JPS62502548A - 新規な螢光性化合物および生物学的検査装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 新規な螢光性化合物および生物学的検査装置発明の背景 本発明は、新規な螢光性化合物およびこれを用いる生物学的検査装置に関するも のである。

生物学的活性化合物を用いる種々の技術が生体医学分野において公知であり、た とえば、螢光、化学ルミネセンス党、生物ルミネセンス光の如き電磁波を発し得 る染料基のような検知可能信号発信染料基（ｄｙｅｍｏｉｅｔｙ　）を含む活性 化合物を用いる種々の技術が現在利用されている。この種の活性化合物の例には 、ＤＮＡ−プローブ（たとえば、相補性ＤＮＡ配列に使用される種類の標識化Ｄ ＮＡ−プローブ）、酵素、酵素抑制剤、抗原、ハプテン等があげられる。

近年になって、体液中の抗原、ホルモン、病原体、血清抗体等の検出のために、 標識化薬剤を用いる免疫学的検査技術が大いに注目されるようになった。したが って、標識化薬剤を用いて抗原と抗体との反応を行って検知可能信号を発せしめ 、たとえば変色や電磁波を生ぜしめる操作を含Ｃ槙々の検査技術が開発され、そ してこれらは種々の特許明細書に開示されている。

これらの検査技術は、リガンドとアンチリガンドとの免疫学的相互作用すなわち 相互反応を利用したものであって、しかして、０の２種の反応体のうちの少なく とも１つは、この免疫学的リガンド−アンチリガンド相互反応の結果としての検 知可能信号を発し得る物質またはそのプレカーサーを含有するものである。

上記の種類の検査技術に一般に利用される標識の例には螢光染料や螢光体があげ られる。螢光性標識化結合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ　）を用いる不均質または 均質系の特異的結合検査（ｂｉｎｄｉｎｇａｓｓａｙ　）技術は周知であり、特 許文献に記載されている。ごの特異的結合検査技術に標識として螢光体を用いる ことを開示した特許文献の例には、米国特許第３，９９２，６３１号、第３．９ ９９，９４８号、第４，０２０，１５１号、第４．０２５，３１０号、第４．０ ３６，９４６号、第４．０５８，７３２号、第４，１１５．６９９号、第４，２ ２０，４５０号および第４，２３８，１９５号明細書があげられる。

これらの検査技術に用いられる螢光性標識は一般に、できるだけ高い螢光効率を 有し、照射波の波長が比較的長＜　（５００ｎｍよシ太）、かつ、結合性に悪影 響を与えることなくリガンドまたはアンチリガンドに共有結合の形で結合し得る ものであることが好ましい。

さらに、この螢光性標識はストークスシフト値（吸収光と照射光とのエネルギー 差）が犬であることが理想的である。ストークスシフト値（吸収光と発射光との エネルギー差）が高いことが好ましい理由は、この場合には、散乱光および螢光 系のバックグラウンドの干渉が減少するからである。化学ルミネセンス光源等か ら螢光性標識へのエネルギーの転移を行うように構成された検を装置が、たとえ ば前記の米国特許第４．２２０，４５０号明細書に記載されている。

本発明は、新規な螢光性結合物（すなわち結合体）、および生物学的検査用要素 中でのその使用に関するものでおる。

したがって本発明の目的の１つは、新規な螢光性化合物を提供することである。

別の目的は、生物学的活性基と染料基とを有する新規な螢光性化合物を提供する ことである。

さらに別の目的は、実質的に非発色性の（ａｃｈｒｏｍｏｐｈｏｒｉｃ　）基を 含′０新規な螢光性化合物を提供することである。

さらに他の目的は、この新規螢光性化合物を使用す、　る生物学的検査装置素を 提供することである。

発明の要旨 本発明の前記の目的および他の目的ならびに効果は、生物学的活性基と下記の一 般式（１）の染料基とを有する新規な螢光性化合物の使用によって達成できる。

式ｔｔ＋において、Ｒはアルキル基、好ましくは炭素原子１−６個のアルキル基 、または親水性基である。

Ｒ１は水素であり、あるいは、ＲとＲ１が一緒になって６員ベンゼン基を形成す るのに必要な、たとえばベンゾビラン基を形成するのに必要な炭素原子を弄す。

このベンゼン環はその中の置換可能位置においてメトキシ基またはＥｔ０２ＣＣ Ｈ２〇−基の如き置換基を有し得、あるいは、このベンゼン環の２個の炭素原子 に２価の一０ＣＲ＝ＣＨ−基が付加してなる縮合環系であってもよい。

Ｒ２およびＲ３はそれぞれ個別的に−ＣＮ、−ＣＯＲ，、−ＣＯＯＲ８の如き電 子吸引性基を弄し、あるい（グこのような電子吸引性基で置換されたフェニル基 を表し、または、Ｒ２およびＲ３は、それらと結合した炭素原子と−ｇになって 、式＋ｎ＋の基を弄す。

式（Ｉｌｌにおいて、Ｘは、５または６員の炭素環式基または複素環式基（置換 された環および網金環構造を有するものをも包含する）ｔ−表す。この炭素環式 基の例には、次式 のインダンジオン基があげられる。複素環式基の例には、次式 のバルビッール酸基があげられる。

Ｒ１およびＲ５の各々はそれぞれ個別的にアルキル基、好ましくは炭素原子１− ６個のアルキル基、または親水性基を表す。あるいは、Ｒ５はＲ６と一緒になっ て＋ＣＨ２＋ｒを弄す。

またはＲ６は水素を弄す。

Ｒ７はアルキル基、好ましくは炭素原子１−６個のアルキル基、またはフェニル 基の如きアリール基金表す。

Ｒ８はアルキル基、好ましくは炭素原子１−６個のアルキル基、フェニル基の如 きアリール基、または親水性基を衣す。

Ｒ９およびＲ工。の各々はそれぞれ個別的に水素を表し、またはアルキル基、好 ましくは炭素原子１−６個のアルキル基を弄し、または親水性基を表す。

本明細書に使用された用語゛親水性基”は、当該分子の水中溶解性を改善し得る ような基を意味する。

本発明の好ましい具体例では、Ｒ％　Ｒ４、Ｒ５、Ｒ８の少なくとも１つは親水 性基であシ、あるいは、Ｒ２とＲ３とが一緒になって、式（ｎ）で示されるよう な５または６員の炭素環式基または複素環式基を表す。

生体中の液の検査の際に通常みられる問題の１つは、この系の成分中への標識染 料（ダイ・ラベル）の非特異性吸収であって、ごれによって、正しい検査結果が 得られなくなる。多くの場合において、これによって生じる非特異性結合は疏水 性のものである。ごの非特異性結合の形成を最小限に抑制するために、染料分子 を親水性にするのが好ましい。この目的のために、この分子中の少なくとも１つ の位置に、好ましくは２つの位置に親水性基を導入できる。このように分子を構 成することによシ、疏水性染料分子の゛露出部”が少なくなるでちろう。また、 多くの染料が種々の溶媒の中で凝集することも公知でちる。１またはそれ以上の 親水性を存在させることによって、水中におけるこの凝集現象を最小限に抑制で きるであろう。本発明の生物学的共役体は、血しようや血清の如き生体散の生物 学的検査等の種々の分野において有利に使用でき、したがって、この共役体の中 に１またはそれ以上の親水性基を存在させるのが好ましい。さらに、弐（ＩＩ） の炭素環式基および複素環式基はこの化合物の光学的性質（すなわちスペクトル 的性５Ｍ）を変改し得るものであるから、これを利用して化合物の吸収および発 光スペクトル極太の値を種々変えるごとができる。

本発明の化合物に導入するのに適した親水性基の例にはカルボン酸基（−Ｃ００ Ｈ）；一般式％式％ （ここにａは１−２０の整数である）の基（たとえばポリエチレンオキサイド基 ）の如きポリエーテル基；一般式 ％式％ （ここにｂは１−２０の整数である）のポリアルコール基；一般式 ％式％ 〔こごにＲ１１およびＲ１２の各々はそれぞれ個別的に水素、アルキル基（好ま しくは炭素原子１−６個のアルキル基）、アリール基（たとえばフェニル基）、 マたは次式 のポリアミン基である〕の第１、第２または第３アミン基；スルホン酸基（−Ｓ ○３Ｈ）；一般式％式％） 〔ここにＣは１−８の整数であシ、Ｒ１３およびＲ１４の各々はそれぞれ個別的 に水素、アルキル基（好ましくは炭素原子１−６個のアルキル基）、置換アルキ ル基（たとえばカルボキシル基またはスルホ基で置換されたアルキル基）、アリ ール基（たとえばフェニル基）または置換アリール基を表す〕のホスホン酸基ま たはホスホン酸エステル基；一般式 ％式％） のホスフェート基ニ一般式 ÷ＣＨ２辷＝ＯＰＯ（ＯＨ）　（ＯＲよ、）〔ごこにＲ１５はアルキル基（好ま しくは炭素原子１−６個のアルキル基）またはアリール基（たとえばフェニル基 ）である〕のホスフェートエステル基；　一般式％式％） 〔ここに’Ｒ１６はアルキル基（好ましくは炭素原子１−６個のアルキル基）で ある〕のホスフィン酸基；一般式 ％式％（） 〔ここにＲ１７は一＋−ＣＨ２→−基、またはアリール基〔たとえばフェニル基 である〕のボロン酸基すなわちボロン酸基；および一般式 ％式％） のボリン酸基があげられる。後で詳細に説明するように、本発明の化合物は同種 の親水性基全１個またはそれ以上有していてもよく、あるいは、種々の種類の親 水性基をそれぞれ１個以上づつ有していてもよい。

