JPH11311607A - 電気化学ルミネセンスシグナルの安定化および増幅 - Google Patents
電気化学ルミネセンスシグナルの安定化および増幅Info
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- JPH11311607A JPH11311607A JP11072146A JP7214699A JPH11311607A JP H11311607 A JPH11311607 A JP H11311607A JP 11072146 A JP11072146 A JP 11072146A JP 7214699 A JP7214699 A JP 7214699A JP H11311607 A JPH11311607 A JP H11311607A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】検出方法における電気化学ルミネセンスシグナ
ルの安定化および増幅を提供する。 【解決手段】 次のステップ：（ａ）測定用電極を含む
電気化学ルミネセンス装置を準備し、（ｂ）電気化学ル
ミネセンス補助基質を含有するコンディショニング液を
電極に接触させ、（ｃ）電極上および／またはその境界
領域に活性化された電気化学ルミネセンス補助基質の分
子を含有する層を形成させるように、電極の条件を調節
し、（ｄ）電気化学ルミネセンスマーカー基として１以
上の電荷担体および／または１以上の親水性基を含有す
る金属錯体と電気化学ルミネセンス補助基質を含むサン
プルを電極に接触させ、（ｅ）電極に電気化学ルミネセ
ンス反応を進行させることが可能な電位を適用して、そ
の電気化学ルミネセンスを測定し、（ｆ）測定したルミ
ネセンスをサンプル中のアナライトの存在または量に相
関させる、ことを含む電気化学ルミネセンス測定による
サンプル中のアナライトの検出方法。
ルの安定化および増幅を提供する。 【解決手段】 次のステップ：（ａ）測定用電極を含む
電気化学ルミネセンス装置を準備し、（ｂ）電気化学ル
ミネセンス補助基質を含有するコンディショニング液を
電極に接触させ、（ｃ）電極上および／またはその境界
領域に活性化された電気化学ルミネセンス補助基質の分
子を含有する層を形成させるように、電極の条件を調節
し、（ｄ）電気化学ルミネセンスマーカー基として１以
上の電荷担体および／または１以上の親水性基を含有す
る金属錯体と電気化学ルミネセンス補助基質を含むサン
プルを電極に接触させ、（ｅ）電極に電気化学ルミネセ
ンス反応を進行させることが可能な電位を適用して、そ
の電気化学ルミネセンスを測定し、（ｆ）測定したルミ
ネセンスをサンプル中のアナライトの存在または量に相
関させる、ことを含む電気化学ルミネセンス測定による
サンプル中のアナライトの検出方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は検出方法における電
気化学ルミネセンスシグナルの安定化および増幅に関す
る。
気化学ルミネセンスシグナルの安定化および増幅に関す
る。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】ルミ
ネセンス性金属錯体は従来技術において知られている。
EP-A-0 178 450に、免疫学的に活性な物質に結合させた
ルテニウム錯体が開示されている。このルテニウム錯体
は２以上の窒素含有複素環を含む同一または異なる二環
式または多環式リガンドを３個含有するものであり、こ
れらのリガンドの少なくとも１つがそれを水溶性にする
１以上の-ＳＯ3Ｈまたは-ＣＯＯＨなどの基で置換さ
れ、そしてこれらのリガンドの少なくとも１つが１以上
の-ＣＯＯＨなどの反応性基で直接にまたはスペーサー
基を介して置換されており、かつリガンドは窒素原子を
介してルテニウムに結合している。
ネセンス性金属錯体は従来技術において知られている。
EP-A-0 178 450に、免疫学的に活性な物質に結合させた
ルテニウム錯体が開示されている。このルテニウム錯体
は２以上の窒素含有複素環を含む同一または異なる二環
式または多環式リガンドを３個含有するものであり、こ
れらのリガンドの少なくとも１つがそれを水溶性にする
１以上の-ＳＯ3Ｈまたは-ＣＯＯＨなどの基で置換さ
れ、そしてこれらのリガンドの少なくとも１つが１以上
の-ＣＯＯＨなどの反応性基で直接にまたはスペーサー
基を介して置換されており、かつリガンドは窒素原子を
介してルテニウムに結合している。
【０００３】その上、電気化学ルミネセンス検出法のた
めの標識試薬としての金属錯体の使用もまた知られてい
る（例えば、EP-A-0 580 979、WO 87/06706、US 5,238,
108または US 5,310,687 参照）。こうした電気化学ル
ミネセンス検出法は好適な測定装置中での金属錯体の中
心原子（例えばルテニウム）の電子移動による励起され
たMLCT３重項への遷移を基礎としている。原子は光子の
放出をともなう禁止３重項−１重項遷移によってこの励
起状態から基底状態に緩和されることができる（例えば
WO/90 05296、Leland and Powell,J.Electrochem.Soc.
137(1990),3127-3131；Blackburn ら、Clin.Chem.37(19
91),1534-1539参照）。
めの標識試薬としての金属錯体の使用もまた知られてい
る（例えば、EP-A-0 580 979、WO 87/06706、US 5,238,
108または US 5,310,687 参照）。こうした電気化学ル
ミネセンス検出法は好適な測定装置中での金属錯体の中
心原子（例えばルテニウム）の電子移動による励起され
たMLCT３重項への遷移を基礎としている。原子は光子の
放出をともなう禁止３重項−１重項遷移によってこの励
起状態から基底状態に緩和されることができる（例えば
WO/90 05296、Leland and Powell,J.Electrochem.Soc.
