抽出した。酢酸エチル溶液を低圧下で乾燥させ蒸
発させ、濃厚な油としての生成物85gを得た。 1 H NMR(CDCl3)δ3.814(t、2H、
J=6Hz)、4.569(t、2H、J=6Hz)、
5.36(br s、1H)、7.06〜7.67
(m、4H)。
合成 3−ヒドロキシ安息香酸(0.47モル)65gを50
0mLの2−クロロエタノールと3mLのH2SO4に
溶かした溶液を4時間還流させた。冷却した溶液を50
0mLの水で希釈し、酢酸エチル(3×250mL)で
抽出した。酢酸エチルは、NaHCO3で二度抽出した
後水で抽出した。酢酸エチル溶液を低圧下で乾燥させ蒸
発させ、濃厚な油としての生成物85gを得た。 1 H NMR(CDCl3)δ3.814(t、2H、
J=6Hz)、4.569(t、2H、J=6Hz)、
5.36(br s、1H)、7.06〜7.67
(m、4H)。
【0051】 (b)2−クロロエチル3−t−ブチルジメチルシリロ
キシベンゾエートの合成 工程(a)で得たエステル10g(50mモル)、塩化
t−ブチルジメチルシリル(8.25g、55mモル)
およびイミダゾル(4.76g、70mモル)を100
mLのDMFに溶かした溶液をアルゴン雰囲気下で1時
間攪拌した。溶液を100mLの水に注ぎ、エーテル
(3×50mL)で抽出した。複合エーテル溶液を20
mLの水で抽出した。有機層を乾燥させ蒸発させて18
gの油を得、この油を、ヘキサン中0−2%の酢酸エチ
ルを用いたカラム・クロマトグラフィーで精製し、無色
の油としての生成物14.4gを得た。1 H NMR(CDCl3) δ0.218(s、6
H)、0.995(s、9H)、3.81(t、2
H)、4.56(t、2H)、7.05〜7.65
(m、4H)。
キシベンゾエートの合成 工程(a)で得たエステル10g(50mモル)、塩化
t−ブチルジメチルシリル(8.25g、55mモル)
およびイミダゾル(4.76g、70mモル)を100
mLのDMFに溶かした溶液をアルゴン雰囲気下で1時
間攪拌した。溶液を100mLの水に注ぎ、エーテル
(3×50mL)で抽出した。複合エーテル溶液を20
mLの水で抽出した。有機層を乾燥させ蒸発させて18
gの油を得、この油を、ヘキサン中0−2%の酢酸エチ
ルを用いたカラム・クロマトグラフィーで精製し、無色
の油としての生成物14.4gを得た。1 H NMR(CDCl3) δ0.218(s、6
H)、0.995(s、9H)、3.81(t、2
H)、4.56(t、2H)、7.05〜7.65
(m、4H)。
【0052】 (c)[(2−クロロエトキシ)−(3−t−ブチルジ
メチルシリロキシフェニル)メチレン]トリシクロ
[3,3,1,13,7 ]デカンの合成 三ネックのフラスコをアルゴンで清浄し、無水THF4
00mLを入れた。攪拌しながら三塩化チタニウム(4
8g、0.3モル)を加え、フラスコを氷浴で冷やし
た。水素化リチウム・アルミニウム(6.0g、0.1
6モル)を少量加えて短時間発熱反応を起こさせた。L
AHを全部加えた後、冷却浴を外し、混合物を室温まで
暖めた。トリエチルアミン(30mL)を添加し、黒色
の混合物をアルゴン雰囲気下で1.5時間還流させた。
還流を続けながら、50mLの乾燥THFの中のアダマ
ンタノン(14g、93mモル)および2−クロロエチ
ル3−t−ブチルジメチルシリロキシベンゾエート(1
0g、31mモル)を滴下した。さらに10分後、TL
C(ヘキサン中の5%酢酸エチル)によって、エステル
が新しい物質に変化したことが示されたので、混合物を
冷却し、ヘキサン3Lで希釈した。ヘキサンの上澄みを
とり、濾紙で濾過し、蒸発させたところ、油が残ったの
で、これをシリカ・ゲル上のカラム・クロマトグラフィ
ーで精製し、ヘキサン中0−3%の酢酸エチルで溶出
し、アルケン8.68g(エステル・ベースで65%)
を得た。1 H NMR(CDCl3) δ0.195(s、6
H)、0.983(s、9H)、1.78〜1.98
(m、12H)、2.65(br s、1H)、3.3
34(br s、1H)、3.55(t、2H)、3.
66(t、2H)、6.85〜7.29(m、4H)。
メチルシリロキシフェニル)メチレン]トリシクロ
[3,3,1,13,7 ]デカンの合成 三ネックのフラスコをアルゴンで清浄し、無水THF4
00mLを入れた。攪拌しながら三塩化チタニウム(4
8g、0.3モル)を加え、フラスコを氷浴で冷やし
た。水素化リチウム・アルミニウム(6.0g、0.1
6モル)を少量加えて短時間発熱反応を起こさせた。L
AHを全部加えた後、冷却浴を外し、混合物を室温まで
暖めた。トリエチルアミン(30mL)を添加し、黒色
の混合物をアルゴン雰囲気下で1.5時間還流させた。
還流を続けながら、50mLの乾燥THFの中のアダマ
ンタノン(14g、93mモル)および2−クロロエチ
ル3−t−ブチルジメチルシリロキシベンゾエート(1
0g、31mモル)を滴下した。さらに10分後、TL
C(ヘキサン中の5%酢酸エチル)によって、エステル
が新しい物質に変化したことが示されたので、混合物を
冷却し、ヘキサン3Lで希釈した。ヘキサンの上澄みを
とり、濾紙で濾過し、蒸発させたところ、油が残ったの
で、これをシリカ・ゲル上のカラム・クロマトグラフィ
ーで精製し、ヘキサン中0−3%の酢酸エチルで溶出
し、アルケン8.68g(エステル・ベースで65%)
を得た。1 H NMR(CDCl3) δ0.195(s、6
H)、0.983(s、9H)、1.78〜1.98
(m、12H)、2.65(br s、1H)、3.3
34(br s、1H)、3.55(t、2H)、3.
66(t、2H)、6.85〜7.29(m、4H)。
【0053】 (d)[(2−クロロエトキシ)−(3−ヒドロキシフ
ェニル)メチレン]トリシクロ[3,3,1,13,7]
デカンの合成 シリル保護アルケン(8.0g、19mモル)を乾燥T
HF100mLの中に溶解させ、フッ化テトラブチルア
ンモニウム5.2gと反応させた。15分間攪拌した
後、溶液を蒸発させ、残留物をエーテル100mLと水
100mLに分けて溶解させた。水溶液は、三つのエー
テル100mL部分で抽出した。複合有機溶液は、三つ
の水100mL部分で洗い、乾燥させ、蒸発させた。残
留物を、ヘキサン中5−20%の酢酸エチルを用いてク
ロマトグラフにかけた。これによって油性の生成物4.
78gを得た。1 H NMR(CDCl3) δ1.78〜1.98
(m、12H)、2.67(br s、1H)、3.3
4(br s、1H)、3.55(t、2H)、3.6
9(t、2H)、4.91(br s、1H)、6.7
7〜7.19(m、4H)。
ェニル)メチレン]トリシクロ[3,3,1,13,7]
デカンの合成 シリル保護アルケン(8.0g、19mモル)を乾燥T
HF100mLの中に溶解させ、フッ化テトラブチルア
ンモニウム5.2gと反応させた。15分間攪拌した
後、溶液を蒸発させ、残留物をエーテル100mLと水
100mLに分けて溶解させた。水溶液は、三つのエー
テル100mL部分で抽出した。複合有機溶液は、三つ
の水100mL部分で洗い、乾燥させ、蒸発させた。残
留物を、ヘキサン中5−20%の酢酸エチルを用いてク
ロマトグラフにかけた。これによって油性の生成物4.
