JP6501271B2 - 非ri系における細胞障害能迅速測定法 - Google Patents
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Description
[1]式(I):
R2およびR3は、それぞれ、置換されていてもよい炭化水素基、または置換されていてもよい複素環基を示し、
Yは、置換基を示し、
nは、0〜3の整数を示し、
Zは、単結合、−O−、−S−、−SO−、−SO2−、または−NR4−(R4は、水素原子または置換基を示す。)を示し、
および
Aは、置換されていてもよいC1−6アルキレン基を示す。)
で表される化合物またはその塩(以下、化合物(I)と略記することがある。)。
[2]Aがメチレンである、上記[1]に記載の化合物またはその塩。
[3]上記[1]または[2]に記載の化合物またはその塩を含む、有機錯体形成剤。
[4]上記[1]または[2]に記載の化合物またはその塩を含む、生細胞数測定用試薬。
[5]細胞障害能測定用試薬である、上記[4]に記載の試薬。
[6]細胞増殖能測定用試薬である、上記[4]に記載の試薬。
[7]上記[1]または[2]に記載の化合物またはその塩と細胞を混合する工程、および
ランタノイド元素と錯体を形成し、蛍光を測定する工程
を含む、細胞障害能を測定する方法。
[8]ランタノイド元素と錯体を形成する前に、界面活性剤を加えることを特徴とする、上記[7]に記載の方法。
以下、本明細書中で用いられる各置換基の定義について詳述する。
本明細書中、「ハロゲン原子」としては、例えば、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素が挙げられる。
本明細書中の「置換されていてもよい炭化水素基」としては、特に断りのない限り、例えば、「置換されていてもよいC1−12アルキル基」、「置換されていてもよいC2−12アルケニル基」、「置換されていてもよいC2−12アルキニル基」、「置換されていてもよいC3−8シクロアルキル基」、「置換されていてもよいC3−8シクロアルケニル基」、「置換されていてもよいC7−14アラルキル基」、「置換されていてもよいC6−14アリール基」などが挙げられる。
例えば、ピロリジニル(例:1−ピロリジニル、2−ピロリジニル、3−ピロリジニル)、オキサゾリジニル(例:2−オキサゾリジニル)、イミダゾリニル(例:1−イミダゾリニル、2−イミダゾリニル、4−イミダゾリニル)、ピペリジニル(例:ピペリジノ、2−ピペリジニル、3−ピペリジニル、4−ピペリジニル)、ピペラジニル(例:1−ピペラジニル、2−ピペラジニル)、モルホリニル(例:2−モルホリニル、3−モルホリニル、モルホリノ)、チオモルホリニル(例:2−チオモルホリニル、3−チオモルホリニル、チオモルホリノ)、テトラヒドロフリル、テトラヒドロピラニルなどの非芳香族複素環基などが挙げられる。
[置換基群A]
(1)ハロゲン原子;
(2)ヒドロキシ;
(3)アミノ;
(4)ニトロ;
(5)シアノ;
(6)ハロゲン原子、ヒドロキシ、アミノ、ニトロ、シアノ、ハロゲン化されていてもよいC1−6アルキル、モノ−又はジ−C1−6アルキル−アミノ、C6−14アリール、モノ−又はジ−C6−14アリール−アミノ、C3−8シクロアルキル、C1−6アルコキシ、C1−6アルコキシ−C1−6アルコキシ、C1−6アルキルスルファニル、C1−6アルキルスルフィニル、C1−6アルキルスルホニル、エステル化されていてもよいカルボキシル、カルバモイル、チオカルバモイル、モノ−又はジ−C1−6アルキル−カルバモイル、モノ−又はジ−C6−14アリール−カルバモイル、スルファモイル、モノ−又はジ−C1−6アルキル−スルファモイル及びモノ−又はジ−C6−14アリール−スルファモイルから選ばれる1ないし3個の置換基で置換されていてもよい複素環基;
(7)モノ−又はジ−C1−6アルキル−アミノ;
(8)モノ−又はジ−C6−14アリール−アミノ;
(9)モノ−又はジ−C7−14アラルキル−アミノ;
(10)N−C1−6アルキル−N−C6−14アリール−アミノ;
(11)N−C1−6アルキル−N−C7−14アラルキル−アミノ;
(12)C3−8シクロアルキル;
(13)ハロゲン化されていてもよいC1−6アルコキシ;
(14)C1−6アルキルスルファニル;
(15)C1−6アルキルスルフィニル;
(16)C1−6アルキルスルホニル;
(17)エステル化されていてもよいカルボキシル;
(18)C1−6アルキル−カルボニル;
(19)C3−8シクロアルキル−カルボニル;
(20)C6−14アリール−カルボニル;
(21)カルバモイル;
(22)チオカルバモイル;
(23)モノ−又はジ−C1−6アルキル−カルバモイル;
(24)モノ−又はジ−C6−14アリール−カルバモイル;
(25)N−C1−6アルキル−N−C6−14アリール−カルバモイル;
(26)モノ−又はジ−5ないし7員複素環−カルバモイル;
(27)カルボキシルで置換されていてもよいC1−6アルキル−カルボニルアミノ;
(28)ハロゲン原子、ヒドロキシ、アミノ、ニトロ、シアノ、ハロゲン化されていてもよいC1−6アルキル、モノ−又はジ−C1−6アルキル−アミノ、C6−14アリール、モノ−又はジ−C6−14アリール−アミノ、C3−8シクロアルキル、C1−6アルコキシ、C1−6アルコキシ−C1−6アルコキシ、C1−6アルキルスルファニル、C1−6アルキルスルフィニル、C1−6アルキルスルホニル、エステル化されていてもよいカルボキシル、カルバモイル、チオカルバモイル、モノ−又はジ−C1−6アルキル−カルバモイル、モノ−又はジ−C6−14アリール−カルバモイル、スルファモイル、モノ−又はジ−C1−6アルキル−スルファモイル及びモノ−又はジ−C6−14アリール−スルファモイルから選ばれる1ないし3個の置換基で置換されていてもよいC6−14アリールオキシ;
