FI111415B

FI111415B - Elektrokemiluminenssimenetelmä

Info

Publication number: FI111415B
Application number: FI955252A
Authority: FI
Inventors: Guenter Mueller; Ulrich Neumann; Ursula Giesen; Nicholas Hoyle; Volker Klemt
Original assignee: Roche Diagnostics Gmbh
Priority date: 1993-05-03
Filing date: 1995-11-02
Publication date: 2003-07-15
Also published as: CA2161666C; CN1089899C; JPH08508570A; EP0697107B1; AU6722394A; CA2161704C; JP3135921B2; NO954387D0; AU6794294A; WO1994025853A1; AU674079B2; RU2116647C1; IL109481A0; EP0697106B1; JP2735688B2; NO954386D0; AU678018B2; CA2161704A1; US5723342A; NO954386L

Description

111415

Elektrokemiluminenssimenetelmä - Elektrokemiluminescensför-farande 5 Keksinnön kohteena ovat menetelmät elektrokemiluminenssi- ilmiöiden mittaamiseksi, menetelmät analyytin osoittamiseksi sellaisten menetelmien avulla, reagenssiliuokset, joita voidaan käyttää näissä menetelmissä, ja menetelmän suoritukseen erityisen sopiva laite.

10

Menetelmät elektrokemiluminenssi-ilmiöiden mittaamiseksi on tunnettu muutamien vuosien ajan. Sellaisissa menetelmissä hyödynnetään erityisten metallikompleksien kykyä päästä hapettamalla tilaan, josta ne palautuvat takaisin perustilaan 15 elektromagneettista säteilyä luovuttaen. Sellaiset menetelmät ja tähän sopivat metallkompleksit on kuvattu esimerkiksi julkaisussa WO 86/02734.

Tätä teknologiaa jalostettiin yhä pitemmälle. Julkaisussa WO 20 90/05296 testikoostumukseen lisätään amiinia, edullisesti tripropyyliamiinia, joka on hapetetussa muodossa voimakasta pelkistintä. Sähkökemiallinen reaktio tapahtuu elektrolyytissä, jossa elektrokemiluminenssi(ECL) -ryhmä, ts. elektromagneettista säteilyä luovuttamaan kykeneväksi tehty metal-25 likompleksi, ja amiini voivat hapettua. Sopivana elektrolyyttinä vesiliuoksessa kuvataan fosfaattipuskuri pH-arvossa 6-9, edullisesti 7-7,5.

Julkaisussa WO 90/05302 tähän testikoostumukseen lisätään 30 elektromagneettisen säteilyn lisäämiseksi detergenttiä Triton X-100 tai Triton N-401. Julkaisussa WO 90/05411 kuvataan ECLin mittaamiseen tarkoitetun laitteen parannus.

Edelleen onnistui perustaa analyyttien osoitukseen tarkoi-35 tettu teknologia, jossa analyytteihin, analyyttianalogeihin tai analyyttispesifisiin aineisiin liitettiin elektrokemilu-minenssimerkkejä. Elektrokemiluminenssia käytettiin läsnä 2 111415 olevan analyytin määrän määritykseen. Erityisesti kuvattiin immunomääritykset, joissa tavalliset merkit on korvattu elektrokemiluminenssimerkeillä.

5 Muita teknologian parannuksia ja käyttöjä kuvataan julkaisuissa WO 87/06706, WO 89/04392, WO 89/10552, WO 89/10551, W0 90/05301 ja WO 90/11511. Mainittujen julkaisujen ilmoituksia pidetään jatkossa selvinä.

10 Tämän keksinnön tehtävänä oli parantaa ennestään tunnettuja menetelmiä, erityisesti herkkyyden suhteen analyytinosoituk-silla, jotka ovat mahdollisia elektrokemiluminenssiteknolo-gialla.

15 Keksinnön kohteena on menetelmä elektrokemiallisten ilmiöiden mittaamiseksi liuoksessa tai liuokseen rajoittuvassa kiinteässä faasissa, jolloin liuos sisältää detergenttiä, joka on rasva-alkoholietoksylaatteja, Plantaren'ia ja/tai oktyyliglukosidia.

20

Edelleen keksinnön kohteena on menetelmä analyytin osoittamiseksi tämän menetelmän avulla samoin kuin sopivat reagens-sit mainitun menetelmän suorittamiseksi.

