JPH0614042B2 - 蛍光標識化特異性結合試薬 - Google Patents

蛍光標識化特異性結合試薬

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JPH0614042B2
JPH0614042B2 JP57112653A JP11265382A JPH0614042B2 JP H0614042 B2 JPH0614042 B2 JP H0614042B2 JP 57112653 A JP57112653 A JP 57112653A JP 11265382 A JP11265382 A JP 11265382A JP H0614042 B2 JPH0614042 B2 JP H0614042B2
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は蛍光性に標識化した生理学的活性物質を含む特
異性結合試薬に関する。
特殊の結合検定において感度は、一般に測定される被分
析物質のレベルが低いために、非常に重要なものであ
る。
螢光分光学分析試験において分析されるべき螢光種を含
む試料はターゲット螢光種の励起スペクトル内に既知の
分光分布の光で照射される。得られる螢光ターゲット分
子の特性発光スペクトルの強度が測定され、ターゲット
分子の数に関連づけられる。
螢光分析試験の感度は、理論的には極めて高いけれど
も、バックグラウンド螢光の存在によって制限される。
バックグラウンド信号レベルは試料においてだけでなく
試料を含む物質において競合する螢光物質から捕えられ
る。これは、生物学的流体においてみられるような低濃
度の望ましいターゲット螢光分子を含む試料と関連した
種の定量的測定において特に重要な問題である。多くの
場合望ましい感度を得るのに十分に（当業者に知られた
適当な過及び他の技術によって）バックグラウンドを
低下させることは不可能である。
時間分解能は興味のある特定の螢光信号を特定でないバ
ックグラウンド螢光から分離するという独立の手段を与
える。時間分解能はもし標識物がバックグラウンドより
もずっと長寿命の螢光を有するならば、そしてもし長寿
命の標識物が短命のバックグラウンドの衰微に伴なって
起る暗期間の間測定できるようにその系が断続的な光源
によって照明されるならば可能である。そのような技術
は西独公開公報第２６２８１５８号においてより詳細に
記載されている。
長寿命螢光（0.1〜５ｍsec）のある種の希土類金属の芳
香族ジケトンキレート化合物、例えばユーロピウムベン
ゾイルアセトネート及びユーロピウムベンゾイルトリフ
ルオルアセトネートがある期間知られてきた。そのキレ
ート剤は光を吸収しそれを金属イオンに伝達し螢光を発
する。西独公開公報第２６２８１５８号は検定において
バックグラウンド干渉を生ずる種のそれと比較した時、
発光が長寿命である螢光標識物の使用を通して螢光分析
免疫検定（FIA）における時間分解能の使用を記載して
いる。この公報はまたFIAの技術の有用な議論及び放射
性免疫検定（RIA）のような他の免疫技術についてその
利点を与えている。
西独公開公報第２６２８１５８号に記載された螢光免疫
試薬は少なくとも一つの免疫系の部分、すなわち希土類
キレートと「結合された」抗体（免疫体）又は抗原を含
んでいる。そのような「結合」は二つの方法： (1)最初、標識化、すなわち「Fluorescent Antibody Te
chniques and Their Application」A.Kawamura,Ed.,University Park Press,
Baltimore,Maryland，１９６９において記載されたよう
に希土類キレートを抗原に結合し、次いで抗体を結合さ
れた抗原に添加しこれにより抗体と抗原が通常の型で結
合することによる、又は (2)抗体をキレートに化学的な基によって共有結合させ
ることによる、 のうちの一つにおいて達成することができる。
西独公開公報第２６２８１５８号において記載された型
の免疫試薬についての問題は水と接触した時、螢光標識
種、すなわち希土類キレートが冷却され、すなわちそれ
らの螢光が消失するということである。以後「水安定
性」の問題として言及されるこの問題は螢光標識化免疫
試薬のための主な用途が血液及び血清のような水性の生
物学的流体の分析試験にあるため特に重大である。もし
水安定性をこれらの物質に与えることができるならそれ
らはこれらの生物学的流体用の螢光標識物として有用で
あり、かくてバックグラウンドからの信号の時間分解能
の使用によって螢光免疫分析感度を増加せしめる。螢光
キレートの「水安定性」は１０10Ｍ-1よりも大きい結合
定数（すなわち結合定数のlog10が１０より大きい）を
示すものとしてここに規定される。この結合定数はキレ
ート剤のランタニド金属に対する結合を言及するもので
ある。
更に、従来蛍光分析に使用されていた希土類キレート
は、例えば発光に対する低量子収率、少量の検知可能物
質を用いる際に不十分な蛍光しか生じない、望ましくな
い増感剤吸光係数、通常低λmax範囲にある、試料中の
他の成分の分析妨害（又は干渉）を受けやすい低λma
x、貧水溶性（大部分の生物流体は水性である）及び低
濃度におけるキレートの不安定性などのような好ましく
ない性質を有していた。
本発明に従えば、ランタニド金属及びキレート剤を含む
蛍光性標識体に吸着又は結合された生理学的に活性な物
質を含んで成る蛍光標識化特異性結合試薬において、前
記キレート剤が 前記ランタニド金属より大きい三重項エネルギーを有す
る芳香族三重項増感剤である核及び 前記三重項増感剤核の異なった炭素原子に結合した少な
くとも２つのヘテロ原子含有基を含み、 前記三重項増感剤核の異なった各炭素原子が前記三重項
増感剤核にある第三のヘテロ原子に隣接してランタニド
金属とキレート構造を形成し得るように位置する蛍光標
識化特異性結合試薬が提供される。そのキレートは水溶
性であり、８〜１０の範囲のpHにおいて低濃度で安定で
あり、高感度であり、好ましいモル吸光係数（１０００
０〜４００００）及び白色光源の使用を可能にする、例
えば300nm超の、好ましくは330nm超の望ましいλmaxを
有する。これらのキレートは１０10Ｍ-1より大きい結合
