WO2015152111A1 - 非ｒｉ系における細胞障害能迅速測定法 - Google Patents

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WO2015152111A1
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terpyridine
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田中　義正
佑宜 酒井
賢志 水田
植田　弘師
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国立大学法人 長崎大学
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    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label

Definitions

  • the present invention relates to a novel compound for rapidly measuring cytotoxicity in a non-RI manner and a method for measuring cytotoxicity using the compound.
  • immune cells such as NK cells and T cells are taken out from plasma and proliferated and / or activated outside the body, and then administered to a patient.
  • the effect is mixed even with the same therapy.
  • the reason for this is that in the process of proliferating and / or activating immune cells, there is no measurement of how much immune cells are proliferated and / or activated and have cytotoxic potential, or the proliferation and / or proliferation of immune cells. It may be administered to a patient with insufficient activation. As a result, patients may receive treatment that may be ineffective in some cases for more than half a year or more.
  • a ⁇ -ray measurement method using [51Cr] sodium chromate is known in the RI system, and in non-RI systems, leakage of lactate dehydrogenase or terpyridine is known.
  • a time-resolved fluorescence method using a derivative chelate is known (Patent Document 1, Non-Patent Document 1).
  • the ⁇ -ray measurement method is not versatile because it is essential to use an RI facility capable of handling ⁇ -rays, making it difficult to handle in clinical settings.
  • An object of the present invention is to provide a novel compound for measuring cytotoxicity that is accurate, reproducible, simple and rapid, and a method for measuring cytotoxicity using the compound.
  • the present inventors have used the compound represented by the following formula (I), thereby reducing spontaneous leakage, reducing variation in values depending on the state of cells, and easily.
  • the inventors have found that cytotoxicity can be measured, and have completed the present invention.
  • R 1 represents a substituent
  • R 2 and R 3 each represent an optionally substituted hydrocarbon group or an optionally substituted heterocyclic group
  • Y represents a substituent
  • n represents an integer of 0 to 3
  • Z represents a single bond, —O—, —S—, —SO—, —SO 2 —, or —NR 4 —
  • R 4 represents a hydrogen atom or a substituent
  • A represents an optionally substituted C 1-6 alkylene group.
  • a salt thereof hereinafter sometimes abbreviated as compound (I)).
  • [3] An organic complex forming agent comprising the compound or salt thereof according to [1] or [2] above.
  • a reagent for measuring the number of viable cells comprising the compound according to [1] or [2] above or a salt thereof.
  • the reagent according to [4] above which is a reagent for measuring cytotoxicity.
  • the reagent according to [4] above which is a reagent for measuring cell proliferation ability.
  • a method for measuring cytotoxicity comprising a step of mixing a cell with the compound or salt thereof according to [1] or [2] above, and a step of forming a complex with a lanthanoid element and measuring fluorescence.
  • the compound of the present invention introduces a specific substituent into the terpyridine skeleton, and increases the polarity of the chelate compound after degradation of esterase in the cell, thereby providing an accurate, highly reproducible and simple non-RI system. It is useful as a reagent for measuring cytotoxicity or a reagent for measuring cell proliferation.
  • the measurement method of the present invention is non-RI, and can measure the cytotoxicity or cell proliferation ability of effector cells / target cell systems easily and rapidly. It is useful in the search for the activator and the like in clinical tests.
  • the therapeutic effect can be enhanced by measuring the proliferation ability and / or activation ability of immune cells and confirming the therapeutic effect, and then administering to the patient.
  • FIG. 1 shows the arrangement of a 96-well plate in the measurement of cytotoxicity using the compound of the present invention (Example 8).
  • FIG. 2 shows time-resolved fluorescence intensity in virus-infected cells HCT-4 and erythroblastoma HCT-4 and K562 using the compound of the present invention (Example 8).
  • FIG. 3 shows the results of measuring cytotoxicity using the compound of the present invention (Example 8).
  • halogen atom include fluorine, chlorine, bromine and iodine.
  • optionally substituted hydrocarbon group is, for example, “optionally substituted C 1-12 alkyl group”, “ optionally substituted C” unless otherwise specified.
  • C 1-12 alkyl (group) unless otherwise specified, for example, methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, pentyl, isopentyl, Neopentyl, 1-ethylpropyl, hexyl, isohexyl, 1,1-dimethylbutyl, 2,2-dimethylbutyl, 3,3-dimethylbutyl, 2-ethylbutyl, heptyl, octyl, nonyl, decyl, undecyl, dodecyl .
  • Examples of the “C 1-6 alkyl (group)” in the present specification include those having 1 to 6 carbon atoms in the “C 1-12 alkyl (group)”.
  • C 2-12 alkenyl (group) is, for example, vinyl, propenyl, isopropenyl, 2-buten-1-yl, 4-penten-1-yl, unless otherwise specified, -Hexen-1-yl and the like.
  • Examples of the “C 2-6 alkenyl (group)” in the present specification include those having 2 to 6 carbon atoms among the above “C 2-12 alkenyl (group)”.
  • C 2-12 alkynyl (group) is, for example, 2-butyn-1-yl, 4-pentyn-1-yl, 5-hexyn-1-yl, unless otherwise specified. Etc.
  • Examples of the “C 2-6 alkynyl (group)” in the present specification include those having 2 to 6 carbon atoms among the above “C 2-12 alkynyl (group)”.
  • C 3-8 cycloalkyl (group) in the present specification includes, for example, cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl and the like.
  • C 3-8 cycloalkenyl (group) is, for example, cyclopropenyl (eg, 2-cyclopropen-1-yl), cyclobutenyl (eg, 2-cyclobutene-), unless otherwise specified.
  • 1-yl cyclopentenyl (eg, 1-cyclopenten-1-yl, 2-cyclopenten-1-yl, 3-cyclopenten-1-yl), cyclohexenyl (eg, 1-cyclohexen-1-yl, 2- Cyclohexen-1-yl, 3-cyclohexen-1-yl) and the like.
  • C 7-14 aralkyl (group) is, for example, benzyl, phenethyl, 1-methyl-2-phenylethyl, diphenylmethyl, 1-naphthylmethyl, 2-naphthyl unless otherwise specified. And methyl, 2,2-diphenylethyl, 3-phenylpropyl, 4-phenylbutyl, 5-phenylpentyl and the like.
  • examples of the “C 6-14 aryl (group)” include phenyl, 1-naphthyl, 2-naphthyl, 1-anthryl, 2-anthryl, and 9-anthryl unless otherwise specified. .
  • C 1-12 alkoxy (group) unless otherwise specified, for example, methoxy, ethoxy, propoxy, isopropoxy, butoxy, isobutoxy, sec-butoxy, tert-butoxy, pentyloxy, Examples include hexyloxy, heptyloxy, octyloxy, nonyloxy, decyloxy, undecyloxy, and dodecyloxy. Examples of “C 1-6 alkoxy (group)” include those having 1 to 6 carbon atoms in “C 1-12 alkoxy (group)”.
  • C 2-12 alkenyloxy (group) in the present specification includes, for example, vinyloxy, propenyloxy, isopropenyloxy and the like, unless otherwise specified.
  • Examples of “C 2-6 alkenyloxy (group)” include those having 2 to 6 carbon atoms in “C 2-12 alkenyloxy (group)”.
  • C 2-12 alkynyloxy (group) in the present specification includes, for example, 2-butynyloxy, 2-pentynyloxy, 5-hexynyloxy and the like, unless otherwise specified.
  • Examples of “C 2-6 alkynyloxy (group)” include those having 2 to 6 carbon atoms in “C 2-12 alkynyloxy (group)”.
  • C 3-8 cycloalkyloxy (group) is, for example, cyclopropyloxy, cyclobutyloxy, cyclopentyloxy, cyclohexyloxy, cycloheptyloxy, cyclooctyloxy and the like, unless otherwise specified. Is mentioned.
  • C 3-8 cycloalkenyloxy (group) is, for example, cyclopropenyloxy (eg, 2-cyclopropenyloxy), cyclobutenyloxy (eg, 2-cyclohexenyloxy) unless otherwise specified. Cyclobutenyloxy), cyclopentenyloxy (eg, 1-cyclopentenyloxy, 2-cyclopentenyloxy, 3-cyclopentenyloxy), cyclohexenyloxy (eg, 1-cyclohexenyloxy, 2-cyclohexenyloxy, 3 -Cyclohexenyloxy) and the like.
  • C 7-14 aralkyloxy (group) in the present specification includes, for example, benzyloxy, phenethyloxy and the like.
  • C 6-14 aryloxy (group) in the present specification includes, for example, phenoxy, 1-naphthyloxy, 2-naphthyloxy and the like, unless otherwise specified.
  • heterocycle-oxy (group) includes a hydroxy group substituted with “heterocycle (group)” described later.
  • Preferable examples of the heterocyclic-oxy (group) include tetrahydropyranyloxy, thiazolyloxy, pyridyloxy, pyrazolyloxy, oxazolyloxy, thienyloxy, furyloxy and the like.
  • C 1-6 alkylsulfanyl (group) is, for example, methylsulfanyl, ethylsulfanyl, propylsulfanyl, isopropylsulfanyl, butylsulfanyl, sec-butylsulfanyl, tert-butyl unless otherwise specified. And sulfanyl.
  • C 2-6 alkenylsulfanyl (group) in the present specification includes, for example, vinylsulfanyl, propenylsulfanyl, isopropenylsulfanyl and the like, unless otherwise specified.
  • C 1-6 alkylsulfonyl (group) is, for example, methylsulfonyl, ethylsulfonyl, propylsulfonyl, isopropylsulfonyl, butylsulfonyl, sec-butylsulfonyl, tert-butyl unless otherwise specified. And sulfonyl.
  • examples of the “C 1-6 alkylene group” include methylene, ethylene, propylene, butylene, pentylene and hexylene.
  • heterocycle (group) as a ring-constituting atom, one or two kinds selected from a nitrogen atom, a sulfur atom and an oxygen atom in addition to a carbon atom, 1 to 2 3 to 14 membered (monocyclic, bicyclic or tricyclic) heterocyclic group containing 4 heteroatoms, preferably (i) a 5 to 14 membered (preferably 5 to 10 membered) aromatic heterocyclic group (Ii) 3 to 8 membered non-aromatic heterocyclic group and the like.
  • a 5- or 6-membered aromatic heterocyclic group or a 5- or 6-membered non-aromatic heterocyclic group is preferable.
  • thienyl eg, 2-thienyl, 3-thienyl
  • furyl eg, 2-furyl, 3-furyl
  • pyridyl eg, 2-pyridyl, 3-pyridyl, 4-pyridyl
  • Thiazolyl eg 2-thiazolyl, 4-thiazolyl, 5-thiazolyl
  • oxazolyl eg 2-oxazolyl, 4-oxazolyl, 5-oxazolyl
  • pyrrolyl Example: 1-pyrrolyl, 2-pyrrolyl, 3-pyrrolyl
  • imidazolyl example: 1-imidazolyl, 2-imidazolyl, 4-imidazolyl
  • pyrazolyl eg 1-pyrazolyl, 3-pyrazolyl, 4-pyrazolyl
  • Triazolyl eg 1-imid
  • pyrrolidinyl eg 1-pyrrolidinyl, 2-pyrrolidinyl, 3-pyrrolidinyl
  • oxazolidinyl eg 2-oxazolidinyl
  • imidazolinyl eg 1-imidazolinyl, 2-imidazolinyl, 4-imidazolinyl
  • piperidinyl eg piperidino
  • piperazinyl eg 1-piperazinyl, 2-piperazinyl
  • morpholinyl eg 2-morpholinyl, 3-morpholinyl, morpholino
  • thiomorpholinyl eg 2-thiomorpholinyl, Non-aromatic heterocyclic groups such as 3-thiomorpholinyl, thiomorpholino
  • “optionally substituted C 1-6 alkylene group” for example, [Substituent group A] (1) a halogen atom; (2) hydroxy; (3) amino; (4) Nitro; (5) Cyano; (6) Halogen atom, hydroxy, amino, nitro, cyano, optionally halogenated C 1-6 alkyl, mono- or di-C 1-6 alkyl-amino, C 6-14 aryl, mono- or di -C 6-14 aryl-amino, C 3-8 cycloalkyl, C 1-6 alkoxy, C 1-6 alkoxy-C 1-6 alkoxy, C 1-6 alkylsulfanyl, C 1-6 alkylsulfinyl, C 1 -6 alkylsulfonyl, optionally esterified carboxyl, carbamoy
  • optionally substituted C 3-8 cycloalkyl group “optionally substituted C 3-8 cycloalkenyl group”, “optionally substituted C 7-14 aralkyl group” , “ Optionally substituted C 6-14 aryl group” and “ optionally substituted heterocyclic group” include, for example, [Substituent group B] (1) Substituent group A; (2) optionally substituted C 1-6 alkyl; (3) optionally substituted C 2-6 alkenyl; (4) optionally substituted C 2-6 alkynyl; 1 to 5 substituents selected from the above may be substituted at each substitutable position, such as “C 3-8 cycloalkyl group”, “C 3-8 cycloalkenyl group”, “C 7-14 Examples thereof include “aralkyl group”, “C 6-14 aryl group”, and “heterocyclic group”. When a plurality of substituents are present, each substituent may be the same or different.
  • substituent group B “optionally substituted C 1-6 alkyl”, “optionally substituted C 2-6 alkenyl”, “optionally substituted C 2-6 alkynyl group”
  • substituent selected from the said substituent A group is mentioned, for example.
  • the number of the substituent is 1 to the maximum number that can be substituted, more preferably 1 to 3.
  • R 1 represents a substituent.
  • R 1 is preferably an optionally substituted C 1-12 alkyl group or an optionally substituted C 1-12 alkoxy group.
  • R 1 is more preferably (1) a hydroxy group, (2) formyl group, (3) C 1-6 alkyl-aminocarbonyl group (eg, ethylaminocarbonyl), and (4) hydroxy-C 1-6 alkoxy group (eg, hydroxyethoxy) C 1-6 alkyl optionally substituted with 1 to 3 substituents selected from (eg, methyl, ethyl, propyl) It is.
  • R 2 and R 3 each represent a hydrocarbon group that may be substituted or a heterocyclic group that may be substituted.
  • R 2 and R 3 are preferably a C 1-12 alkyl group.
  • R 2 and R 3 are more preferably a C 1-6 alkyl group (eg, methyl, ethyl, propyl).
  • Y represents a substituent.
  • n represents an integer of 0 to 3. n is preferably 0.
  • Z represents a single bond, —O—, —S—, —SO—, —SO 2 —, or —NR 4 — (R 4 represents a hydrogen atom or a substituent). Z is preferably a single bond or —O—.
  • A represents an optionally substituted C 1-6 alkylene group.
  • A is preferably methylene.
  • Suitable compounds (I) include the following compounds.
  • R 1 is (1) a hydroxy group, (2) formyl group, (3) C 1-6 alkyl-aminocarbonyl group (eg, ethylaminocarbonyl), and (4) hydroxy-C 1-6 alkoxy group (eg, hydroxyethoxy) C 1-6 alkyl (eg, methyl, ethyl, propyl) optionally substituted with 1 to 3 substituents selected from:
  • R 2 and R 3 are C 1-6 alkyl groups (eg, methyl, ethyl, propyl)
  • n is 0,
  • Specific examples of the compound (I) include the compounds of Examples 1 to 9.
  • examples of the salt include metal salts, ammonium salts, salts with organic bases, salts with inorganic acids, salts with organic acids, and the like.
  • the metal salt include alkali metal salts such as sodium salt and potassium salt; alkaline earth metal salts such as calcium salt, magnesium salt and barium salt; aluminum salt and the like.
  • the salt with an organic base include salts with trimethylamine, triethylamine, pyridine, ethanolamine, diethanolamine, triethanolamine and the like.
  • Preferable examples of the salt with inorganic acid include salts with hydrochloric acid, hydrobromic acid, nitric acid, sulfuric acid, phosphoric acid and the like.
  • the salt with organic acid include, for example, formic acid, acetic acid, trifluoroacetic acid, phthalic acid, fumaric acid, oxalic acid, tartaric acid, maleic acid, citric acid, succinic acid, malic acid, methanesulfonic acid, benzene And salts with sulfonic acid, p-toluenesulfonic acid and the like.
  • the production intermediate obtained in the following production method can also be used for the next reaction without purification, but it can be used after isolation and purification from the reaction mixture by known techniques such as chromatography and recrystallization. Also good.
  • Compound (I) of the present invention can be produced, for example, using the following method A and method B.
  • compound (I) a compound represented by formula (Ia) wherein R 1 is an alkoxy group or a salt thereof (hereinafter also referred to as compound (Ia)) should be produced by the following method A or a method analogous thereto. Can do. [Method A]
  • R 1 ′ and R 1 ′′ each represents an optionally substituted C 1-12 alkyl group
  • X represents a halogen atom
  • A has the same meaning as described above.
  • R 2 and R 3 Is as defined above and is the same.
  • X is preferably a chlorine atom.
  • an O-substituted-2,2 ′: 6 ′, 2 ′′ -terpyridine-6,6 ′′ -dicarboxylate (hereinafter also referred to as compound (2)) is produced by reacting an electrophilic reagent.
  • Compound 1 can be produced by a known method (P. Kadjane, C. Plata-Iglesias, R. Ziessel, L. J. Charbonniere, Dalton Trans. 2009, 5688-5700) or a method analogous thereto.
  • alkali metal hydride include sodium hydride and potassium hydride.
  • the electrophilic agent include methyl iodide and ethyl bromide.
  • the amount of the electrophilic reagent to be used is generally about 1-3 mol, preferably about 1-2 mol, per 1 mol of compound (1).
  • This step is performed in a solvent that does not adversely influence the reaction.
  • the solvent that does not adversely influence the reaction include dimethylformamide, THF, diethyl ether and the like.
  • the reaction temperature is generally about 0-100 ° C, preferably about 20-50 ° C.
  • the reaction time is usually about 2 to 48 hours, preferably about 12 to 24 hours.
  • the reaction time is usually about 10 to 48 hours, preferably about 12 to 36 hours.
  • Compound (Ia) is produced by reacting compound (3) with a haloalkylalkoxylate derivative represented by formula (4) (hereinafter also referred to as compound (4)) in the presence of a base.
  • the base include triethylamine, diisopropylethylamine, N, N-dimethyl-4-aminopyridine and the like.
  • the amount of the base to be used is generally about 2 to 10 mol, preferably about 2 to 4 mol, per 1 mol of compound (3).
  • Compound (4) may be a commercially available product, or can be produced from the corresponding starting material compound by a known method.
  • the amount of compound (4) to be used is generally about 2 to 6 mol, preferably about 2 to 4 mol, per 1 mol of compound (3).
  • This step is performed in a solvent that does not adversely influence the reaction.
  • the solvent that does not adversely influence the reaction include dimethylformamide, THF and the like.
  • the reaction temperature is usually about 0-100 ° C, preferably about 40-60 ° C.
  • the reaction time is usually about 12 to 48 hours, preferably about 12 to 36 hours.
  • the compound (1), compound (2) and compound (3) obtained by the above method A can be used in various acylation reactions, alkylation reactions, amidation reactions, oxidation reactions, reduction reactions, hydrolysis reactions, dehydration reactions, etc. It can be further derivatized by subjecting to a known reaction. Such a reaction can be carried out according to a method known per se or according thereto. Further, when the compound (1), the compound (2) and the compound (3) have a functional group such as a hydroxy group, the reaction can be carried out with appropriate protection. Such protecting groups and protecting / deprotecting reactions can be carried out by known protecting groups and methods (for example, “Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd Ed.” (Theodora W. Greene, Peter G. M., Wiley-Interscience)). Wuts))).
  • compound (I) a compound represented by formula (Ib) wherein R 1 is a hydroxymethyl group or a salt thereof (hereinafter also referred to as compound (Ib)) is produced by the following method B or a method analogous thereto. be able to. [Method B]
  • a and X are as defined above.
  • R 2 and R 3 are as defined above and are the same.
  • X is preferably a chlorine atom.
  • the reaction temperature is generally about 0-100 ° C, preferably about 20-40 ° C.
  • the reaction time is usually about 2 to 48 hours, preferably about 12 to 24 hours.
  • the methyl ester form of compound (5) is reduced with lithium aluminum hydride to produce the hydroxymethyl form of compound (5).
  • the amount of lithium aluminum hydride to be used is generally about 1-3 mol, preferably about 1-2 mol, per 1 mol of compound (5).
  • This step is performed in a solvent that does not adversely influence the reaction. Examples of the solvent that does not adversely influence the reaction include THF, diethyl ether and the like.
  • the reaction temperature is usually about ⁇ 20 to 50 ° C., preferably about 0 to 20 ° C.
  • the reaction time is usually about 1 to 12 hours, preferably about 3 to 5 hours.
  • Process 3 By dissolving the hydroxymethyl form of compound (5) in pyridine and reacting with acetic anhydride, 2,2 ′: 6 ′, 2 ′′ -terpyridin-4′-ylmethyl acetate (hereinafter referred to as formula (6)) is obtained. , Compound (6)).
  • the amount of pyridine to be used is generally about 1-10 L, preferably about 2-5 L, per 1 mol of compound (5).
  • the amount of acetic anhydride to be used is generally about 1-10 mol, preferably about 1-2 mol, per 1 mol of compound (5).
  • the reaction temperature is generally about 0-100 ° C, preferably about 20-40 ° C.
  • the reaction time is usually about 2 to 48 hours, preferably about 12 to 24 hours.
  • a pyridine oxide of compound (6) is produced by reacting compound (6) with a peroxide. This step is performed in a solvent that does not adversely influence the reaction. Examples of the solvent that does not adversely influence the reaction include dichloromethane, chloroform, carbon tetrachloride, 1,2-dichloroethane, chlorobenzene and the like.
  • the reaction temperature is usually about ⁇ 20 to 50 ° C., preferably about 0 to 20 ° C.
  • the reaction time is usually about 2 to 48 hours, preferably about 12 to 24 hours.
  • the amount of the cyanating agent to be used is generally 2 to 10 mol, preferably about 4 to 5 mol, per 1 mol of compound (6).
  • the reaction temperature is generally about 0-100 ° C, preferably about 20-40 ° C.
  • the reaction time is usually about 2 to 48 hours, preferably about 12 to 24 hours.
  • Step 6 By subjecting compound (7) to alkaline hydrolysis, 4 ′-(hydroxymethyl) -2,2 ′: 6 ′, 2 ′′ -terpyridine-6,6 ′′ -dicarboxylic acid represented by formula (8) ( Hereinafter, compound (8) is also produced. This step can be performed in the same manner as Step 2 of Method A above.
  • Step 7) Compound (Ib) is produced by reacting compound (8) with compound (4) in the presence of a base. This step can be carried out in the same manner as Step 3 of Method A above.
  • the compound of the present invention can form an organic complex with a lanthanoid element after degradation of esterase in the cell, and the number of living cells can be measured by measuring the fluorescence of the complex. What can be measured by the compound of the present invention is not limited to the number of living cells, and examples thereof include cytotoxicity and cell proliferation ability.
  • the method for measuring the cytotoxicity of the present invention comprises a step of mixing a compound represented by formula (I) with a cell, and a step of forming a complex with a lanthanoid element and measuring fluorescence.
  • the “cell” in the method of the present invention is a cell having cytotoxicity, and examples thereof include immune cells such as NK cells and T cells, and cancer cells such as leukemia cells.
  • Examples of the “lanthanoid element” in the method of the present invention include europium, samarium, terbium and the like. Preferably, europium is used.
  • the “surfactant” in the method of the present invention is appropriately selected from NP-40, Triton X-100, digitonin, CHAPS and the like. Digitonin is preferable.
  • the fluorescence can be measured, for example, by time-resolved fluorescence measurement. Since the method for measuring the cytotoxicity of the present invention is more sensitive than the conventional cytotoxicity assay, the measurement time can be shortened.
  • Target cells are incubated overnight in RPMI 1640 medium at 37 ° C., 5% CO 2 .
  • Seed in RPMI 1640 medium to a concentration of 1 ⁇ 10 6 cells / mL, add the compound represented by formula (I) to a final concentration of 25 ⁇ M, and incubate at 37 ° C., 5% CO 2 for 15 minutes.
  • the digitonin DMSO solution is prepared so that digitonin is dissolved in DMSO, water is immediately added, and the digitonin concentration is finally 0.0625%. 4). After mixing well and centrifuging, transfer the supernatant to a plate (96 wells, flat bottom) containing 250 ⁇ L of Eu solution. 5. After standing for 15 minutes, time-resolved fluorescence is measured with a PHERAstar microplate reader.
  • Flash column chromatography is a silica gel C60 (50-200 ⁇ m) from Fuji Silysia Chemical Ltd or a CHROMATOREX DIOL (MB 100-40 / 75) with an eluent system as described in the experimental section. Made with. TLC was performed using either TLC Silic gel 60 F254 aluminum sheets (Merck) or silica gel F254 glass plates (Merck).
  • NMR Nuclear magnetic resonance spectrum
  • Hz Hertz J: Coupling constant
  • HRMS High resolution mass spectrometry spectrum
  • THF Tetrahydrofuran
  • DMF N, N-dimethylformamide
  • DMSO Dimethyl sulfoxide
  • IPE Diisopropyl ether
  • TEA Triethylamine
  • BATDA Bis (Acetoxymethyl) 2,2 ′: 6 ′, 2 ′′ -terpyridine-6,6 ′′ -dicarboxylate
  • Step 1 the reaction was performed using 2-acetoxyethyl bromide as the electrophilic reagent.
  • the obtained crude product was purified by flash column chromatography (eluent: 50% n-hexane / ethyl acetate) to give diethyl 4 ′-(2-acetoxyethoxy) -2,2 ′: 6 ′, 2 "-Terpyridine-6,6" -dicarboxylate (494 mg, 41% yield) was obtained as an orange solid.
  • Step 1 the reaction was performed using 2-oxo-2- (propylamino) ethoxymethyl bromide as an electrophilic reagent.
  • the obtained crude product was purified by flash column chromatography (eluent: 50% n-hexane / ethyl acetate) to give diethyl 4 ′-(2-oxo-2- (propylamino) ethoxy) -2, 2 ′: 6 ′, 2 ′′ -terpyridine-6,6 ′′ -dicarboxylate (342 mg, 70% yield) was obtained as a white solid.
  • Step 1 the reaction was performed using 3-((tetrahydro-2H-pyran-2-yl) oxy) propyl bromide as the electrophilic reagent.
  • Step 1 the reaction was performed using 2- (2-acetoxyethoxy) ethyl bromide as the electrophilic reagent.
  • the resulting crude product was purified by flash column chromatography (eluent: 50% n-hexane / ethyl acetate) to give diethyl 4 ′-(2- (2-acetoxyethoxy) ethoxy) -2,2 ′. : 6 ′, 2 ′′ -terpyridine-6,6 ′′ -dicarboxylate (60 mg, 9% yield) was obtained as an orange solid.
  • Example 8 Bis (butyryloxymethyl) 4 ′-(hydroxymethyl) -2,2 ′: 6 ′, 2 ′′ -terpyridine-6,6 ′′ -dicarboxylate
  • Lithium aluminum hydride (28 mg, 0.7 mmol) was added to a solution of the crude product (0.72 mmol) in tetrahydrofuran (7.2 mL) at 0 ° C. After stirring for 3 hours, the reaction mixture was added. Sodium sulfate 1 Hydrate was added, and the mixture was stirred at room temperature for 1 hour, the reaction mixture was filtered through a celite pad, the filtrate was concentrated under reduced pressure, the residue was dissolved in pyridine (3.6 mL), and acetic anhydride (0.
  • Example 10 Measurement of cytotoxicity using a compound of the present invention (When performing time-resolved fluorescence assay (Eu assay: 1), it is necessary to monitor the amount of spontaneous leakage, the method is described below.) Histiocytoma U937 cells were cultured overnight at 37 ° C. and 5% CO 2 in 30 mL of RPMI 1640 medium, 30 mL of the culture was transferred to a 50 mL conical tube, and the number of cells was counted. The mixture was centrifuged at 1700 rpm and 4 ° C. for 5 minutes, the supernatant was discarded, and the cells were resuspended in RPMI 1640 medium to 1 ⁇ 10 6 cells / mL.
  • 100 ⁇ L of the cell suspension was seeded in 6 wells of a 96 well flat bottom plate.
  • 100 ⁇ L of RPMI1640 medium was added to the well for determining the spontaneous leakage amount, and 90 ⁇ L of RPMI1640 medium was added to the well for determining the maximum leakage amount.
  • the plate was centrifuged at 500 rpm at room temperature for 2 minutes, and then incubated at 37 ° C. under 5% CO 2 for 30 minutes.
  • 10 ⁇ L of freshly prepared 0.125% digitonin solution in 19% DMSO (mixed solution of 3 mg digitonin, 0.456 mL DMSO and 1.944 mL H 2 O) was added to each well to determine the maximum leakage.
  • Example 11 Measurement of cytotoxicity using compounds of the present invention (time-resolved fluorescence assay (Eu assay: 1))
  • (1) Preparation of target cells In 30 mL of RPMI1640 medium, the cell line HCT-4 cells derived from CSF of HAM patients infected with HTLV-1 were cultured overnight at 37 ° C. under 5% CO 2 conditions. The cells were measured and adjusted to 0.24 ⁇ 10 6 cells / mL so that the cells were 4.8 ⁇ 10 6 in 20 mL of the medium. The mixture was centrifuged at 1700 rpm and 4 ° C.
  • the cells were resuspended in 4.8 ml of RPMI 1640 medium to 1 ⁇ 10 6 cells / mL.
  • the cell suspension was transferred to three 15 mL conical tubes (B-1, B-2, B-3).
  • 2.5 ⁇ L of DMSO was added to B-1, and 2.5 ⁇ L of 10 mM of the compound of Example 8 was added to B-2 and B-3.
  • the mixture was allowed to stand at 37 ° C. for 15 minutes.
  • the cells were washed three times with 5 mL of RPMI 1640 medium, centrifuged at 1700 rpm at 4 ° C.
  • HCT-4 cell solution and K562 cell solution were added to a 96-well plate.
  • the arrangement of the 96-well plate up to the above is as shown in FIG.
  • the plate was centrifuged at 500 rpm for 2 minutes at room temperature and then incubated at 37 ° C. for 20 minutes.
  • a 0.125% digitonin solution in 19% DMSO (3 mg digitonin, 0.456 mL DMSO and 1.944 mL H 2 O mixed solution) was prepared fresh and 10 ⁇ L of this was added to the wells to determine the maximum release. Each was added and mixed well, then incubated for an additional 20 minutes. After incubation, the cell suspension was mixed well again and centrifuged at 1700 rpm for 2 minutes at room temperature.
  • the compound of the present invention is useful as a reagent for measuring cytotoxicity or cell proliferation ability.
  • the reagent can be used to accurately and rapidly measure the cytotoxicity or cell proliferation ability, with high reproducibility.
  • This application is based on Japanese Patent Application No. 2014-073475 for which it applied on March 31, 2014 in Japan, The content is altogether included in this specification.