25 Keksinnön kohteessa on kyseessä oppi, joka perustuu edellä mainittuun tekniikan tasoon. Elektrokemiluminenssimenetelmän yleiset peruslait on kuvattu tässä tekniikan tasossa yksityiskohtaisesti. Elektrokemiluminenssin mittausten suoritukseen tarkoitetut laitteet sisältävät mittausyksikön, jossa 30 on astia reagenssiliuosta varten, vähintään kaksi elektrodia (yksi työ- ja yksi vastaelektrodi), jotka ovat mittauksen aikana kontaktissa reagenssiliuoksen kanssa, ja detektorin elektrokemiluminenssin tuottaman valon mittaamiseksi. Yleensä liuos alistetaan tässä menetelmässä ensin lähtöjännityk- 35 selle (esipolarisoinnille). Mutta seuraavaksi tämä jännite kohotetaan liuoksen sisältämän aineen, esimerkiksi amiinin, hapetus-pelkistys -potentiaalin yläpuolelle. Tämän kautta 3 111415 hapettuneella aineella viritetään kemiluminenssiin kykenevää materiaalia, esimerkiksi määrättyä ruteniumkompleksia valon lähettämiseksi. Detektorin määrätyn ajan sisällä vastaan ottama valo on mitta elektrokemiluminenssimateriaalin määrän 5 läsnäolosta. Mikäli elektrokemiluminenssimateriaalin kohdalla on kyseessä merkki analyyttiä, analyyttianalogia tai ana-lyyttispesifistä ainetta varten, esimerkiksi immunomäärityk-sessä, on vastaanotettu valo analyytin läsnäolon mitta.

10 On osoittautunut, ettei julkaisusta WO 90/05302 tunnettu ja tähän asti tavallisesti lisätty detergentti Triton X-100, jota on käytännössä käytetty enimmäkseen yhdistelmänä deter-gentin Tween 20 kanssa, ei ole optimaalista. Toisaalta Triton X-100 on huonosti hajoavaa, eikä siten ympäristöystäväl-15 lista. Toisaalta osoitettiin yllättäen, että aivan määrätyt toiset detergentit johtavat Triton X-100:aan verrattuna ECL-menetelmän parannukseen. Näillä erityisillä detergenteillä saavutetaan kohonnut signaalisaanto, parantunut signaali/ko-hina -suhde ja täten osoitusmenetelmän parantunut herkkyys 20 ja alemman osoitusrajan aleneminen samoin kuin parantunut tarkkuus.

Sopiviksi ovat osoittautuneet detergentit, jotka ovat rasva-alkoholietoksylaatteja, joina ymmärretään esimerkiksi Poli-25 docanol (dodekyylipoly-(etyleeniglykolieetteri)n), C14-E09 (poly(etyleeniglykolieetteri)n) , Genapol (isotridekyylipo-ly(etyleeniglykolieetteri)N), C8-E09 (oktyylialkoholipoly(e-tyleeniglykolieetteri)n), Plantaren® (alkyylipolyglukosidi), ja/tai oktyyliglukosidi (oktyyli-E-D-glukopyranosidi). De-30 tergenttejä käytetään konsentraatioissa 0,001 - 1,0 %. Kullekin detergentille parhaiten sopivat konsentraatio voidaan saada selville helposti. Konsentraatiot 0,1 - 0,5 % ovat osoittautuneet sopivimmiksi.

35 Säilöntää varten testikoostumukseen on tähän asti lisätty natriumatsidia tavallisesti konsentraatiossa 5-10 mM. On osoittautunut, että tämä ympäristölle haitallinen reagenssi 4 111415 voidaan korvata Bioban'illa tai Oxaban'illa, jotka ovat paljon ympäristöystävällisempiä kuin atsidi.

Yllättävällä tavalla on osoittautunut, että näillä säilöntä-5 aineilla on edelleen positiivinen vaikutus ECL-menetelmään. Atsidiin verrattuna savaitaan mittaussignaalin kohoaminen. Oxaban'ia ja Bioban'ia käytetään tällöin konsentraatioissa 0,01 - 1 %, edullisesti 0,1 - 0,5 %.

10 Keksinnön mukainen menetelmä elektrokemiallisten ilmiöiden mittaamiseksi liuoksessa tai liuokseen rajoittuvassa kiinteässä faasissa voidaan suorittaa lämpötiloissa, jotka ovat liuoksen jäätymispistettä korkeampia, mutta alle 40 °C.

15 Herkkyyden edelleen paraneminen voidaan saavuttaa siten, että mittausyksikkö alistetaan jännitteelle, jonka kulku on kuitenkin ajan suhteen suorakulmaista. Tämä merkitsee, että lähtöjännityksestä lähtien suoritetaan jännitteen välitön (enintään noin 0,4 s sisällä) kohotus loppujännitteeseen.

20 Tämä jännite pidetään virityksen ajan oleellisen vakiona.

Tämän ajan kuluttua jännite palautetaan välittömästi jälleen järjestelmän hapetus-pelkistys -potentiaalia alhaisempaan jännitteeseen. Tällä toimemnpiteellä saadaan lisäksi tulokseksi dynaamisen mittausalueen laajeneminen, ts. alueen, 25 jonka sisäpuolella vahvistetun immunomäärityksen analyytti-konsentraatiot voidaan mitata. Alhaisten lämpötilojen tapaukselle on suolan lisääminen edullista.

