JPS588783A - 蛍光標識化特異性結合試薬 - Google Patents
蛍光標識化特異性結合試薬Info
- Publication number
- JPS588783A JPS588783A JP11265382A JP11265382A JPS588783A JP S588783 A JPS588783 A JP S588783A JP 11265382 A JP11265382 A JP 11265382A JP 11265382 A JP11265382 A JP 11265382A JP S588783 A JPS588783 A JP S588783A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- solution
- chelate
- fluorescent
- heteroatom
- fluorescence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D295/00—Heterocyclic compounds containing polymethylene-imine rings with at least five ring members, 3-azabicyclo [3.2.2] nonane, piperazine, morpholine or thiomorpholine rings, having only hydrogen atoms directly attached to the ring carbon atoms
- C07D295/04—Heterocyclic compounds containing polymethylene-imine rings with at least five ring members, 3-azabicyclo [3.2.2] nonane, piperazine, morpholine or thiomorpholine rings, having only hydrogen atoms directly attached to the ring carbon atoms with substituted hydrocarbon radicals attached to ring nitrogen atoms
- C07D295/14—Heterocyclic compounds containing polymethylene-imine rings with at least five ring members, 3-azabicyclo [3.2.2] nonane, piperazine, morpholine or thiomorpholine rings, having only hydrogen atoms directly attached to the ring carbon atoms with substituted hydrocarbon radicals attached to ring nitrogen atoms substituted by carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals
- C07D295/155—Heterocyclic compounds containing polymethylene-imine rings with at least five ring members, 3-azabicyclo [3.2.2] nonane, piperazine, morpholine or thiomorpholine rings, having only hydrogen atoms directly attached to the ring carbon atoms with substituted hydrocarbon radicals attached to ring nitrogen atoms substituted by carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals with the ring nitrogen atoms and the carbon atoms with three bonds to hetero atoms separated by carbocyclic rings or by carbon chains interrupted by carbocyclic rings
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C205/00—Compounds containing nitro groups bound to a carbon skeleton
- C07C205/45—Compounds containing nitro groups bound to a carbon skeleton the carbon skeleton being further substituted by at least one doubly—bound oxygen atom, not being part of a —CHO group
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C335/00—Thioureas, i.e. compounds containing any of the groups, the nitrogen atoms not being part of nitro or nitroso groups
- C07C335/04—Derivatives of thiourea
- C07C335/16—Derivatives of thiourea having nitrogen atoms of thiourea groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings of a carbon skeleton
- C07C335/20—Derivatives of thiourea having nitrogen atoms of thiourea groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings of a carbon skeleton being further substituted by nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C51/00—Preparation of carboxylic acids or their salts, halides or anhydrides
- C07C51/347—Preparation of carboxylic acids or their salts, halides or anhydrides by reactions not involving formation of carboxyl groups
- C07C51/353—Preparation of carboxylic acids or their salts, halides or anhydrides by reactions not involving formation of carboxyl groups by isomerisation; by change of size of the carbon skeleton
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C65/00—Compounds having carboxyl groups bound to carbon atoms of six—membered aromatic rings and containing any of the groups OH, O—metal, —CHO, keto, ether, groups, groups, or groups
- C07C65/32—Compounds having carboxyl groups bound to carbon atoms of six—membered aromatic rings and containing any of the groups OH, O—metal, —CHO, keto, ether, groups, groups, or groups containing keto groups
- C07C65/40—Compounds having carboxyl groups bound to carbon atoms of six—membered aromatic rings and containing any of the groups OH, O—metal, —CHO, keto, ether, groups, groups, or groups containing keto groups containing singly bound oxygen-containing groups
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D311/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only hetero atom, condensed with other rings
- C07D311/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only hetero atom, condensed with other rings ortho- or peri-condensed with carbocyclic rings or ring systems
- C07D311/04—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring
- C07D311/06—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring with oxygen or sulfur atoms directly attached in position 2
- C07D311/08—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring with oxygen or sulfur atoms directly attached in position 2 not hydrogenated in the hetero ring
- C07D311/16—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring with oxygen or sulfur atoms directly attached in position 2 not hydrogenated in the hetero ring substituted in position 7
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D471/00—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, at least one ring being a six-membered ring with one nitrogen atom, not provided for by groups C07D451/00 - C07D463/00
- C07D471/02—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, at least one ring being a six-membered ring with one nitrogen atom, not provided for by groups C07D451/00 - C07D463/00 in which the condensed system contains two hetero rings
- C07D471/04—Ortho-condensed systems
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
- G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Luminescent Compositions (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は螢光ギレート化合物、さらに詳しくは螢光性の
標識化した生理学的に活性な物質を含も特殊な結合試薬
の製造に有用な螢光ギレート（化合物）に関するもので
ある。
標識化した生理学的に活性な物質を含も特殊な結合試薬
の製造に有用な螢光ギレート（化合物）に関するもので
ある。
特殊の結合検定において感度は、一般に測定される被分
析物質のレベルが低いために、非常に重要なものである
。
析物質のレベルが低いために、非常に重要なものである
。
螢光分光学分析試験において分析されるべき螢光種を含
む試料はターダット螢光種の励起スペクトル内に既知の
分光分布の光で照射される。得られる螢光ターゲット分
子の特性発光スペクトルの強度が測定され、ターゲット
分子の数に関連づけられる。
む試料はターダット螢光種の励起スペクトル内に既知の
分光分布の光で照射される。得られる螢光ターゲット分
子の特性発光スペクトルの強度が測定され、ターゲット
分子の数に関連づけられる。
螢光分析試験の感度は、理論的には極めて高いけれども
、パックグラウンド螢光の存在によって制限される。パ
ックグラウンド信号レベルは試料においてたけでなく試
料を含む物質において競合する螢光物質から捕えられる
。これは、生物学的流体においてみられるような低濃度
の望ましいターダット螢光分子を含む試料と関連した種
の定量的測定において特に重要な問題である。多くの場
合望ましい感度を得るのに十分に（当業者に知られた適
当なり過及び他の技術によって）バックグラウンドを低
下させることは不可能である。
、パックグラウンド螢光の存在によって制限される。パ
ックグラウンド信号レベルは試料においてたけでなく試
料を含む物質において競合する螢光物質から捕えられる
。これは、生物学的流体においてみられるような低濃度
の望ましいターダット螢光分子を含む試料と関連した種
の定量的測定において特に重要な問題である。多くの場
合望ましい感度を得るのに十分に（当業者に知られた適
当なり過及び他の技術によって）バックグラウンドを低
下させることは不可能である。
時分割は興味のある特定の螢光信号を特定でないパック
グラウンド螢光から分離するという独立の手段を与える
。時分割はもし標識物がパックグラウンドよりもずっと