137(1990),3127-3131；Blackburn ら、Clin.Chem.37(19
91),1534-1539参照）。
【０００４】この方法の欠点は、測定期間中のシグナル
強度の明らかな減少によって、得られる測定シグナルの
最大レベルが極めて限定されることである。これまでの
従来方法および以前に市販されて使用してきた金属錯
体、特にルテニウム（ビピリジル）3 錯体については、
このシグナルの減少は測定期間 100ミリ秒後にすでに発
生し、そしてシグナルの強度とともに大きくなる。この
現象は反応機構に関する従来の文献を根拠としては理解
できない。このシグナルの減少があるため、測定から評
価までの間隔の時間が相当程度、すなわち実施上は最大
で400ミリ秒に限定される。従来のすべての場合におい
て、これは光収率の有意な減少をもたらし、この結果と
して試験感度および試験動力学の低下をまねいた。した
がって、実施上非特異的なシグナルによる問題をともな
わないのは、たかだか 400ミリ秒の測定から評価までの
時間間隔を使用することのみが可能である。その上、不
明確性およびシグナルの不安定性がシグナル曲線のこの
減衰部分で発生することが多く、その結果さらに不正確
になる。
強度の明らかな減少によって、得られる測定シグナルの
最大レベルが極めて限定されることである。これまでの
従来方法および以前に市販されて使用してきた金属錯
体、特にルテニウム（ビピリジル）3 錯体については、
このシグナルの減少は測定期間 100ミリ秒後にすでに発
生し、そしてシグナルの強度とともに大きくなる。この
現象は反応機構に関する従来の文献を根拠としては理解
できない。このシグナルの減少があるため、測定から評
価までの間隔の時間が相当程度、すなわち実施上は最大
で400ミリ秒に限定される。従来のすべての場合におい
て、これは光収率の有意な減少をもたらし、この結果と
して試験感度および試験動力学の低下をまねいた。した
がって、実施上非特異的なシグナルによる問題をともな
わないのは、たかだか 400ミリ秒の測定から評価までの
時間間隔を使用することのみが可能である。その上、不
明確性およびシグナルの不安定性がシグナル曲線のこの
減衰部分で発生することが多く、その結果さらに不正確
になる。
【０００５】リンカー上に親水性置換基および／または
電荷担体を有する新規な金属錯体がWO 96/03409および
WO 96/03410に記載されている。これらの錯体の使用は
望ましくない吸着を減少させ、これによって検出法にお
ける安定性および再現性が改善される。さらに、量子収
率の増加が記載されている。しかし、電気化学ルミネセ
ンス測定における最大測定間隔の延長の可能性について
は何ら報告がない。
電荷担体を有する新規な金属錯体がWO 96/03409および
WO 96/03410に記載されている。これらの錯体の使用は
望ましくない吸着を減少させ、これによって検出法にお
ける安定性および再現性が改善される。さらに、量子収
率の増加が記載されている。しかし、電気化学ルミネセ
ンス測定における最大測定間隔の延長の可能性について
は何ら報告がない。
【０００６】
【課題を解決するための手段】驚くべきことに、例えば
EP-A-0 178 450、WO 96/03409または WO 96/03410に記
載される親水性および／または荷電金属錯体の使用の結
果、非親水性ルテニウム（ビピリジン）3 錯体について
知られているシグナルの減少は発生しないため、電気化
学ルミネセンス検出において注目すべき改善が得られる
ことがわかった。驚くべきことに、シグナルは基本的に
全測定時間間隔にわたり、最大値が維持される。これに
よってシグナルの増幅および／または可能な最大測定時
間間隔の増大がもたらされる。この改善は、好ましく
は、測定の前に、電気化学ルミネセンス補助基質の存在
下で、測定電極に負電位を適用する測定条件下で達成さ
れる。
EP-A-0 178 450、WO 96/03409または WO 96/03410に記
載される親水性および／または荷電金属錯体の使用の結
果、非親水性ルテニウム（ビピリジン）3 錯体について
知られているシグナルの減少は発生しないため、電気化
学ルミネセンス検出において注目すべき改善が得られる
ことがわかった。驚くべきことに、シグナルは基本的に
全測定時間間隔にわたり、最大値が維持される。これに
よってシグナルの増幅および／または可能な最大測定時
間間隔の増大がもたらされる。この改善は、好ましく
は、測定の前に、電気化学ルミネセンス補助基質の存在
下で、測定電極に負電位を適用する測定条件下で達成さ
れる。
【０００７】したがって、本発明の主題の１つは以下の
ステップを含む電気化学ルミネセンス測定による、サン
プル中のアナライトの検出方法である： （ａ）測定用電極を含む電気化学ルミネセンス装置を準
備し、（ｂ）電気化学ルミネセンス補助基質を含有する
コンディショニング液を電極に接触させ、（ｃ）例えば
電極に負電位を適用することによって、電極上および／
またはその境界領域に活性化された電気化学ルミネセン
ス補助基質の分子を含有する層を形成させるように、電
極の条件を調節し、（ｄ）電気化学ルミネセンスマーカ
ー基として１以上の電荷担体および／または１以上の親
水性基を含有する金属錯体と電気化学ルミネセンス補助
基質を含むサンプルを電極に接触させ、（ｅ）電極に電
気化学ルミネセンス反応を進行させることが可能な電位
を適用して、その電気化学ルミネセンスを測定し、そし
て、（ｆ）測定したルミネセンスをサンプル中のアナラ
イトの存在または量に相関させる。
ステップを含む電気化学ルミネセンス測定による、サン
プル中のアナライトの検出方法である： （ａ）測定用電極を含む電気化学ルミネセンス装置を準
備し、（ｂ）電気化学ルミネセンス補助基質を含有する
コンディショニング液を電極に接触させ、（ｃ）例えば
電極に負電位を適用することによって、電極上および／
またはその境界領域に活性化された電気化学ルミネセン
ス補助基質の分子を含有する層を形成させるように、電
極の条件を調節し、（ｄ）電気化学ルミネセンスマーカ
ー基として１以上の電荷担体および／または１以上の親
水性基を含有する金属錯体と電気化学ルミネセンス補助
基質を含むサンプルを電極に接触させ、（ｅ）電極に電
気化学ルミネセンス反応を進行させることが可能な電位
を適用して、その電気化学ルミネセンスを測定し、そし
て、（ｆ）測定したルミネセンスをサンプル中のアナラ
イトの存在または量に相関させる。
【０００８】本発明に従う方法では、従来の非親水性ル
テニウム（ビピリジル）3 マーカー基に比較して、シグ
ナルの減少がないため、少なくとも２倍から５倍高い測