(29)ハロゲン原子、ヒドロキシ、アミノ、ニトロ、シアノ、ハロゲン化されていてもよいC1−6アルキル、モノ−又はジ−C1−6アルキル−アミノ、C6−14アリール、モノ−又はジ−C6−14アリール−アミノ、C3−8シクロアルキル、C1−6アルコキシ、C1−6アルコキシ−C1−6アルコキシ、C1−6アルキルスルファニル、C1−6アルキルスルフィニル、C1−6アルキルスルホニル、エステル化されていてもよいカルボキシル、カルバモイル、チオカルバモイル、モノ−又はジ−C1−6アルキル−カルバモイル、モノ−又はジ−C6−14アリール−カルバモイル、スルファモイル、モノ−又はジ−C1−6アルキル−スルファモイル及びモノ−又はジ−C6−14アリール−スルファモイルから選ばれる1ないし3個の置換基で置換されていてもよいC6−14アリール;
(30)複素環−オキシ;
(31)スルファモイル;
(32)モノ−又はジ−C1−6アルキル−スルファモイル;
(33)モノ−又はジ−C6−14アリール−スルファモイル;
(34)ハロゲン原子、ヒドロキシ、アミノ、ニトロ、シアノ、ハロゲン化されていてもよいC1−6アルキル、モノ−又はジ−C1−6アルキル−アミノ、C6−14アリール、モノ−又はジ−C6−14アリール−アミノ、C3−8シクロアルキル、C1−6アルコキシ、C1−6アルコキシ−C1−6アルコキシ、C1−6アルキルスルファニル、C1−6アルキルスルフィニル、C1−6アルキルスルホニル、エステル化されていてもよいカルボキシル、カルバモイル、チオカルバモイル、モノ−又はジ−C1−6アルキル−カルバモイル、モノ−又はジ−C6−14アリール−カルバモイル、スルファモイル、モノ−又はジ−C1−6アルキル−スルファモイル及びモノ−又はジ−C6−14アリール−スルファモイルから選ばれる1ないし3個の置換基で置換されていてもよいC7−14アラルキルオキシ;
(35)C1−6アルキル−カルボニルオキシ;
(36)C1−6アルコキシ−カルボニル;
(37)モノ−又はジ−C1−6アルキル−カルボニルアミノ;
(38)モノ−又はジ−C1−6アルコキシ−カルボニルアミノ;
(39)モノ−又はジ−C6−14アリールオキシ−カルボニルアミノ;
(40)モノ−又はジ−C7−14アラルキルオキシ−カルボニルアミノ;
(41)トリC1−6アルキルシリルオキシ;
などから選ばれる1ないし5個の置換基をそれぞれ置換可能な位置に有していてもよい、「C1−12アルキル基」、「C2−12アルケニル基」、「C2−12アルキニル基」、「C1−6アルキレン基」が挙げられる。置換基が複数存在する場合、各置換基は同一でも異なっていてもよい。
[置換基群B]
(1)置換基群A;
(2)置換されていてもよいC1−6アルキル;
(3)置換されていてもよいC2−6アルケニル;
(4)置換されていてもよいC2−6アルキニル;
などから選ばれる1ないし5個の置換基をそれぞれ置換可能な位置に有していてもよい、「C3−8シクロアルキル基」、「C3−8シクロアルケニル基」、「C7−14アラルキル基」、「C6−14アリール基」、「複素環基」が挙げられる。置換基が複数存在する場合、各置換基は同一でも異なっていてもよい。
R1は、置換基を示す。
R1は、好ましくは、置換されていてもよいC1−12アルキル基、または置換されていてもよいC1−12アルコキシ基である。
R1は、より好ましくは、
(1)ヒドロキシ基、
(2)ホルミル基、
(3)C1−6アルキル−アミノカルボニル基(例、エチルアミノカルボニル)、および
(4)ヒドロキシ−C1−6アルコキシ基(例、ヒドロキシエトキシ)
から選択される1ないし3個の置換基で置換されていてもよいC1−6アルキル(例、メチル、エチル、プロピル)
である。
R2およびR3は、好ましくは、C1−12アルキル基である。
R2およびR3は、より好ましくは、C1−6アルキル基(例、メチル、エチル、プロピル)である。
nは、0〜3の整数を示す。
nは、好ましくは0である。
Zは、好ましくは、単結合または−O−である。
Aは、好ましくは、メチレンである。
[化合物A]
R1が、
(1)ヒドロキシ基、
(2)ホルミル基、
(3)C1−6アルキル−アミノカルボニル基(例、エチルアミノカルボニル)、および
(4)ヒドロキシ−C1−6アルコキシ基(例、ヒドロキシエトキシ)
から選択される1ないし3個の置換基で置換されていてもよいC1−6アルキル(例、メチル、エチル、プロピル)であり、
R2およびR3が、C1−6アルキル基(例、メチル、エチル、プロピル)
であり、
nが0であり、
Zが、単結合または−O−であり、および
Aが、メチレン基
である化合物またはその塩。
なお、以下の製造法において得られる製造中間体は、精製せずに次の反応に用いることもできるが、反応混合物からクロマトグラフィー、再結晶等の公知の手法により単離、精製して用いてもよい。
化合物(I)中、R1がアルコキシ基である式(Ia)で表される化合物またはその塩(以下、化合物(Ia)ともいう)は、以下のA法またはこれに準ずる方法により製造することができる。
[A法]
Xは、好ましくは、塩素原子である。
(工程1)
アルカリ金属水素化物に、ジエチル 1’,H−[2,2’:6’,2”]テルピリジン−4’−オキソ−6,6”−ジカルボキシラート(以下、化合物(1)ともいう)を加えた後、求電子試剤を反応させることによりO−置換−2,2’:6’,2”−テルピリジン−6,6”−ジカルボキシラート(以下、化合物(2)ともいう)を製造する。
化合物1は、公知の方法(P. Kadjane, C. Plata−Iglesias, R. Ziessel, L. J. Charbonniere, Dalton Trans. 2009, 5688−5700)またはそれに準ずる方法で製造することができる。
アルカリ金属水素化物としては、例えば、水素化ナトリウム、水素化カリウムなどが挙げられる。
求電子試剤としては、例えば、ヨウ化メチル、臭化エチルなどが挙げられる。
求電子試剤の使用量は、化合物(1)1モルに対して、通常約1〜3モル、好ましくは約1〜2モルである。