78gを得た。1 H NMR(CDCl3) δ1.78〜1.98
(m、12H)、2.67(br s、1H)、3.3
4(br s、1H)、3.55(t、2H)、3.6
9(t、2H)、4.91(br s、1H)、6.7
7〜7.19(m、4H)。
【0054】 (e)[(3−ヒドロキシフェニル)−(2−ヨードエ
トキシ)メチレン]トリシクロ[3,3,1,13,7]
デカンの合成 クロロエトキシアルケン(2g)を無水アセトン30m
L中に溶解した。ヨウ化ナトリウム(9.3g)を加え
て溶液を4日間還流させた。冷却後、沈殿物を濾過し、
わずかなCH2Cl2で洗浄した。洗浄液とアセトンを組
み合わせて蒸発させた。残留物をCH2Cl2中に再溶解
し、水で洗浄し、乾燥させた。粗物質を、ヘキサン中2
5%の酢酸エチルを用いてクロマトグラフにかけた。わ
ずかに黄色い油の収量は93%であった。1 H NMR(CDCl3) δ1.78〜1.98
(m、12H)、2.65(br s、1H)、3.1
9(t、2H)、3.35(br s、1H)、3.6
9(t、2H)、4.90(br s、1H)、6.7
5〜7.24(m、4H)。
トキシ)メチレン]トリシクロ[3,3,1,13,7]
デカンの合成 クロロエトキシアルケン(2g)を無水アセトン30m
L中に溶解した。ヨウ化ナトリウム(9.3g)を加え
て溶液を4日間還流させた。冷却後、沈殿物を濾過し、
わずかなCH2Cl2で洗浄した。洗浄液とアセトンを組
み合わせて蒸発させた。残留物をCH2Cl2中に再溶解
し、水で洗浄し、乾燥させた。粗物質を、ヘキサン中2
5%の酢酸エチルを用いてクロマトグラフにかけた。わ
ずかに黄色い油の収量は93%であった。1 H NMR(CDCl3) δ1.78〜1.98
(m、12H)、2.65(br s、1H)、3.1
9(t、2H)、3.35(br s、1H)、3.6
9(t、2H)、4.90(br s、1H)、6.7
5〜7.24(m、4H)。
【0055】 (e)[(3,3−ビスカルボエトキシ)プロポキシ)
−(3−ヒドロキシ−フェニル)メチレン]トリシクロ
[3,3,1,13,7]デカンの合成 マロン酸ジエチル(3.12g)をナトリウム・エトキ
シド21%のエタノール溶液11.65mLを含む無水
エタノール25mLに溶解した。溶液を氷浴中で冷却し
て反応混合物にヨードエトキシ・アルケン(3.2g)
をエタノール溶液として滴下した。反応系を一夜還流さ
せた。冷却後、混合物を蒸発させ、酢酸エチルに再溶解
した。酢酸エチル溶液を水で抽出し、乾燥させ、蒸発さ
せた。粗物質を、ヘキサン中15−25%の酢酸エチル
を用いてクロマトグラフにかけた。生成物の収量はほぼ
42−48%であった。1 H NMR(CDCl3)δ1.24(t、6H)、
1.78〜1.97(m、12H)、2.11〜2.1
7(q、2H)、2.66(br s、1H)、3.2
1(br s、1H)、3.42(t、2H)、3.6
3(t、1H)、4.13〜4.22(m、4H)、
5.00(br s、1H)、6.75〜7.21
(m、4H)。
−(3−ヒドロキシ−フェニル)メチレン]トリシクロ
[3,3,1,13,7]デカンの合成 マロン酸ジエチル(3.12g)をナトリウム・エトキ
シド21%のエタノール溶液11.65mLを含む無水
エタノール25mLに溶解した。溶液を氷浴中で冷却し
て反応混合物にヨードエトキシ・アルケン(3.2g)
をエタノール溶液として滴下した。反応系を一夜還流さ
せた。冷却後、混合物を蒸発させ、酢酸エチルに再溶解
した。酢酸エチル溶液を水で抽出し、乾燥させ、蒸発さ
せた。粗物質を、ヘキサン中15−25%の酢酸エチル
を用いてクロマトグラフにかけた。生成物の収量はほぼ
42−48%であった。1 H NMR(CDCl3)δ1.24(t、6H)、
1.78〜1.97(m、12H)、2.11〜2.1
7(q、2H)、2.66(br s、1H)、3.2
1(br s、1H)、3.42(t、2H)、3.6
3(t、1H)、4.13〜4.22(m、4H)、
5.00(br s、1H)、6.75〜7.21
(m、4H)。
【0056】 (f)[(3,3−ビスカルボエトキシ)プロポキシ)
−(3−ビス−(2−シアノエチル)ホスフォリロキ
シ)フェニル)メチレン]トリシクロ[3,3,1,1
3,7]デカンの合成 アルゴン層の下にCH2Cl230mLを入れたフラスコ
を氷浴中で冷却した。ピリジン(6.95mL)を加
え、さらにPOCl3(2.47mL)をゆっくり加
え、15分間連続して攪拌した。10mLのCH2Cl2
と5mLのピリジン中に工程(e)で得たアルケンを加
えた溶液を滴下した。氷浴を外し、溶液を2時間攪拌し
た。この溶液にピリジン6.95mLおよび2−シアノ
エタノール6.1gを加えた。反応混合物を一夜攪拌し
て黄色い沈殿物を得た。この混合物を200mLのCH
2Cl2に加え、3×75mLの水で洗浄した。CH2C
l2抽出物を乾燥させ蒸発させた。粗物質を、ヘキサン
中70%の酢酸エチルを用いてクロマトグラフィーで精
製した。1 H NMR(CDCl3) δ1.25(t、6H)、
1.74〜1.98(m、12H)、2.10〜2.1
7(q、2H)、2.61(br s、1H)、2.8
1(t、4H)、3.21(br s、1H)、3.4
2(t、2H)、3.59(t、1H)、4.11〜
4.22(m、4H)、4.39〜4.46(m、4
H)、7.14〜7.36(m、4H)。
−(3−ビス−(2−シアノエチル)ホスフォリロキ
シ)フェニル)メチレン]トリシクロ[3,3,1,1
3,7]デカンの合成 アルゴン層の下にCH2Cl230mLを入れたフラスコ
を氷浴中で冷却した。ピリジン(6.95mL)を加
え、さらにPOCl3(2.47mL)をゆっくり加
え、15分間連続して攪拌した。10mLのCH2Cl2
と5mLのピリジン中に工程(e)で得たアルケンを加
えた溶液を滴下した。氷浴を外し、溶液を2時間攪拌し
た。この溶液にピリジン6.95mLおよび2−シアノ
エタノール6.1gを加えた。反応混合物を一夜攪拌し
て黄色い沈殿物を得た。この混合物を200mLのCH
2Cl2に加え、3×75mLの水で洗浄した。CH2C
l2抽出物を乾燥させ蒸発させた。粗物質を、ヘキサン
中70%の酢酸エチルを用いてクロマトグラフィーで精
製した。1 H NMR(CDCl3) δ1.25(t、6H)、
1.74〜1.98(m、12H)、2.10〜2.1
7(q、2H)、2.61(br s、1H)、2.8
1(t、4H)、3.21(br s、1H)、3.4
2(t、2H)、3.59(t、1H)、4.11〜
4.22(m、4H)、4.39〜4.46(m、4
H)、7.14〜7.36(m、4H)。
【0057】 (g)[(3,3−ビスカルボキシプロポキシ)−(3
−ホスフォリロキシフェニル)メチレン]トリシクロ
[3,3,1,13,7]デカン 4ナトリウム塩の合成 工程(f)で得られたアルケン(3.9g)をアセトン
12mL中に溶解した。水3mL中水酸化ナトリウム
1.04gの溶液を加えた。溶液を19時間攪拌し、そ
の間にアセトン3mLをフラスコに加えた。液体の上澄
みをとり、他のアセトンでよく洗浄した。真空中で乾燥
させたところ、白色の固体が得られた。1 H NMR(D2O) δ1.72〜2.07(m、1
4H)、2.59(br s、1H)、3.14〜3.
18(m、2H)、3.40(t、2H)、7.01〜
7.34(m、4H)。
−ホスフォリロキシフェニル)メチレン]トリシクロ
[3,3,1,13,7]デカン 4ナトリウム塩の合成 工程(f)で得られたアルケン(3.9g)をアセトン
12mL中に溶解した。水3mL中水酸化ナトリウム
1.04gの溶液を加えた。溶液を19時間攪拌し、そ
の間にアセトン3mLをフラスコに加えた。液体の上澄
みをとり、他のアセトンでよく洗浄した。真空中で乾燥
させたところ、白色の固体が得られた。1 H NMR(D2O) δ1.72〜2.07(m、1
4H)、2.59(br s、1H)、3.14〜3.
18(m、2H)、3.40(t、2H)、7.01〜
7.34(m、4H)。
【0058】 (h)[4−(3,3−ビスカルボキシ)プロポキシ)
−4−(3−ホスフォリルオキシフェニル)スピロ
[1,2−ジオキセタン−3,2’−トリシクロ[3,
3,1,13,7]デカン] 4ナトリウム塩の合成 工程(g)で得られたアルケン(2.5g)をD2O 5
0mL中に溶解した。p−ジオキサン50mL中にポリ
マー結合ローズ・ベンガル(500mg)を懸濁させ、
上の水溶液に加えた。反応混合物を5−7℃に冷却し、
酸素の沸騰を起こさせ、混合物にカプトン(KAPTO
N)(デュポン)の5milのシートを介してナトリウ
ム・ランプを照射した。合計18時間後、濾過してポリ
マーのビーズ(beads)を除き、容器をメタノール
で洗浄し、混ぜ合せた溶液を25mLまで濃縮させた。
残留溶媒は、凍結乾燥で除去した。
−4−(3−ホスフォリルオキシフェニル)スピロ
[1,2−ジオキセタン−3,2’−トリシクロ[3,
3,1,13,7]デカン] 4ナトリウム塩の合成 工程(g)で得られたアルケン(2.5g)をD2O 5
0mL中に溶解した。p−ジオキサン50mL中にポリ
マー結合ローズ・ベンガル(500mg)を懸濁させ、
上の水溶液に加えた。反応混合物を5−7℃に冷却し、
酸素の沸騰を起こさせ、混合物にカプトン(KAPTO
N)(デュポン)の5milのシートを介してナトリウ
ム・ランプを照射した。合計18時間後、濾過してポリ
マーのビーズ(beads)を除き、容器をメタノール
で洗浄し、混ぜ合せた溶液を25mLまで濃縮させた。
残留溶媒は、凍結乾燥で除去した。
【0059】例2. ジオキセタン3の調製 このジオキセタンは、以下で説明する一連の反応によっ
て調製された。中間のアルケン[(3−カルボキシポロ
ポキシ)−(3−ヒドロキシフェニル)メチレン]トリ
シクロ[3,3,1,13,7]デカンまでの合成は、基
本的に、ヨーロッパ公開特許出願第91113601.