定シグナルが得られるようになる。このより高いシグナ
ル強度によって、従来使用されてきた光電子増倍管に代
えて、より安価な半導体検出器の使用が可能になる。さ
らに、好適な測定条件下で、すなわちルミネセンス反応
のために十分な陽電位を維持すると同時に、電気化学ル
ミネセンス補助基質の十分な供給を維持することによっ
て、任意の所望の時間間隔にわたり、単位時間当たり一
定に保たれる光量を生成することが可能である。これに
よって、はるかに大量の光を集積することが可能にな
り、そしてより高い試験感度が達成される。
テニウム（ビピリジル）3 マーカー基に比較して、シグ
ナルの減少がないため、少なくとも２倍から５倍高い測
定シグナルが得られるようになる。このより高いシグナ
ル強度によって、従来使用されてきた光電子増倍管に代
えて、より安価な半導体検出器の使用が可能になる。さ
らに、好適な測定条件下で、すなわちルミネセンス反応
のために十分な陽電位を維持すると同時に、電気化学ル
ミネセンス補助基質の十分な供給を維持することによっ
て、任意の所望の時間間隔にわたり、単位時間当たり一
定に保たれる光量を生成することが可能である。これに
よって、はるかに大量の光を集積することが可能にな
り、そしてより高い試験感度が達成される。
【０００９】本発明にしたがって使用する金属錯体のそ
の他の利点は、酸素による消光の現象がより少ないこ
と、ならびに例えば試験成分および／または電極への非
特異的吸着による試験の障害が少ないことである。
の他の利点は、酸素による消光の現象がより少ないこ
と、ならびに例えば試験成分および／または電極への非
特異的吸着による試験の障害が少ないことである。
【００１０】本発明に従う方法のステップ（ａ）におい
て準備される電気化学ルミネセンス測定装置は先行技術
で既知の装置でよい（例えばN.R.Hoyle 「イムノアッセ
イに基づくアナライトの測定への電気化学ルミネセンス
の適用」:Bioluminescence and Chemiluminescence；Pr
oceedings of the 8th International Symposium onBio
luminescence and Chemiluminescence, Cambridge, 199
4.9, A.K.Campbellら（発行）John Wiley & Sons；WO 8
9/10551；WO 90/11511 参照）。その装置は好ましくは
測定用電極を備えた測定室、測定室への液体の供給およ
びここからの除去のための手段および測定室で生成され
た電気化学ルミネセンスを検出するための手段を含む。
その上、この装置は好ましくはサンプル液中の磁性粒子
を測定電極上に固定するための磁気手段を含んでいる。
て準備される電気化学ルミネセンス測定装置は先行技術
で既知の装置でよい（例えばN.R.Hoyle 「イムノアッセ
イに基づくアナライトの測定への電気化学ルミネセンス
の適用」:Bioluminescence and Chemiluminescence；Pr
oceedings of the 8th International Symposium onBio
luminescence and Chemiluminescence, Cambridge, 199
4.9, A.K.Campbellら（発行）John Wiley & Sons；WO 8
9/10551；WO 90/11511 参照）。その装置は好ましくは
測定用電極を備えた測定室、測定室への液体の供給およ
びここからの除去のための手段および測定室で生成され
た電気化学ルミネセンスを検出するための手段を含む。
その上、この装置は好ましくはサンプル液中の磁性粒子
を測定電極上に固定するための磁気手段を含んでいる。
【００１１】この方法のステップ（ｂ）は、例えばアミ
ンまたは過硫酸塩などの金属錯体の酸化または還元剤と
して有効な電気化学ルミネセンス補助基質を含有するコ
ンディショニング液を電極に接触させることを含む。ア
ルキル基がそれぞれ１〜４個のＣ原子を含有するトリア
ルキルアミンなどの三級アミンが好ましく使用される。
トリプロピルアミンが特に好ましい。コンディショニン
グ液中の補助基質の濃度は広範囲に変更することが可能
であるが、１ mM 以上が好ましく、特に好ましくは 10
〜500 mM、そして最も好ましくは100〜300 mMである。
コンディショニング液にはその他に例えばリン酸緩衝液
などの好適な電気化学的に不活性な緩衝液および例えば
Thesit などの界面活性剤を含有させることができる。
ンまたは過硫酸塩などの金属錯体の酸化または還元剤と
して有効な電気化学ルミネセンス補助基質を含有するコ
ンディショニング液を電極に接触させることを含む。ア
ルキル基がそれぞれ１〜４個のＣ原子を含有するトリア
ルキルアミンなどの三級アミンが好ましく使用される。
トリプロピルアミンが特に好ましい。コンディショニン
グ液中の補助基質の濃度は広範囲に変更することが可能
であるが、１ mM 以上が好ましく、特に好ましくは 10
〜500 mM、そして最も好ましくは100〜300 mMである。
コンディショニング液にはその他に例えばリン酸緩衝液
などの好適な電気化学的に不活性な緩衝液および例えば
Thesit などの界面活性剤を含有させることができる。
【００１２】ステップ（ｃ）にしたがって、活性化さ
れ、そして特に還元された補助基質の分子の電極上への
付着が生ずるような条件を電極に設定する。この付着は
吸着として生じたり、また電極表面のすぐ近傍に補助基
質分子を含有する境界層の形成によっても生ずる。この
目的のため、好ましくはコンディショニング液の存在下
で電極に負の電位を適用するのが好ましい。負の電位の
値は好ましくは少なくとも−0.3 V 、例えば−1.2〜−
1.0 Vである。負電位は好ましくは0.2〜20秒、特に好ま
しくは約 0.5秒間適用する。
れ、そして特に還元された補助基質の分子の電極上への
付着が生ずるような条件を電極に設定する。この付着は
吸着として生じたり、また電極表面のすぐ近傍に補助基
質分子を含有する境界層の形成によっても生ずる。この
目的のため、好ましくはコンディショニング液の存在下
で電極に負の電位を適用するのが好ましい。負の電位の
値は好ましくは少なくとも−0.3 V 、例えば−1.2〜−
1.0 Vである。負電位は好ましくは0.2〜20秒、特に好ま
しくは約 0.5秒間適用する。
【００１３】本発明に従う方法のステップ（ｄ）はサン
プルを測定電極に接触させることを含む。サンプルは好
ましくは生物学的サンプルであり、そして液体形態で存
在する。これはヒト、動物または植物組織、体液、原核
または真核細胞培養物、その他から誘導することができ
