JP2623452B2 - 蛍光アッセイ方法 - Google Patents
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- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
- G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
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Description
【０００１】本発明の背景 本発明の分野 本発明は化学および生物学の分野に属し、そしてそこで
使用するための螢光アッセイ方法を提供する。さらに詳
しくは、本発明は一群のアリール置換ピリジン化合物
と、螢光アッセイ技術のための螢光キレート標識の成分
として、または該成分の中間体としてのそれらの使用に
関する。
使用するための螢光アッセイ方法を提供する。さらに詳
しくは、本発明は一群のアリール置換ピリジン化合物
と、螢光アッセイ技術のための螢光キレート標識の成分
として、または該成分の中間体としてのそれらの使用に
関する。
【０００２】背 景 螢光アッセイ技術は、化学的、生化学的および医学的分
析に増加しつつある用途を見出しつつある。螢光測定方
法は生来的に極めて感受性である。しかしながら螢光ア
ッセイの感度は実際にはバックグラウンド螢光の存在に
よって制限される。
析に増加しつつある用途を見出しつつある。螢光測定方
法は生来的に極めて感受性である。しかしながら螢光ア
ッセイの感度は実際にはバックグラウンド螢光の存在に
よって制限される。
【０００３】それぞれ１９７９年４月１７日および１９
７７年１１月１５日に発行された米国特許第4,150,295
号および第 4,058,732号、それに Immunofluores- cenc
e and Related Staining Techniques, Knapp, et al 編
（1978, Elsevier／North Holland Bio- medical Pres
s ）68−80頁に見られる章は、バックグラウンド螢光は
比較的短い寿命を有すること、および測定される螢光ス
ペシスとして長い寿命の螢光を有利に採用することがで
きたとの一般的着想を開示する。この報告は、間歇的励
起源と螢光の時間に連結した測定の使用により、所望の
螢光を測定しながらバックグラウンド螢光を実質上回避
もしくは排斥できることを指摘する。
７７年１１月１５日に発行された米国特許第4,150,295
号および第 4,058,732号、それに Immunofluores- cenc
e and Related Staining Techniques, Knapp, et al 編
（1978, Elsevier／North Holland Bio- medical Pres
s ）68−80頁に見られる章は、バックグラウンド螢光は
比較的短い寿命を有すること、および測定される螢光ス
ペシスとして長い寿命の螢光を有利に採用することがで
きたとの一般的着想を開示する。この報告は、間歇的励
起源と螢光の時間に連結した測定の使用により、所望の
螢光を測定しながらバックグラウンド螢光を実質上回避
もしくは排斥できることを指摘する。
【０００４】希土類キレートはこの先行技術により長い
寿命の螢光を有する物質として同定されている。そのよ
うな物質は、多数の代表的開示が指摘するように、アミ
ンポリ酸（WiederおよびWollenbergのUSP 4,352,751 を
見よ）、イミノジアセテート置換フェノール類、クマリ
ン類およびフェナントロリン類を含むヘテロ原子含有基
（イーストマンコダックヨーロッパ特許出願 0068875を
見よ）、および芳香族ジケトン類（西独公開特許 2,62
8,158を見よ）のような一種またはそれ以上のリガンド
によってキレートされたテルビウムまたはユーロピウム
のような希土類金属イオンを含んでいる。
寿命の螢光を有する物質として同定されている。そのよ
うな物質は、多数の代表的開示が指摘するように、アミ
ンポリ酸（WiederおよびWollenbergのUSP 4,352,751 を
見よ）、イミノジアセテート置換フェノール類、クマリ
ン類およびフェナントロリン類を含むヘテロ原子含有基
（イーストマンコダックヨーロッパ特許出願 0068875を
見よ）、および芳香族ジケトン類（西独公開特許 2,62
8,158を見よ）のような一種またはそれ以上のリガンド
によってキレートされたテルビウムまたはユーロピウム
のような希土類金属イオンを含んでいる。
【０００５】先行技術をキレート化基において以下の性
質が望ましいことを認めている。
質が望ましいことを認めている。
【０００６】１． それは希土類と安定なキレート錯
塩、すなわち安定性定数（log K ）１７以上を形成しな
ければならない。
塩、すなわち安定性定数（log K ）１７以上を形成しな
ければならない。
【０００７】２． 希土類との螢光キレートは長い寿命
の螢光、すなわちバックグラウンド妨害が既に崩壊した
時認知できるほど崩壊しない螢光を持たなければならな
い。
の螢光、すなわちバックグラウンド妨害が既に崩壊した
時認知できるほど崩壊しない螢光を持たなければならな
い。
【０００８】３． 螢光励起は、生物学的サンプル中で
は約２７０nmの波長において普通に発生する妨害を避け
るため、できるだけ長い波長，好ましくは３００nmまた
はそれ以上で発生しなければならない。
は約２７０nmの波長において普通に発生する妨害を避け
るため、できるだけ長い波長，好ましくは３００nmまた
はそれ以上で発生しなければならない。
【０００９】４． 螢光錯塩は強い放出を持たなければ
ならないこと、すなわちそれは高い量子収率を持たなけ
ればならない。
ならないこと、すなわちそれは高い量子収率を持たなけ
ればならない。
【００１０】加えて、該物質は、該物質と共に使用され
るサンプル（通常水性サンプル）の性状と共存し得る溶
解度、化学的安定性および他の性質を持たなければなら
ない。
るサンプル（通常水性サンプル）の性状と共存し得る溶
解度、化学的安定性および他の性質を持たなければなら
ない。
【００１１】先行技術においてこのような認識にもかか
わらず、これまで記載された物質は一般にこれら性質の
一またはそれ以上を少なくともある程度欠いていた。例
えば、ヨーロッパ特許 0066875は、芳香族ジケトン類
（西独公開特許 2,628,158）のような試薬の螢光は水中
安定性問題のため水中で消失するが、フェノール性芳香
族ケトン類、クマリン類およびフェナントロリン類（こ
れらはヨーロッパ特許 0068875が特定的に開示する）は
化学的安定性を欠くことと、そして低量子収率を示した
ことを指摘している。これらの欠点の結果、これまで何
人も螢光アッセイに広く使用し得る試薬を製造していな
い。
わらず、これまで記載された物質は一般にこれら性質の
一またはそれ以上を少なくともある程度欠いていた。例
えば、ヨーロッパ特許 0066875は、芳香族ジケトン類
（西独公開特許 2,628,158）のような試薬の螢光は水中
安定性問題のため水中で消失するが、フェノール性芳香
族ケトン類、クマリン類およびフェナントロリン類（こ
れらはヨーロッパ特許 0068875が特定的に開示する）は
化学的安定性を欠くことと、そして低量子収率を示した
ことを指摘している。これらの欠点の結果、これまで何
人も螢光アッセイに広く使用し得る試薬を製造していな
い。
【００１２】必要とされるのは、これら性質をより満足
させる螢光キレートシステムである。
させる螢光キレートシステムである。
【００１３】本発明は、希土類金属との長寿命螢光スペ
シス中へ組み込むことができる置換ピリジン誘導体のフ
ァミリーとその中間体とに関する。置換ピリジン誘導体
の一般的クラスに対する参考は、米国特許 4,008,239,
3,970,662 および 3,907,808, Carbeteas およびWillia
ms, J. Heterocycl. Chem., 11(5) , 819（1974）；We
ller および Luellen, Tetrahedron Letters, Vol. 22,
No. 44, pp 4381−84（1981）； Weller, Luellenお
よびWeller, J. Org. Chem., 47, 4803-06（1982）を含
む。前出のヨーロッパ特許出願 0068875も関係がある。
シス中へ組み込むことができる置換ピリジン誘導体のフ
ァミリーとその中間体とに関する。置換ピリジン誘導体
の一般的クラスに対する参考は、米国特許 4,008,239,
3,970,662 および 3,907,808, Carbeteas およびWillia
ms, J. Heterocycl. Chem., 11(5) , 819（1974）；We
ller および Luellen, Tetrahedron Letters, Vol. 22,
No. 44, pp 4381−84（1981）； Weller, Luellenお
よびWeller, J. Org. Chem., 47, 4803-06（1982）を含
む。前出のヨーロッパ特許出願 0068875も関係がある。
【００１４】本発明の説明 われわれは、置換アリール基でリング置換された 2,6−
ビス〔 N,N−ジ（カルボキシアルキル）アミノアルキ
ル〕ピリジンが螢光キレート形成におけるリガンドとし
て使用するために特に魅力的な部分であることを発見し
た。
ビス〔 N,N−ジ（カルボキシアルキル）アミノアルキ
ル〕ピリジンが螢光キレート形成におけるリガンドとし
て使用するために特に魅力的な部分であることを発見し
た。
【００１５】従って、一面において本発明は、置換アリ
ール置換 2,6−ビス〔 N,N−ジ（カルボキシアルキル）
アミノアルキル〕ピリジン部分を組み込んだために螢光
的に検出可能な化合物を提供する。
ール置換 2,6−ビス〔 N,N−ジ（カルボキシアルキル）
アミノアルキル〕ピリジン部分を組み込んだために螢光
的に検出可能な化合物を提供する。
【００１６】もっと特定の面において、本発明は下記式
を有する置換アリール置換 2,6−ビス〔 N,N−ビス（カ
ルボキシアルキル）アミノアルキル〕ピリジン部分を組
み込んだために螢光的に検出可能な化合物を提供する。
を有する置換アリール置換 2,6−ビス〔 N,N−ビス（カ
ルボキシアルキル）アミノアルキル〕ピリジン部分を組
み込んだために螢光的に検出可能な化合物を提供する。
【００１７】
【化２】
【００１８】式中、n および n’は独立に整数１または
２，Arはアリール， n”はAr上の提供可能な結合部位の
数に等しい整数，M は水素もしくは金属イオン、そして
(R)n”，R'および R”はめいめい独立に水素か、低級ア
ルコキシ、低級アルキル、アミノ、ジアルキルアミノ、
アリールおよびアリールオキシを含む電子供与基か、ま
たは分子の残部へ結合手を提供することができる共有結
合およびブリッジ基を含む連結基から選ばれ、ただし
(R)n”の少なくとも１個は電子供与基であり、そして
R', R”および(R)n”の少なくとも一つは分子の残部へ
の連結基である。
２，Arはアリール， n”はAr上の提供可能な結合部位の
数に等しい整数，M は水素もしくは金属イオン、そして
(R)n”，R'および R”はめいめい独立に水素か、低級ア
ルコキシ、低級アルキル、アミノ、ジアルキルアミノ、
アリールおよびアリールオキシを含む電子供与基か、ま
たは分子の残部へ結合手を提供することができる共有結
合およびブリッジ基を含む連結基から選ばれ、ただし
(R)n”の少なくとも１個は電子供与基であり、そして
R', R”および(R)n”の少なくとも一つは分子の残部へ
の連結基である。
【００１９】前記分子の残部は、生物学的活性物質、す
なわちバイオ特異性アッセイを実施することを許容する
ためバイオ特異性（例えば免疫学的）ペアの半分を含む
ことができる。
