CN112362643A - 一种基于镧系元素化学发光法长效生长激素免疫定量检测试剂盒及其方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物制药领域，特别是涉及一种基于镧系元素化学发光法长效生长激素免疫定量检测试剂盒及其方法。该试剂盒包括：PEG抗体、微孔板，生物素标记的PEG‑rhGH抗体工作液，链霉亲和素标记的镧系元素铕工作液，增强解离液，PEG‑rhGH抗原标准品和质控品。本发明经过方法学评估，结果显示试剂盒灵敏度高、特异性好，准确度更高，为满足长效生长激素药物临床分析和评价提供了一种技术手段。
Description
技术领域
本发明涉及生物制药领域，特别是涉及一种基于镧系元素化学发光法长效生长激素免疫定量检测试剂盒及其方法。
背景技术
生长激素(Growth Hormone，GH)是一种垂体分泌源的蛋白质，参与调节生长发育过程中的代谢，其缺乏可以导致儿童生长发育迟缓，成人则为生长激素缺乏综合征，重组人生长激素(rhGH)可以纠正上述症状。由于rhGH的半衰期短，需要每日皮下注射，大大增加了治疗者的痛苦。为了延长半衰期，长效重组生长激素药物成为目前生物技术药物的研发主流；从技术上讲，聚乙二醇(PEG)化技术是目前最重要的蛋白融合技术。
尽管长效生长激素(PEG-rhGH)药物进展迅速，但尚无检测其完整分子的免疫定量方法，市售试剂盒通常采用夹心酶联免疫吸附法，包被抗体和检测抗体均为抗GH的抗体，不能检测药物中PEG是否在体内仍与药物连接，且血清中含有内源性GH，易与包被板上抗GH的抗体结合，无法特异检测PEG-rhGH，反应PEG-rhGH在体内的代谢情况。如何选择包被抗体和检测抗体，特异性识别PEG-rhGH完整分子是本方法的难点。因此，生物技术药物领域的科研工作者迫切建立灵敏、特异的PEG-rhGH药物的定量检测方法并探索其可行性，从而满足此类药物临床分析和评价需求。
解离增强镧系荧光免疫分析法(Dissociation-enhanced lanthanidefluorescence immunoassay，DEFLIA)是基于时间分辨荧光分析法(Time-resolvedfluorometry，TRF)建立的微量免疫分析技术，其具体原理为：利用荧光发射体的荧光寿命差别，以镧系元素铕(Eu3+)为示踪剂，标记抗原或抗体，解离出来的铕(Eu3+)与特制的扩增液形成新的螯合物时，其荧光明显增强且持久，在检测时，用延迟测量的方法信号较紫外法更高，且不易受血清基质干扰，大大提高检测灵敏度。
对于PEG-rhGH检测，如何制备一种利用镧系元素化学发光测定技术、且可检测完成PEG-rhGH分子的试剂盒，是目前长效生长激素检测亟待解决的问题之一。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种基于镧系元素化学发光法长效生长激素免疫定量检测试剂盒及其方法。该方法可检测PEG-rhGH完整分子，特异性强，灵敏度高。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种基于镧系元素化学发光法长效生长激素免疫定量检测试剂盒，该试剂盒包括：
PEG抗体、微孔板，生物素标记的PEG-rhGH抗体工作液，链霉亲和素标记的镧系元素铕工作液，增强解离液，PEG-rhGH抗原标准品和质控品。
本发明检测方法将抗PEG的抗体过量包被于微孔板上，向微孔板中加入待检的PEG-rhGH与其反应，再加入生物素标记的PEG-rhGH抗体，结合解离增强镧系荧光免疫分析法，检测荧光信号，信号的强度与样品中PEG-rhGH的量呈正相关。本发明利用解离增强镧系荧光免疫分析技术进行长效生长激素定量检测，检测时，捕获抗体为抗PEG的抗体，检测抗体为抗GH的抗体，可检测完整PEG-rhGH分子，同时避免了内源性GH干扰，可准确检测体内长效生长激素代谢情况，或者体外长效生长激素的稳定性。
作为优选，PEG-rhGH标准品为在0.1～150ng/mL范围内的一系列梯度浓度的标准品；
质控品为在2～100ng/mL范围内的高、中、低浓度的质控品。
在本发明具体实施例中，PEG-rhGH标准品为11个，浓度分别为120.000ng/mL、60.000ng/mL、30.000ng/mL、15.000ng/mL、7.500ng/mL、3.750ng/mL、1.875ng/mL、0.938ng/mL、0.469ng/mL、0.234ng/mL、0.117ng/mL；