定数を有する。よって本発明は抗原及びホルモンのよう
な生理学的に活性な物質を標識化する高度に効果のある
水安定性の螢光キレートの部類を提供するものである。
その試薬は螢光標識の抗原、ハプテン、抗体、植物レク
チン、炭水化物、ホルモン、酵素及び他のそのような種
特異性物質を吸着又は共有結合することによって形成さ
れる。
一般にあるランタニド金属はここに記載されたキレート
に有用である。ここで有用なランタニド金属の例はユー
ロピウム及びテルビウムであり、Sinha,S.P.著，Comple
xes of Rare Earths,Pergamon Press，１９６６に記載
されている。
キレート剤の核は必要な三重項エネルギーを有するある
三重項増感剤である。ここで有用な三重項増感剤の例は
ベンゾフェノン、プロピオフェノン、ミヒラーケトン、
アセトフェノン、1,3,5−トリアセチルベンゼン、イソ
ブチロフェノン、１，３−ジフェニル−２−プロパノ
ン、トリフェニルメチルフェニルケトン、１，２−ジベ
ンゾイルベンゼン、４，４′−ジクロロベンゾフェノ
ン、１，４−ジアセチルベンゼン、９−ベンゾイルフル
オレン、ｐ−シアノベンゾフェノン、β−ナフチルフェ
ニルケトン、２−アセトナフトン、α−ナフチルフェニ
ルケトン並びにビアセチル、ベンジル及び２，３−ペン
タンジオンのようなα，β−ジケトンを含む１−アセト
ナフトンのようなケトン，キサントン、チオキサント
ン、アントラキノン、α−ナフトフラボン、フラボン、
５，１２−ナフタセンキノン及びフルオレノンのような
ケト芳香族化合物，ベンズアルデヒド、フェニルグリオ
キサール、エチルフェニルグリオキサレート、２−ナル
トアルデヒド及び１−ナフトアルデヒドのようなアルデ
ヒド，フルオレン、トリフェニレン、フェナントレン、
ナフタレン及びピレンのような線状もしくは溶融多環式
芳香族化合物，カルバゾール、テルピリジン、フェナン
トロリン、トリフェニルアミン、チアゾリン、特に２−
ベンゾイルメチレン−１−メチルナフト〔１，２−ｄ〕
チアゾリン、２−フロイルメチレン−１−メチルナフト
〔１，２−ｄ〕チアゾリン、２−（ジフロイルメチレ
ン）−１−メチルナフト〔１，２−ｄ〕チアゾリン、１
−メチル−２−テノイルメチレンナフト〔１，２−ｄ〕
チアゾリン及び２−（ジテノイルメチレン）−１−メチ
ルナフト〔１，２−ｄ〕チアゾリンのような２−有機カ
ルボニルチアゾリン、のような複素環式及び芳香族窒素
含有化合物，米国特許第2,732,301号及び第4,119,466号
において記載されたようなチアゾリン化合物，並びに米
国特許第4,147,552号において記載されたようなケトク
マリンを含む。
ランタニド金属がユーロピウムである時、三重項エネル
ギーは少なくとも47kcalでなければならず、もしランタ
ニド金属がテルビウムであるならば核の三重項エネルギ
ーは少なくとも53kcalでなければならない。
キレート剤はまたそれらがランタニド金属と配位結合を
形成することができるようにキレート剤上に位置する少
なくとも２つのヘテロ原子を含む基を有する。ランタニ
ド金属と配位結合を形成することができる基はニトリロ
ジアセテート、カルボキシ、ヒドロキシ、アルコキシ、
アミノ、アミド、カルボニル、及びメルカプト基を含
む。これらの基はランタニド金属と基とのキレート化を
可能にするように核に付加される。
好ましいキレート剤は構造， （式中 R2を共に有するＺはランタニド金属のそれよりもより大
きい三重項エネルギーを有する三重項増感剤である置換
（例えば免疫試薬に結合されたウレイレン、チオウレイ
レン、カルボニルイミノもしくはイミノのような免疫試
薬を連結するために使用された基、又はクマリン基と
の）又は未置換の核を満たすのに必要な原子を表わし， R2は(1)ヘテロ原子又は(2)少なくとも１個のヘテロ原子
をその中に有するアルキレン基又はそれらに付加された
ヘテロ原子もしくはヘテロ原子を含む基であり，そして R3及びR4はヘテロ原子を含む基で同じか又は異なったも
ので，Ｒ３及びＲ４はＲ２に十分に近接（又は隣接）し
て、ランタニド金属が（イ）Ｒ２と（ロ）Ｒ３もしくは
Ｒ４又はＲ３及びＲ４の両者とキレートを形成し得るよ
うに位置しており；ここでR2によって表わされた炭素と
ヘテロ原子の数は２０に等しいか又はより小さい。） を有する。
R2は窒素、酸素、硫黄、もしくはセレニウムのようなヘ
テロ原子又は少なくとも１個のヘテロ原子をその中に有
するアルキレン基又はそれらに付加されたヘテロ原子も
しくはヘテロ原子を含む基である。R2で表わされた全原
子数は２０に等しいか又はより小さい、かくてR2は１個
又はそれ以上のヘテロ原子を含むことができる。R2の例
は 及びヘテロ原子又は１０個までの炭素原子を有するヘテ
ロ原子を含むアルキレン基である。さらにその例はカル
ボニル、ジカルボニル、チオカルボニル、ヒドロキシメ
チレン、１，２−ジヒドロキシエチレン及び１，２−ジ
ヒドロキシビニレンである。
Ｒ３及びＲ４は個々にＲ２に隣接している。
ある好ましい実施態様においてランタニド金属はフェノ
ール性の水酸基に対してオルソの各位置に置換されたイ
ミノジアセテート基を有するフェノールとキレートす
る。そのフェノールは未置換のものか又はアルコキシ、
アルキル、ハロゲンもしくはカルボニルのような種々の
基で置換されたものであり、所望によりもう一つの芳香
族基又は脂乾式もしくは複素環式基に溶和される。特に
構造： （式中 Ｍは水素又はアンモニウムもしくはテトラメチルアンモ
ニウム、テトラエチルアンモニウム、もしくはベンジル
トリメチルアンモニウムのようなその誘導体、のような
カチオン、又はナトリウム、リチウム、カリウム、ルビ
ジウム、もしくはセシウムのようなアルカリ金属であ
り，そして Ｄは芳香族環を完成するに必要な原子を表わす。）を有
する化合物が好ましい。この芳香族環は前記のようにヒ
ドロキシル基を有しなければならない。さらにそれは のようなカルボニル基を有さなければならず、ここでア
ルキルは一般にメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペ
ンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシ
ル、又はそれらの異性体のような１０までの炭素原子を
含み、Arはフェニルのようなアリールであり；又それは
好ましくはベンゼン（置換又は未置換）、ベンゾフェノ
ン、又はクマリン核を形成するためにカルボニル基を有
するピランのような４〜７個の炭素原子を含むもう一つ
の芳香族、脂環式、又は複素環式の環に対して２つの有
効位置において縮合されねばならない。芳香族環の例は
フェニル、ナフチル等であり、所望により好ましくはメ
チル、エチル、プロピル、もしくはブチル又はそれらの
異性体のような１〜４個の炭素原子を含むアルキル，ヒ
ドロキシ，フェニルのようなアリール，CHOのようなア
ルデヒド基，又は のようなベンゾイル基で有効位置のいずれかに置換され
たものである。特に好ましい実施態様においてＤはベン
ゾイル置換基のようなカルボニル置換基を有するフェニ
ル環を形成するか又はそれはクマリン基を形成する。明
細書を通して「アルキル」及び「アリール」という語は
そのアリール又はアルキルが所望によりメチル、エチ
ル、及びプロピルのような基で置換されている置換アル
キル及びアリールを含む。
本発明の好ましい実施態様は次の構造： （式中 Ｍは水素、アンモニウム、もしくはアルカリ金属イオ
ン、又はその塩を水溶性たらしめる何か他の適当なカチ
オンである。） を有する塩又は酸とランタニド金属とのキレートの形成
を伴なう。
もう一つの好ましい実施態様においてランタニド金属と
錯体を形成する有機化合物は次の構造： （式中 R5は好ましくは のようなアロイルであり、 各R6は水素，メチル、エチル、プロピル、もしくはブチ
ルのような１〜４個の炭素原子を有するアルキル，さら
に置換もしくは置換されていないアリールもしくはアロ
イル，メトキシ及びプロポキシのようなアルコキシ，又
は臭素もしくは塩素のようなハロゲンから独立に選ばれ
る。） を有する。
好ましいアロイルR5置換基は所望によりさらにアリール
もしくはアルキル基で、又はエステル、アミド、カルバ
ミド、チオカルバミド、イソシアネート、チオシアネー
ト、ハロゲン、もしくはニトリル基で置換される。
R5が陰性（すなわち電子吸引）基とは他のものによって
クマリン環に付加されるある種の他のクマリン化合物
は、激しく螢光を発することが知られており、本発明の
実施には有用ではない。というのはこの螢光が可視スペ
クトルにおいて伴って起る螢光を有するユーロピウム又
はテルビウム錯体への励起エネルギーの移動を防ぐから
である。希土類キレートを形成するために使用される有
機の塩又は酸は３００〜５００nmの範囲において吸収
し、次いでその励起エネルギーをランタニド金属に移動
しなければならず、これにより可視スペクトルにおいて
螢光を発する。有用な錯体化する化合物の他の例は下記
を含む。
前記したランタニド金属とキレート剤とからの錯体（co
mplex）はランタニド金属とキレート剤とを任意の比で
含む。好ましい態様では、ランタニド金属とキレート剤
とのモル比は１：１〜２：１、最も好ましくは１：１で
ある。
本発明に係る前記キレート剤は構造 の既知の化合物及びイミノジ酢酸もしくはそのエステル
とホルムアルデヒドとの間のマンニッヒ反応を行なう
か，又はブロモメチルもしくはメチレントシレート基の
ような活性メチレン基を有する構造 の化合物とイミノジ酢酸エステルとの間の求核置換反応
をし、そして次いでそのエステルを加水分解することに
よって製造される。
有用な化合物は下記を含む。
ランタニド金属とキレート剤はpH7.5〜１０の水溶液に
おいてキレート剤の水溶液をランタニド金属塩と単に混
合することによって容易に錯体化される。ランタニド金
属塩はTbCl3・6H2O又はEuCl3・6H2Oのような塩素塩のよう
なある金属の水溶性塩である。
キレートは一般に８〜１１のpH、好ましくは８〜９の水
溶液において製造される。
キレートは所望により最適なpHを生ずるように燐酸塩及
び硼酸塩のような緩衝剤と混合される。
キレートは錯体に吸着又は共有結合によって結合するこ
とによって種々の生理学的に活性な物質を標識づけるの
に有用である。この型で標識づけられる生理学的に活性
な物質の中には酵素及びそれらの受媒質、抗原、すなわ
ち適当な条件下で特にある探知できる方法で抗体、炭水
化物、代謝産物、薬、他の薬物学的剤及びそれらの受容
体と反応することができるある物質、並びに他の結合物
質がある。特殊の結合検定試薬は米国特許第3,557,555
号、第3,853,987号、第4,108,972号及び第4,205,058号
において記載されている。
そのような生理学的に活性な物質の錯体に対する結合を
達成する技術は当業者によく知られていて、その物質を
単に共に混合することを含む。
特殊結合検定方法においては、測定される分析物に構造
的な類似性を有する化合物が探知できる標識物に結合さ
れる。測定される分析物はここに配位子として言及さ
れ、標識化された化合物は配位子アナローグとして言及
される。特に配位子及び配位子アナローグを認識し、そ
れらに結合する化合物は受容体として言及される。
あるそのような型の検定を行なうのに配位子は受容体に
結合する配位子アナローグと競争して置かれる。未知の
濃度の配位子が標識化された配位子アナローグの測定さ
れた信号から推論される。その反応は次のように進行す
る。
配位子＋（標識化された）配位子アナローグ＋受容体
配位子／受容体＋配位子アナローグ／受容体 例証的な目的のために次の議論はある特定の型の特殊の
結合検定技術すなわち競争的な結合螢光免疫検定技術を
述べている。
この系は螢光標識で標識化された抗原、未標識の天然抗
原（試験試料において）及び特殊な抗体からなり、これ
により未標識の抗原と抗体に結合する標識化された抗原
との間に競争が存在する。
系における試験試料からの未標識の抗原の濃度が大にな
ればなるほど抗体によって結合される標識化された抗原
はより少なくなる。もし標識化された抗原及び抗体の濃
度が一定で、未標識の抗原の量が変化するだけならば、
抗原−抗体錯体を残留する遊離抗原（標識及び未標識の
いずれも）から物理的に分離すること、及び遊離かもし
くは結合されたかのいずれかの標識化された抗原の螢光
を、同じ方法で処理されたある範囲の既知量の抗原によ
って与えられた値の標準曲線のプロットと比較するこ