長生の螢光を有するならば、そしてもし長生の標識物が
短命のパックグラウンドの衰微に伴なって起る暗期間の
量測定できるようにその系が断続的な光源によって照明
されるならば可能である。そのような技術は西独公開公
報第２６２８１５８号においてより詳細に記載されてい
る。
グラウンド螢光から分離するという独立の手段を与える
。時分割はもし標識物がパックグラウンドよりもずっと
長生の螢光を有するならば、そしてもし長生の標識物が
短命のパックグラウンドの衰微に伴なって起る暗期間の
量測定できるようにその系が断続的な光源によって照明
されるならば可能である。そのような技術は西独公開公
報第２６２８１５８号においてより詳細に記載されてい
る。
長生螢光（０１〜５ｍ５ｅｃ）のある種の希土類金属の
芳香族ジケトンキレート化合物、例えばユーロピウムベ
ンゾイルアセトネート及びユーロピウムベンゾイルトリ
フルオルアセトネートがある期間知られてきた。そのキ
レート剤は光を吸収しそれを金属イオンに伝達し螢光を
発する。西独公開公報第２６２８１５８号は検定におい
て／Ｓツクグラウンド干渉を生ずる種のそれと比較した
時、発光が長生である螢光標識物の使用を通して螢光分
析免疫検定（ＦＩＡ ）における時分割の使用を記載し
ている。この公報はまたＦＩＡの技術の有用な議論及び
放射性免疫検定（ＲＩＡ ）のような他の免疫技術につ
いてその利点を与えている。
芳香族ジケトンキレート化合物、例えばユーロピウムベ
ンゾイルアセトネート及びユーロピウムベンゾイルトリ
フルオルアセトネートがある期間知られてきた。そのキ
レート剤は光を吸収しそれを金属イオンに伝達し螢光を
発する。西独公開公報第２６２８１５８号は検定におい
て／Ｓツクグラウンド干渉を生ずる種のそれと比較した
時、発光が長生である螢光標識物の使用を通して螢光分
析免疫検定（ＦＩＡ ）における時分割の使用を記載し
ている。この公報はまたＦＩＡの技術の有用な議論及び
放射性免疫検定（ＲＩＡ ）のような他の免疫技術につ
いてその利点を与えている。
西独公開公報第２６２８１５８号に記載された螢光免疫
試薬は少なくとも一つの免疫系の部分、すなわち希土類
キレートとし結合された」抗体（免疫体）又は抗原を含
んでなる。そのような「結合」は二つの方法： （１）最初、標識化、すなわち「Ｆｌｕｏｒｅａｃｅｎ
ｔＡｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ
ＴｈｅｉｒＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｊ Ａ、 Ｋａｗ
ａｍｕｒａ、 Ｅｄ、、 ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰ
ａｒｋ Ｐｒｅｓｓ、 Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、 Ｍａｒ
ｙｌａｎｄ＋ １９６９において記載されたように希土
類キレートを抗原に結合し、次いで抗体を結合された抗
原に添加しこれにより抗体と抗原が通常の型で結合する
ことによる、又は （２）抗体をキレートに化学的な基によって共有□ 結合きせることによる、 のうちの一つにおいて達成することができる。
試薬は少なくとも一つの免疫系の部分、すなわち希土類
キレートとし結合された」抗体（免疫体）又は抗原を含
んでなる。そのような「結合」は二つの方法： （１）最初、標識化、すなわち「Ｆｌｕｏｒｅａｃｅｎ
ｔＡｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ
ＴｈｅｉｒＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｊ Ａ、 Ｋａｗ
ａｍｕｒａ、 Ｅｄ、、 ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰ
ａｒｋ Ｐｒｅｓｓ、 Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、 Ｍａｒ
ｙｌａｎｄ＋ １９６９において記載されたように希土
類キレートを抗原に結合し、次いで抗体を結合された抗
原に添加しこれにより抗体と抗原が通常の型で結合する
ことによる、又は （２）抗体をキレートに化学的な基によって共有□ 結合きせることによる、 のうちの一つにおいて達成することができる。
西独公開公報第２６２８１５８号において記載された型
の免疫試薬についての問題は水と接触した時、螢光標識
種、すなわち希土類キレートが冷却され、すなわちそｈ
らの螢光が消失するということである。以後「水安定性
」の問題として言及されるこの問題は螢光標識化免疫試
薬のための主な用途が血液及び血清のような水性の生物
学的流体の分析試験にあるため特に重大である。もし水
安定性をこれらの物質に与えることができるならそれら
はこれらの生物学的流体用の螢光標識物として有用であ
り、かくてパックグラウンドからの信号の時分割の使用
によって螢光免疫分析感度を増加せしめる。螢光キレー
トの「水安定性」は１０ Ｍ よりも大きい結合
定数（すかわち結合定数の７０ｇ１０が１０より大きい
）を示すものとしてここに規定される。この結合定数は
キレート剤のランタニド金属に対する結合を言及するも
のである。
の免疫試薬についての問題は水と接触した時、螢光標識
種、すなわち希土類キレートが冷却され、すなわちそｈ
らの螢光が消失するということである。以後「水安定性
」の問題として言及されるこの問題は螢光標識化免疫試
薬のための主な用途が血液及び血清のような水性の生物
学的流体の分析試験にあるため特に重大である。もし水
安定性をこれらの物質に与えることができるならそれら
はこれらの生物学的流体用の螢光標識物として有用であ
り、かくてパックグラウンドからの信号の時分割の使用
によって螢光免疫分析感度を増加せしめる。螢光キレー
トの「水安定性」は１０ Ｍ よりも大きい結合
定数（すかわち結合定数の７０ｇ１０が１０より大きい
）を示すものとしてここに規定される。この結合定数は
キレート剤のランタニド金属に対する結合を言及するも
のである。
さらに先に螢光測定用に使用された希土類キレートは発
光に対する低い量の収量、少量の検出可能々種を用いる
不十分な螢光に帰着する望ましく々い増感剤の吸光係数
、測定をして通常低いλｍａｘ範囲にある試料において
他の成分から妨害を受けせしめる低いλｍＦＬＸｓ不十
分な水溶性（大部分の生物学的流体は水である）、及び
低濃度におけるキレートの不十分な安定性のような望ま
しくない性質を有していた。
光に対する低い量の収量、少量の検出可能々種を用いる
不十分な螢光に帰着する望ましく々い増感剤の吸光係数
、測定をして通常低いλｍａｘ範囲にある試料において
他の成分から妨害を受けせしめる低いλｍＦＬＸｓ不十
分な水溶性（大部分の生物学的流体は水である）、及び
低濃度におけるキレートの不十分な安定性のような望ま
しくない性質を有していた。
本発明はランタニド金属とキレート剤を有する螢光キレ
ートであって、そのキレート剤はランタニド金属のそれ
よりも大きい三重環（ｔｒｉｐｌｅｔ ）エネルギーを
有する三重環増感剤である核及び少なくとも２つのへテ
ロ原子含有基及び三重項増感剤核の中にあるか又はに結
合されている第三のへテロ原子含有基又はヘテロ原子を
含み、前記２つのへテロ原子含有基の各々が三重項増感
剤核の別の炭素原子に結合され、それらのへテロ原子含
有基はそれらと前記第三のへテロ原子又はヘテロ原子含
有基がランタニド金属とキレート構造を形成するように
キレート剤の中に位置する螢光キレートを指向するもの
である。そのキレートは水溶性であり、８〜１０の範囲
のＰＨにおいて低濃度で安定であり、高感度であり、好
ましいモル吸光係数（１００００〜４００００）及び白
色光源の使用を可能にする好ましいλｍａｘ ｓ例えば
３００ｎｍより大きい、好ましくは３３０＋ｙｎより大
きい、を有している。これらのキレートは１０ Ｍ
より大きい結合定数を有する。よって本発明は抗原及
びホルモンのような生理学的に活性な物質を標識化する
高度に効果のある水安定性の螢光キレートの部類を提供
するものである。本発明はまたこれらの高度に有用な螢
光キレ−１を有する、抗原、酵素及びホルモンのような
新規な部類の特殊の結合試薬を提供する。
ートであって、そのキレート剤はランタニド金属のそれ
よりも大きい三重環（ｔｒｉｐｌｅｔ ）エネルギーを
有する三重環増感剤である核及び少なくとも２つのへテ
ロ原子含有基及び三重項増感剤核の中にあるか又はに結
合されている第三のへテロ原子含有基又はヘテロ原子を
含み、前記２つのへテロ原子含有基の各々が三重項増感
剤核の別の炭素原子に結合され、それらのへテロ原子含
有基はそれらと前記第三のへテロ原子又はヘテロ原子含
有基がランタニド金属とキレート構造を形成するように
キレート剤の中に位置する螢光キレートを指向するもの
である。そのキレートは水溶性であり、８〜１０の範囲
のＰＨにおいて低濃度で安定であり、高感度であり、好
ましいモル吸光係数（１００００〜４００００）及び白
色光源の使用を可能にする好ましいλｍａｘ ｓ例えば
３００ｎｍより大きい、好ましくは３３０＋ｙｎより大
きい、を有している。これらのキレートは１０ Ｍ
より大きい結合定数を有する。よって本発明は抗原及
びホルモンのような生理学的に活性な物質を標識化する
高度に効果のある水安定性の螢光キレートの部類を提供
するものである。本発明はまたこれらの高度に有用な螢
光キレ−１を有する、抗原、酵素及びホルモンのような
新規な部類の特殊の結合試薬を提供する。
その試薬は螢光標識の抗原、ハプテン、抗体、植物レク
チン、炭水化物、ホルモン、酵素及び他のそのよう彦種
特異性物質を吸着又は共有結合することによって形成さ
れる。
チン、炭水化物、ホルモン、酵素及び他のそのよう彦種
特異性物質を吸着又は共有結合することによって形成さ
れる。
一般にあるランタニド金属はここに記載されたキレート
に有用である。ここで有用なランタニド金属０例はユー
ロピウム及びテルビウムであり、５ｉｎｈａ、 Ｓ、Ｐ
、著、Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｏｆ Ｒａｒｅ Ｅａｒｔ
ｈｓ。
に有用である。ここで有用なランタニド金属０例はユー
ロピウム及びテルビウムであり、５ｉｎｈａ、 Ｓ、Ｐ
、著、Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｏｆ Ｒａｒｅ Ｅａｒｔ
ｈｓ。
Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ、 １９６６に記載され
ている。
ている。
キレート剤の核は必要な三重項エネルギーを有するある
三重項増感剤である。ここで有用な三重項増感剤の例は
ベンゾフェノン、プロピオフェノンルミヒラ−ケトン、
アセトフェノン、１，３，５−トリアセチルベンゼン、
イソブチロフェノン、１ 、３−ジフェニル−２−７’
ロノぐノン、トリフェニルメチルフェニルケトン、１．
２−ジベンゾイルベンゼン、４ 、４’−ジクロロベン
ゾフェノン、ｌ、４−シアセチルベンゼン、９−ベンゾ
イルフルオレン、ｐ−シアノベンゾフェノン、β−ナフ
チルフェニルケトン、２−アセトナフトン、α−ナフチ
ルフェニルケトン並びにビアセチル、ベンジル及び２，
３−ペンタンジオンのようなα、β−ノヶトンを含む１
−アセトナフトンのようなりトン；キサントン、チオキ
サントン、アントラキノン、α−ナフトフラ？ン、フラ
ビン、５．１２−ナフタセンキノン及びフルオレノンの
ようなケト芳香族化合物；ベンズアルデヒド、フェニル
グ（７） リオキサール、エチルフェニルグリオキサレート、２−
ナフトアルデヒド及び１−ナフトアルデヒドのようなア
ルデヒド；フルオレン、トリフェニレン、フェナントレ
ン、ナフタレン及びピレンのような線状もしくは溶融多
環式芳香族化合物；カルバソール、チルピリジン、フェ
ナントロリン、トリフェニルアミン、チアゾリン、特に
２−ベンゾイルメチレン−１−メチルナフト［１，２−
ｄ］チアゾリン、２−フロイルメチレン−１−メチルナ
ンド（１，２−ｄ：）チアゾリン、２−（シフ０イルメ
チレン）−１−メチルナフト［１，２−ｄ］チアゾリン
、１−メチル−２−テノイルメチレンナフト［：１，２
−ｄ：］チアゾリン及び２−（ジテノイルメチレン）−
１−メチルナンド（１，２−ｄ）チアゾリンのような２
−有機カルがニルチアゾリン、のような複素環式及び芳
香族窒素含有化合物；米国特許第２，７３２，３０１号
及び第４．１１，９，４６６号において記載されたよう
々チアゾリン化合物；並びに米国特許第４，１４７，５
５２号において記載されたよりなケトクマリンを含む。
三重項増感剤である。ここで有用な三重項増感剤の例は
ベンゾフェノン、プロピオフェノンルミヒラ−ケトン、
アセトフェノン、１，３，５−トリアセチルベンゼン、
イソブチロフェノン、１ 、３−ジフェニル−２−７’
ロノぐノン、トリフェニルメチルフェニルケトン、１．
２−ジベンゾイルベンゼン、４ 、４’−ジクロロベン
ゾフェノン、ｌ、４−シアセチルベンゼン、９−ベンゾ
イルフルオレン、ｐ−シアノベンゾフェノン、β−ナフ
チルフェニルケトン、２−アセトナフトン、α−ナフチ
ルフェニルケトン並びにビアセチル、ベンジル及び２，
３−ペンタンジオンのようなα、β−ノヶトンを含む１
−アセトナフトンのようなりトン；キサントン、チオキ
サントン、アントラキノン、α−ナフトフラ？ン、フラ
ビン、５．１２−ナフタセンキノン及びフルオレノンの
ようなケト芳香族化合物；ベンズアルデヒド、フェニル
グ（７） リオキサール、エチルフェニルグリオキサレート、２−
ナフトアルデヒド及び１−ナフトアルデヒドのようなア
ルデヒド；フルオレン、トリフェニレン、フェナントレ
ン、ナフタレン及びピレンのような線状もしくは溶融多
環式芳香族化合物；カルバソール、チルピリジン、フェ
ナントロリン、トリフェニルアミン、チアゾリン、特に
２−ベンゾイルメチレン−１−メチルナフト［１，２−
ｄ］チアゾリン、２−フロイルメチレン−１−メチルナ
ンド（１，２−ｄ：）チアゾリン、２−（シフ０イルメ
チレン）−１−メチルナフト［１，２−ｄ］チアゾリン
、１−メチル−２−テノイルメチレンナフト［：１，２
−ｄ：］チアゾリン及び２−（ジテノイルメチレン）−
１−メチルナンド（１，２−ｄ）チアゾリンのような２
−有機カルがニルチアゾリン、のような複素環式及び芳
香族窒素含有化合物；米国特許第２，７３２，３０１号
及び第４．１１，９，４６６号において記載されたよう
々チアゾリン化合物；並びに米国特許第４，１４７，５
５２号において記載されたよりなケトクマリンを含む。
（８）
ランタニド金属がユーロピウムである時、三重項エネル
ギーは少なくとも４７’ｋｃａＬでなければならず、も
しランタニド金属がテルビウムであるならば核の三重項
エネルギーは少なくとも５３ｋｃａｌでなければならな
い。
ギーは少なくとも４７’ｋｃａＬでなければならず、も
しランタニド金属がテルビウムであるならば核の三重項