本工程は、反応に悪影響を及ぼさない溶媒中で行われる。
反応に悪影響を及ぼさない溶媒としては、例えば、ジメチルホルムアミド、THF、ジエチルエーテル等が挙げられる。
反応温度は、通常約0〜100℃、好ましくは約20〜50℃である。
反応時間は、通常約2〜48時間、好ましくは約12〜24時間である。
(工程2)
化合物(2)と塩基の混合物を撹拌した後、酸で反応混合物のpHを調整することにより、4’−置換−2,2’:6’,2”−テルピリジン−6,6”−ジカルボン酸(以下、化合物(3)ともいう)を製造する。
塩基としては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム等が挙げられる。
塩基の使用量は、化合物(2)1モルに対して、通常約2〜10モル、好ましくは約3〜5モルである。
酸としては、例えば、塩酸、酢酸が挙げられる。
pHは、通常約2〜5、好ましくは約3〜4である。
反応温度は、通常約0〜100℃、好ましくは約20〜40℃である。
反応時間は、通常約10〜48時間、好ましくは約12〜36時間である。
(工程3)
塩基の存在下、化合物(3)と式(4)で表されるハロアルキルアルコキシラート誘導体(以下、化合物(4)ともいう)を反応させることにより、化合物(Ia)を製造する。
塩基としては、例えば、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、N,N−ジメチル−4−アミノピリジン等が挙げられる。
塩基の使用量は、化合物(3)1モルに対して、通常約2〜10モル、好ましくは約2〜4モルである。
化合物(4)は、市販品を使用してもよく、あるいは公知の方法により対応する原料化合物から製造することもできる。
化合物(4)の使用量は、化合物(3)1モルに対して、通常約2〜6モル、好ましくは約2〜4モルである。
本工程は、反応に悪影響を及ぼさない溶媒中で行われる。
反応に悪影響を及ぼさない溶媒としては、例えば、ジメチルホルムアミド、THF等が挙げられる。
反応温度は、通常約0〜100℃、好ましくは約40〜60℃である。
反応時間は、通常約12〜48時間、好ましくは約12〜36時間である。
また、化合物(1)、化合物(2)および化合物(3)がヒドロキシ基等の官能基を有する場合、適宜保護して反応を行うことができる。このような保護基および保護・脱保護反応は、公知の保護基および方法(例えば、Wiley−Interscience社1999年刊「Protective Groups in Organic Synthesis,3rd Ed.」(Theodora W. Greene,Peter G. M. Wuts著))に準じて行うことができる。
[B法]
Xは、好ましくは、塩素原子である。
式(5)で表される2,2’:6’,2”−テルピリジン−4’−カルボン酸(以下、化合物(5)ともいう)、炭酸カリウムおよびヨウ化メチルを反応させ、化合物(5)のメチルエステル体を製造する。
炭酸カリウムの使用量は、化合物(5)1モルに対して、通常約1〜5モル、好ましくは約2〜3モルである。
ヨウ化メチルの使用量は、化合物(5)1モルに対して、通常約1〜5モル、好ましくは約1〜2モルである。
本工程は、反応に悪影響を及ぼさない溶媒中で行われる。
反応に悪影響を及ぼさない溶媒としては、例えば、ジメチルホルムアミド、THF等が挙げられる。
反応温度は、通常約0〜100℃、好ましくは約20〜40℃である。
反応時間は、通常約2〜48時間、好ましくは約12〜24時間である。
(工程2)
化合物(5)のメチルエステル体を水素化アルミニウムリチウムで還元し、化合物(5)のヒドロキシメチル体を製造する。
水素化アルミニウムリチウムの使用量は、化合物(5)1モルに対して、通常約1〜3モル、好ましくは約1〜2モルである。
本工程は、反応に悪影響を及ぼさない溶媒中で行われる。
反応に悪影響を及ぼさない溶媒としては、例えば、THF、ジエチルエーテル等が挙げられる。
反応温度は、通常約−20〜50℃、好ましくは約0〜20℃である。
反応時間は、通常約1〜12時間、好ましくは約3〜5時間である。
(工程3)
化合物(5)のヒドロキシメチル体をピリジンに溶解し、無水酢酸と反応させることにより、式(6)で表される2,2’:6’,2”−テルピリジン−4’−イルメチル アセテート(以下、化合物(6)ともいう)を製造する。
ピリジンの使用量は、化合物(5)1モルに対して、通常約1〜10L、好ましくは約2〜5Lである。
無水酢酸の使用量は、化合物(5)1モルに対して、通常約1〜10モル、好ましくは約1〜2モルである。
反応温度は、通常約0〜100℃、好ましくは約20〜40℃である。
反応時間は、通常約2〜48時間、好ましくは約12〜24時間である。
(工程4)
化合物(6)と過酸化物を反応させることにより化合物(6)のピリジンオキシドを製造する。
本工程は、反応に悪影響を及ぼさない溶媒中で行われる。
反応に悪影響を及ぼさない溶媒としては、例えば、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、1,2−ジクロロエタン、クロロベンゼン等が挙げられる。
反応温度は、通常約−20〜50℃、好ましくは約0〜20℃である。
反応時間は、通常約2〜48時間、好ましくは約12〜24時間である。
(工程5)
化合物(6)のピリジンオキシドとベンゾイルクロリドを反応させ、次いでシアノ化剤を反応させることにより、式(7)で表される(6、6”−ジシアノ−2,2’:6’,2”−テルピリジン−4’−イル)メチル アセテート(以下、化合物(7)ともいう)を製造する。
本工程は、反応に悪影響を及ぼさない溶媒中で行われる。
反応に悪影響を及ぼさない溶媒としては、例えばジクロロメタン等が挙げられる。
ベンゾイルクロリドの使用量は化合物(6)1モルに対して、通常2〜10モル、好ましくは約4〜5モルである。