On osoittautunut edulliseksi rajoittaa työelektrodille ase-30 tettu suorakulmainen loppujännite (Ag/AgCl;ään verrattuna) maksimiarvoon, joka on hapettuvan aineen hapetus-pelkistys -potentiaalin ja 2,2 V:n välillä. Erityisen edullinen on jännite välillä 1,2 - 2,2 V. Erityisen edullisia ovat jännitteet 1,4 V. Nämä arvot pätevät platina- tai kulta-elekt-35 rodiparin käytölle.

5 111415

Mikäli asetetaan tähän asti tavallinen ramppijännite, esimerkiksi kolmiojännitys, rajoitetaan loppujännite (Ag/AgCli-ään verrattuna) maksimiarvooni,0 V.

5 Yllättävällä tavalla voitiin saavuttaa signaalin kohoaminen myös siten, että lähtöjännite ennen elektrokemiluminenssin virittämistä oli työelektrodilla välillä + 400 ja - 400 mV, Ag/AgCl-elektrodiin verrattuna. Erityisen edullinen on arvo välillä + 0 ja + 200 mV. Myös tässä pätevät arvot platina-10 tai kultaelektrodiparin käytölle. Potentiaalit voidaan laskea helposti muiden elektrodimateriaalien käytölle.

Samoin voidaan saavuttaa signaalin kohoaminen säätämällä pH-arvon välillä 6,5 - 9,0, edullisesti välillä 6,5 - 7,5, eri-15 tyisen edullisesti 6,8. Tämä tapahtuu tarkoituksenmukaisesti käyttämällä alueelle sopivaa pH-puskuria. Lisäksi liuokseen voi sisältyä vielä yhtä tai useaa alkali- tai maa-alkalime-tallihalogenidia konsentraatiossa 0,05 - 0,5 mol/1. Edullisesti käytetään natriumkloridia.

20

Edellä mainitut toimenpiteet johtavat jo yksittäin tunnetun menetelmän huomattaviin parannuksiin. Tämän lisäksi voidaan kuitenkin analyyttien osoitusten herkkyyttä tai/ja dynaamista mittausaluetta parantaa toimenpiteiden yhdistelmällä 25 erityisen suuressa laajuudessa.

Analyyttien osoitusherkkyyden kohoaminen, esimerkiksi immu-nomäärityksissä, kuten kerrostus- (Sandwich-) tai kompeti-tiivisella menetelmällä, sallii menetelmän tai käytettyjen 30 laitteiden edelleen yksinkertaistamiset. On esimerkiksi mahdollista käyttää detektorina valodiodia, yksinkertaistaa järjestelmäkalibrointia, lyhyemmän mittausajan johdosta kohonneella signaalilla kohottaa aikayksikössä suoritettujen testien lukumäärää, tai pienentää näytetilavuuksia.

Samoin keksinnön kohteena on elektrokemiallisten ilmiöiden mittaamiseen tarkoitettu reagenssiliuos ja erityisesti ana- 35 6 111415 lyyttien osoittamiseksi, joka liuos sisältää sähkökemiani -sesti hapettuvaa amiinia, joka on hapetetussa tilassa voimakasta pelkistintä, ja joka sisältää detergenttiä, joka on rasva-alkoholietoksylaatteja, Plantaren®'ää ja/tai oktyyli-5 glukosidia. Lisäksi voi vielä sisältyä aikaiikloridia kon-sentraatiossa 0,1 - 0,5 mol/1 ja/tai liuoksen pH-arvo voi olla välillä 6,8 - 8,0. Edelleen voi sisältyä vielä tavallisia lisäaineita, kuten esimerkiksi puskurlaineita, stabilointiaineita ja säilöntäaineita.

10

Reagenssiliuos säilötään edullisesti Bioban'illa tai Oxa-ban'illa.

Eräs laite osoitusten suorittamiseksi elektrokemiluminenssin 15 avulla on kuvattu yksityiskohtaisesti julkaisun WO 90/05302 esimerkissä 1. Tämän lisäksi laite voi sisältää ainetta mittausyksikön tai/ja nestesäiliön jäähdyttämiseksi lämpötiloihin välillä 0 - 25 °C, mikäli menetelmä on määrä suorittaa näissä alhaisissa lämpötiloissa. Mittausyksiköksi ymmärre-20 tään solu, jossa elektroluminenssi suoritetaan. Nesteastiak-si voidaan ymmärtää säiliöastia tai lisäysjohto, esimerkiksi letku, mittauksen aikana mittausyksikössä olevaa reagenssi-liuosta varten.

25 Samoin keksinnön kohteena on menetelmä analyytin osoittamiseksi elektrokemiluminenssimaerkinnällä, jolloin elektroke-miluminenssi-ilmiöiden mittaamiseen käytetään jotain edellä mainituista menetelmistä.

