JP5240704B2 - 新規蛍光化合物およびそれを用いた細胞内コレステロールの検出方法 - Google Patents
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Description
一方、アンホテリシンBはポリエンマクロライド系抗生物質である(非特許文献1)が、コレステロールの検出の目的に応用されたことはなかった。
M. Murata et al. Org. Lett. 2002, 4 , 2087-2089.
(1)下記一般式(I)で表される化合物。
(2)nが2であり、Rがメチルである、(1)の化合物。
(3)(1)または(2)の化合物を細胞に添加し、蛍光を測定することを特徴とする、細胞内コレステロールの検出方法。
(4)(1)または(2)の化合物を含む、コレステロール検出キット。
本発明の化合物は、以下の一般式(I)で表される。
ここで、nは1〜5の整数、Rは炭素数1〜4のアルキルを示す。なお、Rは互いに異なっていてもよい。一般式(I)の化合物としては、nが2であり、Rがメチルである、下記の化合物が特に好ましい。
特に、本発明の化合物は、細胞内に取り込まれ、コレステロールと同様の挙動を示すため、細胞内コレステロールの検出に好適に使用することができる。
検出対象の細胞の種類は特に制限されないが、コレステロールを蓄積する培養細胞が好ましい。生細胞において直接蛍光を観察してもよいし、細胞を固定化してから蛍光を観察してもよい。
本発明の化合物を単独で添加する場合、例えば、同化合物をDMSOなどに溶解させて添加することができる。
本発明の化合物は培養細胞の培地中に加えることができる。その添加濃度は細胞の種類によっても異なるが、好ましくは、0.5μM〜50μMである。
蛍光顕微鏡などの蛍光測定装置を使用することによって本発明の化合物による蛍光を検出することができる。
なお、本発明の化合物を認識する抗体を用いて検出することも可能である。そのような
抗体としては、本発明の化合物に含まれるダンシル基に対する抗体(Molecular Probes 社:Anti-Dansyl Antibody(Catalog.#:A-6398))が挙げられる。
1.mono-N-dansyl-ethylendiamine (Ds-en)の合成
エチレンジアミン 3.34ml (50mmol)を蒸留ジクロロメタン40mlに溶解させ、室温下で攪拌した。この溶液にDansyl chloride 2.698g (10mmol)を10分かけて少しずつ加え、室温で15時間反応させた。反応混合物に水50mlを加え、分液ロートに移した。有機相を水、飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムにて乾燥させた。これを減圧濃縮後、残渣にヘキサンを加えて生じた淡黄色固体を濾取してDs-en 2.04g (6.95mmol)を得た。(収率69.5%(Dansyl chlorideを基準に算出))
m.p.: 153-154℃, 1H NMR (300MHz, CDCl3) δ8.54 (1H, d, J=8.5Hz), 8.30(d, 1H, J=8.6Hz), 8.25 (d, 1H, J=7.3Hz), 7.56 (dd, 1H, J1=8.5Hz, J2=7.6Hz), 7.52 (dd, 1H, J1=8.5Hz, J2=7.6Hz), 7.18 (d, 1H, J=7.4Hz), 2.90 (dd, 2H, J1=5.3Hz, J2=6.5Hz), 2.89 (s, 6H), 2.69 (dd, 2H, J1=5.3Hz, J2=6.5Hz)
N-Fmoc-アンホテリシンB(N-Fmoc-Amp)は文献既知の方法にて合成した。(文献:M. Murata et al. Org. Lett. 2002, 4, 2087-2089.)N-Fmoc-Amp 55mg (0.044mmol)をDMF5mlに溶解させ、氷冷撹拌下Ds-en 16 mg (0.05mmol) , PyBOP (商標:Benzotriazol-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate)27 mg (0.05mmol), DIEA (diisopropylethylamine)18μl (0.106mmol)を加え、氷冷下で1時間、室温で15時間撹拌した。DMFを減圧留去後、残渣に蒸留ジエチルエーテルを加え析出した沈殿を濾取した。得られた粗精製物をジエチルエーテル−メタノールで結晶化を行い、Fmoc-Amp-en-Ds 46 mg (0.032mmol)を得た。(収率73%)これを2%DBU(ジアザビシクロウンデセン)/DMF溶液5 mlに溶解させ、室温で10分間処理してFmoc基の除去を行った。減圧濃縮後、得られた残渣に蒸留エーテルを加え、生じた沈殿を濾取した。この沈殿を蒸留ジエチルエーテルで洗浄し乾燥させてAmp-en-Ds 38 mgを得た。(定量的)Amp-en-Dsの1H NMRスペクトル(300MHz, DMSO-d6)を図1に示す。
m.p.: > 300℃, 大気圧イオン化質量スペクトル (APCI-MS, positive) m/z=1199.9 ([M+3H]+)
Amp-en-DsとアンホテリシンB(Amp)の紫外吸収スペクトルは、紫外・可視分光光度計 (JASCO, Ubest V-550 UV/VIS)で測定した。試料は分光測定用MeOHに溶解させ、光路長1cmの角型石英セルを用いて室温にて測定した。蛍光スペクトルは、蛍光分光光度計 (Hitachi, F-4010)で測定した。測定には紫外吸収スペクトル測定と同じ試料溶液を用い、光路長1cmの角型石英セルを用いて室温にて測定した。
結果を図2および3に示す。Amp-en-DsはアンホテリシンBの吸収に加えて、ダンシル基の吸収が確認された。また、約510nmに蛍光が観察された。
マクロファージ細胞(RAW264.7)にアンホテリシンB, Amp-en-Ds, フィリピンIII のDMSO溶液 (濃度5μM, 75μM) を1時間取り込ませ、蛍光顕微鏡にて染色画像を撮影した。(図4)
上二段は、ホルマリンで固定化された細胞に各化合物を5μM, 75μM加えた場合、下二段は、生細胞に各化合物を5μM, 75μM加えた場合の顕微鏡画像である。
その結果、Amp-en-Dsは細胞内に取り込まれ、公知のコレステロールプローブであるフィリピンIIIよりも強い蛍光を示すことがわかった。アンホテリシンBのみでは蛍光は見られなかった。
Claims (4)
- 下記一般式(I)で表される化合物。
- nが2であり、Rがメチルである、請求項1に記載の化合物。
- 請求項1または2に記載の化合物を細胞に添加し、蛍光を測定することを特徴とする、細胞内コレステロールの検出方法。
- 請求項1または2に記載の化合物を含む、コレステロール検出キット。
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