エネルギーは少なくとも５３ｋｃａｌでなければならな
い。
キレート剤はまたそれらがランタニド金属と配位結合を
形成することができるようにキレート剤上に位置する少
なくとも２つのへテロ原子を含む基を有する。ランタニ
ド金属と配位結合を形成することができる基はニトリロ
ジアセテート、カルがキシ、ヒドロキシ、アルコキシ、
アミノ、アミド、カル？ニル、及びメルカプト基を含む
。これらの基はランタニド金属と基とのキレート化を可
能にするように核に付加される。
形成することができるようにキレート剤上に位置する少
なくとも２つのへテロ原子を含む基を有する。ランタニ
ド金属と配位結合を形成することができる基はニトリロ
ジアセテート、カルがキシ、ヒドロキシ、アルコキシ、
アミノ、アミド、カル？ニル、及びメルカプト基を含む
。これらの基はランタニド金属と基とのキレート化を可
能にするように核に付加される。
好ましいキレート剤は構造；
（式中
Ｒ２を共に有する２はランタニド金属のそれよりもより
大きい三重項エネルギーを有する三重項増感剤である置
換（例えば免疫試薬に結合されたウレイレン、チオウレ
イレン、カルブニルイミノもしくはイミノのような免疫
試薬を連結するために使用された基、又はクマリン基と
の）又は未置換の核を満たすのに必要な原子を表わし；
Ｒ２は（１）へテロ原子又は（２）少なくとも１個のへ
テロ原子をその中に有するアルキレン基又はそれらに付
加され念へテロ原子もしくはヘテロ原子を含む基であり
；そして Ｒ３及びＲ４はへテロ原子を含む基で同じか又は異々っ
たもので；Ｒ及びＲはう／タニド金属がＲ２に及びＲ３
もしくはＲ４か又はその両方のいずれかにキレートが可
能なようにＲ２に十分近接していて；ここでＲ２によっ
て表わされた炭素とへテロ原子の数は２０に等しいか又
はより小さい。）を有する。
大きい三重項エネルギーを有する三重項増感剤である置
換（例えば免疫試薬に結合されたウレイレン、チオウレ
イレン、カルブニルイミノもしくはイミノのような免疫
試薬を連結するために使用された基、又はクマリン基と
の）又は未置換の核を満たすのに必要な原子を表わし；
Ｒ２は（１）へテロ原子又は（２）少なくとも１個のへ
テロ原子をその中に有するアルキレン基又はそれらに付
加され念へテロ原子もしくはヘテロ原子を含む基であり
；そして Ｒ３及びＲ４はへテロ原子を含む基で同じか又は異々っ
たもので；Ｒ及びＲはう／タニド金属がＲ２に及びＲ３
もしくはＲ４か又はその両方のいずれかにキレートが可
能なようにＲ２に十分近接していて；ここでＲ２によっ
て表わされた炭素とへテロ原子の数は２０に等しいか又
はより小さい。）を有する。
Ｒ２は窒素、酸素、硫黄、もしくはセレニウムのような
ヘテロ原子又は少なくとも１個のへテロ原子をその中に
有するアルキレン基又はそれらに付加されたヘテロ原子
もしくはヘテロ原子を含む基である。Ｒで表わされた全
原子数は２０に等しいか又はより小さい、かくてＲ２は
１個又はそれ以上のへテロ原子を含むことができる。Ｒ
２の例は−ＮＨ−１Ｏ１Ｓ、Ｓｓ、−Ｎ＝、 及びヘテロ原子又は１０個までの炭素原子を有するヘテ
ロ原子を含むアルキレン基である。さらにその例はカル
ボニル、ノカルポニル、チオカルぜニル、ヒドロキシメ
チレン、１．２−ノヒドロキシエチレン及び１．２−ジ
ヒドロキシビニレンである。
ヘテロ原子又は少なくとも１個のへテロ原子をその中に
有するアルキレン基又はそれらに付加されたヘテロ原子
もしくはヘテロ原子を含む基である。Ｒで表わされた全
原子数は２０に等しいか又はより小さい、かくてＲ２は
１個又はそれ以上のへテロ原子を含むことができる。Ｒ
２の例は−ＮＨ−１Ｏ１Ｓ、Ｓｓ、−Ｎ＝、 及びヘテロ原子又は１０個までの炭素原子を有するヘテ
ロ原子を含むアルキレン基である。さらにその例はカル
ボニル、ノカルポニル、チオカルぜニル、ヒドロキシメ
チレン、１．２−ノヒドロキシエチレン及び１．２−ジ
ヒドロキシビニレンである。
Ｒ３及びＲ４はＲ２に個々に隣接しているか又はＲ２か
ら移動した３個もしくはそれより少ない原子であるかの
いずれかであることが好ましい。
ら移動した３個もしくはそれより少ない原子であるかの
いずれかであることが好ましい。
ある好ましい当節態様においてランタニド金属はフェノ
ール性の水酸基に対してオルソの各位置に置換されたイ
ミノジアセテート基を有するフェノールとキレートする
。そのフェノールは未置換のものか又はアルコキシ、ア
ルキル、ハロゲンもしくはカルボニルのような種々の基
で置換されたものであり、所望によりもう一つの芳香族
基又は脂環式もしくは複素環式基に溶料される。特に構
造： （式中 Ｍは水素又はアンモニウムもしくはテトラメチルアンモ
ニウム、テトラエチルアンモニウム、もしくはベンジル
トリメチルアンモニウムのようなその誘導体、のような
カチオン、又はナトリウム、リチウム、カリウム、ルビ
ジウム、もしくはセシウムのようなアルカリ金属であり
；そしてＤは芳香族環を完成するに必要な原子を表わす
。）を有する化合物が好ましい。この芳香族環は前記の
ようにヒドロキシル基を有しなければならない。
ール性の水酸基に対してオルソの各位置に置換されたイ
ミノジアセテート基を有するフェノールとキレートする
。そのフェノールは未置換のものか又はアルコキシ、ア
ルキル、ハロゲンもしくはカルボニルのような種々の基
で置換されたものであり、所望によりもう一つの芳香族
基又は脂環式もしくは複素環式基に溶料される。特に構
造： （式中 Ｍは水素又はアンモニウムもしくはテトラメチルアンモ
ニウム、テトラエチルアンモニウム、もしくはベンジル
トリメチルアンモニウムのようなその誘導体、のような
カチオン、又はナトリウム、リチウム、カリウム、ルビ
ジウム、もしくはセシウムのようなアルカリ金属であり
；そしてＤは芳香族環を完成するに必要な原子を表わす
。）を有する化合物が好ましい。この芳香族環は前記の
ようにヒドロキシル基を有しなければならない。
ようなカルがニル基を有さなければならず、ここでアル
キルは一般にメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペン
チル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル
、又はそれらの異性体のような１０までの炭素原子を含
み、Ａｒはフェニルのよう々アリールであり；又それは
好ましくはベンゼン（置換又は未置換）、ベンゾフェノ
ン、又はクマリン核を形成するためにカルボニル基を有
するビランのような４〜７個の炭素原子を含むもう一つ
の芳香族、脂環式、又は複素環式の項に対して２つの有
効位置において縮合されねばならない。
キルは一般にメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペン
チル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル
、又はそれらの異性体のような１０までの炭素原子を含
み、Ａｒはフェニルのよう々アリールであり；又それは
好ましくはベンゼン（置換又は未置換）、ベンゾフェノ
ン、又はクマリン核を形成するためにカルボニル基を有
するビランのような４〜７個の炭素原子を含むもう一つ
の芳香族、脂環式、又は複素環式の項に対して２つの有
効位置において縮合されねばならない。
芳香族環の例はフェニル、ナフチル等であり、所望によ
り好ましくはメチル、エチル、プロピル、もしくはブチ
ル又はそれらの異性体のような１〜４個の炭素原子を含
むアルキル；ヒト四キシ；フェニルのようなアリール；
ＣＨＯのようなアルデヒ有効位置のいずれかに置換さ
れたものである。特に好ましい実施態様においてＤはベ
ンゾイル置換基のようなカルがニル置換基を有するフェ
＝／＋４２を形成するか又はそれはクマリン基を形成す
る。
り好ましくはメチル、エチル、プロピル、もしくはブチ
ル又はそれらの異性体のような１〜４個の炭素原子を含
むアルキル；ヒト四キシ；フェニルのようなアリール；
ＣＨＯのようなアルデヒ有効位置のいずれかに置換さ
れたものである。特に好ましい実施態様においてＤはベ
ンゾイル置換基のようなカルがニル置換基を有するフェ
＝／＋４２を形成するか又はそれはクマリン基を形成す
る。
明細書を通して「アルキル」及び「アリール」という語
はそのアリール又はアルキルが所望によりメチル、エチ
ル、及びプロピルのような基で置換されている置換アル
キル及びアリールを含む。
はそのアリール又はアルキルが所望によりメチル、エチ
ル、及びプロピルのような基で置換されている置換アル
キル及びアリールを含む。
本発明の好ましい実施態様は次の構造：Ｈ
（式中
Ｍは水素、アンモニウム、もしくはアルカリ金属イオン
、又はその塩を水溶性たらしぬる何か他の適尚なカチオ
ンである。） を有する塩又は酸とランタニド金属とのキレートの形成
を伴なう。
、又はその塩を水溶性たらしぬる何か他の適尚なカチオ
ンである。） を有する塩又は酸とランタニド金属とのキレートの形成
を伴なう。
もう一つの好ましい実施態様においてランタニド金属と
錯体を形成する有機化合物は次の構造二Ｈ ５ （式中 ルであり、 各Ｒ６は水素；メチル、エチル、プロピル、モジくはブ
チルのような１〜４個の炭素原子を有するアルキル；さ
らに置換もしくは置換されていないアリールもしくはア
ロイル；メトキシ及びゾロポキシのよう々アルコキシ；
又は臭素もしくは塩素のようなハロダンから独立に選ば
れる。）を有する。
錯体を形成する有機化合物は次の構造二Ｈ ５ （式中 ルであり、 各Ｒ６は水素；メチル、エチル、プロピル、モジくはブ
チルのような１〜４個の炭素原子を有するアルキル；さ
らに置換もしくは置換されていないアリールもしくはア
ロイル；メトキシ及びゾロポキシのよう々アルコキシ；
又は臭素もしくは塩素のようなハロダンから独立に選ば
れる。）を有する。
好ましいアロイルＲ５置換基は所望によりさらにアリー
ルもしくはアルキル基で、又はエステル、アミド、カル
バミド、チオカルバミド、イソシアネート、チオシアネ
ート、ハロダン、もしくはニトリル基で置換される。
ルもしくはアルキル基で、又はエステル、アミド、カル
バミド、チオカルバミド、イソシアネート、チオシアネ
ート、ハロダン、もしくはニトリル基で置換される。
Ｒ５が陰性（す々わち電子吸引）基とは他のものによっ
てクマリン環に付加されるある種の他のクマリン化合物
は、激しく螢光を発することが知られており、本発明の
実施には有用ではない。というのはこの螢光が可視スペ
クトルにおいて伴って起る螢光を有するユーロピウム又
はテルビウム錯体への励起エネルギーの移動を防ぐから
である。
てクマリン環に付加されるある種の他のクマリン化合物
は、激しく螢光を発することが知られており、本発明の
実施には有用ではない。というのはこの螢光が可視スペ
クトルにおいて伴って起る螢光を有するユーロピウム又
はテルビウム錯体への励起エネルギーの移動を防ぐから
である。
希土類キレートを形成するために使用される有機の塩又
は酸は３００〜５００ ｎｍの範囲において吸収し、次
いでその励起エネルギーをランタニド金属に移動しなけ
ればならず、これにより可視スペクトルにおいて螢光を
発する。有用な錯体化する化合物の他の例は下記を含む
。
は酸は３００〜５００ ｎｍの範囲において吸収し、次
いでその励起エネルギーをランタニド金属に移動しなけ
ればならず、これにより可視スペクトルにおいて螢光を
発する。有用な錯体化する化合物の他の例は下記を含む
。
Ｈ
ＨＣ＝０
−０
Ｈ３
その錯体はランタニド金属とキレート剤のある比を含む
。好ましい実施態様においてはランタニド金属とキレー
ト剤のモル比は１：１〜２：１、最も好ましくは１：１
である。
。好ましい実施態様においてはランタニド金属とキレー
ト剤のモル比は１：１〜２：１、最も好ましくは１：１
である。
そのキレート剤は構造
の既知の化合物及びイミノジ酢酸もしくはそのエステル
とホルムアルデヒドとの間のマンニッヒ反応を行なうか
；又はブロモメチルもしくはメチレントシレート基のよ
うな活性メチレン基を有するの化合物とイミノジ酢酸エ
ステルとの間の求核置換反応をし、そして次いでそのエ
ステルを加水分解することによって製造される。
とホルムアルデヒドとの間のマンニッヒ反応を行なうか
；又はブロモメチルもしくはメチレントシレート基のよ
うな活性メチレン基を有するの化合物とイミノジ酢酸エ
ステルとの間の求核置換反応をし、そして次いでそのエ
ステルを加水分解することによって製造される。
有用々化合物は下記を含む。
ランタニド金属とキレート剤はｐＨ７，５〜１０の水溶
液においてキレート剤の水溶液をランタニド金属塩と単
に混合することによって容易に錯体化される。ランタニ
ド、金属塩はＴｂＣｌ３・６Ｈ２０又はＥ ｕ Ｃｌ−
ｓ・６Ｈ２０のような塩素塩のようなある金属の水溶性
塩である。
液においてキレート剤の水溶液をランタニド金属塩と単
に混合することによって容易に錯体化される。ランタニ
ド、金属塩はＴｂＣｌ３・６Ｈ２０又はＥ ｕ Ｃｌ−
ｓ・６Ｈ２０のような塩素塩のようなある金属の水溶性
塩である。
キレートは一般に８〜１１のＰＩ］、好ましくは８〜９
の水溶液において製造される。
の水溶液において製造される。
キレートは所望により最適な−を生ずるように燐酸塩及
び硼酸塩のよう々緩衝剤と混合される。
び硼酸塩のよう々緩衝剤と混合される。
キレートは錯体に吸着又は共有結合（でよって結合する
ことによって種々の生理学的に活性な物質を標識づける
のに有用である。この型で標識づけられる生理学的に活
性な物質の中には酵素及びそれらの受媒質、抗原、すな
わち適当な条件下で特にある探知できる方法で抗体、炭
水化物、代謝産物、薬、他の薬物学的剤及びそれらの受
容体と反応することができるある物質、並びに他の結合
物質がある。特殊の結合検定試薬は米国特許第３．５５
７，５５５号、第３，８５３，９８７号、第４．１０８
，９７２号及び第４．２０５，０５８号において記載さ
れている。
ことによって種々の生理学的に活性な物質を標識づける
のに有用である。この型で標識づけられる生理学的に活
性な物質の中には酵素及びそれらの受媒質、抗原、すな
わち適当な条件下で特にある探知できる方法で抗体、炭
水化物、代謝産物、薬、他の薬物学的剤及びそれらの受
容体と反応することができるある物質、並びに他の結合
物質がある。特殊の結合検定試薬は米国特許第３．５５
７，５５５号、第３，８５３，９８７号、第４．１０８
，９７２号及び第４．２０５，０５８号において記載さ
れている。
そのような生理学的に活性な物質の錯体に対する結合を
達成する技術は尚業者によく知られていて、その物質を
単に共に混合することを含む。
達成する技術は尚業者によく知られていて、その物質を
単に共に混合することを含む。
特殊結合検定方法においては、測定される分析物に構造
的な類似性を有する化合物が探知できる標識物に結合さ
れる。測定される分析物はここに配位子として言及され
、標識化された化合物は配位子アナローブとして言及さ
れる。特に配位子及び配位子アナローブを認識し、それ
らに結合する化合物は受容体として言及される。