る。各アナライトを判定するために必要とされる検出試
薬をこのサンプルに添加する。これらの検出試薬は、好
ましくは生物学的物質（例をあげると、ビオチン、核
酸、例えばオリゴヌクレオチド、ＤＮＡまたはＲＮＡ、
ペプチド核酸などの核酸類似体、抗体または抗体断片、
ポリペプチド抗原、すなわち免疫学的に反応性があるポ
リペプチド、またはハプテン、すなわち分子量が 150〜
2000の有機分子）に結合された、以後マーカー基として
定義する電気化学ルミネセンス性金属錯体、ならびに場
合によっては当業者に既知のその他の検出用試薬を含有
する。サンプルはさらに上記定義の電気化学ルミネセン
ス補助基質を含有する。
プルを測定電極に接触させることを含む。サンプルは好
ましくは生物学的サンプルであり、そして液体形態で存
在する。これはヒト、動物または植物組織、体液、原核
または真核細胞培養物、その他から誘導することができ
る。各アナライトを判定するために必要とされる検出試
薬をこのサンプルに添加する。これらの検出試薬は、好
ましくは生物学的物質（例をあげると、ビオチン、核
酸、例えばオリゴヌクレオチド、ＤＮＡまたはＲＮＡ、
ペプチド核酸などの核酸類似体、抗体または抗体断片、
ポリペプチド抗原、すなわち免疫学的に反応性があるポ
リペプチド、またはハプテン、すなわち分子量が 150〜
2000の有機分子）に結合された、以後マーカー基として
定義する電気化学ルミネセンス性金属錯体、ならびに場
合によっては当業者に既知のその他の検出用試薬を含有
する。サンプルはさらに上記定義の電気化学ルミネセン
ス補助基質を含有する。
【００１４】本発明に従う方法は均一系アッセイとして
実施することができる。すなわち電気化学ルミネセンス
を液相中で測定する。しかし、電気化学ルミネセンス標
識を固相上、例を上げると、磁性マイクロビーズ、例え
ばストレプトアビジン被覆マイクロビーズなどの粒状固
相上、またはコロイド粒子上に固定した、不均一試験を
実施するのが好ましい。不均一試験を実施する場合、本
発明に従う方法には、固相を電極上に固定し、そしてそ
の他のサンプル成分を分離する、いわゆる捕捉および洗
浄ステップが含まれる。
実施することができる。すなわち電気化学ルミネセンス
を液相中で測定する。しかし、電気化学ルミネセンス標
識を固相上、例を上げると、磁性マイクロビーズ、例え
ばストレプトアビジン被覆マイクロビーズなどの粒状固
相上、またはコロイド粒子上に固定した、不均一試験を
実施するのが好ましい。不均一試験を実施する場合、本
発明に従う方法には、固相を電極上に固定し、そしてそ
の他のサンプル成分を分離する、いわゆる捕捉および洗
浄ステップが含まれる。
【００１５】電気化学ルミネセンスを測定するため、ス
テップ（ｅ）にしたがって、電気化学ルミネセンス反応
の発生を可能にする電位、すなわち電気化学ルミネセン
ス性金属錯体および補助基質のための酸化電位を電極に
適用して、その電気化学ルミネセンスを測定する。酸化
電極電位は好ましくは（Ag/AgCl 基準電極に対して）＋
1.2 V 以上である。特に親水性および／または荷電ルテ
ニウム−バソフェナントロリン錯体の場合には、測定電
位は＋1.4 V 以上、例えば＋1.4 V〜＋2.4 Vが特に好ま
しい。シグナルの減少が発生しないため、測定間隔の長
さは従来の標準的な測定時間に比較して相当程度増加さ
せることができる。測定間隔は好ましくは 0.5秒以上、
特に好ましくは１秒以上、そして最も好ましくは２秒以
上である。これに関連して、全測定間隔時間中ルミネセ
ンス反応を維持するのに十分な酸化電位を適用するのが
好ましい。全測定時間中、電極に基本的に一定の酸化電
位を適用するのが特に好ましい。
テップ（ｅ）にしたがって、電気化学ルミネセンス反応
の発生を可能にする電位、すなわち電気化学ルミネセン
ス性金属錯体および補助基質のための酸化電位を電極に
適用して、その電気化学ルミネセンスを測定する。酸化
電極電位は好ましくは（Ag/AgCl 基準電極に対して）＋
1.2 V 以上である。特に親水性および／または荷電ルテ
ニウム−バソフェナントロリン錯体の場合には、測定電
位は＋1.4 V 以上、例えば＋1.4 V〜＋2.4 Vが特に好ま
しい。シグナルの減少が発生しないため、測定間隔の長
さは従来の標準的な測定時間に比較して相当程度増加さ
せることができる。測定間隔は好ましくは 0.5秒以上、
特に好ましくは１秒以上、そして最も好ましくは２秒以
上である。これに関連して、全測定間隔時間中ルミネセ
ンス反応を維持するのに十分な酸化電位を適用するのが
好ましい。全測定時間中、電極に基本的に一定の酸化電
位を適用するのが特に好ましい。
【００１６】本発明に従うステップ（ｆ）は測定した電
気化学ルミネセンスをサンプル中の測定すべきアナライ
トの存在またはその量に相関させることを含む。これに
よって、当業者が既知の標準的方法でのアナライトの定
性的および／または定量的測定が可能になる。
気化学ルミネセンスをサンプル中の測定すべきアナライ
トの存在またはその量に相関させることを含む。これに
よって、当業者が既知の標準的方法でのアナライトの定
性的および／または定量的測定が可能になる。
【００１７】本発明に従う方法の基本的な特徴は電荷担
体および／または１以上の親水性基とともにリガンドを
含有する電気化学ルミネセンス性金属錯体の使用であ
る。金属錯体は好ましくはマーカー基として以下の一般
式（Ｉ）の構造を含有するものを使用する： ［Ｍ(Ｌ1Ｌ2Ｌ3)］n−Ｙm （Ｉ） 式中、 −Ｍは希土類または遷移金属カチオンから選択される２
価または３価金属カチオンであり、 −Ｌ1、Ｌ2およびＬ3 は２以上の窒素含有複素環を含有
する同一または異種のリガンドを表し、そしてＬ1、Ｌ2
およびＬ3 はその窒素原子を介して金属カチオンに結合
しており、 −Ｙはリガンドに結合したリンカーを表し、これによっ
て錯体が例えば（ａ）生物学的物質に結合しているか、
または（ｂ）生物学的物質に結合することが可能であ
り、 −ｍは整数１〜10、好ましくは１〜４、特に好ましくは
１であり、 −ｎは整数１〜６、好ましくは１〜３、特に好ましくは
１であり、 −この錯体中に１以上の親水性基および／または電荷担
体が存在する。
体および／または１以上の親水性基とともにリガンドを
含有する電気化学ルミネセンス性金属錯体の使用であ
る。金属錯体は好ましくはマーカー基として以下の一般
式（Ｉ）の構造を含有するものを使用する： ［Ｍ(Ｌ1Ｌ2Ｌ3)］n−Ｙm （Ｉ） 式中、 −Ｍは希土類または遷移金属カチオンから選択される２
価または３価金属カチオンであり、 −Ｌ1、Ｌ2およびＬ3 は２以上の窒素含有複素環を含有