质控品的浓度分别为96.000ng/mL、16.000ng/mL、2.344ng/mL。
作为优选，试剂盒还包括包被缓冲液、洗涤缓冲液、封闭液、样品稀释液中的一种或几种。
作为优选，包被缓冲液为0.05～0.10M、pH7.0～8.0的磷酸盐缓冲液；
洗涤缓冲液为含有0.4～0.6mM Tween-20的0.05～0.10M磷酸盐缓冲液；
封闭液为含有4％～6％脱脂奶粉的0.05～0.10M磷酸盐缓冲液。
在本发明具体实施例中，包被缓冲液为0.08M、pH7.4的磷酸盐缓冲液；
洗涤所用的洗涤缓冲液为含有0.5mM Tween-20的0.08M磷酸盐缓冲液；
封闭液为含有5％脱脂奶粉的0.08M磷酸盐缓冲液。
作为优选，样品稀释液为0.05～0.10M、pH7.0～8.0的磷酸盐缓冲液。
在本发明具体实施例中，样品稀释液为0.08M pH 7.4的磷酸盐缓冲液。
作为优选，生物素标记的PEG-rhGH抗体用检测抗体稀释液稀释后得到生物素标记的PEG-rhGH抗体工作液；检测抗体稀释液为含有0.8％～1.2％的牛血清白蛋白的0.05～0.10M磷酸盐缓冲液；
在本发明具体实施例中，检测抗体稀释液为含有1％的牛血清白蛋白的0.08M磷酸盐缓冲液。
作为优选，链霉亲和素标记的镧系元素铕用链霉亲和素标记的镧系元素铕稀释液稀释后得到链霉亲和素标记的镧系元素铕工作液；链霉亲和素标记的镧系元素铕稀释液为DELFIA assay buffer。
作为优选，生物素标记的PEG-rhGH抗体的稀释倍数为1:(1400～1800)；
链霉亲和素标记的镧系元素铕的稀释倍数为1:(800～1200)。
在本发明具体实施例中，生物素标记的PEG-rhGH抗体的稀释倍数为1:1600；
链霉亲和素标记的镧系元素铕的稀释倍数为1:1000。
本发明还提供了一种非诊断目的的长效生长激素免疫定量检测方法，包括如下步骤：
步骤1：将PEG抗体加入微孔板，包被，洗板，封闭，得到PEG抗体包被的微孔板；
步骤2：将样品采用样品稀释液稀释，然后加入PEG抗体包被的微孔板中孵育；
步骤3：将生物素标记的PEG-rhGH抗体工作液加入微孔板中孵育；
步骤4：将链霉亲和素标记的镧系元素铕工作液加入微孔板中孵育；
步骤5：最后加入增强解离液，震荡；
步骤6：激发光330，发射光620，读取荧光值；采用外标法得到样品中长效生长激素的含量。
作为优选，PEG抗体的包被浓度为6～10μg/mL，包被温度为2～8℃，包被时间为10～20h；封闭的温度为35～40℃，封闭的时间为1.5～2.5小时。
在本发明具体实施例中，PEG抗体的包被浓度为8μg/mL，包被温度为2～8℃，包被时间为12h；封闭的温度为37℃，封闭的时间为2小时。
作为优选，孵育的温度为20～30℃，孵育的时间为0.5～1.5h；
在本发明具体实施例中，孵育的温度为室温，孵育的时间为1h。
作为优选，震荡的转速为100～200rpm，震荡的时间为10～30分钟。
在本发明具体实施例中，震荡的转速为150rpm，震荡的时间为20分钟。
本发明提供了一种基于镧系元素化学发光法长效生长激素免疫定量检测试剂盒及其方法。该试剂盒包括：PEG抗体、微孔板，生物素标记的PEG-rhGH抗体工作液，链霉亲和素标记的镧系元素铕工作液，增强解离液，PEG-rhGH抗原标准品和质控品。本发明的技术效果为：
本发明经过方法学评估，结果显示试剂盒灵敏度高、特异性好，准确度更高，为满足长效生长激素药物临床分析和评价提供了一种技术手段。
附图说明
图1基于镧系元素化学发光法长效生长激素免疫定量检测方法的标准曲线。
具体实施方式
本发明公开了一种基于镧系元素化学发光法长效生长激素免疫定量检测试剂盒及其方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
中英文对照：
生长激素：Growth Hormone，GH；
重组人生长激素：rhGH；
聚乙二醇：PEG；
长效生长激素：PEG-rhGH；
链霉亲和素标记的镧系元素铕：Europium-labeled streptavidin；
增强解离液：Enhancement Solution。
本发明提供的基于镧系元素化学发光法长效生长激素免疫定量检测试剂盒及其方法中所用试剂或仪器均可由市场购得。增强解离液(Enhancement Solution)、DELFIAassay buffer为商售。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1基于镧系元素化学发光法长效生长激素免疫定量试剂盒