的な類似性を有する化合物が探知できる標識物に結合さ
れる。測定される分析物はここに配位子として言及され
、標識化された化合物は配位子アナローブとして言及さ
れる。特に配位子及び配位子アナローブを認識し、それ
らに結合する化合物は受容体として言及される。
あるそのような型の検定を行なうのに配位子は受容体に
結合する配位子アナローブと競争して置かれる。未知の
濃度の配位子が標識化された配位子アナローブの測定さ
れた信号から推論される。
結合する配位子アナローブと競争して置かれる。未知の
濃度の配位子が標識化された配位子アナローブの測定さ
れた信号から推論される。
その反応は次のように進行する。
配位子＋（標識化された）配位子アナローブ土受容体＃
配位子／受容体′十配位子アナローグ／受容体 例証的々目的のために次の議論はある特定の型の特殊の
結合検定技術すなわち競争的な結合螢光免疫検定技術を
述べている。
配位子／受容体′十配位子アナローグ／受容体 例証的々目的のために次の議論はある特定の型の特殊の
結合検定技術すなわち競争的な結合螢光免疫検定技術を
述べている。
この系は螢光標識で標識化された抗原、未標識の天然抗
原（試験試料において）及び特殊な抗体から々す、これ
ｒ（より未標識の抗原と抗体に結合する標識化された抗
原との間に競争が存在する。
原（試験試料において）及び特殊な抗体から々す、これ
ｒ（より未標識の抗原と抗体に結合する標識化された抗
原との間に競争が存在する。
系における試験試料からの未標識の抗原の濃度が大にな
ればなるほど抗体によって結合される標識化された抗原
はより少々くなる。もし標識化された抗原及び抗体の濃
度が一定で、未標識の抗原の量が変化するだけ々らば、
抗原−杭体錯体を残留する遊離抗原（標識及び未標識の
いずれも）から物理的に分離すること、及び遊離かもし
くは結合されたかのいずれかの標識化された抗原の螢光
を、同じ方法で処理されたある範囲の既知量の抗原によ
って与えられた値の標準曲線のプロットと比較すること
、によって未知の量の未標識の抗原を測定することが可
能である。
ればなるほど抗体によって結合される標識化された抗原
はより少々くなる。もし標識化された抗原及び抗体の濃
度が一定で、未標識の抗原の量が変化するだけ々らば、
抗原−杭体錯体を残留する遊離抗原（標識及び未標識の
いずれも）から物理的に分離すること、及び遊離かもし
くは結合されたかのいずれかの標識化された抗原の螢光
を、同じ方法で処理されたある範囲の既知量の抗原によ
って与えられた値の標準曲線のプロットと比較すること
、によって未知の量の未標識の抗原を測定することが可
能である。
好ましい螢光的に標識化された特殊の結合試薬は構造：
（式中
Ｚ、ＲＳＲ，及びＲは前記のようなものでなエステル；
−ＣＮＨ−１−Ｃ−Ｎ−のようなア２Ｈ５ ミド；５Ｏ２ＮＨ−１ＳＯ２Ｎ−のようなスルホアミ１ ド；−０−１−８−のようなエーテル；−Ｃ−１ｌ −Ｃ−のようなカルがニル；＝Ｎ−のようなニトリロ；
−ＮＨ−のようなイミノの如き結合基であり、アリー
レン及びチオアリーレンのような付加的な有機結合原子
を含んでなるそれらの基を含み；ｐ及びｍは０又は１で
あり、ｎは１〜３であり、Ｒ１は抗原又はホルモンのよ
うな生理学的に活性な物質である。） を有するランタニド金属とキレート剤の錯体を含んでな
る。
−ＣＮＨ−１−Ｃ−Ｎ−のようなア２Ｈ５ ミド；５Ｏ２ＮＨ−１ＳＯ２Ｎ−のようなスルホアミ１ ド；−０−１−８−のようなエーテル；−Ｃ−１ｌ −Ｃ−のようなカルがニル；＝Ｎ−のようなニトリロ；
−ＮＨ−のようなイミノの如き結合基であり、アリー
レン及びチオアリーレンのような付加的な有機結合原子
を含んでなるそれらの基を含み；ｐ及びｍは０又は１で
あり、ｎは１〜３であり、Ｒ１は抗原又はホルモンのよ
うな生理学的に活性な物質である。） を有するランタニド金属とキレート剤の錯体を含んでな
る。
前記のようにいったん製造された場合、螢光標識された
生理学的に活性な種は螢光の特殊の結合検定、特に西独
公開公報筒２，６２８，１５８号にお亀ρで記載された
パックグラウンドから識別する信号を特別に検出する一
時的な分割を利用するもの、に有用である。この時分割
されたモード（すなわち、一時的分割）において試料は
断続的な様式で励起され、情報は他の螢光源が衰微しに
時を除いて、長生の螢光標識物がまだ強く発する時、暗
サイクルの間のみ受は入れられる。不連続の励起が・や
ルスレーザーを含み、連続励起ビームを機械的に細断し
、試料を励起ビームにおいて及びから移動する種々の方
法で達成される。さらに不連続の励起は試料による大量
のエネルギーの吸収なしに高い輻射力の使用を可能にし
、サンプルの光劣化の可能性を減少する利点を有する。
生理学的に活性な種は螢光の特殊の結合検定、特に西独
公開公報筒２，６２８，１５８号にお亀ρで記載された
パックグラウンドから識別する信号を特別に検出する一
時的な分割を利用するもの、に有用である。この時分割
されたモード（すなわち、一時的分割）において試料は
断続的な様式で励起され、情報は他の螢光源が衰微しに
時を除いて、長生の螢光標識物がまだ強く発する時、暗
サイクルの間のみ受は入れられる。不連続の励起が・や
ルスレーザーを含み、連続励起ビームを機械的に細断し
、試料を励起ビームにおいて及びから移動する種々の方
法で達成される。さらに不連続の励起は試料による大量
のエネルギーの吸収なしに高い輻射力の使用を可能にし
、サンプルの光劣化の可能性を減少する利点を有する。
ここに記載された特殊の結合試薬が効用を見い出すその
ような螢光の特殊の結合検定技術の例は米国特許第３，
９９８，９４３号、第４，０２０，１５１号、第３，９
３９，３５０号、第４，２２０，４５０号及び第３，９
０１，６５４号において記載されている。
ような螢光の特殊の結合検定技術の例は米国特許第３，
９９８，９４３号、第４，０２０，１５１号、第３，９
３９，３５０号、第４，２２０，４５０号及び第３，９
０１，６５４号において記載されている。
特に好ましい螢光的に標識化した特殊の結合試薬は次の
構造のものを含む。
構造のものを含む。
好ましい実施態様では特殊な結合検定は米国特許第４，
２５８，００１号において記載されているよう々乾式の
分析要素において行々われる。この実施態様ではその要
素は支持体及び高分子のビーズからなる拡散／試薬層及
び所望により表示層を含む。たいていその拡散層は試薬
層から分離している。拡散、試薬及び表示層は所望によ
り高分子ビーズ構造を含む。試薬層の高分子ビーズはそ
れらの表面に吸着された抗体のような受容体を有する。
２５８，００１号において記載されているよう々乾式の
分析要素において行々われる。この実施態様ではその要
素は支持体及び高分子のビーズからなる拡散／試薬層及
び所望により表示層を含む。たいていその拡散層は試薬
層から分離している。拡散、試薬及び表示層は所望によ
り高分子ビーズ構造を含む。試薬層の高分子ビーズはそ
れらの表面に吸着された抗体のような受容体を有する。
キレート標識物は特定の反応が試料湿潤の前に起るのを
防ぐ方法で試薬層の上、下又は中に置かれるか又はそれ
は試料と共に又はに伴なって要素上に点滴する。標識化
された配位子アナローブが配位子受容体錯体の形成にお
いて試料中の未知量の配位子と競争するために続いて湿
潤しながら要素を透過することがただ必要である。検定
は存在する遊離した標識化配位子アナローブの量又は結
合された標識化配位子アナローブ受容体の量を螢光測定
することによって行なわれる。
防ぐ方法で試薬層の上、下又は中に置かれるか又はそれ
は試料と共に又はに伴なって要素上に点滴する。標識化
された配位子アナローブが配位子受容体錯体の形成にお
いて試料中の未知量の配位子と競争するために続いて湿
潤しながら要素を透過することがただ必要である。検定
は存在する遊離した標識化配位子アナローブの量又は結
合された標識化配位子アナローブ受容体の量を螢光測定
することによって行なわれる。
以下の実施例により本発明の好ましい実施態様を説明す
るが、本発明をこれらの実施例に限定するものではない
。
るが、本発明をこれらの実施例に限定するものではない
。
例１：
ｐＨ９に帰着する硼酸塩緩衝剤を含む水溶液における等
モル量のＴｂＣ４５，６Ｈ２０をＧ、 Ｓｃｈｗａｒｚ
ｅｎｂａｃｈら、 Ｈｅ１ｖ、 Ｃｈｉｍ、 Ａｃｔａ
、 ３５＃ １７８５（１９５２）に記載された方法に
よって製造された構造：０■ Ｈ３ を有する化合物と混合することによって錯体を形成した
。３７係の水性のホルムアルデヒド溶液（３５，６、ｌ
ｉ＋、 ０．４４モル）を１０〜２０℃テ９０ｍ１のＨ
２Ｏ及び８８ｍ１の濃縮された水性ＮａＯＨ中のｐ−ク
レゾール（２１，６ｇ、０２０モル）及びイミノーゾ酢
酸（５６，０ｇ、０．４２モル）の溶液に満願した。得
られる混合物を６０〜７０℃で２時間加熱し、次いで８
６ｍ１の濃ＨＣ１で中和した。溶剤を真空中で除去し、
残留物を１２００ｍ１のエタノール中において加熱した
。不溶性の物質を濾過によって除去し、溶剤容積を６０
０ｍ１まで減少し冷却した。沈澱した塩をν過によって
除去し、Ｐ液を白色粉末（９９係）として７９．９の２
，６−ピスＣＮ、Ｎ−ビス（カルぎキシメチル）アミノ
メチルクー４−メチルフェノールを与える乾燥度まで蒸
発させた。生成物をエタノールから再結晶化した。等モ
ル量の生成物とＰＬ（９の水性の硼酸塩緩衝剤中のＴｂ
Ｃ／−３・６Ｈ２０を混合することによって錯体を形成
した。その溶液が長波長ＵＶランプ（３６６ｎｍにλｍ
ａｘを有するＵＶＬ −２１型ブラツク レイ ランｆ
）で励起された時あざやかな緑色の発光を示した。
モル量のＴｂＣ４５，６Ｈ２０をＧ、 Ｓｃｈｗａｒｚ
ｅｎｂａｃｈら、 Ｈｅ１ｖ、 Ｃｈｉｍ、 Ａｃｔａ
、 ３５＃ １７８５（１９５２）に記載された方法に
よって製造された構造：０■ Ｈ３ を有する化合物と混合することによって錯体を形成した
。３７係の水性のホルムアルデヒド溶液（３５，６、ｌ
ｉ＋、 ０．４４モル）を１０〜２０℃テ９０ｍ１のＨ
２Ｏ及び８８ｍ１の濃縮された水性ＮａＯＨ中のｐ−ク
レゾール（２１，６ｇ、０２０モル）及びイミノーゾ酢
酸（５６，０ｇ、０．４２モル）の溶液に満願した。得
られる混合物を６０〜７０℃で２時間加熱し、次いで８
６ｍ１の濃ＨＣ１で中和した。溶剤を真空中で除去し、
残留物を１２００ｍ１のエタノール中において加熱した
。不溶性の物質を濾過によって除去し、溶剤容積を６０
０ｍ１まで減少し冷却した。沈澱した塩をν過によって
除去し、Ｐ液を白色粉末（９９係）として７９．９の２
，６−ピスＣＮ、Ｎ−ビス（カルぎキシメチル）アミノ
メチルクー４−メチルフェノールを与える乾燥度まで蒸
発させた。生成物をエタノールから再結晶化した。等モ
ル量の生成物とＰＬ（９の水性の硼酸塩緩衝剤中のＴｂ
Ｃ／−３・６Ｈ２０を混合することによって錯体を形成
した。その溶液が長波長ＵＶランプ（３６６ｎｍにλｍ
ａｘを有するＵＶＬ −２１型ブラツク レイ ランｆ
）で励起された時あざやかな緑色の発光を示した。
例２：
９Ｉの水酸化ナトリウムを含む６０ｍ１の水中の９．９
．９ （０，０５モル）のｐ−ヒドロキシベンゾフェノ
ンと１３．７ 、ｌｉ’ （０，１モル）のイミノジ酢
酸の攪拌された溶液に８．９．ｌｉ’の３７チ水性ホル
ムアルデヒド溶液をゆっくり添加した。その混合物を攪
拌し、５時間還流し、次いで室温まで冷却し、２Ｎの塩
酸でＰＨ２まで持っていった。形成された固体を収集し
、水で洗浄し、風乾した。その生成物を５００ｍ１の９
０ｑ６エチルアルコールから再結晶化し、５．９．９の
白色から淡紅色の固体を２つの収穫において与えた。
．９ （０，０５モル）のｐ−ヒドロキシベンゾフェノ
ンと１３．７ 、ｌｉ’ （０，１モル）のイミノジ酢
酸の攪拌された溶液に８．９．ｌｉ’の３７チ水性ホル
ムアルデヒド溶液をゆっくり添加した。その混合物を攪
拌し、５時間還流し、次いで室温まで冷却し、２Ｎの塩
酸でＰＨ２まで持っていった。形成された固体を収集し
、水で洗浄し、風乾した。その生成物を５００ｍ１の９
０ｑ６エチルアルコールから再結晶化し、５．９．９の
白色から淡紅色の固体を２つの収穫において与えた。
Ｃ２３Ｈ２４Ｎ２０１ｏ−Ｈ２Ｏに対する分析計算値：
Ｃ、５４，５；Ｈｒ ５．２ ；Ｎ ｒ ５．５実験値
： Ｃｒ ５４゜５ ；Ｉ（、４，８；Ｎ 、 ６．１
ＵＶスペクトル（ｐＨ９の硼酸塩緩衝剤）λｍａｘ３２
０ｎｍ、ｇ１．６ＸＩＱ’ 前記化合物とｐＨ９の硼酸塩緩衝剤中のＥ ｕ ＣＺ
ｓ・６Ｈ２０又はＴｂＣ！３・６Ｈ２０との正確に等モ
ルの混合物は長波長紫外線ランプで励起された時鮮かな
赤色（Ｅｕ”３）又は緑色（Ｔｂ ＋ ３ ）の螢光を
示した。
Ｃ、５４，５；Ｈｒ ５．２ ；Ｎ ｒ ５．５実験値
： Ｃｒ ５４゜５ ；Ｉ（、４，８；Ｎ 、 ６．１
ＵＶスペクトル（ｐＨ９の硼酸塩緩衝剤）λｍａｘ３２
０ｎｍ、ｇ１．６ＸＩＱ’ 前記化合物とｐＨ９の硼酸塩緩衝剤中のＥ ｕ ＣＺ
ｓ・６Ｈ２０又はＴｂＣ！３・６Ｈ２０との正確に等モ
ルの混合物は長波長紫外線ランプで励起された時鮮かな
赤色（Ｅｕ”３）又は緑色（Ｔｂ ＋ ３ ）の螢光を
示した。
前記ユーロピウムキレート溶液からの発光強度をＦａｒ
ｒａｎｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ販売
ノファランドス啄クトロフルオりメーターにおける濃度
の関数として試験した。データはユーロピウムキレート
におけるｌｏ−５〜１０−’Ｍの濃度の対数の関数とし
ての発光の対数において直線的な減少を示した。λ＝
３２０ ｔｎで励起されたｐＩ（８，５の硼酸塩緩衝剤
における１０−６Ｍ溶液のＥｕ＋３ 錯体に対する螢光
量子収量（φ）はＯ，Ｏ’ ０３であった。Ｔｂ＋３に
ついての同様な溶液はφ＝０．１０を有した。水中にお
けるＥｕ＋３及びＴｂ＋３ に対するこの配位子の結
合定数のｔｏｇｌｏの値はそれぞれ１６．７０±０．１
２Ｍ″″１及び１６７８十０．１１Ｍ−’であった。
ｒａｎｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ販売
ノファランドス啄クトロフルオりメーターにおける濃度
の関数として試験した。データはユーロピウムキレート
におけるｌｏ−５〜１０−’Ｍの濃度の対数の関数とし
ての発光の対数において直線的な減少を示した。λ＝
３２０ ｔｎで励起されたｐＩ（８，５の硼酸塩緩衝剤
における１０−６Ｍ溶液のＥｕ＋３ 錯体に対する螢光
量子収量（φ）はＯ，Ｏ’ ０３であった。Ｔｂ＋３に
ついての同様な溶液はφ＝０．１０を有した。水中にお
けるＥｕ＋３及びＴｂ＋３ に対するこの配位子の結
合定数のｔｏｇｌｏの値はそれぞれ１６．７０±０．１
２Ｍ″″１及び１６７８十０．１１Ｍ−’であった。
例３：
２５ゴのメタノール中における１、６４ ！ｊ（０，０
２モル）の３７部水性ホルムアルデヒドの溶液に３．２
２．９（０，０２モル）のジメチルイミノジ酢酸を添加
した。その溶液をロータリーエ・々ボレーターにおいて
減圧下で濃縮した。メタノール（２５ＴＬｌ）をその残
留物に添加し溶液を再び濃縮した。
２モル）の３７部水性ホルムアルデヒドの溶液に３．２