式［１）に記載の染料基のうちの若干のものは、米国特許第３，８５２，６８３ 号明細書に開示された公知の基であって、その例には、次式 ％式％ チルアミノステリル−４Ｈ−１？ラン（ＤＣＭ　）があげられる。ＤＣＭは強螢 光性メロシアニン染料の１種であって、ストークスシフト値が犬である（λｍａ Ｘ、ａｔ）８．””４　ｓ　ｉ　ｎｍ　；λｆｌｕｏｒｏ、　ｅｍｉｓｓ、　− ６４４ｎｍ；　工１ノール）。本発明の新規結合体は、式ｆｌ）の発色団と生物 学的活性基とを有し、しかしてこの生物学的活性基は２価の非発色性結合基（Ｌ ＩＮＫ　）を介して染料基（発色団）に結合している。用語゛非発色性基”は、 染料基の吸収スペクトル特性に、認め得る程のシフトを全く起こさない基を意味 する。このような結合は、非共役結合であるべきである。

かように、本発明の化合物は一般に、２価の結合基（Ｉ、工ＮＫ　）を介して生 物学的活性基に結合した染料基を有し、このＬＩＮＫは、生物学的活性種と反応 してその生物学的活性基にごのＬＩＮＫを介して染料の発色団系を結合させ、標 識化生物学的薬剤を生成し得る実質的に非発色性の基である。

前記の生物学的活性基（略称Ｂ工０基）ｌｌ−ｃ式（１１の染料基内のＲ，Ｒ２ 、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ９またはＲＩＯによって占められたいずれかの位置に結 合し得る。Ｒがメチル基の如きアルキル基である場合には、この位置において染 料基に生物学的活性基を結合させるために、２価の基が使用できる。この方法に よって作られた標識化生物学的薬剤は、次の一般式（Ｉｌｌ）で表すことができ る。

上式中のＢＩＯは生物学的活性基、たとえばＤＮＡプローブ、抗体、抗原、ハプ テン、Ｆａｂ−フラグメントの残基である。

染料基がＤＣＭ″′Ｃある場合には、標識化生物学的薬剤は次式で表すことがで きる。

ＢＩＯ基の置換基と結合し、かつ反応性を有して、弐〇）、（ＩＶ　Ａ）および （ＩＶ　Ｂ）の化合物の如き本発明の標識化結合体を形成し得るＬＩＮＫ基とし て有用な官能基の例には次のものがあげられる。なお、下表には、Ｂ工ＯＮ−ヒ ドロキシサクシン　アミノ基 イミドエステル基　（α−アミノ基；リジン基）イミドエステル基　アミン基 アルデヒド基　アミノ基 混合アルデヒド基　請求核性基 インチオシアネート基　請求核性基 ２．４−ジクロロ−５− トリアジン基　請求核性基 ジアゾニウム塩の基　トリプタミン基；ヒスタミン基 ブロモアセチル基　ヒスタミン基；ｓＨマレイミド基　ｓＨ 活性ジサルファイド結合 （たとえば２−ぎリジ　ｓＨ ルジサルファイド基） 一般式（１１に示される染料基および結合基を有する化合物の例には次のものが あげられる。

または 式（ＶＡ）および（ＶＢ）の染料基にＬＩＮＫ基を結合させる場合には、ＬＩＮ Ｋ基として、次式 のＮ−ヒドロキシサクシンイミドエステル基、または次式 のマレイミド基を結合させるのが好ましい。

したがって、このようにして得られた化合物の例には、次式 の化合物があげられる。

式（ＶＩＡ）および（ＶＩＢ）で例示されるような化合物を蛋白質の基のような 生物学的活性基と反応させた場合には、染料基と生物学的活性基とをつないでい る活性結合基が別の構造のものになることもあり得るであろう。

Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステルの場合には、生物学的結合体は、次式 ％式％ で表現でき、マレイミド基の場合には、生物学的結合体は次式 で表現できることもあり得る。

他の種々の結合基も本発明の結合体に使用できる。

たとえば、既述の親水性基は実質的に非発色性であシ、そしてこれらのうちの若 干から導かれた誘導体が、適当な結合基として使用できる。たとえば、ＮＦ２− 基はアミドに変換でき、そしてそこに生物学的活性基が結合でき、これによって 　−ＮＨＣＯ−Ｂ工Ｑ基が生じる。さらに、１つの具体例では親水性基が結合基 に結合できる。

たとえば第１アミンの場合には、水素原子の１つがアミドに変侠でき、それに既 述の如く生物学的活性基が結合でき、他の水素原子は親水性基〔たとえば（ＣＨ ２）ｚ”０３Ｈ２”ｌに変換できる。容易に理解され得るように、染料基を生物 学的活性基に結合させる手段として役立つ前記結合基は１だ、親水性基を結合状 態で保つこともできる。さらに、結合基はまた親水性基としての役割も果たすも のであってもよく、その例を以下に示す。

Ｈ 本発明の標識化螢尤性化合物（σ犬なるストークシフト？有するから、これは、 螢光性標識を活性化させるエネルギートランスファ機構を利用した診断用検査の 如き種々の利用分野において有利に使用できる。

一連の螢光性標識化合物に次式で表すことができる。

。。にＲ工、は−○Ｈまたは であシ、Ｂ工、は炭素原子１−６個のアルキル基たとえばメチル基またはエチル 基でおり、ｄは１−６の整数である。

結合基が染料基に結合した構造を有する本発明に係る一部の化合物は、一般式 ％式％ （ここにｄおよびＲ１９は既述の意味を有する）で表すことができる。

一般式（Ｉ）の染料の例として、次式 〔ごこにＲ２０はアルキル基好ましくは１−６個の炭素原子を有するアルキル基 、たとえばメチル基、または−＋−ＣＨ２→−Ｃ○ＯＨであり；Ｒ２１は−←Ｃ Ｈ２→丁ＮＲ２２Ｒ２３であシ；Ｒ２２およびＲ２３の各々は水素であシ、ある いは、これらと結合している窒素原子と一緒になってマレイミド基を表し；Ｒ１ ９は前記の意味を有する〕を有する一部の染料があげられる。

一般式＋１＋の染料の３Ｊの例として、次式Ｒ２，−？”Ｉ−ＣＨ＝　ｃＨ−１ １−≦］二＼−Ｒ２１（Ｘｌ（ここにＲ２０およびＲ２１は既述の意味を有する ）を有する染料があげられる。インドリン環上の結合可能位置のうちの１つに結 合した結合基を介して生物学的活性基金、当該染料基に結合できる。

一般式（１１の染料のうちで、カルボン酸系親水性基を有し、かつ所望に応じて ポリアルコール系親水性基を有し得る一部の染料は、一般式 （ここにＲ２４はアルキル基好ましくは炭素原子１−６個のアルキル基たとえば メチル基、または−（ＣＨＯＨ）　３−−ＣＨ２０Ｈｉ　ｆｉし；　ｄおよびＲ １９は既述の意味を有する〕で表される。

一般式ｆｌｌの染料のうちで、ポリアルコール系親水性基１個と、保護された結 合基とを有する一部の染料は、一般式 （ここにｄおよびＲ１９は既述の意味金有する）で表される。

１個またはそれ以上の親水性基および／または結合基を有する一部の染料は、一 般式 〔ここにＲ２５は水素またはアルキル基、好ましくは炭素原子１−６個のアルキ ル基、たとえばメチル基またはエチル基であ’）　；　Ｒ２６は−（ＣＨ２）ｅ Ｌ−ＰＯ（ＯＣＨ２ＣＨ３）２、−（ＣＨ２）ｌｌｌＣＨＯＨＣＨ２０Ｈまたは 　−（ＣＨ２）ａ−ＰＯ３Ｈｚであシ；Ｒ工、およびｄは既述の意味を有する〕 で表される。

ホスホン酸エステル系親水性基およびマレイミド系結合基を有する一部の標識化 合物は、一般式（ここにＲ２７はアルキル丞、好１しくは１−６個の炭素原子を 有するアルキル基、たとえばメチル基等でらシ、ｄおよびＲ１９は既述の意味を 有する）で！３れる。

一般式（＋１化合物のうちで、親水性基を２個有する一部の化合物は、次式 〔ここにＲ２８はアルキル基、好デしくに１−６個の炭素原子を含むアルキル基 、たとえばメチル基やエチル基等であり、またｆｉ　（ＣＨ２）、Ｃ０ＯＨもし くは−ＣＯＮ（ＣＨ３）　（ＣＨＯＨ）　、ＣＨ２０Ｈであり；Ｒ２９は−ＣＮ 。

