RU2688744C1 - Фотостабильный и яркий флуоресцентный бордипиррометеновый краситель - Google Patents
Фотостабильный и яркий флуоресцентный бордипиррометеновый краситель Download PDFInfo
- Publication number
- RU2688744C1 RU2688744C1 RU2017147031A RU2017147031A RU2688744C1 RU 2688744 C1 RU2688744 C1 RU 2688744C1 RU 2017147031 A RU2017147031 A RU 2017147031A RU 2017147031 A RU2017147031 A RU 2017147031A RU 2688744 C1 RU2688744 C1 RU 2688744C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- fluorescence
- dye
- compound
- compounds
- photostability
- Prior art date
Links
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 36
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 claims description 9
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 claims description 6
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 17
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 14
- 238000000034 method Methods 0.000 description 14
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 238000006862 quantum yield reaction Methods 0.000 description 7
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 5
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 5
- ZOXJGFHDIHLPTG-UHFFFAOYSA-N Boron Chemical group [B] ZOXJGFHDIHLPTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QUSNBJAOOMFDIB-UHFFFAOYSA-N Ethylamine Chemical compound CCN QUSNBJAOOMFDIB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 4
- 229910052796 boron Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 4
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 4
- -1 hydrazide Chemical class 0.000 description 4
- 150000003233 pyrroles Chemical class 0.000 description 4
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 3
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 3
- 150000008064 anhydrides Chemical class 0.000 description 3
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 3
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 3
- BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 6-carboxyfluorescein Chemical compound C12=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C2C11OC(=O)C2=CC=C(C(=O)O)C=C21 BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100038080 B-cell receptor CD22 Human genes 0.000 description 2
- KZMGYPLQYOPHEL-UHFFFAOYSA-N Boron trifluoride etherate Chemical compound FB(F)F.CCOCC KZMGYPLQYOPHEL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000884305 Homo sapiens B-cell receptor CD22 Proteins 0.000 description 2
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Natural products CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000001263 acyl chlorides Chemical class 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- WTEOIRVLGSZEPR-UHFFFAOYSA-N boron trifluoride Chemical compound FB(F)F WTEOIRVLGSZEPR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- USVOOMQVSCOCMC-UHFFFAOYSA-N ethyl 3-(1h-pyrrol-2-yl)propanoate Chemical compound CCOC(=O)CCC1=CC=CN1 USVOOMQVSCOCMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FKRCODPIKNYEAC-UHFFFAOYSA-N ethyl propionate Chemical compound CCOC(=O)CC FKRCODPIKNYEAC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000002189 fluorescence spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 2
- 125000004433 nitrogen atom Chemical group N* 0.000 description 2
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 2
- XHXFXVLFKHQFAL-UHFFFAOYSA-N phosphoryl trichloride Chemical compound ClP(Cl)(Cl)=O XHXFXVLFKHQFAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 229910015900 BF3 Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000011691 Burkitt lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N Propionic acid Substances CCC(O)=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Chemical class Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000002877 alkyl aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 239000006059 cover glass Substances 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 125000000753 cycloalkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- MVEAAGBEUOMFRX-UHFFFAOYSA-N ethyl acetate;hydrochloride Chemical compound Cl.CCOC(C)=O MVEAAGBEUOMFRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OAMZXMDZZWGPMH-UHFFFAOYSA-N ethyl acetate;toluene Chemical compound CCOC(C)=O.CC1=CC=CC=C1 OAMZXMDZZWGPMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 125000005843 halogen group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 1
- 239000012948 isocyanate Substances 0.000 description 1
- 150000002513 isocyanates Chemical class 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- OJGUPVGNPWKCBF-UHFFFAOYSA-N n-azidopropan-1-amine Chemical compound CCCNN=[N+]=[N-] OJGUPVGNPWKCBF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- NMHMNPHRMNGLLB-UHFFFAOYSA-N phloretic acid Chemical compound OC(=O)CCC1=CC=C(O)C=C1 NMHMNPHRMNGLLB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000004262 preparative liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000010453 quartz Substances 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicon dioxide Inorganic materials O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 125000000020 sulfo group Chemical group O=S(=O)([*])O[H] 0.000 description 1
- YBBRCQOCSYXUOC-UHFFFAOYSA-N sulfuryl dichloride Chemical compound ClS(Cl)(=O)=O YBBRCQOCSYXUOC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OBTWBSRJZRCYQV-UHFFFAOYSA-N sulfuryl difluoride Chemical compound FS(F)(=O)=O OBTWBSRJZRCYQV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000005500 uronium group Chemical group 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
- C09K11/00—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области органической химии, а именно к новым производным бордипиррометена. Предложено соединения общей формулы I, где R означает O(CH)CH, NH-(CH)N, а также применение соединения.Технический результат: увеличение стабильности при сохранении высокого квантового выхода. 2 н.п. ф-лы, 3 табл., 2 ил.