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Abstract

　本発明の目的は、正確で再現性が高く、かつ、簡便で迅速に細胞障害能または細胞増殖能を測定するための新規化合物および該化合物を用いた細胞障害能または細胞増殖能の測定方法を提供することにある。本発明は、式（Ｉ）： （式中、Ｒ１は、置換基を示し、Ｒ２およびＲ３は、それぞれ、置換されていてもよい炭化水素基、または置換されていてもよい複素環基を示し、Ｙは、置換基を示し、ｎは、０～３の整数を示し、Ｚは、単結合、－Ｏ－、－Ｓ－、－ＳＯ－、－ＳＯ２－、または－ＮＲ４－（Ｒ４は、水素原子または置換基を示す。）を示し、およびＡは、置換されていてもよいＣ１－６アルキレン基を示す。）で表される化合物またはその塩に関する。

Description

非ＲＩ系における細胞障害能迅速測定法
　本発明は、細胞障害能を非ＲＩでかつ迅速に測定するための新規化合物および該化合物を用いた細胞障害能の測定方法に関する。
　免疫細胞治療では、血漿からＮＫ細胞、Ｔ細胞などの免疫細胞を取り出し、体外で増殖および／または活性化した後、患者に投与することが行われている。しかしながら、現状では、同じ療法であっても、効果がまちまちである。この理由として、免疫細胞を増殖および／または活性化する過程において、免疫細胞がどの程度増殖および／または活性化されて細胞障害能を持つかの測定がされないまま、あるいは免疫細胞の増殖および／または活性化が不十分なまま、患者に投与されることが挙げられる。この結果、患者は場合によっては効果がないかもしれない治療を半年ないし一年以上も受けることになる可能性がある。
　細胞の活性あるいは生細胞の数を測定する方法として、ＲＩ系では［５１Ｃｒ］クロム酸ナトリウムを用いたγ線測定法が知られており、非ＲＩ系では、乳酸脱水素酵素の漏出や、テルピリジン誘導体キレートを用いた時間分解蛍光法が知られている（特許文献１、非特許文献１）。γ線測定法はγ線を扱うことのできるＲＩ施設の使用が必須であることから汎用性がなく、臨床現場などでの扱いが困難になる。乳酸脱水素酵素の漏出検定法では、標的細胞からだけでなく、エフェクター細胞からの自然漏出があり、バックグラウンドが高すぎるため正確な測定ができない点が問題となる。また、従来のテルピリジン誘導体キレート（例えば、ビス（アセトキシメチル）　２，２’：６’，２”－テルピリジン－６，６”－ジカルボキシレート：ＢＡＴＤＡ）を用いたＥｕ時間分解蛍光法では、標的細胞からのキレート漏出が大きく、細胞の状態による結果のばらつきも大きいことから標準的な測定法とはなりにくい。
特表平３－５００２９７号公報
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９３（２），１９９６，ｐｐ．１９９－２０６
　本発明は、正確で再現性があり、かつ簡便で迅速な細胞障害能を測定するための新規化合物および該化合物を用いた細胞障害能の測定方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、下記の式（Ｉ）で示される化合物を用いることにより、自然漏出が低く、細胞の状態による値のばらつきが少なく、かつ簡便に細胞障害能を測定できることを見出し、本発明を完成するに至った。
　即ち、本発明は以下の通りである。
［１］式（Ｉ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
（Ｒ１は、置換基を示し、
Ｒ２およびＲ３は、それぞれ、置換されていてもよい炭化水素基、または置換されていてもよい複素環基を示し、
Ｙは、置換基を示し、
ｎは、０～３の整数を示し、
Ｚは、単結合、－Ｏ－、－Ｓ－、－ＳＯ－、－ＳＯ２－、または－ＮＲ４－（Ｒ４は、水素原子または置換基を示す。）を示し、
および
Ａは、置換されていてもよいＣ１－６アルキレン基を示す。）
で表される化合物またはその塩（以下、化合物（Ｉ）と略記することがある。）。
［２］Ａがメチレンである、上記［１］に記載の化合物またはその塩。
［３］上記［１］または［２］に記載の化合物またはその塩を含む、有機錯体形成剤。
［４］上記［１］または［２］に記載の化合物またはその塩を含む、生細胞数測定用試薬。
［５］細胞障害能測定用試薬である、上記［４］に記載の試薬。
［６］細胞増殖能測定用試薬である、上記［４］に記載の試薬。
［７］上記［１］または［２］に記載の化合物またはその塩と細胞を混合する工程、および
　ランタノイド元素と錯体を形成し、蛍光を測定する工程
を含む、細胞障害能を測定する方法。
［８］ランタノイド元素と錯体を形成する前に、界面活性剤を加えることを特徴とする、上記［７］に記載の方法。
　本発明の化合物は、テルピリジン骨格に特定の置換基を導入し、細胞内におけるエステラーゼ分解後のキレート化合物の極性をあげることにより、正確で再現性が高く、かつ、簡便な、非ＲＩ系での細胞障害能測定用試薬または細胞増殖測定用試薬として有用である。また、本発明の測定方法は、非ＲＩで、しかも、簡便かつ迅速にエフェクター細胞／標的細胞系の細胞障害能または細胞増殖能を測定できることから、がんやウィルス感染免疫研究、細胞療法における新規の活性化物質等の探索、臨床検査などにおいて有用である。さらに、細胞療法の際、免疫細胞の増殖能および／または活性化能を測定し、治療効果を確認した後、患者に投与することにより、治療効果を高めることができる。
図１は、本発明化合物（実施例８）を用いた細胞障害能の測定における９６穴プレートの配置を示す。 図２は、本発明化合物（実施例８）を用いたウィルス感染細胞ＨＣＴ－４および赤芽腫ＨＣＴ－４およびＫ５６２における時間分解蛍光強度を示す。 図３は、本発明化合物（実施例８）を用いて細胞障害能を測定した結果を示す。
　以下に、本発明について詳細に説明する。
　以下、本明細書中で用いられる各置換基の定義について詳述する。
　本明細書中、「ハロゲン原子」としては、例えば、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素が挙げられる。
　本明細書中の「置換されていてもよい炭化水素基」としては、特に断りのない限り、例えば、「置換されていてもよいＣ１－１２アルキル基」、「置換されていてもよいＣ２－１２アルケニル基」、「置換されていてもよいＣ２－１２アルキニル基」、「置換されていてもよいＣ３－８シクロアルキル基」、「置換されていてもよいＣ３－８シクロアルケニル基」、「置換されていてもよいＣ７－１４アラルキル基」、「置換されていてもよいＣ６－１４アリール基」などが挙げられる。
　本明細書中、「Ｃ１－１２アルキル（基）」としては、特に断りのない限り、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、１－エチルプロピル、ヘキシル、イソヘキシル、１，１－ジメチルブチル、２，２－ジメチルブチル、３，３－ジメチルブチル、２－エチルブチル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシルが挙げられる。本明細書中の「Ｃ１－６アルキル（基）」としては、「Ｃ１－１２アルキル（基）」のうち、炭素数が１～６のものが挙げられる。
　本明細書中の「Ｃ２－１２アルケニル（基）」としては、特に断りのない限り、例えば、ビニル、プロペニル、イソプロペニル、２－ブテン－１－イル、４－ペンテン－１－イル、５－へキセン－１－イルなどが挙げられる。本明細書中の「Ｃ２－６アルケニル（基）」としては、上記「Ｃ２－１２アルケニル（基）」のうち、炭素数が２～６のものが挙げられる。
　本明細書中の「Ｃ２－１２アルキニル（基）」としては、特に断りのない限り、例えば、２－ブチン－１－イル、４－ペンチン－１－イル、５－へキシン－１－イルなどが挙げられる。本明細書中の「Ｃ２－６アルキニル（基）」としては、上記「Ｃ２－１２アルキニル（基）」のうち、炭素数が２～６のものが挙げられる。
　本明細書中の「Ｃ３－８シクロアルキル（基）」としては、特に断りのない限り、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチルなどが挙げられる。
　本明細書中の「Ｃ３－８シクロアルケニル（基）」としては、特に断りのない限り、例えば、シクロプロペニル（例、２－シクロプロペン－１－イル）、シクロブテニル（例、２－シクロブテン－１－イル）、シクロペンテニル（例、１－シクロペンテン－１－イル、２－シクロペンテン－１－イル、３－シクロペンテン－１－イル）、シクロヘキセニル（例、１－シクロヘキセン－１－イル、２－シクロヘキセン－１－イル、３－シクロヘキセン－１－イル）などが挙げられる。
　本明細書中の「Ｃ７－１４アラルキル（基）」としては、特に断りのない限り、例えば、ベンジル、フェネチル、１－メチル－２－フェニルエチル、ジフェニルメチル、１－ナフチルメチル、２－ナフチルメチル、２，２－ジフェニルエチル、３－フェニルプロピル、４－フェニルブチル、５－フェニルペンチルなどが挙げられる。
　本明細書中、「Ｃ６－１４アリール（基）」としては、特に断りのない限り、例えば、フェニル、１－ナフチル、２－ナフチル、１－アントリル、２－アントリル、９－アントリルが挙げられる。
　本明細書中、「Ｃ１－１２アルコキシ（基）」としては、特に断りのない限り、例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ－ブトキシ、ｔｅｒｔ－ブトキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシ、ヘプチルオキシ、オクチルオキシ、ノニルオキシ、デシルオキシ、ウンデシルオキシ、ドデシルオキシが挙げられる。「Ｃ１－６アルコキシ（基）」としては、「Ｃ１－１２アルコキシ（基）」のうち、炭素数が１～６のものが挙げられる。
　本明細書中の「Ｃ２－１２アルケニルオキシ（基）」としては、特に断りのない限り、例えば、ビニルオキシ、プロペニルオキシ、イソプロペニルオキシなどが挙げられる。「Ｃ２－６アルケニルオキシ（基）」としては、「Ｃ２－１２アルケニルオキシ（基）」のうち、炭素数が２～６のものが挙げられる。
　本明細書中の「Ｃ２－１２アルキニルオキシ（基）」としては、特に断りのない限り、例えば、２－ブチニルオキシ、２－ペンチニルオキシ、５－ヘキシニルオキシなどが挙げられる。「Ｃ２－６アルキニルオキシ（基）」としては、「Ｃ２－１２アルキニルオキシ（基）」のうち、炭素数が２～６のものが挙げられる。
　本明細書中の「Ｃ３－８シクロアルキルオキシ（基）」としては、特に断りのない限り、例えば、シクロプロピルオキシ、シクロブチルオキシ、シクロペンチルオキシ、シクロヘキシルオキシ、シクロヘプチルオキシ、シクロオクチルオキシなどが挙げられる。
　本明細書中の「Ｃ３－８シクロアルケニルオキシ（基）」としては、特に断りのない限り、例えば、シクロプロペニルオキシ（例、２－シクロプロペニルオキシ）、シクロブテニルオキシ（例、２－シクロブテニルオキシ）、シクロペンテニルオキシ（例、１－シクロペンテニルオキシ、２－シクロペンテニルオキシ、３－シクロペンテニルオキシ）、シクロヘキセニルオキシ（例、１－シクロヘキセニルオキシ、２－シクロヘキセニルオキシ、３－シクロヘキセニルオキシ）などが挙げられる。
　本明細書中の「Ｃ７－１４アラルキルオキシ（基）」としては、特に断りのない限り、例えば、ベンジルオキシ、フェネチルオキシなどが挙げられる。
　本明細書中の「Ｃ６－１４アリールオキシ（基）」としては、特に断りのない限り、例えば、フェノキシ、１－ナフチルオキシ、２－ナフチルオキシなどが挙げられる。
　本明細書中の「複素環－オキシ（基）」としては、後述の「複素環（基）」で置換されたヒドロキシ基が挙げられる。該複素環－オキシ（基）の好適な例としては、テトラヒドロピラニルオキシ、チアゾリルオキシ、ピリジルオキシ、ピラゾリルオキシ、オキサゾリルオキシ、チエニルオキシ、フリルオキシなどが挙げられる。
　本明細書中の「Ｃ１－６アルキルスルファニル（基）」としては、特に断りのない限り、例えば、メチルスルファニル、エチルスルファニル、プロピルスルファニル、イソプロピルスルファニル、ブチルスルファニル、ｓｅｃ－ブチルスルファニル、ｔｅｒｔ－ブチルスルファニルなどが挙げられる。
　本明細書中の「Ｃ２－６アルケニルスルファニル（基）」としては、特に断りのない限り、例えば、ビニルスルファニル、プロペニルスルファニル、イソプロペニルスルファニルなどが挙げられる。
　本明細書中の「Ｃ１－６アルキルスルホニル（基）」としては、特に断りのない限り、例えば、メチルスルホニル、エチルスルホニル、プロピルスルホニル、イソプロピルスルホニル、ブチルスルホニル、ｓｅｃ－ブチルスルホニル、ｔｅｒｔ－ブチルスルホニルなどが挙げられる。
　本明細書中、「Ｃ１－６アルキレン基」としては、例えば、メチレン、エチレン、プロピレン、ブチレン、ペンチレン、ヘキシレンが挙げられる。
　本明細書中の「複素環（基）」としては、特に断りのない限り、例えば、環構成原子として、炭素原子以外に窒素原子、硫黄原子及び酸素原子から選ばれる１又は２種、１ないし４個のヘテロ原子を含む３ないし１４員（単環、２環又は３環式）複素環基、好ましくは、（i）５ないし１４員（好ましくは、５ないし１０員）芳香族複素環基、（ii）３ないし８員非芳香族複素環基などが挙げられる。なかでも５または６員芳香族複素環基、あるいは５または６員非芳香族複素環基が好ましい。具体的には、例えば、チエニル（例：２－チエニル、３－チエニル）、フリル（例：２－フリル、３－フリル）、ピリジル（例：２－ピリジル、３－ピリジル、４－ピリジル）、チアゾリル（例：２－チアゾリル、４－チアゾリル、５－チアゾリル）、オキサゾリル（例：２－オキサゾリル、４－オキサゾリル、５－オキサゾリル）、ピラジニル、ピリミジニル（例：２－ピリミジニル、４－ピリミジニル）、ピロリル（例：１－ピロリル、２－ピロリル、３－ピロリル）、イミダゾリル（例：１－イミダゾリル、２－イミダゾリル、４－イミダゾリル）、ピラゾリル（例：１－ピラゾリル、３－ピラゾリル、４－ピラゾリル）、トリアゾリル（例：１－トリアゾリル、２－トリアゾリル）、テトラゾリル、ピリダジニル（例：３－ピリダジニル、４－ピリダジニル）、イソチアゾリル（例：３－イソチアゾリル、４－イソチアゾリル、５－イソチアゾリル）、イソキサゾリル（例：３－イソキサゾリル、４－イソキサゾリル、５－イソキサゾリル）、インドリル（例：１－インドリル、２－インドリル、３－インドリル）、２－ベンゾチアゾリル、２－ベンズオキサゾリル、ベンズイミダゾリル（例：１－ベンズイミダゾリル、２－ベンズイミダゾリル）、ベンゾ［ｂ］チエニル（例：２－ベンゾ［ｂ］チエニル、３－ベンゾ［ｂ］チエニル）、ベンゾ［ｂ］フリル（例：２－ベンゾ［ｂ］フラニル、３－ベンゾ［ｂ］フラニル）、キノリル（例：２－キノリル、３－キノリル、４－キノリル、５－キノリル、８－キノリル）、イソキノリル（例：１－イソキノリル、３－イソキノリル、４－イソキノリル、５－イソキノリル）、ピラゾロピリジニル（例：ピラゾロ［１，５－ａ］ピリジン－３－イル）などの芳香族複素環基；
例えば、ピロリジニル（例：１－ピロリジニル、２－ピロリジニル、３－ピロリジニル）、オキサゾリジニル（例：２－オキサゾリジニル）、イミダゾリニル（例：１－イミダゾリニル、２－イミダゾリニル、４－イミダゾリニル）、ピペリジニル（例：ピペリジノ、２－ピペリジニル、３－ピペリジニル、４－ピペリジニル）、ピペラジニル（例：１－ピペラジニル、２－ピペラジニル）、モルホリニル（例：２－モルホリニル、３－モルホリニル、モルホリノ）、チオモルホリニル（例：２－チオモルホリニル、３－チオモルホリニル、チオモルホリノ）、テトラヒドロフリル、テトラヒドロピラニルなどの非芳香族複素環基などが挙げられる。
　本明細書中、「置換されていてもよいＣ１－１２アルキル基」、「置換されていてもよいＣ２－１２アルケニル基」、「置換されていてもよいＣ２－１２アルキニル基」、「置換されていてもよいＣ１－６アルキレン基」としては、例えば、
［置換基群Ａ］
（1）ハロゲン原子；
（2）ヒドロキシ；
（3）アミノ；
（4）ニトロ；
（5）シアノ；
（6）ハロゲン原子、ヒドロキシ、アミノ、ニトロ、シアノ、ハロゲン化されていてもよいＣ１－６アルキル、モノ－又はジ－Ｃ１－６アルキル－アミノ、Ｃ６－１４アリール、モノ－又はジ－Ｃ６－１４アリール－アミノ、Ｃ３－８シクロアルキル、Ｃ１－６アルコキシ、Ｃ１－６アルコキシ－Ｃ１－６アルコキシ、Ｃ１－６アルキルスルファニル、Ｃ１－６アルキルスルフィニル、Ｃ１－６アルキルスルホニル、エステル化されていてもよいカルボキシル、カルバモイル、チオカルバモイル、モノ－又はジ－Ｃ１－６アルキル－カルバモイル、モノ－又はジ－Ｃ６－１４アリール－カルバモイル、スルファモイル、モノ－又はジ－Ｃ１－６アルキル－スルファモイル及びモノ－又はジ－Ｃ６－１４アリール－スルファモイルから選ばれる１ないし３個の置換基で置換されていてもよい複素環基；