8号に記載のとおりに行なった。
て調製された。中間のアルケン[(3−カルボキシポロ
ポキシ)−(3−ヒドロキシフェニル)メチレン]トリ
シクロ[3,3,1,13,7]デカンまでの合成は、基
本的に、ヨーロッパ公開特許出願第91113601.
8号に記載のとおりに行なった。
【0060】 (a)3−クロロプロピル3−ヒドロキシベンゾエート
の合成 3−クロロ−1−プロパノール(161.6g、1.7
1モル)を3−ヒドロキシ安息香酸(40.0g、0.
29モル)および触媒量の硫酸と合計9時間還流させ
た。過剰なアルコールは、真空蒸留で除去した。得られ
たオレンジ色の油を400mLの水で希釈し、pH7に
中和した。溶液は、酢酸エチルで(3×250mL)で
抽出した。有機層を100mLのブラインで洗浄し、無
水硫酸ナトリウムの上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃
縮させた。生成物をカラム・クロマトグラフィーで精製
し、67.5gの生成物を得たが、これは、出発材料の
アルコールを少量含んだものであった。1 H NMR(CDCl3) δ2.24(quint、
2H)、3.70(t、2H)、4.48(t、2H、
J=6Hz)、5.55(s、1H)、7.05〜7.
63(m、4H)。
の合成 3−クロロ−1−プロパノール(161.6g、1.7
1モル)を3−ヒドロキシ安息香酸(40.0g、0.
29モル)および触媒量の硫酸と合計9時間還流させ
た。過剰なアルコールは、真空蒸留で除去した。得られ
たオレンジ色の油を400mLの水で希釈し、pH7に
中和した。溶液は、酢酸エチルで(3×250mL)で
抽出した。有機層を100mLのブラインで洗浄し、無
水硫酸ナトリウムの上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃
縮させた。生成物をカラム・クロマトグラフィーで精製
し、67.5gの生成物を得たが、これは、出発材料の
アルコールを少量含んだものであった。1 H NMR(CDCl3) δ2.24(quint、
2H)、3.70(t、2H)、4.48(t、2H、
J=6Hz)、5.55(s、1H)、7.05〜7.
63(m、4H)。
【0061】 (b)3−クロロプロピル 3−(tert−ブチルジ
メチルシリロキシ)ベンゾエートの合成 3−クロロプロピル 3−ヒドロキシベンゾエート(6
7.5g)を無水DMF(100mL)中に、つづいて
塩化t−ブチル−ジメチルシリル(52.11g)中に
溶解した。反応混合物をArのもとで出発材料がなくな
るまで攪拌した。反応混合物を水(500mL)で希釈
し、ヘキサン(4×750mL)およびさらに2×25
0mLの酢酸エチルで抽出した。合体した有機溶液を硫
酸ナトリウムの上で乾燥し、減圧下で濃縮させ、再び5
00mLの水およびヘキサンの間に分割した。有機溶液
を乾燥、蒸発させて、白色結晶状のシリル化エステルを
得た(89.64g、94%)。1 H NMR(CDCl3) δ0.219(s、6
H)、0.998(s、9H)、2.24(quin
t、2H)、3.70(t、2H)、4.470(t、
2H)、7.03〜7.64(m、4H)。
メチルシリロキシ)ベンゾエートの合成 3−クロロプロピル 3−ヒドロキシベンゾエート(6
7.5g)を無水DMF(100mL)中に、つづいて
塩化t−ブチル−ジメチルシリル(52.11g)中に
溶解した。反応混合物をArのもとで出発材料がなくな
るまで攪拌した。反応混合物を水(500mL)で希釈
し、ヘキサン(4×750mL)およびさらに2×25
0mLの酢酸エチルで抽出した。合体した有機溶液を硫
酸ナトリウムの上で乾燥し、減圧下で濃縮させ、再び5
00mLの水およびヘキサンの間に分割した。有機溶液
を乾燥、蒸発させて、白色結晶状のシリル化エステルを
得た(89.64g、94%)。1 H NMR(CDCl3) δ0.219(s、6
H)、0.998(s、9H)、2.24(quin
t、2H)、3.70(t、2H)、4.470(t、
2H)、7.03〜7.64(m、4H)。
【0062】 (c)[(3−tert−ブチルジメチルシリロキシフ
ェニル)−(3−クロロプロポキシ)メチレン]トリシ
クロ[3,3,1,13,7]デカンの合成 乾燥させた3Lの三ネックのフラスコの中に入れた乾燥
したTHF(500mL)に、0℃、アルゴンの雰囲気
下で三塩化チタニウム(25.8g、0.167モル)
を加えた。水素化リチウム・アルミニウム(3.01
g、0.084モル)を少量加えて激しく攪拌した。反
応混合物を室温まで暖め、トリエチルアミン23.3m
Lを滴下した。添加終了後、反応混合物を2時間還流さ
せた。加熱を止め、還流混合物に、100mLの乾燥T
HFに3−クロロプロピル−3−(tert−ブチルジ
メチルシリロキシ)ベンゾエート(5.28g、0.0
16モル)およびアダマンタノン(7.23g、0.0
48モル)を溶解した溶液を45分かけて滴下した。反
応混合物を、室温で一夜攪拌した。黒色の混合物を水で
希釈し、3×300mLのヘキサンで抽出した。合体し
た有機溶液を濾過し、硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下
で濃縮させた。残留物をフラッシュ・クロマトグラフィ
ー(2%酢酸エチル/ヘキサン)で一部精製し、生成物
として粘着性の油を得た。これは、次の工程に使用し
た。1 H NMR(CDCl3) δ0.200(s、6
H)、0.988(s、9H)、1.66〜2.01
(m、14H)、2.63(br s、1H)、3.2
3(br s、1H)、3.538(t、2H、J=
5.7Hz)、3.640(t、2H、J=6.6H
z)、6.75〜7.22(m、4H)。
ェニル)−(3−クロロプロポキシ)メチレン]トリシ
クロ[3,3,1,13,7]デカンの合成 乾燥させた3Lの三ネックのフラスコの中に入れた乾燥
したTHF(500mL)に、0℃、アルゴンの雰囲気
下で三塩化チタニウム(25.8g、0.167モル)
を加えた。水素化リチウム・アルミニウム(3.01
g、0.084モル)を少量加えて激しく攪拌した。反
応混合物を室温まで暖め、トリエチルアミン23.3m
Lを滴下した。添加終了後、反応混合物を2時間還流さ
せた。加熱を止め、還流混合物に、100mLの乾燥T
HFに3−クロロプロピル−3−(tert−ブチルジ
メチルシリロキシ)ベンゾエート(5.28g、0.0
16モル)およびアダマンタノン(7.23g、0.0
48モル)を溶解した溶液を45分かけて滴下した。反
応混合物を、室温で一夜攪拌した。黒色の混合物を水で
希釈し、3×300mLのヘキサンで抽出した。合体し
た有機溶液を濾過し、硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下
で濃縮させた。残留物をフラッシュ・クロマトグラフィ
ー(2%酢酸エチル/ヘキサン)で一部精製し、生成物
として粘着性の油を得た。これは、次の工程に使用し
た。1 H NMR(CDCl3) δ0.200(s、6
H)、0.988(s、9H)、1.66〜2.01
(m、14H)、2.63(br s、1H)、3.2
3(br s、1H)、3.538(t、2H、J=
5.7Hz)、3.640(t、2H、J=6.6H
z)、6.75〜7.22(m、4H)。
【0063】 (d)[(3−クロロプロポキシ)−(3−ヒドロキシ
フェニル)メチレン]トリシクロ[3,3,1,
13,7]デカンの合成 シリル保護アルケン(5.36g、わずかに不純)を乾
燥THF75mLの中に溶解させ、Arの雰囲気下にお
いた。TBAF(4.16g、13.2mモル)を添加
し、反応混合物を室温で30分間攪拌した。溶媒を蒸発
させ、残留物を水100mLに溶解した。溶液を3×1
25mLのエーテルで抽出し、有機層をブラインで洗浄
して硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を減圧下で除去
し、ヘキサン中10%の酢酸エチルを用いてカラム・ク
ロマトグラフィーにかけた結果、保護を外したアルケン
2.05gを得た。1 H NMR(CDCl3) δ1.78〜2.01
(m、14H)、2.65(br s、1H)、3.2
2(br s、1H)、3.541(t、2H、J=6
Hz)、3.644(t、2H、J=6Hz)、5.3
0(s、1H)、6.75〜7.24(m、4H)。
フェニル)メチレン]トリシクロ[3,3,1,
13,7]デカンの合成 シリル保護アルケン(5.36g、わずかに不純)を乾
燥THF75mLの中に溶解させ、Arの雰囲気下にお
いた。TBAF(4.16g、13.2mモル)を添加
し、反応混合物を室温で30分間攪拌した。溶媒を蒸発
させ、残留物を水100mLに溶解した。溶液を3×1
25mLのエーテルで抽出し、有機層をブラインで洗浄
して硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を減圧下で除去
し、ヘキサン中10%の酢酸エチルを用いてカラム・ク
ロマトグラフィーにかけた結果、保護を外したアルケン
2.05gを得た。1 H NMR(CDCl3) δ1.78〜2.01
(m、14H)、2.65(br s、1H)、3.2
2(br s、1H)、3.541(t、2H、J=6
Hz)、3.644(t、2H、J=6Hz)、5.3
0(s、1H)、6.75〜7.24(m、4H)。
【0064】 (e)[(3−シアノプロポキシ)−(3−ヒドロキシ
フェニル)メチレン]トリシクロ[3,3,1,
13,7]デカンの合成 無水DMSO(4mL)中にクロロアルケン(815m
g、2.4mモル)を加えた溶液にシアン化ナトリウム
(300mg、6.1mモル)を加えて紫色の溶液を生
成し、これを120℃で1時間加熱した。冷やした溶液
をエーテル(50mL)で希釈し、水(3×25mL)
で洗浄した。エーテル層を減圧下で乾燥、濃縮させた。
油状の生成物の収量は、85%であった。1 H NMR(CDCl3) δ1.77〜1.97
(m、14H)、2.49(t、2H)、2.65(b
r s、1H)、3.19(br s、1H)、3.4
9(t、2H)、5.04(s、1H)、6.75〜
7.24(m、4H)。
フェニル)メチレン]トリシクロ[3,3,1,
13,7]デカンの合成 無水DMSO(4mL)中にクロロアルケン(815m
g、2.4mモル)を加えた溶液にシアン化ナトリウム
(300mg、6.1mモル)を加えて紫色の溶液を生
成し、これを120℃で1時間加熱した。冷やした溶液
をエーテル(50mL)で希釈し、水(3×25mL)
で洗浄した。エーテル層を減圧下で乾燥、濃縮させた。
油状の生成物の収量は、85%であった。1 H NMR(CDCl3) δ1.77〜1.97
(m、14H)、2.49(t、2H)、2.65(b
r s、1H)、3.19(br s、1H)、3.4
9(t、2H)、5.04(s、1H)、6.75〜
7.24(m、4H)。
【0065】 (f)[(3−カルボキシプロポキシ)−(3−ヒドロ
キシフェニル)メチレン]トリシクロ[3,3,1,1
3,7]デカンの合成 ニトリル(0.67g、2mモル)に水酸化ナトリウム
(2N溶液7mL)を加え、反応混合物を36時間還流
させた。溶液を室温に冷やし、酢酸(1eq.)で中和
した。混合物を酢酸エチルで抽出した。有機層を、水で
3回、次にブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥さ
せた。生成物を減圧下で濃縮させて油状とし、酸(0.