なわちバイオ特異性アッセイを実施することを許容する
ためバイオ特異性（例えば免疫学的）ペアの半分を含む
ことができる。
【００２０】本発明はテトラ酸（すなわちＭ＝水素）の
上記部分を組み込んだ化合物を提供する。本発明はまた
４個のＭが螢光希土類キレートを形成するような希土類
金属イオンを含む１個またはそれ以上の金属イオンを含
む金属塩、特に金属錯塩である化合物を提供する。
上記部分を組み込んだ化合物を提供する。本発明はまた
４個のＭが螢光希土類キレートを形成するような希土類
金属イオンを含む１個またはそれ以上の金属イオンを含
む金属塩、特に金属錯塩である化合物を提供する。
【００２１】本発明はさらに、中間体として、上記テト
ラ酸に対応するエステル類、およびジ酸として、そして
その金属塩、モノおよびジエステルとして前駆体アリー
ル置換 2,6−ジカルボキシピリジン誘導体を提供する。
ラ酸に対応するエステル類、およびジ酸として、そして
その金属塩、モノおよびジエステルとして前駆体アリー
ル置換 2,6−ジカルボキシピリジン誘導体を提供する。
【００２２】さらに他の面において、本発明は上記置換
ピリジン部分に対抗して、アリール置換ピリジンテトラ
酸化合物を提供する。これら化合物は式：
ピリジン部分に対抗して、アリール置換ピリジンテトラ
酸化合物を提供する。これら化合物は式：
【００２３】
【化３】
【００２４】を有し、そして希土類と長寿命螢光キレー
トを形成するそれらの塩、および前記テトラ酸へのテト
ラエステル前駆体を含んでいる。前記式において、n お
よびn'は１または２から選ばれた整数であり、R, R' お
よび R”は水素か、低級アルコキシ、低級アルキル、ア
ミノ、アルキルアミノ、アリール、アリールオキシ等の
ような電子供与基から選ばれた同一もしくは異なる基で
あり、Arはアリール基，特にフェニルもしくはナフチル
基であり、 n”はAr基上の提供可能な共有結合部位の数
に相当する整数である。これらテトラ酸化合物は希土類
金属、好ましくはユーロピウムおよびテルビウムとキレ
ートを形成する。
トを形成するそれらの塩、および前記テトラ酸へのテト
ラエステル前駆体を含んでいる。前記式において、n お
よびn'は１または２から選ばれた整数であり、R, R' お
よび R”は水素か、低級アルコキシ、低級アルキル、ア
ミノ、アルキルアミノ、アリール、アリールオキシ等の
ような電子供与基から選ばれた同一もしくは異なる基で
あり、Arはアリール基，特にフェニルもしくはナフチル
基であり、 n”はAr基上の提供可能な共有結合部位の数
に相当する整数である。これらテトラ酸化合物は希土類
金属、好ましくはユーロピウムおよびテルビウムとキレ
ートを形成する。
【００２５】本発明の物質は、バックグラウンド妨害を
避けるように２８０nmまたはそれ以上である励起波長を
持ち、３１０nmないし３２５nmまたはそれ以上の励起波
長が可能である利益を提供する。これら波長へのシフト
を達成した以前の物質は、芳香環がピリジン環へ縮合し
た構造を採用していた。これら縮合環物質と比較する
時、本発明部分は実質的に改善された量子効率を有す
る。加えて、本発明の物質は化学的に安定であり、水溶
性で、そして高度に安定な金属錯塩を形成する。
避けるように２８０nmまたはそれ以上である励起波長を
持ち、３１０nmないし３２５nmまたはそれ以上の励起波
長が可能である利益を提供する。これら波長へのシフト
を達成した以前の物質は、芳香環がピリジン環へ縮合し
た構造を採用していた。これら縮合環物質と比較する
時、本発明部分は実質的に改善された量子効率を有す
る。加えて、本発明の物質は化学的に安定であり、水溶
性で、そして高度に安定な金属錯塩を形成する。
【００２６】さらに他の面において、本発明は、高い量
子効率を持続する螢光希土類キレートの励起波長を増す
ための改良方法と、そしてキレート化リガンドとしてこ
の芳香環置換ピリジンの使用を含んでいる螢光アッセイ
の改良された方法を提供する。
子効率を持続する螢光希土類キレートの励起波長を増す
ための改良方法と、そしてキレート化リガンドとしてこ
の芳香環置換ピリジンの使用を含んでいる螢光アッセイ
の改良された方法を提供する。
【００２７】本発明の詳細な説明 置換ピリジン部分 本発明による置換ピリジン部分は、分子を螢光的に検出
可能なアリール置換 2,6−ビス〔 N,N−ジ（カルボキシ
アルキル）アミノアルキル〕ピリジン類とするように、
分子中へ組み込まれる。該アリール置換分はそれ自体少
なくとも１個の電子供与基で置換される。これら物質は
下記一般式Ｉで表すことができる。
可能なアリール置換 2,6−ビス〔 N,N−ジ（カルボキシ
アルキル）アミノアルキル〕ピリジン類とするように、
分子中へ組み込まれる。該アリール置換分はそれ自体少
なくとも１個の電子供与基で置換される。これら物質は
下記一般式Ｉで表すことができる。
【００２８】
【化４】
【００２９】この式において、n および n’は整数１ま
たは２，そして好ましくは同じ整数であり、そしてさら
に好ましくは１である。ピリジン環は置換分R', R”お
よび−Ar−(R)n”を有する。R'および R”置換分は水素
か、または電子供与基、例えば炭素数１ないし４のアル
コキシ，特にメトキシもしくはエトキシである低級アル
コキシ；メチル、エチル、ｎおよびイソプロピル等のよ
うな炭素数１ないし４の低級アルキル基；アミノ；アル
キルすなわちモノおよびジ、そして特にジアルキルアミ
ノ、例えばジメチルアミノのようなアルキルが炭素数１
ないし４であるジアルキルアミノ；フェニルもしくはベ
ンジル等のような炭素数６のアリールおよび約９までの
炭素数のアラルキル（ただしそのようなアリールはピリ
ジン環から垂れ下がっており縮合していないことを条件
とする）；フェニルオキシもしくはベンジルオキシ構造
のようなアリールオキシもしくは約９までの炭素数のア
ラルキルオキシであり、または後記のように分子の残部
への結合手を提供し得る共有結合およびブリッジ基を含
む連結基とすることができる。
たは２，そして好ましくは同じ整数であり、そしてさら
に好ましくは１である。ピリジン環は置換分R', R”お
よび−Ar−(R)n”を有する。R'および R”置換分は水素
か、または電子供与基、例えば炭素数１ないし４のアル
コキシ，特にメトキシもしくはエトキシである低級アル
コキシ；メチル、エチル、ｎおよびイソプロピル等のよ
うな炭素数１ないし４の低級アルキル基；アミノ；アル
キルすなわちモノおよびジ、そして特にジアルキルアミ
ノ、例えばジメチルアミノのようなアルキルが炭素数１
ないし４であるジアルキルアミノ；フェニルもしくはベ
ンジル等のような炭素数６のアリールおよび約９までの
炭素数のアラルキル（ただしそのようなアリールはピリ
ジン環から垂れ下がっており縮合していないことを条件
とする）；フェニルオキシもしくはベンジルオキシ構造
のようなアリールオキシもしくは約９までの炭素数のア
ラルキルオキシであり、または後記のように分子の残部
への結合手を提供し得る共有結合およびブリッジ基を含
む連結基とすることができる。
【００３０】ピリジン環上のAr−(R)n”置換分は、 n”
個のR 置換分を含むアリールそのものである。該アリー
ルはフェニルもしくはナフチル環のどちらかである。数
n”はAr置換分上に提供可能な共有結合部位の数に相当
する整数、すなわちフェニルの場合は５またはナフチル
の場合は７である。Ar基上のR 置換分は R' および R”
置換分と同じ基から選ぶことができる。
個のR 置換分を含むアリールそのものである。該アリー
ルはフェニルもしくはナフチル環のどちらかである。数
n”はAr置換分上に提供可能な共有結合部位の数に相当
する整数、すなわちフェニルの場合は５またはナフチル
の場合は７である。Ar基上のR 置換分は R' および R”
置換分と同じ基から選ぶことができる。
【００３１】このように、Ar−(R)n”置換分は構造上一
般式IIａおよびIIｂによって表すことができる。
般式IIａおよびIIｂによって表すことができる。
【００３２】
【化５】
【００３３】式中、
【００３４】
【化６】
【００３５】はAr単位がフェニルかまたはナフチルかに
応じてピリジン環への共有結合である。
応じてピリジン環への共有結合である。
【００３６】好ましくは、アリール置換ピリジン類は、
一般式Ｉとそして式IIａまたはｂを含む組合せ構造によ
ってさらに詳細に表すことができる。これは一般式III
を与える。
一般式Ｉとそして式IIａまたはｂを含む組合せ構造によ
ってさらに詳細に表すことができる。これは一般式III
を与える。
【００３７】
【化７】
【００３８】式中、 R', R”, R, M, n およびn'は前に
定義したとおりである。われわれは前出の物質のどれも
が本発明に従って実施可能であると信ずるが、われわれ
の最大の経験はピリジン窒素に対して４位、すなわちパ
ラ位に結合したAr−(R)n”を有する物質についてであ
り、それを基礎にしてこの関係が好ましい。また、連結
基がR'または R”ではなくてR の一つであり、R'および
R”の一方または両方が水素であり、そして特にR の１
個ないし３個が低級アルコキシであり、R の残りが水素
である物質が好ましい。
定義したとおりである。われわれは前出の物質のどれも
が本発明に従って実施可能であると信ずるが、われわれ
の最大の経験はピリジン窒素に対して４位、すなわちパ
ラ位に結合したAr−(R)n”を有する物質についてであ
り、それを基礎にしてこの関係が好ましい。また、連結
基がR'または R”ではなくてR の一つであり、R'および
R”の一方または両方が水素であり、そして特にR の１
個ないし３個が低級アルコキシであり、R の残りが水素
である物質が好ましい。
【００３９】このアリール置換ピリジン部分は他の基へ
連結することができる。この連結はR', R”またはR の
一つ、特にR の１個を構成する共有結合により、または
他の連結基によって達成することができる。この連結は
螢光ピリジン部分が生物学的に活性なバイオ特異性基を
標識することを許容する。
連結することができる。この連結はR', R”またはR の
一つ、特にR の１個を構成する共有結合により、または
他の連結基によって達成することができる。この連結は
螢光ピリジン部分が生物学的に活性なバイオ特異性基を
標識することを許容する。
【００４０】この連結が連結基によって達成されるとき
は、このR 基はアミン、ヒドロキシル、カルボキシル、
エステル等のようなバイオ特異性基のカップリングを容
易にする活性または結合し得る部位を表さなければなら
ない。そのような結合し得るR 基の例は、アミノ基（−
NH2)、− CH2-CH2-NH2もしくは
は、このR 基はアミン、ヒドロキシル、カルボキシル、
エステル等のようなバイオ特異性基のカップリングを容
易にする活性または結合し得る部位を表さなければなら
ない。そのような結合し得るR 基の例は、アミノ基（−
NH2)、− CH2-CH2-NH2もしくは
【００４１】
【化８】
【００４２】のような、１級および２級アミン末端アル
キル、
キル、
【００４３】
【化９】
【００４４】それらの異性体等のような１級および２級
アミン末端アリールおよびアリールオキシ、-CH2-CH2-O
H,
アミン末端アリールおよびアリールオキシ、-CH2-CH2-O
H,
【００４５】
【化１０】
【００４６】等のようなヒドロキシル含有アルキル, お
よび
よび
【００４７】
【化１１】
【００４８】および
【００４９】
【化１２】
【００５０】のようなヒドロキシル含有アリールおよび
アリールオキシである。
アリールオキシである。
【００５１】バイオ特異性基への結合手を形成するため
の他の適当な官能基は、アミド、アミジン、チオアミ
ド、尿素、チオ尿素、グアニジン、ジアゾ、チオエーテ
ル、カルボキシおよびリン酸エステル、チオエステルお
よび既に知られているような他の共有結合鎖を含んでい
る。好ましい連結基は単なるアミノ基である。該連結基
は生物学的に活性な基へ直接連結することができ、また