30 Seuraavat esimerkit kuvaavat keksintöä lähemmin:

Esimerkki 1

Keksinnön mukaisesti käytettyjen detergenttien vaikutus mitattiin koesarjassa. Jotta detergenttien vaikutus signaa-35 linvalmistukseen voitaisiin määrittää mahdollisimman riippumattomasti yksittäisistä testiparametreistä, ts. määritettävistä analyyteistä, käytettiin streptavidiinilla päällystet- 7 111415 tyjä magneettipartikkeleita, joille oli kiinnitetty biotiny-loitua ja samanaikaisesti rutenyloitua vasta-ainetta (HSAP: "hot-Streptavidin-Partikel").

5 Mittaamiseen käytettiin laitetta, jollainen kuvataan julkaisun W0 90/05302 esimerkissä 1, ja joka sisälsi lisäksi mittaussolussa kestomagneetin (Origen 1.0 yhtiöstä IGEN, Rockville, USA tai Magnalyser). Tämä instrumentti sisältää edelleen fotomonistimen, potentiostaatin, sähkökemiallisen 10 läpivirtaussolun, nesteensiirtovälineen ja näyteroottorin 50 putkea varten.

Osoitusta varten yhdistettiin yhdessä putkessa: 15 HSAP (lyofilisoitua HSAP:tä liuotettiin Tris/Polidocanol-puskuriin (100 mM; 0,1 %) pH 9,0 niin, että oli työliuos, jossa oli 600 Ag/ml) 50 μΐ PB-puskuri (50 mM KH2P04; 100 mM NaCl; 0,1 % RSA; pH 7,0) 20 200 μΐ

Reagenssiliuos (200 mM KH2P04-puskuria; 100 mM TPA; pH 7,5; kulloinkin testattua reagenssia) 25 Tämä seos pipetoitiin mittausputkeen, ja siirrettiin seuraa-vaksi mittaussoluun. HSAP't pestiin puskurilla (AB), ja mitataan signaalisaanto tässä puskurissa.

Käytetty vasta-aine biotinyloitiin biotiini-DDS:llä (bio-30 tinyyliamino-3,6-dioksaoktanoyyli-aminokarbonyyli-heptaani-happo-N-hydroksisukkinimidiesteri). (Tris)(2,2'-bipyridyy-li)-ruteniumkloridiheksahydraatti kiinnitettiin vasta-aineisiin DSS:llä (disukkinyylisuberaatti).

35 Streptavidiinipäällysteiset magneettipartikkelit saatiin yhtiöstä Deutsche Dynal GmbH, Saksa (Dynabeads M-280 Strep-tavidin).

8 111415

Mittauksessa käytetyn puskurin (AB) koostumus oli seuraava:

KH2P04· 2H20 0,2 M

KOH 0,076 M

5 NaCl 0,05 mM

TPA (tripropyyliamiini) 0,1 M

Detergentti taulukossa ilmoitetut konsentraatiot

Oxaban/Bioban 0,1/0,3 % 10 pH 7,5

Kontrolleina käytettiin tähän asti tavallisia detergenttejä Tween 20 ja Triton X-100 kulloinkin konsentraatiossa 0,05 %. Vertailun vuoksi pidettiin taulukossa 1 tällä detergentillä 15 saatua signaalisaantoa 100:na. Edelleen eräänä mittausarvona määritettiin epäspesifinen signaalisaanto puskurissa (AB), ja selvitettiin täten HSAP/AB-signaalisaantosuhde. Tämä HSAP:n kanssa ja ilman saadun signaalisaannon välinen suhde on hyvä todiste testin herkkyydestä. Taulukon 1 tuloksista 20 on selvästi tunnistettavissa, että keksinnön mukaiset deter-gentit ovat sopivimmat.

Polidocanol'illa ja CS-E0G:llä nähdään paras vaikutus HSAP/-AB-suhteeseen. Muut detergentit aiheuttavat Tween/Triton X-25 100:aan verrattuna signaalisaannon huononemisen.

Taulukko 1:

ECL-määrityspuskuria varten testatut detergentit Elektrodi: BIPt3 30 PMT 700 V

Detergenttiä puskurissa HSAP [%] HSAP/AB [%] 0,05 % Tween 100 100 0,05 % Triton 0,1 % Polidocanol 295,1 414,5 35 0,4 % C14-E09 289,2 292,8 9 111415 0,2 % C14-E09 346,2 308,2 0,1 % C14-E09 382 343,4 0,05 % C14-E09 402,5 342,4 0,4 % Genapol 360,1 117,8 5 0,2 % Genapol 377,2 129,6 0,1 % Genapol 386,5 126 0,05 % Genapol 361,5 140,1 0,4 % C8-E09 481,4 530,3 0,2 % C8-E09 402 394,7 10 0,1 % Plantaren 219,1 200,7 0,05 % Plantaren 270,6 276,3 0,025 % Plantaren 295,3 292,1 0,2 % oktyyliglukosidia 286,8 390,8 15 Taulukko 1 jatkoa ei-käyttökelpoiset detergentit 0,2 % Tween 20 106,9 176,3 0,1 % Tween 20 114,9 184,5 20 0,05 % Tween 20 124,8 213,2 0,2 % Triton X-100 62,6 68,8 0,1 % Triton X-100 83 154,3 0,05 % Triton X-100 115,6 195,4 0,2 % C16-E09 17,3 36,8 25 0,05 % C16-E09 50 98 0,2 % dodekyyli-maltosidi 17,7 50 10 111415 0,1 % dodekyyli-maltosidi 46,9 112,5 0,2 % SDS 4,1 5,6 0,1 % SDS 22,9 32,9 0,2 % Ralufon 3-14 27,3 29 5 0,1 % Ralufon 3-14 27,8 31,3 Käytettyjen detergenttien merkintä C8-E09: oktyylialkoholipoly(etyleeniglykolieet- teri)n 10 C14-E09: poly(etyleeniglykolieetteri)„ C16-E09: setyylipoly(etyleeniglykolieetteri)n dodekyylimaltosidi: dodekyyli-B-D-glukopyranosyyli(l->4)a- D-glukopyranosidi

Genapol: isotridekyylipoly(etyleeniglykolieette- 15 ri)„ oktyyliglukosidi: oktyyli-B-D-glukopyranosidi

Plantarens alkyylipolyglukosidi (C14-C16)

Ralufon 3-14: n-tetradekyyli-n,n-dimetyyli-3-amino-l- propaanisulfonaatti 20 SDS: natriumlauryylisulfaatti

Polidocanol: dodekyylipoly(etyleeniglykolieetteri)n

Triton X-100: oktyylifenolipoly(etyleeniglykolieette- ri ) n

Tween: poly (oksietyleeni) n-sorbitaani-mono- 25 lauraatti

Esimerkki 2

Parametreistä riippumattoman testin (HSAP) esimerkissä esitetään solulämpötilan vaikutus signaalin takaisinsaantiin ja 30 dynamiikkaan ramppijännityksen tapaukselle 28 - 35 °C:ssa mittaussolussa NaCl:stä riippuen.

Testi suoritettiin esimerkissä 1 esitetyllä tavalla. Purku-rin (AB) sijasta käytettiin puskuria BMG 2, jolla oli seu-35 raava koostumus: 11 111415

H3P04 0,2 M

Polidocanol 0,1 %

Oxaban 0,1 %

Tripropyyliamiini 0,16 M 5 KOH 0,12 M

pH 6,8

NaCl taulukossa ilmoitettu konsentraatio

Tulokset esitetään taulukossa 2. Lämpötilaa suolakonsentraa-10 tiota kohotettaessa kohoavat ECL-signaalit, jotka saatiin puskurilla (BMG2) yksinään ja HSAPillä. Suhteet HSAP/AB, HSAP/FC ja FC/AB ovat lähes riippumattomia lämpötilasta, sitä vastoin suolakonsentraatiosta riippuvia.

15 Taulukko 2 a) ECL-signaalin lämpötila/suola-riippuvuus Lämpötila °C 28 30 35

Suolakonsentraatio NaCl 0 % NaCl 0 % NaCl 0 % 20 BMG 2 2479 2111 3165 FC 4378 3426 6856 HSAP 3160000 2550000 3610000 HSAP/BMG2 1257 1208 1141 HSAP/FC 722 744 626 25 FC/BMG 2 1,77 1,62 2,17 Lämpötila °C 28 30 35 12 111415

Suolakonsentraatio NaCl 0,2 % NaCl 0,2 % NaCl 0,2 % BMG 2 1963 2169 2930 FC 5072 4281 4137 5 HSAP 3940000 4030000 4450000 HSAP/BMG2 2007 1858 1519 HSAP / FC 777 941 1076 FC/BMG 2 2,58 1,97 1,41 10 Lämpötila °C 28 30 35

Suolakonsentraatio NaCl 0,9 % NaCl 0,9 % NaCl 0,9 % BMG 2 2208 2367 3610 FC 5280 4954 7487 15 HSAP 5130000 5940000 6940000 HSAP/BMG2 2323 2510 1927 HSAP/FC 972 1199 927 FC/BMG 2 2,39 2,09 2,06 20 Lämpötila °C 28 30 35 13 111415