と、によって未知の量の未標識の抗原を測定することが
可能である。
好ましい螢光的に標識化された特殊の結合試薬は構造： （式中 Ｚ、R2、R3、及びR4は前記のようなものであり、Ｌ′は のようなエステル， のようなアミド，SO2NH−、 のようなスルホアミド，−Ｏ−、−Ｓ−のようなエーテ
ル， のようなカルボニル，＝Ｎ−のようなニトリロ，−NH−
のようなイミノの如き結合基であり、アリーレン及びチ
オアリーレンのような付加的な有機結合原子を含んでな
るそれらの基を含み， ｐ及びｍは０又は１であり、ｎは１〜３であり、R1は抗
原又はホルモンのような生理学的に活性な物質であ
る。） を有するランタニド金属とキレート剤の錯体を含んでな
る。
前記のようにいったん製造された場合、螢光標識された
生理学的に活性な種は螢光の特殊の結合検定、特に西独
公開公報第2,628,158号において記載されたバックグラ
ウンドから識別する信号を特別に検出する一時的な分割
を利用するもの、に有用である。この時分割されたモー
ド（すなわち、一時的分割）において試料は断続的な様
式で励起され、情報は他の螢光源が衰微した時を除い
て、長生の螢光標識物がまだ強く発する時、暗サイクル
の間のみ受け入れられる。不連続の励起がパルスレーザ
ーを含み、連続励起ビームを機械的に細断し、試料を励
起ビームにおいて及びから移動する種々の方法で達成さ
れる。さらに不連続の励起は試料による大量のエネルギ
ーの吸収なしに高い輻射力の使用を可能にし、サンプル
の光劣化の可能性を減少する利点を有する。
ここに記載された特殊の結合試薬が効用を見い出すその
ような螢光の特殊の結合検定技術の例は米国特許第3,99
8,943号、第4,020,151号、第3,939,350号、第4,220,450
号及び第3,901,654号において記載されている。
特に好ましい螢光的に標識化した特殊の結合試薬は次の
構造のものを含む。
好ましい実施態様では特殊な結合検定は米国特許第4,25
8,001号において記載されているような乾式の分析要素
において行なわれる。この実施態様ではその要素は支持
体及び高分子のビーズからなる拡散／試薬層及び所望に
より表示層を含む。たいていその拡散層は試薬層から分
離している。拡散、試薬及び表示層は所望により高分子
ビーズ構造を含む。試薬層の高分子ビーズはそれらの表
面に吸着された抗体のような受容体を有する。
キレート標識物は特定の反応が試料湿潤の前に起るのを
防ぐ方法で試薬層の上、下又は中に置かれるか又はそれ
は試料と共に又はに伴なって要素上に点滴する。標識化
された配位子アナローグが配位子受容体錯体の形成にお
いて試料中の未知量の配位子と競争するために続いて湿
潤しながら要素を透過することがただ必要である。検定
は存在する遊離した標識化配位子アナローグの量又は結
合された標識化配位子アナローグ受容体の量を螢光測定
することによって行なわれる。
以下の実施例により本発明の好ましい実施態様を説明す
るが、本発明をこれらの実施例に限定するものではな
い。
例１： pH９に帰着する硼酸塩緩衝剤を含む水溶液における等モ
ル量のTbCl3・6H2OをG.Schwarzenbachら，Helv.Chim.Act
a,35,1785(1952)に記載された方法によって製造された
構造： を有する化合物と混合することによって錯体を形成し
た。３７％の水性のホルムアルデヒド溶液（３5.6ｇ、
0.4４モル）を１０〜２０℃で９０ｍのH2O及び８８ｍ
の濃縮された水性NaOH中のｐ−クレゾール（２1.6
ｇ、0.2０モル）及びイミノージ酢酸（５6.0ｇ、0.4２
モル）の溶液に滴加した。得られる混合物を６０〜７０
℃で２時間加熱し、次いで８６ｍの濃HClで中和し
た。溶剤を真空中で除去し、残留物を１２００ｍのエ
タノール中において加熱した。不溶性の物質を過によ
って除去し、溶剤容積を６００ｍまで減少し冷却し
た。沈澱した塩を過によって除去し、液を白色粉末
（９９％）として７９ｇの２，６−ビス〔Ｎ，Ｎ−ビス
（カルボキシメチル）アミノメチル〕−４−メチルフェ
ノールを与える乾燥度まで蒸発させた。生成物をエタノ
ールから再結晶化した。等モル量の生成物とpH９の水性
の硼酸塩緩衝剤中のTbCl3・6H2Oを混合することによって
錯体を形成した。その溶液が長波長ＵＶランプ（３６６
nmにλmaxを有するUVL−２１型ブラック レイランプ）
で励起された時あざやかな緑色の発光を示した。
例２： ９ｇの水酸化ナトリウムを含む６０ｍの水中の9.9ｇ
（0.0５モル）のｐ−ヒドロキシベンゾフェノンと１3.7
ｇ（0.1モル）のイミノジ酢酸の攪拌された溶液に8.9ｇ
の３７％水性ホルムアルデヒド溶液をゆっくり添加し
た。その混合物を攪拌し、５時間還流し、次いで室温ま
で冷却し、2Nの塩酸でpH２まで持っていった。形成され
た固体を収集し、水で洗浄し、風乾した。その生成物を
５００ｍの９０％エチルアルコールから再結晶化し、
5.9ｇの白色から淡紅色の固体を２つの収穫において与
えた。
C23H24N2O10・H2Oに対する分析計算値： Ｃ，５4.5，Ｈ，5.2，Ｎ，5.5 実験値：Ｃ，５4.5，Ｈ，4.8，Ｎ，6.1 UVスペクトル（pH９の硼酸塩緩衝剤）λmax ３２０nm，ε1.6×１０４ 前記化合物とpH９の硼酸塩緩衝剤中のEuCl3・6H2O又はTb
Cl3・6H2Oとの正確に等モルの混合物は長波長紫外線ラン
プで励起された時鮮かな赤色（Eu+3）又は緑色（Tb+3）
の螢光を示した。前記ユーロピウムキレート溶液からの
発光強度をFarrand Instrment Company販売のファラン
ドスペクトロフルオリメーターにおける濃度の関数とし
て試験した。データはユーロピウムキレートにおける10
-5〜10-9Ｍの濃度の対数の関数として発光の対数におい
て直線的な減少を示した。λ＝320mで励起されたpH8.5
の硼酸塩緩衝剤における１０-6Ｍ溶液のEu+3錯体に対す
る螢光量子終了（φ）は0.0０３であった。Tb+3につい
ての同様な溶液はφ＝0.1０を有した。水中におけるEu
+3及びTb+3に対するこの配位子の結合定数のlog10の値
はそれぞれ１6.7０±0.1２Ｍ-1及び１6.7８±0.1１Ｍ-1
であった。
例３： ２５ｍのメタノール中における1.6４ｇ（0.0２モル）