−ＣＯＯＣＨ２ＣＨＯＨＣＨ２０Ｈ！たは　−ＣＯＯＣＨ２ＰＯ３Ｈ２テ、ｓ　 り　；Ｒ３０は　−（ＣＨ２）　（ＣＨＯＨ）３ＣＨ２０Ｈ，（ＣＨ２）ａ−Ｐ Ｏ（ＯＣＨ２ＣＨ３）２己 または−（ＣＨ２）、Ｌ−ＰＯ３Ｈ２であり　；　Ｒ３１は水素、−Ｃ０Ｃ）（ ２Ｂｒは既述の意味を有する〕で弄されるものである。

一般式ｆｉ＋の染料基、および結合基金有する化合物の具体例には、次のものが あげられる。

本発明の標識化生物学的結合体のうちの一部の結合体は、次式 ０こに２は次式 ○ ■ ＣＨ３ の基であり；Ｒ，Ｒ１９およびｄは既述の意味を有する）で弄される。

本発明に係る別の一部の標識化生物学的結合体は、次式 〔こごにＲ３２はアルキル基、好丁しくに１−６個の炭素原子を有するアルキル 基、たとえばメチル基、エチル基等であシ、筐たは　−（ＣＨ２）２ＣＯＯＨ。

（ＣＨ２）２ＣＯＯＣＨ２ＣＨ３筐たは（ＣＨ２）２ＣＯＮ（ＣＨ３）ＣＨ２（ ＣＨＯＨ）４ＣＥ（２０Ｅ（Ｔあり；Ｒ３３ｉ’！−（ＣＨ２：ｈＰ０３Ｈｚ、 −ＣＥ（２（ＣＨＯ）り３ＣＨ２０Ｈｊた（グーＣＨ２ＣＨＯＥ（ＣＨ２０ＨＴ 　６す；ｚ′は次式の基であり、Ｒ４ｇは既述の意味を有する〕で表される。

これらの化合物では、Ｚ′で表さｎる生物学的基が、親水性基の付いた結合基を 介して染料基に結合している。

本発明に係る別の一部の標識化生物学的結合体（グ、次式 ％式％ ｉ丁（ＣＨ２）２Ｐ○３Ｈ２であり；Ｒ％　Ｒ１９、Ｚ′およびｄ（ζ既述本発 明に係るさらに別の一部の標識化生物学的結合体は、次式 （ここにＲ，ＲおよびＢＩＱは既述の意味を有する）で表される。

式（Ｘ■）の標識化生物学的結合体の水中溶解度を測定した。一般に、次の操作 を行い、すなわち、この結合体の溶液を作り、ろ過によって余剰の結合体を除去 し、ろ液の光学濃度を測定した。ろ液の光学濃度および染料分子の吸収係数（ε ）からこの結合体の濃度を算出した。化合物（追ＴＩＡ）　ＣＲ３２＝メチル基 ；　Ｒ１９＝エテル基：　Ｒ３３＝　（ＣＨ２）２”０３Ｈ２：　ｄ　＝　２　 ’Ｊ、化合物１１１Ｂ）　ＣＲ３２＝）ｆｋＭ　；　Ｒ１９＝ｘｆｋ’＆　；　 Ｒ３３＝−ＣＨ２（ＣＨＯＨ）３ＣＨ２０Ｈ：　ｄ＝　２　〕、および化合物（ 追上Ｃ）ＣＲ３□＝　（ＣＨ２）２ＣＯＯＨ；　Ｒ１，−エテル基；　Ｒ３３＝ −ＣＨ２（ＣＨＯＨ）３ＣＨ２０Ｈ；ａ＝２１の溶解度はそれぞれ２．５　Ｘ　 １０−４モル／ｌ、２．［］Ｘ１０−５モル／ｌ、および４Ｘ１０−’モル／ｌ であった。

−！た、ヒトの血清アルブミン（Ｈ８Ａ　）中への化合物（追１１Ａ）および（ Ｘ〜ＩＩＣ）の非特異性吸収能も測定した。

Ｈ８Ａに結合したＤＣＭの螢光収量に、Ｈ８Ａに結合していないＤＣＭの螢光収 量の値と実質的に異なる。したがって、或一定のＤＣＭ濃度を有する溶液中のＨ ＳＡ濃度が変化したときの関数として、螢光強度の変化を測定し、グラフ用紙に 、゛相対的量子効率の逆数”対”　Ｈ８Ａ濃度の逆数”の関係を示すグラフを描 くことによって、この結合体の結合定数（ｂｉｎｄｉｎｇｃｏｎｅｔａｎｔ　） 　請求めた。化合物（Ｘ■Ａ）および（Ｘ■Ｃ）の矩合係数はそれぞれ２．５Ｘ １０５モルー１、およびｉ、５Ｘ１０４モルー１であった。弐ｍｋ有する染料分 子の１種（Ｒ＝メチル基；Ｒ１＝水素；Ｒ２およびＲ３の各々＝　−ＣＮ　：　 Ｒ，＝−（ＣＨ２）２ＣＯＯＨ；　Ｒ５＝　！　ｆ　＃基；Ｒ６＝水素〕の結合 定数は７Ｘ１０’モルー１であった。

これらのデータから明らかなように、一般に標識化結合体の染料基中に１または それ以上の親水性基が存在すると該結合体の溶解度が増加し、かつ該結合体の非 特異性結合能が低下するのである。

本発明に係る新規化合物は、合成有機化学分野で公知の置換反応によって製造で きる。この化合物は一般に、米国特許第２，９６５，４８６号明細曹に記載の方 法に従って、ｐ−ジアルキルアミノ置換−ベンズアルデヒドおよび４−メチレン ビランを縮合させることによって製造できる。この反応は一般に次の反応式によ って表すことができる。

したがって、適切に官能基を付けたベンズアルデヒドおよび／またはぎラン誘導 体の使用によって、種々の官能基の付いた染料基が形成できるであろう。たとえ ば、Ｒ基としてカルボキシエチル置換基を有する染料化合物の合成の場合には、 ２−メチル−６−カルボキシエチル置換−γ−ピロンを使用するごとが必要であ る。ごれらの同族体は、Ａ、Ｂ、スミス等の論文（”　Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、　 ＳＯｃ、　”　１［１３，１５０１（１９８２）および゛テトラヘドロン、レタ ーズ”４１９３（１９７８）”］に記載の方法に従って２，６−ジメテルーγ− ピロンのリチウムジエル−ト？プロそ酢酸誘導体の存在下にアルキル化すること によって製造できる。

さらに、Ｒ４およびＲ５である官能基は合成操作の初期段階において次の方法に よって導入できる。置換アルデヒドによるＮ−メチルアニリンまたはＮ−エチル −Ｎ−アミノエチルアニリンの還元性アルキル化反応によって導入できる。これ らのアニリン誘導体に真後にホルミル化反応を行うことによってベンズアルデヒ ド化合物が得られ、そしてこの化合物を用いて所定の合成操作を行うことによっ て、Ｒ１およびＲ５の位置に所定の官能基を有する目的化合物が得られる。

染料基に結合性置換基が次の反応によって導入できる。すなわち、所定の結合性 置換基金放出し得る化合物’５７、ＤＣＭのＮ−メチルアミノステリル同族体と 反応させるのである。

式（ＶＩＡ）’ｒ有する好ましい新規化合物は、４−ジシアノメチレン−２−メ チル−６−ｐ−（Ｎ−カルボキシアルキル、Ｎ−アルキル）−アミノステリル− ４−Ｈ−ビラン（ＸＸ）と、Ｎ−ヒドロキシーサクシンイミドとを反応させるこ とによって製造できる。

（ＸＸ） 〔式（ＶＩ　Ａ）　’］ ビラン（ＸＸ）が容易に入手できない場合には、−ランのカルボキシアルキルア ミノベンズアルデヒド同族体（χＸＩ）と４−ジシアノメチレン−２，６−ジメ テルー４−Ｈ−ビランとの反応によって、−ラン（ＸＸ　）が得られる。

しかして上記のカルボキシアルキルアミノベンズアルデヒド（ＸＸ　Ｉ　）は、 それに対応するエステルの加水分解によって得られる。

アルデヒド置換基を有するエステル（ＸＸｎ　）が入手できない場合には、これ はアミノベンゼン同族体（ＸＸＩＩＩ　）のホルミル化反比、によって製造でき る。

もし所望ならば、窒素原子上のアルキル置換基ｙは、前記の化合物のいずれかの 第２アミン同族体のアルキル化反応によって形成できる。

実施例１および２に示されているように、或場合には、出発物質としてＮ−フェ ニル環状アミド金使用するのが便利であろう。この環状アミドのケト基のメトキ シル化反応によって開環し、式（ＸＸＩＩＩ）のアミノベンゼン化合物の第２ア ミン同族体が得られる。式（ＸＸＩｎ　）の化合物は其後に既述の如くＮ−アル キル化でき、中間体（ＸＸＩ［ｌ）が得られる。−（ＣＨ２）ｎ−基を得るのに 必要な数の環炭素原子を有する塊状アミドが容易に入手できる場合には、上記の 方法は好ましい方法である。