する同一または異種のリガンドを表し、そしてＬ1、Ｌ2
およびＬ3 はその窒素原子を介して金属カチオンに結合
しており、 −Ｙはリガンドに結合したリンカーを表し、これによっ
て錯体が例えば（ａ）生物学的物質に結合しているか、
または（ｂ）生物学的物質に結合することが可能であ
り、 −ｍは整数１〜10、好ましくは１〜４、特に好ましくは
１であり、 −ｎは整数１〜６、好ましくは１〜３、特に好ましくは
１であり、 −この錯体中に１以上の親水性基および／または電荷担
体が存在する。
【００１８】この錯体中の金属カチオンは好ましくはル
テニウム、オスミウム、レニウム、イリジウム、ロジウ
ム、白金、インジウム、パラジウム、モリブデン、テク
ネチウム、銅、クロム、タングステン、イットリウムま
たはルテチウムである。ルテニウム、イリジウム、レニ
ウム、クロムおよびオスミウムが特に好ましい。ルテニ
ウムが最も好ましい。錯体は場合によって電荷平衡のた
め、対イオン、例えばアニオンを含んでもよい。
テニウム、オスミウム、レニウム、イリジウム、ロジウ
ム、白金、インジウム、パラジウム、モリブデン、テク
ネチウム、銅、クロム、タングステン、イットリウムま
たはルテチウムである。ルテニウム、イリジウム、レニ
ウム、クロムおよびオスミウムが特に好ましい。ルテニ
ウムが最も好ましい。錯体は場合によって電荷平衡のた
め、対イオン、例えばアニオンを含んでもよい。
【００１９】リガンドＬ1、Ｌ2およびＬ3 は好ましくは
２以上の窒素含有複素環を有するリガンドである。例え
ばビピリジル、ビピラジル、ターピリジルおよびフェナ
ントロニルなどの芳香族複素環が好ましい。リガンドは
特に好ましくはビピリジンおよびフェナントロリン環系
から選択される。リガンドは最も好ましくはバソフェナ
ントロリン環系を含有する。
２以上の窒素含有複素環を有するリガンドである。例え
ばビピリジル、ビピラジル、ターピリジルおよびフェナ
ントロニルなどの芳香族複素環が好ましい。リガンドは
特に好ましくはビピリジンおよびフェナントロリン環系
から選択される。リガンドは最も好ましくはバソフェナ
ントロリン環系を含有する。
【００２０】本発明に従う金属錯体中の親水性基および
／または電荷担体は好ましくは例えばリンカーまたはリ
ガンドＬ1、Ｌ2若しくはＬ3 の別の置換基に共有結合し
ている。用語「電荷担体」は本発明の意味では、６〜８
の範囲のｐＨ値で主としてイオン形態で存在する基を表
す。錯体は好ましくは10個まで、特に好ましくは２〜８
個のこうした電荷担体を含有している。
／または電荷担体は好ましくは例えばリンカーまたはリ
ガンドＬ1、Ｌ2若しくはＬ3 の別の置換基に共有結合し
ている。用語「電荷担体」は本発明の意味では、６〜８
の範囲のｐＨ値で主としてイオン形態で存在する基を表
す。錯体は好ましくは10個まで、特に好ましくは２〜８
個のこうした電荷担体を含有している。
【００２１】錯体は特に好ましくは１以上の陰電荷担体
を含有する。好適な陰電荷担体の例はリン酸、ホスホン
酸、スルホン酸およびカルボン酸基であり、この中でス
ルホン酸およびカルボン酸基が最も好ましい。
を含有する。好適な陰電荷担体の例はリン酸、ホスホン
酸、スルホン酸およびカルボン酸基であり、この中でス
ルホン酸およびカルボン酸基が最も好ましい。
【００２２】陽電荷担体の例はアミノ基およびモノ、ジ
またはトリアルキルアミノ基などのモノ置換またはポリ
置換アミノ基であり、ここでアルキルは１〜６Ｃ原子の
直鎖若しくは分枝アルキル基また３〜６Ｃ原子の環状ア
ルキル基を表す。リガンドと生物学的物質の間のリンカ
ーは好ましくは４〜40原子数の鎖長を有し、異種原子、
例えばアミド基の組み込みによって改変したアルキレン
鎖でありうる。
またはトリアルキルアミノ基などのモノ置換またはポリ
置換アミノ基であり、ここでアルキルは１〜６Ｃ原子の
直鎖若しくは分枝アルキル基また３〜６Ｃ原子の環状ア
ルキル基を表す。リガンドと生物学的物質の間のリンカ
ーは好ましくは４〜40原子数の鎖長を有し、異種原子、
例えばアミド基の組み込みによって改変したアルキレン
鎖でありうる。
【００２３】遊離の電荷担体を含有するリンカーは例え
ば互いにペプチド結合によって連結されたアミノカルボ
ン酸単位で部分的に構成されていてもよい。この場合、
リンカー中に取り込まれて荷電基の２つが付随反応した
後でも、１以上の遊離電荷担体が依然として存在してい
るように、電荷担体は３以上の荷電基（アミノ＋カルボ
ン酸）を含有する多官能性アミノカルボン酸の遊離のア
ミノおよび／またはカルボン酸基由来のものとすること
ができる。
ば互いにペプチド結合によって連結されたアミノカルボ
ン酸単位で部分的に構成されていてもよい。この場合、
リンカー中に取り込まれて荷電基の２つが付随反応した
後でも、１以上の遊離電荷担体が依然として存在してい
るように、電荷担体は３以上の荷電基（アミノ＋カルボ
ン酸）を含有する多官能性アミノカルボン酸の遊離のア
ミノおよび／またはカルボン酸基由来のものとすること
ができる。
【００２４】遊離電荷担体はリンカーの成分ではないリ
ガンドの置換基由来のものとしてもよい。これらの電荷
担体は複素環に直接またはスペーサー基を介して結合さ
せることができる。スペーサー基が存在する場合、それ
は好ましくは１〜８原子数の鎖長であり、異種原子、例
えばアミド基の組み込みによって改変したアルキレン鎖
であってもよい。
ガンドの置換基由来のものとしてもよい。これらの電荷
担体は複素環に直接またはスペーサー基を介して結合さ
せることができる。スペーサー基が存在する場合、それ
は好ましくは１〜８原子数の鎖長であり、異種原子、例
えばアミド基の組み込みによって改変したアルキレン鎖
であってもよい。
【００２５】さらに、本発明に従う方法にとって、親水
性基を含有する錯体が好適である。好適な親水性基の例
はＣ2〜Ｃ3アルキレンオキシ単位、Ｃ2〜Ｃ3アルキレン
チオ単位およびポリヒドロキシ単位である。
性基を含有する錯体が好適である。好適な親水性基の例
はＣ2〜Ｃ3アルキレンオキシ単位、Ｃ2〜Ｃ3アルキレン
チオ単位およびポリヒドロキシ単位である。
【００２６】ポリヒドロキシ単位は好ましくは式（IIa
）または（IIb ）の基から選択される： −ＮＲ−Ｗ （IIa ） −Ｏ−Ｗ− （IIb ) 式中、Ｗは２以上のヒドロキシ基を含有する有機残基を
表し、そしてＲは水素またはＣ1〜Ｃ5アルキル、好まし
くは水素またはＣ1〜Ｃ3アルキルを表す。
）または（IIb ）の基から選択される： −ＮＲ−Ｗ （IIa ） −Ｏ−Ｗ− （IIb ) 式中、Ｗは２以上のヒドロキシ基を含有する有機残基を
表し、そしてＲは水素またはＣ1〜Ｃ5アルキル、好まし