Suolakonsentraatio NaCl 1,8 % NaCl 1,8 % NaCl 1,8 % BMG 2 2691 2970 4453 5 FC 5805 6129 6507 HSAP 4200000 4750000 5830000 HSAP/BMG2 1561 1599 1309 HSAP/FC 724 775 896 FC/BMG 2 2,16 2,06 1,46 10 -- b) Tulkinta yksikössä %, 28 °C:een ja 0 %:n NaCltää perusteella Lämpötila °C 28 30 35 15 Suolakonsentraatio NaCl 0 % NaCl 0 % NaCl 0 % BMG 2 100,0 85,2 127,7 FC 100,0 78,3 156,6 HSAP 100,0 80,7 114,2 HSAP/BMG2 100,0 94,8 89,5 20 HSAP/FC 100,0 103,1 72,9 FC/BMG 2 100,0 91,9 122,7 Lämpötila °C 28 30 35 14 111415

Suolakonsentraatio NaCl 0,2 % NaCl 0,2 % NaCl 0,2 % BMG 2 79,2 87,5 118,2 5 FC 115,9 97,8 94,5 HSAP 124,7 127,5 140,8 HSAP/BMG2 157,5 145,8 119,1 HSAP/FC 107,6 130,4 149,0 FC/BMG 2 146,3 111,8 80,0 10 Lämpötila °C 28 30 35

Suolakonsentraatio NaCl 0,9 % NaCl 0,9 % NaCl 0,9 % 15 BMG 2 89,1 95,5 145,3 FC 120,6 113,2 171,0 HSAP 162,3 188,0 219,6 HSAP/BMG2 182,3 196,9 151,2 HSAP/FC 134,6 166,1 128,4 20 FC/BMG 2 135,4 118,5 117,7 Lämpötila °C 28 30 35 15 111415

Suolakonsentraatio NaCl 1,8 % NaCl 1,8 % NaCl 1,8 % BMG 2 108,6 119,6 179,6 5 FC 132,6 140,0 148,6 HSAP 132,9 150,3 184,5 HSAP/BMG2 122,4 125,5 102,7 HSAP/FC 100,2 107,4 124,1 FC/BMG 2 122,1 116,9 82,7 10 --L- BMG 2; Kontrolli, jossa on näytepuskuria BMG 2 FC: Kontrolli, jossa on vapaata konjugaattia (bio- tinyloitua ja rutenyloitua vasta-ainetta) HSAP: ”hot-Streptavidin"-partikkeli 15 Lämpötilan alentaminen alle 20 °C:seen vaatii alkalimetalli-kloridin lisäystä ja pH-arvoa edullisesti 7,25 - 7,75.

Esimerkki 3 20 T3:n osoitus

Immunomääritysesimerkissä trijodityroniinin (T3) osoittamiseksi verrataan keksinnön mukaista testikoostumusta BMG 1 tekniikan tason testikoostumukseen (BMG 0): 25 Reagenssiliuoksilla on seuraava koostumus:

Reagenssi BMG 0 BMG 1 111415 16

KH2P04· 2H20 0,2 M 0,2 M

H3P04 5 Detergentti Triton X-100 Polidocanol 0,005 % 0,1 %

Tween 0,05 % Säilöntäaine NaN3 7,8 mM Oxaban 0,1 %

10 Tripropyyliamiini 0,1 M 0,1 M

KOH 0,076 M 0,076 M

pH 7,5 7,5 Käytettiin seuraavia muita reagensseja: 15

HEPES-puskuri 7,0: HEPES-Na pH 7,0 0,1 M

0,06 % ANS

0,1 % naudan IgG

0,5 % Byco 20 50 mM NaCl PAK-RU (rutenyloitu polyklonaalinen vasta-aine) (Tris)(2, 2'-bipyridyyli)ruteniumkloridiheksahydraatti, 25 joka on sidottu DDSillä T3:n vastaiseen poly- klonaaliseen vasta-aineeseen HEPES-puskurissa 7,0 100 ng/ml PH-BI (T3-polyhapteeni biotinyloitu) 30 PH PAK <->K-IgG(DE)BOC-T3-lBi HEPES-puskurissa 7,0 600 ng/ml 17 111415 Näytteet: Standardi a - e T3-konsentraatio: a: 0,24 ng/ml b: 0,88 ng/ml c: 1,90 ng/ml 5 d: 3,05 ng/ml e: 6,65 ng/ml 3 ihmisseerumia 2 ihmisseerumia 500 mg:n/dl kanssa hemoglobiinia (Hb) ja ilman 10

Streptavidiinilla päällystetyt magneettipartikkelit:

Dynabeads M-280 Streptavidin (Deutsche Dynal GmbH, Saksa) HEPES-puskurissa 7,0 600 pg/ml 15

Osoitusta varten yhdistetään: PAK-RU 50 pl

Dynabeads M-280 50 pl 20 Näyte 30 pl PH-BI 50 pl BMG 0 tai 1 500 pl Tätä seosta inkuboitiin 16 min ajan 28 °C:ssa, siirrettiin 25 seuraavaksi 28 ®C:seen temperoituun mittaussoluun, ja partikkelit pestiin BMG 0:11a tai l:llä kulloisenkin testierän mukaan, ja mitattiin siinä. Käytettiin kolmioramppijännitystä. Mittausjännite oli 0,565 V, ja PMT oli 720 mV.