シアノ化剤としては、トリメチルシリルシアニド等が挙げられる。
シアノ化剤の使用量は化合物(6)1モルに対して、通常2〜10モル、好ましくは約4〜5モルである。
反応温度は、通常約0〜100℃、好ましくは約20〜40℃である。
反応時間は、通常約2〜48時間、好ましくは約12〜24時間である。
(工程6)
化合物(7)をアルカリ加水分解に付すことにより、式(8)で表される4’−(ヒドロキシメチル)−2,2’:6’,2”−テルピリジン−6,6”−ジカルボン酸(以下、化合物(8)ともいう)を製造する。
本工程は上記A法の工程2と同様に行うことができる。
(工程7)
塩基の存在下、化合物(8)と化合物(4)を反応させることにより、化合物(Ib)を製造する。
本工程は上記A法の工程3と同様に行うことができる。
次に、本発明の細胞障害能を測定する方法を説明する。
本発明の方法は、式(I)で表される化合物と細胞を混合する工程、およびランタノイド元素と錯体を形成し、蛍光を測定する工程を含む。
本発明の方法における「ランタノイド元素」としては、例えば、ユーロピウム、サマリウム、テルビウムなどが挙げられる。好ましくは、ユーロピウムが用いられる。
本発明の方法における「界面活性剤」は、NP−40、トリトンX−100、ジギトニン、CHAPS等から適宜選択される。好ましくは、ジギトニンである。
本発明の細胞障害能を測定する方法は、従来の細胞障害アッセイと比べて感度がよいため、測定時間を短縮することができる。
1.RPMI1640培地中、標的細胞を37℃、5%CO2で終夜インキュベートする。
2.RPMI1640培地中、1×106細胞/mLの濃度なるよう播種し、式(I)で表される化合物を終濃度が25μMになるように加え、37℃、5%CO2で15分間インキュベートする。
3.用時調製した0.125%ジギトニンDMSO溶液を加え、よく混合した後、37℃、5%CO2で15分間インキュベートする。
ここで、当該ジギトニンDMSO溶液は、ジギトニンをDMSOに溶解し、すぐに水を添加し、ジギトニン濃度が最終的に0.0625%になるように調製する。
4.よく混合し、遠心した後、Eu溶液250μLを含むプレート(96ウェル、平底)に上清を移す。
5.15分間静置した後、PHERAstarマイクロプレートリーダーにより時間分解蛍光を測定する。
全てのNMRデータは、Varian社の Gemini300、 JEOL社の AL 400 、 Varian社の 500PS 分光器で測定された。1Hと13C NMRスペクトルは、内部標準物質としてテトラメチルシランか、(2,2,3,3−D4)トリメチルシリル-3-プロピオン酸またはそのナトリウム塩(1H および 13C)を用いた溶媒ピークに対する100万分率(ppm)で化学シフト(δ)として記した。化学シフト(δ)は、100万分率(ppm)で記され、カップリング定数(J)は、ヘルツ(Hz)単位で記されている。多重度を記述するために次のような略語を使用している。
s=シングレット,d=ダブレット,t=トリプレット,q=カルテット,quint.=クインテット,sext.=セクステット,sept.=セプテット,br=ブロード,m=マルチプレット
すべての反応は、マグネティックスターラーで撹拌され、不活性ガス雰囲気下で行われた。フラッシュカラムクロマトグラフィーは、Fuji Silysia Chemical Ltd社製のsilica gel C60(50−200 μm)、あるいはCHROMATOREX DIOL(MB 100−40/75)で、実験の項で述べられているように溶出液システムを用いて行われた。TLCは、TLC Silic gel 60 F254 aluminium sheets(Merck社)か、silica gel F254 glass plates(Merck社)のどちらかを用いて行われた。
NMR:核磁気共鳴スペクトル
Hz:ヘルツ
J:カップリング定数
HRMS:高分解能質量分析スペクトル
THF:テトラヒドロフラン
DMF:N,N−ジメチルホルムアミド
DMSO:ジメチルスルホキシド
DIEA:ジイソプロピルエチルアミン
IPE:ジイソプロピルエーテル
TEA:トリエチルアミン
BATDA:ビス(アセトキシメチル) 2,2’:6’,2”−テルピリジン−6,6”−ジカルボキシラート
ビス(ブチリロキシメチル) 4’−(2−ヒドロキシエトキシ)−2,2’:6’,2”−テルピリジン−6,6”−ジカルボキシラート
(工程1)
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 1.48 (t, J = 7.1 Hz, 6H), 2.14 (s, 3H), 4.49−4.54 (m, 4H), 4.52 (q, J = 7.1 Hz, 4H), 8.00 (t, J = 7.8 Hz, 2H), 8.16 (dd, J = 1.0, 7.6 Hz, 2H), 8.20 (s, 2H), 8.80 (dd, J = 1.0, 7.8 Hz, 2H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 14.3, 20.9, 61.8, 62.4, 66.1, 108.3, 124.3, 125.1, 137.7, 147.8, 156.0, 156.4, 165.2, 166.8, 170.9.
(工程2)
1H NMR (500 MHz, d-DMSO) δ 3.84 (t, J = 4.6 Hz, 2H), 4.32 (t, J = 4.6 Hz, 2H), 8.16 (d, J = 7.1 Hz, 2H), 8.19 (t, J = 7.8 Hz, 2H), 8.24 (s, 2H), 8.84 (d, J = 7.6 Hz, 2H); 13C NMR (125 MHz, d-DMSO) δ 59.4, 70.2, 107.9, 123.6, 124.8, 138.7, 154.3, 155.9, 166.3, 167.3.