くは水素またはＣ1〜Ｃ3アルキルを表す。
【００２７】有機残基Ｗは好ましくは２〜６、特に好ま
しくは２〜４個のヒドロキシ基を含有する。その上、Ｗ
は２〜10、特に３〜６個の炭素原子を含むのが有利であ
る。好適なポリヒドロキシ単位の特定の例をあげると、
グリセロールまたはアミノポリアルコールなどのポリア
ルコールの残基である。好ましいアミノアルコールはト
リス（2-アミノ-2- ヒドロキシメチル）-1,3- プロパン
トリオールである。ポリアルコールおよびアミノポリア
ルコールは好ましくはエステルおよびアミド形態で金属
錯体に連結されている。
しくは２〜４個のヒドロキシ基を含有する。その上、Ｗ
は２〜10、特に３〜６個の炭素原子を含むのが有利であ
る。好適なポリヒドロキシ単位の特定の例をあげると、
グリセロールまたはアミノポリアルコールなどのポリア
ルコールの残基である。好ましいアミノアルコールはト
リス（2-アミノ-2- ヒドロキシメチル）-1,3- プロパン
トリオールである。ポリアルコールおよびアミノポリア
ルコールは好ましくはエステルおよびアミド形態で金属
錯体に連結されている。
【００２８】本発明に従う金属錯体のＣ2〜Ｃ3アルキレ
ンオキシ単位およびＣ2〜Ｃ3アルキレンチオ単位は好ま
しくはＣ2 単位、特にエチレンオキシ単位である。錯体
は好ましくは１金属カチオンについて１〜30、好ましく
は２〜20アルキレンオキシまたはアルキレンチオ単位を
含有する。アルキレンオキシまたはアルキレンチオ単位
は場合によっては互いに橋頭を介して連結していてもよ
い。他方、いくつかの錯体単位が互いにそうした橋頭を
介して連結して半かご状またはかご状構造を形成するこ
とも可能である。
ンオキシ単位およびＣ2〜Ｃ3アルキレンチオ単位は好ま
しくはＣ2 単位、特にエチレンオキシ単位である。錯体
は好ましくは１金属カチオンについて１〜30、好ましく
は２〜20アルキレンオキシまたはアルキレンチオ単位を
含有する。アルキレンオキシまたはアルキレンチオ単位
は場合によっては互いに橋頭を介して連結していてもよ
い。他方、いくつかの錯体単位が互いにそうした橋頭を
介して連結して半かご状またはかご状構造を形成するこ
とも可能である。
【００２９】好適な親水性および／または荷電金属錯体
の特定の例がEP-A-0 178 540、WO 96/03409 および WO
96/03410中に示されている。こうした金属錯体は既知の
方法、例えば金属ハロゲン化物などの金属塩を反応さ
せ、場合によっては続いてそのハロゲン化物イオンをヘ
キサフルオロリン酸、トリフルオロ酢酸またはテトラフ
ルオロホウ酸基で置換することによって合成することが
できる。こうした方法は既知である。本発明に従う方法
のために、金属錯体は通常は１以上の金属錯体が生物学
的物質に連結している、生物学的物質との結合体の形態
で使用される。好適な生物学的物質の例は細胞、ウイル
ス、細胞下粒子、タンパク質、リポタンパク質、糖タン
パク質、ペプチド、ポリペプチド、核酸、オリゴ糖、多
糖類、リポ多糖類、細胞代謝物質、ハプテン、ホルモ
ン、薬理学的薬剤、アルカロイド、ステロイド、ビタミ
ン、アミノ酸および糖類である。
の特定の例がEP-A-0 178 540、WO 96/03409 および WO
96/03410中に示されている。こうした金属錯体は既知の
方法、例えば金属ハロゲン化物などの金属塩を反応さ
せ、場合によっては続いてそのハロゲン化物イオンをヘ
キサフルオロリン酸、トリフルオロ酢酸またはテトラフ
ルオロホウ酸基で置換することによって合成することが
できる。こうした方法は既知である。本発明に従う方法
のために、金属錯体は通常は１以上の金属錯体が生物学
的物質に連結している、生物学的物質との結合体の形態
で使用される。好適な生物学的物質の例は細胞、ウイル
ス、細胞下粒子、タンパク質、リポタンパク質、糖タン
パク質、ペプチド、ポリペプチド、核酸、オリゴ糖、多
糖類、リポ多糖類、細胞代謝物質、ハプテン、ホルモ
ン、薬理学的薬剤、アルカロイド、ステロイド、ビタミ
ン、アミノ酸および糖類である。
【００３０】金属錯体は好ましくは、生物学的物質の官
能基の１つに共有結合させることができる、金属錯体上
の反応性または活性化し得る官能基、例えばカルボン酸
ハロゲン化物、カルボン酸無水物、またはN-ヒドロキシ
スクシンイミドエステルなどの活性型エステル、若しく
はマレイミド、によって生物学的物質に連結されてい
る。官能基がカルボン酸無水物、カルボン酸ハロゲン化
物または活性型エステルの場合、例えば生物学的物質の
遊離のアミノ基に連結することが可能である。官能基が
マレイミド残基の場合、生物学的物質の遊離のＳＨ基に
連結することができる。生物学的物質の官能基の活性化
もまた同様の方法で実施することができ、これに続いて
例えば金属錯体の遊離のカルボン酸、アミノまたはチオ
ール基と反応させることができる。
能基の１つに共有結合させることができる、金属錯体上
の反応性または活性化し得る官能基、例えばカルボン酸
ハロゲン化物、カルボン酸無水物、またはN-ヒドロキシ
スクシンイミドエステルなどの活性型エステル、若しく
はマレイミド、によって生物学的物質に連結されてい
る。官能基がカルボン酸無水物、カルボン酸ハロゲン化
物または活性型エステルの場合、例えば生物学的物質の
遊離のアミノ基に連結することが可能である。官能基が
マレイミド残基の場合、生物学的物質の遊離のＳＨ基に
連結することができる。生物学的物質の官能基の活性化
もまた同様の方法で実施することができ、これに続いて
例えば金属錯体の遊離のカルボン酸、アミノまたはチオ
ール基と反応させることができる。
【００３１】従前の実験結果は、金属錯体は遊離の錯体
としても、また生物学的物質、例えば（均一系アッセイ
の場合）抗体に連結した場合、または固相、例えば常磁
性マイクロビーズに高親和性結合、例えば免疫学的若し
くはビオチン−ストレプトアビジン結合を介して固定化
した場合にも、改善されたシグナル特性、すなわち全測
定期間にわたって基本的に一定のシグナルを表出するこ
とを示している。本発明に従う方法の予期しなかったさ
らに別の有利な特性は、生物学的活性物質と金属錯体で
構成される結合体の固相、すなわちマイクロビーズへの
非特異的結合が、従前使用されていた金属錯体および方
法の条件よりもずっと少ないことである。電極表面への
非特異的結合についても改善が見られた。さらに、本発
明に従う、例えば遊離形態での金属錯体と生物学的物質
で構成される結合体は均一系試験変法において、同一濃
度の従前使用された結合体よりも、高いシグナル振幅を
表出する。
としても、また生物学的物質、例えば（均一系アッセイ
の場合）抗体に連結した場合、または固相、例えば常磁