30 Tulokset esitetään taulukossa 3. Osoittautuu, että hemoglo-biinihäiriö, joka on havaittavissa BMG 0:ssa, vältetään BMG l:ssä. Alempaan osoitusrajaan ei ole vaikutusta.

18 BMG 0 BMG 1 111415

Taulukko 3: UNG (2s) 0,3 ng/ml 0,3 ng/ml

Ihmisen seerumi ilman Hb:tä 100% 100% 5 Ihmisen seerumi Hb:n kanssa 307 % 106 % UNG (2s) = Alempi osoitusraja

Esimerkki 4 10 HBsAg:n osoitus

Testattiin keksinnön mukaista testikoostumusta BMG 1 verrattuna BMG 0:aan kerrostusimmunomääritysesimerkissä HBsAg;n osoittamiseksi. BMG 0:11a ja l:llä oli esimerkissä 3 esitetyt koostumukset.

15 Käytettiin seuraavia reagensseja:

HEPES-puskuri pH 7,5: HEPES-Na 0,05 M

Naudan seerumialbumiini 1 % 20 Genapol X 080 0,1 %

Nauta(R)-IgG 0,1 %

Hiiri-IgM 10 pg/ml CAM (Klooriasetamidi) 0,1 % MIT (Metyyli-isotiatsoloni) 0,01 % 25 AK-Bi (Vasta-aine biotiini-DDS:llä biotinyloitu) MAK<HBs>M5Ai0-IgG-Bi (DDS) 1:7,5 HEPES-puskurissa pH 7,5 300 ng/ml 30 TAG (rutenyloitu vasta-aine)

MAK<HBs>M5Al0-F(ab')2-BPRU

(Tris)(2,2'-bipyridyyli)ruteniumkloridiheksahyd-raatti, joka on sidottu DSS:llä HBsAG (F(ab')-fragmentin) vastaiseen monoklonaaliseen vasta-aineeseen 35 HEPES-puskurissa pH 7,5 500 ng/ml 19 111415 Näytteet: Standardi a - h HBsAg-konsentraatio a: 0 E/ml b: 0,22 E/ml c: 0,52 E/ml 5 d: 1,08 E/ml e: 2,30 E/ml f: 4,50 E/ml g: 10,30 E/ml h: 22,20 E/ml 10

Streptavidiinilla päällystetyt magneettipartikkelit:

Dynabeads M-280 Streptavidin HEPES-puskurissa pH 7,5 600 ^g/ml 15 Osoitusta varten yhdistettiin:

Dynabeads M-280 50 μΐ AK-Bi 50 /il TAG 40 μΐ 20 Näyte 50 μΐ HEPES-puskuri pH 7,5 20 μΐ BMG 0 tai 1 150 μΐ Tätä seosta inkuboitiin 16 min ajan 28 °C:ssa, siirrettiin 25 seuraavaksi 28 °C:seen temperoituun mittaussoluun, ja partikkelit pestiin BMG 0:11a tai l;llä, ja mitattiin siinä.

Tulokset esitetään taulukossa 4. Alempaa osoitusrajaa voitiin parantaa selvästi BMG l:tä käyttämällä. Samoin VK aleni 30 BMG 0:aan verrattuna. Standardinäytteiden kalibrointikäyrän arvojen suhde h:a on kohonnut BMG l:llä, jonka kautta saavutetaan kalibrointikäyrän parempi differentiointi.

BMG 0 BMG 1

Taulukko 4: 20 111415 UNG [E/ml] 0,21 0,06

Standardi h/a 40 78 5 VK [%] 6,9 4,3 UNG = Alempi osoitusraja VK: = Vaihtelukerroin 10 Esimerkki 5 TSH:n osoitus

Kerrostusimmunomääritysesimerkissä TSH:n (kilpirauhasta stimuloivan hormonin) osoittamiseksi verrataan keksinnön mukaisia testikoostumuksia BMG 1 ja BMG 1 ilman Oxaban'ia 15 verrattuna tekniikan tason testikoostumukseen BMG 0. BMG 0:11a ja l:llä oli esimerkissä 3 kuvattu koostumus.

Kilpirauhasta stimuloiva hormoni (TSH) määritettiin kerros-tusimmunomäärityksellä. Suoritukseen voidaan tällöin käyttää 20 laitetta, kuten esimerkissä 1 kuvattua.