（7）モノ－又はジ－Ｃ１－６アルキル－アミノ；
（8）モノ－又はジ－Ｃ６－１４アリール－アミノ；
（9）モノ－又はジ－Ｃ７－１４アラルキル－アミノ；
（10）Ｎ－Ｃ１－６アルキル－Ｎ－Ｃ６－１４アリール－アミノ；
（11）Ｎ－Ｃ１－６アルキル－Ｎ－Ｃ７－１４アラルキル－アミノ；
（12）Ｃ３－８シクロアルキル；
（13）ハロゲン化されていてもよいＣ１－６アルコキシ；
（14）Ｃ１－６アルキルスルファニル；
（15）Ｃ１－６アルキルスルフィニル；
（16）Ｃ１－６アルキルスルホニル；
（17）エステル化されていてもよいカルボキシル；
（18）Ｃ１－６アルキル－カルボニル；
（19）Ｃ３－８シクロアルキル－カルボニル；
（20）Ｃ６－１４アリール－カルボニル；
（21）カルバモイル；
（22）チオカルバモイル；
（23）モノ－又はジ－Ｃ１－６アルキル－カルバモイル；
（24）モノ－又はジ－Ｃ６－１４アリール－カルバモイル；
（25）Ｎ－Ｃ１－６アルキル－Ｎ－Ｃ６－１４アリール－カルバモイル；
（26）モノ－又はジ－５ないし７員複素環－カルバモイル；
（27）カルボキシルで置換されていてもよいＣ１－６アルキル－カルボニルアミノ；
（28）ハロゲン原子、ヒドロキシ、アミノ、ニトロ、シアノ、ハロゲン化されていてもよいＣ１－６アルキル、モノ－又はジ－Ｃ１－６アルキル－アミノ、Ｃ６－１４アリール、モノ－又はジ－Ｃ６－１４アリール－アミノ、Ｃ３－８シクロアルキル、Ｃ１－６アルコキシ、Ｃ１－６アルコキシ－Ｃ１－６アルコキシ、Ｃ１－６アルキルスルファニル、Ｃ１－６アルキルスルフィニル、Ｃ１－６アルキルスルホニル、エステル化されていてもよいカルボキシル、カルバモイル、チオカルバモイル、モノ－又はジ－Ｃ１－６アルキル－カルバモイル、モノ－又はジ－Ｃ６－１４アリール－カルバモイル、スルファモイル、モノ－又はジ－Ｃ１－６アルキル－スルファモイル及びモノ－又はジ－Ｃ６－１４アリール－スルファモイルから選ばれる１ないし３個の置換基で置換されていてもよいＣ６－１４アリールオキシ；
（29）ハロゲン原子、ヒドロキシ、アミノ、ニトロ、シアノ、ハロゲン化されていてもよいＣ１－６アルキル、モノ－又はジ－Ｃ１－６アルキル－アミノ、Ｃ６－１４アリール、モノ－又はジ－Ｃ６－１４アリール－アミノ、Ｃ３－８シクロアルキル、Ｃ１－６アルコキシ、Ｃ１－６アルコキシ－Ｃ１－６アルコキシ、Ｃ１－６アルキルスルファニル、Ｃ１－６アルキルスルフィニル、Ｃ１－６アルキルスルホニル、エステル化されていてもよいカルボキシル、カルバモイル、チオカルバモイル、モノ－又はジ－Ｃ１－６アルキル－カルバモイル、モノ－又はジ－Ｃ６－１４アリール－カルバモイル、スルファモイル、モノ－又はジ－Ｃ１－６アルキル－スルファモイル及びモノ－又はジ－Ｃ６－１４アリール－スルファモイルから選ばれる１ないし３個の置換基で置換されていてもよいＣ６－１４アリール；
（30）複素環－オキシ；
（31）スルファモイル；
（32）モノ－又はジ－Ｃ１－６アルキル－スルファモイル；
（33）モノ－又はジ－Ｃ６－１４アリール－スルファモイル；
（34）ハロゲン原子、ヒドロキシ、アミノ、ニトロ、シアノ、ハロゲン化されていてもよいＣ１－６アルキル、モノ－又はジ－Ｃ１－６アルキル－アミノ、Ｃ６－１４アリール、モノ－又はジ－Ｃ６－１４アリール－アミノ、Ｃ３－８シクロアルキル、Ｃ１－６アルコキシ、Ｃ１－６アルコキシ－Ｃ１－６アルコキシ、Ｃ１－６アルキルスルファニル、Ｃ１－６アルキルスルフィニル、Ｃ１－６アルキルスルホニル、エステル化されていてもよいカルボキシル、カルバモイル、チオカルバモイル、モノ－又はジ－Ｃ１－６アルキル－カルバモイル、モノ－又はジ－Ｃ６－１４アリール－カルバモイル、スルファモイル、モノ－又はジ－Ｃ１－６アルキル－スルファモイル及びモノ－又はジ－Ｃ６－１４アリール－スルファモイルから選ばれる１ないし３個の置換基で置換されていてもよいＣ７－１４アラルキルオキシ；
（35）Ｃ１－６アルキル－カルボニルオキシ；
（36）Ｃ１－６アルコキシ－カルボニル；
（37）モノ－又はジ－Ｃ１－６アルキル－カルボニルアミノ；
（38）モノ－又はジ－Ｃ１－６アルコキシ－カルボニルアミノ；
（39）モノ－又はジ－Ｃ６－１４アリールオキシ－カルボニルアミノ；
（40）モノ－又はジ－Ｃ７－１４アラルキルオキシ－カルボニルアミノ；
（41）トリＣ１－６アルキルシリルオキシ;
などから選ばれる１ないし５個の置換基をそれぞれ置換可能な位置に有していてもよい、「Ｃ１－１２アルキル基」、「Ｃ２－１２アルケニル基」、「Ｃ２－１２アルキニル基」、「Ｃ１－６アルキレン基」が挙げられる。置換基が複数存在する場合、各置換基は同一でも異なっていてもよい。
　本明細書中、「置換されていてもよいＣ３－８シクロアルキル基」、「置換されていてもよいＣ３－８シクロアルケニル基」、「置換されていてもよいＣ７－１４アラルキル基」、「置換されていてもよいＣ６－１４アリール基」、「置換されていてもよい複素環基」としては、例えば、
［置換基群Ｂ］
（1）置換基群Ａ；
（2）置換されていてもよいＣ１－６アルキル；
（3）置換されていてもよいＣ２－６アルケニル；
（4）置換されていてもよいＣ２－６アルキニル；
などから選ばれる１ないし５個の置換基をそれぞれ置換可能な位置に有していてもよい、「Ｃ３－８シクロアルキル基」、「Ｃ３－８シクロアルケニル基」、「Ｃ７－１４アラルキル基」、「Ｃ６－１４アリール基」、「複素環基」が挙げられる。置換基が複数存在する場合、各置換基は同一でも異なっていてもよい。
　置換基Ｂ群中の、「置換されていてもよいＣ１－６アルキル」、「置換されていてもよいＣ２－６アルケニル」、「置換されていてもよいＣ２－６アルキニル基」の置換基としては、例えば、上記置換基Ａ群から選択される置換基が挙げられる。当該置換基の数は、１個～置換可能な最大数、より好ましくは１～３個である。
　以下、式（Ｉ）中の各記号の定義について詳述する。
　Ｒ１は、置換基を示す。
　Ｒ１は、好ましくは、置換されていてもよいＣ１－１２アルキル基、または置換されていてもよいＣ１－１２アルコキシ基である。
　Ｒ１は、より好ましくは、
（１）ヒドロキシ基、
（２）ホルミル基、
（３）Ｃ１－６アルキル－アミノカルボニル基（例、エチルアミノカルボニル）、および
（４）ヒドロキシ－Ｃ１－６アルコキシ基（例、ヒドロキシエトキシ）
から選択される１ないし３個の置換基で置換されていてもよいＣ１－６アルキル（例、メチル、エチル、プロピル）
である。
　Ｒ２およびＲ３は、それぞれ、置換されていてもよい炭化水素基、または置換されていてもよい複素環基を示す。
　Ｒ２およびＲ３は、好ましくは、Ｃ１－１２アルキル基である。
　Ｒ２およびＲ３は、より好ましくは、Ｃ１－６アルキル基（例、メチル、エチル、プロピル）である。
　Ｙは、置換基を示す。
　ｎは、０～３の整数を示す。
　ｎは、好ましくは０である。
　Ｚは、単結合、－Ｏ－、－Ｓ－、－ＳＯ－、－ＳＯ２－、または－ＮＲ４－（Ｒ４は、水素原子または置換基を示す。）を示す。
　Ｚは、好ましくは、単結合または－Ｏ－である。
　Ａは、置換されていてもよいＣ１－６アルキレン基を示す。
　Ａは、好ましくは、メチレンである。
　本明細書中で説明される基、置換基などの好ましい例は、より好ましくは、組み合わせて用いられる。
　好適な化合物（Ｉ）としては、以下の化合物が挙げられる。
［化合物Ａ］
Ｒ１が、
（１）ヒドロキシ基、
（２）ホルミル基、
（３）Ｃ１－６アルキル－アミノカルボニル基（例、エチルアミノカルボニル）、および
（４）ヒドロキシ－Ｃ１－６アルコキシ基（例、ヒドロキシエトキシ）
から選択される１ないし３個の置換基で置換されていてもよいＣ１－６アルキル（例、メチル、エチル、プロピル）であり、
Ｒ２およびＲ３が、Ｃ１－６アルキル基（例、メチル、エチル、プロピル）
であり、
ｎが０であり、
Ｚが、単結合または－Ｏ－であり、および
Ａが、メチレン基
である化合物またはその塩。
　上記化合物（Ｉ）の具体例としては、実施例１～９の化合物が挙げられる。
　化合物（Ｉ）のうち、塩としては、例えば、金属塩、アンモニウム塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩等が挙げられる。金属塩の好適な例としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩、バリウム塩等のアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩等が挙げられる。有機塩基との塩の好適な例としては、例えば、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン等との塩が挙げられる。無機酸との塩の好適な例としては、例えば、塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸等との塩が挙げられる。有機酸との塩の好適な例としては、例えば、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、フタル酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸等との塩が挙げられる。
　次に、本発明の化合物（Ｉ）もしくはその塩の製造法について説明する。
　なお、以下の製造法において得られる製造中間体は、精製せずに次の反応に用いることもできるが、反応混合物からクロマトグラフィー、再結晶等の公知の手法により単離、精製して用いてもよい。
　本発明の化合物（Ｉ）は、例えば下記Ａ法およびＢ法を用いて製造することができる。
　化合物（Ｉ）中、Ｒ１がアルコキシ基である式（Ｉａ）で表される化合物またはその塩（以下、化合物（Ｉａ）ともいう）は、以下のＡ法またはこれに準ずる方法により製造することができる。
［Ａ法］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
［式中、Ｒ１’およびＲ１”は、それぞれ置換されていてもよいＣ１－１２アルキル基を示し、Ｘはハロゲン原子を示し、Ａは上記と同意義を示す。Ｒ２およびＲ３は上記と同意義を示し、かつ、同一である。］
　Ｘは、好ましくは、塩素原子である。
（工程１）
　アルカリ金属水素化物に、ジエチル　１’，Ｈ－［２，２’：６’，２”］テルピリジン－４’－オキソ－６，６”－ジカルボキシラート（以下、化合物（１）ともいう）を加えた後、求電子試剤を反応させることによりＯ－置換－２，２’：６’，２”－テルピリジン－６，６”－ジカルボキシラート（以下、化合物（２）ともいう）を製造する。
　化合物１は、公知の方法（Ｐ．　Ｋａｄｊａｎｅ，　Ｃ．　Ｐｌａｔａ－Ｉｇｌｅｓｉａｓ，　Ｒ．　Ｚｉｅｓｓｅｌ，　Ｌ．　Ｊ．　Ｃｈａｒｂｏｎｎｉeｒｅ，　Ｄａｌｔｏｎ　Ｔｒａｎｓ．　２００９，　５６８８－５７００）またはそれに準ずる方法で製造することができる。
　アルカリ金属水素化物としては、例えば、水素化ナトリウム、水素化カリウムなどが挙げられる。
　求電子試剤としては、例えば、ヨウ化メチル、臭化エチルなどが挙げられる。
　求電子試剤の使用量は、化合物（１）１モルに対して、通常約１～３モル、好ましくは約１～２モルである。
　本工程は、反応に悪影響を及ぼさない溶媒中で行われる。
　反応に悪影響を及ぼさない溶媒としては、例えば、ジメチルホルムアミド、ＴＨＦ、ジエチルエーテル等が挙げられる。
　反応温度は、通常約０～１００℃、好ましくは約２０～５０℃である。
　反応時間は、通常約２～４８時間、好ましくは約１２～２４時間である。
（工程２）
　化合物（２）と塩基の混合物を撹拌した後、酸で反応混合物のｐＨを調整することにより、４’－置換－２，２’：６’，２”－テルピリジン－６，６”－ジカルボン酸（以下、化合物（３）ともいう）を製造する。
　塩基としては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム等が挙げられる。
　塩基の使用量は、化合物（２）１モルに対して、通常約２～１０モル、好ましくは約３～５モルである。
　酸としては、例えば、塩酸、酢酸が挙げられる。
　ｐＨは、通常約２～５、好ましくは約３～４である。
　反応温度は、通常約０～１００℃、好ましくは約２０～４０℃である。
　反応時間は、通常約１０～４８時間、好ましくは約１２～３６時間である。
（工程３）
　塩基の存在下、化合物（３）と式（４）で表されるハロアルキルアルコキシラート誘導体（以下、化合物（４）ともいう）を反応させることにより、化合物（Ｉａ）を製造する。
　塩基としては、例えば、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、Ｎ，Ｎ－ジメチル－４－アミノピリジン等が挙げられる。
　塩基の使用量は、化合物（３）１モルに対して、通常約２～１０モル、好ましくは約２～４モルである。
　化合物（４）は、市販品を使用してもよく、あるいは公知の方法により対応する原料化合物から製造することもできる。
　化合物（４）の使用量は、化合物（３）１モルに対して、通常約２～６モル、好ましくは約２～４モルである。
　本工程は、反応に悪影響を及ぼさない溶媒中で行われる。
　反応に悪影響を及ぼさない溶媒としては、例えば、ジメチルホルムアミド、ＴＨＦ等が挙げられる。
　反応温度は、通常約０～１００℃、好ましくは約４０～６０℃である。
　反応時間は、通常約１２～４８時間、好ましくは約１２～３６時間である。
　上記Ａ法により得られる化合物（１）、化合物（２）および化合物（３）は、種々のアシル化反応、アルキル化反応、アミド化反応、酸化反応、還元反応、加水分解反応、脱水反応等の公知の反応に付すことにより、さらに誘導体化することもできる。このような反応は、それ自体公知の方法またはそれに準じて行うことができる。
　また、化合物（１）、化合物（２）および化合物（３）がヒドロキシ基等の官能基を有する場合、適宜保護して反応を行うことができる。このような保護基および保護・脱保護反応は、公知の保護基および方法（例えば、Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ社１９９９年刊「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　Ｇｒｏｕｐｓ　ｉｎ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，３ｒｄ　Ｅｄ．」（Ｔｈｅｏｄｏｒａ　Ｗ．　Ｇｒｅｅｎｅ，Ｐｅｔｅｒ　Ｇ．　Ｍ．　Ｗｕｔｓ著））に準じて行うことができる。
　化合物（Ｉ）中、Ｒ１がヒドロキシメチル基である式（Ｉｂ）で表される化合物またはその塩（以下、化合物（Ｉｂ）ともいう）は、以下のＢ法またはこれに準ずる方法により製造することができる。
［Ｂ法］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
［式中、ＡおよびＸは上記と同意義を示す。Ｒ２およびＲ３は上記と同意義を示し、かつ、同一である。］
　Ｘは、好ましくは、塩素原子である。
（工程１）
　式（５）で表される２，２’：６’，２”－テルピリジン－４’－カルボン酸（以下、化合物（５）ともいう）、炭酸カリウムおよびヨウ化メチルを反応させ、化合物（５）のメチルエステル体を製造する。
　炭酸カリウムの使用量は、化合物（５）１モルに対して、通常約１～５モル、好ましくは約２～３モルである。
　ヨウ化メチルの使用量は、化合物（５）１モルに対して、通常約１～５モル、好ましくは約１～２モルである。
　本工程は、反応に悪影響を及ぼさない溶媒中で行われる。
　反応に悪影響を及ぼさない溶媒としては、例えば、ジメチルホルムアミド、ＴＨＦ等が挙げられる。
　反応温度は、通常約０～１００℃、好ましくは約２０～４０℃である。
　反応時間は、通常約２～４８時間、好ましくは約１２～２４時間である。
（工程２）
　化合物（５）のメチルエステル体を水素化アルミニウムリチウムで還元し、化合物（５）のヒドロキシメチル体を製造する。
　水素化アルミニウムリチウムの使用量は、化合物（５）１モルに対して、通常約１～３モル、好ましくは約１～２モルである。
　本工程は、反応に悪影響を及ぼさない溶媒中で行われる。
　反応に悪影響を及ぼさない溶媒としては、例えば、ＴＨＦ、ジエチルエーテル等が挙げられる。
　反応温度は、通常約－２０～５０℃、好ましくは約０～２０℃である。