の３７％水性ホルムアルデヒドの溶液に3.2２ｇ（0.0２
モル）のジメチルイミノジ酢酸を添加した。その溶液を
ロータリーエバポレーターにおいて減圧下で濃縮した。
メタノール（２５ｍ）をその残留物に添加し溶液を再
び濃縮した。残留オイル2.6６ｇ（0.0１モル）の３−ベ
ンゾイル−７−ヒドロキシクマリン、次いで４ｍのＮ
−メチルモルホリンを添加した。その混合物を１１５℃
で３時間攪拌しながら加熱し、次いでロータリーエバポ
レーターにおいて減圧下で濃縮した。得られる濃縮オイ
ルを最小量のCH2Cl2に溶かし、乾燥したシリカゲルのカ
ラムに適用した。そのカラムを１：４の酢酸エチル：CH
2Cl2で溶離した。最初の黄色帯の単一付加物は棄てた。
第二番目の黄色帯を収集した。減圧下での溶剤の除去は
1.6ｇの望ましい生成物を結晶化を引き起すことができ
ない黄色オイルとして与えた。
２０ｍの酢酸中における1.5ｇ（.0０２７モル）の前
記テトラエステルの溶液に0.6ｇ（0.003モル）の酢酸第
二銅−水塩、次いで１０ｍの水を添加した。その混合
物を攪拌し窒素下で２時間還流した。反応を室温まで冷
却し、塩酸で約pH２までもっていった。攪拌しながらそ
の混合物を硫化水素ガスで飽和し、１５分放置せしめ
た。沈澱した硫化銅を珪藻土パッドを通しての吸引過
によって除去した。透明な橙褐色の液をロータリーエ
バポレーターにおいて減圧下で濃縮した。その残留物を
２５％の水を含む熱エタノール中に溶解し、次いで最終
的に５℃で数時間冷却せしめた。固体を収集し、水で洗
浄し、真空乾燥して0.3ｇの生成物を与えた。ＵＶスペ
クトル（pH９の硼酸塩緩衝剤）λmax３９６nm、ε２７
０００。
C26H24N2O12に対する分析計算値：Ｃ，５6.1；Ｈ，4.
3，Ｎ，5.0。
実験値：Ｃ，５5.6，Ｈ，4.2，Ｎ，4.6。
正確に等モル量の前記化合物とpH９の硼酸塩緩衝剤にお
けるEuCl3・6H2Oは長波長紫外線ランプで励起された時鮮
かな赤色の発光を示した。
前記ユーロピウムキレート溶液からの発光強度をファラ
ンドスペクトロフルオリメーターにおける濃度の関数と
して試験した。そのデータはユーロピウムキレートにお
ける10-5〜10-10Ｍの濃度の関数として発光における減
少を示した。
λmax発光５９３nm、６１４nm、６５２nm、７０１nm、
５６０〜８００nmにわたる発光量子収量＝4.5％ ６１４nmにおける発光量子収量＝3.7％ 水中におけるEu3+及びTb3+とこの配合子の結合定数に対
するlog10の値はそれぞれ１6.2６±0.2３Ｍ-1及び１6.3
５±0.2１Ｍ-1であった。
例４： ２，４−ジヒドロキシ−３，５−ビス−〔Ｎ，Ｎ−ジ
（エトキシカルボニルメチル）−アミノメチル〕ベンズ
アルデヒド の製造 ５０ｍのエタノール中における8.2ｇ（0.1モル）の３
７％水性ホルムアルデヒドに１8.9ｇ（0.1モル）のジエ
チルイミノジアセテートを添加した。その混合物をロー
タリーエバポレーターにおいて減圧下で濃縮した。追加
的な５０ｍのエタノールを添加し、混合物を再び乾燥
まで濃縮した。得られるオイルに6.9ｇ（0.0５モル）の
固体２，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドを添加し
た。その混合物を攪拌し、１２０℃で３時間加熱し、次
いで精製せずに使用した。
前記をジメチルイミノジアセテートを用いて同じ結果と
共に繰り返した。
例５： ３−（４−ニトロベンゾイル）−７−ヒドロキシ−６，
８−ビス〔Ｎ，Ｎ−ジ（カルボキシメチル）−アミノメ
チル〕クマリン の製造 前記例４の粗アルデヒド（0.0５モル）に１1.8５ｇ（0.
0５モル）のエチル４−ニトロベンゾイルアセテート、
次いで１００ｍのエタノールを添加した。１ｍのエ
タノール中における３０mgの酢酸と４２mgのピペリジン
の溶液を添加し、その混合物を攪拌し、１６時間還流し
た。この時間の後反応生成物をロータリーエバポレータ
ーにおいて濃縮した。得られるオイルを最小量のCH2Cl2
中に溶解し、シリカゲル乾燥カラムに適用した。そのカ
ラムを１５０：８５０の酢酸エチル：CH2Cl2で溶離し
た。最初流れる無色の不純物と第二番目に流れる暗黄色
の不純物を棄てた。より遅く移動する淡黄色生成物帯を
収集し、溶剤を減圧下で除去した。得られるオイルをNM
R及び質量スペクトルによって分析し直接使用した。収
量、１4.3ｇ。
７５ｍの酢酸中における前記節で形成された2.6７ｇ
（0.0０３７５モル）のテトラエステルに1.0ｇ（0.0０
５モル）の酢酸第一銅−水塩、次いで２５ｍの水を添
加した。その混合物を攪拌し、窒素下で２時間還流し
た。反応を室温まで冷却し、塩酸でpH２までもっていっ
た。それから過剰の硫化水素ガスを攪拌された溶液の中
へ通過させ、その混合物を３０分放置せしめた。沈澱し
た硫化銅を珪藻土パッドを通しての吸引過によって除
去した。その液をロータリーエバポレーターにおいて
真空下で乾燥まで濃縮した。残留物を５０ｍの水です
りつぶした。固体を収集し水でよく洗浄し乾燥した。収
量1.2ｇ。サンプルを５０％の熱い水性エタノールに溶
解した。その混合物を固体が形成されるまで減圧下で濃
縮した。固体を収集し冷水で洗浄し、乾燥した。
C26H23N3O14・H2Oに対する分析計算値：Ｃ，５0.4，Ｈ，
4.1，Ｎ，6.8。
実験値：Ｃ，５0.8，Ｈ，4.1，Ｎ，6.4。
水性の重炭酸ナトリウム溶液における前記キレート剤の
触媒的な還元は相当するアミノ化合物を与えた。
例６： 前記例３において記載された１０-4Ｍの濃度のユーロピ
ウムキレートを含む素溶液を硼酸塩緩衝剤（pH8.5）で
表Ｉに示される濃度まで稀釈した。１０マイクロリット
ルの各濃度のアリコートを次の方法において製造された
分析要素上に点滴した。
ポリカーボネートフィルム支持体をオバルブミン、カル
ボキシメチルセルロース（0.1９ｇ／m2）、全溶融重量
に基づいて0.0５％のZonyl FSN（デュポンから得た非イ
オン系の螢光界面活性剤）、通常の家兎の血清（0.8３
ｇ／m2）、ポリ（ｎ−ブチルアクリレート−CO−スチレ
ン−CO−２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスル
ホン酸）（重量比７０：２０：１０）（2.2５ｇ／m2）
及びpH8.5のH3BO3・KCl緩衝剤で吸着された、ポリ（スチ
レン−ＣＯ−メタアクリル酸）（重量比９８：２）（７
5.0ｇ／m2）からなるミクロビーズ層でコートした。
それからその要素をWrattan１８Ａフィルターを有する
フルオリメーターを使用して、励起３００−４００nm及
び発光６２０nmで、pH８及びpH9.1８で評価した。
下記表において示された結果は得られた螢光信号がサン
プルにおけるユーロピウムキレートの濃度の関数である
ことを説明している。バックグラウンド螢光は５０mVで
あった。
例７： 例３において記載されたように製造されたテルビウム化
合物を例６の方法で試験した。その結果を５５０nmで測
定されマイクロアンペア（μＡ）で与えられた螢光を有
する表IIに示す。
例８： ユーロピウムと３，５−ビス〔Ｎ，Ｎ−ビス（カルボキ
シ−メチル）アミノメチル〕−４′−｛Ｎ′−〔４−
（４−ヒドロキシ−３，５−ジイオドフェノキシ）−
３，５−ジイオド−β−メトキシカルボニル−フェネチ
ル〕−チオウレイド｝−４−メトキシベンゾフェノンと
の錯体。キレート剤の製造のための総合図式は次のとお
りである。
（ここでNH2T4OCH3は ３，５−ジメチル−４−ヒドロキシ−４′−ニトロベン
ゾフェノン(1)の製造 ２５０mLのニトロベンゼン中におけるｐ−ニトロベンゾ
イルクロリド（７6.1ｇ、0.4１０モル）の攪拌された溶
液に８２ｇのAlCl3（0.6２モル）を添加した。この混合
物に２５０ｍのニトロベンゼン中における５０ｇの
２，６−ジメチルフェノール（0.4１モル）の溶液を４
５分間にわたって滴加し、得られる混合物を室温で１６
時間攪拌した。その反応物を２の３％HClと氷の中へ
注ぎ、(CH3CH2)2Oで３×１の（すなわち１づつのジ
エチルエーテルで３回）抽出をした。結合されたエーテ
ル層を１の飽和NaHCO3で洗浄し、次いで１０％NaOHで
２×１の抽出をした。結合された塩基性抽出物を濃HC
lで酸性にし白色沈澱物を与えた。過後CH3OH/H2Oから
の再結晶化により薄層クロマトグラフィー(TLC)、Ｉ
Ｒ、質量スペクトル、NMR、及び元素分析、融点１８2.5
〜１８4.5による所望の生成物に一致した３７ｇ（３３
％）の白色粉末を与えた。
C15H13NO4・H2Oに対する分析計算値：Ｃ，６2.2７，Ｈ，
5.2４；Ｎ，4.8４。
実験値：Ｃ，６2.3４；Ｈ，5.3１，Ｎ，4.7６。
３，５−ジメチル−４−メトキシ−４′−ニトロベンゾ
フェノン(2)の製造 ２５０ｍのアセトン中において化合物１（１5.0ｇ、
５5.4ミリモル）、K2CO3（２0.0ｇ、0.1４５モル）及び
CH3I（３０ｍ、0.4８モル）を含む溶液を６時間還流
した。その溶剤を蒸発させて、残留物をCH2Cl2と水の間
で分配した。有機層をNa2SO4を通して乾燥し、過し蒸
発させて黄白色粉末を残した。−２０℃でのCH3OH／石
油エーテルからの再結晶は１4.9ｇの白色結晶（９４
％）を与えた。その物質をNMR、TLC、質量スペルトル、Ｉ
Ｒ、及び元素分析、融点１３１〜１３2.5℃によって特
性づけた。
C16H15NO4に対する分析計算値：Ｃ，６7.3５；Ｈ，5.3
１；Ｎ，4.9１。
実験値：Ｃ，６7.5４；Ｈ，5.3８，Ｎ，4.8７。
３，５−ビスブロモメチル−４−メトキシ−４′−ニト
ロエンゾフェノン(3)の製造 化合物２（4.0ｇ、１４ミリモル）とｎ−ブロモスクシ
ニイミド（5.0ｇ、２８ミリモル）の混合物をラジカル
開始剤として約５０mgのジベンゾイルペルオキシドをも
った２５０ｍのCCl4においてN2下で１時間還流した。
反応物を室温まで冷却し１００ｍのCH2Cl2を添加し
た。過後水性のチオ硫酸ナトリウムで液を抽出し、
有機層をNa2SO4を通して乾燥し、過及び溶剤除去は白
色粉末を残した。この粉末を(CH3CH2)2Oで３×５０ｍ
のすりつぶしをし、TLCが３の成分を含むことを示した
5.7ｇの白色粉末を残した。NMR及び質量スペクトルは不
純物の存在を確認したが、物質の大部分は所望の生成物
であった。
３，５−ビス〔Ｎ，Ｎ−ビス（ｔ−ブトキシカルボニル
メチル）−アミノメチル〕−４−メトキシ−４′−ニト
ロベンゾフェノン(4)の製造 化合物３（2.0ｇ、4.5ミリモル）とジ−ターシャリ−ブ
チルイミノジアセテート（2.2ｇ、9.0ミリモル）の溶液
を２００ｍのテトラヒドロフランにおいて室温で６０
時間攪拌した。溶剤を除去し残りの黄色オイルをCH2Cl2
と高度に精製された水から得られた冷水性のK2CO3との
間で分配した。有機層をNa2SO4を通して乾燥し、過し
蒸発させて4.5ｇの黄色オイルを残した。溶離剤としてC
H2Cl2を有する分取ゲル透過カラムを出発物質及び単一
付加物から所望の生成物を分離するために使用した。得
られる黄色オイル（1.5ｇ、４３％）は結晶化せしめる
ことができなく、TLC、電界脱着（field desorption）
質量スペクトル、NMR、及びＩＲによって特性づけた。
４′−アミノ−３，５−ビス〔Ｎ，Ｎ−ビス（ｔ−ブト
キシ−カルボニルメチル）アミノメチル〕−４−メトキ
シベンゾフェノン(5)の製造 ニトロテトラエステル４（3.0ｇ、3.9ミリモル）を５０
psiの初期の水素圧でParr振とう機における１００mgの
１０％Pd/Cを有する５０ｍのCH3OHにおいて2.5時間還
元した。TLCは定量的な還元を示した。その混合物を珪
藻土を通して過し蒸発させて黄色のオイルを残し、そ
れは化合物４用に使用された方法によってゲル透過クロ
マトグラフィーにより精製された。このようにして得ら
れた黄色ガラスは正しいNMR、ＩＲおよび電界脱着質量
スペクトル挙動を有した。
３，５−ビス〔Ｎ，Ｎ−ビス−ｔ−ブトキシカルボニル
メチル）アミノメチル〕−４′−｛Ｎ′−〔４−（４−
ヒドロキシ−３，５−ジイオドフェノキシ）−３，５−
ジイオド−β−メトキシカルボニルフェネチル〕−チオ
ウレイド｝−４−メトキシベンゾフェノン(6)の製造 トリエチルアミン（1.2８ｍ、9.2ミリモル）と共にテ
トラエステルアミン５（1.7ｇ、2.3ミリモル）を４０ｍ
の乾燥テトラヒドロフラン（THF）に溶解し、次いで
１０ｍの乾燥THF中のチオホスゲン（0.1７５ｍ、2.