は基−CO(CH2)4−，−CS−，−CO(CH2)8NHCOCH2ON ＝,
−COCH2ON ＝，−CO(CH2)5NHCO(CH2)6CO−，−CO(CH2)2
SS(CH2)2CO-,−CSNH(CH2)3N(CH2CH2)2N(CH2)3NHCO(CH2)
6CO −，−CSNH(CH2)3N(CH2CH2)2N(CH2)3NHCO(CHOH)2CO
−，−CSNH(CH2)3N(CH2CH2)3NHCOCH2ON ＝等のような二
官能性スペーサー試薬を介して連結することができる。
そのような連結基は代表であり、螢光ピリジンとバイオ
特異性基との間の相互作用を変化させそして影響させる
ことができる。
の他の適当な官能基は、アミド、アミジン、チオアミ
ド、尿素、チオ尿素、グアニジン、ジアゾ、チオエーテ
ル、カルボキシおよびリン酸エステル、チオエステルお
よび既に知られているような他の共有結合鎖を含んでい
る。好ましい連結基は単なるアミノ基である。該連結基
は生物学的に活性な基へ直接連結することができ、また
は基−CO(CH2)4−，−CS−，−CO(CH2)8NHCOCH2ON ＝,
−COCH2ON ＝，−CO(CH2)5NHCO(CH2)6CO−，−CO(CH2)2
SS(CH2)2CO-,−CSNH(CH2)3N(CH2CH2)2N(CH2)3NHCO(CH2)
6CO −，−CSNH(CH2)3N(CH2CH2)2N(CH2)3NHCO(CHOH)2CO
−，−CSNH(CH2)3N(CH2CH2)3NHCOCH2ON ＝等のような二
官能性スペーサー試薬を介して連結することができる。
そのような連結基は代表であり、螢光ピリジンとバイオ
特異性基との間の相互作用を変化させそして影響させる
ことができる。
【００５２】バイオ特異性基 上で認めたように、多数の有益な用途において、生物学
的に活性な、すなわちバイオ特異性基が前記置換ピリジ
ンへ連結される。“バイオ特異性基”および“生物学的
に活性な基”なる用語は、他の分子スペシスと“特異的
に認識する”または“特異的に反応する”または“特異
的に相互反応する”すべての分子構造を含む広義に使用
される。そのような基は、抗体およびそれらのそれぞれ
の抗原もしくはハプテンのような免疫学的に特異性基、
ホルモンおよびその受容体、ビオチンとアビジンのペア
のような結合ペアその他を含む。それらはまたそれらの
相補配列によって特異的にハイブリッド化される核酸配
列を含むことができる。
的に活性な、すなわちバイオ特異性基が前記置換ピリジ
ンへ連結される。“バイオ特異性基”および“生物学的
に活性な基”なる用語は、他の分子スペシスと“特異的
に認識する”または“特異的に反応する”または“特異
的に相互反応する”すべての分子構造を含む広義に使用
される。そのような基は、抗体およびそれらのそれぞれ
の抗原もしくはハプテンのような免疫学的に特異性基、
ホルモンおよびその受容体、ビオチンとアビジンのペア
のような結合ペアその他を含む。それらはまたそれらの
相補配列によって特異的にハイブリッド化される核酸配
列を含むことができる。
【００５３】バイオ特異性基は標的分子を結合もしくは
ほかに複合するように選定されることができ、またはバ
イオ特異性反応において標的と競合するように標的分子
を模倣もしくは含有するように選定されることができ
る。
ほかに複合するように選定されることができ、またはバ
イオ特異性反応において標的と競合するように標的分子
を模倣もしくは含有するように選定されることができ
る。
【００５４】前に記載したように、生物学的に活性な物
質 (ＭB ) は式のR'または R”に位置することができる
が、しかし好ましくは下記式の螢光標識したバイオ特異
性試薬を与えるように、R の一つとして連結される。
質 (ＭB ) は式のR'または R”に位置することができる
が、しかし好ましくは下記式の螢光標識したバイオ特異
性試薬を与えるように、R の一つとして連結される。
【００５５】
【化１３】
【００５６】式中、ＭB , M, n, n', n”は前記のとお
りであり、R, R' および R”は各自独立に水素と、そし
て電子供与基から選ばれる。
りであり、R, R' および R”は各自独立に水素と、そし
て電子供与基から選ばれる。
【００５７】同様に、好ましい螢光標識したバイオ特異
性試薬は以下の式を持つことができる。
性試薬は以下の式を持つことができる。
【００５８】
【化１４】
【００５９】式中、M は金属イオンまたは水素、 n＊は
１ないし４の整数、Alk は炭素数１ないし４のアルキ
ル、ＭB は生物学的に活性な物質である。
１ないし４の整数、Alk は炭素数１ないし４のアルキ
ル、ＭB は生物学的に活性な物質である。
【００６０】標的分子 バイオ特異性基が存在する時、その標的分子もしくは検
体はモノエピトープ性もしくはポリエピトープ性物質で
よい。それは薬物、代謝物、天然物、殺虫剤、空気およ
び水の汚染物質のような物質から限定なしに選ぶことが
できる。例示目的のため、ジゴキシン、ジギトキシン、
フェニトイン、テオフィリン、ゲンタマイシンおよびト
ブラマイシンを含む薬剤；モルフィン、ヘロイン、コカ
イン、麦角アルカロイド等のようなアルカロイド；エス
トローゲンおよびアンドローゲン例えばエストリオー
ル、および抗炎症ステロイド例えばコルチゾールを含む
ステロイドホルモン；フェノバルビタールを含むバルビ
ツレートのようなラクタム；アンフェタミンのようなア
ミノアルキルベンゼン；ビタミン、Ｆ2 アルファおよび
Ｅのようなプロスタグランジン、抗生物質その他、チロ
キシン，トリヨードチロキシンおよびオキシトシンのよ
うな短鎖ペプチド配列またはアミノ酸を挙げることがで
きる。代表的な汚染物質および殺虫剤は、ＰＣＢ、ダイ
オキシン、ハロゲン化ビフェニール、カーバメート、チ
オフォスファイト、リン酸エステルおよびそれらの代謝
物を含む。そのような物質は分子量が約５０ないし約１
０００の範囲であることができる。
体はモノエピトープ性もしくはポリエピトープ性物質で
よい。それは薬物、代謝物、天然物、殺虫剤、空気およ
び水の汚染物質のような物質から限定なしに選ぶことが
できる。例示目的のため、ジゴキシン、ジギトキシン、
フェニトイン、テオフィリン、ゲンタマイシンおよびト
ブラマイシンを含む薬剤；モルフィン、ヘロイン、コカ
イン、麦角アルカロイド等のようなアルカロイド；エス
トローゲンおよびアンドローゲン例えばエストリオー
ル、および抗炎症ステロイド例えばコルチゾールを含む
ステロイドホルモン；フェノバルビタールを含むバルビ
ツレートのようなラクタム；アンフェタミンのようなア
ミノアルキルベンゼン；ビタミン、Ｆ2 アルファおよび
Ｅのようなプロスタグランジン、抗生物質その他、チロ
キシン，トリヨードチロキシンおよびオキシトシンのよ
うな短鎖ペプチド配列またはアミノ酸を挙げることがで
きる。代表的な汚染物質および殺虫剤は、ＰＣＢ、ダイ
オキシン、ハロゲン化ビフェニール、カーバメート、チ
オフォスファイト、リン酸エステルおよびそれらの代謝
物を含む。そのような物質は分子量が約５０ないし約１
０００の範囲であることができる。
【００６１】標的分子はまた、タンパクもしくは他のポ
リ（アミノ酸）、ポリ核酸、またはポリサッカライドの
ような高分子物質であることができる。そのようなタン
パク物質は、限定なしで、グロブリン、アルブミン、リ
ポタンパク、糖タンパク、ヒストーン等を含むタンパク
類、アルブミン、ＩｇＥのような免疫グロブリン、フィ
ブリノーゲン、トランスフェリン、種々の補因子、ＣＥ
Ａ（がん胎児性抗原）およびＰＡＰのような腫瘍マーカ
ーを含む高感受性タンパク、ベーターｈＣＧ、ＦＳＨ、
ガストリン、ＬＨおよびプロラクチン、インシュリン、
チロトロピン、ゴナドトロピン等を含む種々の血液凝固
因子およびタンパクホルモンの任意のクラスから選ぶこ
とができる。バイオ特異性ポリサッカライドの例は、サ
ルモネラ属、ストレプトコッカス属およびクレブシェラ
属の種々のスペシスに関連するような微生物から誘導さ
れたものである。他の標的は、限定なしに肝炎または風
疹による感染のような感染病症状に責任ある物質であ
る。
リ（アミノ酸）、ポリ核酸、またはポリサッカライドの
ような高分子物質であることができる。そのようなタン
パク物質は、限定なしで、グロブリン、アルブミン、リ
ポタンパク、糖タンパク、ヒストーン等を含むタンパク
類、アルブミン、ＩｇＥのような免疫グロブリン、フィ
ブリノーゲン、トランスフェリン、種々の補因子、ＣＥ
Ａ（がん胎児性抗原）およびＰＡＰのような腫瘍マーカ
ーを含む高感受性タンパク、ベーターｈＣＧ、ＦＳＨ、
ガストリン、ＬＨおよびプロラクチン、インシュリン、
チロトロピン、ゴナドトロピン等を含む種々の血液凝固
因子およびタンパクホルモンの任意のクラスから選ぶこ
とができる。バイオ特異性ポリサッカライドの例は、サ
ルモネラ属、ストレプトコッカス属およびクレブシェラ
属の種々のスペシスに関連するような微生物から誘導さ
れたものである。他の標的は、限定なしに肝炎または風
疹による感染のような感染病症状に責任ある物質であ
る。
【００６２】以上のリストは概略アウトラインであるこ
とを意図する。先行技術にさらに詳しく挙げられたよう
な他の均等な物質（参照として取り入れたUSP 4,193,98
3 第７〜１１欄参照）も本発明によって提供される螢光
団と共に使用することができることを認識すべきであ
る。
とを意図する。先行技術にさらに詳しく挙げられたよう
な他の均等な物質（参照として取り入れたUSP 4,193,98
3 第７〜１１欄参照）も本発明によって提供される螢光
団と共に使用することができることを認識すべきであ
る。
【００６３】非連結生成物 R, R' または R”基の一つがバイオ特異性生物学的活性
基への連結基である、直前に記載した化合物に加え、本
発明はまた、式ＩおよびIII と同じ一般的構造である
が、バイオ特異性物質への連結基を含まない、すなわち
R, R'および R”のすべてが水素かまたは電子供与基で
ある他の物質を提供する。特にM が水素である式Ｉおよ
びIII のそのような物質は金属のキレート剤として有用
であり、そして希土類金属へキレートした時溶液中の希
土類金属イオンの定量的もしくは定性的螢光測定のため
の指示薬として役立ち得る螢光スペシスを与える。
基への連結基である、直前に記載した化合物に加え、本
発明はまた、式ＩおよびIII と同じ一般的構造である
が、バイオ特異性物質への連結基を含まない、すなわち
R, R'および R”のすべてが水素かまたは電子供与基で
ある他の物質を提供する。特にM が水素である式Ｉおよ
びIII のそのような物質は金属のキレート剤として有用
であり、そして希土類金属へキレートした時溶液中の希
土類金属イオンの定量的もしくは定性的螢光測定のため
の指示薬として役立ち得る螢光スペシスを与える。
【００６４】希土類金属 本発明のアリール置換ピリジン類は、テルビウム、ジス
プロシウム、ユーロピウム、サマリウムおよびネオジム
を含む希土類金属とそれらのイオンの形において長寿命
螢光錯塩を形成する。テルビウムおよびユーロピウム
（Tb+++ およびEu+++ ）が好ましい希土類金属イオンで
ある。
プロシウム、ユーロピウム、サマリウムおよびネオジム
を含む希土類金属とそれらのイオンの形において長寿命
螢光錯塩を形成する。テルビウムおよびユーロピウム
（Tb+++ およびEu+++ ）が好ましい希土類金属イオンで
ある。
【００６５】該金属イオンと、本発明のテトラ酸リガン
ドとの間に形成される錯塩は、１：１等モル金属：リガ
ンドキレート錯塩であると一般に考えられる。それらは
一般式IVとして与えられた構造によって表される。
ドとの間に形成される錯塩は、１：１等モル金属：リガ
ンドキレート錯塩であると一般に考えられる。それらは
一般式IVとして与えられた構造によって表される。
【００６６】
【化１５】
【００６７】製造方法 本発明の置換ピリジン類は二方法のいずれかによって製
造することができる。もし最終構造が反応性アミン官能