　反応時間は、通常約１～１２時間、好ましくは約３～５時間である。
（工程３）
　化合物（５）のヒドロキシメチル体をピリジンに溶解し、無水酢酸と反応させることにより、式（６）で表される２，２’：６’，２”－テルピリジン－４’－イルメチル　アセテート（以下、化合物（６）ともいう）を製造する。
　ピリジンの使用量は、化合物（５）１モルに対して、通常約１～１０Ｌ、好ましくは約２～５Ｌである。
　無水酢酸の使用量は、化合物（５）１モルに対して、通常約１～１０モル、好ましくは約１～２モルである。
　反応温度は、通常約０～１００℃、好ましくは約２０～４０℃である。
　反応時間は、通常約２～４８時間、好ましくは約１２～２４時間である。
（工程４）
　化合物（６）と過酸化物を反応させることにより化合物（６）のピリジンオキシドを製造する。
　本工程は、反応に悪影響を及ぼさない溶媒中で行われる。
　反応に悪影響を及ぼさない溶媒としては、例えば、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、１，２－ジクロロエタン、クロロベンゼン等が挙げられる。
　反応温度は、通常約－２０～５０℃、好ましくは約０～２０℃である。
　反応時間は、通常約２～４８時間、好ましくは約１２～２４時間である。
（工程５）
　化合物（６）のピリジンオキシドとベンゾイルクロリドを反応させ、次いでシアノ化剤を反応させることにより、式（７）で表される（６、６”－ジシアノ－２，２’：６’，２”－テルピリジン－４’－イル）メチル　アセテート（以下、化合物（７）ともいう）を製造する。
　本工程は、反応に悪影響を及ぼさない溶媒中で行われる。
　反応に悪影響を及ぼさない溶媒としては、例えばジクロロメタン等が挙げられる。
　ベンゾイルクロリドの使用量は化合物（６）１モルに対して、通常２～１０モル、好ましくは約４～５モルである。
　シアノ化剤としては、トリメチルシリルシアニド等が挙げられる。
　シアノ化剤の使用量は化合物（６）１モルに対して、通常２～１０モル、好ましくは約４～５モルである。
　反応温度は、通常約０～１００℃、好ましくは約２０～４０℃である。
　反応時間は、通常約２～４８時間、好ましくは約１２～２４時間である。
（工程６）
　化合物（７）をアルカリ加水分解に付すことにより、式（８）で表される４’－（ヒドロキシメチル）－２，２’：６’，２”－テルピリジン－６，６”－ジカルボン酸（以下、化合物（８）ともいう）を製造する。
　本工程は上記Ａ法の工程２と同様に行うことができる。
（工程７）
　塩基の存在下、化合物（８）と化合物（４）を反応させることにより、化合物（Ｉｂ）を製造する。
　本工程は上記Ａ法の工程３と同様に行うことができる。
　本発明の化合物は、細胞内におけるエステラーゼ分解後、ランタノイド元素と有機錯体を形成することができ、当該錯体の蛍光を測定することにより生細胞数を測定することができる。本発明の化合物によって測定できるものとしては、生細胞数に限定されるものではなく、例えば、細胞障害能、細胞増殖能が挙げられる。
　次に、本発明の細胞障害能を測定する方法を説明する。
　本発明の方法は、式（Ｉ）で表される化合物と細胞を混合する工程、およびランタノイド元素と錯体を形成し、蛍光を測定する工程を含む。
　本発明の方法における「細胞」としては、細胞障害能を持つ細胞であり、例えば、ＮＫ細胞、Ｔ細胞などの免疫細胞、白血病細胞などのがん細胞などが挙げられる。
　本発明の方法における「ランタノイド元素」としては、例えば、ユーロピウム、サマリウム、テルビウムなどが挙げられる。好ましくは、ユーロピウムが用いられる。
　本発明の方法における「界面活性剤」は、ＮＰ－４０、トリトンＸ－１００、ジギトニン、ＣＨＡＰＳ等から適宜選択される。好ましくは、ジギトニンである。
　上記蛍光は、例えば、時間分解蛍光測定により測定することができる。
　本発明の細胞障害能を測定する方法は、従来の細胞障害アッセイと比べて感度がよいため、測定時間を短縮することができる。
　本発明の細胞障害能を測定する際、標識化合物の自然漏出量を検討する必要があるが、その方法として、例えば下記の方法が挙げられる。
１．ＲＰＭＩ１６４０培地中、標的細胞を３７℃、５％ＣＯ２で終夜インキュベートする。
２．ＲＰＭＩ１６４０培地中、１×１０６細胞／ｍＬの濃度なるよう播種し、式（Ｉ）で表される化合物を終濃度が２５μＭになるように加え、３７℃、５％ＣＯ２で１５分間インキュベートする。
３．用時調製した０．１２５％ジギトニンＤＭＳＯ溶液を加え、よく混合した後、３７℃、５％ＣＯ２で１５分間インキュベートする。
　ここで、当該ジギトニンＤＭＳＯ溶液は、ジギトニンをＤＭＳＯに溶解し、すぐに水を添加し、ジギトニン濃度が最終的に０．０６２５％になるように調製する。
４．よく混合し、遠心した後、Ｅｕ溶液２５０μＬを含むプレート（９６ウェル、平底）に上清を移す。
５．１５分間静置した後、ＰＨＥＲＡｓｔａｒマイクロプレートリーダーにより時間分解蛍光を測定する。
　以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
　全てのＮＭＲデータは、Ｖａｒｉａｎ社の　Ｇｅｍｉｎｉ３００、　ＪＥＯＬ社の　ＡＬ　４００　、　Ｖａｒｉａｎ社の　５００ＰＳ　分光器で測定された。１Ｈと１３Ｃ　ＮＭＲスペクトルは、内部標準物質としてテトラメチルシランか、（２，２，３，３－Ｄ４）トリメチルシリル-３-プロピオン酸またはそのナトリウム塩（１Ｈ　および　１３Ｃ）を用いた溶媒ピークに対する１００万分率（ｐｐｍ）で化学シフト（δ）として記した。化学シフト（δ）は、１００万分率（ｐｐｍ）で記され、カップリング定数（Ｊ）は、ヘルツ（Ｈｚ）単位で記されている。多重度を記述するために次のような略語を使用している。
　ｓ＝シングレット，ｄ＝ダブレット，ｔ＝トリプレット，ｑ＝カルテット，ｑｕｉｎｔ．＝クインテット，ｓｅｘｔ．＝セクステット，ｓｅｐｔ．＝セプテット，ｂｒ＝ブロード，ｍ＝マルチプレット
　すべての反応は、マグネティックスターラーで撹拌され、不活性ガス雰囲気下で行われた。フラッシュカラムクロマトグラフィーは、Ｆｕｊｉ　Ｓｉｌｙｓｉａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｌｔｄ社製のｓｉｌｉｃａ　ｇｅｌ　Ｃ６０（５０－２００　μｍ）、あるいはＣＨＲＯＭＡＴＯＲＥＸ　ＤＩＯＬ（ＭＢ　１００－４０／７５）で、実験の項で述べられているように溶出液システムを用いて行われた。ＴＬＣは、ＴＬＣ　Ｓｉｌｉｃ　ｇｅｌ　６０　Ｆ２５４　ａｌｕｍｉｎｉｕｍ　ｓｈｅｅｔｓ（Ｍｅｒｃｋ社）か、ｓｉｌｉｃａ　ｇｅｌ　Ｆ２５４　ｇｌａｓｓ　ｐｌａｔｅｓ（Ｍｅｒｃｋ社）のどちらかを用いて行われた。
　実施例における略号の意味は以下の通りである。
ＮＭＲ：核磁気共鳴スペクトル
Ｈｚ：ヘルツ
Ｊ：カップリング定数
ＨＲＭＳ：高分解能質量分析スペクトル
ＴＨＦ：テトラヒドロフラン
ＤＭＦ：Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド
ＤＩＥＡ：ジイソプロピルエチルアミン
ＩＰＥ：ジイソプロピルエーテル
ＴＥＡ：トリエチルアミン
ＢＡＴＤＡ：ビス（アセトキシメチル）　２，２’：６’，２”－テルピリジン－６，６”－ジカルボキシラート
実施例１：
ビス（ブチリロキシメチル）　４’－（２－ヒドロキシエトキシ）－２，２’：６’，２”－テルピリジン－６，６”－ジカルボキシラート
（工程１）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
　上記Ａ法工程１に記載の方法（２．５　ｍｍｏｌ　スケール）に従って、求電子試剤として２－アセトキシエチルブロミドを用いて反応を行った。得られた粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（溶離液：５０％ｎ－ヘキサン／酢酸エチル）で精製することにより、ジエチル　４’－（２－アセトキシエトキシ）－２，２’：６’，２”－テルピリジン－６，６”－ジカルボキシラート（４９４ｍｇ、収率４１％）をオレンジ色固体として得た。
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 1.48 (t, J = 7.1 Hz, 6H), 2.14 (s, 3H), 4.49－4.54 (m, 4H), 4.52 (q, J = 7.1 Hz, 4H), 8.00 (t, J = 7.8 Hz, 2H), 8.16 (dd, J = 1.0, 7.6 Hz, 2H), 8.20 (s, 2H), 8.80 (dd, J = 1.0, 7.8 Hz, 2H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 14.3, 20.9, 61.8, 62.4, 66.1, 108.3, 124.3, 125.1, 137.7, 147.8, 156.0, 156.4, 165.2, 166.8, 170.9.
（工程２）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
　上記Ａ法工程２に記載の方法（０．８　ｍｍｏｌ　スケール）に従って、ジエチル　４’－（２－アセトキシエトキシ）－２，２’：６’，２”－テルピリジン－６，６”－ジカルボキシラートを用いて反応を行った。得られた粗生成物を減圧濃縮することにより、４’－（２－ヒドロキシエトキシ）－２，２’：６’，２”－テルピリジン－６，６”－ジカルボン酸（２４８ｍｇ、収率　７８％）を黄色固体として得た。得られた固体はさらに精製せず次の反応に用いた。
1H NMR (500 MHz, d-DMSO) δ 3.84 (t, J = 4.6 Hz, 2H), 4.32 (t, J = 4.6 Hz, 2H), 8.16 (d, J = 7.1 Hz, 2H), 8.19 (t, J = 7.8 Hz, 2H), 8.24 (s, 2H), 8.84 (d, J = 7.6 Hz, 2H); 13C NMR (125 MHz, d-DMSO) δ 59.4, 70.2, 107.9, 123.6, 124.8, 138.7, 154.3, 155.9, 166.3, 167.3.
（工程３）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
　上記Ａ法工程３に記載の方法（０．３９　ｍｍｏｌ　スケール）に従って、４’－（２－ヒドロキシエトキシ）－２，２’：６’，２”－テルピリジン－６，６”－ジカルボン酸およびブチリルオキシメチルクロリドを用いて反応を行った。得られた粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（溶離液：５０％ｎ－ヘキサン／酢酸エチル）で精製することにより、ビス（ブチリロキシメチル）　４’－（２－ヒドロキシエトキシ）－２，２’：６’，２”－テルピリジン－６，６”－ジカルボキシラート（１０１ｍｇ、収率４５％）を黄色固体として得た。
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 0.97 (t, J = 7.4 Hz, 6H), 1.70 (sext. J = 7.6 Hz, 4H), 2.41 (t, J = 7.4 Hz, 4H), 4.08 (t, J = 4.4 Hz, 2H), 4.41 (t, J = 4.9 Hz, 2H), 6.11 (s, 4H), 7.99 (t, J = 7.8 Hz, 2H), 8.16 (dd, J = 1.2, 7.6 Hz, 2H), 8.18 (s, 2H), 8.78 (dd, J = 1.0, 7.9 Hz, 2H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 13.5, 18.1, 35.8, 61.1, 69.6, 80.1, 108.5, 124.9, 125.6, 137.8, 146.3, 156.0, 156.2, 163.9, 167.1, 172.3.
実施例２：
ビス（アセトキシメチル）　４’－（２－オキソ－２－（プロピルアミノ）エトキシ）－２，２’：６’，２”－テルピリジン－６，６”－ジカルボキシラート
（工程１）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
　上記Ａ法工程１に記載の方法（１．０　ｍｍｏｌ　スケール）に従って、求電子試剤として２－オキソ－２－（プロピルアミノ）エトキシメチルブロミドを用いて反応を行った。得られた粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（溶離液：５０％ｎ－ヘキサン／酢酸エチル）で精製することにより、ジエチル　４’－（２－オキソ－２－（プロピルアミノ）エトキシ）－２，２’：６’，２”－テルピリジン－６，６”－ジカルボキシラート（３４２ｍｇ、収率７０％）を白色固体として得た。
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 0.99 (t, J = 7.1 Hz, 3H), 1.50 (t, J = 7.4 Hz, 6H), 1.65 (sext. J = 7.3 Hz. 2H), 3.38 (q, J = 7.9 Hz, 2H), 4.53 (t, J = 7.1 Hz, 4H), 6.76 (br. t, NH), 8.01 (t, J = 7.9 Hz, 2H), 8.17 (dd, J = 1.0, 7.6 Hz, 2H), 8.22 (s, 2H), 8.79 (dd, J = 1.0, 7.9 Hz, 2H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 11.3, 14.3, 22.8, 40.9, 61.9, 66.8, 108.2, 124.3, 125.3, 137.8, 147.8, 155.6, 156.7, 165.1, 165.3, 166.9.
（工程２）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
　上記Ａ法工程２に記載の方法（０．６　ｍｍｏｌ　スケール）に従って、ジエチル　４’－（２－オキソ－２－（プロピルアミノ）エトキシ）－２，２’：６’，２”－テルピリジン－６，６”－ジカルボキシラートを用いて反応を行うことにより、４’－（２－オキソ－２－（プロピルアミノ）エトキシ）－２，２’：６’，２”－テルピリジン－６，６”－ジカルボン酸（２１０ｍｇ、収率７９％）を薄黄色固体として得た。
1H NMR (500 MHz, d-DMSO) δ 0.84 (t, J = 7.6 Hz, 3H), 1.48 (sext. J = 7.1 Hz, 2H), 3.13 (q, J = 6.4 Hz, 2H), 4.82 (s, 2H), 8.15 (dd, J = 1.2, 7.8 Hz, 2H), 8.20 (t, J = 7.9 Hz, 2H), 8.25 (s, 2H), 8.37 (br. t, J = 5.9 Hz, NH), 8.86 (dd, J = 1.2, 7.8 Hz, 2H); 13C NMR (125 MHz, d-DMSO) δ 11.4, 22.4, 40.2, 66.9, 108.1, 124.2, 125.2, 138.9, 147.9, 154.6, 155.8, 165.9, 166.2, 166.6.
（工程３）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
　上記Ａ法工程３に記載の方法（０．１４　ｍｍｏｌ　スケール）に従って、４’－（２－オキソ－２－（プロピルアミノ）エトキシ）－２，２’：６’，２”－テルピリジン－６，６”－ジカルボン酸およびアセトキシメチルクロリドを用いて反応を行った。得られた粗生成物をカラムクロマトグラフィーで精製することにより、ビス（アセトキシメチル）　４’－（２－オキソ－２－（プロピルアミノ）エトキシ）－２，２’：６’，２”－テルピリジン－６，６”－ジカルボキシラート（７８ｍｇ、収率９８％）を白色固体として得た。