(工程3)
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 0.97 (t, J = 7.4 Hz, 6H), 1.70 (sext. J = 7.6 Hz, 4H), 2.41 (t, J = 7.4 Hz, 4H), 4.08 (t, J = 4.4 Hz, 2H), 4.41 (t, J = 4.9 Hz, 2H), 6.11 (s, 4H), 7.99 (t, J = 7.8 Hz, 2H), 8.16 (dd, J = 1.2, 7.6 Hz, 2H), 8.18 (s, 2H), 8.78 (dd, J = 1.0, 7.9 Hz, 2H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 13.5, 18.1, 35.8, 61.1, 69.6, 80.1, 108.5, 124.9, 125.6, 137.8, 146.3, 156.0, 156.2, 163.9, 167.1, 172.3.
ビス(アセトキシメチル) 4’−(2−オキソ−2−(プロピルアミノ)エトキシ)−2,2’:6’,2”−テルピリジン−6,6”−ジカルボキシラート
(工程1)
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 0.99 (t, J = 7.1 Hz, 3H), 1.50 (t, J = 7.4 Hz, 6H), 1.65 (sext. J = 7.3 Hz. 2H), 3.38 (q, J = 7.9 Hz, 2H), 4.53 (t, J = 7.1 Hz, 4H), 6.76 (br. t, NH), 8.01 (t, J = 7.9 Hz, 2H), 8.17 (dd, J = 1.0, 7.6 Hz, 2H), 8.22 (s, 2H), 8.79 (dd, J = 1.0, 7.9 Hz, 2H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 11.3, 14.3, 22.8, 40.9, 61.9, 66.8, 108.2, 124.3, 125.3, 137.8, 147.8, 155.6, 156.7, 165.1, 165.3, 166.9.
(工程2)
1H NMR (500 MHz, d-DMSO) δ 0.84 (t, J = 7.6 Hz, 3H), 1.48 (sext. J = 7.1 Hz, 2H), 3.13 (q, J = 6.4 Hz, 2H), 4.82 (s, 2H), 8.15 (dd, J = 1.2, 7.8 Hz, 2H), 8.20 (t, J = 7.9 Hz, 2H), 8.25 (s, 2H), 8.37 (br. t, J = 5.9 Hz, NH), 8.86 (dd, J = 1.2, 7.8 Hz, 2H); 13C NMR (125 MHz, d-DMSO) δ 11.4, 22.4, 40.2, 66.9, 108.1, 124.2, 125.2, 138.9, 147.9, 154.6, 155.8, 165.9, 166.2, 166.6.
(工程3)
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 1.00 (t, J = 7.6 Hz, 3H), 1.67 (sext, J = 7.4 Hz, 2H), 2.19 (s, 6H), 3.40 (q, J = 7.3 Hz, 2H), 4.79 (s, 2H), 6.11 (s, 4H), 6.78 (br. t, J = 5.6 Hz, NH), 8.03 (t, J = 7.9 Hz, 2H), 8.20 (d, J = 7.4 Hz, 2H), 8.22 (s, 2H), 8.82 (d, J = 7.6 Hz, 2H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 11.4, 20.8, 22.8, 40.9, 66.9, 80.3, 108.4, 125.0, 125.9, 138.0, 146.5, 155.9, 156.5, 163.8, 165.4, 166.8, 169.6.
ビス(アセトキシメチル) 4’−(2−ヒドロキシエトキシ)−2,2’:6’,2”−テルピリジン−6,6”−ジカルボキシラート
(工程1)
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 2.18 (s, 6H), 4.07-4,10 (m, 2H), 4.42 (t, J = 4.5 Hz, 2H), 6.11 (s, 4H), 8.01 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 8.18 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 8.21 (s, 2H), 8.81 (d, J = 8.0 Hz, 2H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 20.8, 61.1, 65.6, 80.2, 108.5, 124.9, 125.7, 137.9, 146.4, 156.1, 156.3, 163.9, 165.5, 169.6.
ビス(ブチリロキシメチル) 4’−(2−オキシエトキシ)−2,2’:6’,2”−テルピリジン−6,6”−ジカルボキシラート
(工程1)
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 0.98 (t, J = 7.4 Hz. 6H), 1.71 (sext. J = 7.3 Hz, 4H), 2.42 (t, J = 7.6 Hz, 4H), 4.93 (s, 2H), 6.12 (s, 4H), 8.02 (t, J = 8.1 Hz, 2H), 8.18−8.21 (m, 4H), 8.81 (d, J = 7.8 Hz, 2H), 9.96 (s, 1H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 13.5, 18.1, 35.8, 72.4, 80.1, 108.3, 124.9, 125.8, 137.9, 146.4, 163.8, 172.3, 172.5, 197.0.
ビス(プロピオニルオキシメチル) 4’−(2−ヒドロキシエトキシ)−2,2’:6’,2”−テルピリジン−6,6”−ジカルボキシラート
(工程1)
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 1.19 (t, J = 8.0 Hz, 6H), 2.46 (q, J = 8.0 Hz, 4H), 4.07-4.10 (m, 2H), 4.41 (t, J = 4.5 Hz, 2H), 6.12 (s, 4H), 8.01(t, J = 7.5 Hz, 2H), 8.18 (dd, J = 1.0, 7.5 Hz, 2H), 8.21 (s, 2H), 8.82 (dd, J = 1.0, 7.5 Hz, 2H).
ビス(ブチリロキシメチル) 4’−(3−ヒドロキシプロポキシ)−2,2’:6’,2”−テルピリジン−6,6”−ジカルボキシラート
(工程1)
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 1.49 (t, J = 7.0 Hz, 6H), 1.52-1.63 (m, 4H), 1.70-1.76 (m, 1H), 1.80-1.89 (m, 1H), 2.18 (quint., J = 6.0 Hz, 2H), 3.50-3.54 (m, 1H), 3.63-3.67 (m, 1H), 3.85-3.90 (m, 1H), 3.98-4.02 (m, 1H), 4.37-4.44 (m, 2H), 4.51 (q, J = 7.0 Hz, 4H), 4.63 (t, J = 4.5 Hz, 1H), 7.98 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 8.14 (dd, J = 1.0, 8.0 Hz, 2H), 8.17 (s, 2H), 8.78 (dd, J = 1.0, 8.0 Hz, 2H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 14.3, 19.6, 25.4, 29.5, 30.6, 61.8, 62.3, 63.7, 65.2, 99.0, 108.3, 124.3, 125.0, 137.6, 147.7, 156.2, 156.2, 165.3, 167.3.