か、または使用する試薬と共存し得ない他の官能基を含
んでいなければ、第１の方法が好ましい。第２の方法は
そのような基を組み込むことを許容する。
造することができる。もし最終構造が反応性アミン官能
か、または使用する試薬と共存し得ない他の官能基を含
んでいなければ、第１の方法が好ましい。第２の方法は
そのような基を組み込むことを許容する。
【００６８】第１の方法は、 Ａ．適当に置換されたベンズアルデヒドまたはナフトア
ルデヒドを少なくとも２モルの 2−アシルフランと 1,5
−ジ（２−フリル）−1,5 −ペンタンジオンが生成する
ように反応させる。
ルデヒドを少なくとも２モルの 2−アシルフランと 1,5
−ジ（２−フリル）−1,5 −ペンタンジオンが生成する
ように反応させる。
【００６９】Ｂ．液相中、４０℃ないし１７０℃，特に
８０℃ないし１５０℃のような上昇温度においてヒドロ
キシルアミンと反応させることにより、Ａの生成物を対
応するジ（フリル）ピリジンへ変換する。
８０℃ないし１５０℃のような上昇温度においてヒドロ
キシルアミンと反応させることにより、Ａの生成物を対
応するジ（フリル）ピリジンへ変換する。
【００７０】Ｃ．有機液相中酸化剤と接触させることに
より、Ｂの生成物を対応するピリジン−2,6 −ジカルボ
ン酸へ酸化する。この酸化の一例はアルカノール中約５
０℃ないし約１００℃において３０ないし１２０分間過
マンガン酸カリウムの過剰の使用である。
より、Ｂの生成物を対応するピリジン−2,6 −ジカルボ
ン酸へ酸化する。この酸化の一例はアルカノール中約５
０℃ないし約１００℃において３０ないし１２０分間過
マンガン酸カリウムの過剰の使用である。
【００７１】Ｄ．前記ピリジン−2,6 −ジカルボン酸を
ジアミドへ変換する。これはオキザリルクロライドの過
剰と、そして低温ないし環境温度において水酸化アンモ
ニウムを使用して実施することができる。
ジアミドへ変換する。これはオキザリルクロライドの過
剰と、そして低温ないし環境温度において水酸化アンモ
ニウムを使用して実施することができる。
【００７２】Ｅ．前記ジアミドを、約−１０゜ないし＋
３５℃の温度において無水酢酸、無水トリフルオロ酢酸
等のような脱水剤との反応によってジニトリルへ変換す
る。
３５℃の温度において無水酢酸、無水トリフルオロ酢酸
等のような脱水剤との反応によってジニトリルへ変換す
る。
【００７３】Ｆ．該ジニトリルをジアミンへ還元する。
これは微量の酸の存在下貴金属触媒および分子状水素を
使用して接触的に実施することができる。
これは微量の酸の存在下貴金属触媒および分子状水素を
使用して接触的に実施することができる。
【００７４】Ｇ．該アミン基へエステル基を連結する。
これは 1,8−ビス（ジメチルアミノ）ナフタレンまたは
他の適当な塩基の存在下ハロ酢酸アルキル、例えばブロ
モ酢酸アルキルとの反応によって実施することができ
る。
これは 1,8−ビス（ジメチルアミノ）ナフタレンまたは
他の適当な塩基の存在下ハロ酢酸アルキル、例えばブロ
モ酢酸アルキルとの反応によって実施することができ
る。
【００７５】Ｈ．エステル基を約５℃ないし約４５℃の
ような緩和な温度においてアルカリ金属炭酸塩もしくは
水酸化物のような無機塩基による鹸化によって酸へ変換
する。
ような緩和な温度においてアルカリ金属炭酸塩もしくは
水酸化物のような無機塩基による鹸化によって酸へ変換
する。
【００７６】言及しないが、しかし実地においては実施
しなければならないいくつかの分離および精製工程が存
在するこが認識されるであろう。
しなければならないいくつかの分離および精製工程が存
在するこが認識されるであろう。
【００７７】第２の製造方法においては、最初の三工程
は、アリールアルデヒド、すなわちベンズアルデヒドま
たはナフトアルデヒドが、アミン置換基が最終的に望ま
れる場合はニトロ基を有し、または方法１の後の反応と
共存し得ない他の基を有する変更を除いて、第１の方法
と実質上同様に実施される。これら三工程の生成物は、
所望のそしてそのため出発物質上に存在する種々のR,
R' および R”置換分を有するニトロフェニルもしくは
ニトロナフチルピリジン−2,6 −ジカルボン酸である。
は、アリールアルデヒド、すなわちベンズアルデヒドま
たはナフトアルデヒドが、アミン置換基が最終的に望ま
れる場合はニトロ基を有し、または方法１の後の反応と
共存し得ない他の基を有する変更を除いて、第１の方法
と実質上同様に実施される。これら三工程の生成物は、
所望のそしてそのため出発物質上に存在する種々のR,
R' および R”置換分を有するニトロフェニルもしくは
ニトロナフチルピリジン−2,6 −ジカルボン酸である。
【００７８】第２の方法の工程Ｄにおいては、２個のカ
ルボキシル基が選択的に還元される。すなわち、それら
はニトロ基を還元しない条件下で還元される。ボランが
これを達成する還元剤の一種である。この還元は過剰の
ボランと、緩和な温度と、そして乾燥条件を使用するこ
とによって実施することができる。これによりジカルボ
ン酸に対応するジカルビノールが得られる。
ルボキシル基が選択的に還元される。すなわち、それら
はニトロ基を還元しない条件下で還元される。ボランが
これを達成する還元剤の一種である。この還元は過剰の
ボランと、緩和な温度と、そして乾燥条件を使用するこ
とによって実施することができる。これによりジカルボ
ン酸に対応するジカルビノールが得られる。
【００７９】Ｅ．このジカルビノールは該カルビノール
官能をアルキルハライドへ変換する試薬と反応させられ
る。モル過剰のチオニールブロマイドが５０℃ないし１
２５℃のような上昇温度においてこの変換を達成し、ピ
リジン窒素に関し２位および６位においてアルキルブロ
マイドで置換された所望のニトロアリールピリジンであ
る生成物を与える。
官能をアルキルハライドへ変換する試薬と反応させられ
る。モル過剰のチオニールブロマイドが５０℃ないし１
２５℃のような上昇温度においてこの変換を達成し、ピ
リジン窒素に関し２位および６位においてアルキルブロ
マイドで置換された所望のニトロアリールピリジンであ
る生成物を与える。
【００８０】Ｆ．この工程においては、前記アルキルブ
ロマイド置換ピリジンがイミノジ酢酸ジエステルと、２
個の臭素をイミノジ酢酸官能で置換するために反応させ
られる。これは 1,8−ビス（ジメチルアミノ）ナフタレ
ンのような塩基と、約２５℃ないし約５５℃のような緩
和な温度と、そして不活性雰囲気を使用して実施するこ
とができる。これはテトラエステルを与える。
ロマイド置換ピリジンがイミノジ酢酸ジエステルと、２
個の臭素をイミノジ酢酸官能で置換するために反応させ
られる。これは 1,8−ビス（ジメチルアミノ）ナフタレ
ンのような塩基と、約２５℃ないし約５５℃のような緩
和な温度と、そして不活性雰囲気を使用して実施するこ
とができる。これはテトラエステルを与える。
【００８１】Ｇ．次に４個のエステル基は方法１の工程
度Ｈに示した鹸化条件を使用して除去することができ
る。
度Ｈに示した鹸化条件を使用して除去することができ
る。
【００８２】Ｈ．この方法の最終工程においては、アリ
ール置換分上のニトロ基がアミンへ還元される。この反
応は貴金属触媒と分子状水素とを使用して接触的に実施
することができる。代表的な触媒はアルミナまたは炭素
上の白金またはパラジウムを含む。水素圧力は大気圧な
いし数気圧、すなわち１〜10気圧の範囲とすることがで
き、そして環境ないし約７５℃の温度が所望の選択的還
元を達成するために採用される。これは所望のアミン置
換ピリジン物質を与える。もし望むならば他の均等製造
方法を使用することができる。例えば、アミン官能は、
方法１の工程Ｇの生成物を発煙硝酸でニトロ化し、その
ように導入されたニトロ基を方法２におけるように後で
還元する、方法１の修飾によって導入することができ
る。
ール置換分上のニトロ基がアミンへ還元される。この反
応は貴金属触媒と分子状水素とを使用して接触的に実施
することができる。代表的な触媒はアルミナまたは炭素
上の白金またはパラジウムを含む。水素圧力は大気圧な
いし数気圧、すなわち１〜10気圧の範囲とすることがで
き、そして環境ないし約７５℃の温度が所望の選択的還
元を達成するために採用される。これは所望のアミン置
換ピリジン物質を与える。もし望むならば他の均等製造
方法を使用することができる。例えば、アミン官能は、
方法１の工程Ｇの生成物を発煙硝酸でニトロ化し、その
ように導入されたニトロ基を方法２におけるように後で
還元する、方法１の修飾によって導入することができ
る。
【００８３】中間体 これら方法において、新規化合物と信じられる重要中間
体が製造される。これらは下記式を持つ酸、塩として、
またはモノもしくはジエステルとして存在し得る 2,6−
ジカルボン酸置換ピリジンを含んでいる。
体が製造される。これらは下記式を持つ酸、塩として、
またはモノもしくはジエステルとして存在し得る 2,6−
ジカルボン酸置換ピリジンを含んでいる。
【００８４】
【化１６】
【００８５】式中、Arはアリールであり、 n”はAr上の
提供し得る結合部位の数に等しい整数であり、R, R' お
よび R”は独立に水素か、または低級アルコキシ、低級
アルキル、アミノ、ジアルキルアミノ、アリールおよび
アリールオキシを含む電子供与基か、または連結基から
選ばれ、 R＊および R＊＊は独立して金属イオン、水素
および低級アルキルの中から選ばれる。
提供し得る結合部位の数に等しい整数であり、R, R' お
よび R”は独立に水素か、または低級アルコキシ、低級
アルキル、アミノ、ジアルキルアミノ、アリールおよび
アリールオキシを含む電子供与基か、または連結基から
選ばれ、 R＊および R＊＊は独立して金属イオン、水素
および低級アルキルの中から選ばれる。
【００８６】製品の使用 本発明の製品は希土類金属をキレートするためのリガン
ドとして広い用途を有する。そのようにして生成したキ
レートは螢光を発し、そのため材料中の希土類イオン含
量の測定方法を提供する。ここに記載した置換ピリジン
類はそれらの希土類金属キレートとして、それらの螢光
性質がそれらをバイオ特異性分子のための標識として役
立つことを許容する場合、各種のアッセイ操作において
特に有用である。典型的には、本発明のキレートまたは
リガンドは、抗体、抗原、ハプテンまたは他の標的分子
のようなバイオ特異性分子の適当な反応性基と反応する
イソシアネート、アミン、イミデート、ジアゾまたは他
の適当な基のような反応性官能基を持つように製造され
る。バイオ特異性分子の結合ペアのこのように標識され
たメンバーは、競合的結合アッセイおよびイムノメトリ
ックサンドイッチ型アッセイを含む、当業者に既知の種
々のアッセイ方法のどれにも使用することができる。
ドとして広い用途を有する。そのようにして生成したキ
レートは螢光を発し、そのため材料中の希土類イオン含
量の測定方法を提供する。ここに記載した置換ピリジン
類はそれらの希土類金属キレートとして、それらの螢光
性質がそれらをバイオ特異性分子のための標識として役
立つことを許容する場合、各種のアッセイ操作において
特に有用である。典型的には、本発明のキレートまたは
リガンドは、抗体、抗原、ハプテンまたは他の標的分子
のようなバイオ特異性分子の適当な反応性基と反応する
イソシアネート、アミン、イミデート、ジアゾまたは他
の適当な基のような反応性官能基を持つように製造され
る。バイオ特異性分子の結合ペアのこのように標識され
たメンバーは、競合的結合アッセイおよびイムノメトリ
ックサンドイッチ型アッセイを含む、当業者に既知の種
々のアッセイ方法のどれにも使用することができる。
【００８７】実施例 本発明は以下の実施例によりさらに説明されるそれらは
本発明を例証することを意図し、その範囲を限定するも
のと解してはならない。
本発明を例証することを意図し、その範囲を限定するも
のと解してはならない。
【００８８】実施例１
【００８９】
【化１７】