２．９（０，０２モル）のジメチルイミノジ酢酸を添加
した。その溶液をロータリーエ・々ボレーターにおいて
減圧下で濃縮した。メタノール（２５ＴＬｌ）をその残
留物に添加し溶液を再び濃縮した。
残留オイル２．６ｆｌ（０，０１モル）の３−ベンゾイ
ル−７−ヒドロキシクマリン、次いテ４ ｍｌのＮ−メ
チルモルホリンを添加した。その混合物を１１５℃で３
時間攪拌しカから加熱し、次いでロータリーエバポレー
ターにおいて減圧下で濃縮した。得られる濃縮オイルを
最小量のＣＨ２Ｃｌ２に溶かし、乾燥したシリカゲルの
カラムに適用した。
ル−７−ヒドロキシクマリン、次いテ４ ｍｌのＮ−メ
チルモルホリンを添加した。その混合物を１１５℃で３
時間攪拌しカから加熱し、次いでロータリーエバポレー
ターにおいて減圧下で濃縮した。得られる濃縮オイルを
最小量のＣＨ２Ｃｌ２に溶かし、乾燥したシリカゲルの
カラムに適用した。
そのカラムを１＝４の酢酸エヂル：ＣＨ２Ｃ４２で溶離
した。最初の黄色帯の単一付加物は棄てた。第二番目の
黄色帯を収集した。減圧下での溶剤の除去は１．６９の
望ましい生成物を結晶化を引き起すことができない黄色
オイルとして与えた。
した。最初の黄色帯の単一付加物は棄てた。第二番目の
黄色帯を収集した。減圧下での溶剤の除去は１．６９の
望ましい生成物を結晶化を引き起すことができない黄色
オイルとして与えた。
２０ｍ１の酢酸中における１、５．！９ （，００２７
％ル）の前記テトラエステルの溶液に０．６．９ （０
，００３モル）の酢酸第二銅−水塩、次いで１０ｍ１の
水を添加した。その混合物を攪拌し窒素下で２時間還流
した。反応を室温まで冷却し、塩酸で約ｐ）Ｉ２までも
っていった。攪拌しながらその混合物を硫化水素ガスで
飽和し、１５分放置せしめた。沈澱した硫化銅を珪藻土
パッドを通しての吸引濾過によって除去した。透明な橙
褐色のＰ液をロータリーエバポレーターにおいて減圧下
で濃縮した。その残留物を２５係の水を含む熱エタノー
ル中に溶解し、次いで最終的に５℃で数時間冷却せしめ
た。固体を収集し、水で洗浄し、真空乾燥して０，３Ｉ
の生成物を与えた。ＵＶスペクトル（ｐｌ−１９の硼酸
緩衝剤）λｍａｘ３９６ｎｍ、ε２７０００゜Ｃ２６Ｈ
２４Ｎ２０１２に対する分析計算値：Ｃ，５６，１；Ｉ
（、４，３；Ｎ 、 ５．０゜ 実験値：Ｃ，５５，６；Ｈ，４，２；Ｎ、４．６゜正確
に等モル量の前記化合物とｐＨ９の硼酸塩緩衝剤におけ
るＦ、ｕ Ｃ２３・６Ｈ２０は長波長紫外線ランプで励
起された時鮮かが赤色の発光を示した。
％ル）の前記テトラエステルの溶液に０．６．９ （０
，００３モル）の酢酸第二銅−水塩、次いで１０ｍ１の
水を添加した。その混合物を攪拌し窒素下で２時間還流
した。反応を室温まで冷却し、塩酸で約ｐ）Ｉ２までも
っていった。攪拌しながらその混合物を硫化水素ガスで
飽和し、１５分放置せしめた。沈澱した硫化銅を珪藻土
パッドを通しての吸引濾過によって除去した。透明な橙
褐色のＰ液をロータリーエバポレーターにおいて減圧下
で濃縮した。その残留物を２５係の水を含む熱エタノー
ル中に溶解し、次いで最終的に５℃で数時間冷却せしめ
た。固体を収集し、水で洗浄し、真空乾燥して０，３Ｉ
の生成物を与えた。ＵＶスペクトル（ｐｌ−１９の硼酸
緩衝剤）λｍａｘ３９６ｎｍ、ε２７０００゜Ｃ２６Ｈ
２４Ｎ２０１２に対する分析計算値：Ｃ，５６，１；Ｉ
（、４，３；Ｎ 、 ５．０゜ 実験値：Ｃ，５５，６；Ｈ，４，２；Ｎ、４．６゜正確
に等モル量の前記化合物とｐＨ９の硼酸塩緩衝剤におけ
るＦ、ｕ Ｃ２３・６Ｈ２０は長波長紫外線ランプで励
起された時鮮かが赤色の発光を示した。
前記ユーロピウムキレート溶液からの発光強度をファラ
ンドスペクトロフルオリメーターにおける濃度の関数と
して試験した。そのデータはユーロピウムキレートにお
ける１０〜１０ Ｍの濃度の関数として発光における
減少を示した。
ンドスペクトロフルオリメーターにおける濃度の関数と
して試験した。そのデータはユーロピウムキレートにお
ける１０〜１０ Ｍの濃度の関数として発光における
減少を示した。
λｍａＸ発光 ５９３ ｎｍ 、 ６１４ ｎｍ 、
６５２ ｎｍ 。
６５２ ｎｍ 。
７０１ ｎｍ 、 ５６０〜８００ ｎｍにわたる発
光量子収量＝４．５％ ５１４ ｎｍにおける発光量子収量−３，７係水中にお
けるＥｕ 及びＴｂ とこの配合子の結合定数に対
する＆ｇ１ｏの値はそれぞれ１６．２６±０．２３Ｍ−
１及び１６．３５±０．２１Ｍ−１であった。
光量子収量＝４．５％ ５１４ ｎｍにおける発光量子収量−３，７係水中にお
けるＥｕ 及びＴｂ とこの配合子の結合定数に対
する＆ｇ１ｏの値はそれぞれ１６．２６±０．２３Ｍ−
１及び１６．３５±０．２１Ｍ−１であった。
以下余白
例４：
２．４−ジヒドロキシ−３，５−ビス−（Ｎ、Ｎ−ジ（
エトキシカルボニルメチル）−アミノメチル〕ベンズア
ルデヒド の製造 ５０Ｔ／Ｌｌのエタノール中における８、２．９（０，
１モル）の３７’％水性ホルムアルデヒドに１８．１’
（０，１モル）のジエチルイミノジアセテートを添加し
た。その混合物を四−タリーエバポレーターにおいて減
圧下で濃縮した。追加的な５０ｍＪのエタノールを添加
し、混合物を再び乾燥まで濃縮した。得られるオイルに
６．９ 、！ｉ’ （０，０５モル）の固体２ 、４−
ジヒドロキシベンズアルデヒドを添加した。その混合物
を攪拌し、１２０℃で３時間加熱し、次いで精製せずに
使用した。
エトキシカルボニルメチル）−アミノメチル〕ベンズア
ルデヒド の製造 ５０Ｔ／Ｌｌのエタノール中における８、２．９（０，
１モル）の３７’％水性ホルムアルデヒドに１８．１’
（０，１モル）のジエチルイミノジアセテートを添加し
た。その混合物を四−タリーエバポレーターにおいて減
圧下で濃縮した。追加的な５０ｍＪのエタノールを添加
し、混合物を再び乾燥まで濃縮した。得られるオイルに
６．９ 、！ｉ’ （０，０５モル）の固体２ 、４−
ジヒドロキシベンズアルデヒドを添加した。その混合物
を攪拌し、１２０℃で３時間加熱し、次いで精製せずに
使用した。
前記をジメチルイミノジアセテートを用いて同じ結果と
共に繰り返した。
共に繰り返した。
例５：
３−（４−ニトロベンゾイル）−７−ヒトロキシー６．
８−ビス（Ｎ、Ｎ−ジ（カルがキシメチル）−アミノメ
チルコクマリン の製造 前記例４の粗アルデヒド（０，０５モル）に１１．８５
９（０，０５モル）のエチル４−ニトロベンゾイルアセ
テート、次いで１００ｍ１のエタノールを添加した。１
−のエタノール中における３０〜の酢酸と４２ｍ９のピ
ペリジンの溶液を添加し、その混合物を攪拌し、１６時
間還流した。この時間の後反応生成物をロータリーエバ
ポレーターにおいて濃縮した。得られるオイルを最小量
のＣＨ２Ｃｌ２中に溶解し、シリカダル乾燥カラムに適
用した。そのカラムを１５０：８５０の酢酸エチル：Ｃ
Ｆ２Ｃｌ２で溶離した。最初流れる無色の不純物と第二
番目に流れる暗黄色の不純物を棄てた。
８−ビス（Ｎ、Ｎ−ジ（カルがキシメチル）−アミノメ
チルコクマリン の製造 前記例４の粗アルデヒド（０，０５モル）に１１．８５
９（０，０５モル）のエチル４−ニトロベンゾイルアセ
テート、次いで１００ｍ１のエタノールを添加した。１
−のエタノール中における３０〜の酢酸と４２ｍ９のピ
ペリジンの溶液を添加し、その混合物を攪拌し、１６時
間還流した。この時間の後反応生成物をロータリーエバ
ポレーターにおいて濃縮した。得られるオイルを最小量
のＣＨ２Ｃｌ２中に溶解し、シリカダル乾燥カラムに適
用した。そのカラムを１５０：８５０の酢酸エチル：Ｃ
Ｆ２Ｃｌ２で溶離した。最初流れる無色の不純物と第二
番目に流れる暗黄色の不純物を棄てた。
より遅く移動する淡黄色生成物帯を収集し、溶剤を減圧
下で除去した。得られるオイルをＮＭＲ及び質量スペク
トルによって分析し直接使用した。収量、１４．３Ｎ。
下で除去した。得られるオイルをＮＭＲ及び質量スペク
トルによって分析し直接使用した。収量、１４．３Ｎ。
７５ｍ１の酢酸中における前記節で形成された２、６７
、ｌＯ，００３７５モル）のテトラエステルに１．０＃
（０，００５モル）の酢酸第一銅−水塩、次いで２５ｍ
７！の水を添加した。その混合物を攪拌し、窒素下で２
時間還流した。反応を室温まで冷却し、塩酸で約Ｐ１１
２までもりていりた。それから過剰の硫化水素ガスを攪
拌された溶液の中へ通過させ、その混合物を３０分放置
せしめた。沈澱した硫化銅を珪藻土・七ッドを通しての
吸引涙過によって除去した。そのν液をロータリーエバ
ポレーターにおいて真空下で乾燥まで濃縮した。残留物
を５０ｍ１の水ですりつぶした。固体を収集し水でよく
洗浄し乾燥した。収量、１．２．！ｉ＋、サンプルを５
０係の熱い水性エタノールに溶解した。その混合物を固
体が形成されるまで減圧下で濃縮した。
、ｌＯ，００３７５モル）のテトラエステルに１．０＃
（０，００５モル）の酢酸第一銅−水塩、次いで２５ｍ
７！の水を添加した。その混合物を攪拌し、窒素下で２
時間還流した。反応を室温まで冷却し、塩酸で約Ｐ１１
２までもりていりた。それから過剰の硫化水素ガスを攪
拌された溶液の中へ通過させ、その混合物を３０分放置
せしめた。沈澱した硫化銅を珪藻土・七ッドを通しての
吸引涙過によって除去した。そのν液をロータリーエバ
ポレーターにおいて真空下で乾燥まで濃縮した。残留物
を５０ｍ１の水ですりつぶした。固体を収集し水でよく
洗浄し乾燥した。収量、１．２．！ｉ＋、サンプルを５
０係の熱い水性エタノールに溶解した。その混合物を固
体が形成されるまで減圧下で濃縮した。
固体を収集し冷水で洗浄し、乾燥した。
Ｃ２６Ｈ２３Ｎ３０，４・Ｈ２Ｏに対する分析計算値：
Ｃ１５０，４；Ｈ、４，１；Ｎ 、 ６．８゜実験値：
Ｃ，５０，８；Ｈ，４，１；Ｎ、６．４水性の重炭酸す
） ＩＪウム溶液における前記キレート剤の触媒的な還
元は相当するアミン化合物を与えた。
Ｃ１５０，４；Ｈ、４，１；Ｎ 、 ６．８゜実験値：
Ｃ，５０，８；Ｈ，４，１；Ｎ、６．４水性の重炭酸す
） ＩＪウム溶液における前記キレート剤の触媒的な還
元は相当するアミン化合物を与えた。
例６：
前記例３において記載された１０ Ｍの濃度のユーロ
ピウムキレートを含む素溶液を硼酸塩緩衝剤（ｐＨ８，
５）で表ＩＫ示される濃度まで稀釈した。
ピウムキレートを含む素溶液を硼酸塩緩衝剤（ｐＨ８，
５）で表ＩＫ示される濃度まで稀釈した。
１０マイクロリツトルの各濃度のアリコートを次の方法
において製造された分析要素上に点滴した。
において製造された分析要素上に点滴した。
ブリカーブネートフィルム支持体をオパルブミン、カル
ボキシメチルセルロース（０，１９ｇ／ｍ” ）、全溶
融重量に基づいて０．０５係のＺｏｎｙｌ ＦＳＮ（デ
ーポンから得た非イオン系の螢光界面活性剤）、通常の
家兎の血清（０，８３１／／ｍ２） 、ポリ（ｎ−ブチ
ルアクリレート−ＣＯ−スチレン−ＣＯ−２−アクリル
アミド−２−メチルフロ、ｆンスルホン酸）（重量比７
０：２０：１０）（２，２５ｙ／ｙｎ２）及びｐＨ８，
５０Ｈ３ＢＯ３・Ｋ（４緩衝剤で吸着された、ポリ（ス
チレン−〇〇−メタアクリル酸）（ｆｆｔ量比９８ ：
２ ） （７５，Ｏ、！９／ｍ” ）から々るミクロ
ビーズ層でコートした。
ボキシメチルセルロース（０，１９ｇ／ｍ” ）、全溶
融重量に基づいて０．０５係のＺｏｎｙｌ ＦＳＮ（デ
ーポンから得た非イオン系の螢光界面活性剤）、通常の
家兎の血清（０，８３１／／ｍ２） 、ポリ（ｎ−ブチ
ルアクリレート−ＣＯ−スチレン−ＣＯ−２−アクリル
アミド−２−メチルフロ、ｆンスルホン酸）（重量比７
０：２０：１０）（２，２５ｙ／ｙｎ２）及びｐＨ８，
５０Ｈ３ＢＯ３・Ｋ（４緩衝剤で吸着された、ポリ（ス
チレン−〇〇−メタアクリル酸）（ｆｆｔ量比９８ ：
２ ） （７５，Ｏ、！９／ｍ” ）から々るミクロ
ビーズ層でコートした。
それからその要素をＷｒａｔｔａｎ １８Ａ フィル
クーを有するフルオリメーターを使用して、励起３００
−４００ ｎｍ及び発光６２０ ｎｍで、ｐＨ８及びｐ
Ｈ９，１８で評価した。
クーを有するフルオリメーターを使用して、励起３００
−４００ ｎｍ及び発光６２０ ｎｍで、ｐＨ８及びｐ
Ｈ９，１８で評価した。
下記表において示された結果は得られた螢光信号がサン
プルにおけるユーロピウムキレートの濃度の関数である
ことを説明している。・々ツクグラウンド螢光は５０
ｍＶであった。
プルにおけるユーロピウムキレートの濃度の関数である
ことを説明している。・々ツクグラウンド螢光は５０
ｍＶであった。
以下余白
表 ■
”０−７８ ４００−４５０ ｍＶｌｏ−６８
４５００ｍＶ ｌｏ ８ ４０ Ｖ １０”−８９，１８６０ｍＶ ｌｏ”” ９．１８ ２５０ ｍＶｌｏ
−’ ９．１８ ２．Ｉ Ｖｌｏ−”、
９・１８ ２０ Ｖ例７： 例３において記載されたように製造されたテルビウム化
合物を例６の方法で試験した。その結果ヲ５５０ ｎｍ
で測定されマイクロアンペア（μＡ）で与えられた螢光
を有する表Ｈに示す。
４５００ｍＶ ｌｏ ８ ４０ Ｖ １０”−８９，１８６０ｍＶ ｌｏ”” ９．１８ ２５０ ｍＶｌｏ
−’ ９．１８ ２．Ｉ Ｖｌｏ−”、
９・１８ ２０ Ｖ例７： 例３において記載されたように製造されたテルビウム化
合物を例６の方法で試験した。その結果ヲ５５０ ｎｍ
で測定されマイクロアンペア（μＡ）で与えられた螢光
を有する表Ｈに示す。
表■
Ｔｂキレートの濃度（Ｍ） ｐ± Ｅｍ５５０１ｍに
おける螢光（麩）１０−５８．０ １１．１ １０” ８．０ １．４１１０”−
７８，００，２７ １０＝ ８．０ ０．０４１０”
８．０ ０．０５例８： ユーロピウムと３，５−ビス（Ｎ、Ｎ−ビス（カルブキ
シ−メチル）アミノメチル） ＋ ４７−（Ｎ′−〔４
−〔４−ヒドロキシ−３，５−シイオドフェノキシ）−
３，５−シイオド−β−メトキシカルツクニル−フェネ
チル〕−チオウレイド）−４−メトキシベンゾフェノン
との錯体。
おける螢光（麩）１０−５８．０ １１．１ １０” ８．０ １．４１１０”−
７８，００，２７ １０＝ ８．０ ０．０４１０”
８．０ ０．０５例８： ユーロピウムと３，５−ビス（Ｎ、Ｎ−ビス（カルブキ
シ−メチル）アミノメチル） ＋ ４７−（Ｎ′−〔４
−〔４−ヒドロキシ−３，５−シイオドフェノキシ）−
３，５−シイオド−β−メトキシカルツクニル−フェネ
チル〕−チオウレイド）−４−メトキシベンゾフェノン
との錯体。
キレート剤の製造のための総合図式は次のとおりである
。
。
２
Ｂｒ ＯＣＨ３Ｂｒ
３
■
１
２）闇、Ｔ４０ＣＨ３，Ｅｔ３Ｎ
（ここでＮＨ２Ｔ４０ＣＨ３は
０ＣＨ。
３．５−ツメチル−４−ヒドロキシ−４′−二トロ２５
０ｍＬ（７）ニトロベンゼン中におけるｐ−ニトロベン
ゾイルクロリド（７６，１，、Ｆ、 ０．４１．０モル
）の攪拌された溶液に８２．９のＡｔＣ１３（０，６２
モル）を添加した。この混合物に２５０ｍ１のニトロベ
ンゼン中における５０ｇの２，６−シメチルフエノール
（０，４１モル）の溶液を４５分間にわたって満願し、
得られる混合物を室温で１６時間攪拌した。その反応物
を２１の３俤ＨＣ１と氷の中へ注ぎ、（ＣＨ３ＣＨ２）