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 1.00 (t, J = 7.6 Hz, 3H), 1.67 (sext, J = 7.4 Hz, 2H), 2.19 (s, 6H), 3.40 (q, J = 7.3 Hz, 2H), 4.79 (s, 2H), 6.11 (s, 4H), 6.78 (br. t, J = 5.6 Hz, NH), 8.03 (t, J = 7.9 Hz, 2H), 8.20 (d, J = 7.4 Hz, 2H), 8.22 (s, 2H), 8.82 (d, J = 7.6 Hz, 2H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 11.4, 20.8, 22.8, 40.9, 66.9, 80.3, 108.4, 125.0, 125.9, 138.0, 146.5, 155.9, 156.5, 163.8, 165.4, 166.8, 169.6.
実施例３：
ビス（アセトキシメチル）　４’－（２－ヒドロキシエトキシ）－２，２’：６’，２”－テルピリジン－６，６”－ジカルボキシラート
（工程１）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
　上記Ａ法工程３に記載の方法（０．０５　ｍｍｏｌ　スケール）に従って、４’－（２－ヒドロキシエトキシ）－２，２’：６’，２”－テルピリジン－６，６”－ジカルボン酸およびアセトキシメチルクロリドを用いて反応を行った。得られた粗生成物をプレパラティブＴＬＣ（溶離液：クロロホルム：アセトン＝４：１）で精製することにより、標題化合物（１２ｍｇ、収率４７％）を白色固体として得た。
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 2.18 (s, 6H), 4.07-4,10 (m, 2H), 4.42 (t, J = 4.5 Hz, 2H), 6.11 (s, 4H), 8.01 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 8.18 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 8.21 (s, 2H), 8.81 (d, J = 8.0 Hz, 2H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 20.8, 61.1, 65.6, 80.2, 108.5, 124.9, 125.7, 137.9, 146.4, 156.1, 156.3, 163.9, 165.5, 169.6.
実施例４：
ビス（ブチリロキシメチル）　４’－（２－オキシエトキシ）－２，２’：６’，２”－テルピリジン－６，６”－ジカルボキシラート
（工程１）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
　２－ヨードキシ安息香酸（６０　ｍｇ，０．２１　ｍｍｏｌ）のＤＭＳＯ（２　ｍＬ）懸濁液に、ビス（ブチリロキシメチル）　４’－（２－ヒドロキシエトキシ）－２，２’：６’，２”－テルピリジン－６，６”－ジカルボキシラート（２５　ｍｇ，０．０４　ｍｍｏｌ）を室温で加え、２４時間撹拌した。水で反応をクエンチし、有機層を分離し、水層を酢酸エチル（２×１０　ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせ、食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。ろ過した後、減圧濃縮した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：酢酸エチル）で精製することにより、標題化合物（１９ｍｇ、収率７４％）を白色固体として得た。
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 0.98 (t, J = 7.4 Hz. 6H), 1.71 (sext. J = 7.3 Hz, 4H), 2.42 (t, J = 7.6 Hz, 4H), 4.93 (s, 2H), 6.12 (s, 4H), 8.02 (t, J = 8.1 Hz, 2H), 8.18－8.21 (m, 4H), 8.81 (d, J = 7.8 Hz, 2H), 9.96 (s, 1H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 13.5, 18.1, 35.8, 72.4, 80.1, 108.3, 124.9, 125.8, 137.9, 146.4, 163.8, 172.3, 172.5, 197.0.
実施例５：
ビス（プロピオニルオキシメチル）　４’－（２－ヒドロキシエトキシ）－２，２’：６’，２”－テルピリジン－６，６”－ジカルボキシラート
（工程１）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
　上記Ａ法工程３に記載の方法（０．０５　ｍｍｏｌ　スケール）に従って、４’－（２－ヒドロキシエトキシ）－２，２’：６’，２”－テルピリジン－６，６”－ジカルボン酸およびプロピオニルオキシメチルクロリドを用いて反応を行った。得られた粗生成物をプレパラティブＴＬＣ（溶離液：クロロホルム：アセトン＝２：１）で精製することにより、標題化合物（４ｍｇ、収率１３％）を白色固体として得た。
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 1.19 (t, J = 8.0 Hz, 6H), 2.46 (q, J = 8.0 Hz, 4H), 4.07-4.10 (m, 2H), 4.41 (t, J = 4.5 Hz, 2H), 6.12 (s, 4H), 8.01(t, J = 7.5 Hz, 2H), 8.18 (dd, J = 1.0, 7.5 Hz, 2H), 8.21 (s, 2H), 8.82 (dd, J = 1.0, 7.5 Hz, 2H).
実施例６：
ビス（ブチリロキシメチル）　４’－（３－ヒドロキシプロポキシ）－２，２’：６’，２”－テルピリジン－６，６”－ジカルボキシラート
（工程１）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
　上記Ａ法工程１に記載の方法（０．５　ｍｍｏｌ　スケール）に従って、求電子試剤として３－（（テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－イル）オキシ）プロピルブロミドを用いて反応を行った。得られた粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（溶離液：ヘキサン：酢酸エチル＝２：１～１：１）で精製することにより、ジエチル　４’－（３－（（テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－イル）オキシ）プロポキシ）－２，２’：６’，２”－テルピリジン－６，６”－ジカルボキシラート（１１０ｍｇ、収率４０％）を白色固体として得た。
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 1.49 (t, J = 7.0 Hz, 6H), 1.52-1.63 (m, 4H), 1.70-1.76 (m, 1H), 1.80-1.89 (m, 1H), 2.18 (quint., J = 6.0 Hz, 2H), 3.50-3.54 (m, 1H), 3.63-3.67 (m, 1H), 3.85-3.90 (m, 1H), 3.98-4.02 (m, 1H), 4.37-4.44 (m, 2H), 4.51 (q, J = 7.0 Hz, 4H), 4.63 (t, J = 4.5 Hz, 1H), 7.98 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 8.14 (dd, J = 1.0, 8.0 Hz, 2H), 8.17 (s, 2H), 8.78 (dd, J = 1.0, 8.0 Hz, 2H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 14.3, 19.6, 25.4, 29.5, 30.6, 61.8, 62.3, 63.7, 65.2, 99.0, 108.3, 124.3, 125.0, 137.6, 147.7, 156.2, 156.2, 165.3, 167.3.
（工程２）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
　上記Ａ法工程２に記載の方法（０．２０　ｍｍｏｌ　スケール）に従って、ジエチル　４’－（３－（（テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－イル）オキシ）プロポキシ）－２，２’：６’，２”－テルピリジン－６，６”－ジカルボキシラートを用いて反応を行うことにより、４’－（３－ヒドロキシプロポキシ）－２，２’：６’，２”－テルピリジン－６，６”－ジカルボン酸（６１ｍｇ、収率７７％）を黄色固体として得た。得られた固体はさらに精製せず次の反応に用いた。
1H NMR (500 MHz, d-DMSO) δ 1.93-1.99 (m, 2H), 3.62 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 4.33 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 8.11-8.19 (m, 6H), 8.78-8.84 (m, 2H); 13C NMR (125 MHz, d-DMSO) δ 32.0, 57.2, 65.6, 108.0, 124.3, 125.3, 139.0, 147.9, 154.6, 155.6, 165.9, 167.4.
（工程３）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
　上記Ａ法工程３に記載の方法（０．０５　ｍｍｏｌ　スケール）に従って、４’－（３－ヒドロキシプロポキシ）－２，２’：６’，２”－テルピリジン－６，６”－ジカルボン酸およびブチリルオキシメチルクロリドを用いて反応を行った。得られた粗生成物をプレパラティブＴＬＣ（溶離液：ヘキサン：酢酸エチル＝２：１）で精製することにより、ビス（ブチリロキシメチル）　４’－（３－ヒドロキシプロポキシ）－２，２’：６’，２”－テルピリジン－６，６”－ジカルボキシラート（１５ｍｇ、収率５１％）を白色固体として得た。
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 0.98 (t, J = 7.5 Hz, 6H), 1.71 (sext., J = 7.5 Hz, 4H), 2.16 (quint., J = 6.0 Hz, 2H), 2.41 (t, J = 7.5 Hz, 4H), 3.93 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 4.46 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 6.11 (s, 4H), 8.01 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 8.17 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 8.22 (s, 2H), 8.81 (d, J = 8.0 Hz, 2H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 13.5, 18.1, 31.9, 35.8, 59.6, 65.7, 80.1, 108.6, 124.9, 125.6, 137.8, 146.4, 156.1, 156.4, 163.9, 167.3, 172.4.
実施例７：
ビス（ブチリロキシメチル）　４’－（２－（２－ヒドロキシエトキシ）エトキシ）－２，２’：６’，２”－テルピリジン－６，６”－ジカルボキシラート
（工程１）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
　上記Ａ法工程１に記載の方法（１．３　ｍｍｏｌ　スケール）に従って、求電子試剤として２－（２－アセトキシエトキシ）エチルブロミドを用いて反応を行った。得られた粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（溶離液：５０％ｎ－ヘキサン／酢酸エチル）で精製することにより、ジエチル　４’－（２－（２－アセトキシエトキシ）エトキシ）－２，２’：６’，２”－テルピリジン－６，６”－ジカルボキシラート（６０ｍｇ、収率９％）をオレンジ色固体として得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1.49 (t, J = 7.1 Hz, 6H), 2.08 (s, 3H), 3.81－3.83 (m, 2H), 3.96－3.98 (m, 2H), 4.27 (t, J = 3.5 Hz, 2H), 4.43－4.46 (m, 2H), 4.50 (q, J = 7.1 Hz, 4H),7.98 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 8.13 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 8.19 (s, 2H), 8.87 (d, J = 7.8 Hz, 2H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 14.2, 20.8, 61.8, 63.5, 67.6, 69.3, 108.4, 124.4, 125.1, 137.7, 147.8, 156.2, 156.4, 165.4, 167.1, 171.1.
（工程２）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
　上記Ａ法工程２に記載の方法（０．１　ｍｍｏｌ　スケール）に従って、ジエチル　４’－（２－（２－アセトキシエトキシ）エトキシ）－２，２’：６’，２”－テルピリジン－６，６”－ジカルボキシラートを用いて反応を行い、減圧濃縮することにより、４’－（２－（２－ヒドロキシエトキシ）エトキシ）－２，２’：６’，２”－テルピリジン－６，６”－ジカルボン酸（３０ｍｇ、収率＞９０％）を白色固体として得た。得られた固体はさらに精製せず次の反応に用いた。
1H NMR (500 MHz, d-DMSO) δ 3.55 (m, 4H), 3.87 (t, J = 4.2 Hz, 2H), 4.44 (t, J = 3.9 Hz, 2H), 8.15 (dt, J = 1.3, 7.6 Hz, 2H), 8.20 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 8.26 (d, J = 1.7 Hz, 2H), 8.86 (ddd, J = 1.3, 2.4, 7.8 Hz, 2H); 13C NMR (125 MHz, d-DMSO) δ 60.7, 68.4, 69.1, 73.0, 108.5, 124.7, 125.6, 139.4, 148.2, 166.3, 167.5.
（工程３）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
　上記Ａ法工程３に記載の方法（０．０７　ｍｍｏｌ　スケール）に従って、４’－（２－（２－ヒドロキシエトキシ）エトキシ）－２，２’：６’，２”－テルピリジン－６，６”－ジカルボン酸およびブチリルオキシメチルクロリドを用いて反応を行った。得られた粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（溶離液：酢酸エチル）で精製することにより、ビス（ブチリロキシメチル）　４’－（２－（２－ヒドロキシエトキシ）エトキシ）－２，２’：６’，２”－テルピリジン－６，６”－ジカルボキシラート（２１ｍｇ、収率５６％）を薄黄色固体として得た。