Description
- область техники, к которой относится изобретение;
Изобретение относится к области органической химии, в частности новым производным бордипиррометена формулы I
где, R=O(СН2)1-10СН3, NH-(CH2)1-12N3, к указанным соединениям для применения
- в качестве флуоресцентных меток белковых молекул, ДНК, в том числе при производстве меченых антител, применяемых в иммунофлуоресцентном анализе для диагностики инфекционных заболеваний, модифицированных олигонуклеотидов, применяемых в методе ПЦР.
- для флуоресцентного мечения в культурах клеток при исследованиях, требующих высокой фотостабильности флуорофора из-за применения мощных лазеров, в частности анализе клеточной структуры методом проточной цитометрии, исследовании отдельных клеток методом флуоресцентной микроскопии.
- уровень техники;
В литературе имеется описание производных бордипиррометена [1] и способов их получения.
а) Известен способ получения различных производных бордипиррометена формулы (I) реакцией замещенных пирролов с ацилхлоридами или ангидридами. Вначале проводят конденсацию замещенных пирролов с ацилхлоридом или ангидридом в органическом растворителе, затем, не выделяя получившийся продукт, обрабатывают этиламином и комплексом трифторида бора с диэтиловым эфиром [1], после чего выделяют продукт в виде молекулярных кристаллических или аморфных соединений, имеющих в своем составе один атом бора и являющихся цвиттер-ионами (положительно заряженный атом азота и отрицательно заряженный атом бора) (I).
II R1-R8 - Н, алкильные, арильные и иные заместители
б) Известен способ получения производных бордипиррометена формулы (II) реакцией замещенных пирролов с альдегидами. Вначале проводят конденсацию замещенных пирролов с альдегидом в органическом растворителе, затем обрабатывают смесь окислителем, после чего, не выделяя получившийся продукт, обрабатывают этиламином и комплексом трифторида бора с диэтиловым эфиром [1]. Продукт выделяют в виде молекулярных кристаллических или аморфных соединений, имеющих в своем составе один атом бора и являющихся цвиттер-ионами (положительно заряженный атом бора и отрицательно заряженный атом азота) (II).
Известен патент на химически реакционноспособные соединения формулы I, где R - Н, Hal, алкил, арил, циклоалкил, алкиларил, ацил и сульфогруппа [2], а реакционноспособными группами являются карбоксильная группа, ее N-гидроксисукцинимидный эфир или ангидрид, сульфонил хлорид, сульфонил фторид, гидразид, амин, ОН, изоцианат, галоацетамид, альдегид, ацилазид. Патент не упоминает соединения формулы I как предпочтительные или имеющие высокую фотостабильность в контексте применения бордипиррометеновых красителей с высокой стабильностью в проточной цитометрии или флуоресцентной микроскопии, кроме того формула изобретения не включает в качестве реакционноспособной группы алкилазид. Таким образом, патент [2] не описывает соединение формулы I как высокостабильную флуоресцентную метку для приложений, где применяются мощные лазеры, которые могут разрушить метку - проточной цитометрии или флуоресцентной микроскопии.
Настоящие соединения формулы I можно получить известными в данной области способами, например, описанными выше способами (а)-(б). Исходные вещества или имеются в продаже, или же известны из химической литературы, либо могут быть получены в соответствии с хорошо известными в данной области способами.