64g、91%)を得た。1 H NMR(CDCl3) δ1.78〜1.97
(m、14H)、2.47(t、2H)、2.65(b
r s、1H)、3.22(br s、1H)、3.4
5(t、2H)、5.83(s、1H)、6.74〜
7.22(m、4H)。
キシフェニル)メチレン]トリシクロ[3,3,1,1
3,7]デカンの合成 ニトリル(0.67g、2mモル)に水酸化ナトリウム
(2N溶液7mL)を加え、反応混合物を36時間還流
させた。溶液を室温に冷やし、酢酸(1eq.)で中和
した。混合物を酢酸エチルで抽出した。有機層を、水で
3回、次にブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥さ
せた。生成物を減圧下で濃縮させて油状とし、酸(0.
64g、91%)を得た。1 H NMR(CDCl3) δ1.78〜1.97
(m、14H)、2.47(t、2H)、2.65(b
r s、1H)、3.22(br s、1H)、3.4
5(t、2H)、5.83(s、1H)、6.74〜
7.22(m、4H)。
【0066】 (g)[(3−カルボメトキシプロポキシ)−(3−ヒ
ドロキシ−フェニル)メチレン]トリシクロ[3,3,
1,13,7]デカンの合成 前の工程のカルボン酸(660mg、1.9mモル)を
10mLのCH2Cl2に溶解した。DCC(597m
g、2.8mモル)、DMAP(23mg)、およびメ
タノール(1mL)を加え、30mLを入れたフラスコ
を氷浴中で冷却した。ピリジン(6.95mL)を加
え、溶液を18時間攪拌した。混合物を濾過して固体の
物質を除去し、蒸発させた。固体の残留物をエーテルに
懸濁させて濾過した。生成物をヘキサン中30%の酢酸
エチルを用いてカラム・クロマトグラフィーで精製し
た。1 H NMR(CDCl3) δ1.77〜1.96
(m、14H)、2.42(t、4H)、2.65(b
r s、1H)、3.22(br s、1H)、3.4
1(t、2H)、3.65(s、3H)、5.15(b
r s、1H)、6.74〜7.22(m、4H)。
ドロキシ−フェニル)メチレン]トリシクロ[3,3,
1,13,7]デカンの合成 前の工程のカルボン酸(660mg、1.9mモル)を
10mLのCH2Cl2に溶解した。DCC(597m
g、2.8mモル)、DMAP(23mg)、およびメ
タノール(1mL)を加え、30mLを入れたフラスコ
を氷浴中で冷却した。ピリジン(6.95mL)を加
え、溶液を18時間攪拌した。混合物を濾過して固体の
物質を除去し、蒸発させた。固体の残留物をエーテルに
懸濁させて濾過した。生成物をヘキサン中30%の酢酸
エチルを用いてカラム・クロマトグラフィーで精製し
た。1 H NMR(CDCl3) δ1.77〜1.96
(m、14H)、2.42(t、4H)、2.65(b
r s、1H)、3.22(br s、1H)、3.4
1(t、2H)、3.65(s、3H)、5.15(b
r s、1H)、6.74〜7.22(m、4H)。
【0067】 (h)[(3−カルボメトキシプロポキシ)−(3−ビ
ス−(2−シアノエチル)ホスフォリルオキシ)フェニ
ル)メチレン]トリシクロ[3,3,1,13,7]デカン
の合成 アルゴン層の下にCH2Cl25mLを入れたフラスコを
氷浴中で冷却した。ピリジン(0.5mL)を加え、さ
らにPOCl3 (465mg)をゆっくり加え、15分
間連続して攪拌した。1:1のCH2Cl2/ピリジン
0.5mgの中に工程(g)で得たアルケン(360m
g)の溶液を滴下した。氷浴を外し、溶液を135分間
攪拌した。この溶液にピリジン1.0mLおよび2−シ
アノエタノール0.69mLを加えた。反応混合物を4
時間攪拌して白色の沈殿物を得た。TLCによって二つ
の物質の生成が示された。さらにシアノエタノール20
0μLを加えて生じた沈殿物を溶解させようとしたが、
一夜攪拌しても効果がなかった。溶液を蒸発させて乾燥
させ、粗物質を、クロマトグラフィーで精製した。1 H NMR(CDCl3) δ1.79〜1.98
(m、14H)、2.41(t、2H)、2.61(b
r s、1H)、2.80(m、4H)、3.23(b
r s、1H)、3.41(t、2H)、3.65
(s、3H)、4.32〜4.48(m、4H)、7.
15〜7.37(m、4H)。
ス−(2−シアノエチル)ホスフォリルオキシ)フェニ
ル)メチレン]トリシクロ[3,3,1,13,7]デカン
の合成 アルゴン層の下にCH2Cl25mLを入れたフラスコを
氷浴中で冷却した。ピリジン(0.5mL)を加え、さ
らにPOCl3 (465mg)をゆっくり加え、15分
間連続して攪拌した。1:1のCH2Cl2/ピリジン
0.5mgの中に工程(g)で得たアルケン(360m
g)の溶液を滴下した。氷浴を外し、溶液を135分間
攪拌した。この溶液にピリジン1.0mLおよび2−シ
アノエタノール0.69mLを加えた。反応混合物を4
時間攪拌して白色の沈殿物を得た。TLCによって二つ
の物質の生成が示された。さらにシアノエタノール20
0μLを加えて生じた沈殿物を溶解させようとしたが、
一夜攪拌しても効果がなかった。溶液を蒸発させて乾燥
させ、粗物質を、クロマトグラフィーで精製した。1 H NMR(CDCl3) δ1.79〜1.98
(m、14H)、2.41(t、2H)、2.61(b
r s、1H)、2.80(m、4H)、3.23(b
r s、1H)、3.41(t、2H)、3.65
(s、3H)、4.32〜4.48(m、4H)、7.