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 0.98 (t, J = 7.6 Hz, 6H), 1.71 (sext. J = 7.6 Hz, 4H), 2,41 (t, J = 7.3 Hz, 4H), 3.72 (dd, J = 3.9, 5.6 Hz, 2H), 3.80 (dd, J = 4.2, 4.9 Hz, 2H), 3.97－3.99 (m, 2H), 4.47－4.49 (m, 2H), 6.11 (s, 4H), 8.00 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 8.17 (dd, J = 1.0, 7.8 Hz, 2H), 8.24 (s, 2H), 8.81 (dd, J = 1.0, 7.8 Hz, 2H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 13.5, 18.1, 35.8, 61.2, 67.7, 69.6, 72.7, 80.1, 108.7. 124.9, 125.6, 137.8, 146.4, 156.0, 156.4, 163.9, 167.2, 172.3.
実施例８：
ビス（ブチリロキシメチル）　４’－（ヒドロキシメチル）－２，２’：６’，２”－テルピリジン－６，６”－ジカルボキシラート
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
（工程１）
　２，２’：６’，２”－テルピリジン－４’－カルボン酸（２００　ｍｇ，０．７２　ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（３．６　ｍＬ）溶液に、炭酸カリウム（２０　ｍｇ，　１．４　ｍｍｏｌ）およびヨウ化メチル（０．０７　ｍＬ，１．１　ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温で１６時間撹拌した。反応混合物に食塩水を加え、水層を酢酸エチル（３×５．０　ｍＬ）で抽出し、抽出液を食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。混合物をろ過し、減圧濃縮することにより、粗生成物を得た。得られた粗生成物は精製せずに次の反応に用いた。　粗生成物（０．７２　ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（７．２　ｍＬ）溶液に、リチウム　アルミニウム　ヒドリド（２８　ｍｇ，０．７　ｍｍｏｌ）を０℃で加えた。３時間撹拌した後、反応混合物に硫酸ナトリウム１０水和物を加え、室温で１時間撹拌した。反応混合物をセライトパッドでろ過し、ろ液を減圧濃縮した。残渣をピリジン（３．６　ｍＬ）に溶解し、該溶液に無水酢酸（０．１４ｍＬ，　１．４　ｍｍｏｌ）を加えた。１６時間撹拌した後、混合物にトルエンを加え、減圧濃縮した。残渣をCHROMATOREX Diolシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：ｎ－ヘキサン：酢酸エチル＝１：０～１：１）で精製することにより、２，２’：６’，２”－テルピリジン－４’－イルメチル　アセテート（８８　ｍｇ、収率４０％　３工程）を白色固体として得た。
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 2.20 (s, 3H), 5.28 (s, 2H), 7.32-7.35 (m, 2H), 7.85 (dt, J = 2.0, 8.0 Hz, 2H), 8.43 (s, 2H), 8.61 (td, J = 1.0, 8.0 Hz, 2H), 8.70-8.71 (m, 2H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 20.9, 64.8, 119.2, 121.3, 123.9, 136.8, 146.9, 149.1, 155.8, 155.8, 170.6.
（工程２）
　２，２’：６’，２”－テルピリジン－４’－イルメチル　アセテート（８８　ｍｇ，０．２８　ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（２．８　ｍＬ）溶液に、ｍ－クロロ過安息香酸（１７０　ｍｇ，　７５％，　０．７４　ｍｍｏｌ）を０℃で加えた。１９時間撹拌した後、混合物を飽和チオ硫酸ナトリウム水溶液（２０　ｍＬ）で洗浄し、水層をクロロホルム（２×２０　ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液および食塩水で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、減圧濃縮した。残渣をジクロロメタン（２．８　ｍＬ）に溶解し、得られた溶液にベンゾイルクロリド（０．１０　ｍＬ，０．８６　ｍｏｌ）を室温で加えた。２０分間撹拌した後、トリメチルシリルシアニド（０．１１　ｍＬ，０．８７　ｍｍｏｌ）を滴下し、室温で１９時間撹拌した。該溶液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（５．０　ｍＬ）を加え、分液した後、水層をクロロホルム（３×５．０　ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：クロロホルム：酢酸エチル＝１：０～１５：１）で精製することにより、（６、６”－ジシアノ－２，２’：６’，２”－テルピリジン－４’－イル）メチル　アセテート（９２　ｍｇ，収率９２％）を白色固体として得た。
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 2.26 (s, 3H), 5.33 (s, 2H), 7.76 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 8.02 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 8.52 (s, 2H), 8.81 (d, J = 7.5 Hz, 2H); 13C NMR (125MHz, CDCl3) δ 20.9, 64.4, 117.2, 120.7, 124.3, 128.5, 133.4, 138.0, 148.1, 154.0, 157.0, 170.6.
（工程３）
　（６、６”－ジシアノ－２，２’：６’，２”－テルピリジン－４’－イル）メチル　アセテート（８０　ｍｇ，０．２３　ｍｍｏｌ）のエタノール（６．９　ｍＬ）溶液および蒸留水（１．８　ｍＬ）に水酸化カリウム（２００　ｍｇ，３．９　ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を １１時間加熱還流した後、室温まで冷却した。１規定塩酸でｐＨを約４に調整し、析出物をろ取することにより、４’－（ヒドロキシメチル）－２，２’：６’，２”－テルピリジン－６，６”－ジカルボン酸を薄茶色固体として得た。得られた固体はさらに精製せずに次の反応に用いた。
1H NMR (500 MHz, d-DMSO) δ 4.77 (s, 2H), 8.12 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 8.17 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 8.57 (s, 2H), 8.83 (d, J = 7.5 Hz, 2H); 13C NMR (125 MHz, d-DMSO) δ62.0, 124.0, 125.0, 138.8, 148.1, 154.0, 154.6, 155.2, 166.0. 
（工程４）
　４’－（ヒドロキシメチル）－２，２’：６’，２”－テルピリジン－６，６”－ジカルボン酸（１８　ｍｇ，０．０５　ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１．０　ｍＬ）溶液に、ジイソプロピルエチルアミン（０．０５　ｍＬ，０．２９　ｍｍｏｌ）およびクロロメチルブチラート（０．０３　ｍＬ，　０．２４　ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を５０℃に加熱した。１５時間撹拌した後、室温まで冷却し、混合物を飽和塩化アンモニウム水溶液（２．０　ｍＬ）で洗浄した。水層を酢酸エチル（３×５．０　ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過し、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：ｎ－ヘキサン：酢酸エチル＝２：１～１：１）で精製することにより、ビス（ブチリロキシメチル）　４’－（ヒドロキシメチル）－２，２’：６’，２”－テルピリジン－６，６”－ジカルボキシラート（１０ｍｇ，収率３６％）を白色ろう状物質として得た。
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 0.98 (t, J = 7.5 Hz, 6H), 1.71 (sext., J = 8.0 Hz, 4H), 2.41 (t, J = 7.5 Hz, 4H), 2.45 (brt, J = 6.0 Hz, 1H), 4.9(br. d, J = 6.0 Hz, 2H), 6.12 (s, 4H), 8.01 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 8.17 (dd, J = 1.0, 7.5 Hz, 2H), 8.61 (s, 2H), 8.80 (dd, J = 1.0, 7.5 Hz, 2H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 13.5, 18.1, 35.8, 63.9, 80.2, 119.7, 124.9, 125.6, 137.9, 146.5, 152.6, 154.5, 156.5, 163.9, 172.3.
実施例９：
ビス（アセトキシメチル）　４’－（ヒドロキシメチル）－２，２’：６’，２”－テルピリジン－６，６”－ジカルボキシラート
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
　上記Ａ法工程３に記載の方法（０．０５　ｍｍｏｌ　スケール）に従って、４’－（ヒドロキシメチル）－２，２’：６’，２”－テルピリジン－６，６”－ジカルボン酸およびアセトキシメチルクロリドを用いて反応を行った。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：ヘキサン：酢酸エチル＝２：１～１：３）で精製することにより、標題化合物（５．２ｍｇ、収率２０％）を白色固体として得た。
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 2.18 (s, 6H), 4.96 (brs. 2H), 6.11 (s, 4H), 8.02 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 8.19 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 8.62 (s, 2H), 8.82 (d, J = 7.5 Hz, 2H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 20.8, 63.9, 80.2, 119.7, 125.0, 125.7, 137.9, 138.9, 146.5, 154.6, 156.5, 169.6.
実施例１０：本発明化合物を用いた細胞障害能の測定（時間分解蛍光アッセイ（Ｅｕアッセイ：１）を行う際に、自然漏出量をモニターする必要があるが、その方法について下記に記す。）
　３０ｍＬのＲＰＭＩ１６４０培地中で、組織球腫Ｕ９３７細胞を、３７℃、５％ＣＯ２条件下で一晩培養し、該培養液３０ｍＬを５０ｍＬのコニカルチューブに移し、細胞数を計測した。１７００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心し、上清を廃棄し、１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように細胞をＲＰＭＩ１６４０培地に再懸濁した。該細胞懸濁液１ｍＬを１５ｍＬのコニカルチューブに移し、２．５μＬの式（I）で表される化合物またはその塩（１０ｍＭの保存溶液）を加え（最終濃度：２５μＭ）、３７℃、５％ＣＯ２条件下で１５分間インキュベートした。５ｍＬのＲＰＭＩ１６４０培地で細胞を３回洗浄した後、細胞を５ｍＬのＲＰＭＩ１６４０培地に再懸濁し、該細胞懸濁液２ｍＬを６ｍＬのＲＰＭＩ１６４０培地を含む１５ｍＬのコニカルチューブに移し、細胞の濃度を５×１０３ｃｅｌｌｓ／１００μＬとした。該細胞懸濁液１００μＬを、９６ウェル平底プレートの６つのウェルに播種した。自然漏出量を決定するためのウェルには１００μＬのＲＰＭＩ１６４０培地を、最大漏出量を決定するためのウェルには９０μＬのＲＰＭＩ１６４０培地を加えた。該プレートを５００ｒｐｍ、室温で２分間遠心した後、３７℃、５％ＣＯ２条件下で３０分間インキュベートした。新たに調製した１９％ＤＭＳＯ中の０．１２５％ジギトニン溶液（３ｍｇジギトニン、０．４５６ｍＬ　ＤＭＳＯおよび１．９４４ｍＬ　Ｈ２Ｏの混合溶液）１０μＬを、前記最大漏出量を決定するためのウェルにそれぞれ添加し、良く混合した後、さらに３０分間インキュベートした。インキュベーション後、再度細胞懸濁液を良く混合し、１７００ｒｐｍ、室温で２分間遠心した。遠心後、上清２５μＬを慎重にとり、２５０μＬのユーロピウム溶液を含む９６ウェル平底プレートに移した後、そこから２００μＬの溶液を９６ウェルＮｕｎｃプレートに移した。該プレートを１５分間静置した後、ＡＲＶＯマルチプレートリーダーで時間分解蛍光を測定した。
　上記の方法で測定した結果を下記表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000022
実施例１１：本発明化合物を用いた細胞障害能の測定（時間分解蛍光アッセイ（Ｅｕアッセイ：１））
（１）ターゲット細胞の準備
　３０ｍＬのＲＰＭＩ１６４０培地中で、ＨＴＬＶ－１に感染したＨＡＭ患者髄液由来の細胞株ＨＣＴ－４細胞を、３７℃、５％ＣＯ２条件下で一晩培養し、ＲＰＩＭＩ１６４０培地２０ｍＬ中に細胞４．８×１０６になるように、細胞を計測し０．２４×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製した。１７００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心し、上清を廃棄し、１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように細胞を４．８ｍＬのＲＰＭＩ１６４０培地に再懸濁した。該細胞懸濁液を各１ｍＬずつ１５ｍＬのコニカルチューブ２本（Ａ－１、Ａ－２）に移した。
（２）ターゲット細胞の準備
　３０ｍＬのＲＰＭＩ１６４０培地中で、ヒト慢性白血病由来細胞株Ｋ５６２細胞を、３７℃、５％ＣＯ２条件下で一晩培養し、ＲＰＩＭＩ１６４０培地２０ｍＬ中に細胞４．８×１０６になるように、細胞数を計測し０．２４×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製した。１７００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心し、上清を廃棄し、１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように細胞を４．８ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培地に再懸濁した。該細胞懸濁液を各１ｍＬずつ１５ｍＬのコニカルチューブ３本（Ｂ－１、Ｂ－２、Ｂ－３）に移した。Ｂ－１に２．５μＬのＤＭＳＯを、Ｂ－２とＢ－３には、２．５μＬの１０ｍＭ実施例８の化合物を加えた。３７℃で１５分間静置した。５ｍＬのＲＰＭＩ１６４０培地で細胞を３回洗浄した後、１７００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心し、それぞれを５ｍＬのＲＰＭＩ１６４０培地に再懸濁し、該細胞懸濁液２ｍＬを６ｍＬのＲＰＭＩ１６４０培地を含む１５ｍＬのコニカルチューブに移した。
（３）エフェクター細胞の準備
　ヘルパーＮＫ細胞６０×１０３ｃｅｌｌｓを、１２ｍｌのＲＰＭＩ培養液に懸濁し、１７００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心し、上清を捨て、ＲＰＭＩ１６４０培養液３ｍｌに再懸濁した。
　以下、下記の濃度に調整したものを３ｍＬずつ準備した。
 