Выделение и очистку соединений и промежуточных соединений, описанных здесь, можно осуществить, если требуется, с помощью колоночной хроматографии или препаративной жидкостной хроматографии низкого или высокого давления. Конкретные иллюстрации подходящих процедур разделения и выделения приведены ниже.
В литературе соединения формулы I не описаны, их фотостабильность не предсказана.
Описаны соединения формулы III, где R1, R2, R3, R4 Н или СН3, для которых установлены закономерности зависимости фотостабильности от наличия метальных заместителей в положениях 1,3,5,7 и арильного в положении 8 [3].
Показано, что наличие арильной группы в положении 8 повышает фотостабильность соединения, так же как и уменьшение числа метальных заместителей в положениях 1,3,5,7. Однако возрастание стабильности негативно сказывается на квантовом выходе флуоресценции вещества - краситель становится неярким, максимальный квантовый выход составляет около 0.6. Поэтому актуальным является увеличение стабильности, при сохранении высокого квантового выхода. Подобная задача для простых бордипиррометенов с немассивными заместителями не решена. Немассивные заместители позволяют работать с красителем, как заменителем широко используемого флуоресцеина (поглощение при 495 нм, испускание при 520). - раскрытие сущности изобретения;
Предлагаются новые соединения общей формулы I, предпочтительно R=ОСН2СН3, NH-(СН2)3N3 к их использованию для флуоресцентного мечения в культурах клеток при исследованиях, требующих высокой фотостабильности флуорофора из-за применения мощных лазеров, в частности анализе клеточной структуры методом проточной цитометрии, исследовании отдельных клеток методом флуоресцентной микроскопии. Неожиданно было обнаружено, что соединения общей формулы I проявляют более высокую фотостабильность по сравнению с известными аналогами - флуорофорами, применяемыми в канале флуоресцеина (поглощение 490 нм, флуоресценция 520 нм). При этом не происходит снижения квантового выхода (0.9) и краситель остается ярким. Это позволяет добиться проведения более длительных и статистически более достоверных экспериментов.
Предлагается применение соединений формулы I как флуоресцентных меток с квантовым выходом более 0,9, и фотостабильностью при этом более высокой, чем это известно из уровня техники, - для использования в методах, требующих использования мощных лазерных источников света, под действием которых флуорофор может утратить флуоресцентные свойства, а именно в лазерной флуоресцентной микроскопии при визуализации единичных белковых молекул, нуклеиновых кислот, клеток, клеточных органелл, в проточной цитометрии для анализа клеточной структуры меченных флуорофорами клеток. Неожиданно было обнаружено, что соединения общей формулы I проявляют более высокую фотостабильность по сравнению с известными аналогами - флуорофорами, применяемыми в канале флуоресцеина (поглощение 490 нм, флуоресценция 520 нм). При этом не происходит снижения квантового выхода (0.9) и краситель остается ярким. Фотостабильность повышается более чем в два раза сильнее, чем это могло бы следовать из уровня техники.
- осуществление изобретения
3-(4,4-дифтор-3-метил-4-боро-3а,4а-диаза-s-индацен-5-ил)-пропионовой кислоты этиловый эфир (соединение I, R=OCH2CH3)
Раствор этилового эфира 2-формил-5-метилпиррола (1,0 г, 9,17 ммоль) и этилового эфира 3-пиррол-2-илпропионовой кислоты (1,53 г, 9,17 ммоль) в хлороформе (20 мл) охлаждали до 0°С и добавляли фосфора оксихлорид (1,4 г, 9,17 ммоль) по каплям (в течение 3 мин). Смесь перемешивали при 0°С в течение 10 мин, затем в течение 6 ч при комнатной температуре, затем охлаждали до 0°С и добавляли комплекс трифторида бора с диэтиловым эфиром (6,51 г, 45,85 ммоль) с последующим добавлением по каплям N,N-диизопропилэтиламин (5,91 г, 45,85 ммоль) в течение 3 мин после чего смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Смесь выливали в воду (300 мл) и после чего перемешивали в течение 3 часов. Органическую фазу отделяли, воду экстрагировали хлороформом (3×20 мл), объединенные органические фазы сушили над Na2SO4, растворитель удаляли в вакууме. Продукт выделяли колоночной хроматографией (элюент - толуол, см. примечание 1), получено 1,2 г (42%) целевого продукта (красновато-коричневые кристаллы, Rf=0,5 в элюенте толуол - этилацетат 4:1), наряду с симметричным 3,5-диметил-BODIPY (0,14 г, Rf=0,6) и симметричным этиловым эфиром ди-(3-пиррол-2-илпропионовой кислоты) (0,11 г, Rf=0,4, коричневые кристаллы).