式（ＶＩＢ）の新規化合物は次の方法によって製造でき、（ａｌ　次式 のアミンを無水フタル酸と反応させて、次式の化合物を生成させ、 （ｂｌ　上記の化合物（ＸＸＩＶ）　ｔ−ホルミル化して、次式のアルデヒド化 合物を生成させ、 （Ｃ）　上記のアルデヒド化合＠　（ＸＸＶ）と４−ジシアノメチレン−２，６ −シメチルー４−Ｈ−ビランと全反応させて、次式 のビラン（、ＸＸ■）　全生成させ、次いで、（ｄ）　フタルイミド基を除去し 、其後に所望のマレイミドを生成させることによって製造できる。

本発明の標識化生物学的結合体（ζ、種々多数の利用分野で利用でき、たとえば 、生物学的検査分野では競合結合能検査（ｃｏｍｐｅｔｉ℃ｉｖｅ　ｂｉｎｄｉ ｎｇ　ａｓｓａｙ　）免疫検査、標識化薬剤を使用する免疫応答反応等において 利用できる。好ましい具体例について述べれば、０の化合物はテオフィリンやジ ゴキシン等の薬剤のモニタリング分野において使用される。すなわち本発明の化 合物は、標識化テオフィリンおよび標識化アンチ−ジゴキシンを包含する。本発 明の結合体が特に有利に利用できる検査方法の具体的な例には、免疫性測定検査 、競合結合能検査等があげられるが、これらの検査方法自体は周知であるので、 その詳細な説明（グ省略する。

このような公知の生物学的検量や試験においては、生物学的反応や相互作用の結 果として検出可能信号が生じる。たとえば、普通の免疫検査では、血清または全 面の如き体液からなるアナライ）　（ａｎａｌｙｔｅ　）含有試料を検査用要素 （ｅｌθｍｅｎｔ　）の表面に付活させる。これは其後に、標識化生物学的活性 化合物を含む層内に拡散して、この診断用要素に特有の形式に従った免疫反応が 起こシ、この反応が検出可能信号を発するが、０の信号は、液状試料中のアナラ イトの存在を知らせる信号である。このようにして発せられた信号は、信号解読 力の比較的低い系ではアナライトの存在に関する単なる定性的情報を与えるだけ であるが、より高度の信号解読力を有する系ではアナライトの半定量的または定 量的情報を与えることがあり得る。このような検査系においては、検知可能信号 を発し得る基を含む生物学的活性化合物は、いわゆる標識−■白質結合体であっ てよく、すなわち、染料基である標識または染料基を含む標識の付いた抗原、抗 体またはＦａｂ−フラグメントの如き蛋白質であってよい。

本発明の結合体はまた細胞の螢光染色のためにも使用できる。細胞は其後に顕微 鏡で観察でき、螢光性結合体の存在が、或特定のデテルミナント・サイトの存在 の有無の検査の指針となる。さらに、この結合体は、螢光活性細胞ンーグーにお ける抹消、分離または他の用途のために使用できる。

本発明を一層具体的に説明するために、次に実施例を示す。これらの実施例は本 発明の例示のために記載されたものであって、換言すれば、本発明の範囲は決し て実施例に記載の物質、操作条件等のみに限定されるものではないことが理解さ れるべきである。

（ａｌ　Ｎ−フェニルピロリドン５００ｍ９　（３−１ミリモル）をクロロホル ム１０．０ｍｇに溶解し、０°Ｃに冷却した。

次いでメタントリフルオロメタンスルホネート６５６ｍ９　（４，０ミ！Ｊモル ）を添加し、その結果得られた混合物を２５°Ｃに加熱した。約１６時間かくは んした後に、この混合物全無水メタノール１０．０ｒｎｅ中に注ぎ入れ、次いで １０分間かくはんした。其後にｌ炭酸す）　ＩＪウムの飽和浴ｇ５．０ｍＡを添 加し、この混合物を１０分間かくはんした。次いで反応混合物に抽出操作を、ク ロロホルムを用いて行い、硫酸マグネシウムで乾燥した。

ろ過し、溶媒を蒸発さセた後に、次式 Ｈ○ の純粋なエステルが５８０ｍｇ得られた。収率９０％。

ｔｂ＋　前記エステル（Ｘ追’１１）　６．０．９　（０，０３１モル）をアセ トニトリル６５ｍ６に添加し、次いでホルムアルデヒドの３７％水溶液５　ｒｕ ｂ　ｆ添加した。°其後にシアノ−ポロ水素化ナトリウム１．５．ｌ：添加し、 得られた混合物を其後に２５°Ｃにおいて６０分間かくはんした。次いでこの混 合物を水７５属中に注ぎ入れ、酢酸で酸性化した。これを其後に水浴中で９０分 間保ち、１０％炭酸カリウム溶液の添加によってｏＨｙＢに上昇さセた。

其後にこの混合物に抽出操作を、エーテル２Ｘ１００ｍＡ　ｆ用いて行い、有機 相を集めて飽和重炭酸ナトリウム溶液で洗浄し、次いで硫酸マグネシクムで乾燥 した。

この溶液をろ過し、溶媒を蒸発させた。次式の化合物が無色の油状物の形で、定 量的収率で得られた。

（Ｃ）　ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ　）　１０　ｏｍｚｖｏｏＣに冷却し、 ｐｏｃ１３２　［１，８９（０，１３５モル）全滴下した。

得られた混合ｗＪヲ其真後２５°Ｃに暖めながら１５分間かくはんした。ＤＭＦ 　ｉ　３らに１０［］ｍＡ添加し、この混合物を再びＯｏＣに冷却した。其後に エステル（ＸＸＸ■）１５．０　ｇ（０，０７２モル）のＤＭＦ　１００ｍｊｍ 浴中を、５０分間を要して滴下した。得られた混合物ｋ　５０　’Ｃに９０分間 加熱した。ごれを其後に２５°Ｃに冷却し、酢酸ナトリウム１００ｇの冷水溶液 （水の量は６００ｍＡ　）の中に注ぎ入れた。次いでこの混合物を水蒸気浴で２ ０分間加熱し、水浴で冷却し、１Ｍ−ＫＯＨで中和した。沈殿として生じた油状 物に、エーテル（３×３００　ｍＡ　）　Ｔｈ用いて抽出操作を行い、Ｋ２ＣＯ ３で乾燥し、ろ過し、蒸発操作を行った。次式 のアルデヒドが１０ｇ得られた（収率８４係）が、これはさらに精製することな く其後の工程に使用した。

（ｄ）＠記のアルデヒド（、ＸＸＩＸ　）　５．０９　（０，０２１モル）を、 エタノール５０１および１　Ｍ　−ＫＯＨ２Ｏｒｕｂ中に入れて約４時間還流し た。次いでこの混合物を冷却し、Ｉ　Ｍ　−ＭＣＩで酸性化した。生じた白色沈 殿上ろ別し、水で洗浄し、真空中で乾燥した。次式 の化合物が４．６９得られた。

（８１前記の生成物（ＸＸＸ）　’にさらに精製することなく本工程で使用した 。丁なわち、前の工程の生成物（、ＸＸＸ）１．０９　（４，５ミリモル）およ び４−ジシアノメチレン−２，６−ジメテルー４−Ｈ−ぎラン１．ｏ　ｇ＜、　 ！５．９ミリモル）’ｔ　ＤＭＦ　４０　ｍＡに添加した。次いでエチルジイン プロピルアミン０．８　ｍｌ　’ｆｉｒ添加し、この混合物を窒素雰囲気下に約 ４時間還流した。其後に反応混合物を冷却し、’ＤＭＦを高真空下に除去した。

得られた赤褐色の残留物’ｉ　ＨＰＬＣによって絹艮した。次式のビラン化合物 が４ｓｏｍ９得られた（収率２５％）。

（ｆ）　ビラン化合物１１．ＸＸＸＩ）　１００　ｍ９　（０，２６ミリモル） およびＮ−ヒドロキシーサクシンイミド３１　ｍ９　（０，２７ミリモル）を乾 燥ＤＭＦ　３　ｍｌと混合し、窒素雰囲気下に一１５°Ｃに冷却した。次いでジ シクロへキンル力ルポジイミド（ＤＣＣ）　５６　ｍ９　（０，２７ミリモル） 全添加し、得られた混合物？−１５°Ｃにおいて９０分間かくはんした。これを 其後に２５°Ｃに加熱し、約１６時間かくはんした。ＤＭＦ　ｆ高真空下に除去 し、帯赤色の残留物をアセトンｉＱｍｔに溶解し、ろ過した。ろ液を蒸発させ、 赤褐色の残留物を、フラッシュクロマトグラフィ（シリカ；１０％ＣＦ（３ＣＮ 　／　Ｃ）（２Ｃ１２）によって精製した。螢光性染料化合物（１）が７５％の 収率で得られた。

ごれは赤色粉末であって、ＤＭＳＯ、アセトン、アセトニトリルに可溶である。

λｍａｘ、　ａｂ８．　”’　４７１　：既に述べたように、本発明の係る新規 染料（ａ１親化合物（すなわちに゛アレント化合物）すなわちＤＣＭと同じ吸収 スペクトル特性を有する。例１中に記駈のデーター（４７１および６１５）とＤ ＣＭのデーター（４８１および６４４）とを比較した結果（ζ上記の説明と矛盾 すると思われるかもしれない。しかしながらこの差は測定操作に使用された溶媒 に起因するものである。