ヘルパーＮＫ細胞濃度
エフェクター細胞／標的細胞比４０　　　　　　2 x 106/ml 
エフェクター細胞／標的細胞比２０　　　　　　1 x 106/ml 
エフェクター細胞／標的細胞比１０　　　　　　5 x 105/ml
エフェクター細胞／標的細胞比５　　　　　　　2.5 x 105/ml 
エフェクター細胞／標的細胞比２．５　　　　　1.25 x 104/ml 
エフェクター細胞／標的細胞比１．２５　　　　6.25 x 103/ml 
エフェクター細胞／標的細胞比０．６２５　　　3.125 x 103/ml 
エフェクター細胞／標的細胞比０　　　　　　　0/ml (Cell concentration):
 
　上記濃度ヘルパーＮＫ細胞懸濁液をそれぞれ１００μＬ、また自然漏出量を決めるためにＲＰＩＭ１６４０培養液１００μＬ、最大漏出量を決定するためにＲＰＩＭ培養液９０μＬを、９６ウェル平底プレートに加えた。ＨＣＴ-４細胞液、Ｋ５６２細胞液を９６穴プレートに１００μＬ加えた。
　上記までの９６穴プレートの配置は図１に示す通りである。該プレートを５００ｒｐｍ、室温で２分間遠心した後、３７℃で２０分間インキュベートした。１９％ＤＭＳＯ中の０．１２５％ジギトニン溶液（３ｍｇジギトニン、０．４５６ｍＬ　ＤＭＳＯおよび１．９４４ｍＬ　Ｈ２Ｏの混合溶液）を、新たに調製しその１０μＬを、最大放出量を決定するためのウェルにそれぞれ添加し、良く混合した後、さらに２０分間インキュベートした。インキュベーション後、再度細胞懸濁液を良く混合し、１７００ｒｐｍ、室温で２分間遠心した。遠心後、上清２５μＬを慎重にとり、２５０μＬのユーロピウム溶液を含む９６ウェル平底プレートに移した後、そこから２００μＬの溶液を９６ウェルＮｕｎｃプレートに移した。該プレートを１５分間静置した後、ＡＲＶＯマルチプレートリーダーで時間分解蛍光を測定した。
　上記の方法で測定した結果を図２および図３に示す。
　これにより、エフェクター細胞の細胞障害能の測定が可能であることが示された。
　本発明の化合物は、細胞障害能または細胞増殖能を測定するための試薬として有用である。また、当該試薬を用いて、細胞障害能または細胞増殖能を正確で再現性が高く、かつ、簡便で迅速に測定することができる。
　本出願は、日本国で２０１４年３月３１日に出願された特願２０１４－０７３４７５を基礎としており、その内容は本明細書にすべて包含されるものである。