15〜7.37(m、4H)。
【0068】 (i)[(3−カルボキシプロポキシ)−(3−ホスフ
ォリルオキシフェニル)メチレン]トリシクロ[3,
3,1,13,7]デカン3ナトリウム塩の合成 工程(h)で得られたアルケン(142mg)をアセト
ン4mL中に溶解した。<1mLの水に水酸化ナトリウ
ム36.4mgを溶かした溶液を加えた。溶液を20時
間攪拌し、沈殿物を生成させた。液体の上澄みをとり、
固体を他のアセトンでまた次にメタノールで洗浄した。
真空中で乾燥させたところ、白色の固体10mgが得ら
れた。1 H NMR(D2O) δ1.71〜1.95(m、1
4H)、2.23(t、2H)、2.62(br s、
1H)、3.18(br s、1H)、3.53(t、
2H)、7.04〜7.36(m、4H)。
ォリルオキシフェニル)メチレン]トリシクロ[3,
3,1,13,7]デカン3ナトリウム塩の合成 工程(h)で得られたアルケン(142mg)をアセト
ン4mL中に溶解した。<1mLの水に水酸化ナトリウ
ム36.4mgを溶かした溶液を加えた。溶液を20時
間攪拌し、沈殿物を生成させた。液体の上澄みをとり、
固体を他のアセトンでまた次にメタノールで洗浄した。
真空中で乾燥させたところ、白色の固体10mgが得ら
れた。1 H NMR(D2O) δ1.71〜1.95(m、1
4H)、2.23(t、2H)、2.62(br s、
1H)、3.18(br s、1H)、3.53(t、
2H)、7.04〜7.36(m、4H)。
【0069】 (j)[4−(3−カルボキシプロポキシ)−4−(3
−ホスフォリルオキシフェニル)スピロ[1,2−ジオ
キセタン−3,2’−トリシクロ[3,3,1,
13,7]デカン]の合成 工程(i)で得られたアルケン(26.8mg)をD2
O 1.5mL中に溶解した。p−ジオキサン−d
81.5mL中にポリマー結合ローズ・ベンガル(75
mg)を懸濁させ、上の水溶液に加えた。反応混合物を
5−7℃に冷却し、酸素の沸騰を起こさせ、混合物にカ
プトン(KAPTON)の0.005”のシートを介し
てナトリウム・ランプを照射した。合計30分後、1H
NMRによって反応が完了したことが示された(δ
2.6でのピークの消滅)ので、ポリマーのビードを濾
過して取り除いた。
−ホスフォリルオキシフェニル)スピロ[1,2−ジオ
キセタン−3,2’−トリシクロ[3,3,1,
13,7]デカン]の合成 工程(i)で得られたアルケン(26.8mg)をD2
O 1.5mL中に溶解した。p−ジオキサン−d
81.5mL中にポリマー結合ローズ・ベンガル(75
mg)を懸濁させ、上の水溶液に加えた。反応混合物を
5−7℃に冷却し、酸素の沸騰を起こさせ、混合物にカ
プトン(KAPTON)の0.005”のシートを介し
てナトリウム・ランプを照射した。合計30分後、1H
NMRによって反応が完了したことが示された(δ
2.6でのピークの消滅)ので、ポリマーのビードを濾
過して取り除いた。
【0070】例3. カプセル化学分析システムでの試
薬のキャリオーバーの問題の発見 以下に説明する実験は、本質的にはクマーがアメリカ合
衆国特許第5399497号に記載しているようなプロ
トタイプのカプセル化学分析システムに対し、発光(ル
ミネセンス)を測定するために構成された検出システム
で行った。方法および装置は、テフロン管を介して流体
セグメントの流れを供給するもので、管は、内表面にフ
ルオロカーボンオイルの絶縁層を有する。試料および試
薬は、この管の中に吸引させ、得られた液体セグメント
を管を通して移動させる。ヘテロジニアスイムノアッセ
イ法で必要な分離工程と洗浄工程は、磁石を用いて一つ
の水性セグメントから他のセグメントへ磁気粒子を移す
ことによって容易となった。検出システムは、フォトン
・カウンターと光ファイバー読み取りヘッドからなり、
このうち、ファイバーは、光の収集効率をできるだけ高
めるためにテフロン管の周囲に径方向に配置した。
薬のキャリオーバーの問題の発見 以下に説明する実験は、本質的にはクマーがアメリカ合
衆国特許第5399497号に記載しているようなプロ
トタイプのカプセル化学分析システムに対し、発光(ル
ミネセンス)を測定するために構成された検出システム
で行った。方法および装置は、テフロン管を介して流体
セグメントの流れを供給するもので、管は、内表面にフ
ルオロカーボンオイルの絶縁層を有する。試料および試
薬は、この管の中に吸引させ、得られた液体セグメント
を管を通して移動させる。ヘテロジニアスイムノアッセ
イ法で必要な分離工程と洗浄工程は、磁石を用いて一つ
の水性セグメントから他のセグメントへ磁気粒子を移す
ことによって容易となった。検出システムは、フォトン
・カウンターと光ファイバー読み取りヘッドからなり、
このうち、ファイバーは、光の収集効率をできるだけ高
めるためにテフロン管の周囲に径方向に配置した。
【0071】発光試薬の試験には代表的なイムノアッセ
イ法としてテクニコン・イムノ(TECHNICON IMMUNO)1
(登録商標)TSH法(ベイヤー・コーポレーション、
米国ニューヨーク州タリータウン)を用いた。この方法
の原理は、抗原TSHを含む試料をフルオレセイン−標
識抗体を含む第一試薬(R1)および抗体−アルカリ性
ホスファターゼ(ALP)複合体(conjugate)を含む第
二試薬(R2)と共に同時に培養するものである。各抗
体は、TSH抗原上の異なるエピトープに特異的であ
り、そのためこれら二つの抗体とTSH抗原の間で「サ
ンドイッチ」の形成が促進された。結合されたアンチ−
フルオレセイン(bound anti-fluorescein)を含む磁気粒
子をこのサンドイッチを捕捉するために使用し、次いで
捕捉された粒子を洗浄し、未結合試薬を除去した。次
に、粒子にALP用基質を含む発光試薬を加え、発光を
測定した。
イ法としてテクニコン・イムノ(TECHNICON IMMUNO)1
(登録商標)TSH法(ベイヤー・コーポレーション、
米国ニューヨーク州タリータウン)を用いた。この方法
の原理は、抗原TSHを含む試料をフルオレセイン−標
識抗体を含む第一試薬(R1)および抗体−アルカリ性
ホスファターゼ(ALP)複合体(conjugate)を含む第
二試薬(R2)と共に同時に培養するものである。各抗
体は、TSH抗原上の異なるエピトープに特異的であ
り、そのためこれら二つの抗体とTSH抗原の間で「サ
ンドイッチ」の形成が促進された。結合されたアンチ−
フルオレセイン(bound anti-fluorescein)を含む磁気粒
子をこのサンドイッチを捕捉するために使用し、次いで
捕捉された粒子を洗浄し、未結合試薬を除去した。次
に、粒子にALP用基質を含む発光試薬を加え、発光を
測定した。
【0072】発光R3試薬は、0.2mMのCSPD
(ジナトリウム3−(4−メトキシスピロ(1,2−ジ
オキセタン−3,2’−(5’−クロロ)トリシクロ
[3,3,1,13,7]デカン)−4−イル)フェニル
ホスフェート(トロピックスInc.、米国マサチュー
セッツ州ベドフォード)、3mMのピラニン(ヒドロキ
シピレンスルフォン酸)、1mMのMgCl2 、1Mの
ジエタノールアミン緩衝剤(pH10.0)、0.1%
のトリトンX−100、および0.1%のNaN3から
なるものであった。カプセル化学分析システムにおける
事象の順序を図1に示す。流体カプセル、すなわち試験
パッケージは、六つの液体セグメントからなり、その各
々の容積は28μlであった。磁気粒子(テクニコン・
イムノ1システムに用いた磁気粒子試薬1.4μl)を
第一のセグメント(MP)の中に吸引させた。流体の残
りは、粒子洗浄緩衝液(25mMトリス(Tris)、
pH7.5、0.2MのNaClと、0.1%のトリト
ンX−100と保存剤を含む)である。R1(TSHに
対するフルオレセイン−標識抗体を含む血清がベースの
溶液10.4μl)、R2(ALPで複合体化(conjuga
ted)したTSHに対する抗体を含む血清がベースの溶液
10.4μl)、およびS(血清の試料7.2μl)を
第二のセグメントの中に吸引させた。次の二つのセグメ
ント(W1およびW2)は、上の磁気粒子(MP)セグ
メントで用いたと同じ洗浄緩衝液とした。第五のセグメ
ントは、上述の組成物R3で、重要な要素は、発光基質
と発光エンハンサーである。第六のセグメントは、イン
ター・テスト緩衝液(上に述べた粒子緩衝液と同じ)
で、隣接する試験を隔離するために用いた。磁気の移転
は、図1の矢印で示してある。これらの移転は、二つの
磁気移転アセンブリー(M1またはM2)の一つを用い
ることによって容易に行なえた。13分間培養し、その
間にサンドイッチの形成が行なわれたが、その後に、M
1が磁気粒子をR1+R2+Sセグメントの中に移転さ
せ、捕捉を開始した。さらに6分間経過後、M2が粒子
を第一の洗浄セグメントの中に移転させた。さらに12
秒間経過後、M2が粒子を第二の洗浄セグメントの中に
移転させた。さらに12秒間経過後、M2が粒子をR3
セグメントの中へ移転させ、水性セグメントの流れがル
ミノメーター読み取りヘッドを前後に通過するのに応じ
てこのセグメントからの発光が検出された。
(ジナトリウム3−(4−メトキシスピロ(1,2−ジ
オキセタン−3,2’−(5’−クロロ)トリシクロ
[3,3,1,13,7]デカン)−4−イル)フェニル
ホスフェート(トロピックスInc.、米国マサチュー
セッツ州ベドフォード)、3mMのピラニン(ヒドロキ
シピレンスルフォン酸)、1mMのMgCl2 、1Mの
ジエタノールアミン緩衝剤(pH10.0)、0.1%
のトリトンX−100、および0.1%のNaN3から
なるものであった。カプセル化学分析システムにおける
事象の順序を図1に示す。流体カプセル、すなわち試験
パッケージは、六つの液体セグメントからなり、その各
々の容積は28μlであった。磁気粒子(テクニコン・
イムノ1システムに用いた磁気粒子試薬1.4μl)を
第一のセグメント(MP)の中に吸引させた。流体の残
りは、粒子洗浄緩衝液(25mMトリス(Tris)、
pH7.5、0.2MのNaClと、0.1%のトリト
ンX−100と保存剤を含む)である。R1(TSHに
対するフルオレセイン−標識抗体を含む血清がベースの
溶液10.4μl)、R2(ALPで複合体化(conjuga
ted)したTSHに対する抗体を含む血清がベースの溶液
10.4μl)、およびS(血清の試料7.2μl)を