ＤＣＭは水に不溶であυ、したがって有機溶媒に溶解してスペクトル特性全測定 する。一方、化合物（１）は水溶性であり、水溶液の形で測定操作に供６れたの である。

例　２ 例１に記側の操作？繰り返した。ただし今回は、工程（ａ＋においてＮ−フェニ ルピロリドンの代わりにＮ−フェニルピペリドンを使用した。螢光性染料化合′ ａ（２１が９５呪の収率で得られた。

例）の反応生成物の生成機構は、次の反応式で表すことができる。

例　３ （ａ）　容量ｓｏｏｍｇのフラスコに塩化メチレン３ｏｏｍｇ、Ｎ−（２−アミ ノエチル）−Ｎ−エチルアニリン１６．５９　（０，１モル）および無水フタル 酸ｉｓ、ｏｇを（０，１モル）を入れた。反応混合物を６ｏ分間還流し、ついで 溶媒全蒸発させた（アスピレータ−）。無水酢酸２００ｍおよび酢酸ナトリウム ５１１ｔ−其後に添加し、得られた生成物全３時間還流し、冷却し、−晩中室温 において放置した。次いでこの混合物をろ過し、ろ液から溶媒を真空下に蒸発さ せた。固体残留物を塩化メチレンに溶解し、シリカゲルプラグを通じてろ過した 。

溶媒？蒸発きせ、黄色固体を熱いエタノールから再結晶させた。次式 の化合物が黄色結晶の形で１７．９得られた（収率５８％〕。

（ｂ）５［］Ｑｍｇ容童の乾燥したフラスコにＤＭＦ　３　ｒｎｌ　ｆ入れ、窒 素雰囲気下に０℃に冷却した。次いでｐａｃｔ３４．９ｇ（３２ミリモル〕を滴 下し、水浴を除去し、この混合物’に１５分間がくほんした。其後にＤＭＦ　５ 　Ｑ　ｍｅを添加し、混合物音ｏ℃に冷却した。化合物Ｃ，ＸＸＸ■〕９．０． ９　（３０，６ミリモルつのＤＶＦ　５　Ｑ　Ｉｎｌｎｌ液溶液下した。この滴 下の完了後に水浴を除去し、混合物を６０℃に９０分間加熱した。次いで混合物 上２５℃に冷却し、酢酸ナトリウム３０ｇ金含む水２ｓｏｍｇの中に注ぎ入れた 。生じた黄色沈殿奮ろ別し、水で洗い、次いで乾燥した。この粗製黄色固体を熱 いエタノール２００ｍｔから再結晶させた。次式 ％式％） の化合物が黄色針状晶の形で８ｇ得られた（収率８１％）。

（Ｃ）　上記化合物（ＸＸＸＩＩＩ　）　０．５　ｇ（１，５５ミリモル）、４ −ジシアノメチレン−２，６−シメチルー４−Ｈ−ビラン２７０ｍ９（１，６ミ リモル）およびジイソゾロピルエチルアミンｏ、ｉｓｍεｉ、ＤＭＦ７Ｍとに添 加し、窒素雰囲気下に６時間還流した。ＤＭＦ　ｋ　？？Ｆｒ真空下に除去し、 赤褐色の残留ｗｉ得た。この残留換金薄層クロマトグラフィ（塩化メチレン）に よって精製した。次式の化合物が赤色粉本の形で得られた。

（ｄ）　上記化合物（ＸＸＸＩＶ　）　１００■（０，２１ミリモル）を無水エ タノール１０ｍ６に添加し、次いで９５％ヒドラジン８ｒｎ９（０，２５ミリモ ル）全添加した。この混合′？ＩＪヶ１０分間還流し、溶媒を窒素流によって除 去した。

残留物全塩化メチレン中に入れ、ろ過した。ろ液上無水マレイン酸２５ｍ９　（ ０，２５ミリモル）で処理し、２５°Ｃにおいて一晩中かくはんした。塩化メチ レンを窒素流で除去し、次いでＤＭＦ　５　Ｍ＆およびジシクロへキシルカルｇ ’；　イミド（ＤＣＣ）　１０５ｍ？（０，５ミリモル）孕添加した。混合物’ に２５℃において２５時間かくはんした。螢光性染料化合物（′５）が赤褐色粉 本として得られた。収率く９５％；　ＤＭＦに可溶。

例　４ ウサギの血清（Ｆａｂ　ａｎｔｉ−Ｈ８Ａ　ｒａｂｂｉｔ　ｓｅｒｕｍ　）　１ ．８５Ｘ　Ｉ　Ｑ−７モルおよび式（１）の螢光性染料９．２６　Ｘ　１０−’ モル全、緩衝ｇ（０，Ｉ　Ｍ　ＨＥＰＥＳ　ｂｕｆｆｅｒ　；　Ｐ）′Ｉ８．［ ］　）に祭加し、この混合″ｆ７１Ｊ’に室温において２０分関保ち、其後にグ リシン１．３３　Ｘ　１０−’モル全添加することによつて、反応を停止した。

得られたＦａｂ−標識化結合体を、非結合螢光性染料からグルろ過クロマトグラ フィ操作（セファデックス　Ｇ５０〕によって分離した。

蛋白質上に非特異的に結合した螢光性染料全確実に除去するために、結合体含有 画分に再びクロマトグラフィ操作（セファデックス　Ｇ５６Ｄ）’に行い、第二 ゾール画分に光分に透析操作？行った。結合体の組成はスペクトル分析によって 調べた。標識ｉ　Ｆａｂ比は３：１−メチルインドール（４，０、Ｆ　；　０． ０３モル）の酢酸１５０ｍＪ中溶液を水溶液で冷却しかつかくはんしながら、こ れに、粉末状のホウ水素化ナトリウム（７，０，９；　０．１８モル）を徐々に 添加した。次いで反応混合ｗ’を室温において４時間かくはんし、６０°Ｃにお いて３時間かくはんした。反応混合物を室温に冷却し、Ｎａ２ＣＯ３（１５０ｊ ｉ　）の水１を中溶液にかくはん下に徐々に添加した。この混合物を分液漏斗に 移し、当該生成物に抽出操作？、エチルエーテル２００ｍＬ’ｆＫ用いて６回行 った。抽出物？集め、塩溶液（すなわち塩水）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥 し、蒸発操作全行った。得られた粗製生成物全蒸留した。１−メチルインドリン が沸点７２°Ｃ（１−５ｍｍＨｇ　）の無色油状物として２，８Ｉ得られた（収 率７０％）。

ＩＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ２）δ２．７３（ｓ、３Ｈ）、　２．８９（ｔ、２Ｈ，Ｊ ＝７Ｈｚ）。

３．２４　（ｔ、２Ｈ，Ｊ＝７Ｈｚ）、６．５２　（ｍ、２Ｈ）、７−０３　（ ｍ、２Ｈ）。

水浴上で冷却したＤＭＩＦ５　ｍＡにオキシ塩化燐（１，２３ｙ　；　ｏ、ｏ　 ｏ　ｓ　ｏモル）を徐々に滴下した。得られた溶液全５分間かくはんし、これに １−メチルインドリン（１−０９；　０．００７５モル）　ノＤＭＦ　２ｍｅ中 溶液ヲ滴下した。これによって得られた混合物を水浴中で５分間かくはんし、つ いで室温において１時間がくはんし、最後に８０°Ｃにおいて２時間かくはんし た。反応混合物を室温に冷却し、かくはん下に水中に徐々に注ぎ入れ、エチルエ ーテル？用いて抽出操作を行った。得られた粗製油状物にクロマトグラフィ操作 （シリカゲル；　８０　／　２０　（ｖ／ｖ　）　ＣＨ２Ｃ２２／　ＥｔＯＡｃ 　）　ｆ行った。

５−ホルミル−１−メチルインドリンが融点３９−４１°Ｃの黄色固体として０ ．７４５　ｇ得られた（収率６２％）。

ｌＨＮＭＲ（ＣＤＣ４３）δ２．７９　（ｓ、３Ｈ）、　２．８９　（ｔ、２Ｈ ，Ｊ　＝７）。

３．４３　（ｔ、２Ｈ，、Ｔ＝７）、　６．２５　（ｄ、１Ｈ，Ｊ＝１０）、　 ７．４６　（ｍ、２Ｈ）。

９−５６　（ｓ、１Ｈ）。

上記の５−ホルミル−１−メチルインドリン（０，５００，９；　０．００３１ モル）？４−ジシアノメチレンー２゜６−シメチルー４−Ｈ−ピラン（０，７０ ０Ｆ　；　０．００４１モルＬ　ＤＭＦ　（７，５ｍ’）およびエチルジイソプ ロピルアミン（０，５ｍ５）と混合し、この混合物を窒素の存在下に８時間還流 した。噴色の反応液ヲ室温に冷却し、かくはん下に塩水１００ｍ１中に注入した 。粗製生成物を集め、水で洗浄し、クロマトグラフィ操作（シリカゲル；　ＣＨ ２Ｃｌ２　）を行った。次式の化合物が赤色固体の形で２５０ｍ９得られた（収 率２６係）。