２０で３×１１の（すなわちｌｌづつのジエチルエーテ
ルで３回）抽出をした。結合されたエーテル層を１１の
飽和Ｎａ ＨＣＯ３で洗浄し、次いで１０４ ＮａＯＨ
で２×１１の抽出をした。結合された塩基性抽出物を濃
ＨＣ１で酸性にし白色沈澱物を与えた；濾過後ＣＨ３０
ＶＨ２０からの再結晶化により薄層クロマトグラフィー
（ＴＬＣ） 、ＩＲ，質量スペクトル、ＮＭＲ、及び元
素分析、融点１８２．５〜１、８４．５による所望の生
成物に一致した３７ｇ（３，３，％）の白色粉末を与え
た。
０ｍＬ（７）ニトロベンゼン中におけるｐ−ニトロベン
ゾイルクロリド（７６，１，、Ｆ、 ０．４１．０モル
）の攪拌された溶液に８２．９のＡｔＣ１３（０，６２
モル）を添加した。この混合物に２５０ｍ１のニトロベ
ンゼン中における５０ｇの２，６−シメチルフエノール
（０，４１モル）の溶液を４５分間にわたって満願し、
得られる混合物を室温で１６時間攪拌した。その反応物
を２１の３俤ＨＣ１と氷の中へ注ぎ、（ＣＨ３ＣＨ２）
２０で３×１１の（すなわちｌｌづつのジエチルエーテ
ルで３回）抽出をした。結合されたエーテル層を１１の
飽和Ｎａ ＨＣＯ３で洗浄し、次いで１０４ ＮａＯＨ
で２×１１の抽出をした。結合された塩基性抽出物を濃
ＨＣ１で酸性にし白色沈澱物を与えた；濾過後ＣＨ３０
ＶＨ２０からの再結晶化により薄層クロマトグラフィー
（ＴＬＣ） 、ＩＲ，質量スペクトル、ＮＭＲ、及び元
素分析、融点１８２．５〜１、８４．５による所望の生
成物に一致した３７ｇ（３，３，％）の白色粉末を与え
た。
Ｃ１５Ｈ４３ＮＯ４・Ｈ２０ニ対する分析計算値：ｃ。
６２．２７；Ｈ，５，２４；Ｎ、４．８４゜実験値：Ｃ
，６２，３４：Ｔ（，５，３］ ；Ｎ、４．７６゜２５
０ｍ１のアセトン中において化合物１（１５，０，９，
５５，４ミリモル）、Ｋ２ＣＯ２（２０，ＯＦ％０．１
．４５モル）及ヒｃＨ３Ｉ（３０ｍ１ｓ ０．４８ ％
ル）を含む溶液を６時間還流した。その溶剤を蒸発させ
て、残留物をＣＨ２Ｃ４２と水の間で分配した。有機層
をＮａ ２ Ｓ Ｏ４を通して乾燥Ｌ、沖過し蒸発させ
て黄白色粉末を残した。−２０℃でのＣＨ３０Ｈ／石油
エーテルからの再結晶は１４．９Ｆの白色結晶（９４係
）を与えた。その物質をＮＭＲＳＴＬＣ，質量ス被りト
ル、ＩＲ，及び元素分析、融点１３１〜１３２．５℃に
よって特性づけた。
，６２，３４：Ｔ（，５，３］ ；Ｎ、４．７６゜２５
０ｍ１のアセトン中において化合物１（１５，０，９，
５５，４ミリモル）、Ｋ２ＣＯ２（２０，ＯＦ％０．１
．４５モル）及ヒｃＨ３Ｉ（３０ｍ１ｓ ０．４８ ％
ル）を含む溶液を６時間還流した。その溶剤を蒸発させ
て、残留物をＣＨ２Ｃ４２と水の間で分配した。有機層
をＮａ ２ Ｓ Ｏ４を通して乾燥Ｌ、沖過し蒸発させ
て黄白色粉末を残した。−２０℃でのＣＨ３０Ｈ／石油
エーテルからの再結晶は１４．９Ｆの白色結晶（９４係
）を与えた。その物質をＮＭＲＳＴＬＣ，質量ス被りト
ル、ＩＲ，及び元素分析、融点１３１〜１３２．５℃に
よって特性づけた。
Ｃ１６Ｈ１５ＮＯ４に対する分析計算値：Ｃ，６７，３
５；Ｈ，５，３］、；Ｎ、４．９１゜ 実験値：Ｃ，６７，５４；Ｔ（，５，３８；Ｎ、４．８
７゜以下余白 ３．５−ビスブロモメチル−４−メトキシ−４′−モス
クシニイミド（５，０，！７，２８ミリモル）の混合物
をラジカル開始剤として約５０ｍｇのジベンゾイルペル
オキシドをもった２５０ｍ１のＣＣｌ２においてＮ２下
で１時間還流した。反応物を室温まで冷却し１ｏｏｍｌ
！のＣＨ２Ｃｌ２を添加した。Ｐ退後水性のチオ硫酸す
） ＩＪウムで炉液を抽出し、有機層をＮａ２ＳＯ４を
通して乾燥し、沖過及び溶剤除去は白色粉末を残した。
５；Ｈ，５，３］、；Ｎ、４．９１゜ 実験値：Ｃ，６７，５４；Ｔ（，５，３８；Ｎ、４．８
７゜以下余白 ３．５−ビスブロモメチル−４−メトキシ−４′−モス
クシニイミド（５，０，！７，２８ミリモル）の混合物
をラジカル開始剤として約５０ｍｇのジベンゾイルペル
オキシドをもった２５０ｍ１のＣＣｌ２においてＮ２下
で１時間還流した。反応物を室温まで冷却し１ｏｏｍｌ
！のＣＨ２Ｃｌ２を添加した。Ｐ退後水性のチオ硫酸す
） ＩＪウムで炉液を抽出し、有機層をＮａ２ＳＯ４を
通して乾燥し、沖過及び溶剤除去は白色粉末を残した。
この粉末を（ＣＨ２Ｃ４２）２０テ３×５０ｍ１のすり
つぶしをし、ＴＬＣが３の成分を含むことを示した５、
７．！７の白色粉末を残した。ＮＭＲ及び質量スペクト
ルは不純物の存在を確認したが、物質の大部分は所望の
生成物であった。
つぶしをし、ＴＬＣが３の成分を含むことを示した５、
７．！７の白色粉末を残した。ＮＭＲ及び質量スペクト
ルは不純物の存在を確認したが、物質の大部分は所望の
生成物であった。
化合物性（２゜０，９，４．５ミリモル）とジ−ターシ
ャリ−ブチルイミノジアセテート（２，１，９，０ミリ
モル）の溶液ヲ２００ ｍｌのテトラヒドロフランにお
いて室温で６０時間攪拌した。溶剤を除去し残りの黄色
オイルをＣＨ２Ｃｌ２と高度に精製された水から得られ
た冷水性のに２ＣＯ３との間で分配した。有機層をＮａ
２ＳＯ４を通して乾燥し、ｐ過し蒸発させて４５．９の
黄色オイルを残した。溶離剤としてＣＨ２Ｃ４２を有す
る分取グル透過カラムを出発物質及び岸−付加物から所
望の生成物を分離するために使用した。得られる黄色オ
イル（１，５ｙ１４３係）は結晶化せしめることができ
＆＜、ＴＬＣ。
ャリ−ブチルイミノジアセテート（２，１，９，０ミリ
モル）の溶液ヲ２００ ｍｌのテトラヒドロフランにお
いて室温で６０時間攪拌した。溶剤を除去し残りの黄色
オイルをＣＨ２Ｃｌ２と高度に精製された水から得られ
た冷水性のに２ＣＯ３との間で分配した。有機層をＮａ
２ＳＯ４を通して乾燥し、ｐ過し蒸発させて４５．９の
黄色オイルを残した。溶離剤としてＣＨ２Ｃ４２を有す
る分取グル透過カラムを出発物質及び岸−付加物から所
望の生成物を分離するために使用した。得られる黄色オ
イル（１，５ｙ１４３係）は結晶化せしめることができ
＆＜、ＴＬＣ。
電界脱着（ｆｉｅｌｄ ｄｅａｏｒｐｔｉｏｎ ）質量
スにクトル、ＮＭＲｌ及びＩＲによって特性づけな。
スにクトル、ＮＭＲｌ及びＩＲによって特性づけな。
ニトロテトラエステル±（３，０ｇ、３．９ ミｌＪ％
ル）を５０ｐｓｉの初期の水素圧でＰａｒｒ振とぅ機に
おける１００ｍ９の１． Ｏ％ Ｐｄ／Ｃを有する５０
ｍＡ！ノＣＨ３０Ｈにおいて２，５時間還元した。ＴＬ
Ｃは定量的な還元を示ｌ−た。その混合物を珪藻土を通
して沖過し蒸発させて黄色のオイルを残し、それは化合
物土用に使用された方法によってダル透過クロマトグラ
フィーにより精製された。このようにして得られた黄色
ガラスは正しいＮＭＲ，ＩＲおよび電界脱着質量スペク
トル挙動を有しな。
ル）を５０ｐｓｉの初期の水素圧でＰａｒｒ振とぅ機に
おける１００ｍ９の１． Ｏ％ Ｐｄ／Ｃを有する５０
ｍＡ！ノＣＨ３０Ｈにおいて２，５時間還元した。ＴＬ
Ｃは定量的な還元を示ｌ−た。その混合物を珪藻土を通
して沖過し蒸発させて黄色のオイルを残し、それは化合
物土用に使用された方法によってダル透過クロマトグラ
フィーにより精製された。このようにして得られた黄色
ガラスは正しいＮＭＲ，ＩＲおよび電界脱着質量スペク
トル挙動を有しな。
トリエチルアミン（１，２８１ｎ１１９．２ミリモル）
と共にテトラエステルアミンΣ（１，，７，９，２，３
ミリモル〕を４０ｍ１の乾燥テトラヒドロフラン（Ｔ’
ＨＦ ）に溶解し、次いで１０ｍ１の乾燥ＴＨＦ中のチ
オホスケ９ン（０，１７５ｍｌ、 ２．３ ミ！Ｊモル
）ｔ−満願した。その反応を２時間進行せしめ、その後
溶剤を除去し、黄橙色オイルを得た。そのオイルを６０
ｍ１の乾ｉＮ、Ｎ−−２メチルボルムアミド（ＤＭＦ
）に溶解し、２０ ｍｌＤＭＦ中におけるＬ−チロキシ
ンメチルエステルヒドロクロリド（１，９，９，２，３
ミリモル）とトリエチルアミン（０，３２ｍ／。
と共にテトラエステルアミンΣ（１，，７，９，２，３
ミリモル〕を４０ｍ１の乾燥テトラヒドロフラン（Ｔ’
ＨＦ ）に溶解し、次いで１０ｍ１の乾燥ＴＨＦ中のチ
オホスケ９ン（０，１７５ｍｌ、 ２．３ ミ！Ｊモル
）ｔ−満願した。その反応を２時間進行せしめ、その後
溶剤を除去し、黄橙色オイルを得た。そのオイルを６０
ｍ１の乾ｉＮ、Ｎ−−２メチルボルムアミド（ＤＭＦ
）に溶解し、２０ ｍｌＤＭＦ中におけるＬ−チロキシ
ンメチルエステルヒドロクロリド（１，９，９，２，３
ミリモル）とトリエチルアミン（０，３２ｍ／。
２．３ミリモル）の溶液を一部分に添加した。反応物を
Ｎ２下で１時間攪拌し、次いで３５０ｍ１の■■２０に
注いだ。エーテル抽出後エーテル層を引続いて３００ｍ
１分の純水で３回洗浄し、Ｎａ ２ Ｓ Ｏ４を通して
乾燥し、沖過し、そして蒸発させて３．１ｇの橙白色の
泡を与えた。この物質はグル透過クロマトグラフィーに
よって精製され、橙白色の泡として１．３Ｉの所望の生
成物を与えた。その生成物をさらにＴＬＣｌＮＭＲｌ及
び電界脱着質量スペクトルによって特性づけな。
Ｎ２下で１時間攪拌し、次いで３５０ｍ１の■■２０に
注いだ。エーテル抽出後エーテル層を引続いて３００ｍ
１分の純水で３回洗浄し、Ｎａ ２ Ｓ Ｏ４を通して
乾燥し、沖過し、そして蒸発させて３．１ｇの橙白色の
泡を与えた。この物質はグル透過クロマトグラフィーに
よって精製され、橙白色の泡として１．３Ｉの所望の生
成物を与えた。その生成物をさらにＴＬＣｌＮＭＲｌ及
び電界脱着質量スペクトルによって特性づけな。
テトラエステル６ （０，５Ｆ、 ０．３ミリモル）を
１５ｍ１のＣＦ３ＣＯ２Ｈに溶解し、乾燥管を反応７ラ
スコに結合させて室温で１６時間攪拌した。溶剤を真空
で除去し橙色の泡を残した。ＣＦ２Ｃｌ２による泡のす
りつぶしは定量的な収量の黄橙色粉末を生成した。電界
脱着質量スペクトルはｍ／ｅ（質量／負荷比）１３５０
で親イオンを示し、そのＩＲは生成物と一致している。
１５ｍ１のＣＦ３ＣＯ２Ｈに溶解し、乾燥管を反応７ラ
スコに結合させて室温で１６時間攪拌した。溶剤を真空
で除去し橙色の泡を残した。ＣＦ２Ｃｌ２による泡のす
りつぶしは定量的な収量の黄橙色粉末を生成した。電界
脱着質量スペクトルはｍ／ｅ（質量／負荷比）１３５０
で親イオンを示し、そのＩＲは生成物と一致している。
Ｃ４１Ｈ３８■４Ｎ４０１４Ｓに対する分析計算値：Ｃ
、３６，５；Ｈ，２，８；Ｎｌ ４．１ ；Ｓ 、 ２
．４゜実験値：Ｃ，３６４；Ｉ（１２，８；Ｎ、３．７
；Ｓ、２．７゜１当量の前記化合物と２尚量のｐＨ８，
５の緩衝剤中のＥ ｕ Ｃｌ３・６Ｈ２０は長波長紫外
線下で弱い螢光を示し、独特の朱色発光を与えた。螢光
強度とキレート濃度との間の直線関係はＶａｒｉａｎ
Ｓ Ｆ ３３０スペクトロフルオリメーターで１０ と
１０ Ｍ及びλｅｘ””３２０ ｎｍ 、 λｅｍ
＝６１４ ｎｍの間で示された。１当量の化合物ヱと２
当量のｐＨ８，５の硼酸塩緩衝剤中のＴｂＣ２３・６Ｈ
２０は長波長紫外線下で強い螢光を示した。このキレー
トはまた螢光強度と１０−５Ｍと５×１０−”Ｍ の間
のキレート濃度との間に直線関係を有した。
、３６，５；Ｈ，２，８；Ｎｌ ４．１ ；Ｓ 、 ２
．４゜実験値：Ｃ，３６４；Ｉ（１２，８；Ｎ、３．７
；Ｓ、２．７゜１当量の前記化合物と２尚量のｐＨ８，
５の緩衝剤中のＥ ｕ Ｃｌ３・６Ｈ２０は長波長紫外
線下で弱い螢光を示し、独特の朱色発光を与えた。螢光
強度とキレート濃度との間の直線関係はＶａｒｉａｎ
Ｓ Ｆ ３３０スペクトロフルオリメーターで１０ と
１０ Ｍ及びλｅｘ””３２０ ｎｍ 、 λｅｍ
＝６１４ ｎｍの間で示された。１当量の化合物ヱと２
当量のｐＨ８，５の硼酸塩緩衝剤中のＴｂＣ２３・６Ｈ
２０は長波長紫外線下で強い螢光を示した。このキレー
トはまた螢光強度と１０−５Ｍと５×１０−”Ｍ の間
のキレート濃度との間に直線関係を有した。
交叉反応性は抗体が未標識の抗原と比較していかによく
標識化された抗原を認識するかを反映するものである。
標識化された抗原を認識するかを反映するものである。
既知の技術によって測定されたような抗原のユーロピウ
ムキレートの交叉反応性は放射性標識化チロキシン及び
チロキシン抗体に対して７５ｑ６であった。
ムキレートの交叉反応性は放射性標識化チロキシン及び
チロキシン抗体に対して７５ｑ６であった。
例９：
３．５−ビス［Ｎ、Ｎ−ビス（カルボキシメチル）アミ
ノメチルクー４−ヒドロキシ−３′−（４−（４−ヒド
ロキシ−３，５−シイオドフェノキシ）−３，５−シイ
オド−β−エトキシカル？ニルフェネチル〕ベンゾフェ
ノンとユーロピウムの錯体 この例のキレート剤の製造のための総合図は次のとおり
である。
ノメチルクー４−ヒドロキシ−３′−（４−（４−ヒド
ロキシ−３，５−シイオドフェノキシ）−３，５−シイ
オド−β−エトキシカル？ニルフェネチル〕ベンゾフェ
ノンとユーロピウムの錯体 この例のキレート剤の製造のための総合図は次のとおり
である。
＊ＥＥＤＱ＝１−カルブ５トキシー１−エトキシ−１，
２−ジヒドロキノリン（１６） この化合物を米国特許第３，５３１，４３５号（Ｃｈｅ
ｍ、 Ａｂｓｔｒａｃｔｓ ７４ ＋ ４２８３Ｖ（
１９７１） ）に記載された方法によって製造した。１
０ｍ１のテトラクロロエタン中に２６．３．９のアニソ
ール（０，２４モル）と４６．９の３−カルがメトキシ
ベンゾイルクロリド（０，２３モル）を含む溶液を１０
０ｍ１のテトラクロロエタン中の６５．９ ＡｔＣ４３
（０，４９モル）の攪拌された溶液に０℃で１時間にわ
たって流加した。その混合物を室温まで到らせしめ１４
時間攪拌した。それから温度を７５〜８０℃まで上げ、
３２ＩＩのｋｔｃｔ３（０，２４モル）を３０分間にわ
たって添加した。その温度を４５分間保持し、次いでそ
の溶液を氷と６４ｍ１の濃塩酸の混合物の中へ注いだ。
２−ジヒドロキノリン（１６） この化合物を米国特許第３，５３１，４３５号（Ｃｈｅ
ｍ、 Ａｂｓｔｒａｃｔｓ ７４ ＋ ４２８３Ｖ（
１９７１） ）に記載された方法によって製造した。１
０ｍ１のテトラクロロエタン中に２６．３．９のアニソ
ール（０，２４モル）と４６．９の３−カルがメトキシ
ベンゾイルクロリド（０，２３モル）を含む溶液を１０
０ｍ１のテトラクロロエタン中の６５．９ ＡｔＣ４３
（０，４９モル）の攪拌された溶液に０℃で１時間にわ
たって流加した。その混合物を室温まで到らせしめ１４
時間攪拌した。それから温度を７５〜８０℃まで上げ、
３２ＩＩのｋｔｃｔ３（０，２４モル）を３０分間にわ
たって添加した。その温度を４５分間保持し、次いでそ
の溶液を氷と６４ｍ１の濃塩酸の混合物の中へ注いだ。
下部の相を除去し水洗した。テトラクロロエタンを水蒸
気蒸留によって除去し、固体褐色の残留物を残し、それ
を収集しテトラヒドロフラン及びトルエンから再結晶化
した。この中間体と水性ＮａＯＨとのケン化は酸性化後
白色粉末（１６，５Ｆ、２９係）：ｍｐ２４０〜２４１
℃（１１ｔ、２４０〜２４１℃）として所望の生成物を
与えた。
気蒸留によって除去し、固体褐色の残留物を残し、それ
を収集しテトラヒドロフラン及びトルエンから再結晶化
した。この中間体と水性ＮａＯＨとのケン化は酸性化後