第二のセグメントの中に吸引させた。次の二つのセグメ
ント(W1およびW2)は、上の磁気粒子(MP)セグ
メントで用いたと同じ洗浄緩衝液とした。第五のセグメ
ントは、上述の組成物R3で、重要な要素は、発光基質
と発光エンハンサーである。第六のセグメントは、イン
ター・テスト緩衝液(上に述べた粒子緩衝液と同じ)
で、隣接する試験を隔離するために用いた。磁気の移転
は、図1の矢印で示してある。これらの移転は、二つの
磁気移転アセンブリー(M1またはM2)の一つを用い
ることによって容易に行なえた。13分間培養し、その
間にサンドイッチの形成が行なわれたが、その後に、M
1が磁気粒子をR1+R2+Sセグメントの中に移転さ
せ、捕捉を開始した。さらに6分間経過後、M2が粒子
を第一の洗浄セグメントの中に移転させた。さらに12
秒間経過後、M2が粒子を第二の洗浄セグメントの中に
移転させた。さらに12秒間経過後、M2が粒子をR3
セグメントの中へ移転させ、水性セグメントの流れがル
ミノメーター読み取りヘッドを前後に通過するのに応じ
てこのセグメントからの発光が検出された。
【0073】テフロン管が光を透過させるため、光のパ
イピング(piping)(すなわち「光学的キャリオーバー」
の問題が予想された。具体的には、隣接の試験のR3セ
グメントが発するフォトンの若干がテフロン材の中に入
り、管の長手方向に伝搬し、散乱して問題の試験の信号
測定中に検出器の中に入る可能性があった。しかし、隣
接の試験で信号が検出されている間、この現象は予想し
たようには起こらなかった。試験Nからの距離にともな
って急速に減衰するのではなく、図2に示すように、隣
接のテスト・パッケージのR3セグメントのあたりに光
の出力のピークがあることが観察された。図2で、試験
Nは、約毎秒750万カウント(cps)の高いレベル
の発光を示した。試験N−1およびN−2は、試験Nの
前に管の中に吸引され、この試験の前にルミノメーター
を通過した。また、試験N+1およびN+2は、試験N
の後に行なわれた。分析システムは、流れの中の個々の
気体および液体のセグメントでカウントされたフォトン
を記録した。図2のグラフは、5つの試験の10の反復
パネルの平均を示すが、試験は、各々、ALPのない場
合に生じたバックグランドの発光信号についての補正を
行なった。各データ・ポイントから試薬なしの値を引い
たものが、5つの試験の各々の10の反復パネルから得
られた平均である。キャリオーバー信号の大きさは、各
隣接の試験におけるピークcpsを試験Nにおけるピー
クcpsで割って計算した。これらの値は、ppmで表
わした。
イピング(piping)(すなわち「光学的キャリオーバー」
の問題が予想された。具体的には、隣接の試験のR3セ
グメントが発するフォトンの若干がテフロン材の中に入
り、管の長手方向に伝搬し、散乱して問題の試験の信号
測定中に検出器の中に入る可能性があった。しかし、隣
接の試験で信号が検出されている間、この現象は予想し
たようには起こらなかった。試験Nからの距離にともな
って急速に減衰するのではなく、図2に示すように、隣
接のテスト・パッケージのR3セグメントのあたりに光
の出力のピークがあることが観察された。図2で、試験
Nは、約毎秒750万カウント(cps)の高いレベル
の発光を示した。試験N−1およびN−2は、試験Nの
前に管の中に吸引され、この試験の前にルミノメーター
を通過した。また、試験N+1およびN+2は、試験N
の後に行なわれた。分析システムは、流れの中の個々の
気体および液体のセグメントでカウントされたフォトン
を記録した。図2のグラフは、5つの試験の10の反復
パネルの平均を示すが、試験は、各々、ALPのない場
合に生じたバックグランドの発光信号についての補正を
行なった。各データ・ポイントから試薬なしの値を引い
たものが、5つの試験の各々の10の反復パネルから得
られた平均である。キャリオーバー信号の大きさは、各
隣接の試験におけるピークcpsを試験Nにおけるピー
クcpsで割って計算した。これらの値は、ppmで表
わした。
【0074】このような現象の原因としては、他に、意
図しないかたちで試験Nから隣接の試験の中にALPの
物理的キャリオーバーが生じたことが考えられる。この
ようなことは、例えば、管が壁に堆積した粒子状物質を
含み、それが管を通る液体セグメントの滑らかな流れを
妨げる場合に起こり得る。しかし、隣接の試験のR3セ
グメントの中に10mMの無機リン酸塩を入れても、隣
接の試験の信号の大きさに影響はなかった。この量のリ
ン酸塩は、これらの試験条件の下では、ALPを少なく
とも90%抑制するはずなので、物理的キャリオーバー
の可能性は排除された。
図しないかたちで試験Nから隣接の試験の中にALPの
物理的キャリオーバーが生じたことが考えられる。この
ようなことは、例えば、管が壁に堆積した粒子状物質を
含み、それが管を通る液体セグメントの滑らかな流れを
妨げる場合に起こり得る。しかし、隣接の試験のR3セ
グメントの中に10mMの無機リン酸塩を入れても、隣
接の試験の信号の大きさに影響はなかった。この量のリ
ン酸塩は、これらの試験条件の下では、ALPを少なく
とも90%抑制するはずなので、物理的キャリオーバー
の可能性は排除された。
【0075】さらに光学的キャリオーバーの可能性も排
除するために、蛍光エンハンサーピラニンを試験Nだけ
から除外し、隣接の試験には入れるようにした。その結
果、試験Nの信号の大きさは約10分の一に低下した。
しかし、図3に示すように、隣接の試験のピークの高さ
の有意な変化はなかった。隣接の試験でキャリオーバー
信号が比例的に変化しなかったことで、キャリオーバー
が光学的なものでないことが明確に示された。
除するために、蛍光エンハンサーピラニンを試験Nだけ
から除外し、隣接の試験には入れるようにした。その結
果、試験Nの信号の大きさは約10分の一に低下した。
しかし、図3に示すように、隣接の試験のピークの高さ
の有意な変化はなかった。隣接の試験でキャリオーバー
信号が比例的に変化しなかったことで、キャリオーバー
が光学的なものでないことが明確に示された。
【0076】キャリオーバーの問題の原因は、さらに他
の予想しない種類のキャリオーバーにあった。ヒドロキ
シ・ジオキセタンの中間物がテフロン管の内壁を被覆す
るために用いたフルオロカーボンオイルに十分に溶解
し、キャリオーバーが、このオイルを介して溶解したヒ
ドロキシ・ジオキセタン中間物が隣接の試験のR3セグ
メント内に移転したことによるものであることがわかっ
た。このプロセスを、隣接の試験のR3セグメントの緩
衝液をpH10での1MのDEAからpH7での1Mの
トリス(Tris)へ変更して試験した。pH7では、これ
らR3セグメントにおいて溶解したヒドロキシ・ジオキ
セタン中間物は、安定しており、光を発しない。図4に
示すように、このpHの変更の結果、発光の側波帯が完
全に除去された。N+1およびN−1の試験の残りのわ
ずかなキャリオーバーは、予期した程度の光学的キャリ
オーバーによるものであった。これらの結果から、隣接
の試験でのピークの発光源が、CSPDから生じたヒド
ロキシ・ジオキセタンの隣接の試験のR3セグメント内
への「化学的キャリオーバー」であったことが確認され
た。
の予想しない種類のキャリオーバーにあった。ヒドロキ
シ・ジオキセタンの中間物がテフロン管の内壁を被覆す
るために用いたフルオロカーボンオイルに十分に溶解
し、キャリオーバーが、このオイルを介して溶解したヒ
ドロキシ・ジオキセタン中間物が隣接の試験のR3セグ
メント内に移転したことによるものであることがわかっ
た。このプロセスを、隣接の試験のR3セグメントの緩
衝液をpH10での1MのDEAからpH7での1Mの
トリス(Tris)へ変更して試験した。pH7では、これ
らR3セグメントにおいて溶解したヒドロキシ・ジオキ
セタン中間物は、安定しており、光を発しない。図4に
示すように、このpHの変更の結果、発光の側波帯が完
全に除去された。N+1およびN−1の試験の残りのわ
ずかなキャリオーバーは、予期した程度の光学的キャリ
オーバーによるものであった。これらの結果から、隣接
の試験でのピークの発光源が、CSPDから生じたヒド
ロキシ・ジオキセタンの隣接の試験のR3セグメント内
への「化学的キャリオーバー」であったことが確認され
た。
【0077】例4. ジカルボン酸置換ジオキセタン1
による観察された化学的キャリオーバーの排除 下記の表1は、反応中間物の化学的キャリオーバーに対
して他の三つのジオキセタンを使用した場合の効果を示
す。ルミゲン(LUMIGEN)PPD[4−(メトキシ)−4
−(3−ホスフォリル−オキシフェニル)スピロ[1、
2−ジオキセタン−3、2’−トリシクロ[3、3、
1、13、7]デカン](ルミゲンInc.、米国ミシ
ガン州サウスフィールド)、モノカルボン酸誘導体であ
るジオキセタン3、およびジカルボン酸誘導体であるジ
オキセタン1を、各々、試験の中で同じ濃度で使用し
た。ppmの欄は、N−1の試験の信号で、最も悪いケ
ースの挙動を示すものである。変質されてない親化合物
PPDのキャリオーバーも、CSPDで観察されたと同
じ高さで2度以上見いだされた。おどろくことに、モノ
カルボン酸誘導体であるジオキセタン3は、化学的キャ
リオーバーの大きさを84%しか低減させなかった。こ
のことは、帯電(charged)基が一つだけでは、反応中間
物のフルオロカーボンオイルへの可溶化を完全に防ぐの
に不十分であることを示している。しかし、ジカルボン
酸誘導体では、100%の効果が得られ、所望の効果を
得るためには帯電基が二つあれば十分であることが示さ
れた。
による観察された化学的キャリオーバーの排除 下記の表1は、反応中間物の化学的キャリオーバーに対
して他の三つのジオキセタンを使用した場合の効果を示
す。ルミゲン(LUMIGEN)PPD[4−(メトキシ)−4
−(3−ホスフォリル−オキシフェニル)スピロ[1、
2−ジオキセタン−3、2’−トリシクロ[3、3、
1、13、7]デカン](ルミゲンInc.、米国ミシ
ガン州サウスフィールド)、モノカルボン酸誘導体であ
るジオキセタン3、およびジカルボン酸誘導体であるジ
オキセタン1を、各々、試験の中で同じ濃度で使用し
た。ppmの欄は、N−1の試験の信号で、最も悪いケ
ースの挙動を示すものである。変質されてない親化合物
PPDのキャリオーバーも、CSPDで観察されたと同