【００９０】の製造 Ａ．5-ジ（2-フリル）-3−フェニル-1,5−ペンタンジオンの製造 ベンズアルデヒド 62.6g （60ml）（0.59モル） 2-アセチルフラン, 85％ 165g（ 150ml） （1.27モル） 水酸化カリウム, 85％ 35g（0.53モル）
【００９１】ＫＯＨを加熱かきまぜながらメタノール
（約６００ml）に溶解する。この溶液を少し冷し、アル
デヒドとフランとの混合物を一度に添加する。混合物を
６０℃へ加熱し、４５〜６０分間かきまぜる。最初緑色
が発色し、速やかに褐色に暗色化する。反応混合物はオ
レンジ−褐色結晶の塊に固化する。エタノール（約１５
０ml）を加え、固体を砕く。混合物を一夜冷却し、生成
物結晶をロ取し、氷冷エタノール（約４００ml）で洗
い、次にヘプタン（約２００ml）で洗う。結晶を８０℃
で減圧乾燥する。ペンタンジオンの収量１０３．５mgま
たは５７．３％
（約６００ml）に溶解する。この溶液を少し冷し、アル
デヒドとフランとの混合物を一度に添加する。混合物を
６０℃へ加熱し、４５〜６０分間かきまぜる。最初緑色
が発色し、速やかに褐色に暗色化する。反応混合物はオ
レンジ−褐色結晶の塊に固化する。エタノール（約１５
０ml）を加え、固体を砕く。混合物を一夜冷却し、生成
物結晶をロ取し、氷冷エタノール（約４００ml）で洗
い、次にヘプタン（約２００ml）で洗う。結晶を８０℃
で減圧乾燥する。ペンタンジオンの収量１０３．５mgま
たは５７．３％
【００９２】 Ｂ．4-フェニル- 2,6-ジ（2-フリル）ピリジンの製造 5-ジ（2-フリル）-3- フェニル- 1,5-ペンタンジオン 143g ヒドロシキルアミン塩酸塩（アルドリッチ 102337 ） 129g n-ブタノール（シグマ 13F-5070 ） 1600 ml
【００９３】工程Ａで製造したジオン、ヒドロキシルア
ミン塩酸塩およびブタノールを、機械的スターラーとコ
ンデンサーを備えた５Ｌの３頚フラスコへ加え、５時間
還流かきまぜ、冷却し、約６０時間かきまぜる。生成し
た黒色溶液を１５％ NaOH １Ｌ中へ注ぎ、トルエン（１
Ｌ）で抽出する。有機層を脱イオン水（１×２００ml）
で洗い、Na2SO4で乾燥し、ロータリーエバポレーターで
濃縮する。粘ちょうな残渣を CH2Cl2 （約２５０ml）で
溶かす。ヘキサン（約２５０ml）を生成溶液へ加え、シ
リカゲルでロ過し、１：１ CH2Cl2 ／ヘキサン（約５０
０ml）で溶出する。ロ液を濃縮し、エタノール（約２０
０ml）を加え、混合物を氷中で冷却する。生成した結晶
をロ取し、氷冷エタノールで洗い、室温で減圧乾燥する
と、１番結晶約６５ｇが得られる。ロ液を濃縮し、精製
し、冷却すると２番結晶１３．６ｇが得られる。
ミン塩酸塩およびブタノールを、機械的スターラーとコ
ンデンサーを備えた５Ｌの３頚フラスコへ加え、５時間
還流かきまぜ、冷却し、約６０時間かきまぜる。生成し
た黒色溶液を１５％ NaOH １Ｌ中へ注ぎ、トルエン（１
Ｌ）で抽出する。有機層を脱イオン水（１×２００ml）
で洗い、Na2SO4で乾燥し、ロータリーエバポレーターで
濃縮する。粘ちょうな残渣を CH2Cl2 （約２５０ml）で
溶かす。ヘキサン（約２５０ml）を生成溶液へ加え、シ
リカゲルでロ過し、１：１ CH2Cl2 ／ヘキサン（約５０
０ml）で溶出する。ロ液を濃縮し、エタノール（約２０
０ml）を加え、混合物を氷中で冷却する。生成した結晶
をロ取し、氷冷エタノールで洗い、室温で減圧乾燥する
と、１番結晶約６５ｇが得られる。ロ液を濃縮し、精製
し、冷却すると２番結晶１３．６ｇが得られる。
【００９４】Ｃ．4-フェニル- 2,6-ピリジンジカルボン
酸 工程Ｂのジフリルピリジン化合物を過マンガン酸で酸化
する。 工程Ｂの生成物 ２３ミリモル KMnO4 ４５．４ｇ ｔ−ブタノール １５００ml 水 ３００ml
酸 工程Ｂのジフリルピリジン化合物を過マンガン酸で酸化
する。 工程Ｂの生成物 ２３ミリモル KMnO4 ４５．４ｇ ｔ−ブタノール １５００ml 水 ３００ml
【００９５】ｔ−ブタノール（約１Ｌ）をメカニカルス
ターラー、マントルおよびコンデンサーを備えた三頚フ
ラスコへ入れる。工程Ｂの生成物を加え、フラスコ中へ
残りのｔ−ブタノールを加える。混合物を加熱し、溶液
になるまでかきまぜる。次に水を加え、温度が約７５℃
へ達した時 KMnO4を少しづつ３０分を要して加える。混
合物を９０分間還流する。アルコールをアスピレーター
真空で留去し、熱い残渣をセライトでロ過し、熱１：１
t-BuOH ／H2O で洗う。残存 KMnO4を NaHSO3で消費
し、溶液をロータリーエバポレーター（約６５℃）で約
１５０mlへ濃縮する。2N HCl（２５ml）で酸性化した
後、生成した所望の 4- フェニル- 2,6-ピリジンジカル
ボン酸の結晶をロ取し、洗浄し、乾燥する。
ターラー、マントルおよびコンデンサーを備えた三頚フ
ラスコへ入れる。工程Ｂの生成物を加え、フラスコ中へ
残りのｔ−ブタノールを加える。混合物を加熱し、溶液
になるまでかきまぜる。次に水を加え、温度が約７５℃
へ達した時 KMnO4を少しづつ３０分を要して加える。混
合物を９０分間還流する。アルコールをアスピレーター
真空で留去し、熱い残渣をセライトでロ過し、熱１：１
t-BuOH ／H2O で洗う。残存 KMnO4を NaHSO3で消費
し、溶液をロータリーエバポレーター（約６５℃）で約
１５０mlへ濃縮する。2N HCl（２５ml）で酸性化した
後、生成した所望の 4- フェニル- 2,6-ピリジンジカル
ボン酸の結晶をロ取し、洗浄し、乾燥する。
【００９６】 Ｄ．4-フェニル−2,6-ピリジンジカルボン酸アミド 4-フェニル- 2,6-ピリジンジカルボン酸 ２１．５ミリモル オキザリルクロライド ４．８ml 塩化メチレン ８０ ml ジメチルホルムアミド ５ 滴
【００９７】ピリジンジカルボン酸を CH2Cl2 , DMF お
よびかくはん棒つきの１００ml二頚フラスコへ加える。
フラスコを CaSO4乾燥チューブで封鎖し、氷中で冷却す
る。次いでオキザリルクロライドを注射器から約５分に
わたって加え、室温で約２時間かきまぜる。得られる溶
液をロータリーエバポレーターで濃縮して固体の酸クロ
ライドを得、ベンゼン（１５０ml）を加え、ロータリー
エバポレーターで除去し、次に残渣を真空乾燥する。酸
クロライドを２８％ NH4OH（５０ml）へ５〜１０分にわ
たってかきまぜながら添加し、１時間かきまぜ、ロ過
し、水洗し、乾燥して所望のアミドを得る。
よびかくはん棒つきの１００ml二頚フラスコへ加える。
フラスコを CaSO4乾燥チューブで封鎖し、氷中で冷却す
る。次いでオキザリルクロライドを注射器から約５分に
わたって加え、室温で約２時間かきまぜる。得られる溶
液をロータリーエバポレーターで濃縮して固体の酸クロ
ライドを得、ベンゼン（１５０ml）を加え、ロータリー
エバポレーターで除去し、次に残渣を真空乾燥する。酸
クロライドを２８％ NH4OH（５０ml）へ５〜１０分にわ
たってかきまぜながら添加し、１時間かきまぜ、ロ過
し、水洗し、乾燥して所望のアミドを得る。
【００９８】 Ｅ．4-フェニル- 2,6-ピリジンジカルボニトリル 4-フェニル- 2,6-ピリジン- ジカルボン酸アミド １７．５ミリモル ｐ−ジオキサン １７０ml ピリジン １１．３ml トリフルオロ酢酸無水物 １１．０ml
【００９９】最初の三成分をかくはん棒を備えた２５０
mlフラスコ中へ入れる。フラスコをアルゴンガス下封鎖
し、凍結したジオキサンが存在するまで氷中で冷却する
（１０℃）。酸無水物を約１０分を要して加え（温度約
１５℃）、混合物を室温で２時間かきまぜる。生成した
暗色溶液を水中へ注ぎ、各回メチレンクロライド１５０
mlで３回抽出する。抽出液をNa2SO4上で乾燥し、ロータ
リーエバポレーターで暗色固体へ濃縮し、塩化メチレン
へ溶解し、シリカを通して追加の塩化メチレンで溶出す
る。溶出液を固体へ濃縮し、乾燥し、所望のジカルボニ
トリルを得る。
mlフラスコ中へ入れる。フラスコをアルゴンガス下封鎖
し、凍結したジオキサンが存在するまで氷中で冷却する
（１０℃）。酸無水物を約１０分を要して加え（温度約
１５℃）、混合物を室温で２時間かきまぜる。生成した
暗色溶液を水中へ注ぎ、各回メチレンクロライド１５０
mlで３回抽出する。抽出液をNa2SO4上で乾燥し、ロータ
リーエバポレーターで暗色固体へ濃縮し、塩化メチレン
へ溶解し、シリカを通して追加の塩化メチレンで溶出す
る。溶出液を固体へ濃縮し、乾燥し、所望のジカルボニ
トリルを得る。
【０１００】 Ｆ．4-フェニル−2,6-ジ（アミノメチル）−ピリジン 4-フェニル-2,6−ピリジン−ジカルボニトリル １３．５ミリモル ２％ HClO4エタノール ３７０ml １０％パラジウム炭 ３．７ｇ
【０１０１】ニトリルを７０％ HClO4１０．５mlを添加
したエタノール中に懸濁し、混合物をパールボトルへ移
す。ボトルを窒素で掃気し、触媒を加える。ボトルを次
に水素で４０psi へ与圧する。３０分後ボトルを開き、
液体を取り出して暗色液体へ濃縮する。該液へジメチル
エーテルを加え、ロ過することによって黄色固体を回収
する。過酸塩素酸塩固体を真空ポンプで乾燥する。この
アミン過塩素酸塩を水約３０mlへ溶解し、４０％ NaOH
へ加える。生成した遊離アミンを CH2Cl2 で抽出し、Na
2S4 上で乾燥し、真空ポンプで暗色オイルへ濃縮する。
したエタノール中に懸濁し、混合物をパールボトルへ移
す。ボトルを窒素で掃気し、触媒を加える。ボトルを次
に水素で４０psi へ与圧する。３０分後ボトルを開き、
液体を取り出して暗色液体へ濃縮する。該液へジメチル
エーテルを加え、ロ過することによって黄色固体を回収
する。過酸塩素酸塩固体を真空ポンプで乾燥する。この
アミン過塩素酸塩を水約３０mlへ溶解し、４０％ NaOH
へ加える。生成した遊離アミンを CH2Cl2 で抽出し、Na
2S4 上で乾燥し、真空ポンプで暗色オイルへ濃縮する。
【０１０２】 Ｇ．4-フェニル- 2,6-ビス〔 N,N- ジ（メトキシカルボニルメチル）- アミノメ チル〕- ピリジン 工程Ｆのアミン １２．０ミリモル 1,8-ビス（ジメチルアミノ）ナフタレン １０．３ｇ ブロム酢酸メチル ７．３５ｇ アセトニトリル １３０ml
【０１０３】塩基をフラスコへ入れる。アミンをアセト
ニトリルへ溶解し、フラスコへ入れる。かくはん棒を加
え、混合物を均一になるまで４５℃でかきまぜる。次に
アルゴンガス下アセトニトリル４０ml中のブロム酢酸メ
チルを滴下する。約４５℃で約１６時間後、生成物を水
１５０mlと０．１M クエン酸中へ注ぐ。この混合物を塩
化メチレンで抽出する。抽出液を洗浄し、乾燥し、濃縮
し、再溶解し、シリカでロ過する。生成物は溶媒として
酢酸エチル／塩化メチレンを使用してシリカゲルクロマ
トグラフィーで精製する。
ニトリルへ溶解し、フラスコへ入れる。かくはん棒を加
え、混合物を均一になるまで４５℃でかきまぜる。次に
アルゴンガス下アセトニトリル４０ml中のブロム酢酸メ
チルを滴下する。約４５℃で約１６時間後、生成物を水
１５０mlと０．１M クエン酸中へ注ぐ。この混合物を塩
化メチレンで抽出する。抽出液を洗浄し、乾燥し、濃縮
し、再溶解し、シリカでロ過する。生成物は溶媒として
酢酸エチル／塩化メチレンを使用してシリカゲルクロマ
トグラフィーで精製する。
【０１０４】Ｈ．テトラエステルの鹸化 工程Ｇのテトラエステルをメタノール／水１：１中へ入
れ、 K2CO3のモル過剰を加え、室温で２．５時間かきま
ぜることによって鹸化する。次に溶液をｐＨ７へ酸性化
し、乾燥すると所望のテトラ酸を与える。NMR によって
その同一性が確認される。
れ、 K2CO3のモル過剰を加え、室温で２．５時間かきま
ぜることによって鹸化する。次に溶液をｐＨ７へ酸性化
し、乾燥すると所望のテトラ酸を与える。NMR によって
その同一性が確認される。
【０１０５】実施例２ 実施例１の製造法を、工程Ａにおいてベンズアルデヒド
を 2,4−ジメトキシベンズアルデヒドの同モル量に代
え、生成する中間体が4-（2,4-ジメトキシフェニル）-