白色粉末（１６，５Ｆ、２９係）：ｍｐ２４０〜２４１
℃（１１ｔ、２４０〜２４１℃）として所望の生成物を
与えた。
Ｃ１４Ｈ１ｏＯ４に対する分析計算値：ｃ、６９．４；
Ｈ，４，２゜ 実験値：Ｃ，６９，５；Ｈ，４，４゜ ５０ｍ１のイソブチルアルコール中における５、２２．
９ （０，０６モル）のモルホリンと１．８ｇ（０，０
６モル）のｉ＋ラホルムアルデヒドの混合物を窒素下で
透明な溶液が得られるまで還流した。
Ｈ，４，２゜ 実験値：Ｃ，６９，５；Ｈ，４，４゜ ５０ｍ１のイソブチルアルコール中における５、２２．
９ （０，０６モル）のモルホリンと１．８ｇ（０，０
６モル）のｉ＋ラホルムアルデヒドの混合物を窒素下で
透明な溶液が得られるまで還流した。
この溶液に４．８ Ｆ （（１０２モル）の３−カル？
キシー４′−ヒドロキシベンゾフェノン（ｉ６）を添加
し、還流を３時間続けた。その溶液を減圧蒸留し、ゴム
状残留物をエーテルで数回攪拌し、精製されていない９
５９の固体を与えた。
キシー４′−ヒドロキシベンゾフェノン（ｉ６）を添加
し、還流を３時間続けた。その溶液を減圧蒸留し、ゴム
状残留物をエーテルで数回攪拌し、精製されていない９
５９の固体を与えた。
９．５９の１１及び７５ｍ１の無水酢酸の混合物を２４
時間還流し、過剰の無水酢酸を真空下で除去した。残留
物を水で攪拌し、固体を収集し乾燥した；収量８．５ｇ
の薄層クロマトグラフィー（シリカダル；塩化メチ１７
９１％メタノール）は１８の中に存在する約１０係のよ
り速く移動するモノアセトキシメチル誘導体を示す。
時間還流し、過剰の無水酢酸を真空下で除去した。残留
物を水で攪拌し、固体を収集し乾燥した；収量８．５ｇ
の薄層クロマトグラフィー（シリカダル；塩化メチ１７
９１％メタノール）は１８の中に存在する約１０係のよ
り速く移動するモノアセトキシメチル誘導体を示す。
、酢酸中における２ｇの１８．２０ｍ１の塩化メチレン
及び５ｍｌの３１係臭化水素酸の溶液を一昼夜攪拌し、
３ｍｌの無水酢酸を添加し、その溶液を乾燥まで蒸発さ
せた。その残留物を５ｔｉｌｌの方法（Ｗ、Ｃ，５ｔｉ
ｌｌ、 Ｍ、Ｋａｈｎ＆Ａ、Ｍｉｔｒａ、 Ｊ Ｏｒｇ
Ｃｈｅｍ、４３．２９２３ （１９７８））を用いて１
：１ノＣＨ３ＣＯ２Ｃ２Ｈ５／ｃＨ２Ｃｔ２テ溶離すル
シリカクル上でクロマトグラフし、ＮＭＲによって測定
された０５６ｇの精製した１９を力えた。
及び５ｍｌの３１係臭化水素酸の溶液を一昼夜攪拌し、
３ｍｌの無水酢酸を添加し、その溶液を乾燥まで蒸発さ
せた。その残留物を５ｔｉｌｌの方法（Ｗ、Ｃ，５ｔｉ
ｌｌ、 Ｍ、Ｋａｈｎ＆Ａ、Ｍｉｔｒａ、 Ｊ Ｏｒｇ
Ｃｈｅｍ、４３．２９２３ （１９７８））を用いて１
：１ノＣＨ３ＣＯ２Ｃ２Ｈ５／ｃＨ２Ｃｔ２テ溶離すル
シリカクル上でクロマトグラフし、ＮＭＲによって測定
された０５６ｇの精製した１９を力えた。
１５ｍ１の乾燥テトラヒドロフラン中における４ ６０
７！（１，０７ミリモル）の１９，５２１１％’（２，
１４ミリモル〕のｔ−ブチルイミノジアセテート、及び
２１６ｍ９Ｃ２，１４ミリモル）のトリエチルアミンの
溶液をアルゴン下で２日間攪拌した。
７！（１，０７ミリモル）の１９，５２１１％’（２，
１４ミリモル〕のｔ−ブチルイミノジアセテート、及び
２１６ｍ９Ｃ２，１４ミリモル）のトリエチルアミンの
溶液をアルゴン下で２日間攪拌した。
その反応混合物を濾過し、トリエチルアミンヒドロプロ
ミドを除去した。Ｐ液を乾燥まで蒸発させ、９００ηの
２０を与えた。
ミドを除去した。Ｐ液を乾燥まで蒸発させ、９００ηの
２０を与えた。
以下余白
４−アセトキシ−３，５−ビスＣＮ’、Ｎ−ビス（２１
） ２０ｍｌの乾燥テトラヒドロフラン中における９００ｍ
９の２０と０．２６５！９（１−，０７ミリモル）の１
−カルブエトキシ−２−エトキシ−１，２−ジヒドロキ
ノリン（ＥＥＤＱ ）の混合物を３０分間攪拌し、０．
８５ Ｆ （１，，０７ミリモル）のチロキシンのメチ
ルエステルを添加した。その混合物を一昼夜攪拌した。
） ２０ｍｌの乾燥テトラヒドロフラン中における９００ｍ
９の２０と０．２６５！９（１−，０７ミリモル）の１
−カルブエトキシ−２−エトキシ−１，２−ジヒドロキ
ノリン（ＥＥＤＱ ）の混合物を３０分間攪拌し、０．
８５ Ｆ （１，，０７ミリモル）のチロキシンのメチ
ルエステルを添加した。その混合物を一昼夜攪拌した。
その反応混合物を溶剤としてテトラヒドロフランを使用
するダル透過クロマトグラフイーによって精製し、構造
２１に一致したＮＭＲス波ク波層トルした６３０ｍｇの
物質を与えた。
するダル透過クロマトグラフイーによって精製し、構造
２１に一致したＮＭＲス波ク波層トルした６３０ｍｇの
物質を与えた。
ネチル〕ベンゾフェノン（２２）
５ｍｌのトリフルオロ酢酸中における６３０ｍｇの２１
の溶液を一昼夜攪拌し次いで水で稀釈した。
の溶液を一昼夜攪拌し次いで水で稀釈した。
分離された固体を収集し乾燥した；収量５５０ｍｇ。
電界脱着質量スペクトルは２２ （ｍ／ｅ １３０５
）が存在すること、捷タチロキシンのメチルエステルが
酸に加水分解されるある種の物質を示した。
）が存在すること、捷タチロキシンのメチルエステルが
酸に加水分解されるある種の物質を示した。
１当量の２２に加えｆ？：、２当量のＥｕ Ｃｔ３’
６Ｈ２０はＰＨ８，５の硼酸塩緩衝剤に溶解し長波長紫
外線下に試験された時適度に螢光を示した。キレート濃
度に対する螢光強度の直線プロットがこの化合物に対し
て１０−５と１０−’Ｍの間で形成された。すべての螢
光測定をＶａｒｉａｎ Ｓ Ｆ ３３０ス被クトロフル
オリメーターで行なった。
６Ｈ２０はＰＨ８，５の硼酸塩緩衝剤に溶解し長波長紫
外線下に試験された時適度に螢光を示した。キレート濃
度に対する螢光強度の直線プロットがこの化合物に対し
て１０−５と１０−’Ｍの間で形成された。すべての螢
光測定をＶａｒｉａｎ Ｓ Ｆ ３３０ス被クトロフル
オリメーターで行なった。
２２のユーロピウムキレートは放射性標識化チロキシン
及びチロキシン抗体に対して８０係の交叉反応性を有し
た。
及びチロキシン抗体に対して８０係の交叉反応性を有し
た。
例１０〜１６
次のキレート剤とのユーロピウム及びテルビウム錯体を
硼酸塩緩衝剤中のＥ ｕ Ｃｌ−３・６Ｈ２０及びＴｂ
Ｃｌ３・６Ｈ２０を用いて例９のように製造した：０ｌ
−１ （６５） − ｃＱ
Ｑロ ロベ
汽ｎ口 （６６） 例１０〜１６の錯体は螢光を示し、コントロールＡ、Ｂ
及びＣのそれは螢光を示さなかった。コントロールＡ、
Ｂ及びＣの錯体をさらにグリシンアセテート緩衝剤、燐
酸塩緩衝剤及び重炭酸ナトリウム緩衝剤において試験し
、ＥｕＣ４３・６Ｈ２０又はＴｂＣ１，・６Ｈ２０のい
ずれでも螢光を示さなかった。
硼酸塩緩衝剤中のＥ ｕ Ｃｌ−３・６Ｈ２０及びＴｂ
Ｃｌ３・６Ｈ２０を用いて例９のように製造した：０ｌ
−１ （６５） − ｃＱ
Ｑロ ロベ
汽ｎ口 （６６） 例１０〜１６の錯体は螢光を示し、コントロールＡ、Ｂ
及びＣのそれは螢光を示さなかった。コントロールＡ、
Ｂ及びＣの錯体をさらにグリシンアセテート緩衝剤、燐
酸塩緩衝剤及び重炭酸ナトリウム緩衝剤において試験し
、ＥｕＣ４３・６Ｈ２０又はＴｂＣ１，・６Ｈ２０のい
ずれでも螢光を示さなかった。
特許出願人
イーストマンコダック カン、ｆニー
特許出願代理人
弁理士 青 木 朗
弁理士 西舘和之
弁理士 内田幸男
弁理士 山 口 昭 之
（６７）
Claims (1)
- １、 ランタニド金属とキレート剤の螢光キレートであ
って、キレート剤はランタニド金属のそれより大きい三
重項エネルギーを有する三重項増感剤である核及び少な
くとも２つのへテロ原子含有基及び三重項増感剤核の中
にあるか又はに結合している第三のへテロ原子含有基又
はペテロ原子を含み、前記２つのへテロ原子含有基の各
々が三重項増感剤核の別の炭素原子に結合され、それら
のへテロ原子含有基はそれらと前記第三のへテロ原子又
はペテロ原子含有基がランタニド金属とキレート構造を
形成するようにキレート剤の中に位置する螢光キレート
。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US27939881A | 1981-07-01 | 1981-07-01 | |
| US279398 | 1988-12-05 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS588783A true JPS588783A (ja) | 1983-01-18 |
| JPH0614042B2 JPH0614042B2 (ja) | 1994-02-23 |
Family
ID=23068781
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57112653A Expired - Lifetime JPH0614042B2 (ja) | 1981-07-01 | 1982-07-01 | 蛍光標識化特異性結合試薬 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0068875B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0614042B2 (ja) |
| CA (1) | CA1205028A (ja) |
| DE (1) | DE3277869D1 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6054378A (ja) * | 1983-07-29 | 1985-03-28 | フイデイ−ア・ソシエタ・ペル・アチオニ | クマリン誘導体および医薬 |
| US5122041A (en) * | 1989-06-20 | 1992-06-16 | Sanden Corporation | Scroll type fluid displacement apparatus having an axially movable seal plate |
| JP2007231124A (ja) * | 2006-02-28 | 2007-09-13 | Nagoya City Univ | ペプチド又は蛋白質標識用の蛍光色素、及び該蛍光色素を利用した標識方法 |
Families Citing this family (35)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4837169A (en) * | 1981-07-01 | 1989-06-06 | Eastman Kodak Company | Polypyridine Fluorescent labels for immunoassay |
| CA1223831A (en) | 1982-06-23 | 1987-07-07 | Dean Engelhardt | Modified nucleotides, methods of preparing and utilizing and compositions containing the same |
| USRE43096E1 (en) | 1984-01-16 | 2012-01-10 | California Institute Of Technology | Tagged extendable primers and extension products |
| US5821058A (en) * | 1984-01-16 | 1998-10-13 | California Institute Of Technology | Automated DNA sequencing technique |
| CA1258611A (en) * | 1984-01-16 | 1989-08-22 | Lloyd M. Smith | Method of dna sequencing |
| US4672028A (en) * | 1984-05-23 | 1987-06-09 | Icn Micromedic Systems, Inc. | Compositions and method for simultaneous multiple array of analytes using radioisotope chelate labels |
| GB8420521D0 (en) * | 1984-08-13 | 1984-09-19 | Hsc Res Dev Corp | Fluorescent label |
| US5220012A (en) * | 1984-09-26 | 1993-06-15 | Compagnie Oris Industrie Sa | Macropolycyclic rare earth complexes and application as fluorescent tracers |
| FR2570703B1 (fr) * | 1984-09-26 | 1988-07-08 | Commissariat Energie Atomique | Complexes macropolycycliques de terres rares et application a titre de marqueurs fluorescents |
| US5238808A (en) * | 1984-10-31 | 1993-08-24 | Igen, Inc. | Luminescent metal chelate labels and means for detection |
| US4735907A (en) * | 1985-03-18 | 1988-04-05 | Eastman Kodak Company | Stabilized fluorescent rare earth labels and labeled physiologically reactive species |
| US4761481A (en) * | 1985-03-18 | 1988-08-02 | Baxter Travenol Laboratories, Inc. | Substituted pyridine derivatives |
| US5830769A (en) * | 1985-03-18 | 1998-11-03 | Wieder; Irwin | Homogeneous fluorassay methods employing fluorescent background rejection and water-soluble rare earth metal chelates |
| SE8502573D0 (sv) * | 1985-05-23 | 1985-05-23 | Jouko Kanakre | Fluorescent lanthanide chelates useful as labels of physiologically active materials |
| US5155216A (en) * | 1985-08-15 | 1992-10-13 | Amoco Corporation | Nucleic acids labeled with a chemiluminescent acridine ester |