3ミリモル）を滴加した。その反応を２時間進行せし
め、その後溶剤を除去し、黄橙色オイルを得た。そのオ
イルを６０ｍの乾燥Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
（DMF）に溶解し、２０ｍDMF中におけるＬ−チロキシ
ンメチルエステルヒドロクロリド（1.9ｇ、2.3ミリモ
ル）とトリエチルアミン（0.3２ｍ、2.3ミリモル）の
溶液を一部分に添加した。反応物をN2下で１時間攪拌
し、次いで３５０ｍのH2Oに注いだ。エーテル抽出後
エーテル層を引続いて３００ｍ分の純水で３回洗浄
し、Na2SO4を通して乾燥し、過し、そして蒸発させて
3.1ｇの橙白色の泡を与えた。この物質はゲル透過クロ
マトグラフィーによって精製され、橙白色の泡として1.
3ｇの所望の生成物を与えた。その生成物をさらにTLC、
NMR、及び電界脱着質量スペクトルによって特性づけ
た。
３，５−ビス〔Ｎ，Ｎ−ビス（カルボキシメチル）アミ
ノメチル〕−４′−｛Ｎ′−〔４−（４−ヒドロキシ−
３，５−ジイオドフェノキシ）−３，５−ジイオド−β
−メトキシカルボニルフェネチル〕−チオウレイド｝−
４−メトキシベンゾフェノン(7)の製造及び評価 テトラエステル６（0.5ｇ、0.3ミリモル）を１５ｍの
CF3CO2Hに溶解し、乾燥管を反応フラスコに結合させて
室温で１６時間攪拌した。溶剤を真空で除去し橙色の泡
を残した。CH2Cl2による泡のすりつぶしは定量的な収量
の黄橙色粉末を生成した。電界脱着質量スペクトルはm/
e（質量／負荷比）１３５０で親イオンを示し、そのＩ
Ｒは生成物と一致している。
C41H38I4N4O14Sに対する分析計算値： Ｃ，３6.5，Ｈ，2.8；Ｎ，4.1；Ｓ，2.4。
実験値：Ｃ，３6.4；Ｈ，2.8；Ｎ，3.7；Ｓ，2.7。
１当量の前記化合物と２当量のpH8.5の緩衝剤中のEuCl3
・6H2Oは長波長紫外線下で弱い螢光を示し、独特の朱色
発光を与えた。螢光強度とキレート濃度との間の直線関
係はVarianＳＦ３３０スペクトロフルオリメーターで１
０-5と１０-7Ｍ及びλex＝３２０nm、λem＝６１４nmの
間で示された。１当量の化合物７と２当量のpH8.5の硼
酸塩緩衝剤中のTbCl3・6H2Oは長波長紫外線下で強い螢光
を示した。このキレートはまた螢光強度と１０-5Ｍと５
×１０-8Ｍの間のキレート濃度との間に直線関係を有し
た。
交叉反応性は抗体が未標識の抗原と比較していかによく
標識化された抗原を認識するかを反映するものである。
既知の技術によって測定されたような抗原のユーロピウ
ムキレートの交叉反応性は放射性標識化チロキシン及び
チロキシン抗体に対して７５％であった。
例９： ３，５−ビス〔Ｎ，Ｎ−ビス（カルボキシメチル）アミ
ノメチル〕−４−ヒドロキシ−３′−〔４−（４−ヒド
ロキシ−３，５−ジイオドフェノキシ）−３，５−ジイ
オド−β−エトキシカルボニルフェネチル〕ベンゾフェ
ノンとユーロピウムの錯体 この例のキレート剤の製造のための総合図は次のとおり
である。
３−カルボキシ−４′−ヒドロキシベンゾフェノン(16) この化合物を米国特許第3,531,435号（Chem.Abstracts
74,4283V(1971)）に記載された方法によって製造した。
１０ｍのテトラクロロエタン中に２6.3ｇのアニソー
ル（0.2４モル）と４６ｇの３−カルボメトキシベンゾ
イルクロリド（0.2３モル）を含む溶液を１００ｍの
テトラクロロエタン中の６５ｇAlCl3（0.4９モル）の攪
拌された溶液に０℃で１時間にわたって滴加した。その
混合物を室温まで到らせしめ１４時間攪拌した。それか
ら温度を７５〜８０℃まで上げ、３２ｇのAlCl3（0.2４
モル）を３０分間にわたって添加した。その温度を４５
分間保持し、次いでその溶液を氷と６４ｍの濃塩酸の
混合物の中へ注いだ。下部の相を除去し水洗した。テト
ラクロロエタンを水蒸気蒸留によって除去し、固体褐色
の残留物を残し、それを収集しテトラヒドロフラン及び
トルエンから再結晶化した。この中間体と水性NaOHとの
ケン化は酸性化後白色粉末（１6.5ｇ、２９％）：mp２
４０〜２４１℃（lit.２４０〜２４１℃）として所望の
生成物を与えた。
C14H10O4に対する分析計算値：Ｃ，６9.4，Ｈ，4.2。
実験値：Ｃ，６9.5；Ｈ，4.4。
３′−カルボキシ−３，５−ビス（モルホリノメチル）
−４−ヒドロキシベンゾフェノン(17) ５０ｍのイソブチルアルコール中における5.2２ｇ
（0.0６モル）のモルホリンと1.8ｇ（0.0６モル）のパ
ラホルムアルデヒドの混合物を窒素下で透明な溶液が得
られるまで還流した。この溶液に4.8ｇ（0.0２モル）の
３−カルボキシ−４′−ヒドロキシベンゾフェノン(16)
を添加し、還流を３時間続けた。その溶液を減圧蒸留
し、ゴム状残留物をエーテルで数回攪拌し、精製されて
いない9.5ｇの固体を与えた。
４−アセトキシ−３，５−ビス（アセトキシメチル）−
３′−カルボキシベンゾフェノン(18) 9.5ｇの１７及び７５ｍの無水酢酸の混合物を２４時
間還流し、過剰の無水酢酸を真空下で除去した。残留物
を水で攪拌し、固体を収集し乾燥した。収量8.5ｇの薄
層クロマトグラフィー（シリカゲル，塩化メチレン中１
％メタノール）は１８の中に存在する約１０％のより速
く移動するモノアセトキシメチル誘導体を示す。
４−アセトキシ−３，５−ビスブロモメチル−３′−カ
ルボキシベンゾフェノン(19) 酢酸中における２ｇの１８、２０ｍの塩化メチレン及
び５ｍの３１％臭化水素酸の溶液を一昼夜攪拌し、３
ｍの無水酢酸を添加し、その溶液を乾燥まで蒸発させ
た。その残留物をStillの方法（W.C.Still,M.Kahn & A.