性マイクロビーズに高親和性結合、例えば免疫学的若し
くはビオチン−ストレプトアビジン結合を介して固定化
した場合にも、改善されたシグナル特性、すなわち全測
定期間にわたって基本的に一定のシグナルを表出するこ
とを示している。本発明に従う方法の予期しなかったさ
らに別の有利な特性は、生物学的活性物質と金属錯体で
構成される結合体の固相、すなわちマイクロビーズへの
非特異的結合が、従前使用されていた金属錯体および方
法の条件よりもずっと少ないことである。電極表面への
非特異的結合についても改善が見られた。さらに、本発
明に従う、例えば遊離形態での金属錯体と生物学的物質
で構成される結合体は均一系試験変法において、同一濃
度の従前使用された結合体よりも、高いシグナル振幅を
表出する。
【００３２】本発明のさらに別の主題は、電気化学ルミ
ネセンスマーカー基として１以上の電荷担体および／ま
たは１以上の親水性基を含有する金属錯体を使用し、測
定を0.5秒間以上、好ましくは１秒間以上および特に好
ましくは２秒間以上実施する、電気化学ルミネセンスに
よるサンプル中のアナライトの検出方法である。本方法
の好ましい特徴は上記において包括的に説明されてい
る。本発明を以下の実施例および図面によってさらに詳
細に説明する。
ネセンスマーカー基として１以上の電荷担体および／ま
たは１以上の親水性基を含有する金属錯体を使用し、測
定を0.5秒間以上、好ましくは１秒間以上および特に好
ましくは２秒間以上実施する、電気化学ルミネセンスに
よるサンプル中のアナライトの検出方法である。本方法
の好ましい特徴は上記において包括的に説明されてい
る。本発明を以下の実施例および図面によってさらに詳
細に説明する。
【００３３】
【実施例】実施例１： 均一系試験方法材料 EP-A-0 178または WO 96/03410にしたがってルテニウム
（ビピリジル）3 錯体（Rubpy）およびルテニウム（バ
ソフェナントロリン(ＳＯ3)2）3 錯体（Rubaphe）を調
製した。標準的な方法によって、これらの錯体をヒツジ
からのポリクローナル抗-T4 IgG 抗血清に連結した。 装置：Elecsys 2010シリーズ装置
（ビピリジル）3 錯体（Rubpy）およびルテニウム（バ
ソフェナントロリン(ＳＯ3)2）3 錯体（Rubaphe）を調
製した。標準的な方法によって、これらの錯体をヒツジ
からのポリクローナル抗-T4 IgG 抗血清に連結した。 装置：Elecsys 2010シリーズ装置
【００３４】微小粒子および結合物−遊離物分離を使用
しなかったこと以外は実施例２に記載する不均一系試験
の電位プロフィルに基本的に対応する分析サイクルを使
用して、試験操作を実施した。したがって、電極表面に
微小粒子を捕捉することはしないで、気泡によって囲ま
れたマーカー分子を含有する溶液のセグメントを測定室
の電極のまわりに位置させた。その後、ルミネセンスを
測定した。最初の試験において、均一系試験で金属錯体
Rubpyおよび Rubapheのそれぞれを単独（濃度 10 nM）
または抗体結合体 1:15 （133 ng）として試験した。評
価間隔の長さは 400ミリ秒または 1.2秒とした。これら
の試験の結果を表１に要約する。
しなかったこと以外は実施例２に記載する不均一系試験
の電位プロフィルに基本的に対応する分析サイクルを使
用して、試験操作を実施した。したがって、電極表面に
微小粒子を捕捉することはしないで、気泡によって囲ま
れたマーカー分子を含有する溶液のセグメントを測定室
の電極のまわりに位置させた。その後、ルミネセンスを
測定した。最初の試験において、均一系試験で金属錯体
Rubpyおよび Rubapheのそれぞれを単独（濃度 10 nM）
または抗体結合体 1:15 （133 ng）として試験した。評
価間隔の長さは 400ミリ秒または 1.2秒とした。これら
の試験の結果を表１に要約する。
【００３５】
【００３６】均一系試験操作の場合、Rubpy に比較して
Rubapheを使用した時の方がシグナルの増加が見られ
た。特により長い評価間隔において、Rubpy よりも Rub
apheの結果の方が顕著に良好なシグナルとなった。
Rubapheを使用した時の方がシグナルの増加が見られ
た。特により長い評価間隔において、Rubpy よりも Rub
apheの結果の方が顕著に良好なシグナルとなった。
【００３７】分析用緩衝液中の遊離の錯体を使用した測
定結果を図１に示す。Rubpy の場合、数ミリ秒後にはす
でにシグナルのかなりの減少があるが、Rubaphe はシグ
ナルの全期間にわたって基本的に一定のシグナル経過を
有している。図２は抗体−金属錯体結合体を使用した測
定結果を示している。この場合も、Rubpyに比較した Ru
bapheの優位性が見られる。
定結果を図１に示す。Rubpy の場合、数ミリ秒後にはす
でにシグナルのかなりの減少があるが、Rubaphe はシグ
ナルの全期間にわたって基本的に一定のシグナル経過を
有している。図２は抗体−金属錯体結合体を使用した測
定結果を示している。この場合も、Rubpyに比較した Ru
bapheの優位性が見られる。
【００３８】実施例２： 微小粒子を使用した不均一系
試験操作 プロゲステロン 2G に関する不均一系競合試験を実施し
た。このために、ビオチン化モノクローナル抗プロゲス
テロン IgG抗体（60 ng/ml）85μlに Rubpyまたは Ruba
pheプロゲステロン結合体（20 ng/ml）75μlおよびスト
レプトアビジン被覆微小粒子 10 μl を添加した。プロ
ゲステロン−ルテニウム錯体結合体はDMF中のプロゲス
テロン-3-CMO-アミノジオキサオクタンに活性化金属錯
体（N-ヒドロキシスクシンイミドエステル）を連結させ
ることによって、 WO 96/03410と同様にして調製した。
このステップのための全インキュベート時間は 8.4分と
した。次に、試験するサンプル 30 μl を添加し、さら
に 8.4分インキュベートした。次に、ルミネセンス測定
を実施した。
試験操作 プロゲステロン 2G に関する不均一系競合試験を実施し
た。このために、ビオチン化モノクローナル抗プロゲス
テロン IgG抗体（60 ng/ml）85μlに Rubpyまたは Ruba
pheプロゲステロン結合体（20 ng/ml）75μlおよびスト
レプトアビジン被覆微小粒子 10 μl を添加した。プロ
ゲステロン−ルテニウム錯体結合体はDMF中のプロゲス
テロン-3-CMO-アミノジオキサオクタンに活性化金属錯
体（N-ヒドロキシスクシンイミドエステル）を連結させ
ることによって、 WO 96/03410と同様にして調製した。