ＩＨＮＭＲ（ＣＤＣ２３）δ２．３１　（ｓ、　３Ｈ）、　２．７９　（ｓ、　 ３Ｈ）。

２．９２　（ｔ、　２Ｈ）、　３．４２　（ｔ、　２Ｈ）、　６−２−６．５　 （ｍ、　４Ｈ）。

７．１−７．４　（ｍ、　３Ｈ）、　Ｖｉｓ　（ｍｅｔｈ、　ｃｅＬｌ）：λｍ ａｘ　＝４７７　ｎｍ　（ε＝５３．２５１１）、　Ｆｌｕｏｒ、　ｅｍｉｓｓ 、　（ＤＭＳ○）：　６６８　ｎｍ。

上記生成物（２５ｍ９；０．０８ミリ−１１−／ｌ’　）　ＯｃＨ２ｃｚ２５　 ｍＬｃｐ溶液金、製造用シリカケゞルＴＬＣプレートに供給し、６時間乾燥した 。次いでこのプレートにおいてＣＨ２Ｃ４２ｉ用いて浴岨操作？行った。上記生 成物よシ少し高いＲｆ　ｉ有する黄色帯域（バンド）？削り取シ、抽出操作全行 った。抽出？！］會蒸発させることによって、次式 の化合物が、オレンジ色の結晶の形で６．２　ｍ９　（収率２５％）得られた） 。

ＩＨＮＭＲ（ＣＤＣ／！、３）δ２．３８　（ｓ、　３Ｈ）、　３．８３　（ｓ 、　３Ｈ）。

６．４−６−７　（ｍ、　４Ｈ）、　７．０−７−８　（ｍ、　５Ｈ）、　Ｖｉ ｓ　（ｍｅｔｈ。

１．１，１．３．３．３−へキサメチルジシラヂン（３，４ｍｇ　：　０．０１ ６モル）の乾燥ＴＨＦ　６［１ｍｅ中浴溶液乾燥窒素流のもとてか（はん下に一 ７８°Ｃに冷却し、そしてこれに、ｎ−ブチルリチウム９．６５　ｍｔ　（０， ０１６モル）（ヘキサノ９１．６フ 加した。１時間後に、２．６−シメチルーγーピロン（　２．０　Ｆ　；　０． ０　１　６モル）の乾燥ＴＨＦ　４　５　ｍｌ中溶液全、部下漏斗を用いて３０ 分間？要して添加した。得られた明るい黄色の溶液全３０分間かくはんし、次い でブロモ酢酸ｔーブチル（２．６ｆｆル；　０．０　１　６モル）を注射器で滴 下して処理した。混合物を徐々に一１０°Ｃに暖め、−晩中放置した。この混合 換金分液漏斗に移し、エーテルを用いて抽出操作全行い、Ｉ　Ｎ　−ＨＣｔ５　 Ｑ　ｍｌおよび水５Ｑｍｔで順次洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒全蒸 発させた後に、次式 の生成物がコハク色の油状物として３．９Ｉ得られた。

”ＨＮＭＲ（ＣＤＣ６３）　１−４５　（ｓ、　９Ｈ）、　２−２　（ｓ、　３ Ｈ）。

２．４−２．９　（ｍ、　４Ｈ）、　６．０　（ｂｓ、　２Ｈ）。

この油状生成物のＴＬＣおよびＮＭＲ分析の結果、これは全く純粋であることが 確認され、したがってこれは、きらに精製することなく真後の工程に使用した。

ピロンエステル（ＸＸＸ５ＩＩ　）　（４，２，９；　０．０１８モル〕および マロンニトリル（１，２８，９；　０．０１９そル）をＡｃ２０９　ｍＬ中で還 流下に３時間加熱した。高真空下で蒸発させ、次いでシリカデルクロマトグラフ ィ操作（ＣＨ２Ｃ４２）　’に行い、ヘキサンから貴結晶させることによって純 粋な生成物が得られ、すなわち、次式の化合物が、薄肯黄色の針状結晶として得 られた。

↓Ｈ服Ｒ（ＣＤＣＡ３）δ１−４５　（ｓ、　９Ｈ）、　２．３　（ｓ、　３Ｈ ）。

２．４５−２．９５　（ｍ、　４Ｈ）、　６−５　（ｓ、　２Ｈ）−前記のジシ アノメチレンビラン（ＸＸＸＶＩＩＩ　）　（１０３ｍ９；　０．３６ミリモル ）のＣＨ２Ｃｌ２２　ｍｅ中浴溶液室温において調製し、トリフルオロ酢酸Ｑ、 ５ｍｊで処理し、得られた混合？！ｌｌ−アルゴン中で５時間かくはんした。乾 燥状態になるまで蒸発させた後に、次式の化合物が黄褐色固体の形で定量的収率 で得られた。

ｌＨＮＭＲ（δ４−メタノール／ＣＤＣ１３）　δ２．３４　（ｓ、９Ｈ）。

２．５５−３．０　（ｍ、　４Ｈ）、　３．０　（ｓ、　３Ｈ）、　６．５５　 （ｂｓ、　２Ｈ）−例　７ Ｎ−メチルアニリン（３，６ｍＬ；　０．０３３　モル）およびＤ　−Ｈ−リボ ース（５，０，９；　０．０３３モル〕を無水エタノール１［］Ｏｍε中に含有 してなる混合物音、アルゴン中で６時間還流した。溶媒？真空下に除去した後に 、得られたコハク色のシロップ状液金再び無水エタノール１００ｍεに溶解し、 シアノ−ホウ水素化ナトリウム（２，０７，９；　０．０３３モル〕で処理した 。混合物全室温においてかくはんし、ｐｌ（’（ｒ約５−６（指示薬：ブロモク レゾール）に維持するように２　Ｎ　−ＨＣｔ−Ｆ、ｔＯＨ溶液（無水溶液）を 添加した。

１時間後に回転蒸発器で溶媒を除去し、残留物全過剰量のＨＣｔ−ＥｔＯＨ浴液 （無水溶液で）注意深く処理し、そして再び真空下に蒸発操作を行った。この一 連の操作を３回繰り返した。残留物？再び無水エタノールｉＱＱｍｌ中に入れ、 Ｋ２ＣＯ２（１０ｐ　）で３時間処理し、次いで吸引ろ過？行い、ろ液？蒸発で せた。

得られた粗製生成物をピリジン（２５Ｄｍｇ）に浴解し、無水酢酸（３１ｍＬ； ０．３３モル〕で処理し、室温において一晩中放置した。高真空下に揮発物を除 去し、生成物音クロマトグラフィ操作（シリカケゞル；１％ＭｅＯＨ；　ＣＨ２ Ｃ４２中）によって精製した。次式の生成物が、少なくとも１つの極性バンドと して溶離された。収量１．１２　＆　（収率９％〕。

１ＨＮＭＲ（ｃＤｃｚ３）δ１．８５　（ｓ、３Ｈ）、２．０５　（ｂｓ、６Ｈ ）。

２−１５　（ｓ、３Ｈ）、２．９　（Ｓ、３Ｈ）、３−３−３．６５　（ｍ、２ Ｈ）。

４．１　−　４．４５　（ｍ、２Ｈ）、５．２−５．５　（ｍ、３Ｈ）、６．６ −６．７５（ｍ、３Ｈ）、７．１　−７．３　（ｍ、２Ｈ）−オキシ塩化燐（０ ，２８ｍ６；０．００３０％ル）ｋＤＭＦＯ，７ｍＪ（０，Ｏｏ　８９モル〕に かくはん下に滴下した。

半時間後に上記生成物（ＸＬ）（１，１Ｎ；０．００２７モル）のＤｌｖｌＦ　 ５　ｍｌ中溶液？添加し、その結果得られた６０°Ｃにおいて６時間かくはんし た。冷却した溶液を水（数ｍｌ　）の中に入れ、塩化メチレンを用いて抽出操作 δ２回行った。クロマトグラフィ操作（シリカゲル；１％ＭｅＯＨ；　ＣＨ２Ｃ ２２中）によって精製生成物が得られ、すなわち、次式 の化合物が０．３６　Ｆ得られた（収率３０％）。

Ｍ”　（４３７）。

ｌＨＮＭＲ（ＣＤＣ４３）δ１．８４　（ｓ、　３Ｈ）、　２．０５　（ｓ、　 ３Ｈ）。

２．１３　（ｂｓ、　、６Ｈ）、　５−０　（ｓ、　３Ｈ）、　３．４−．５． ８　（ｍ、　２Ｈ）。

４．１−４．４５　（ｍ、　２Ｈ）、　５．２−５．４　（ｍ、　３Ｈ）、　６ ．７　（ｄ。

Ｊ　＝　１０　Ｈｚ、　２Ｈ）、　７．７　（ｄ、　Ｊ　＝　１０　Ｈｚ、　２ Ｈ）、　９．７（ｓ、　ＩＨ）。

例　８ 例７に記載の化合物（ＸＬ）の製造のためのアミノアルキル化反応會少く変改す ることによって、次式の化合物が得られた。

すなわち、アミノエチルーエチルアニリ７　（２，ＯＦ；　０−０１２２モル） およびＤ　−Ｈ−リボース（１，８４＆　；　０−０１２３モル〕ゲ混合し、室 温においてアルゴン中で一晩中かくはんした。酸性ＥｔＯＨ中で、シアノ−ホウ 水素化ナトリウム（０，７８＆　；　０．０１２３モル〕で還元し、通常の方法 で還元生成物を集め、シロップ状の粗製生成物會得た。