じ高さで2度以上見いだされた。おどろくことに、モノ
カルボン酸誘導体であるジオキセタン3は、化学的キャ
リオーバーの大きさを84%しか低減させなかった。こ
のことは、帯電(charged)基が一つだけでは、反応中間
物のフルオロカーボンオイルへの可溶化を完全に防ぐの
に不十分であることを示している。しかし、ジカルボン
酸誘導体では、100%の効果が得られ、所望の効果を
得るためには帯電基が二つあれば十分であることが示さ
れた。
【0078】表1 化学的キャリオーバーの低減 化合物 ppm 低減% ルミゲン PPD 1640 ジオキセタン3 260 84 ジオキセタン1 0 100
【0079】例5. エンハンサーの役割 ジオキセタン1をベースにした試薬を最適化するための
一部として、多数のエンハンサー物質を調べた。pH
9.6では、エンハンサーA(1−トリオクチルホスフ
ォニウムメチル−4−トリブチルホスフォニウムメチル
ベンゼン・ジクロライド)は、発光信号を6.2倍に高
め、エンハンサーB(ポリ(ビニルベンジルトリブチル
ホスフォニウム・クロライド))は、信号を19.7倍
に高めた。pH10.0では、エンハンサーAは、信号
を4.8倍に高め、エンハンサーBは、信号を18.9
倍に高めた。
一部として、多数のエンハンサー物質を調べた。pH
9.6では、エンハンサーA(1−トリオクチルホスフ
ォニウムメチル−4−トリブチルホスフォニウムメチル
ベンゼン・ジクロライド)は、発光信号を6.2倍に高
め、エンハンサーB(ポリ(ビニルベンジルトリブチル
ホスフォニウム・クロライド))は、信号を19.7倍
に高めた。pH10.0では、エンハンサーAは、信号
を4.8倍に高め、エンハンサーBは、信号を18.9
倍に高めた。
【0080】エンハンサーBのほうがより高い光の強度
が得られたにもかかわらず、エンハンサーAのほうが低
分子量のモノマー化合物であるので分析システムには好
ましいとされた。ポリマー化合物は、とくにポリカチオ
ン系である場合、血清成分と作用し合って沈殿を生じ、
それが分析システムの操作に有意な問題をあた得る。
が得られたにもかかわらず、エンハンサーAのほうが低
分子量のモノマー化合物であるので分析システムには好
ましいとされた。ポリマー化合物は、とくにポリカチオ
ン系である場合、血清成分と作用し合って沈殿を生じ、
それが分析システムの操作に有意な問題をあた得る。
【0081】フルオレセインおよびピラニンは、とも
に、エンハンサーAと組み合わせて補足的蛍光物質とし
て用いると有効であることが分かった。これらの蛍光物
質は、単独では、約10倍の増強を達成するためには比
較的高い濃度(3mM)で使用する必要がある。しか
し、エンハンサーAと組み合わせて使用すると、共働効
果が得られ、エンハンサーがない場合に必要な蛍光物質
の濃度より100分の一の濃度で、ほぼ同程度の増強が
達成される。下記の表2および表3は、1mg/mlの
エンハンサーAの存在の下でのピラニンとフルオレセイ
ンによる増強の程度を示す。
に、エンハンサーAと組み合わせて補足的蛍光物質とし
て用いると有効であることが分かった。これらの蛍光物
質は、単独では、約10倍の増強を達成するためには比
較的高い濃度(3mM)で使用する必要がある。しか
し、エンハンサーAと組み合わせて使用すると、共働効
果が得られ、エンハンサーがない場合に必要な蛍光物質
の濃度より100分の一の濃度で、ほぼ同程度の増強が
達成される。下記の表2および表3は、1mg/mlの
エンハンサーAの存在の下でのピラニンとフルオレセイ
ンによる増強の程度を示す。
【0082】表2 エンハンサーAとともに用いたピラニンによる増強 (ピラニン) (mM) 増強度(ファクター) 0.01 3.7 0.02 7.3 0.03 9.8 0.04 12.2 0.05 13.7
【0083】表3 エンハンサーAとともに用いたフルオレセインによる増強 (フルオレセイン)(mM) 増強度(ファクター) 0.01 2.6 0.02 4.0 0.05 7.1 0.10 8.7
【0084】例6. カプセル化学分析システムの最適
の組成 上に説明した観察結果から、カプセル化学分析システム
の最適の組成が開発された。この組成は、ジオキセタン
1が0.1〜1mM、ピラニンが1.0〜0.05m
M、エンハンサーAが0.1〜5mg/mL、Mg+2が
0〜1mM、2−アミノ−2−メチル−1−1プロパノ
ール(pH10.0)が0.1〜1M、およびトリトン
X−100が0.01〜1%からなるものである。この
組成を使用すると、化学的キャリオーバーの問題を完全
に除去することができ、効果が高められる。
の組成 上に説明した観察結果から、カプセル化学分析システム
の最適の組成が開発された。この組成は、ジオキセタン
1が0.1〜1mM、ピラニンが1.0〜0.05m
M、エンハンサーAが0.1〜5mg/mL、Mg+2が
0〜1mM、2−アミノ−2−メチル−1−1プロパノ
ール(pH10.0)が0.1〜1M、およびトリトン
X−100が0.01〜1%からなるものである。この
組成を使用すると、化学的キャリオーバーの問題を完全
に除去することができ、効果が高められる。
【図面の簡単な説明】
【図1】問題とすべきキャリオーバーを測定するカプセ
ル化学分析システムの説明図である。
ル化学分析システムの説明図である。
【図2】カプセル化学分析システムにおける隣接するセ
グメントの、例の中で詳述するキャリオーバーによる発
光観察を示す線図である。
グメントの、例の中で詳述するキャリオーバーによる発
光観察を示す線図である。
【図3】例の中で詳述する実験で観察された隣接するセ
グメントを示す図で、キャリオーバーが光学的な性質の
ものでないことを示す線図である。
グメントを示す図で、キャリオーバーが光学的な性質の
ものでないことを示す線図である。
【図4】例の中で詳述する実験で観察された隣接するセ
グメントを示す図で、キャリオーバーが実際には化学的
な性質のものであることを示す線図である。
グメントを示す図で、キャリオーバーが実際には化学的
な性質のものであることを示す線図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ハシェム アクハヴァン−タフティ アメリカ合衆国 ミシガン 48310 スタ ーリング ハイツ リアン ロード 33858 (72)発明者 レヌカ ド シルヴァ アメリカ合衆国 ミシガン 48167 ノー スヴィル デルタ ドライブ 40628 (72)発明者 ポール エイ シャープ アメリカ合衆国 ミシガン 48230 グロ ッセ ポイント パーク ペンバートン 512
Claims (17)
- 【請求項1】 下記式、 (式中、R1は、1ないし20の炭素原子を有する、置
換されたアルキル、ヘテロアルキル、アルケニルまたは
アルキニル基、少なくとも二つの水溶液への可溶性を高
める基、および随意に少なくとも1個の酸素原子を含む
親水性有機基であり、R3およびR4は、各々が、随意
にヘテロ原子で置換することができ、またジオキセタン
環にスピロ融合した環式または多環式有機環基を組み合
わされて随意に形成し得る非環式、環式または多環式有
機基であり、R2は、付加的な置換基を含むことができ
るフェニルおよびナフチル基からなる群から選ばれるア
リ−ル環基であり、Xは、活性化試剤によって除去され
光を生ずることのできる保護基である)で表される安定
なジオキセタン。 - 【請求項2】 下記式、 (式中、R1は、1ないし8の炭素原子を有する、置換
されたアルキル、ヘテロアルキル、アルケニルまたはア
ルキニル基、少なくとも二つの水溶液への可溶性を高め
る基、および随意に少なくとも1個の酸素原子を含む親
水性有機基であり、R5は、ジオキセタン環にスピロ融
合した環式および多環式アルキル基からなる群から選ば
れ、6から30の炭素原子を有し、場合により付加的な
置換基を含有し得るものであり、R2は、場合により付
加的な置換基を含むことができるフェニルおよびナフチ
ル基からなる群から選ばれるアリール環基であり、X
は、活性化試剤によって除去され光を生じることのでき
る保護基である)で表される安定なジオキセタン。 - 【請求項3】 下記式、 で表される請求項2記載のジオキセタン。
- 【請求項4】 可溶性を高める基が、カルボキシレー
ト、スルフォネート、サルフェート、ホスフェート、ホ
スフォネート、ニトレート、トリアルキルアンモニウ
ム、トリアルキルホスフォニウム、ジアルキルスルフォ
ニウム、およびグアニジニウム基からなる群から選ばれ
る請求項1、2または3記載のジオキセタン。 - 【請求項5】 可溶性を高める基がカルボキシレート基
である請求項1、2または3記載のジオキセタン。 - 【請求項6】 OX基が、O−M+基(ただし、Mは水
素原子、アルカリ金属イオン、第四級アンモニウムおよ
び第四級ホスフォニウム・イオンからなる群から選ばれ
る)、OOCR8基(ただし、R8は、2ないし8の炭
素原子を有し、かつ随意にヘテロ原子を含有するアルキ
ルおよびアリール基からなる群から選ばれる)、OPO
3 −2塩、OSO3 −塩、β−D−ガラクトシドキシ、
およびβ−D−グルクロニジロキシ基からなる群から選
ばれる請求項5記載のジオキセタン。 - 【請求項7】 下記式、 で表されるジオキセタン化合物。
- 【請求項8】 水溶液中に、(a)下記式、 (式中、R1は、1ないし20の炭素原子を有する、置
換されたアルキル、ヘテロアルキル、アルケニルまたは
アルキニル基、少なくとも二つの水溶液への可溶性を高
める基、および随意に少なくとも1個の酸素原子を含む
親水性有機基であり、R3およびR4は、各々が、随意
にヘテロ原子で置換することができ、またジオキセタン
環にスピロ融合した環式または多環式環基を組み合わさ
れて随意に形成し得る非環式、環式または多環式有機基
であり、R2は、付加的な置換基を含むことができるフ
ェニルおよびナフチル基からなる群から選ばれるアリ−
ル環基であり、Xは、活性化試剤によって除去され光を
生ずることのできる保護基である)で表される安定なジ
オキセタンと、(b)ジオキセタンと活性化試剤との反
応により、エンハンサーなしで発生する光の量に比し
て、発生する光の量を増大させる非ポリマー系でかつカ
チオン系のエンハンサー物質と、を含む光発生組成物。 - 【請求項9】 前記エンハンサー物質が下記式、 (式中、各Aは、PおよびN原子からなる群から独立に