3-(4,4-дифтор-3-метил-4-боро-За,4а-диаза-$-индацен-5-ил)-пропионовая кислота (соединение I, R=ОН, в целях синтеза соединения I, R=-NH-(CH2)3N3)
3-Метил-5-этоксикарбонилэтил-BODIPY (1,2 г, 3,95 ммоль) растворяли в ТГФ (160 мл) и добавляли раствор конц. H2SO4 (12 мл, 22 г, 0,225 моль) в воде (36 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 дней. ТСХ (этилацетат, Rf=0,2) свидетельствовала о хорошей конверсии. ТГФ удаляли в вакууме при 40°С. Образовавшийся осадок отфильтровывали, промывали водой (3×30 мл) и диэтиловым эфиром (3×20 мл) и сушили. Выход 0,85 г (77%) красных кристаллов.
Синтез соединения I, R=-NH-(CH2)3N3
3-Метил-3-карбоксиэтил-BODIPY (2,0 г, 7,19 ммоль) суспендировали в CH2Cl2 (50 мл) и добавляли триэтиламин (0,87 г, 8,63 ммоль) - образовывался прозрачный раствор. TSTU (N,N,N',N'-Тетраметил-О-(N-сукцинимидил) уроний) (2,6 г, 8,63 ммоль) добавляли небольшими порциями (более ~ 3 мин) и смесь перемешивали в течение 1 часа при комнатной температуре. Добавляли триэтиламин (0,87 г, 8,63 ммоль) с последующим добавлением азидопропиламина (0,87 г, 8,63 ммоль) и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. ТСХ (элюэнт - этил ацетат) свидетельствовал о хорошей конверсии, реакционную смесь промывали водой (3×50 мл), сушили над Na2SO4, растворитель удаляли в вакууме. Продукт дважды очищали колоночной хроматографией (элюент металенхлорид-этилацетат 1:1), получая 0,93 г продукта (37%) в виде красновато-коричневых кристаллов.
Полученные соединения I R=-NH-(CH2)3N3, R=ОСН2СН3, обладают следующими свойствами:
- соединение является флуоресцентным красителем.
- спектр флуоресценции соединения находится в том же диапазоне, что и спектр широко используемого в лабораторной практике флуоресцеина, благодаря чему с веществом можно работать на приборах, имеющих фиксированные длины волн возбуждения/излучения, рассчитанные на флуоресцеиновые красители.
- соединение имеет более высокую фотостабильность по сравнению с аналогами (см таблица 1).
соединение IR=-NH-(CH2)3N3 проходит быструю конъюгацию с антителами, модифицированными дибензилциклооктином (реакция клик-химии без присутствия медного катализатора.
Условия проведения экспериментов по фотостабильности:
Приготовлены растворы красителей с приблизительно одинаковой начальной концентрацией (согласно измерению максимума поглощения Dmax=0.06-0.07). Определение фотостабильности проводилось по средствам последовательного интенсивного облучения образца красителя (в кварцевой кювете) светом в течение определенного временного интервала, и последующей регистрации спектра его флуоресценции. Облучение проводилось в алюминиевом резервуаре с матовой отражающей поверхностью при постоянной температуре (±2°С), с использованием 100 Вт светодиода белого света.
Регистрация спектра флуоресценции образца проводилась на флуориметре в области длин волн: 476 нм - 700 нм, при длине волны возбуждения 466 нм.