この粗製生成物？クロマトグラフィ操作（シリカゾル；塩化メチレン中酢酸５％ 、メタノール１０％）によって精製した。無水メタノール２０ｒｒｕ中でビスー ＨＣ４塩が生じ、これはエーテル２００ｍｔ中で析出し、化合？り　（ＸＬＩＩ 　）が吸湿性固体として１．５２　ｇ得られた（収率３３％〕。Ｍ”　（２９８ ；遊離塩基として〕。

ｌＨＮＭＲ（ｄｓ−ピリジン、ＣＤＣ４３）　δ１．１５　（ｔ、Ｊ　−７Ｈｚ 。

３Ｈ）、　３．２−４．０　（ｍ、　１３Ｈ）、　５．０　（ｂｓ、　ｅｘｃｈ ａｎｇａｂｌ、）。

６．７−７．１　（ｍ、　３Ｈ）、　７．．２−７．５５　（ｍ、　２Ｈ）。

次式 の化合物（０，６５＆　；　０．００２４モル〕およびトリエチルアミン（１， ０５腕；　０．００７５モル）のＤＭＦ　１２ｍｌ中溶液に５°Ｃにおいてか（ はん下に、１　、１　、１．−トリメチルアセチルクロライド（０，３１ｍｇ　 ；　０．００２５５モル〕を添加した。その結果得られた白色ミルク状懸濁液を １時間かくはんし、次いで、化合物（ＸＬＩＩ　）およびトリエチルアミン０． ３５ｍＡ（ｏ、ｏ　０２５５モル〕’；ｆ　ＤＭＦ　３　Ｑｍｂ中に含有してな る混合物音滴下することによって処理した。かくはん？５°Ｇにおいて３０分間 続け、次いで室温において１時間続けた。高真空下に蒸発させた後に、得られた 中間生成物にクロマトグラフィ操作（シリカゲル；１０％ＭｅＯＨ；　ＣＨ２Ｃ ｌ２中）？行うことによって、次式 （ここにＲは水素である）の結晶質ポリアルコールが得られた。

このポリアルコール？ピリジン２０ｍ１ｊ中に入れ、無水酢酸（２，３ｍｔ　； 　０．０２４２モル）で処理し、室温において２日間放置した。揮発物音高真空 下に除去し、残留物？エーテル中に入れ、水で洗浄し、乾燥し、蒸発操作ケ行っ た。クロマトグラフィ操作（シリカゾル；　２−５　％　ＭｅＯＨ：　ＣＨ２Ｃ ｔ２Ｈ２Ｃ上って固体フオーム（ＸＩＪ　）　（？：−コＫＲＢ−ｃｏｃＨ３テ ロ１　）カ１．０９得られた（収率５６％〕。Ｍ”　（５４６）。

”ＨＮＭＲのデーターは複雑でめったが、この生成物の構造に調和したものであ った。

上記のポリアルコール中間体（ＸＬＩ））（コこＫＲｌｄ−ＣＯＣＨ３である〕 にホルミル化反応？、化合物（ＸＬＩ）の台底方法の説明のところで述べたホル ミル化方法に従って行った。ただし加熱時間は一晩中に延長した。

次式 （ここにＲは−ＣＯＣＨ３でろる）の中間ベンズアルデヒド化合物が得られた。

この中間体にクロマトグラフィ操作（シリカゾル；３％ＭｅＯＨ；　ＣＨ２Ｃｔ ２Ｈ２Ｃ上い、得られた固体フオームケメタノール中に入れ、トリエチルアミン （２０当量〕で処理し、７時間還流した。高真空下の蒸発操作の後に、薄青黄色 固体の形の化合物（ＸＬＶ　）　（ここにＲは水素でおる）が得られた（全収率 ４９％〕。Ｍ＋（５７５）。

ｌＨＮＭＲのデーターは複雑であるが、この化合物の構造に調和するものであっ た。

例　９ 化合ｖｌＪ（ＸＬＩ　）　（０，３５５Ｆ　；　０．０００８−＋＝ル）、化合 物（ＸＸχＩ’ｌｌｉ　）　（０，２３＆　；　０．０００８モル〕およびピペ リジン（８μｔ　；　ｏ、ｉ当量〕會ピリジン４　ｍｇ中に含有してなる混合物 ？−一晩中流した。高真空下に揮発物？除去し、残留物にクロマトグラフィ操作 （シリカゲル；１％ＭｅＯＨ；　ＣＨ２Ｃｔ２中〕？行うことによつ（ここにＲ は−ＣＯＣＨ３であり、Ｒ１はｔ−ブチル基である〕の化合物が０．１７１得ら れた（収率３０％〕。

この化合物ｋ　ＣＨ２Ｃ４２３ｍｌに溶解し、トリフルオロ酢酸２　ｍｔで処理 し、室温において４時間かくはんした。

この混合物に蒸発操作を、乾燥状態になる迄行い、得られた残留物にクロマトグ ラフィ操作（シリカゲル；５％Ｍｅ　ＯＨ；　ＣＨ２ＣＬ　２中）を行うことに よって、化合物（ＸＬＶ）（ここにＲは−ＣＯＣＨ３でらシ、Ｒ１はＨである〕 が、９０％の収率で得られた。

化合物（ＸＬＶｉ　）　（ここにＲは−ＣＯＣＨ３テロ　り、Ｒ′ハＨである〕 ？メタノール中で、触媒作用を有するナトリウムメトキシドで処理することによ って、アセチル保護基が定量的に除去された。クロマトグラフ操作（シリカゲル ；　５　％　ＨＯＡｃ　；　Ｉ　Ｑ　％　ＭｅＯＨ；　ＣＨ２Ｃ４２，２中〕の 後に、化合’＠　（ＸＬＶ）　（ここにＲ＝Ｒ’＝Ｈ）が、良好な螢光性ヶ有す るオレンジ色固体として得られた。

Ｍ”　（４８１）。

ＩＨＮＭＲのデーターは複雑であるが、この化合物の構造に調和するものでめっ た。

例８に記載の薄青黄色固体化合物（ＸＬＶ　）　（ＲはＨである）（７１ｍｏ； 　０．１２４ミリモル〕、化合物（ＸＸＸＩＸ　）　（２８ｍ９：　０．１２４ ミリモル〕およびピペリジン（１，２μｔ　；　ｏ、ｉ当量）會ピリジン２ｍｔ 、中に含有してなる混合物？アルゴン雰囲気下に一晩中還流した。溶媒の蒸発後 に得られた残留物にクロマトグラフィ操作（シリカゲル：５％ＡｃＯＨ；　１０ ％ＭｅＯＨ；ＣＨ２Ｃ４２中〕を行うことによって、次式の化合物がオレンジ色 の固体として２２■得られた（収率２３％〕。Ｍ”　（７８７）。

ＩＨＮＭＲのデーターは複雑であるが、この化合物の構造に調和したものであっ た。

例１１ ２−（２’−カルボエトキシ〕エチル−６−メチル−４−ジシアノメチレンピラ ン（２００■；　０．７７ミリモル〕、ピリジン（５ｍと〕、ピペリジン（１０ ０μｔ）およびｐ−（Ｎ−カルボベンジルオキシ−アミノエチル−Ｎ−メチルア ミン〕−ベンズアルデヒド（２４２ｍＱ　；　０．７７　ミ’Ｊモル〕の混合Ｗ ｔ、窒素雰囲気下に６時間還流した。窒紫流のもとて蒸発操作７行って溶媒金除 去し、残留物（（コラムクロマトグラフィ操作（２％ＭｅＯＨ；　ＣＨＣｔ３甲 〕？行って精製することによって、次式 の化合物が２４０ｍ９得られた（収率５６％）。

化合物（χＬ）ｌｌｌ）　（２３０ｍｇ；　０．４ミリモル〕と飽和エーテル（ ５０ｍ６）ｔ−添加し、ケイシャによって液層と沈澱固体とを分離した。この固 体？エーテル５［］ｍｅで洗浄し、ろ過し、高真空下に速やかに乾燥した後に、 遊離アミンのＨＢｒ塩が得られたが、これは、さらに精製することなく其次の工 程に使用した。

このアミンのＨＢｒ塩（約０．７ミリモル〕、ＮａＨＣＯ３（２００ｍｑ）およ びメタノール（１０ｍＬ〕の混合物に、アセトアルデヒドジエチルホスホネート 七祭加し、この混合物？窒素雰囲気下に２５℃において１７時間かくはんした。

次いで反応混合物に遠心分離操作ケ行い、ケイシャによって上澄液上分離した。

シアノ−ホウ水素化ナトリウム（４４０ｍ９：　７　ミＩＪモル〕全液状の反応 混合物に添加し、この混合物を２５°Ｃにおいて３０分間かく加した。蒸発操作 によってメタノール？除去し、次いでメタノール１０ｍＡｋ追加し、そしてこれ 會蒸発によって再び除去した。この一連の操作をさらに２回繰り返した。得られ た残留物？コラムクロマトグラフィ操作（８％ＭｅＯＨ：　ＣＨ２Ｃｔ２Ｈ２Ｃ 上って精製した。次式の化合物が赤色粉末として１４１　ｍ９得られた（収率６ ５％〕。