| JP2509574B2 (ja) * | 1985-08-15 | 1996-06-19 | アモコ・コーポレーション | 標識付けした核酸 |
| EP0272320B1 (en) | 1986-06-17 | 1994-03-23 | Baxter Diagnostics Inc. | Homogeneous fluoroassay methods employing fluorescent background rejection |
| US4925804A (en) * | 1986-06-17 | 1990-05-15 | Baxter International Inc. | Interligand metal transfer assay |
| US5032677A (en) * | 1987-11-06 | 1991-07-16 | Baxter International Inc. | Fluorescent poly(arylpyridine) rare earth chelates |
| US5162508A (en) * | 1987-12-18 | 1992-11-10 | Compagnie Oris Industrie | Rare earth cryptates, processes for their preparation, synthesis intermediates and application as fluorescent tracers |
| SE8800613D0 (sv) * | 1988-02-23 | 1988-02-23 | Wallac Oy | A novel spectrofluorometric method and compounds that are of value for the method |
| SE461117B (sv) * | 1988-03-21 | 1990-01-08 | Jouko J Kankare | Foerfarande foer bestaemning av koncentrationen av en luminiscerande lantanid foerening |
| US4962045A (en) * | 1988-05-02 | 1990-10-09 | The Perkin-Elmer Corporation | Time-resolved fluorimetric detection of lanthanide labeled nucleotides |
| SE8801702D0 (sv) * | 1988-05-05 | 1988-05-05 | Pharmacia Ab | Sett vid bestemning av enzymatisk aktivitet |
| SE8802575D0 (sv) * | 1988-07-08 | 1988-07-08 | Wallac Oy | Terpyridine derivatives |
| US5202423A (en) * | 1988-07-08 | 1993-04-13 | Wallac Oy | Terpyridine derivatives |
| US5696239A (en) * | 1988-10-31 | 1997-12-09 | The Dow Chemical Company | Conjugates possessing ortho ligating functionality and complexes thereof |
| US5342604A (en) * | 1988-10-31 | 1994-08-30 | The Dow Chemical Company | Complexes possessing ortho ligating functionality |
| PH31170A (en) * | 1988-10-31 | 1998-03-20 | Dow Chemical Co | Chelants possesing ortho ligating functionality and complexes thereof. |
| GB8927503D0 (en) * | 1989-12-04 | 1990-02-07 | Kronem Systems Inc | Enzyme-amplified lanthanide chelate luminescence |
| EP0434262B1 (en) * | 1989-12-07 | 1995-05-03 | Wako Pure Chemical Industries Ltd | Phenol derivative and its use in colorimetric analysis of metal ions |
| WO2015152111A1 (ja) * | 2014-03-31 | 2015-10-08 | 国立大学法人 長崎大学 | 非ｒｉ系における細胞障害能迅速測定法 |
| CN107915701B (zh) * | 2016-10-10 | 2020-09-29 | 沈阳药科大学 | 一种PPARα/γ双重激动剂及其应用 |
| CN111116581B (zh) * | 2019-12-10 | 2021-06-08 | 清华大学 | 2,9-二酰胺-1,10-邻菲罗啉类化合物、及其合成方法和应用 |
| PL442489A1 (pl) * | 2022-10-10 | 2024-04-15 | Politechnika Śląska | Sposób otrzymywania pochodnych 1,3,4-oksadiazolu |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5210796A (en) * | 1975-06-30 | 1977-01-27 | Analytical Radiation Corp | Keikobunseki hoho oyobi sochi |
| JPS5331836A (en) * | 1976-09-03 | 1978-03-25 | Pirelli | Apparatus for bundling plurality of fine filaments |
| JPS54101439A (en) * | 1977-12-28 | 1979-08-10 | Eastman Kodak Co | Fluorescent label |
| JPS5659741A (en) * | 1979-09-10 | 1981-05-23 | Analytical Radiation Corp | Seed bonding diamine triacetic acid and its chelate |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CH393356A (de) * | 1958-08-08 | 1965-06-15 | Ciba Geigy | Verfahren zur Herstellung neuer Eisen-Komplexsalze |
| DE1187132B (de) * | 1963-08-24 | 1965-02-11 | Agfa Ag | Photographisches Material |
| US3398099A (en) * | 1964-12-28 | 1968-08-20 | American Optical Corp | Fluorescent europium chelates |
| US3484380A (en) * | 1965-12-15 | 1969-12-16 | American Optical Corp | Fluorescent europium chelates with tetradentate ligands |
-
1982
- 1982-06-11 CA CA000405050A patent/CA1205028A/en not_active Expired
- 1982-06-28 EP EP82303380A patent/EP0068875B1/en not_active Expired
- 1982-06-28 DE DE8282303380T patent/DE3277869D1/de not_active Expired
- 1982-07-01 JP JP57112653A patent/JPH0614042B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5210796A (en) * | 1975-06-30 | 1977-01-27 | Analytical Radiation Corp | Keikobunseki hoho oyobi sochi |
| JPS5331836A (en) * | 1976-09-03 | 1978-03-25 | Pirelli | Apparatus for bundling plurality of fine filaments |
| JPS54101439A (en) * | 1977-12-28 | 1979-08-10 | Eastman Kodak Co | Fluorescent label |
| JPS5659741A (en) * | 1979-09-10 | 1981-05-23 | Analytical Radiation Corp | Seed bonding diamine triacetic acid and its chelate |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6054378A (ja) * | 1983-07-29 | 1985-03-28 | フイデイ−ア・ソシエタ・ペル・アチオニ | クマリン誘導体および医薬 |
| JPH0475911B2 (ja) * | 1983-07-29 | 1992-12-02 | Fidia Spa | |
| US5122041A (en) * | 1989-06-20 | 1992-06-16 | Sanden Corporation | Scroll type fluid displacement apparatus having an axially movable seal plate |
| JP2007231124A (ja) * | 2006-02-28 | 2007-09-13 | Nagoya City Univ | ペプチド又は蛋白質標識用の蛍光色素、及び該蛍光色素を利用した標識方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0068875B1 (en) | 1987-12-23 |
| DE3277869D1 (en) | 1988-02-04 |
| CA1205028A (en) | 1986-05-27 |
| EP0068875A2 (en) | 1983-01-05 |
| JPH0614042B2 (ja) | 1994-02-23 |
| EP0068875A3 (en) | 1983-05-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4670572A (en) | Phenolic fluorescent labels | |
| JPS588783A (ja) | 蛍光標識化特異性結合試薬 | |
| US4637988A (en) | Fluorescent labels for immunoassay | |
| US4801722A (en) | Coumarin chelates | |
| US4794191A (en) | Fluorescent chelates | |
| CA1292710C (en) | Fluorescent labels | |
| EP0203047B1 (en) | Fluorescent lanthanide chelates | |
| JP2623452B2 (ja) | 蛍光アッセイ方法 | |
| US4859777A (en) | Terpyridine chelating agents | |
| Grynkiewicz et al. | A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. | |
| US4927923A (en) | Macropolycyclic rare earth complexes and application as fluorescent tracers | |
| US5216134A (en) | Spectrofluorometric method and compounds that are of value for the method | |
| Lee et al. | Coumestrol, NBD-norhexestrol, and dansyl-norhexestrol, fluorescent probes of estrogen-binding proteins | |
| US5457186A (en) | Luminescent lanthanide chelates with decreased non-radiative energy loss | |
| JPH0665271A (ja) | 発光性金属キレート標識及び検出手段 | |
| JPS63112564A (ja) | 化学発光性アクリジニウム塩 | |
| CN106232771B (zh) | 镧系螯合物的新发色团结构 | |
| CA2478110A1 (en) | Novel fluorescent label compounds | |
| US5432101A (en) | Macropolycyclic rare earth complexes and application as fluorescent tracers | |
| JPH0853467A (ja) | ボロン酸基を有する発蛍光性化合物 | |
| CN111675674A (zh) | 一种aie分子及其合成方法 | |
| CN111056985A (zh) | 一种部花菁类衍生物荧光探针及其制备方法和应用 | |
| JP2006503902A (ja) | 金属キレートおよび、時間分解蛍光測定におけるその使用方法 | |
| JP3538277B2 (ja) | 免疫測定用標識試薬及びそれに用いる蛍光性化合物及び錯体、及びそれらを用いる生物物質の免疫測定法 | |
| Yuan et al. | Synthesis and luminescence properties of lanthanide (III) chelates with polyacid derivatives of thienyl-substituted terpyridine analogues |