Согласно описанной процедуре были получены кривые зависимости интегральных интенсивностей флуоресценции образцов красителей от времени облучения. Все полученные кривые с высокой точностью соответствуют общей формуле I=I0*e-kt, где: I - интегральная интенсивность флуоресценции, I0 - начальная интегральная интенсивность флуоресценции (до облучения), k - константа "скорости падения флуоресценции" (в мин-1) t - продолжительность интенсивного облучения (в минутах). Данное уравнение является аналогом уравнения для химической реакции первого порядка C=C0*ekt.
Таким образом, скорость падения интенсивности флуоресценции образца зависит от концентрации красителя (в первой степени) и величины коэффициента к. Коэффициент к, при этом, характеризует фотостабильность флуоресцентного красителя в условиях проведения эксперимента (чем меньше к, тем выше фотостабильность красителя). В серии экспериментов были получены значения коэффициентов к для красителей BODIPY. Для сравнения, было также измерено значение коэффициента к для карбоксифлуоресцеина (6-FAM). Период полураспада красителя t1/2=ln(2)/k. Эти данные представлены в таблице 1.
Из таблицы 1 следует, что наиболее фотостабильными являются красители с меньшим числом алкильных заместителей в положениях 1,3,5,7. При этом стоит отметить, что стабильность соединения I неожиданно превышает ту, которая могла бы следовать из уровня техники. Соединения III известны из уровня техники и закономерность уменьшения стабильности с увеличением алкильных групп также известны из уровня техники. Если рассмотреть математическую корреляцию числа метальных групп и фотостабильности, то она имеет зависимость вида N=Aln(t1/2), близкую к линейной, на нее ложатся все соединения из таблицы 1. Однако соединение IR=ОСН2СН3 неожиданно, что не может быть предсказано из уровня техники, имеет в два раза большую фотостабильность, чем следует из полученной зависимости. Это представляет дополнительный практический интерес, учитывая, что данные красители чаще всего применяются не в форме кислоты, которая удовлетворяет обнаруженной зависимости, а именно в форме амидов или эфиров.
Повышенная фотостабильность не влияет на яркость соединения, которое имеет высокий квантовый выход в воде (0,9), что позволяет надежно отсекать фоновый сигнал возбуждающего излучения в практических применениях.
Пример
Применение соединения I в качестве флуоресцентной метки при исследованиях на флуоресцентном микроскопе: окрашивание фиксированных CD22-позитивных клеток линии Raji анти-CD22 антителами, меченными различными флуорофорами, применение флуоресцентной микроскопии.
Протокол процедуры
Клеточная линия Raji (лимфома Беркитта), гиперэкспрессирующая поверхностный CD22-маркер.
Культивирование клеток проводили в RPMI-1640 с 10% Fetal Bovine Serum.
1. Подготовка клеток.
1) Клетки собирали, центрифугировали (8 мин, 800 g), супернатант декантировали, добавляли 5 мл натрий-фосфатного буфера (PBS) и вновь центрифугировали (5 мин, 800 g).
2) Фиксация: супернатант декантировали, добавляли 1 мл 2% параформальдегида. Инкубировали 40 мин при комнатной температуре, затем помещали на +4°С до проведения процедуры окрашивания.
2. Окрашивание фиксированных клеток.
1) Клетки центрифугировали (10 мин, 1500 g), супернатант декантировали, добавляли 1 мл PBS и центрифугировали (10 мин, 1500 g).
2) Блокирование сайтов неспецифичного связывания проводили параллельно с процедурой окрашивания: к клеткам (0,5 мкл/точка) добавляли 40 мл 10% бычьего сывороточного альбумина (Bovine serum albumin, BSA) на PBS и антитела, конъюгированные с флуорофором, в концентрации 7 мкг/мл. Инкубировали 1 час при комнатной температуре. ГХ71.
3) Клетки центрифугировали (10 мин, 1500 g), супернатант декантировали, добавляли 1 мл PBS и вновь центрифугировали (10 мин, 1500 g).