(工程2)
1H NMR (500 MHz, d-DMSO) δ 1.93-1.99 (m, 2H), 3.62 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 4.33 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 8.11-8.19 (m, 6H), 8.78-8.84 (m, 2H); 13C NMR (125 MHz, d-DMSO) δ 32.0, 57.2, 65.6, 108.0, 124.3, 125.3, 139.0, 147.9, 154.6, 155.6, 165.9, 167.4.
(工程3)
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 0.98 (t, J = 7.5 Hz, 6H), 1.71 (sext., J = 7.5 Hz, 4H), 2.16 (quint., J = 6.0 Hz, 2H), 2.41 (t, J = 7.5 Hz, 4H), 3.93 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 4.46 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 6.11 (s, 4H), 8.01 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 8.17 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 8.22 (s, 2H), 8.81 (d, J = 8.0 Hz, 2H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 13.5, 18.1, 31.9, 35.8, 59.6, 65.7, 80.1, 108.6, 124.9, 125.6, 137.8, 146.4, 156.1, 156.4, 163.9, 167.3, 172.4.
ビス(ブチリロキシメチル) 4’−(2−(2−ヒドロキシエトキシ)エトキシ)−2,2’:6’,2”−テルピリジン−6,6”−ジカルボキシラート
(工程1)
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1.49 (t, J = 7.1 Hz, 6H), 2.08 (s, 3H), 3.81−3.83 (m, 2H), 3.96−3.98 (m, 2H), 4.27 (t, J = 3.5 Hz, 2H), 4.43−4.46 (m, 2H), 4.50 (q, J = 7.1 Hz, 4H),7.98 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 8.13 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 8.19 (s, 2H), 8.87 (d, J = 7.8 Hz, 2H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 14.2, 20.8, 61.8, 63.5, 67.6, 69.3, 108.4, 124.4, 125.1, 137.7, 147.8, 156.2, 156.4, 165.4, 167.1, 171.1.
(工程2)
1H NMR (500 MHz, d-DMSO) δ 3.55 (m, 4H), 3.87 (t, J = 4.2 Hz, 2H), 4.44 (t, J = 3.9 Hz, 2H), 8.15 (dt, J = 1.3, 7.6 Hz, 2H), 8.20 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 8.26 (d, J = 1.7 Hz, 2H), 8.86 (ddd, J = 1.3, 2.4, 7.8 Hz, 2H); 13C NMR (125 MHz, d-DMSO) δ 60.7, 68.4, 69.1, 73.0, 108.5, 124.7, 125.6, 139.4, 148.2, 166.3, 167.5.
(工程3)
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 0.98 (t, J = 7.6 Hz, 6H), 1.71 (sext. J = 7.6 Hz, 4H), 2,41 (t, J = 7.3 Hz, 4H), 3.72 (dd, J = 3.9, 5.6 Hz, 2H), 3.80 (dd, J = 4.2, 4.9 Hz, 2H), 3.97−3.99 (m, 2H), 4.47−4.49 (m, 2H), 6.11 (s, 4H), 8.00 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 8.17 (dd, J = 1.0, 7.8 Hz, 2H), 8.24 (s, 2H), 8.81 (dd, J = 1.0, 7.8 Hz, 2H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 13.5, 18.1, 35.8, 61.2, 67.7, 69.6, 72.7, 80.1, 108.7. 124.9, 125.6, 137.8, 146.4, 156.0, 156.4, 163.9, 167.2, 172.3.
ビス(ブチリロキシメチル) 4’−(ヒドロキシメチル)−2,2’:6’,2”−テルピリジン−6,6”−ジカルボキシラート
2,2’:6’,2”−テルピリジン−4’−カルボン酸(200 mg,0.72 mmol)のDMF(3.6 mL)溶液に、炭酸カリウム(20 mg, 1.4 mmol)およびヨウ化メチル(0.07 mL,1.1 mmol)を加え、反応混合物を室温で16時間撹拌した。反応混合物に食塩水を加え、水層を酢酸エチル(3×5.0 mL)で抽出し、抽出液を食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。混合物をろ過し、減圧濃縮することにより、粗生成物を得た。得られた粗生成物は精製せずに次の反応に用いた。 粗生成物(0.72 mmol)のテトラヒドロフラン(7.2 mL)溶液に、リチウム アルミニウム ヒドリド(28 mg,0.7 mmol)を0℃で加えた。3時間撹拌した後、反応混合物に硫酸ナトリウム10水和物を加え、室温で1時間撹拌した。反応混合物をセライトパッドでろ過し、ろ液を減圧濃縮した。残渣をピリジン(3.6 mL)に溶解し、該溶液に無水酢酸(0.14mL, 1.4 mmol)を加えた。16時間撹拌した後、混合物にトルエンを加え、減圧濃縮した。残渣をCHROMATOREX Diolシリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶離液:n−ヘキサン:酢酸エチル=1:0〜1:1)で精製することにより、2,2’:6’,2”−テルピリジン−4’−イルメチル アセテート(88 mg、収率40% 3工程)を白色固体として得た。
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 2.20 (s, 3H), 5.28 (s, 2H), 7.32-7.35 (m, 2H), 7.85 (dt, J = 2.0, 8.0 Hz, 2H), 8.43 (s, 2H), 8.61 (td, J = 1.0, 8.0 Hz, 2H), 8.70-8.71 (m, 2H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 20.9, 64.8, 119.2, 121.3, 123.9, 136.8, 146.9, 149.1, 155.8, 155.8, 170.6.