テオフィリン−８−ラフ酸（２５６ｍ９：ＣＪ、９６ミリモル〕ヲ、乾燥ＤＭＦ 　（３ｍｔ　）とトリエチルアミン（７５ｍ９　；　０．９６　ミＩＪモル〕と の混合物に添加した。この混合物を窒素雰囲気下にかくはん下に０６Ｃに冷却し 、トリメチルアセチルクロライド（１２０■；　０．９６ミリモル）會滴下した 。０°Ｃにおいて１時間かくはんした後に、ジメチルアばノビリジン約５　ｍ９ 　ｋ含有ｊるＤＭＦ２ｍｃ中に化合物１１　Ｂ（１４０＃Ｉ＆；　０．２４ミリ モル）七溶解してなる溶液を添加し、混合物？！−６０’Ｃに加熱し、ざらに２ 時間かくはんした。溶媒を窒素雰囲気下に除去し、残留物？クロマトグラフィ操 作（８％インプロパツール；　ＣＨＣＬ３中）によって精製した。次式の化合物 が１７５ｍ９得られた（収率８８％〕。

本明細書には本発明の若干の具体例について詳細に開示されているけれども、本 発明の範囲は決してこれらの具体例のみに限定きれるものでになく、当業者には 明らかなように、本発明はその趣旨および請求の範囲に記載の範囲内で種々多様 の態様変化が可能であることが理解きれるべきである。

国際調査報告 ＡＮＮＥＸτ０τＨＥ　ＩトＩＴＥＲＢＩＡＴＩＯＮＡら５ＥＡＲＣＨＲＥＰＯ ＲＴ　０ＮＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ　ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮ　Ｎｏ、　Ｐ ＣＴ／ＵＳ　８６１００９１２　（ＳＡ　１３１０４）優先権主張　０１９８に ４月１０日［相］米国（Ｕ　Ｓ）＠８５０１ＳＯ発　明　者　メネギニ　フラン ク　エイ　アレ ０発　明　者　バラムボ　ポール　ニス　アト ０発　明　者　ストラウド　スチーブン　ジー　アダ ０発　明　者　ゼンプ　チャールズ　エム　アン 一メリカ合衆国　０２１７４　マサチューセッツ州、アーリントン、り／アーモ ンド　アベニュー　１２３ −メリカ合衆国　０２１６５　マサチューセッツ州、ウェスト　ニュー・ン、チ ェリイ　ストリート　２７１ ｒメリ力合衆国　０２１５５　マサチューセッツ州、メツドフオード。

ｌ゛ンバーアベニュー　１５ ｒメリカ合衆国　０１５０３　マサチューセッツ州、バーリン、バイラノド　ス トリート　１９

Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. １．実質的に非発色性の２価結合基を介して染料基に結合した生物学的活性基を 含有し、この染料基が次式 ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔ここにＲはアルキル基であり、または親水性基を含む置換基であり、 Ｒ１は水素であり；あるいは、 ＲとＲ１とが一緒になつて、６員炭素環式基を形成するのに必要な炭素原子を表 わし； Ｒ２およびＲ３はそれぞれ個別的に−ＣＮ、−ＣＯＲ７、−ＣＯＯＲ８を表わし 、あるいは、電子放出性置換基で置換されたフェニル基であり；あるいは、Ｒ２ およびＲ３はそれらと結合している炭素原子と一緒になつて、次式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （ここにＸは、５−６員炭素環式基または複素環式基を完成させるのに必要な非 金属原子を表す）の基を表し； Ｒ４およびＲ５の各々はそれぞれ個別的にアルキル基であり、あるいは親水性基 を含む置換基であり；あるいは、 Ｒ５はＲ６と一緒になつて−（ＣＨ２）−２を表し；またはＲ６は水素であり； Ｒ７はアルキル基またはアリール基であり；Ｒ８はアルキル基またはアリール基 であり、あるいは親水性基を含む置換基であり； Ｒ９およびＲ１０の各々はそれぞれ個別的に水素またはアルキル基であり、ある いは親水性基を含む置換基である〕 で表されるものであることを特徴とする螢光性結合体。
2. ２．Ｒ、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０のうちの少なくとも１つが、親水性基 を含む置換基であることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の結合体。
3. ３．前記の生物学的活性基が蛋白質であることを特徴とする請求の範囲第２項に 記載の結合体。
4. ４．前記蛋白質が抗原、抗体またはＦａｂ−フラグメントであることを特徴とす る請求の範囲第３項に記載の結合体。
5. ５．Ｒ、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０のうちの少なくとも１つが、カルボン 酸、ポリエーテル、ポリアルコール、アミン、スルホン酸、ホスホン酸、ホスホ ン酸エステル、ホスフエート、ホスフエートエステル、ホスフイン酸、ボロン酸 、ボリン酸からなる群から選択された親水性基を含む置換基であることを特徴と する請求の範囲第２項に記載の結合体。
6. ６．Ｒ、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０のうちの少なくとも１つか、カルボン 酸、ポリエーテル、ポリアルコール、ホスホン酸、ホスホン酸エステルからなる 群から選択された親水性基を含む置換基であることを特徴とする請求の範囲第５ 項に記載の結合体。
7. ７．Ｒ２およびＲ３は、それらと結合した炭素原子と一緒になつて、次式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （ここにＸは５−６員炭素環または複素環を完成させるのに必要な非金属原子を 表す） の基を表すものであることを特徴とする請求の範囲第２項に記載の結合体。
8. ８．次式 ▲数式、化学式、表等があります▼ または ▲数式、化学式、表等があります▼ （ここにＲ１９はアルキル基であり、 ＢＩＯは生物学的活性基であり、 ＬＩＮＫは実質的に非発色性の２価結合基である）を有する標識化生物学的結合 体。
9. ９．ＢＩＯが蛋白質であることを特徴とする請求の範囲第８項に記載の結合体。
10. １０．前記の蛋白質が抗原、抗体またはＦａｂ−フラグメントであることを特徴 とする請求の範囲第９項に記載の結合体。
11. １１．生物学的流体試料を受容し、該流体中におけるアナライトの存在の場合の 機能として検知可能信号を発し得るように構成された検査用要素において、請求 の範囲第１項に記載の螢光性結合体を含有することを特徴とする検査用要素。
12. １２．Ｒ、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０のうちの少なくとも１つが、親水性 基を含む置換基であることを特徴とする請求の範囲第１１項に記載の検査用要素 。
13. １３．前記の生物学的活性基が蛋白質であることを特徴とする請求の範囲第１２ 項に記載の検査用要素。
14. １４．前記の蛋白質が抗原、抗体またはＦａｂ−フラグメントであることを特徴 とする請求の範囲第１３項に記載の検査用要素。
15. １５．Ｒ、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０の少なくとも１つが、カルボン酸、 ポリエーテル、ポリアルコール、アミン、スルホン酸、ホスホン酸、ホスホン酸 エステル、ホスフエート、ホスフエートエステル、ホスフイン酸、ボロン酸、ボ リン酸からなる群から選択された親水性基を含む置換基であることを特徴とする 請求の範囲第１２項に記載の検査用要素。
16. １６．Ｒ、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０のうちの少なくとも１つが、カルボ ン酸、ポリエーテル、ポリアルコール、ホスホン酸、ホスホン酸エステルからな る群から選択された親水性基を含む置換基であることを特徴とする請求の範囲第 １５項に記載の検査用要素。
17. １７．生物学的流体の試料を受容し、該流体中のアナライトの存在の場合の機能 として検知可能信号を発し得るように構成された検査用要素において、請求の範 囲第８項に記載の螢光性結合体を含有することを特徴とする検査用要素。
18. １８．ＢＩＯが蛋白質であることを特徴とする請求の範囲第１７項に記載の検査 用要素。
19. １９．前記の蛋白質か抗原、抗体またはＦａｂ−フラグメントであることを特徴 とする請求の範囲第１８項に記載の検査用要素。
20. ２０．螢光性共役体を用いて細胞染色螢光活性化による細胞選別または生物学的 検査方法において、請求の範囲第１項に記載の螢光性結合体を使用することを特 徴とする方法。
21. ２１．螢光活性化による細胞選別を行う方法であることを特徴とする請求の範囲 第２０項に記載の方法。
22. ２２．螢光性結合体を使用して生物学的検査を行う方法であることを特徴とする 請求の範囲第２０項に記載の方法。
23. ２３．前記の結合体中のＲ、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０のうちの少なくと も１つが、親水性基を含む置換基であることを特徴とする請求の範囲第２０項に 記載の方法。
24. ２４．前記の結合体中のＲ、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０の少なくとも１つ が、カルボン酸、ポリエーテル、ポリアルコール、アミン、スルホン酸、ホスホ ン酸、ホスホン酸エステル、ホスフエート、ホスフエートエステル、ホスフイン 酸、ボロン酸、ボリン酸からなる群から選択された親水性基を含む置換基である ことを特徴とする請求の範囲第２３項に記載の方法。