2,6- ピリジンジカルボン酸であり、そして最終生成物
が実施例１の工程Ｈの生成物の 2,4−ジメトキシ類縁体
となるように変更してくり返す。各工程において得た収
率は、所望の 4−（2,4-ジメトキシフェニル）-2,6−ビ
ス〔N,N-ジ（カルボキシメチル）アミノメチル〕- ピリ
ジンの、 Ａ工程 ９５％ Ｂ工程 ７２％ Ｅ工程 ８４％である。
を 2,4−ジメトキシベンズアルデヒドの同モル量に代
え、生成する中間体が4-（2,4-ジメトキシフェニル）-
2,6- ピリジンジカルボン酸であり、そして最終生成物
が実施例１の工程Ｈの生成物の 2,4−ジメトキシ類縁体
となるように変更してくり返す。各工程において得た収
率は、所望の 4−（2,4-ジメトキシフェニル）-2,6−ビ
ス〔N,N-ジ（カルボキシメチル）アミノメチル〕- ピリ
ジンの、 Ａ工程 ９５％ Ｂ工程 ７２％ Ｅ工程 ８４％である。
【０１０６】実施例３ないし１７ 実施例１の製造法を、ベンズアルデヒドを以下の置換ベ
ンズアルデヒドの同モル量に代えることにより変更し、
１５回くり返す。
ンズアルデヒドの同モル量に代えることにより変更し、
１５回くり返す。
【０１０７】実施例No . ベンズアルデヒド類縁体 ３ 4-メトキシベンズアルデヒド ４ 3,4-ジメトキシ 〃 ５ 3,4,5-トリメトキシ 〃 ６ 2,5-ジメトキシ 〃 ７ 2,4,5-トリメトキシ 〃 ８ 4-エトキシ 〃 ９ 2,4-ジプロポキシ 〃 １０ 2-エトキシ-4- メトキシ〃 １１ 4-ベンジルオキシ 〃 １２ 3-メトキシ-4- ベンジルオキシ 〃 １３ 3,4-メチレンジオキシ 〃 １４ 2-メトキシ-4- ベンジルオキシ 〃 １５ 2,4-ジメトキシ 〃 １６ 2,4,6-トリメトキシ 〃 １７ 3-メトキシ-4−（4-ニトロベンジルオキシ）〃
【０１０８】これら異なるベンズアルデヒドをもって対
応する 2,6- ピリジンジカルボン酸中間体およびテトラ
酸最終製品が得られる。
応する 2,6- ピリジンジカルボン酸中間体およびテトラ
酸最終製品が得られる。
【０１０９】実施例１８ この実施例はアミン置換分をフェニル環へ導入すること
を示す。実施例１の工程Ａ，ＢおよびＣを、ベンズアル
デヒドを 3−ニトロベンズアルデヒドの同モル量に代え
る変更をもってくり返す。これせは 4−（3-ニトロフェ
ニル）-2,6- ピリジンジカルボン酸を与える。
を示す。実施例１の工程Ａ，ＢおよびＣを、ベンズアル
デヒドを 3−ニトロベンズアルデヒドの同モル量に代え
る変更をもってくり返す。これせは 4−（3-ニトロフェ
ニル）-2,6- ピリジンジカルボン酸を与える。
【０１１０】Ｄ．4-（3-ニトロフェニル）- 2,6-ピリジ
ンジメタノール 上記ジ酸 ２８．８ｇ（０．１モル） ボラン／THF 錯体 ２８８ml，１モル
ンジメタノール 上記ジ酸 ２８．８ｇ（０．１モル） ボラン／THF 錯体 ２８８ml，１モル
【０１１１】ジ酸をＴＨＦ１０００mlおよびかくはん棒
を入れた乾燥した２Ｌフラスコへ入れる。乾燥チューブ
を取り付け、フラスコをアルゴンで掃気する。次にボラ
ン／ＴＨＦ錯体をはげしくかきまぜながら室温において
徐々に２０〜３０分を要して添加する。かくはんを４時
間続け、次に過剰のボランを希 HCl（6N HCl２０mlおよ
びH2O ８５ml）で加水分解する。次に１０％Na2CO3６０
mlを加え、溶液をロータリーエバポレーターで濃縮す
る。残渣を重炭酸塩水溶液へ加え、酢酸ブチルで３回抽
出し、抽出液を乾燥し、溶媒を留去して所望のジオール
をオレンジ色固体として得る。
を入れた乾燥した２Ｌフラスコへ入れる。乾燥チューブ
を取り付け、フラスコをアルゴンで掃気する。次にボラ
ン／ＴＨＦ錯体をはげしくかきまぜながら室温において
徐々に２０〜３０分を要して添加する。かくはんを４時
間続け、次に過剰のボランを希 HCl（6N HCl２０mlおよ
びH2O ８５ml）で加水分解する。次に１０％Na2CO3６０
mlを加え、溶液をロータリーエバポレーターで濃縮す
る。残渣を重炭酸塩水溶液へ加え、酢酸ブチルで３回抽
出し、抽出液を乾燥し、溶媒を留去して所望のジオール
をオレンジ色固体として得る。
【０１１２】Ｅ．4-（3-ニトロフェニル）−2,6-ビス
（ブロムメチル）ピリジン 工程Ｄのジオール ９．１ｇ（３５ミリモル） チオニルブロマイド ７．０ml（９０ミリモル）
（ブロムメチル）ピリジン 工程Ｄのジオール ９．１ｇ（３５ミリモル） チオニルブロマイド ７．０ml（９０ミリモル）
【０１１３】工程Ｄのジオールをフラスコに入れ、約２
０mlの塩化メチレンを加え、次にチオニルブロマイドを
加える。フラスコを入口アダプターで封鎖し、８０℃の
油浴へ入れる。塩化メチレンおよび HBrを追い出し、粘
ちょうな残渣が残る。これを水性Na2CO3中へ入れ、塩化
メチレンで３回抽出する。抽出液を乾燥し、濃縮し、塩
化メチレンで希釈し、シリカでロ過する。ロ液を集め、
蒸発し所望の臭化物を得る。
０mlの塩化メチレンを加え、次にチオニルブロマイドを
加える。フラスコを入口アダプターで封鎖し、８０℃の
油浴へ入れる。塩化メチレンおよび HBrを追い出し、粘
ちょうな残渣が残る。これを水性Na2CO3中へ入れ、塩化
メチレンで３回抽出する。抽出液を乾燥し、濃縮し、塩
化メチレンで希釈し、シリカでロ過する。ロ液を集め、
蒸発し所望の臭化物を得る。
【０１１４】Ｆ．2,6-ビス〔N,N-ジ（カルボキシメチ
ル）アミノメチル〕-4−（3-ニトロフェニル）−ピリジ
ンテトラメチルエステル 工程Ｅのジブロマイド 3.44g （8.9 ミリモル） イミドジ酢酸ジメチルエーテル 2.88g 1,8-ビス（ジメチルアミノ）ナフタレン 3.76g アセトニトリル 140ml
ル）アミノメチル〕-4−（3-ニトロフェニル）−ピリジ
ンテトラメチルエステル 工程Ｅのジブロマイド 3.44g （8.9 ミリモル） イミドジ酢酸ジメチルエーテル 2.88g 1,8-ビス（ジメチルアミノ）ナフタレン 3.76g アセトニトリル 140ml
【０１１５】塩基をフラスコに入れる。イミドジエステ
ルをアセトニトリルと混合し、そして添加する。フラス
コをアルゴンで掃気し、４５℃へ加熱する。ＴＨＦ中の
ジブロマイドを磁力でかきまぜながら６０〜９０分にわ
たって加える。１８時間後混合物を冷却し、室温で約２
日間かきまぜる。混合物をベンゼンへ加え、ロ過し、
０．１M クエン酸および水で洗い、Na2SO4上で乾燥す
る。溶液を次に油へ濃縮し、塩化メチレンへ取り、酢酸
エチル／塩化メチレン、次いで酢酸エチルを溶出液とし
てシリカゲルを２回通す。分画を集め、所望の物質を単
離し、こはく色の油へ濃縮する。
ルをアセトニトリルと混合し、そして添加する。フラス
コをアルゴンで掃気し、４５℃へ加熱する。ＴＨＦ中の
ジブロマイドを磁力でかきまぜながら６０〜９０分にわ
たって加える。１８時間後混合物を冷却し、室温で約２
日間かきまぜる。混合物をベンゼンへ加え、ロ過し、
０．１M クエン酸および水で洗い、Na2SO4上で乾燥す
る。溶液を次に油へ濃縮し、塩化メチレンへ取り、酢酸
エチル／塩化メチレン、次いで酢酸エチルを溶出液とし
てシリカゲルを２回通す。分画を集め、所望の物質を単
離し、こはく色の油へ濃縮する。
【０１１６】Ｇ．ニトロ基のアミンへの還元 工程Ｆのニトロテトラメチルエスル 2.7g（4.9 ミリ
モル） ５％パラジウム炭 2.7g エチルアルコール ３００ml
モル） ５％パラジウム炭 2.7g エチルアルコール ３００ml
【０１１７】ニトロ化合物をエタノール３００mlを入れ
た１Ｌフラスコへ入れる。フラスコを窒素で掃気し、触
媒を加える。フラスコを次に水素で１気圧に与圧する。
１時間後反応混合物をロ過し、ロ液をロータリー蒸発に
よって黄色油へ濃縮する。この油は工程Ｆの製品に対応
するアミノテトラメチルエステルであることが決定され
る。
た１Ｌフラスコへ入れる。フラスコを窒素で掃気し、触
媒を加える。フラスコを次に水素で１気圧に与圧する。
１時間後反応混合物をロ過し、ロ液をロータリー蒸発に
よって黄色油へ濃縮する。この油は工程Ｆの製品に対応
するアミノテトラメチルエステルであることが決定され
る。
【０１１８】Ｈ．鹸化 工程Ｇのアミノテトラメチルエステルは実施例１の方法
を使用して鹸化される。これにより所望の 3−アミノテ
トラ酸が得られる。
を使用して鹸化される。これにより所望の 3−アミノテ
トラ酸が得られる。
【０１１９】実施例１９ Ａ．2,6-ビス〔N,N-ジ（カルボキシメチル）アミノメチ
ル〕-4−（4-ニトロフェニル）−ピリジンテトラメチル
エステルの製造 発煙硝酸（０．０３ml，０．４３２８ミリモル）を室温
において塩化メチレン（４ml）中のトリフルオロメタン
スルホン酸溶液へ加える。５分間かきまぜた後、少量の
塩化メチレン中の実施例１の工程Ｇからのような 2,6−
ビス〔N,N-ジ（カルボキシメチル）アミノメチル〕-4−
フェニル−ピリジン溶液を０℃においてゆっくり加え
る。溶液が室温へ暖まることを許容し、１時間かきまぜ
を許容する。次に反応混合物を氷の上へ注ぎ、混合物を
炭酸ナトリウムで中和する。塩化メチレンで抽出し、硫
酸ナトリウム上で乾燥し、蒸発すると粗製品９０mgを与
える。
ル〕-4−（4-ニトロフェニル）−ピリジンテトラメチル
エステルの製造 発煙硝酸（０．０３ml，０．４３２８ミリモル）を室温
において塩化メチレン（４ml）中のトリフルオロメタン
スルホン酸溶液へ加える。５分間かきまぜた後、少量の
塩化メチレン中の実施例１の工程Ｇからのような 2,6−
ビス〔N,N-ジ（カルボキシメチル）アミノメチル〕-4−
フェニル−ピリジン溶液を０℃においてゆっくり加え
る。溶液が室温へ暖まることを許容し、１時間かきまぜ
を許容する。次に反応混合物を氷の上へ注ぎ、混合物を
炭酸ナトリウムで中和する。塩化メチレンで抽出し、硫
酸ナトリウム上で乾燥し、蒸発すると粗製品９０mgを与
える。
【０１２０】Ｂ．2,6-ビス〔N,N-ジ（カルボキシメチ
ル）アミノメチル〕-4−（4-アミノフェニル）−ピリジ
ンテトラメチルエステルの製造 上記反応からの粗生成物（９０mg，０．１７ミリモル）
をエタノール（１３ml）に溶解し、１０％Pd／C ５０mg
を加え、混合物を水素１気圧のもとで１時間室温でかき
まぜる。触媒をロ去し、溶媒を蒸発すると 4−アミノ化
合物６０mlを与える。このアミノ化合物（５１mg）は製
法２によって製造された対応する 3−ニトロ化合物７０
mg（０．１２９ミリモル）から同様に製造される。この
製造法は実施例１８に示したものと実質上同じである。
もし望むならば、それらのアリール環上にアミン置換分
を有するこれらおよび同様なアリールピリジンは、アミ
ン含有標的分子その他へ結合することができるイソチオ
シアネートへアミンを変換するチオホスゲンとアリール
アミンとの反応について既知の条件でチオホスゲンと反
応させることができる。
ル）アミノメチル〕-4−（4-アミノフェニル）−ピリジ
ンテトラメチルエステルの製造 上記反応からの粗生成物（９０mg，０．１７ミリモル）
をエタノール（１３ml）に溶解し、１０％Pd／C ５０mg
を加え、混合物を水素１気圧のもとで１時間室温でかき
まぜる。触媒をロ去し、溶媒を蒸発すると 4−アミノ化
合物６０mlを与える。このアミノ化合物（５１mg）は製
法２によって製造された対応する 3−ニトロ化合物７０
mg（０．１２９ミリモル）から同様に製造される。この
製造法は実施例１８に示したものと実質上同じである。
もし望むならば、それらのアリール環上にアミン置換分
を有するこれらおよび同様なアリールピリジンは、アミ
ン含有標的分子その他へ結合することができるイソチオ
シアネートへアミンを変換するチオホスゲンとアリール
アミンとの反応について既知の条件でチオホスゲンと反
応させることができる。
【０１２１】Ｃ．2,6-ビス〔N,N-ジ（カルボキシメチ
ル）アミノメチル〕-4−（4-および3-アミノフェニル）
−ピリジンテトラメチルエステルのテオフィリン-8−酪