(工程2)
2,2’:6’,2”−テルピリジン−4’−イルメチル アセテート(88 mg,0.28 mmol)のジクロロメタン(2.8 mL)溶液に、m−クロロ過安息香酸(170 mg, 75%, 0.74 mmol)を0℃で加えた。19時間撹拌した後、混合物を飽和チオ硫酸ナトリウム水溶液(20 mL)で洗浄し、水層をクロロホルム(2×20 mL)で抽出した。合わせた有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液および食塩水で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、減圧濃縮した。残渣をジクロロメタン(2.8 mL)に溶解し、得られた溶液にベンゾイルクロリド(0.10 mL,0.86 mol)を室温で加えた。20分間撹拌した後、トリメチルシリルシアニド(0.11 mL,0.87 mmol)を滴下し、室温で19時間撹拌した。該溶液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液(5.0 mL)を加え、分液した後、水層をクロロホルム(3×5.0 mL)で抽出した。合わせた有機層を食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶離液:クロロホルム:酢酸エチル=1:0〜15:1)で精製することにより、(6、6”−ジシアノ−2,2’:6’,2”−テルピリジン−4’−イル)メチル アセテート(92 mg,収率92%)を白色固体として得た。
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 2.26 (s, 3H), 5.33 (s, 2H), 7.76 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 8.02 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 8.52 (s, 2H), 8.81 (d, J = 7.5 Hz, 2H); 13C NMR (125MHz, CDCl3) δ 20.9, 64.4, 117.2, 120.7, 124.3, 128.5, 133.4, 138.0, 148.1, 154.0, 157.0, 170.6.
(工程3)
(6、6”−ジシアノ−2,2’:6’,2”−テルピリジン−4’−イル)メチル アセテート(80 mg,0.23 mmol)のエタノール(6.9 mL)溶液および蒸留水(1.8 mL)に水酸化カリウム(200 mg,3.9 mmol)を加えた。反応混合物を 11時間加熱還流した後、室温まで冷却した。1規定塩酸でpHを約4に調整し、析出物をろ取することにより、4’−(ヒドロキシメチル)−2,2’:6’,2”−テルピリジン−6,6”−ジカルボン酸を薄茶色固体として得た。得られた固体はさらに精製せずに次の反応に用いた。
1H NMR (500 MHz, d-DMSO) δ 4.77 (s, 2H), 8.12 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 8.17 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 8.57 (s, 2H), 8.83 (d, J = 7.5 Hz, 2H); 13C NMR (125 MHz, d-DMSO) δ62.0, 124.0, 125.0, 138.8, 148.1, 154.0, 154.6, 155.2, 166.0.
(工程4)
4’−(ヒドロキシメチル)−2,2’:6’,2”−テルピリジン−6,6”−ジカルボン酸(18 mg,0.05 mmol)のDMF(1.0 mL)溶液に、ジイソプロピルエチルアミン(0.05 mL,0.29 mmol)およびクロロメチルブチラート(0.03 mL, 0.24 mmol)を加えた。反応混合物を50℃に加熱した。15時間撹拌した後、室温まで冷却し、混合物を飽和塩化アンモニウム水溶液(2.0 mL)で洗浄した。水層を酢酸エチル(3×5.0 mL)で抽出した。合わせた有機層を食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過し、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶離液:n−ヘキサン:酢酸エチル=2:1〜1:1)で精製することにより、ビス(ブチリロキシメチル) 4’−(ヒドロキシメチル)−2,2’:6’,2”−テルピリジン−6,6”−ジカルボキシラート(10mg,収率36%)を白色ろう状物質として得た。
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 0.98 (t, J = 7.5 Hz, 6H), 1.71 (sext., J = 8.0 Hz, 4H), 2.41 (t, J = 7.5 Hz, 4H), 2.45 (brt, J = 6.0 Hz, 1H), 4.9(br. d, J = 6.0 Hz, 2H), 6.12 (s, 4H), 8.01 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 8.17 (dd, J = 1.0, 7.5 Hz, 2H), 8.61 (s, 2H), 8.80 (dd, J = 1.0, 7.5 Hz, 2H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 13.5, 18.1, 35.8, 63.9, 80.2, 119.7, 124.9, 125.6, 137.9, 146.5, 152.6, 154.5, 156.5, 163.9, 172.3.
ビス(アセトキシメチル) 4’−(ヒドロキシメチル)−2,2’:6’,2”−テルピリジン−6,6”−ジカルボキシラート
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 2.18 (s, 6H), 4.96 (brs. 2H), 6.11 (s, 4H), 8.02 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 8.19 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 8.62 (s, 2H), 8.82 (d, J = 7.5 Hz, 2H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 20.8, 63.9, 80.2, 119.7, 125.0, 125.7, 137.9, 138.9, 146.5, 154.6, 156.5, 169.6.