Mitra,J Org Chem,43,2923（１９７８））を用いて１：
１のCH3CO2C2H5/CH2Cl2で溶離するシリカゲル上でクロ
マトグラフし、NMRによって測定された0.5６ｇの精製し
た１９を与えた。
４−アセトキシ−３，５−ビス〔Ｎ，Ｎ−ビス（ｔ−ブ
トキシカルボニルメチル）−アミノメチル〕−３′−カ
ルボキシベンゾフェノン(20) １５ｍの乾燥テトラヒドロフラン中における４６０mg
（1.0７ミリモル）の１９、５２４mg（2.1４ミリモル）
のｔ−ブチルイミノジアセテート、及び２１６mg（2.1
４ミリモル）のトリエチルアミンの溶液をアルゴン下で
２日間攪拌した。その反応混合物を過し、トリエチル
アミンヒドロブロミドを除去した。液を乾燥まで蒸発
させ、９００mgの２０を与えた。
４−アセトキシ−３，５−ビス〔Ｎ，Ｎ−ビス（ｔ−ブ
トキシカルボニルメチル）−アミノメチル〕−３′−
〔４−（４−ヒドロキシ−３，５−ジイオドフェノキ
シ）−３，５−ジイオド−β−メトキシカルボニルフェ
ネチル〕ベンゾフェノン(21) ２０ｍの乾燥テトラヒドロフラン中における９００mg
の２０と0.2６５ｇ（1.0７ミリモル）の１−カルブエト
キシ−２−エトキシ−１，２−ジヒドロキノリン（EED
Q）の混合物を３０分間攪拌し、0.8５ｇ（1.0７ミリモ
ル）のチロキシンのメチルエステルを添加した。その混
合物を一昼夜攪拌した。その反応混合物を溶剤としてテ
トラヒドロフランを使用するゲル透過クロマトグラフィ
ーによって精製し、構造２１に一致したNMRスペクトル
を示した６３０mgの物質を与えた。
３，５−ビス〔Ｎ，Ｎ−ビス（カルボキシメチル）アミ
ノメチル〕−４−ヒドロキシ−３′−〔４−（４−ヒド
ロキシ−３，５−ジイオドフェノキシ）−３，５−ジイ
オド−β−メトキシカルボニルフェネチル〕ベンゾフェ
ノン(22) ５ｍのトリフルオロ酢酸中における６３０mgの２１の
溶液を一昼夜攪拌し次いで水で稀釈した。分離された固
体を収集し乾燥した；収量５５０mg。電界脱着質量スペ
クトルは２２（m/e１３０５）が存在すること、またチ
ロキシンのメチルエステルが酸に加水分解されるある種
の物質を示した。
１当量の２２に加えた２当量のEuCl3・6H2OはpH8.5の硼
酸塩緩衝剤に溶解し長波長紫外線下に試験された時適度
に螢光を示した。キレート濃度に対する螢光強度の直線
プロットがこの化合物に対して１０-5と１０-7Ｍの間で
形成された。すべての螢光測定をVarianＳＦ３３０スペ
クトロフルオリメーターで行なった。
２２のユーロピウムキレートは放射性標識化チロキシン
及びチロキシン抗体に対して８０％の交叉反応性を有し
た。
例１０〜１６ 次のキレート剤とのユーロピウム及びテルビウム錯体を
硼酸塩緩衝剤中のEuCl3・6H2O及びTbCl3・6H2Oを用いて例
９のように製造した： 例１０〜１６の錯体は螢光を示し、コントロールＡ，Ｂ
及びＣのそれは螢光を示さなかった。コントロールＡ，
Ｂ及びＣの錯体をさらにグリシンアセテート緩衝剤、燐
酸塩緩衝剤及び重炭酸ナトリウム緩衝剤において試験
し、EuCl3・6H2O又はTbCl3・6H2Oのいずれでも螢光を示さ
なかった。
フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭56−59741（ＪＰ，Ａ) 特開 昭54−101439（ＪＰ，Ａ) 特公 昭53−31836（ＪＰ，Ｂ２)

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ランタニド金属及びキレート剤を含む蛍光
    性標識体に吸着又は結合された生理学的に活性な物質を
    含んで成る蛍光標識化特異性結合試薬において、前記キ
    レート剤が 前記ランタニド金属より大きい三重項エネルギーを有す
    る芳香族三重項増感剤である核及び 前記三重項増感剤核の異なった炭素原子に結合した少な
    くとも２つのヘテロ原子含有基を含み、 前記三重項増感剤核の異なった各炭素原子が前記三重項
    増感剤核にある第三のヘテロ原子に隣接してランタニド
    金属とキレート構造を形成し得るように位置する蛍光標
    識化特異性結合試薬。
JP57112653A 1981-07-01 1982-07-01 蛍光標識化特異性結合試薬 Expired - Lifetime JPH0614042B2 (ja)

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