このステップのための全インキュベート時間は 8.4分と
した。次に、試験するサンプル 30 μl を添加し、さら
に 8.4分インキュベートした。次に、ルミネセンス測定
を実施した。
【００３９】分析サイクルの経過を電位プロフィルを基
礎として図３に示す。そこに含まれる Cond1、Cond2 お
よび Cond3と命名したコンディショニングステップ、特
に還元部分を有する Cond2（Ag/AgCl 基準電極に対して
陰電位）は電極のコンディショニングおよび試験した金
属錯体による一定のシグナルにとって最大の重要性があ
る。Rubpy および Rubapheについての結果を表２に示
す。
礎として図３に示す。そこに含まれる Cond1、Cond2 お
よび Cond3と命名したコンディショニングステップ、特
に還元部分を有する Cond2（Ag/AgCl 基準電極に対して
陰電位）は電極のコンディショニングおよび試験した金
属錯体による一定のシグナルにとって最大の重要性があ
る。Rubpy および Rubapheについての結果を表２に示
す。
【００４０】 表２ 検量 プロゲステロン濃度 Rubaphe シグナル Rubpy シグナル [ng/ml] 検量１ 0 160893 257102 検量２ 2 116140 193590 検量３ 5 78362 142102 検量４ 10 52570 101752 検量５ 20 43306 89240 検量６ 70 33806 67518 検量７ 100 31446 62772 プロゲステロン不在下では Rubpyの結果は最大シグナル
が 60％高い。しかし、Rubpy の場合の最小シグナル
（プロゲステロン 100 ng/ml）は Rubapheよりも約 200
％と高いので、この結果として、Rubaphe の方が少なく
とも 20％良好なシグナル動力学（最小シグナル強度に
対する最大シグナル強度の割合）となる。
が 60％高い。しかし、Rubpy の場合の最小シグナル
（プロゲステロン 100 ng/ml）は Rubapheよりも約 200
％と高いので、この結果として、Rubaphe の方が少なく
とも 20％良好なシグナル動力学（最小シグナル強度に
対する最大シグナル強度の割合）となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】遊離の Rubpyおよび Rubaphe錯体を使用したル
ミネセンス測定の比較を示す図である。
ミネセンス測定の比較を示す図である。
【図２】Rubpy-および Rubaphe- 抗体結合体を使用した
ルミネセンス測定の比較を示す図である。
ルミネセンス測定の比較を示す図である。
【図３】１回の分析サイクルでの電位曲線の例を示す図
である。
である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ハンス−ペーター ジョセル ドイツ連邦共和国 ディー−82362ヴァイ ルハイム，プララテンヴェク ７
Claims (10)
- 【請求項１】 以下のステップを含む電気化学ルミネセ
ンス測定による、サンプル中のアナライトの検出方法： （ａ）測定用電極を含む電気化学ルミネセンス装置を準
備し、（ｂ）電気化学ルミネセンス補助基質を含有する
コンディショニング液を電極に接触させ、（ｃ）電極上
および／またはその境界領域に活性化された電気化学ル
ミネセンス補助基質の分子を含有する層を形成させるよ
うに、電極の条件を調節し、（ｄ）電気化学ルミネセン
スマーカー基として１以上の電荷担体および／または１
以上の親水性基を含有する金属錯体と電気化学ルミネセ
ンス補助基質を含むサンプルを電極に接触させ、（ｅ）
電極に電気化学ルミネセンス反応を進行させることが可
能な電位を適用して、その電気化学ルミネセンスを測定
し、そして、（ｆ）測定したルミネセンスをサンプル中
のアナライトの存在または量に相関させる。 - 【請求項２】 マーカー基として以下の一般式（Ｉ）の
構造を含有する金属錯体を使用する、請求項１に記載の
方法： ［Ｍ(Ｌ1Ｌ2Ｌ3)］n−Ｙm （Ｉ） 式中、 −Ｍは希土類または遷移金属カチオンから選択される２
価または３価金属カチオンであり、 −Ｌ1、Ｌ2およびＬ3 は２以上の窒素含有複素環を含有
する同一または異種のリガンドを表し、そしてＬ1、Ｌ2
およびＬ3 はその窒素原子を介して金属カチオンに結合
しており、 −Ｙはリガンドに結合したリンカーを表し、 −ｍは整数１〜10であり、 −ｎは整数１〜６であり、 −錯体中に１以上の親水性基および／または電荷担体が
存在する。 - 【請求項３】 親水性基および／または電荷担体がリン
カーまたはリガンドＬ1、Ｌ2およびＬ3 の別の置換基に
結合している、請求項２に記載の方法。 - 【請求項４】 リン酸、ホスホン酸、スルホン酸および
カルボン酸基から選択される１以上の陰電荷担体を含有
する錯体を使用する、請求項１〜３のいずれか１項に記
載の方法。 - 【請求項５】 Ｃ2〜Ｃ3アルキレンオキシ単位、Ｃ2〜
Ｃ3アルキレンチオ単位およびポリヒドロキシ単位から
選択される１以上の親水性基を含有する錯体を使用す
る、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項６】 電気化学ルミネセンス補助基質として、
アルキル残基がそれぞれ互いに独立して１〜４個のＣ原
子を含有するトリアルキルアミンを使用する、請求項１
〜５のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項７】 ステップ（ｃ）において（Ag/AgCl 基準
電極に対して）−0.3〜−1.2 Vの電位を適用する、請求
項１〜６のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項８】 ステップ（ｅ）において、全測定期間に
わたってルミネセンス反応を維持するのに十分な電位を
適用する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項９】 ステップ（ｅ）において、（Ag/AgCl 基
準電極に対して）＋1.2 V 以上の陽極電位を適用する、
請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項10】 電気化学ルミネセンスマーカー基として
１以上の電荷担体および／または１以上の親水性基を含
有する金属錯体を使用し、測定を 0.5秒間以上実施す
る、電気化学ルミネセンスによるサンプル中のアナライ
トの検出方法。
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