1.试剂盒的组成
本发明试剂盒包括：PEG抗体包被的微孔板，多个浓度不同的PEG-rhGH标准品和质控品，生物素标记的PEG-rhGH抗体，链霉亲和素标记的镧系元素铕，增强解离液，洗涤缓冲液，封闭液，样品稀释液，检测抗体稀释液。
2.试剂盒的制备方法
1)PEG抗体包被微孔板的制备
微孔板为96孔DELFIA Yellow Plate。
包被缓冲液为0.08M pH 7.4的磷酸盐缓冲液。
洗涤缓冲液为含有0.5m M Tween-20的0.08M磷酸盐缓冲液。
封闭液为含有5％脱脂奶粉的0.08M磷酸盐缓冲液。
包被步骤具体包括：
(1)以包被缓冲液将PEG抗体稀释成包被浓度为8μg/ml的包被液，以每孔50μL加入微孔板，2～8℃过夜，使其与酶标板紧密结合。
(2)次日，弃去孔内包被液，以每孔260μL加入洗涤缓冲液，后弃去孔内液体，洗板3次，拍干微孔板；以每孔100μL加入封闭液进行封闭，37℃温育2小时。
2)PEG-rhGH标准品、质控品的配制
样品稀释液为0.08M pH 7.4的磷酸盐缓冲液。
将标准PEG-rhGH用血清稀释成标准品，浓度为120.000ng/mL、60.000ng/mL、30.000ng/mL、15.000ng/mL、7.500ng/mL、3.750ng/mL、1.875ng/mL、0.938ng/mL、0.469ng/mL、0.234ng/mL、0.117ng/mL。
将标准PEG-rhGH蛋白用血清稀释稀释成质控品，浓度为96.000ng/mL(HQC)、16.000ng/mL(MQC)、2.344ng/mL(LQC)。
临上样前用样品稀释液将标准品、质控品稀释10倍。
3)生物素标记的PEG-rhGH抗体工作液的制备
检测抗体稀释液为含有1％的牛血清白蛋白的0.08M磷酸盐缓冲液。
用检测抗体稀释液将生物素标记的PEG-rhGH抗体按照1:1600比例稀释后备用。
4)链霉亲和素标记的镧系元素铕工作液的制备
链霉亲和素标记的镧系元素铕稀释液为DELFIA assay buffer。
用链霉亲和素标记的镧系元素铕稀释液将链霉亲和素标记的镧系元素铕按照1:1000比例稀释后备用。
3.使用步骤
(1)以包被缓冲液将PEG抗体稀释成包被浓度为8μg/mL的包被液，以每孔50μL加入微孔板，2～8℃过夜，使其与酶标板紧密结合。
(2)次日，弃去孔内包被液，以每孔260μL加入洗涤缓冲液，后弃去孔内液体，洗板3次，拍干微孔板；以每孔100μL加入封闭液进行封闭，37℃温育2小时；封闭结束后，拍干酶标板，用样品稀释液将标准品、质控品和样品稀释10倍，每孔加入100μL，室温孵育1小时。
(3)弃去孔内溶液，洗板3次后，生物素标记的PEG-rhGH抗体工作液，每孔100μL，室温孵育1小时。
(4)弃去孔内溶液，洗板4次，加入链霉亲和素标记的镧系元素铕工作液，每孔100μL，室温孵育1小时。
(5)弃去孔内溶液，洗板6次，最后加入的显色剂增强解离液，每孔200μL，室温，150rpm震荡20分钟；
(6)测定：激发光330，发射光620，读取荧光值。
实施例2方法的建立
1、试验方法
(1)PEG-rhGH蛋白的线性范围
将标准PEG-rhGH蛋白作系列稀释至0.117-120.000ng/mL，用上述建立的方法检测，进行6次重复，以PEG-rhGH蛋白标准品质量浓度(ng/mL)为横坐标，化学发光信号值为纵坐标，用四参数拟合标准曲线，确定线性范围与定量下限。
(2)特异性验证
以混合空白血清配制HQC与LQC，加入递增浓度(至少两个浓度)的rhGH进行特异性考察，未加入分析物的基质也应同时被测量。
(3)与酶联免疫吸附法比较
采用酶联免疫吸附法重复本方法，以PEG-rhGH蛋白标准品质量浓度(ng/mL)为横坐标，吸光度值为纵坐标，用四参数拟合标准曲线，确定线性范围与定量下限。
2.结果
(1)标准曲线
通过测试数据拟合曲线表明(图1)，本方法对PEG-rhGH蛋白，定量限为0.938ng/mL，R2＝1。
(2)线性范围
通过6次测试数据拟合曲线如下：
表1
0.117、0.234、0.469为锚定点，参与曲线拟合，无接受标准，0.938ng/mL、120.000ng/mL的精密度小于25％，准确度在理论值的75％-125％以内，精密度和准确度的总变异在40％以内；其余浓度样品的精密度小于20％，准确度在理论值的80％-120％以内，精密度和准确度的总变异在30％以内，则认为方法的精密度和准确度符合标准曲线要求。本方法的线性范围为0.938-120.000ng/mL。