30mLのRPMI1640培地中で、組織球腫U937細胞を、37℃、5%CO2条件下で一晩培養し、該培養液30mLを50mLのコニカルチューブに移し、細胞数を計測した。1700rpm、4℃で5分間遠心し、上清を廃棄し、1×106cells/mLになるように細胞をRPMI1640培地に再懸濁した。該細胞懸濁液1mLを15mLのコニカルチューブに移し、2.5μLの式(I)で表される化合物またはその塩(10mMの保存溶液)を加え(最終濃度:25μM)、37℃、5%CO2条件下で15分間インキュベートした。5mLのRPMI1640培地で細胞を3回洗浄した後、細胞を5mLのRPMI1640培地に再懸濁し、該細胞懸濁液2mLを6mLのRPMI1640培地を含む15mLのコニカルチューブに移し、細胞の濃度を5×103cells/100μLとした。該細胞懸濁液100μLを、96ウェル平底プレートの6つのウェルに播種した。自然漏出量を決定するためのウェルには100μLのRPMI1640培地を、最大漏出量を決定するためのウェルには90μLのRPMI1640培地を加えた。該プレートを500rpm、室温で2分間遠心した後、37℃、5%CO2条件下で30分間インキュベートした。新たに調製した19%DMSO中の0.125%ジギトニン溶液(3mgジギトニン、0.456mL DMSOおよび1.944mL H2Oの混合溶液)10μLを、前記最大漏出量を決定するためのウェルにそれぞれ添加し、良く混合した後、さらに30分間インキュベートした。インキュベーション後、再度細胞懸濁液を良く混合し、1700rpm、室温で2分間遠心した。遠心後、上清25μLを慎重にとり、250μLのユーロピウム溶液を含む96ウェル平底プレートに移した後、そこから200μLの溶液を96ウェルNuncプレートに移した。該プレートを15分間静置した後、ARVOマルチプレートリーダーで時間分解蛍光を測定した。
上記の方法で測定した結果を下記表1に示す。
(1)ターゲット細胞の準備
30mLのRPMI1640培地中で、HTLV−1に感染したHAM患者髄液由来の細胞株HCT−4細胞を、37℃、5%CO2条件下で一晩培養し、RPIMI1640培地20mL中に細胞4.8×106になるように、細胞を計測し0.24×106cells/mLに調製した。1700rpm、4℃で5分間遠心し、上清を廃棄し、1×106cells/mLになるように細胞を4.8mLのRPMI1640培地に再懸濁した。該細胞懸濁液を各1mLずつ15mLのコニカルチューブ2本(A−1、A−2)に移した。
(2)ターゲット細胞の準備
30mLのRPMI1640培地中で、ヒト慢性白血病由来細胞株K562細胞を、37℃、5%CO2条件下で一晩培養し、RPIMI1640培地20mL中に細胞4.8×106になるように、細胞数を計測し0.24×106cells/mLに調製した。1700rpm、4℃で5分間遠心し、上清を廃棄し、1×106cells/mLになるように細胞を4.8mlのRPMI1640培地に再懸濁した。該細胞懸濁液を各1mLずつ15mLのコニカルチューブ3本(B−1、B−2、B−3)に移した。B−1に2.5μLのDMSOを、B−2とB−3には、2.5μLの10mM実施例8の化合物を加えた。37℃で15分間静置した。5mLのRPMI1640培地で細胞を3回洗浄した後、1700rpm、4℃で5分間遠心し、それぞれを5mLのRPMI1640培地に再懸濁し、該細胞懸濁液2mLを6mLのRPMI1640培地を含む15mLのコニカルチューブに移した。
(3)エフェクター細胞の準備
ヘルパーNK細胞60×103cellsを、12mlのRPMI培養液に懸濁し、1700rpm、4℃で5分間遠心し、上清を捨て、RPMI1640培養液3mlに再懸濁した。
以下、下記の濃度に調整したものを3mLずつ準備した。
ヘルパーNK細胞濃度
エフェクター細胞/標的細胞比40 2 x 106/ml
エフェクター細胞/標的細胞比20 1 x 106/ml
エフェクター細胞/標的細胞比10 5 x 105/ml
エフェクター細胞/標的細胞比5 2.5 x 105/ml
エフェクター細胞/標的細胞比2.5 1.25 x 104/ml
エフェクター細胞/標的細胞比1.25 6.25 x 103/ml
エフェクター細胞/標的細胞比0.625 3.125 x 103/ml
エフェクター細胞/標的細胞比0 0/ml (Cell concentration):
上記濃度ヘルパーNK細胞懸濁液をそれぞれ100μL、また自然漏出量を決めるためにRPIM1640培養液100μL、最大漏出量を決定するためにRPIM培養液90μLを、96ウェル平底プレートに加えた。HCT-4細胞液、K562細胞液を96穴プレートに100μL加えた。
上記までの96穴プレートの配置は図1に示す通りである。該プレートを500rpm、室温で2分間遠心した後、37℃で20分間インキュベートした。19%DMSO中の0.125%ジギトニン溶液(3mgジギトニン、0.456mL DMSOおよび1.944mL H2Oの混合溶液)を、新たに調製しその10μLを、最大放出量を決定するためのウェルにそれぞれ添加し、良く混合した後、さらに20分間インキュベートした。インキュベーション後、再度細胞懸濁液を良く混合し、1700rpm、室温で2分間遠心した。遠心後、上清25μLを慎重にとり、250μLのユーロピウム溶液を含む96ウェル平底プレートに移した後、そこから200μLの溶液を96ウェルNuncプレートに移した。該プレートを15分間静置した後、ARVOマルチプレートリーダーで時間分解蛍光を測定した。
上記の方法で測定した結果を図2および図3に示す。
これにより、エフェクター細胞の細胞障害能の測定が可能であることが示された。
本出願は、日本国で2014年3月31日に出願された特願2014−073475を基礎としており、その内容は本明細書にすべて包含されるものである。
Claims (7)
- 式(I):
(式中、
R1は、(1)ヒドロキシ基、(2)ホルミル基、(3)C 1−6 アルキル−アミノカルボニル基、および(4)ヒドロキシ−C 1−6 アルコキシ基から選択される1ないし3個の置換基で置換されていてもよいC 1−6 アルキルを示し、
R2およびR3は、それぞれ、C 1−6 アルキル基を示し、
nは、0を示し、
Zは、単結合または−O−を示し、
および
Aは、メチレンを示す。)
で表される化合物またはその塩。 - 請求項1に記載の化合物またはその塩を含む、有機錯体形成剤。
- 請求項1に記載の化合物またはその塩を含む、生細胞数測定用試薬。
- 細胞障害能測定用試薬である、請求項3に記載の試薬。
- 細胞増殖能測定用試薬である、請求項3に記載の試薬。
- 請求項1に記載の化合物またはその塩と細胞を混合する工程、および
ランタノイド元素と錯体を形成し、蛍光を測定する工程
を含む、細胞障害能を測定する方法。 - ランタノイド元素と錯体を形成する前に、界面活性剤を加えることを特徴とする、請求項6に記載の方法。
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JP2014073475 | 2014-03-31 | ||
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