Claims (8)

  1. 　式（Ｉ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （式中、
    Ｒ１は、置換基を示し、
    Ｒ２およびＲ３は、それぞれ、置換されていてもよい炭化水素基、または置換されていてもよい複素環基を示し、
    Ｙは、置換基を示し、
    ｎは、０～３の整数を示し、
    Ｚは、単結合、－Ｏ－、－Ｓ－、－ＳＯ－、－ＳＯ２－、または－ＮＲ４－（Ｒ４は、水素原子または置換基を示す。）を示し、
    および
    Ａは、置換されていてもよいＣ１－６アルキレン基を示す。）
    で表される化合物またはその塩。
  2. 　Ａがメチレンである、請求項１に記載の化合物またはその塩。
  3. 　請求項１または２に記載の化合物またはその塩を含む、有機錯体形成剤。
  4. 　請求項１または２に記載の化合物またはその塩を含む、生細胞数測定用試薬。
  5. 　細胞障害能測定用試薬である、請求項４に記載の試薬。
  6. 　細胞増殖能測定用試薬である、請求項４に記載の試薬。
  7. 　請求項１または２に記載の化合物またはその塩と細胞を混合する工程、および
    　ランタノイド元素と錯体を形成し、蛍光を測定する工程
    を含む、細胞障害能を測定する方法。
  8. 　ランタノイド元素と錯体を形成する前に、界面活性剤を加えることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0068875A2 (en) * 1981-07-01 1983-01-05 EASTMAN KODAK COMPANY (a New Jersey corporation) Fluorescent chelates and labeled specific binding reagents prepared therefrom
WO1990000550A1 (en) * 1988-07-08 1990-01-25 Wallac Oy Terpyridine derivatives

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4837169A (en) 1981-07-01 1989-06-06 Eastman Kodak Company Polypyridine Fluorescent labels for immunoassay
US4801722A (en) 1981-07-01 1989-01-31 Eastman Kodak Company Coumarin chelates
US4794191A (en) 1981-07-01 1988-12-27 Eastman Kodak Company Fluorescent chelates
US4637988A (en) 1981-07-01 1987-01-20 Eastman Kodak Company Fluorescent labels for immunoassay
US4670572A (en) 1981-07-01 1987-06-02 Eastman Kodak Company Phenolic fluorescent labels
US4859777A (en) 1981-07-01 1989-08-22 Eastman Kodak Company Terpyridine chelating agents
US5202423A (en) 1988-07-08 1993-04-13 Wallac Oy Terpyridine derivatives
US5648270A (en) 1995-02-06 1997-07-15 Molecular Probes, Inc. Methods of sensing with fluorescent conjugates of metal-chelating nitrogen heterocycles
EP2161339A1 (en) * 2008-08-29 2010-03-10 F. Hoffmann-La Roche Ag ADCC with modified NK92 cells
FR2948371B1 (fr) 2009-07-21 2011-08-19 Commissariat Energie Atomique Composes utiles comme ligands des actinides, leur synthese et leurs utilisations

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0068875A2 (en) * 1981-07-01 1983-01-05 EASTMAN KODAK COMPANY (a New Jersey corporation) Fluorescent chelates and labeled specific binding reagents prepared therefrom
WO1990000550A1 (en) * 1988-07-08 1990-01-25 Wallac Oy Terpyridine derivatives

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BLOMBERG K. ET AL.: "Journal of Immunological Methods", vol. 193, no. 2, 1996, pages 199 - 206, XP055359262 *
HEMMILA I. ET AL.: "Di- and tetracarboxylate derivatives of pyridines, bipyridines and terpyridines as luminogenic reagents for time- resolved fluorometric determination of terbium and dysprosium", JOURNAL OF BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL METHODS, vol. 26, no. 4, 1993, pages 283 - 90, XP025211400 *

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