(3)特异性验证
特异性测试数据如下：
表2
加入93.75ng/mL rhGH的质控品准确度在80％-120％范围内，且未加入分析物的基质的测量值低于定量下限，说明特异性良好。
(4)与酶联免疫吸附法比较
酶联免疫吸附法结果如下：
表3
通过酶联免疫吸附法重复，方法的灵敏度为1.523ng/mL，线性范围为1.523-41.111ng/mL，较一种基于镧系元素化学发光法长效生长激素免疫定量试剂盒相差甚远。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种基于镧系元素化学发光法长效生长激素免疫定量检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
PEG抗体、微孔板，生物素标记的PEG-rhGH抗体工作液，链霉亲和素标记的镧系元素铕工作液，增强解离液，PEG-rhGH抗原标准品和质控品。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述PEG-rhGH标准品为在0.1～150ng/mL范围内的一系列梯度浓度的标准品；
所述质控品为在2～100ng/mL范围内的高、中、低浓度的质控品。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括包被缓冲液、洗涤缓冲液、封闭液、样品稀释液中的一种或几种。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述包被缓冲液为0.05～0.10M、pH7.0～8.0的磷酸盐缓冲液；
所述洗涤缓冲液为含有0.4～0.6mM Tween-20的0.05～0.10M磷酸盐缓冲液；
所述封闭液为含有4％～6％脱脂奶粉的0.05～0.10M磷酸盐缓冲液。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述样品稀释液为0.05～0.10M、pH7.0～8.0的磷酸盐缓冲液。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的试剂盒，其特征在于，生物素标记的PEG-rhGH抗体用检测抗体稀释液稀释后得到生物素标记的PEG-rhGH抗体工作液；所述检测抗体稀释液为含有0.8％～1.2％的牛血清白蛋白的0.05～0.10M磷酸盐缓冲液；
链霉亲和素标记的镧系元素铕用链霉亲和素标记的镧系元素铕稀释液稀释后得到链霉亲和素标记的镧系元素铕工作液；所述链霉亲和素标记的镧系元素铕稀释液为DELFIAassay buffer。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述生物素标记的PEG-rhGH抗体的稀释倍数为1:(1400～1800)；
所述链霉亲和素标记的镧系元素铕的稀释倍数为1:(800～1200)。
8.一种非诊断目的的长效生长激素免疫定量检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：将PEG抗体加入微孔板，包被，洗板，封闭，得到PEG抗体包被的微孔板；
步骤2：将样品采用样品稀释液稀释，然后加入PEG抗体包被的微孔板中孵育；
步骤3：将生物素标记的PEG-rhGH抗体工作液加入微孔板中孵育；
步骤4：将链霉亲和素标记的镧系元素铕工作液加入微孔板中孵育；
步骤5：最后加入增强解离液，震荡；
步骤6：激发光330，发射光620，读取荧光值；采用外标法得到样品中长效生长激素的含量。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述PEG抗体的包被浓度为6～10μg/mL，包被温度为2～8℃，包被时间为10～20h；封闭的温度为35～40℃，封闭的时间为1.5～2.5小时。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述孵育的温度为20～30℃，孵育的时间为0.5～1.5h；
震荡的转速为100～200rpm，震荡的时间为10～30分钟。
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