選ばれ、Linkは、置換および未置換アリール、アル
キル、アルケニルおよびアルキニル基からなる群から選
ばれる少なくとも二つの炭素原子を含む有機結合基であ
り、また、Linkは場合によりヘテロ原子を含有して
もよく、Rは1ないし20の炭素原子を含む低級アルキ
ルまたはアラルキル基から選ばれ、Yはアニオンであ
る)で表される請求項8記載の光発生組成物。 - 【請求項10】 前記エンハンサー物質が下記式、 (式中、Linkはフェニレン基である)で表されるジ
カチオン系界面活性剤である請求項8記載の光発生組成
物。 - 【請求項11】 ジオキセタンが下記式、 (式中、R5はジオキセタン環にスピロ融合され、6な
いし30の炭素原子を含み、また随意に付加的置換基を
含み得る環式または多環式アルキル基からなる群から選
ばれる)で表される請求項8、9、または10記載の組
成物。 - 【請求項12】 R5は、アダマンティル基および置換
アダマンティル基からなる群から選ばれる請求項11記
載の光発生組成物。 - 【請求項13】 ジオキセタンが、下記式、 で表される請求項11記載の光発生組成物。
- 【請求項14】 ジオキセタンが、下記式、 で表され、また、エンハンサー物質が1−トリオクチル
ホスフォニウムメチル−4−トリブチルホスフォニウム
メチルベンゼン・ジクロライドである請求項8記載の光
発生組成物。 - 【請求項15】 下記式、 で表される化合物 。
- 【請求項16】 下記式、 で表される化合物 。
- 【請求項17】 下記式、 で表される化合物。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US08/509305 | 1995-07-31 | ||
US08/509,305 US5777135A (en) | 1995-07-31 | 1995-07-31 | Di-substituted 1,2-dioxetane compounds having increased water solubility and assay compositions |
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JPH09249659A true JPH09249659A (ja) | 1997-09-22 |
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US5721370A (en) * | 1995-07-31 | 1998-02-24 | Lumigen Inc. | Water soluble tri-substituted 1,2-dioxetane compounds and assay compositions having increased storage stability |
US6036892A (en) * | 1995-07-31 | 2000-03-14 | Lumigen, Inc. | Water soluble tri-substituted 1,2-dioxetane compounds having increased storage stability, synthetic processes and intermediates |
US6245928B1 (en) * | 1995-07-31 | 2001-06-12 | Lumigen, Inc. | Water soluble tri-substituted 1,2-dioxetane compounds having increased storage stability, synthetic processes and intermediates |
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US6636489B1 (en) | 1997-11-03 | 2003-10-21 | Bell South Wireless Data. L.P. | Wireless management system and a method for an automated over-the-air managing process for wireless communication device |
US6767716B2 (en) * | 2000-06-17 | 2004-07-27 | Brij P. Giri | Chemluminescent systems containing unsaturated 1,2-dioxetanes |
US7300766B2 (en) * | 2002-05-23 | 2007-11-27 | Giri Brij P | Polymeric ammonium and or phosphonium salts having added π-electrons and higher molecular weight as enhancers for chemiluminescent systems |
US7416898B2 (en) * | 2002-10-04 | 2008-08-26 | Giri Brij P | Chemiluminescent 1,2-dioxetanes |
CN103951704A (zh) * | 2013-12-10 | 2014-07-30 | 云南民族大学 | 一种免疫分析用化学发光物amppd的制备方法 |
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US5068339A (en) * | 1986-07-17 | 1991-11-26 | Board Of Governors Of Wayne State University | Enhanced chemiluminescence from 1,2-dioxetanes through energy transfer to tethered fluorescers |
US4959182A (en) * | 1986-07-17 | 1990-09-25 | Board Of Governors Of Wayne State University | Method and compositions providing enhanced chemiluminescence from 1,2-dioxetanes |
US5004565A (en) * | 1986-07-17 | 1991-04-02 | The Board Of Governors Of Wayne State University | Method and compositions providing enhanced chemiluminescence from 1,2-dioxetanes |
CA1340590C (en) * | 1986-07-24 | 1999-06-08 | John C. Voyta | Chemiluminescence enhancement |
US4978614A (en) * | 1988-10-26 | 1990-12-18 | Tropix, Inc. | Method of detecting a substance using enzymatically-induced decomposition of dioxetanes |
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BR8707399A (pt) * | 1986-07-24 | 1988-09-13 | Quest Systems Inc | Metodo de detectar uma substancia usando decomposicao enzimaticamente induzida de dioxetanos |
US5220005A (en) * | 1986-07-24 | 1993-06-15 | Tropix, Inc. | Substituted adamantyl dioxetanes |
US5582980A (en) * | 1989-07-17 | 1996-12-10 | Tropix, Inc. | Chemiluminescent 1,2-dioxetanes |
JPH0731201B2 (ja) * | 1987-12-31 | 1995-04-10 | トロピックス・インコーポレーテッド | 化学発光による測定法 |
US4952707A (en) * | 1988-06-30 | 1990-08-28 | Tropix, Inc. | Enzymatically-cleavable chemiluminescent fused polycyclic ring-containing 1,2-dioxetanes |
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EP0473984A1 (en) * | 1990-09-07 | 1992-03-11 | The Board Of Governors Of Wayne State University | 1,2-Dioxetane compounds as chemiluminescent labels for organic and biological molecules |
WO1993018022A1 (en) * | 1992-03-05 | 1993-09-16 | Tropix, Inc. | Synthesis of stable, water-soluble chemiluminescent 1,2-dioxetanes and intermediates therefor |
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WO1997000869A1 (en) * | 1995-06-20 | 1997-01-09 | Lumigen, Inc. | Process for the preparation of 1,2-dioxetane compounds and novel sulfur-substituted 1,2-dioxetane compounds as intermediates |
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