酸への結合 クロルギ酸イソブチル（０．０２ml，０．１１７ミリモ
ル）をトリエチルアミン（０．２０ml，０．１１７ミリ
モル）を含有するジメチルホルムアミド（１．５ml）中
のテオフィリン−８−酪酸（３１．３mg，０．１１７ミ
リモル）の溶液へアルゴン雰囲気下０℃において加え
る。０℃で０．５時間後、クロロホルム中の 4−アミン
（６０mg，０．１１７ミリモル）の溶液をゆっくり加え
る。溶液を０〜５℃で１７時間かきまぜ、次に溶媒を蒸
発により除去し、粗製品１０３mgを残す。この物質をシ
リカゲル上でクロロホルム：メタノール（９：１）でク
ロマトグラフィーし、所望の生成物６０mg（６７％）を
与える。対応する 3−アミノ化合物（５１mg、０．０１
ミリモル）を同様に処理し、３位にテオフィリンが結合
した物質５０mgを得る。
ル）アミノメチル〕-4−（4-および3-アミノフェニル）
−ピリジンテトラメチルエステルのテオフィリン-8−酪
酸への結合 クロルギ酸イソブチル（０．０２ml，０．１１７ミリモ
ル）をトリエチルアミン（０．２０ml，０．１１７ミリ
モル）を含有するジメチルホルムアミド（１．５ml）中
のテオフィリン−８−酪酸（３１．３mg，０．１１７ミ
リモル）の溶液へアルゴン雰囲気下０℃において加え
る。０℃で０．５時間後、クロロホルム中の 4−アミン
（６０mg，０．１１７ミリモル）の溶液をゆっくり加え
る。溶液を０〜５℃で１７時間かきまぜ、次に溶媒を蒸
発により除去し、粗製品１０３mgを残す。この物質をシ
リカゲル上でクロロホルム：メタノール（９：１）でク
ロマトグラフィーし、所望の生成物６０mg（６７％）を
与える。対応する 3−アミノ化合物（５１mg、０．０１
ミリモル）を同様に処理し、３位にテオフィリンが結合
した物質５０mgを得る。
【０１２２】Ｄ．2,6-ビス〔N,N-ジ（カルボキシメチ
ル）アミノメチル〕-4−〔4-（テオフィリン-8−ブチル
アミド）−フェニル〕−ピリジンテトラ酸の製造 前工程からのテトラメチルエステル（３４mg，０．０４
５ミリモル）を１N 水酸化ナトリウム０．２mlを含有す
るメタノール（２ml）中に溶解し、３時間加熱還流す
る。次に溶液を氷浴中で冷却し、1N HClで酸性化し、蒸
発して粗製品を得る。メタノール：水（６：４）中の逆
相カラムクロマトグラフィーによる粗製品はテトラ酸１
４mgを与える。類似の 3−置換化合物４０mg（０．０５
ミリモル）の鹸化は逆相クロマトグラフィー後そのテト
ラ酸１４．６mgを与える。
ル）アミノメチル〕-4−〔4-（テオフィリン-8−ブチル
アミド）−フェニル〕−ピリジンテトラ酸の製造 前工程からのテトラメチルエステル（３４mg，０．０４
５ミリモル）を１N 水酸化ナトリウム０．２mlを含有す
るメタノール（２ml）中に溶解し、３時間加熱還流す
る。次に溶液を氷浴中で冷却し、1N HClで酸性化し、蒸
発して粗製品を得る。メタノール：水（６：４）中の逆
相カラムクロマトグラフィーによる粗製品はテトラ酸１
４mgを与える。類似の 3−置換化合物４０mg（０．０５
ミリモル）の鹸化は逆相クロマトグラフィー後そのテト
ラ酸１４．６mgを与える。
【０１２３】Ｅ．キレートの製造 Ｄ部のテトラ酸を別々に１０-5M の濃度に０．０１M ホ
ウ酸ナトリウム溶液に溶解する。次に水性塩化テルビウ
ムの同モル量をそれぞれへ加え、混合物を数分間放置す
る。螢光測定を実施し、テトラ酸とテルビウムとの１：
１モルキレート錯塩が生成したこと、およびそのような
錯塩は螢光性であり、かつ安定であることを示す。
ウ酸ナトリウム溶液に溶解する。次に水性塩化テルビウ
ムの同モル量をそれぞれへ加え、混合物を数分間放置す
る。螢光測定を実施し、テトラ酸とテルビウムとの１：
１モルキレート錯塩が生成したこと、およびそのような
錯塩は螢光性であり、かつ安定であることを示す。
【０１２４】Ｆ．標識したテオフィリンの抗体への結合
による螢光の増強によるテオフィリンの均質螢光イムノ
アッセイ テオフィリンのアッセイは、上の螢光標識したテオフィ
リントレーサーのテルビウムキレート（すなわち、2,6-
ビス〔N,N-ジ（カルボキシメチル）アミキメチル〕-4−
〔4-（テオフィリン-8−ブチルアミド）−フェニル〕−
ピリジンテリビウムキレート）が抗テオフィリン抗体へ
の結合についてテオフィリンスタンダードと競合するこ
とを許容することによって実施される。抗体への結合に
際し標識したテオフィリンはその螢光の増強を受け、そ
してこの増強は結合した標識テオフィリンの量に正比例
し、そしてサンプル中に存在するテオフィリンの量に反
比例する。アッセイはポリスチレン試験管（１２×１５
mm）中で実施され、該試験管へ０．０１M ホウ酸ナトリ
ウム緩衝液ｐＨ８．５の１mlが加えられる。その後１μ
M トレーサー１０μＬ（８．７ｎｇ）およびテオフィリ
ンスタンダード（0,5.4, 16.2, 54および540 ng）の１
０μＬが添加される。0.1M塩化ナトリウムおよび１％正
常ヒト血清を含有する 0.01Mホウ酸塩中の約０．３μM
抗テオフィリン抗体２５μＬ（アッセイ管中の最終濃度
約７．５nM）の添加は、種々のスタンダードに対し、観
察された螢光の増加それぞれ４００％〜５０％へ導く。
これは5.4, 16.2, 54 および540ng スタンダードについ
てそれぞれ 80, 64,53および14％の B／Bo値に相当す
る。
による螢光の増強によるテオフィリンの均質螢光イムノ
アッセイ テオフィリンのアッセイは、上の螢光標識したテオフィ
リントレーサーのテルビウムキレート（すなわち、2,6-
ビス〔N,N-ジ（カルボキシメチル）アミキメチル〕-4−
〔4-（テオフィリン-8−ブチルアミド）−フェニル〕−
ピリジンテリビウムキレート）が抗テオフィリン抗体へ
の結合についてテオフィリンスタンダードと競合するこ
とを許容することによって実施される。抗体への結合に
際し標識したテオフィリンはその螢光の増強を受け、そ
してこの増強は結合した標識テオフィリンの量に正比例
し、そしてサンプル中に存在するテオフィリンの量に反
比例する。アッセイはポリスチレン試験管（１２×１５
mm）中で実施され、該試験管へ０．０１M ホウ酸ナトリ
ウム緩衝液ｐＨ８．５の１mlが加えられる。その後１μ
M トレーサー１０μＬ（８．７ｎｇ）およびテオフィリ
ンスタンダード（0,5.4, 16.2, 54および540 ng）の１
０μＬが添加される。0.1M塩化ナトリウムおよび１％正
常ヒト血清を含有する 0.01Mホウ酸塩中の約０．３μM
抗テオフィリン抗体２５μＬ（アッセイ管中の最終濃度
約７．５nM）の添加は、種々のスタンダードに対し、観
察された螢光の増加それぞれ４００％〜５０％へ導く。
これは5.4, 16.2, 54 および540ng スタンダードについ
てそれぞれ 80, 64,53および14％の B／Bo値に相当す
る。
【０１２５】実施例２０ Ａ．O-ベンジルバニリンの製造 バニリン 100.4g（0.66モル）アルドリッチ ベンジルクロライド 84.0g （77ml, 0.66モル） 炭酸カリウム 115 g アセトン 2 Ｌ 18−クラウン-6 3 g
【０１２６】上記成分をマントル、コンデンサーおよび
メカニカルスターラーを備えた３Ｌ三頚丸底フラスコへ
入れる。混合物を還流下７０時間かきまぜる。最初の２
４時間の間に明るい黄色になり、還流３日目に明るい黄
褐色に変わる。次にアセトン約１Ｌを留去し、残渣を砕
いた氷（約２Ｌ）と水（約５００ml）中にかきまぜなが
ら注ぐ。溶液を接種し、固体沈澱を析出させ、約２０分
間静置し、次にロ過し、エタノール（０℃，４００ml）
で洗い、真空乾燥すると、所望の生成物１２０ｇを与え
る。これは約７５％の収率である。
メカニカルスターラーを備えた３Ｌ三頚丸底フラスコへ
入れる。混合物を還流下７０時間かきまぜる。最初の２
４時間の間に明るい黄色になり、還流３日目に明るい黄
褐色に変わる。次にアセトン約１Ｌを留去し、残渣を砕
いた氷（約２Ｌ）と水（約５００ml）中にかきまぜなが
ら注ぐ。溶液を接種し、固体沈澱を析出させ、約２０分
間静置し、次にロ過し、エタノール（０℃，４００ml）
で洗い、真空乾燥すると、所望の生成物１２０ｇを与え
る。これは約７５％の収率である。
【０１２７】Ｂ．2,6-ジ（2-フリル）-4−（3-メトキシ
-4−ベンジルオキシフェニル）−ピリジン O-ベンジルバニリン（Ａ部から）31.5g （0.13モル） アセチルフラン（アルドリッチ） 43g（0.39モル） メタノール 300 ml
-4−ベンジルオキシフェニル）−ピリジン O-ベンジルバニリン（Ａ部から）31.5g （0.13モル） アセチルフラン（アルドリッチ） 43g（0.39モル） メタノール 300 ml
【０１２８】上記成分を５００mlフラスコ中で混合し、
均質になるまで（約２０分）加熱し、かきまぜる。次に
２０％ KOH／メタノール約５mlを加え、４５分間加熱か
くはんを続ける。次に２０％ KHO／メターノルの他の１
５mlを加え、フラスコの口を軽くカバーし、中味を１６
時間加熱し、かきまぜる。生成物を6N HCl（約１０ml）
で酸性化し、約５５℃でロータリーエバポレーター中で
濃縮する。
均質になるまで（約２０分）加熱し、かきまぜる。次に
２０％ KOH／メタノール約５mlを加え、４５分間加熱か
くはんを続ける。次に２０％ KHO／メターノルの他の１
５mlを加え、フラスコの口を軽くカバーし、中味を１６
時間加熱し、かきまぜる。生成物を6N HCl（約１０ml）
で酸性化し、約５５℃でロータリーエバポレーター中で
濃縮する。
【０１２９】次にヒドロキシルアミン塩酸塩２２ｇとｎ
−ブチルアルコール２５０mlを加え、混合物をマントル
を使って３時間還流する。ブタノールを約６５℃でロー
タリーエバポレーター中で除去し、残渣を水（２００m
l）中へ注ぎ、6N NaOH （６０ml）で塩基性化し、トル
エン（２×２００ml）で抽出する。抽出液を水（約１０
０ml）で洗い、Na2SO4上で乾燥し、ロータリーエバポレ
ーターで約６５℃において黒い油へ濃縮する。これをシ
リカゲル（約２００ｇ）でロ過し、１：１ CH2Cl2 ／ヘ
キサンで溶出する。溶出液を油へ濃縮する。この油を再
度シリカロ過にかけ、再度油へ濃縮し、再度シリカゲル
（約２００ｇ）でロ過し、今度はトルエン／CH2Cl2
９：１（約１Ｌ）で溶出する。この溶出液はこはく色油
へ濃縮され、エタノール（約５０ml）に溶解され、再度
油へ濃縮される。製品収率は約２５ｇである。
−ブチルアルコール２５０mlを加え、混合物をマントル
を使って３時間還流する。ブタノールを約６５℃でロー
タリーエバポレーター中で除去し、残渣を水（２００m
l）中へ注ぎ、6N NaOH （６０ml）で塩基性化し、トル
エン（２×２００ml）で抽出する。抽出液を水（約１０
０ml）で洗い、Na2SO4上で乾燥し、ロータリーエバポレ
ーターで約６５℃において黒い油へ濃縮する。これをシ
リカゲル（約２００ｇ）でロ過し、１：１ CH2Cl2 ／ヘ
キサンで溶出する。溶出液を油へ濃縮する。この油を再
度シリカロ過にかけ、再度油へ濃縮し、再度シリカゲル
（約２００ｇ）でロ過し、今度はトルエン／CH2Cl2
９：１（約１Ｌ）で溶出する。この溶出液はこはく色油
へ濃縮され、エタノール（約５０ml）に溶解され、再度
油へ濃縮される。製品収率は約２５ｇである。
【０１３０】Ｃ．4-（3-メトキシ-4−ベンジルオキシフ
ェニル）−2,6-ピリジンジカルボン酸ジフリルピリジン
（Ｂ部から）19g （0.45モル） t-ブチルアルコール 3Ｌ 脱イオン水 0.6Ｌ 過マンガン酸カリウム 93g
ェニル）−2,6-ピリジンジカルボン酸ジフリルピリジン
（Ｂ部から）19g （0.45モル） t-ブチルアルコール 3Ｌ 脱イオン水 0.6Ｌ 過マンガン酸カリウム 93g
【０１３１】実施例１のＣ部の操作を以下の変更を加え
て実施する。KMnO4 添加後、混合物を１．５時間加熱、
かきまぜる。次にｔ−ブタノールを留去する。約２００
mlへ濃縮後、生成物を2N HCl（約５０ml）で酸性化す