4) Осадок ресуспендировали в 40 мкл PBS, помещали на покровное стекло и анализировали на флуоресцентном микроскопе Olympus 1X71 (Япония), оснащенном флуоресцентными фильтрами (emission filters) с параметрами длин возбуждения/поглощения - excitation/emission (далее ex/em) 488/535 нм и ex/em 555/583 нм, а также объективом с увеличением ×40.
5) При анализе клеток в программе ImageJ (NIH, США) была определена средняя интенсивности уровень флуоресценции (отн. ед.) на клетку, представленная в таблицах 2 и 3.
Фиг. 1. Исследование антитела CD22-BODIPY FL методом флуоресцентной микроскопии
Фиг. 2. Исследование антитела СВ22-соединение I методом флуоресцентной микроскопии
Из фиг. 1 и 2 и таблиц 2 и 3 следует, что конъюгат соединения I с антителом более яркий, чем у известного из уровня техники BODIPY FL.
Определение времени полувыгорания флуорофора во флуоресцентном микроскопе
Расчет времени полувыгорания флуорофора проводили с использованием флуоресцентного фильтра, при применении которого наблюдалась максимальная флуоресценция. Видео, снятое при известной экспозиции, анализировали в программе ImageJ. Перед анализом проводили «вычитание» фоновой флуоресценции. Далее во вкладке Plot Z-axis Profile получали кривую, отражающую падения уровня флуоресценции во время съемки.
Координаты кривой экспортировали в формат.txt и далее анализировали в программе Excel. При анализе отмечали точки с падением уровня флуоресценции в 2 раза и замеряли соответствующий временной интервал, который далее был преобразован в формат «секунд» путем умножения на время экспозиции.
Результаты обсчета времени полувыгорания флуорофора при 488 нм показали, что время полувыгорания соединения I в 3,5 раза больше чем известного из уровня техники BODIPY FL этиловый эфир, а следовательно инкремент фотостабильности соединения I во флуоресцентном микроскопе еще выше, чем при предварительном выгорании в белом свете.
Список литературы
1. Loudet A., Burgess К. Chem. Rev. 2007,107, 4891-4932.
2. Haugland R.P., Kang H.C., Chemically reactive dipyrrometheneboron difluoride dyes, US Patent 4774339 A, 1988.
3. Aijun Cui, Xiaojun Peng, Jiangli Fan, Xiuying Chen, Yunkou Wu, Binchen Guo/ Journal of Photochemistry and Photobiology A: Chemistry 186 (2007) 85-92.
Claims (4)
1. Соединение общей формулы I
где R означает O(CH2)1-10CH3, NH-(CH2)1-12N3.
2. Применение соединений по п. 1 как флуоресцентных меток для исследования культур клеток методами флуоресцентной микроскопии и проточной цитометрии.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017147031A RU2688744C1 (ru) | 2017-12-29 | 2017-12-29 | Фотостабильный и яркий флуоресцентный бордипиррометеновый краситель |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017147031A RU2688744C1 (ru) | 2017-12-29 | 2017-12-29 | Фотостабильный и яркий флуоресцентный бордипиррометеновый краситель |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2688744C1 true RU2688744C1 (ru) | 2019-05-22 |
Family
ID=66637111
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2017147031A RU2688744C1 (ru) | 2017-12-29 | 2017-12-29 | Фотостабильный и яркий флуоресцентный бордипиррометеновый краситель |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2688744C1 (ru) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5573909A (en) * | 1992-05-13 | 1996-11-12 | Molecular Probes, Inc. | Fluorescent labeling using microparticles with controllable stokes shift |