Osoitusta varten yhdistettiin:

Inkubointipuskuri 25 (joka sisältää 6,06 g/1 TrisHCl, 50 μΐ 1 g/1 klooriasetamidia, 0,1 g/1 metyyli-isotiatsolonia, pH 8,0, 50 g/1 naudan seerumialbumiinia, 10 g/1 R-IgG) 30 Streptavidiinilla päällystetyt mag-neettipartikkelit (Dynal, 2,8 pm) inkubointipuskurissa 600 pg/ml 40 μΐ 21 111415 DSS:llä (disukkinidyylisuberaatti) biotinyloitu TSH:n vastainen mono-klonaalinen vasta-aine (MAK) inkubointipuskurissa 3,0 μq/ml 40 μΐ 5 TAG: (Tris)(2,2'-bipyridyyli)rutenium-kloridiheksahydraatti, joka on sidottu DSS:llä TSH:n vastaiseen 10 monoklonaaliseen vasta-aineeseen inkubointipuskurissa 1,2 μq/ml 40 μΐ Näyteneste tai standardi 50 μΐ 15 Resuspensio (reagenssiliuoksen (BMGl) lisäys 100 μΐ Tätä seosta inkuboitiin 16 min ajan huoneenlämpötilassa (21 °C), ja siirrettiin seuraavaksi haluttuun mittauslämpötilaan säädettyyn mittaussoluun, immobilisoidut partikkelit pestiin 20 reagenssiliuoksella BMGl, ja mitattiin BMGl:ssä.

Näytteinä käytettiin standardeja a - e, joiden TSH-konsent-raatiot olivat a: 0 μϋ/ml b: 0,39 μϋ/ml 25 c: 3,54 μϋ/ml d: 12,4 μϋ/ml e: 44,3 μϋ/ml.

Tulokset esitetään taulukossa 5. BMG l:llä saavutetaan BMG 30 0:aan verrattuna parempi osoitusraja. Oxaban-säilöntäainetta lisäämällä alempi osoitusraja alenee edelleen. Samoin vaih-telukerroin paranee molemmissa esimerkeissä (BMG 1 +/- Oxaban) yksiselitteisesti.

Taulukko 5: 22 111415 BMG 0 BMG 1 BMG 1 ilman Oxaban'ia UNG (2s) [mlU/ml] 0,049 0,028 0,041 5 VK [%] 3,35 2,28 2,38

Lyhenteillä on esimerkissä 4 mainitut merkitykset.

Claims

111415

1. Menetelmä elektrokemiluminenssi-ilmiöiden mittaamiseksi liuoksessa tai liuokseen rajoittuvasta kiinteästä faasista saattamalla elektrokemiluminenssiin kykenevän komponentin 5 kontaktiin hapettuvan amiinin kanssa, ja alistamalla sähköiselle jännitteelle elektrokemiluminenssin indusoimiseksi, ja ilmaisemalla elektromagneettisen säteilyn, tunnettu siitä, että liuos sisältää detergenttiä, joka on rasva-alko-holietoksylaatteja,

10 Plantaren'ia ja/tai oktyyliglukosidia.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että rasva-alkoholietoksylaattina käytetään Polidocanol'ia, Cl4-E09:ää, Genapol'ia tai C8-E09:ää. 15

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että liuos sisältää yhtä tai useaa alkali-tai maa-alkalimetallihalogenidia.

4. Patenttivaatimuksen 1-3 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että liuoksen pH-arvo on välillä 6,5 ja 9,0.

5. Patenttivaatimuksen 1-4 mukainen menetelmä, t u n -25 n e t t u siitä, että elektrokemiluminenssi viritetään käyttämällä suorakulmio jännitettä enintään 2,2 V tai ramppi-jännitystä enintään 3,0 V.

6. Jonkin patenttivaatimuksista 1-5 mukainen menetelmä 30 analyytin osoittamiseksi, tunnettu siitä, että elektrokemiluminenssiin kykenevä komponentti on analyytin, analyyttianalogin tai analyyttispesifisen aineen merkki ja havaittava säteily on analyytin läsnäolon mitta.

7. Reagenssiliuos elektrokemiallisten ilmiöiden mittaamisek si, joka sisältää sähkökemiallisesti hapettuvaa amiinia, joka on hapettuneessa tilassa vahvaa pelkistintä, t u n - 111415 n e t t u siitä, että se sisältää detergenttiä, joka on rasva-alkoholietoksylaattia, Plantaren'ia ja/tai oktyyliglu-kosidia.

8. Patenttivaatimuksen 6 mukainen reagenssiliuos, tun nettu siitä, että se sisältää detergenttiä konsentraa-tiossa 0,001 - 1 %.

9. Patenttivaatimuksen 6 tai 7 mukainen reagenssiliuos, 10 tunnettu siitä, että se sisältää lisäksi alkaliklo-ridia konsentraatiossa 0,05 - 0,5 mol/1.

10. Patenttivaatimuksen 6-8 mukainen reagenssiliuos, tunnettu siitä, että sen pH-arvo on välillä 6,5 ja 15 9,0.