る。カナリヤ黄色沈澱が生成し、これを水数mlで薄め、
ロ過し、冷水（約５０ml）で洗い、真空乾燥し、製品１
５．２ｇを与える。これは約９０％の収率である。
て実施する。KMnO4 添加後、混合物を１．５時間加熱、
かきまぜる。次にｔ−ブタノールを留去する。約２００
mlへ濃縮後、生成物を2N HCl（約５０ml）で酸性化す
る。カナリヤ黄色沈澱が生成し、これを水数mlで薄め、
ロ過し、冷水（約５０ml）で洗い、真空乾燥し、製品１
５．２ｇを与える。これは約９０％の収率である。
【０１３２】Ｄ．4-（3-メトキシ-4−ベンジルオキシフ
ェニル-2,6−ピリジンカルボン酸クロライド ジ酸（Ｃ部から） 6.07g （0.016 モル） 塩化メチレン 60 ml オキザリルクロライド 3.5 ml ジメチルホルムアミド 4 滴
ェニル-2,6−ピリジンカルボン酸クロライド ジ酸（Ｃ部から） 6.07g （0.016 モル） 塩化メチレン 60 ml オキザリルクロライド 3.5 ml ジメチルホルムアミド 4 滴
【０１３３】ジ酸を乾燥チューブおよび隔壁ストッパー
を取り付けた１００ml二頚丸底フラスコ中へ秤量する。
かくはん棒を CH2Cl2 （約６０ml）および DMFとともに
加える。オキザリルクロライド（３．５ml）を注射器か
らゆっくり加える間（添加時間約５分）混合物を氷中で
かきまぜる。次に反応混合物を室温で２時間かきまぜ
る。酸は約１時間で HClを発生して溶液中へ移行する。
暗色溶液を２５０mlフラスコへ移し、そして溶媒をロー
タリーエバポレーターで除去する。ベンゼン（約１００
ml）を黄色残渣へ加え、ロータリーエバポレーターで除
去すると、所望のクロライドである暗緑色固体６．６５
ｇが得られる。
を取り付けた１００ml二頚丸底フラスコ中へ秤量する。
かくはん棒を CH2Cl2 （約６０ml）および DMFとともに
加える。オキザリルクロライド（３．５ml）を注射器か
らゆっくり加える間（添加時間約５分）混合物を氷中で
かきまぜる。次に反応混合物を室温で２時間かきまぜ
る。酸は約１時間で HClを発生して溶液中へ移行する。
暗色溶液を２５０mlフラスコへ移し、そして溶媒をロー
タリーエバポレーターで除去する。ベンゼン（約１００
ml）を黄色残渣へ加え、ロータリーエバポレーターで除
去すると、所望のクロライドである暗緑色固体６．６５
ｇが得られる。
【０１３４】Ｅ．4-（3-メトキシ-4−ベンジルオキシフ
ェニル）-2,6−ピリジンメタノールジ酸クロライド（Ｄ
部から）6.65g （0.16モル） ジグリム 300 ml 水素化ホウ素ナトリウム 1.5g テトラヒドロフラン 20 ml
ェニル）-2,6−ピリジンメタノールジ酸クロライド（Ｄ
部から）6.65g （0.16モル） ジグリム 300 ml 水素化ホウ素ナトリウム 1.5g テトラヒドロフラン 20 ml
【０１３５】NaBH4 をアルゴン導入口、温度計および添
加ロートを備えた乾燥５００ml三頚フラスコ中へ秤取す
る。かくはん棒およびジグリム（約３００ml）を加え、
フラスコをアルゴンで掃気し、０℃へ冷却する。ジ酸ク
ロライドをジグリム（約４０ml）およびＴＨＦ（約２０
ml）中に溶解し、添加ロートへ移し、そしてかきまぜお
よび冷却下（温度０℃）１５分を要してフラスコへ滴下
する。混合物を室温で２時間かきまぜる。溶液の色はこ
はく色から１時間の間にさんご色へ変化し、次に以後濁
った褐色へ変化する。生成物を水（約５００ml）と約１
００mlの０．１M クエン間中へ注ぎ、ロータリーエバポ
レーターで濃縮する（６０℃）。残渣（約５００ml）を
水（約Ｌ）中へ注ぎ、そしてエチルエーテル（４×１０
０ml）で抽出する。抽出液をNa2SO4上で乾燥し、ロータ
リーエバポレーターで濃縮し、DMSOに可溶な褐色固体と
して所望のジオール４．０ｇを得る。
加ロートを備えた乾燥５００ml三頚フラスコ中へ秤取す
る。かくはん棒およびジグリム（約３００ml）を加え、
フラスコをアルゴンで掃気し、０℃へ冷却する。ジ酸ク
ロライドをジグリム（約４０ml）およびＴＨＦ（約２０
ml）中に溶解し、添加ロートへ移し、そしてかきまぜお
よび冷却下（温度０℃）１５分を要してフラスコへ滴下
する。混合物を室温で２時間かきまぜる。溶液の色はこ
はく色から１時間の間にさんご色へ変化し、次に以後濁
った褐色へ変化する。生成物を水（約５００ml）と約１
００mlの０．１M クエン間中へ注ぎ、ロータリーエバポ
レーターで濃縮する（６０℃）。残渣（約５００ml）を
水（約Ｌ）中へ注ぎ、そしてエチルエーテル（４×１０
０ml）で抽出する。抽出液をNa2SO4上で乾燥し、ロータ
リーエバポレーターで濃縮し、DMSOに可溶な褐色固体と
して所望のジオール４．０ｇを得る。
【０１３６】Ｆ．4-（3-メトキシ-4−ベンジルオキシフ
ェニル）-2,6−ジ（ブロムメチル）-ピリジン ジオール（Ｅ部からとプラス反復）5.1g（21.2ミリモ
ル） トリフェニルフォスフィン 15.2g 臭素 3.0 ml
ェニル）-2,6−ジ（ブロムメチル）-ピリジン ジオール（Ｅ部からとプラス反復）5.1g（21.2ミリモ
ル） トリフェニルフォスフィン 15.2g 臭素 3.0 ml
【０１３７】乾燥した２５０ml三頚丸底フラスコ中にフ
ォスフィンを秤取する。 CH3CN（約５０ml）とかくはん
棒とを加え、フラスコを隔壁とアルゴン導入口で封鎖す
る。溶液を氷／メタノール中０℃へ冷却し、Br2 を約２
０分を要して滴下する。混合物を室温で１５分間かきま
ぜる。ジオールを CH3CN（約７５ml）中に懸濁し、フォ
スフィン臭素複合体中へ移し、２時間室温でかきまぜ、
そして水（約６００ml）中へ注ぎ、NaHCO3を飽和させ
る。この水性懸濁液を CH2Cl2 （２×２００ml）で抽出
する。抽出液をNa2SO4上で乾燥し、シリカゲルでロ過
し、 CH2Cl2 で溶出する。溶出液をロータリーエバポレ
ーターで２．２ｇの白色固体へ濃縮する。これが所望の
ジブロマイドであり、微量のトリフェニルフォスフィン
オキサイドを含有する。
ォスフィンを秤取する。 CH3CN（約５０ml）とかくはん
棒とを加え、フラスコを隔壁とアルゴン導入口で封鎖す
る。溶液を氷／メタノール中０℃へ冷却し、Br2 を約２
０分を要して滴下する。混合物を室温で１５分間かきま
ぜる。ジオールを CH3CN（約７５ml）中に懸濁し、フォ
スフィン臭素複合体中へ移し、２時間室温でかきまぜ、
そして水（約６００ml）中へ注ぎ、NaHCO3を飽和させ
る。この水性懸濁液を CH2Cl2 （２×２００ml）で抽出
する。抽出液をNa2SO4上で乾燥し、シリカゲルでロ過
し、 CH2Cl2 で溶出する。溶出液をロータリーエバポレ
ーターで２．２ｇの白色固体へ濃縮する。これが所望の
ジブロマイドであり、微量のトリフェニルフォスフィン
オキサイドを含有する。
【０１３８】Ｇ．2,6-ビス〔N,N-ジ（カルボキシメチ
ル）アミノメチル〕-4−（3-メトキシ-4−ベンジルオキ
シフェニル）−ピリジンテトラエステル ジブロマイド（Ｆ部より）2.15g （4.5 ミリモル） イミドジ酢酸ジメチルエーテル1.45g （9.0 ミリモル） 1,8 −ビス（ジメチルアミノ）−ナフタレン 1.94g
ル）アミノメチル〕-4−（3-メトキシ-4−ベンジルオキ
シフェニル）−ピリジンテトラエステル ジブロマイド（Ｆ部より）2.15g （4.5 ミリモル） イミドジ酢酸ジメチルエーテル1.45g （9.0 ミリモル） 1,8 −ビス（ジメチルアミノ）−ナフタレン 1.94g
【０１３９】乾燥した１００ml三頚フラスコ中へイミノ
エステルを秤取し、塩基および CH3CN（約５０ml）を加
える。ジブロマイドはＴＨＦ（約３５ml）に溶かし、フ
ラスコへかきまぜまがらアルゴン下４５℃で一夜添加す
る。反応混合物を水（約１５０ml）および 0.1M クエン
酸（約１５０ml）および酢酸エチル（約１５０ml）中へ
注ぐ。酢酸エチル層を分離し、0.1Mクエン酸（約１００
ml）、水（約１００ml）および食塩水（約１００ml）で
洗い、Na2SO4上で乾燥し、粘ちょうな紫色油へ濃縮す
る。この油を CH2Cl2 に溶かし、シリカ（３５ｇ）でロ
過する。紫色バンドを CH2Cl2 （約２００ml）中１０％
酢酸エチルで溶出する。その後所望のテトラエステルを
５０％酢酸エチル／ CH2Cl2 （２００ml）および８０％
酢酸エチル／ CH2Cl2 （約２００ml）で溶出する。テト
ラエステルを含有する溶液分画を約２．５ｇの油へ濃縮
する。
エステルを秤取し、塩基および CH3CN（約５０ml）を加
える。ジブロマイドはＴＨＦ（約３５ml）に溶かし、フ
ラスコへかきまぜまがらアルゴン下４５℃で一夜添加す
る。反応混合物を水（約１５０ml）および 0.1M クエン
酸（約１５０ml）および酢酸エチル（約１５０ml）中へ
注ぐ。酢酸エチル層を分離し、0.1Mクエン酸（約１００
ml）、水（約１００ml）および食塩水（約１００ml）で
洗い、Na2SO4上で乾燥し、粘ちょうな紫色油へ濃縮す
る。この油を CH2Cl2 に溶かし、シリカ（３５ｇ）でロ
過する。紫色バンドを CH2Cl2 （約２００ml）中１０％
酢酸エチルで溶出する。その後所望のテトラエステルを
５０％酢酸エチル／ CH2Cl2 （２００ml）および８０％
酢酸エチル／ CH2Cl2 （約２００ml）で溶出する。テト
ラエステルを含有する溶液分画を約２．５ｇの油へ濃縮
する。
【０１４０】Ｈ．テトラエステルの鹸化 工程Ｇのテトラエステルは実施例１の操作を使用して鹸
化され、所望のテトラ酸を与える。
化され、所望のテトラ酸を与える。
【０１４１】実施例２１ 実施例１９の一般的操作を追従して、4-〔４（または
３）−アミノフェニル〕−2,6 −ビス〔N,N-ジ（カルボ
キシメチル）アミノメチル〕−ピリジンテトラエステル
は、ジゴキシゲニンオン-3−O-カルボキシメチルオキシ
ム、フェニトイン-3−（8-オクタン酸）、およびコルチ
ゾール-3-O−カルボキシメチルオキシムへ結合され、結
晶物質を与える。これらテトラエステルの鹸化はテトラ
酸を与え、それは希土類金属と標的検体の螢光標識した
免疫学的に活性な類縁体を形成した。
３）−アミノフェニル〕−2,6 −ビス〔N,N-ジ（カルボ
キシメチル）アミノメチル〕−ピリジンテトラエステル
は、ジゴキシゲニンオン-3−O-カルボキシメチルオキシ
ム、フェニトイン-3−（8-オクタン酸）、およびコルチ
ゾール-3-O−カルボキシメチルオキシムへ結合され、結
晶物質を与える。これらテトラエステルの鹸化はテトラ
酸を与え、それは希土類金属と標的検体の螢光標識した
免疫学的に活性な類縁体を形成した。
Claims (2)
- 【請求項１】式Ｉ： （式中、ｎおよびｎ’は独立に１または２の整数であ
り、Ａｒはアリールであり、ｎ”はＡｒ上の提供可能な
結合部位の数に等しい整数であり、Ｍは水素か金属イオ
ンであり、そして（Ｒ）ｎ”，Ｒ’およびＲ”はめいめ
い独立に水素か、電子供与基か、または生物学的に活性
な物質への結合手を提供することができる連結基から選
ばれ、ただし（Ｒ）ｎ”の少なくとも１個は電子供与基
であり、そしてＲ’，Ｒ”，（Ｒ）ｎ”の少なくとも１
個は連結基である。）を有するアリール置換ピリジン誘
導体を前記連結基を使用して生物学的に活性な物質へ直
接、または二官能スペーサー基を介して結合して標識す
る工程、標識した生物学的に活性な物質へ希土類金属イ
オンを錯塩結合して希土類金属キレートを生成させる工
程、生成した希土類金属キレートを測光的に励起し、そ
して該分子からの蛍光放出を検出することによって標的
分子の存在を検出することを特徴とする蛍光アッセイ方
法。 - 【請求項２】前記励起は放射線のパルスによって実施さ
れ、該パルスは前記金属キレート分子の蛍光崩壊寿命に
比較して短いパルス持続時間を有し、そして前記金属キ
レート分子の蛍光を環境物質の蛍光が実質上崩壊した後
に検出する請求項１の方法。
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