| US8277775B2 (en) * | 2007-08-17 | 2012-10-02 | The Research Foundation Of The City University Of New York | Boron dipyrromethene difluoro (BODIPY) conjugates |
-
2017
- 2017-12-29 RU RU2017147031A patent/RU2688744C1/ru active IP Right Revival
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5573909A (en) * | 1992-05-13 | 1996-11-12 | Molecular Probes, Inc. | Fluorescent labeling using microparticles with controllable stokes shift |
| US8277775B2 (en) * | 2007-08-17 | 2012-10-02 | The Research Foundation Of The City University Of New York | Boron dipyrromethene difluoro (BODIPY) conjugates |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| An ICT-based fluorescent switch-on probe for hydrogen sulfide in living cells. Xin Li et al., Chemical Communications (Cambridge, United Kingdom), 49(77), 8656-8658, 2013. * |
| An ICT-based fluorescent switch-on probe for hydrogen sulfide in living cells. Xin Li et al., Chemical Communications (Cambridge, United Kingdom), 49(77), 8656-8658, 2013. Design and synthesis of a highly selective fluorescent turn-on probe for thiol bioimaging in living cells. Xin Li et al., Organic & Biomolecular Chemistry, 8(16), 3627-3630, 2010. Synthesis of a BODIPY Library and Its Application to the Development of Live Cell Glucagon Imaging Probe. Jun-Seok Lee et al., Journal of the American Chemical Society, 131(29), 10077-10082 2009. * |
| Design and synthesis of a highly selective fluorescent turn-on probe for thiol bioimaging in living cells. Xin Li et al., Organic & Biomolecular Chemistry, 8(16), 3627-3630, 2010. . * |
| Synthesis of a BODIPY Library and Its Application to the Development of Live Cell Glucagon Imaging Probe. Jun-Seok Lee et al., Journal of the American Chemical Society, 131(29), 10077-10082 2009 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4774339A (en) | Chemically reactive dipyrrometheneboron difluoride dyes | |
| JP6351511B2 (ja) | 非対称Ｓｉローダミン及びロドールの合成 | |
| US5344928A (en) | Phenothiazine derivatives, their production and use | |
| JP2688549B2 (ja) | １，２−ジオキセタン製造用のアルケン化合物 | |
| AU2005280581B9 (en) | Long wavelength thiol-reactive fluorophores | |
| US4018884A (en) | Fluorogenic materials and labeling techniques | |
| US8664400B2 (en) | Triphenylamine derivatives useful as fluorophores in biology, in particular for two-photon microscopy | |
| WO2018003686A1 (ja) | 酵素特異的な細胞内滞留性赤色蛍光プローブ。 | |
| CN109824565B (zh) | 一种光响应性多功能化学交联剂及其制备方法与应用 | |
| CN108516979B (zh) | 一种基于萘酰亚胺-罗丹明的化合物及其应用 | |
| CN114671851B (zh) | 萘二甲酰亚胺-四嗪类化合物及其制备方法与应用 | |
| JP2006342299A (ja) | 蛍光性アミノ酸誘導体 | |
| RU2688744C1 (ru) | Фотостабильный и яркий флуоресцентный бордипиррометеновый краситель | |
| US20040054195A1 (en) | Xanthene derivatives | |
| CN110407835A (zh) | 咪唑并[1,2-a]吡啶近红外比率型pH荧光探针及其制备和应用 | |
| US4045487A (en) | 1-Dimethylamino-2,4-diphenyl-1-butene-3,4-dione | |
| CN113563298B (zh) | 一类含水溶性取代基罗丹明荧光染料其制备方法和应用 | |
| CN109824571B (zh) | 一种荧光探针及其制备方法与应用 | |
| JP5240704B2 (ja) | 新規蛍光化合物およびそれを用いた細胞内コレステロールの検出方法 | |
| KR101125058B1 (ko) | 물질 표지용 화합물 및 그 제조방법 | |
| JP2593121B2 (ja) | 近赤外光励起の蛍光ラベル化剤とその応用 | |
| US3969373A (en) | Fluorogenic 2-oxy-3(2H)-furanone materials | |
| CN111621289A (zh) | 一种光控双通道荧光染料及其制备方法和应用 | |
| KR102509732B1 (ko) | 지질 방울 표지를 위한 형광 프로브 | |
| CN115215849B (zh) | 具有大斯托克斯位移的红色双光子荧光化合物及其合成与应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20191230 |
|
| NF4A | Reinstatement of patent |
Effective date: 20201105 |